ES2709073T3

ES2709073T3 - Procedimiento y aparato para seleccionar células

Info

Publication number: ES2709073T3
Application number: ES09772915T
Authority: ES
Inventors: Mark Luscher
Original assignee: Microbix Biosystems Inc
Current assignee: Microbix Biosystems Inc
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2019-04-15
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: UA102854C2; CA2728289A1; DK2304020T3; PL2304020T3; CN102119212A; NZ590166A; US20120038914A1; WO2010001254A2; US20090325217A1; US8004661B2; RU2011102290A; RU2520848C2; WO2010001254A3; CA2728289C; UA115521C2; BRPI0914919A2; EP2304020A2; MX2011000182A; EP2304020B1; US8467040B2

Abstract

Un procedimiento de selección de un primer conjunto de células a partir de una población de células que incluye el primer conjunto de células y un segundo conjunto de células, comprendiendo el procedimiento: el marcaje de la población de células de manera que el primer conjunto de células pueda distinguirse del segundo conjunto de células; la provisión de una primera vía (110) de flujo que presenta un extremo distal, un extremo proximal, un área (128) de interrogación dispuesta entre el extremo proximal y el extremo distal y un eje geométrico de flujo; la creación de un flujo (116) de vaina de un fluido de vaina a través de la primera vía de flujo, desplazándose el flujo de vaina hacia el extremo proximal en un primer caudal; la inyección dentro del flujo de vaina, en un punto corriente arriba a partir del extremo proximal, de un flujo (120) de muestra que incluye la población de células, presentando el flujo de muestra inicialmente un segundo caudal inferior al primer caudal; la provisión de una fuente de energía de excitación, actuando la energía emitida por la fuente de energía de excitación sobre células individuales cuando pasan a través del área de interrogación y provocando la emisión o la transmisión de una radiación secundaria procedente de las células; la utilización de una lente (142) de objetivo que presenta un eje geométrico (144) óptico alineado genéricamente de forma coaxial con el eje geométrico (130) de flujo para focalizar la radiación secundaria procedente de las células individuales cuando las células pasan a través del área de interrogación; la detección de la radiación secundaria focalizada procedente de las células individuales; la determinación, a partir de la radiación secundaria detectada, de si las células individuales están en el primer conjunto o en el segundo conjunto; y la selección de células determinadas como incluidas en el primer conjunto.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento y aparato para seleccionar celulas

Solicitudes relacionadas

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere, en general, a procedimientos y aparatos para seleccionar celulas y, en particular, a unos procedimientos y aparatos para utilizar una fuente de energfa controlada para modificar una poblacion de celulas de interes mediante la retirada de manera selectiva, el enriquecimiento o la alteracion de celulas, virus o de partmulas respecto de la poblacion.

El documento US 2005/207633A se refiere a un procedimiento para clasificar celulas.

Antecedentes

La seleccion citometrica de flujo permite la seleccion, el enriquecimiento, la distribucion o la division de poblaciones de celulas, virus, cuerpos o partmulas de interes (en lo sucesivo designadas como celulas). Los criterios de seleccion incluyen las propiedades mensurables de celulas individuales que pueden ser detectadas desde el exterior de la celula con o la sin ayuda de reactivos qmmicos o de complejos o cuerpos que esten, o que pueden conseguirse que se asocien con la celula. Por ejemplo, las propiedades de las celulas pueden ser medidas o aproximadas mediante la deteccion y / o la cuantificacion de la asociacion de las celulas con uno o mas marcados, por ejemplo moleculas, complejos o cuerpos que fluorescen o que han sido modificados para convertirse en fluorescentes. Dichas moleculas, complejos y / o cuerpos fluorescentes pueden estar asociados de diferente manera con celulas sobre la base de las propiedades cualitativas o cuantitativas de las celulas incluyendo su composicion con respecto a protemas, lfpidos, fosfoprotemas, glucoprotemas, fosfolfpidos, glucolfpidos, acidos nucleicos, (incluyendo la cantidad, la secuencia o la organizacion de los acidos nucleicos), carbohidratos, sales / iones, y cualquier otra molecula dentro, sobre o asociada con las celulas. Asf mismo, dichas moleculas, complejos y / o cuerpos fluorescentes pueden asociarse de manera diferente con celulas en base a caractensticas ffsicas o fisiologicas de las celulas, ejemplos de las cuales incluyen, pero no se limitan a, la permeabilidad de la membrana, la composicion de la membrana, la fluidez de la membrana, el potencial qmmico de la membrana, la viabilidad, los gradientes qmmicos, la motilidad, el potencial o estado de reduccion u oxidacion y otros parametros o propiedades. Otras propiedades mensurables de las celulas, ya sean marcadas o no marcadas, modificadas o no modificadas, que pueden proporcionar una base para la seleccion de las celulas pueden incluir, sin limitacion:

propiedades de interaccion de la luz con las celulas, por ejemplo fluorescencia, absorbencia, reflectancia, dispersion, polarizacion u otras propiedades;

propiedades electricas de las celulas o del efecto de las celulas sobre su entorno, incluyendo la conductancia, la inductancia, la resistencia, el potencial o la tension de la membrana, u otras propiedades; propiedades magneticas o electromagneticas de las celulas, incluyendo el magnetismo, el paramagnetismo, la resonancia magnetica y / o la interaccion de las celulas con la energfa electromagnetica;

la apariencia, la imagen o las propiedades morfologicas de las celulas; y

la estructura de las celulas con respecto a cualquier sustancia o parametro medido directa o indirectamente de cualquier forma.

Asf mismo, la medicion de dichos parametros, directa o indirectamente de manera singular o en combinacion, puede reflejar propiedades simples o complejas de interes de las celulas.

Un ejemplo de dicha propiedad es el cromosoma sexual incluido en el genoma de gameto, haploide, que puede ser un cromosoma X o un cromosoma Y o una combinacion de ambos dependiendo del tipo de celula y del organismo. La determinacion del contenido de los cromosomas sexuales puede inferirse utilizando mediciones o determinaciones directas o indirectas utilizando uno o mas procedimientos. Dichos procedimientos incluyen la medicion del contenido del ADN de las celulas determinado relativa o absolutamente; la presencia o ausencia de determinadas secuencias de ADN o marcadores de la presencia o ausencia de determinadas secuencias de ADN; el tamano de las celulas o de las porciones u organulos de las celulas; la presencia, localizacion o la ausencia de protemas u otros marcadores caractensticos de los cromosomas sexuales o de las celulas o combinaciones o patrones de expresion de dicho marcadores; o cualquier otra medicion que refleje la composicion del cromosoma sexual de la celula. Pueden llevarse a cabo otras muchas mediciones o determinarse propiedades para identificar celulas que sean de interes en un supuesto, situacion, sistema, enfermedad, anomalfa, proceso o circunstancia concretas.

Dichas mediciones citometricas permiten determinaciones cuantitativas y / o cualitativas acerca de las celulas, de poblaciones de celulas, organos, tejidos u organismos. Dichas determinaciones pueden utilizarse de muchas maneras incluyendo sin limitacion el diagnostico, la investigacion biomedica, la ingeniena genetica, la epidiomolog^a, la medicina, la agricultura, la cna de animales, el manejo de ganado, la zoolog^a, la industria biofarmaceutica, y otros campos. Ademas de la capacidad para llevar a cabo dichas mediciones, los procedimientos y el instrumental actuales permiten la separacion de las celulas en base a las caractensticas o parametros medidos por citometna de acuerdo con lo antes expuesto. Las celulas pueden ser seleccionadas positiva o negativamente mediante la concentracion, agrupacion o division de celulas de interes o mediante la eliminacion de celulas no deseadas o de interes en la preparacion. Dicha seleccion puede ser controlada sobre la base de cualquier parametro, caractenstica o combinacion de parametros o de caractensticas que pueden determinarse segun lo antes descrito.

Las celulas identificadas mediante procedimientos que incluyen o que estan relacionados con los descritos anteriormente, pueden ser separadas, divididas, concentradas, reducidas o agrupadas en cualquier numero arbitrario de grupos. Un procedimiento de separacion habitual (representado en la Fig. 1A) utiliza fuerzas electrostaticas para desviar una corriente electrica o electrostaticamente cargada, una gotfcula o gotfculas que contengan una celula o unas celulas que presenten unas propiedades deseadas o no deseadas. Las celulas desviadas son recogidas o descartadas como apropiadas para la aplicacion concreta, como se ilustra en la Fig. 1A. Otros procedimientos de separacion incluyen el uso de dispositivos flmdicos que incluyen ondas para desviar celulas de una corriente de fluido hacia vfas de paso alternativas, canales, tubos o elementos para su posterior recogida o eliminacion, como se ilustra en la Fig. 1B.

Existe una pluralidad de procedimientos y sistemas para llevar a cabo la seleccion citometrica de flujo de celulas. Entre estos existen procedimientos y sistemas disenados espedficamente para llevar a cabo una seleccion citometrica de flujo de celulas espermaticas de mamfferos y, en particular, para seleccionar las celulas espermaticas en poblaciones de celulas espermaticas cargadas con cromosomas X y / o poblaciones de celulas espermaticas que cargadas con cromosomas Y con la finalidad de incrementar la probabilidad de que la fertilizacion de un huevo con el esperma seleccionado se traduzca en una descendencia con un genero deseado. Por ejemplo, un granjero de productos lacteos puede desear seleccionar el esperma de un toro de manera que puedan obtenerse embriones bovinos, mediante inseminacion artificial, fertilizacion in vitro u otros medios con un esperma que incorpore un cromosoma X para obtener una descendencia bovina hembra adicional.

Los procedimientos de seleccion citometrica de flujo presentan una serie de problemas, particularmente con respecto a la seleccion de las celulas espermaticas de los mairnferos para su uso posterior en la produccion de descendencia. Es de destacar que los procedimientos utilizados para marcar y / o diferenciar entre las celulas y / o los procedimientos utilizados para seleccionar las celulas no deban afectar negativamente a la viabilidad de las celulas. A menudo, uno o mas objetivos de los procedimientos y / o sistemas implicados (por ejemplo, una seleccion mas rapida, una precision mejorada, etc.) entran en conflicto con otros objetivos de los procedimientos y / o sistemas. Diversos factores deben ser sopesados y considerados, incluyendo las temperaturas, los cambios de temperatura, las presiones y / o los cambios de presion a las que quedan sometidas las celulas, los entornos flmdicos a los cuales estan expuestas las celulas, las fuerzas aplicadas a las celulas, y la longevidad de la celula. Por ejemplo, la velocidad a la cual una molecula fluorescente (por ejemplo, un fluorocromo) entra en una celula para fijarse al ADN dentro del nucleo de la celula (esto es, la velocidad a la cual las celulas pueden ser coloreadas), puede aumentar a medida que aumenta la temperatura. Asf, el rendimiento total de un sistema (al menos el rendimiento total del proceso de tincion) puede incrementar con un incremento de la temperatura del entorno de las celulas. Sin embargo, la temperatura incrementada puede en ultimo termino resultar desventajosa para la viabilidad de las celulas y / o respecto de la longitud del tiempo durante el cual las celulas permanecen viables. Por el contrario, el mantenimiento de las celulas a la temperatura optima para su viabilidad puede incrementar el tiempo requerido para colorear (y medir y seleccionar) las celulas, de manera que el proceso lleve mas tiempo del que sena practico o de manera que las celulas no resulten viables despues del tiempo requerido para completar el proceso.

Otro problema asociado con la seleccion de las celulas se refiere a las propiedades ffsicas y opticas de las celulas. En particular, las celulas planas o de cualquier forma asimetricas, como por ejemplo los eritrocitos de los mamfferos o las celulas espermaticas, muestran una emision anisotropica de energfa (por ejemplo, luz). Las complejas geometnas del interior de una celula y / o las complejas geometnas de los lfmites de la celula actuan para refractar y / o reflejar la luz de manera que resulta altamente dependiente de la orientacion de la celula con respecto a cualquier fuente de iluminacion y / o de los detectores utilizados para diferenciar las celulas. Por ejemplo, la seleccion de citometna de flujo de las celulas espermaticas de los marnfferos en poblaciones con cromosomas X o Y generalmente implica la tincion de las celulas con una molecula fluorescente que se fija al ADN dentro de las celulas. La variacion del contenido del ADN entre los cromosomas X e Y de la mayona de las especies de los mamfferos (los cromosomas Y contienen generalmente menos ADN que los cromosomas X) se traduce en una fluorescencia relativamente mayor procedente de las celulas que contienen cromosomas X. Sin embargo, la diferencia en el contenido del ADN de los cromosomas X e Y es tfpicamente del orden de un escaso porcentaje y, a menudo, la geometna y / o la orientacion de las celulas puede afectar a la fluorescencia detectada en un porcentaje que excede con mucho la diferencia de porcentaje en el contenido del ADN entre los cromosomas X e Y. Asf mismo, dicho analisis requiere que las celulas pasen a traves de la region de deteccion por separado, de manera que un detector no interprete la fluorescencia procedente de dos celulas como una fluorescencia de una sola celula.

Los sistemas de seleccion por citometna de flujo frecuentemente emplean un mecanismo flmdico de nucleo en vaina para conducir las celulas a traves de la region de deteccion. Como se representa en la Fig. 1C, una corriente 50 en movimiento relativamente lento de una suspension acuosa de unas celulas 52 es inyectada en un flujo 54 en movimiento relativamente mas rapido de fluido de vaina. Esta disposicion focaliza las celulas 52 dentro de una corriente 56, designada como la corriente del nucleo. Con una seleccion apropiada de las presiones y de las consiguientes velocidades de la suspension del nucleo y del fluido de vaina, la corriente del nucleo es estrechada por las fuerzas hidrodinamicas ejercidas por el flujo de vaina, y las celulas de la corriente del nucleo son distribuidas longitudinalmente de manera que sean conducidas de una en una por el flujo. Las fuerzas que alargan y estrechan la corriente del nucleo presentan la ventaja adicional de orientar las celulas 52 de manera que el eje geometrico 58 longitudinal de la celula 52 sea paralelo con la direccion del flujo de la corriente 56 de hilera unica. Sin embargo, la orientacion de las celulas alrededor del eje geometrico 58 longitudinal sigue siendo mas o menos aleatoria. Asf, a medida que cada celula 52 pasa a traves del area de deteccion, la luz que incide sobre la celula, la luz emitida procedente de la celula (por ejemplo, luz fluorescente) y la luz reflejada fuera de la celula, sigue dependiendo de la orientacion de la celula 52. Esto es especialmente cierto en muchos tipos de celulas espermaticas de los mairnferos.

Existe una pluralidad de soluciones al problema de la orientacion de las celulas espermaticas con respecto a la iluminacion y la deteccion de las celulas dentro de los sistemas de citometna de flujo. Por ejemplo, la Fig. 1D ilustra una solucion, solucion que emplea una punta 60 biselada, cortada sobre un tubo 62 que inyecta una corriente 64 de muestra dentro de un flujo 66 de vaina. La punta 60 biselada aplastada contribuye a orientar las celulas alrededor de sus ejes geometricos 58 longitudinales dentro del flujo 66 de vaina de manera que las caras planas de las celulas tienden a alinearse en una direccion homogenea. Otra solucion (que se puede combinar con la solucion de la punta biselada) emplea dos detectores 68 y 70 ortogonales entre sf (un detector 68 de 0 grados y un detector 70 de 90 grados) que se utilizan en combinacion para estimar la situacion de cada celula 52 cuando pasa a traves de un area 72 de deteccion y para medir la fluorescencia de esas celulas que aparecen adecuadamente orientadas de manera que resulta posible una cuantificacion precisa de la senal fluorescente. Las soluciones que emplean una orientacion hidrodinamica de las celulas alrededor del eje geometrico longitudinal generalmente consiguen poblaciones en las que la alineacion deseada para la medicion de la fluorescencia se consigue para aproximadamente un 70% o menos de las celulas del flujo de muestra, lo que reduce el rendimiento global del instrumento y provoca el descarte de las celulas incorrectamente orientadas.

Otra solucion adicional a los problemas asociados con la geometna y la orientacion de las celulas utiliza una deteccion optica a lo largo del mismo eje geometrico que el flujo de nucleo en vaina que conduce las celulas. En una solucion de este tipo, son utilizados elementos opticos de epiiluminacion para iluminar la celula y detectar la luz emitida por la celula. Como se representa en la Fig. 1E, una corriente 74 de muestra conducidas por un flujo 76 de vaina se desplaza directamente a traves de una lente 78 de objetivo de microscopio, eliminando la dependencia de la orientacion de la celula (por ejemplo, una celula 80 espermatica) alrededor de un eje geometrico 82 longitudinal de la celula 80. Sin embargo, la trayectoria de la celula 80 hacia la lente 78 de objetivo requiere que la celula 80 cambie inmediatamente la trayectoria despues de pasar a traves de un area 82 de deteccion (esto es, el punto 84 focal de la lente 78 de objetivo). El sistema consigue este cambio de trayectoria utilizando un flujo 86 de fluido transversal. Una incertidumbre en cuanto a la posicion de las celulas individuales puede introducirse despues del analisis mediante la convergencia 88 del flujo 86 de fluido transversal y del flujo 76 de vaina y de la corriente 74 de fluido. Dicha incertidumbre de posicion puede convertir el sistema en inoperable para llevar a cabo la seleccion de las celulas porque el emplazamiento de la celula 80 dentro del flujo convergido puede resultar impredecible inmediatamente despues de que la celula pase a traves del area 82 de deteccion.

Otra solucion adicional, ilustrada en la Fig. 1F, utiliza uno o mas reflectores 102 parabolicos para iluminar uniformemente las celulas y / o para recoger la luz radialmente procedente de las celulas. El sistema utiliza una tobera 104 para emitir una corriente / chorro 106 de lfquido que contiene celulas 92 individuales. La corriente 106 se desplaza a traves de una region 94 de deteccion y a traves de un orificio 96 practicado en el reflector 102 parabolico. En algun punto despues de pasar a traves de la region de deteccion, la corriente 106 se desglosa en unas gotfculas 90 que pueden ser electricamente cargadas. A continuacion, cada una de las gotfculas 90 puede ser seleccionada mediante, por ejemplo, la deflexion de la gotfcula 90 cargada y de unas placas 98 de deflector electricamente cargadas para deflectar las gotfculas hasta dentro de uno o mas receptaculos 100. De forma problematica, la configuracion de "chorro en el aire" somete a la corriente 106 (y a las celulas 92 contenidas dentro de la corriente 106) a una cafda de la presion cuando la corriente 106 sale de la tobera 104. Los cambios repentinos de la presion (y las presiones incrementadas dentro de la propia tobera), pueden afectar negativamente a la viabilidad de la celula lo mismo que el consiguiente impacto de la celula 92 dentro del receptaculo 100. Asf, la presion y la velocidad de la corriente 106 que sale de la tobera 104 debe permanecer por debajo de cualquier umbral que pudiera danar las celulas 92, lo que reduce el rendimiento global del sistema. Asf mismo, el desplazamiento de las gotfculas 90 a traves de la atmosfera puede requerir condicionamientos medioambientales incluyendo la limpieza del medio ambiente (por ejemplo, una "sala limpia") y el control de la temperatura.

Asf, incluso en el estado relativamente avanzado de la citometna de flujo, en la tecnica persiste la necesidad de unos procedimientos y unos dispositivos mas eficientes, mas sensibles y mas precisos para la separacion y / o la identificacion de celulas.

Sumario

Se describe un procedimiento y un aparato para detectar, alterar selectivamente mediante una modificacion funcional y / o ffsica, y una recogida de celulas deseadas o no deseadas en una poblacion que utilice citometna de flujo. El procedimiento no se basa en reflectores parabolicos o en la deteccion ortogonal para detectar y situar por categonas las celulas, como en el caso de los procedimientos y aparatos de seleccion citometrica generalmente existentes. Por el contrario, el procedimiento emplea una lente de objetivo que incluye un eje geometrico optico coaxial con el flujo de la muestra a traves de un area de deteccion. El procedimiento puede o puede no basarse en la diversion o el desglose de la corriente de flujo de celulas o en la coleccion de celulas para diferentes receptaculos o vfas de paso de recepcion, como tambien es el caso para los procedimientos y aparatos de seleccion citometrica generalmente existentes.

El procedimiento contempla el uso de una fuente de energfa controlable como por ejemplo, pero no limitada, una fuente de radiacion electromagnetica, por ejemplo un laser, para irradiar celulas deseadas o no deseadas de una poblacion de celulas que han sido identificadas utilizando las tecnicas de deteccion citometricas. La fuente de energfa controlable es dirigida de manera selectiva hacia las celulas de interes en base a sus propiedades o caractensticas medidas, despues de su analisis en el citometro, en cierto aspecto dentro de un segundo de sus analisis mientras las celulas permanecen en el flujo flmdico del dispositivo. Dichas celulas pueden ser funcional o ffsicamente alteradas por la energfa transmitida. Dependiendo del uso concreto y de la forma de realizacion concreta de los procedimientos o de los aparatos, la poblacion de celulas resultante puede ser funcional o ffsicamente vaciada de celulas no deseadas, y puede ser modificada de tal manera que permita el posterior enriquecimiento de las celulas deseadas o la retirada de las celulas no deseadas. Los procedimientos y los aparatos descritos resultan de amplia utilidad en aplicaciones en las que se requiera el enriquecimiento o la reduccion de las celulas. En algunas formas de realizacion, el procedimiento y / o el aparato altera el ffquido que contiene las celulas deseadas o no deseadas de una poblacion que han sido identificada utilizando las tecnicas de deteccion citometricas, y pueden no alterar las celulas directamente. En estas formas de realizacion el procedimiento y / o el aparato puede basarse en la diversion o en el desglose de la corriente de flujo de celulas o la seleccion de las celulas en diferentes receptaculos o vfas de acceso.

Un aspecto de los procedimientos y aparatos descritos incluye el uso de estos para el enriquecimiento, la seleccion, la alteracion funcional, o la reduccion de las celulas espermaticas en una poblacion sobre la base del cromosoma sexual X o Y, contenido en las celulas. Los procedimientos y aparatos incluyen el uso de disenos alternativos para los sistemas flmdicos y opticos de un citometro, incluyendo en un aspecto, un aparato en el que los componentes de medicion opticos y / o una fuente de energfa de alteracion de las celulas estan / esta orientados ortogonalmente con respecto a la corriente flmdica, y, en otro aspecto, un aparato en el que algunos de dichos componentes pueden tambien o como alternativa estar orientados en el mismo eje geometrico que la corriente flmdica y / o en angulos oblicuos respecto de esta.

Los procedimientos y aparatos citometricos de flujo aportan un procedimiento y un aparato novedosos que permiten la seleccion positiva o negativa de las celulas mediante la observacion de las celulas y la clasificacion precisa de cada celula con independencia de la orientacion de la celula alrededor de su eje geometrico mas largo y, posteriormente, utilizar la seleccion para determinar si es necesario modificar, derivatizar, deteriorar, destruir o fragmentar la celula en el curso del procedimiento citometrico. Los procedimientos y aparatos actualmente descritos incorporan la aplicacion de fuerzas, energfa o irradiacion hacia celulas deseadas o no deseadas coincidente con o antes de que transcurra un segundo de la medicion citometrica para efectuar cambios en esas celulas que las alteren ffsica o funcionalmente. Dichas celulas alteradas o sus residuos o derivados pueden, en un aspecto, ser retenidas en la preparacion resultante o, en otros aspectos, son enriquecidas o retiradas, dependiendo de las exigencias del uso o aplicacion concretos.

Se describe una forma de realizacion que permite la separacion funcional y / o ffsica de espermatozoides argados con los cromosomas X de los espermatozoides cargados con los cromosomas Y y / o de los espermatozoides cargados con los cromosomas Y de los espermatozoides cargados con los cromosomas X. En esta forma de realizacion, el contenido relativo del ADN de los espermatozoides individuales en una poblacion de espermatozoides se mide indirectamente, utilizando una propiedad conocida de las sustancias qmmicas en asociacion con el ADN como por ejemplo, pero sin limitacion, bisbenzimida, colorantes SYBR, como el SYBR-14, Hoechst 33342, Hoechst 33258, bromuro de etidio, naranja de acridina, DAPI, cromomicina, mitramicina, oligomicina, y otras sustancias qmmicas conocidas en la tecnica que muestran una fluorescencia potenciada cuando se asocian con el ADN. La medicion se lleva a cabo observando una celula cuando la celula se desplaza dentro de una corriente que fluye hacia el punto de observacion, de modo preferente mediante una lente de objetivo que incluye un eje geometrico optico coaxial con el flujo de la corriente. Las celulas que contienen relativamente mas ADN (esto es un contenido mas elevado de ADN) se considera que contienen el cromosoma de mayor tamano X, y las celulas que contienen relativamente menos ADN (esto es con un contenido inferior de ADN) se presume que contienen el cromosoma mas pequeno Y. En algunas formas de realizacion del procedimiento en el que se desean celulas que incluyan solo uno de los cromosomas sexuales en la preparacion final, el procedimiento utiliza una fuente de energfa laser dirigida hacia las celulas, en un aspecto, coincidente con o, en otro aspecto, en el margen de un segundo o menos de su analisis, cuando la fuente de energfa laser puede ser rapidamente modulada para irradiar celulas que contengan el cromosoma sexual no deseado y / o las celulas cuyo contenido cromosomico sexual sea incierto. En un aspecto de esta forma de realizacion, el procedimiento utiliza una fuente de energfa laser que deposita ene^a de calidad y / o cantidad suficientes para modificar, derivatizar, desorganizar, inhabilitar y / o destruir las celulas no deseadas. Dichos cambios de las celulas seleccionadas implican en un aspecto, la fragmentacion de las celulas o, en un aspecto alternativo, son menos desorganizadores, dependiendo de la aplicacion. Por ejemplo, en formas de realizacion del procedimiento en las que deba utilizarse esperma identificado y / o aislado para la fertilizacion y / o la reproduccion, haciendo que las celulas no deseadas sean incapaces de producir descendencia viable, por ejemplo mediante la interrupcion de la secuencia o estructura de las moleculas del ADN de las celulas o mediante la reduccion de motilidad de manera que sean en su mayona infertiles para su uso en la inseminacion artificial, es en un aspecto suficiente para producir la preparacion deseada. En otros aspectos, las celulas no deseadas se hacen no motiles, destruidas, modificadas o desactivadas de alguna otra forma para afectar a la capacidad reproductiva de las celulas no deseadas. En un aspecto alternativo, las celulas no deseadas son modificadas o derivatizadas de una forma que permite su posterior retirada o una parcial retirada de la preparacion de las celulas deseadas.

En otra forma de realizacion, la configuracion del citometro emplea uno o mas elementos opticos, utilizados en un aspecto, para la medicion de las propiedades celulares y / o en otro aspecto, utilizado en la aplicacion de energfa de las celulas, en el que al menos un elemento optico, de modo preferente, un eje geometrico optico de una lente de objetivo, es orientado en el mismo eje geometrico que el flujo de las celulas sometidas a analisis. Asf, en algunas formas de realizacion, se dispone un procedimiento y un aparato utilizando un elemento optico y, en particular, una lente de objetivo situada en posicion coaxial con el flujo de fluido para la iluminacion, medicion o la administracion de energfa a las celulas. En otra forma de realizacion, se dispone un procedimiento y un aparato que utiliza uno o mas elementos adicionales, solo o en combinacion, situados en un angulo de 90 grados con respecto a la corriente de fluido para mediciones o para la administracion de energfa a las celulas. En otra forma de realizacion adicional, se incorpora un procedimiento y un aparato que utiliza uno o mas elementos opticos adicionales, solos o en combinacion, situados de forma no coaxial con respecto a la corriente de fluido para mediciones o para la administracion de energfa a las celulas. En otra forma de realizacion adicional, se dispone un procedimiento y un aparato que utiliza uno o mas elementos opticos adicionales, solos o en combinacion, situados en un angulo oblicuo con respecto a la corriente de fluido para mediciones o para la administracion de energfa a las celulas. Segun se utiliza en la presente memoria, un "angulo oblicuo" es un angulo por ejemplo un angulo agudo u obtuso, que no sea un angulo recto o un multiplo de un angulo recto.

Algunas formas de realizacion proporcionan un procedimiento para modificar una celula de interes de una poblacion de celulas que comprende la etapa de contactar la celula de interes con una fuente de energfa controlable que modifica la celula de interes tras la identificacion de una celula como celula de interes en una poblacion de celulas, sin separar la celula de interes de la poblacion de celulas tras la modificacion mediante la fuente de energfa.

Algunas formas de realizacion proporcionan un procedimiento para identificar una subpoblacion de celulas de interes en una poblacion de celulas que comprende la etapa de contactar con poblacion de celulas con una fuente de energfa controlable que modifica las celulas de la subpoblacion de celulas de interes, en la que el contacto tiene lugar despues de un primer analisis de las celulas en un flujo de muestras fluidico de un citometro de flujo, y no mas alla de aproximadamente un segundo despues del primer analisis, permaneciendo las celulas dentro del flujo de muestras fluidico del citometro de flujo, en la que el primer analisis identifica celulas de la subpoblacion de celulas como celulas de interes, cuando esas celulas de interes fluyen hacia un area de interrogacion y en la que la fuente de energfa controlable modifica las celulas de interes en el mismo flujo de muestras a traves del citometro de flujo.

En algunas formas de realizacion, el primer analisis comprende la deteccion de las celulas de interes que incorporan una propiedad deseada seleccionada entre el grupo compuesto por un elemento deseado: una composicion protemica, una composicion de ADN, un marcador de la superficie de la celula, el tamano molecular, la absorbencia de la luz, la reflexion de la luz, la fluorescencia, la difusion de la luz, la polarizacion, la propiedad electrica, la propiedad magnetica, la propiedad morfologica, la permeabilidad de la membrana, la fluidez de la membrana y el estado de oxidorreduccion.

En algunas formas de realizacion, el contacto con la poblacion de celulas con la fuente de energfa se produce cuando la poblacion de celulas pasa a traves de una corriente de flujo en un citometro de flujo. En una forma de realizacion relacionada, la celula de interes es contactada con la fuente de energfa despues, y en el curso de un segundo de la identificacion de la celula como celula de interes en la corriente de flujo.

Se preve, en algunas formas de realizacion, que la fuente de energfa esta situada en posicion coaxial con la corriente de flujo. Tambien se preve que la fuente de energfa esta situada en un angulo de 90° con respecto a la corriente de flujo, o situada en un angulo oblicuo con la corriente de flujo. En otra forma de realizacion, la fuente de energfa es administrada a las celulas de interes por medio de una optica Kohler y / o epiiluminacion. En otra forma de realizacion, la fuente de energfa es dirigida hacia un punto del flujo de celulas que esta corriente abajo de la posicion en la que son medidas las propiedades celulares. En otra forma de realizacion, la fuente de energfa es dirigida hacia un punto en el flujo de celulas que esta corriente abajo en la posicion en la que son medidas las posiciones celulares y posteriormente se produce una diversion o giro de la corriente de flujo desde su direccion original de flujo.

En algunas formas de realizacion, pueden llevarse a cabo uno o mas analisis mediante la observacion de una celula cuando la celula se desplaza dentro de una corriente que fluye hacia un punto de observacion, de modo preferente, mediante una lente de objetivo que incluya un eje geometrico optico coaxial con el flujo de la corriente. Despues de pasar a traves del punto de observacion, la corriente cambia las direcciones en algunas formas de realizacion, mientras que el orden y / o el emplazamiento de las celulas dentro de la corriente permanecen determinates. En algunas formas de realizacion, una fuente de energfa controlable puede controlar selectivamente una o mas de las celulas de acuerdo con los uno o mas analisis. En algunas formas de realizacion, la fuente de energfa controlable esta situada en posicion coaxial con la corriente nuevamente dirigida, mientras que en otras formas de realizacion, la fuente de energfa controlable esta situada en perpendicular o en un angulo oblicuo con respecto a la corriente nuevamente dirigida. En algunas formas de realizacion, que pueden o pueden no incluir una fuente de energfa controlable, una tobera puede expulsar la corriente formando gotfculas que pueden ser clasificadas utilizando medios conocidos (por ejemplo, utilizando una fuente de energfa controlable para aplicar una carga electrostatica, controlar la presion en varios puntos de acceso del flujo de fluido, etc.).

En algunas formas de realizacion relacionadas, la fuente de energfa controlable es dirigida hacia el emplazamiento de la celula en una corriente de flujo de una manera seleccionada a partir del grupo compuesto por una corriente continua, una corriente pulsada, ciclos intermitentes de activacion / desactivacion, focalizacion y desfocalizacion periodicas de la fuente de energfa y la diversion rapida intermitente de la fuente de energfa hasta la corriente.

En algunas formas de realizacion, la fuente de energfa controlable es una fuente electromagnetica. En algunas formas de realizacion, la fuente de energfa es un laser.

En algunas formas de realizacion, la modificacion de las celulas se selecciona entre el grupo compuesto por la derivatizacion, la destruccion, el deterioro, la perturbacion y la fragmentacion de las celulas de interes.

En otro aspecto, la celula de interes es identificada como celula de interes utilizando un marcaje detectable por medios electricos, magneticos, espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunomecanicos, fluorescentes u otros medios qmmicos. En algunas formas de realizacion, el marcaje es la adicion de un compuesto marcaje fotoactivable qmmico.

En una forma de realizacion relacionada, la celula de interes es identificada porque incorpora una propiedad deseada seleccionada entre el grupo compuesto por un elemento deseado: una composicion protemica, un contenido protemico, una composicion de a Dn , un contenido de ADN, un marcador de superficie de la celula, el tamano molecular, la absorbencia de la luz, la reflexion de la luz, la fluorescencia, la difusion de la luz, la polarizacion, la propiedad electrica, la propiedad magnetica, la propiedad morfologica, la permeabilidad de la membrana, la fluidez de la membrana y el estado de oxidorreduccion.

Los procedimientos y los aparatos descritos contemplan que cualquier fuente de energfa, detector, o elemento de enfoque utilizado en la deteccion de las propiedades de las celulas en el flujo, puede estar situado en posicion coaxial con respecto a la corriente de flujo. Por ejemplo, en un citometro de flujo que comprenda unos detectores y una fuente de energfa controlable, o bien los detectores o bien la fuente de energfa controlable, o ambos, son situados coaxiales con la corriente de flujo. En una forma de realizacion relacionada, cualquier aparato de deteccion y elementos opticos utilizados en la deteccion de propiedades de las celulas en el flujo esta situado en posicion coaxial con respecto a la corriente de flujo.

En otra forma de realizacion, la optica Kohler y / o epiiluminacion son utilizadas para la administracion de luz o energfa utilizada para la deteccion de propiedades deseadas. En una forma de realizacion relacionada, cuando el procedimiento utiliza un citometro de flujo, el citometro de flujo es un citometro de epiiluminacion. Tambien se contempla que un citometro de epiiluminacion de utilidad en el procedimiento descrito incorpora un aparato para la modificacion de celulas de interes segun lo anteriormente descrito en la presente memoria.

Cuando un citometro de flujo es utilizado en el procedimiento descrito, el citometro de flujo es un citometro de flujo que incluye una o mas corrientes de muestras e incorpora una optica que incluye una lente de objetivo coaxial con el flujo de las una o mas corrientes de muestras para la administracion de luz o de energfa utilizada para la deteccion de propiedades deseadas para la seleccion de propiedades deseadas de celulas y / o para la administracion de luz o energfa utilizadas para la modificacion de celulas deseadas o no deseadas.

En otra forma de realizacion, la fuente de energfa modifica la celula de interes que incluye una propiedad deseada. En una forma de realizacion relacionada, la fuente de energfa modifica la celula de interes que carece de una propiedad deseada.

En una forma de realizacion adicional, la celula de interes es una celula espermatica seleccionada entre el grupo consistente en el esperma que incorpora el cromosoma X y el esperma que incluye el cromosoma Y. Se contempla, en algunas formas de realizacion, que la celula espermatica se identifica como celula de interes en base a una propiedad deseada de diferencia en el contenido del ADN entre el esperma que incluye el cromosoma X y el esperma que incluye el cromosoma Y.

Los procedimientos y aparatos descritos proporcionan tambien que la poblacion de celulas son recogidas en una camara de recogida para su uso ulterior. En algunas formas de realizacion, la camara de recogida contiene celulas de interes que han sido modificadas por la fuente de energfa controlable y las celulas que no han sido modificadas por la fuente de energfa controlable. En una forma de realizacion, despues de la recogida, las celulas de interes pueden ser utilizadas en posteriores procesos o procedimientos. En una forma de realizacion adicional, se contempla que despues de la recogida, las celulas de interes son descartadas y el resto de la poblacion de celulas es utilizado en procesos o procedimientos posteriores.

Los procedimientos y aparatos descritos tambien proporcionan un aparato para la modificacion de una celula de interes de una poblacion de celulas que comprende una fuente de energfa controlable que modifica la celula de interes tras la identificacion de una celula como celula de interes en una poblacion de celulas, sin separacion de la ceula de interes de la poblacion de celulas tras la modificacion por la fuente de energfa.

En una forma de realizacion relacionada, los procedimientos y aparatos descritos contemplan la identificacion de una subpoblacion de celulas de interes a partir de una poblacion de celulas, que utilizan un citometro de flujo que comprende una fuente de energfa controlable que modifica la subpoblacion de celulas de interes, en la que el contacto tiene lugar despues de un primer analisis de las celulas durante el flujo de muestras a traves de un tubo de muestras del citometro de flujo, y generalmente en el curso de un segundo del analisis de la celula, mientras que las celulas permanecen dentro del flujo de muestras fluidico del aparato, en la que el primer analisis identifica la celula como celula de interes, y en la que la fuente de energfa controlable modifica la celula de interes durante el flujo de muestras a traves del citometro de flujo.

En algunas formas de realizacion, una o mas etapas de un procedimiento descrito son almacenadas como instrucciones legibles por maquina sobre un medio de almacenamiento tangible dentro de un controlador. Un procesador del controlador ejecuta las instrucciones para supervisar y / o controlar los diversos aspectos de un citometro de flujo de seleccion. Las instrucciones pueden incorporar una o mas rutinas adaptadas a las diversas tareas efectuadas en el citometro.

En algunas formas de realizacion adicionales, una celula optica, cubeta, ventana, tubo de flujo, pared, contorno u otra parte de un citometro de flujo de seleccion esta formada por un material con un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive. En estas y otras formas de realizacion, una solucion cargada con analito puede ser ajustada de manera que el mdice de refraccion de la solucion sea proximo al mdice de refraccion de la celula optica, cubeta, ventana, tubo de flujo u otra parte del citometro de flujo de seleccion y, en particular, los indices de refraccion difieren en 0,02 o menos.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1A ilustra un procedimiento de seleccion de gotmulas empleado en citometros de flujo de seleccion; la Fig. 1B ilustra un procedimiento de presion de flujo diferencial empleado en citometros de flujo de seleccion;

la Fig. 1C representa un mecanismo de vaina y corriente empleado en sistemas de simetna de flujo;

la Fig. 1D representa un mecanismo de vaina y corriente que emplea una punta biselada para orientarse dentro de la corriente;

la Fig. 1E representa un citometro de flujo que detecta una celula que utiliza una lente de objetivo orientada coaxialmente con la corriente de flujo;

la Fig. 1F ilustra un sistema que utiliza un reflector parabolico para iluminar celulas de manera uniforme y para recoger la luz radialmente procedente de las celulas;

la Fig. 2 representa una forma de realizacion prevista de la via de flujo de un citometro de flujo de seleccion; la Fig. 3 representa una forma de realizacion prevista de un citometro de flujo de seleccion;

la Fig. 4 representa una forma de realizacion alternativa prevista de un citometro de flujo de seleccion; la Fig. 5 representa otra forma de realizacion alternativa prevista de un citometro de flujo de seleccion; la Fig. 6A representa una forma de realizacion alternativa prevista de una porcion de un citometro de flujo de seleccion;

la Fig. 6B representa otra forma de realizacion alternativa prevista de una porcion de un citometro de flujo de seleccion;

la Fig. 7 ilustra un procedimiento que puede ser utilizado con una o mas formas de realizacion de un citometro de flujo de seleccion previsto para crear dos puntos focales diferentes de energfa dentro del sistema;

la Fig. 8A representa una lente de objetivo y un punto focal asociado dentro de una via de flujo de una forma de realizacion prevista de los procedimientos y aparatos actualmente descritos;

la Fig. 8B ilustra una forma de realizacion de un volumen genericamente conico formado entre un punto focal nominal y una lente de objetivo;

la Fig. 9 representa una lente de objetivo de inmersion en agua y un punto focal asociado dentro de una via de flujo de una forma de realizacion de los procedimientos y los aparatos actualmente descritos;

la Fig. 10 representa un cuerpo en el que una porcion de la via de flujo de un citometro de flujo de seleccion puede formarse, de acuerdo con una forma de realizacion de los procedimientos y aparatos actualmente descritos;

la Fig. 11 representa una forma de realizacion alternativa del cuerpo representado en la Fig. 9;

la Fig. 12 representa otra forma de realizacion alternativa del cuerpo representado en la Fig. 9;

la Fig. 13 representa otra forma de realizacion alternativa adicional del cuerpo representado en la Fig. 9;

la Fig. 14 representa otra forma de realizacion alternativa mas del cuerpo representado en la Fig. 9; y

la Fig. 15 representa un diagrama de flujo que ilustra las etapas de un procedimiento de acuerdo con los procedimientos y aparatos actualmente descritos.

Descripcion detallada

La presente memoria descriptiva describe procedimientos, sistemas y aparatos para la seleccion de celulas en base a la citometna de flujo. A menos que se establezca lo contrario todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el generalmente admitido por parte del experto en la materia a la cual estas invenciones reivindicadas pertenecen.

Debe destacarse aqu que, segun se utiliza en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno-a" y "el-la" incluyen las formas plurales a menos que del contexto claramente se derive lo contrario.

Como sin dificultad apreciaran las personas expertas en la materia a menos que se indique otra cosa que se considere importante para la comprension de los procedimientos y aparatos descritos, las figuras incluidas no estan trazadas a escala.

Segun se utilizan en la presente memoria, los terminos que siguen ofrecen los significados a ellos adscritos a menos que se especifique otra cosa.

El termino "celulas" se refiere al analito contenido en los procedimientos y aparatos descritos, incluyendo esta materia, sin limitacion, celulas, virus, cuerpos o partmulas. El termino "celulas de interes" o "celula de interes" se refiere a una celula que ofrece una propiedad deseada, propiedad que puede ser detectada en el curso del flujo de la celula a traves del aparato citometrico de flujo. Una "propiedad deseada" se refiere a una determinada caractenstica que distingue la celula que ofrece la propiedad deseada respecto de una celula que no presenta dicha caractenstica. Las celulas que ofrecen una propiedad deseada se incluyen en una "subpoblacion deseada" de celulas. Caractensticas de celulas ejemplares mensurables o detectables de una celula de interes incluyen, sin limitacion, una composicion protemica, una composicion de ADN de contenido protemico, un contenido de ADN, marcadores superficiales de celulas, el tamano molecular, la absorbencia lummica, la reflexion lummica, la fluorescencia, la dispersion lummica, la polarizacion, las propiedades electricas de las celulas, las propiedades magneticas, las propiedades morfologicas, la permeabilidad de las membranas, la fluidez de las membranas y el estado de la oxidorreduccion. El experto en la materia apreciara sin dificultad que un citometro puede medir o detectar un numero indeterminado de caractensticas alternativas de una celula de interes, y que estas caractensticas alternativas son facilmente susceptibles de explotacion en los procedimientos y aparatos descritos.

En un aspecto, los procedimientos y aparatos explotan una "propiedad deseada" de una celula de interes para identificar celulas que ofrezcan esta propiedad.

El termino "primer analisis" se refiere a un analisis inicial de celulas cuando las celulas avanzan a traves de un aparato citometro de flujo, que puede ser un tubo, una cubeta, una region, una celula, una camara, etc., para determinar si las celulas son celulas de interes. En un aspecto de algunas formas de realizacion, los detectores de un citometro de flujo ejecutan el primer analisis.

El termino "segundo analisis", segun se utiliza en la presente memoria, se refiere a la caracterizacion de la celula de interes despues del primer analisis a traves del tubo de flujo para determinar si es necesario alterar la celula de interes utilizando una fuente de energfa. En un aspecto de algunas formas de realizacion, el segundo analisis tiene lugar despues, generalmente menos de un segundo despues, que el primer analisis.

Los terminos "modificar", "modificacion", "alterar", y "alteracion", segun se utilizan en la presente memoria, se refieren a la utilizacion de la fuente de energfa para inducir cambios en una celula. Las modificaciones incluyen, sin limitacion, efectos directos sobre las celulas, incluyendo, sin limitacion, la modificacion de componentes celulares o sustancias qmmicas que incluyan protemas, ADN y sustancias implicadas en el metabolismo celular; la perturbacion, el calentamiento, la cavitacion, o las explosiones que se produzcan en o cerca de las celulas; la permeabilizacion o la perforacion de las celulas y la destruccion, fragmentacion o la alteracion morfologica de las celulas. En otros aspectos, las modificaciones tambien, o como alternativa, incluyen efectos indirectos de la fuente de energfa, por la medicion de la fuente de energfa o mediante otros factores incluyendo la activacion y / o desactivacion qmmicas, el reticulado qmmico o la derivitizacion qmmica de las celulas o de uno o mas componentes celulares, la activacion y / o desactivacion de uno o mas agentes qmmicos en o cerca de las celulas que provoquen la union o la asociacion de dichos agentes o sus derivados a la celula o sus componentes o la induccion del funcionamiento alterado de las celulas. En determinados aspectos, los agentes qmmicos, normalmente presentes en el interior o de cualquier otra forma aplicado a las celulas, interactuan con las celulas tras la irradiacion de las celulas.

Los procedimientos y aparatos descritos permiten la identificacion de celulas de interes mediante la deteccion de la presencia o ausencia de un numero indeterminado de caractensticas (por ejemplo, una propiedad deseada) o parametros que pueden determinarse, estimarse o ser reflejados en mediciones compatibles con las tecnicas de citometna de flujo. Las mediciones citometricas utilizadas para definir celulas o poblaciones celulares de interes incluyen en varios aspectos las analizadas en la presente memoria y aquellas conocidas de otro modo en la tecnica, asf como procedimientos, mecanismos y / o aparatos de medicion novedosos que puedan ser introducidos o resultar aplicables en el analisis citometrico de flujo. Las celulas sometidas al analisis citometrico por medio de la practica de los procedimientos y aparatos actualmente descritos pueden ser marcados o no marcados o de cualquier otra forma modificados o no modificados utilizando tecnicas y reactivos conocidos en la materia.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "marcado" o "marcaje" se refiere a unos medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos u otros medios qmmicos. Por ejemplo, marcajes de utilidad incluyen tintes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas, biotina - estretavidina, dioxigenina, haptenes, protemas para las cuales se encuentran disponibles anticuerpos de inmunosueros o monocronales, o tintes espedficos de acido nucleico. Asf, en los procedimientos y aparatos actualmente descritos, la estructura, las propiedades y / o las caractensticas de las celulas con respecto a cualquier sustancia o parametro medidos directa o indirectamente de cualquier forma es la base para la identificacion de las celulas y de las poblaciones de celulas con fines de seleccion o exclusion.

Ejemplos de estructuras, propiedades detectables y / o caractensticas de celulas incluyen, sin limitacion: mediciones de propiedades de la luz que interactuan con las celulas emitidas por las celulas, por ejemplo la absorbencia, la dispersion lummica, la luminiscencia, la fluorescencia, la fosforescencia, la polarizacion o la despolarizacion de luz y otras propiedades; propiedades de electricidad que incluyen, sin limitacion, la inductancia, la capacitancia, el potencial, la corriente o la resistencia de las celulas o del medio circundante; propiedades de electromagnetismo incluyendo el magnetismo, el paramagnetismo, la resonancia magnetica y / o la interaccion de la celula con o la emision de fuerzas electromagneticas y / u ondas; formacion de imagenes, propiedades de formacion de imagenes, propiedades morfologicas o propiedades relacionadas delgadas a partir de la recogida y / o el analisis de la imagen o de las propiedades tipo imagen de celulas. En determinados aspectos, la medicion es una cantidad o calidad intrrnseca de la celula o, en aspectos alternativos, la medicion es un valor que indirectamente refleja, representa o se aproxima a una cantidad o calidad de la celula. A modo de ejemplo y no de limitacion, una medicion de fluorescencia de una celula puede reflejar la fluorescencia intrrnseca de la celula o la medicion de la fluorescencia de una celula puede reflejar la presencia y / o la cantidad de un flurocromo o de una parffcula fluorocomo o de una parffcula fluorescente que se fije a o se asocie con la celula y directa o indirectamente refleje alguna propiedad de la celula, o ambas circunstancias.

En algunos aspectos de los procedimientos y aparatos descritos, un citometro de seleccion emplea una tecnica que se traduce en una separacion ffsica o espacial de celulas y de poblaciones celulares. En otros aspectos los procedimientos y aparatos descritos, un citometro de seleccion utiliza una tecnica que ffsica y / o funcionalmente modifica las celulas seleccionadas de poblaciones para permitir su separacion y / o diferenciacion funcional y / o ffsica, de manera opcional para un uso posterior. En algunos aspectos del procedimiento y del aparato descrito, un citometro de seleccion no se basa en la separacion inmediata de celulas mediante la posicion, emplazamiento, receptaculo o el tiempo sino que, por el contrario, aporta celulas que estan desactivadas, incapacitadas, perturbadas, desarticuladas, fragmentadas o alteradas de cualquier otra forma (esto es "modificadas") con respecto a alguna propiedad deseada, que, de manera opcional, posibilita la separacion de diferencia de subpoblaciones en la preparacion. La naturaleza de la modificacion depende, en todo o en parte, de una aplicacion o uso perseguidos para celulas identificadas, y con ello, de caractensticas de las celulas identificadas que son relevantes en la aplicacion. Por ejemplo, y con fines unicamente de analisis de clarificacion, una celula maligna o de cualquier otro tipo inmortal o que crece rapidamente podna considerarse desactivada funcionalmente en el contexto de la preparacion de celulas somaticas normales sin la capacidad de la celula para reproducirse se ve afectada negativamente o si la celula se destruye. En otro ejemplo, tambien con fines unicamente de analisis o clarificadores, en el que una aplicacion requiere la retirada de una poblacion respecto de una subpoblacion de celulas que producen una protema indeseable y otra sustancia, un citometro de seleccion puede conseguir este resultado mediante la anulacion de la produccion de la sustancia de estas celulas, mediante la destruccion de las celulas y / o la modificacion de las celulas para permitir su retirada ffsica de la poblacion.

Los procedimientos y aparatos actualmente descritos utilizan, en algunas formas de realizacion, una fuente de energfa para la modificacion de celulas o para la induccion o iniciacion de procesos tales como la activacion qmmica que puede modificar celulas. Las modificaciones inducidas por la fuente de energfa incluyen en diversos aspectos, efectos directos sobre las celulas, incluyendo sin limitaciones la modificacion de los componentes celulares o de las sustancias qmmicas incluyendo las protemas, el ADN y sustancias implicadas en el metabolismo celular; perturbacion, calentamiento, cavitacion o explosiones que se produzcan en o cerca de las celulas; la permeabilizacion o la perforacion de las celulas; y la descripcion, fragmentacion o la alteracion morfologica de las celulas, incluyendo celulas, virus, cuerpos o partfculas. En otras formas de realizacion, las modificaciones tambien, o como alternativa, incluyen efectos indirectos de la fuente de energfa, con la intermediacion por parte de la fuente de energfa o por otros factores, incluyendo la activacion y / o la desactivacion qmmicas, el reticulado qmmico o la derivatizacion de las celulas o de uno o mas componentes celulares, la activacion o desactivacion de los uno o mas agentes en o cerca de las celulas que provocan la fijacion o asociacion de dichos agentes o de sus derivados a la celula o sus componentes o la induccion de funcionamientos alterados de las celulas. En determinadas formas de realizacion, agentes qmmicos que reaccionan tras la irradiacion con las celulas estan normalmente presentes en las celulas y en la aplicacion se anaden como parte del procedimiento.

En algunas formas de realizacion, los procedimientos y aparatos descritos incorporan el uso de compuestos fotoactivables que son inducidos a fijarse o asociarse con celulas o componentes celulares tras la irradiacion con luz de una intensidad y energfa apropiadas. Dichos compuestos, en determinados aspectos inducen la suficiente reticulacion o desnaturalizacion de uno o mas componentes celulares que afectan a los procesos celulares o al metabolismo de las celulas de interes. Como alternativa, dichos compuestos en determinados aspectos inducen la reticulacion o desnaturalizacion suficientes de uno o mas componentes celulares que destruyen las celulas de interes. En otra alternativa, unos compuestos fotoactivables utilizados en los procedimientos y aparatos descritos se fijan a celulas seleccionadas y alteran una o mas propiedades de las celulas de interes de tal manera que hacen que las celulas de interes sean susceptibles de identificacion y / o enriquecimiento y / o su agotamiento en procesos posteriores. Las celulas de interes que han sido alteradas por derivatizacion qmmica, por ejemplo mediante la adicion de una sustancia qmmica, son, en determinados aspectos, retiradas, concentradas o purificadas en una etapa posterior empleando procedimientos que utilizan las propiedades o interacciones de dicha sustancia. Por ejemplo y unicamente con fines de analisis y clarificacion, las celulas de interes son, en un aspecto, derivatizadas mediante la adicion de una sustancia que es posteriormente fijada por un anticuerpo que permite la captura o retencion de la celula de interes derivatizada por diversos medios. Se preven muchas sustancias de este tipo y, en un aspecto, dichas sustancias incluyen una clase de compuestos que contienen y estan relacionados con el grupo 2, 4 - dinitrofenilo posteriormente (DNP), el cual en un aspecto, es reconocido y espedficamente ligado por anticuerpos que reconocen el DNP. Por consiguiente, los derivados fotoactivables del DNpo de compuestos relacionados son utilizados en un aspecto para derivatizar celulas de interes en una aplicacion de este tipo. Como alternativa, las celulas derivatizadas de interes son capturadas o retiradas utilizando estrategias que provocan que las celulas derivatizadas de interes se fijen de modo preferente a determinados sustratos. Por ejemplo y con fines unicamente explicativos y de clarificacion, las celulas de interes derivatizadas utilizan compuestos que contienen o estan relacionados con la biotina son, en un aspecto, capturados o retenidos sobre sustratos, superficies, sustancias, medios, compuestos o partfculas que exijan o han sido modificados para fijarse a la biotina, por ejemplo mediante la presencia de avidina, estreptavidina, anticuerpos de fijacion a la biotina u otras moleculas de fijacion a la biotina. En otra alternativa relacionada con este aspecto, los derivados de la biotina fotoaactivables o compuestos relacionados son utilizados para derivatizar celulas de interes en dicha aplicacion. Como alternativa, en otros aspectos, las celulas de interes son alteradas mediante la adicion o la asociacion de sustancias o compuestos qmmicos antes de ser sometidas a una seleccion y modificacion. En un caso de este tipo, por tanto, una forma de realizacion de los procedimientos y aparatos descritos en la presente memoria, utiliza la alteracion de la sustancia anadida sobre celulas seleccionadas para permitir la diferenciacion de dichas celulas respecto de otras de la poblacion. Por ejemplo, y unicamente con fines explicatorios y de clarificacion, en un aspecto, todas las celulas de la poblacion son derivatizadas por la adicion de un compuesto qmmico fotolabil antes del analisis y, en un aspecto, unas celulas espedficas son elegidas como objetivo para la modificacion y utilizando la fuente de energfa del aparato para modificar el compuesto qmmico fotolabil sobre estas celulas.

En algunas formas de realizacion de un citometro (vease la Fig. 1), las celulas pasan al interior de una camara de interrogacion o analisis, cubeta, corriente u otra posicion o region de analisis de la forma usual, conocida en la tecnica, para el analisis y / o la seleccion citometrica de flujo. El citometro identifica las celulas mediante sus propiedades medidas segun lo antes descrito, incluyendo, sin limitacion, propiedades tales como la fluorescencia y / o la distersion lummica, que cuenten con una propiedad deseada o que no cuenten con una propiedad deseada en la preparacion final. Un flujo de fluido conduce las celulas a traves de la region del citometro y, en un aspecto, pasan uno o mas haces de rayos laser, detectores y / u otros aparatos que detectan las cantidades y las calidades de las celulas. En un aspecto de este tipo, el flujo de fluido desplaza las celulas hacia un elemento optico que incluye un eje geometrico genericamente coaxial alineado con el flujo de fluido. A modo de ejemplo y no de limitacion, el elemento optico puede incluir una lente, por ejemplo una lente de objetivo y / o puede incluir uno o mas detectores, haces de rayos laser y / u otras fuentes de energfa. La luz y / o la energfa que pasa entre las celulas y los detectores, los haces de rayos laser y / u otras fuentes de energfa puede pasar a traves del elemento optico (por ejemplo, la lente de objetivo) que esta genericamente alineada de manera coaxial con el flujo de las celulas a traves de la porcion relevante del citometro. La posicion de cada celula en el citometro en cualquier momento, en un aspecto, se determina directa o indirectamente y / o se estima a partir de la velocidad de la celula o del fluido que pasa a traves de la porcion relevante del instrumento. Una celula que ha pasado alguna o toda(s) la(s) posicion(es) de analisis en la region es, en un aspecto, identificada como que ofrece una propiedad deseada o que no ofrece una propiedad deseada en la preparacion final. Dicha determinacion se efectua, en un aspecto, mediante un ordenador y / o analogico y / o electrico digital o electronico y / o un software y / o un dispositivo o unos dispositivos de analisis de datos por hardware de ordenador. Dicho dispositivo compara las propiedades individuales o multiples, las mediciones y / o la caractenstica de cada celula con respecto a una o a un conjunto o grupo de propiedades, mediciones, y / o caractensticas definidas por el operador del aparato. Como alternativa, las propiedades con las cuales las propiedades medidas deben ser comparadas son, en un aspecto, determinadas automaticamente utilizando algoritmos o programas incluidos en o con el citometro.

El conjunto de propiedades con respecto a las cuales las celulas medidas en el citometro son comparadas, en un aspecto, define una o mas subpoblaciones de celulas de interes que presentan una propiedad deseada o que no presentan ninguna propiedad deseada en la preparacion de las celulas. La determinacion de si una celula que esta pasando a traves de la region de analisis del instrumento es un miembro de una subpoblacion concreta de celulas de interes es, en un aspecto, llevada a cabo rapidamente de manera que el estado de la celula que presenta una propiedad deseada o que no presentan una propiedad deseada en la preparacion de la celula se determina en el momento en que la posicion de la celula del sistema de flujo del instrumento es determinado, en ciertos aspectos, generalmente inferior a un segundo despues de la entrada en la region de analisis del instrumento. Una vez que se ha efectuado la determinacion, las celulas, en un aspecto, son accionadas por una energfa o fuerza que se transmite de manera selectiva sobre las celulas que satisfacen o no satisfacen los criterios de seleccion. La fuerza o energfa en diversos aspectos desactiva, incapacita, perturba, desarticula, fragmenta o de cualquier otra forma altera las celulas de interes con respecto a una propiedad deseada que es relevante para una aplicacion posterior opcional, o la fuerza o energfa en aspectos alternativos modifica y / o derivatiza o provoca que las celulas de interes sean derivatizadas de una forma que permita la separacion o diferenciacion posteriores de una o mas subpoblaciones de celulas de interes en la preparacion.

Dicha fuerza o energfa, en diversos aspectos, es transmitida por uno o mas laseres u otra luz y / o fuentes electromagneticas dirigidas hacia el emplazamiento de las celulas en la corriente que fluye, de tal manera que la fuente de energfa puede ser rapidamente desviada, desenfocada o desactivada para permitir el paso de celulas que no sean seleccionadas para su modificacion. Por ejemplo y solamente con fines de clarificacion y analisis, una energfa elevada y / o un laser de intensidad elevado, capaz de ser rapidamente pulsado o encendido y apagado, expone las celulas seleccionadas a una radiacion perjudicial convirtiendolas en disfuncionales en el contexto de cualquier uso deseado. En algunos aspectos, la fuerza de energfa pasa a traves de un elemento optico alineado generalmente de forma coaxial con el citometro. En cualquier caso, las celulas, tanto las seleccionadas como las sometidas a la fuerza de modificacion o a la energfa, y aquellas no seleccionadas y no sometidas a la fuerza o energfa, continuan hasta migrar con el flujo celular y salir de la region del aparato en la que se lleva a cabo la medicion de las propiedades celulares y la modificacion de las celulas seleccionadas. El producto efluente es recogido y contiene tambien celulas modificadas y no modificadas, en determinados aspectos, fragmentos o residuos de celulas asf como fluido, soluciones y / o tampones utilizados en el proceso en diversos aspectos, el producto de salida es utilizado asf mismo en esta forma o, en otros aspectos, es concentrado, fraccionado o de cualquier otra forma tratado posteriormente para conseguir las propiedades y / o la composicion deseadas.

Las Figs. 2 - 5 representan diversas formas de realizacion de un citometro de flujo de seleccion de acuerdo con los procedimientos y los aparatos descritos. La Fig. 2 representa en concreto una forma de realizacion de una via 110 de flujo basico del referido citometro. Un tubo 112 de entrada del fluido de vaina posibilita que el fluido de vaina presurizado entre en la via 110 de flujo en una entrada 114 de fluido de vaina, creando un flujo 116 de fluido de vaina a traves de la via 110 de flujo. Corriente abajo de la entrada 114 de fluido de vaina y, de modo preferente, en una region de suave flujo laminar del fluido de vaina, un tubo 118 de entrada de fluido de analito permite una corriente 120 de fluido de analito (esto es, un fluido en el que un analito es suspendido, transportado, etc.) hasta entrar en la via 110 de flujo a traves de la entrada 122 del analito. En algunas formas de realizacion, la entrada 122 del analito esta dispuesta en posicion central dentro del flujo 116 del fluido de vaina y / o en posicion central dentro de la via 110 de flujo, y orientada de tal manera que la corriente 120 del fluido de analito se situe en paralelo con el flujo 116 del fluido de vaina cuando el fluido del analito entre en la via 110 de flujo. Por supuesto, la entrada 122 del analito no necesita estar en posicion central respecto ya sea del flujo 116 del fluido de vaina o de la via 110 de flujo, y el experto en la materia podna contemplar formas de realizacion en las que la corriente 120 del fluido de analito sea distinta de la paralela con respecto al flujo 116 del fluido de vaina cuando la corriente 120 del fluido de analito entra en la via 110 de flujo. El caudal y la presion del flujo 116 del fluido de vaina con respecto a la corriente 120 del fluido de analito comprime y constrine la corriente 120 del fluido de analito para que se estreche con respecto al flujo 116 del fluido de vaina. El flujo 116 del fluido de vaina y la corriente 120 del fluido de analito se combinan para formar un flujo 123 de muestra.

La via 110 de flujo puede cambiar de direccion en una region 124 pero, de modo preferente, a continuacion incluye una region 126 libre tanto de obstaculos como de cambios abruptos en la direccion del flujo, que sirven para estabilizar el flujo 123 de muestra antes de que el flujo 123 de muestra alcance un area 128 de interrogacion (esto es, un area de observacion, un area de analisis, un punto focal nominal, etc.). La via del flujo 123 de muestra a traves de la via 110 de flujo define un eje geometrico 130 de flujo. En algunas formas de realizacion, la corriente 120 del fluido de analito asf, en particular, los analitos (esto es, las celulas) dentro de la corriente 120 del fluido de analito generalmente se desplaza a traves de la via 110 de flujo a lo largo del eje geometrico 130 del flujo.

Despues de alcanzar y / o pasar a traves del area 128 de interrogacion, el flujo 123 de muestra se desvfa. En algunas formas de realizacion, la via 110 de flujo cambia las direcciones en una esquina 132 (indicada en la Fig. 2 por una lmea discontinua). En otras formas de realizacion, el flujo 123 de muestra tropieza con un flujo 134 transversal cuando llega hasta un extremo 136 de la region 126. El flujo 134 transversal redirige el flujo 123 de muestra. En algunas formas de realizacion, la esquina 132 o el flujo 134 transversal determina un cambio de 90 grados en la direccion del flujo 123 de muestra. Sin embargo, el flujo 123 de muestra puede, en formas de realizacion alternativas, variar en mas o en menos en 90 grados. En cualquier caso, despues del cambio de direccion, el flujo 123 de muestra puede fluir hacia un receptaculo 138 de recogida, y puede pasar a traves de uno o mas elementos 140 de via de flujo (por ejemplo, reguladores del flujo, filtros, etc.) antes de alcanzar el receptaculo 138 de recogida.

Una lente 142 de objetivo dispuesta generalmente en o cerca de la esquina 132 o en o cerca de la interseccion del flujo 123 de muestra con el flujo 134 transversal opera para crear un punto focal (no mostrado) dentro del area 128 de interrogacion. Un eje geometrico 144 optico de la lente 142 de objetivo esta alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico 130 de flujo de la via 110 de flujo cuando la via 110 de flujo pasa a traves del area 128 de interrogacion. Por supuesto, el eje geometrico 144 optico y el eje geometrico 130 de flujo no requieren que sean perfectamente coaxiales y pueden variar de manera que el eje geometrico 144 optico sea paralelo a y desplazado del eje geometrico 130 de flujo, de modo que el eje geometrico 144 optico este en angulo oblicuo con respecto al eje geometrico 130 de flujo, etc.

La Figura 3 ilustra un citometro 1501 ejemplar de flujo de seleccion que incluye diversas caractensticas de los procedimientos y aparatos descritos. De modo similar a la forma de realizacion de la via 110 de flujo representada en la Fig. 2, la Fig. 3 representa el tubo 112 de entrada del flujo de vaina y el tubo 118 de entrada del fluido de muestra, que introduce, respectivamente, el flujo 116 del fluido de vaina y la corriente 120 del fluido de analito a traves de la entrada 114 del fluido de vaina y de la entrada 122 del fluido de analito. En particular, el fluido de analito representado en la Fig. 3 incluye unas celulas 150 espermaticas de mairnfero y una solucion 152 tampon que conduce las celulas 150 espermaticas de mamffero. Cuando el flujo 116 del f luido de vaina y el flujo 120 del fluido de analito se fusionan para formar el flujo 123 de muestra, los respectivos caudales provocan que las celulas 150 formen una corriente de una generica sola fila y alineen su eje geometrico longitudinal (esto es, a lo largo de la extension de la cola de las celulas) con la direccion del flujo 123 de muestra.

Todavfa con referencia a la Fig. 3, una forma de realizacion de un citometro de flujo de seleccion incluye un primer analisis y un segundo analisis. Cuando las celulas 150 avanzan a traves de la via 110 de flujo con el flujo 123 de muestra, el primer analisis puede determinar si las celulas son de interes, puede determinar la velocidad a la que se estan desplazando las celulas a traves de la via 110 de flujo, puede determinar si en un punto determinado del flujo 123 de muestra, las celulas 150 estan demasiado proximas entre sf para uno o mas posteriores analisis, si las celulas 150 estan orientadas de cola o de cabeza, etc. En la forma de realizacion representada por la Fig. 3, el primer analisis se produce cuando las celulas 150 alcanzan un punto 154 de la via 110 de flujo. Una primera fuente 156 de iluminacion del primer analisis dirige una energfa 158 hacia el punto 154. La energfa 158 puede interactuar con cada celula 150 para dispersar la energfa 158 o para de otra forma interactuar con la celula 150, con un anticuerpo asociado con la celula 150, con un fluorocromo (por ejemplo, fluorescema) asociado con la celula 150, etc. Un detector 160 puede detectar la energfa 162 resultante (por ejemplo, la energfa dispersada, la senal fluorescente resultante, etc.) y enviar una correspondiente senal por medio de una conexion 164 hacia un controlador 166. El detector 160 puede estar dispuesto en cualquier emplazamiento apropiado para detectar la energfa 162, por ejemplo en angulo oblicuo desde el punto 154 (con respecto a la fuente 156 de la energfa de iluminacion) o en lmea con el punto 154. La fuente 156 de iluminacion del primer analisis es, de modo preferente, un laser de 488 nm, pero puede comprender cualquier fuente de energfa apropiada para las mediciones contempladas en el primer analisis. La fuente 156 de iluminacion del primer analisis puede estar orientada de manera que la energfa 158 se desplace perpendicularmente con respecto al flujo 123 de muestra o puede, como alternativa, estar orientada de manera que la energfa 158 incida sobre las celulas 150 en angulo oblicuo con respecto a la direccion del flujo 123 de muestra. Ademas, la energfa 158 y / o la energfa 162 puede atravesar uno o mas elementos opticos (no mostrados) tales como filtros, lentes, etc., los cuales pueden hacer posible que uno u otro o ambos entre la fuente 156 de energfa de iluminacion y el detector 160 queden situados de manera diferente representada mediante la creacion de una via optica diferente, como es generalmente conocido en la tecnica.

Algunas formas de realizacion pueden prescindir del primer analisis. Por ejemplo, la informacion e x ^ d a del segundo analisis (descrita con detalle mas adelante) puede resultar suficiente tanto para determinar cuales sean las celulas de interes como para distinguir entre las celulas de las subpoblaciones deseadas y no deseadas. Asf, los elementos 154 - 164 pueden omitirse en algunas formas de realizacion. Como alternativa, algunas formas de realizacion pueden incluir dos o mas primeros analisis y, por consiguiente, dos o mas conjuntos de elementos 154 -164. Por ejemplo, y sin limitacion, el flujo 123 de muestra puede incluir uno o mas marcadores (por ejemplo, incluidos en el flujo 116 de vaina, fijados o de cualquier otra forma asociados con algunas celulas 150 dentro de la corriente 120 de muestra, etc.). Un primer analisis basico puede detectar uno de los marcadores en un primer punto, y un primer analisis secundario puede detectar el marcador en un segundo punto para determinar el caudal de celulas del flujo 123 de muestra.

En cualquier caso, el flujo 123 de muestra avanza despues de que el primer analisis conduzca a las celulas 150 a lo largo de la via 110 de flujo. Las celulas 150 pasan a traves de un punto 170, el segundo analisis caracteriza las celulas 150, segun se describe mas adelante, para determinar si procede modificar cada celula 150. Cuando cada celula 150 alcanza el punto 170, una segunda fuente 172 de iluminacion del segundo analisis dirige la energfa 174 hacia el punto 170. La energfa 174 puede interactuar con la celula 150, con un anticuerpo asociado con la celula 150, con un fluorocromo (por ejemplo, una tincion Hoechst) asociado con la celula 150 o con el ADN del interior de la celula 150, etc. En algunas formas de realizacion, la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis es un laser ultravioleta que emite la energfa 174 en forma de radiacion ultravioleta que interactua con partfculas de la tincion Hoechst fijada al ADN dentro de la celula 150 para provocar una fluorescencia proporcional con el contenido del ADN de la celula 150, como es bien sabido en la tecnica. La fuente 172 de iluminacion del segundo analisis puede estar orientada de manera que el haz 174 sea perpendicular al flujo 123 de muestra, como se representa en la Fig. 3. Sin embargo, la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis puede tambien estar situada en angulo oblicuo con respecto al flujo 123 de muestra. Ademas, la energfa 174 puede pasar a traves de uno o mas elementos (no mostrados), por ejemplo filtros, lentes, etc. que pueden posibilitar que la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis quede situada de manera diferente a la representada mediante la creacion de una via optica que no sea recta.

La interaccion de la energfa 174 con la celula 150 o con los elementos situados dentro de la celula 150, provoca que la energfa 176 resultante irradie desde la celula 150. La lente 142 de objetivo, situada de manera que el eje geometrico 144 de la lente 142 de objetivo sea genericamente coaxial con el flujo 123 de muestra opera para focalizar la energfa 176. Un punto 178 focal de la lente 142 de objetivo esta situada genericamente en el punto 170, pero puede estar situado para detectar la energfa 176 resultante procedente de la celula 150 ligeramente despues de que la energfa 174 ilumine la celula 150 (esto es, el punto 178 focal puede situarse ligeramente mas proximo a la lente 142 de objetivo que el punto 170). Un detector 180 situado para recibir una energfa 182 focalizada por la lente 142 de objetivo detecta la energfa 182 focalizada a partir de la celula 150, y envfa una senal correspondiente por medio de una conexion 184 al controlador 166. Por supuesto, uno o mas elementos opticos, por ejemplo un filtro 186 pueden actuar para alterar o redirigir la energfa 182 entre la lente 142 de objetivo y el detector 180. En algunas formas de realizacion, la lente 142 de objetivo crea el punto 178 focal antes de la esquina 132 o de la convergencia del flujo 134 transversal y del flujo 123 de muestra. En otras formas de realizacion, la lente 142 de objetivo crea un punto focal (no mostrado) en o cerca de la esquina 132 o en la convergencia del flujo 134 transversal y el flujo 123 de muestra.

El controlador 166, que puede incluir o mas microprocesadores 188, uno o mas osciladores 190 de cristal, una o mas memorias 192 que almacenan una o mas rutinas 194, etc., interpreta las senales recibidas del detector 160 y / o del detector 180 para determinar, para cada celula 150, si la celula 150 es parte de una subpoblacion deseada de celulas. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, las celulas 150 son celulas espermaticas de mairnfero, y el controlador 166 interpreta las senales recibidas del detector 180 para determinar si cada celula 150 esta cargada con un cromosoma X o con un cromosoma Y. Como es sabido por los expertos en la materia, en celulas espermaticas de marnffero los cromosomas Y generalmente contienen menos ADN que los cromosomas X. Por consiguiente, analizando la fluorescencia (esto es, la energfa 176 resultante) emitida por la tincion de la celula 150 tras la iluminacion por la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis, el controlador 166 puede generalmente determinar si la celula 150 acarrea un cromosoma X o un cromosoma Y. En algunas formas de realizacion, una de las rutinas 194 supervisa continuamente la distribucion estadfstica de las senales fluorescentes detectadas para mejorar con el paso del tiempo la precision de la determinacion.

Continuando con la referencia a la Fig. 3, en algunas formas de realizacion, el controlador 166, de acuerdo con la determinacion de si una celula 150 es parte de una subpoblacion deseada, emite una senal hacia una fuente 196 de energfa controlable por medio de una conexion 198. La fuente 196 de energfa controlable puede emitir una energfa 197 dirigida en un punto 199 en el flujo 123 de muestra. En algunas formas de realizacion, el controlador 166 opera para coordinar la senal hacia la fuente 196 de energfa controlable y / o el punto 199 es seleccionado (por ejemplo, apuntando, mediante una o mas lentes, espejos, etc.) de acuerdo con la velocidad a la cual la celula 150 se desplaza a traves de la via 110 de flujo. En algunas formas de realizacion, el punto 199 puede ser situado antes de que la esquina 132 o que la convergencia del flujo 134 transversal y el flujo 123 de muestra, para simplificar la determinacion de la posicion de la celula 150 que se desplaza a lo largo de la via 110 de flujo. En otras formas de realizacion, el punto 199 puede estar situado despues de la esquina 132 o puede estar situado en o despues de la convergencia del flujo 134 transversal y el flujo 123 de muestra. En el ejemplo anterior, el controlador 166 puede emitir una senal para provocar que la fuente 196 de energfa controlable emita la ene^a 197 en respuesta a una determinacion de que la celula l5o esta cargada con un cromosoma X o en respuesta a una determinacion de que la celula 150 esta cargada con un cromosoma Y. Como alternativa, el controlador 166 puede emitir una senal para provocar que la fuente 196 de energfa controlable detenga la energfa 197 de emision en respuesta a una determinacion de que la celula 150 incorpora un cromosoma X o en respuesta de la determinacion de que la celula 150 incorpora un cromosoma Y. La energfa 197 emitida desde la fuente 196 de energfa controlable puede actuar para inhabilitar la celula 150 o hacer que la celula 150 no sea viable (por ejemplo, modificando los componentes o sustancias qmmicas celulares como por ejemplo las protemas, el ADN y las sustancias implicadas en el metabolismo celular; provocando la perturbacion, el calentamiento, la cavitacion o las explosiones en o cerca de la celula 150; provocando la permeabilizacion o la perforacion de la celula 150; y / o provocando la destruccion, la fragmentacion o la alteracion morfologica de la celula 150), puede actuar para alterar ( por ejemplo interactuando con una sustancia qmmica incluida en o fijada a un componente celular) la celula de manera que pueda mas tarde ser identificada y / o suprimida de la subpoblacion deseada de celulas 150 o puede actuar para afectar de manera favorable a la celula. En algunas formas de realizacion, la fuente 196 de energfa controlable es un laser y, en particular, puede ser una energfa de emision de rayos laser en las partes visibles o de infrarrojo del espectro. En algunas formas de realizacion, el laser emite energfa con una longitud de onda de 690 nm. En otras formas de realizacion, la fuente 196 de energfa controlable puede emitir otros tipos de longitudes de onda de radiacion, por ejemplo rayos X, microondas, luz visible, luz infrarroja, luz ultravioleta, o cualquier otro tipo de energfa que produzca un efecto deseado sobre una celula 150. Por supuesto en respuesta a la determinacion de si una celula es parte de una subpoblacion deseada, el controlador 166 puede: (1) emitir la energfa 197 para afectar de manera negativa a las celulas 150 determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada (aunque dejando libres las celulas 150 determinadas como formando parte de la subpoblacion deseada); (2) puede emitir la energfa 197 para afectar positivamente a las celula 150 determinadas como que forman parte de la subpoblacion deseada (aunque prescindiendo de las celulas 150 determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada); (3) puede dejar de emitir la energfa 197 para evitar afectar positivamente a las celulas 150 determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada (aunque continuando la emision de la energfa 197 para afectar positivamente a las celulas 150 determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada); o (4) puede dejar de emitir la energfa 197 para evitar afectar negativamente a las celulas 150 determinadas como formando parte de la subpoblacion deseada (aunque continuando emitiendo la energfa 197 para afectar negativamente a las celulas 150 determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada). Ademas, en algunas formas de realizacion, el controlador 166 puede tratar celulas 150 indeterminadas (por ejemplo, las celulas 150 respecto de las cuales el controlador 166 no puede efectuar una determinacion, las celulas 150 que estan demasiado proximas entre sf, etc.) de la misma manera en la que el controlador 166 trata las celulas determinadas como que no forman parte de la subpoblacion deseada.

La Fig. 4 ilustra un citometro 200 de flujo ejemplar de seleccion que incluye diversas caractensticas de los aparatos y procedimientos descritos. En particular, el citometro 200 de flujo de seleccion representado en la Fig. 4, prescinde del primer analisis y, por consiguiente, los elementos 154 - 164 no aparecen. Sin embargo, aunque no se ilustra, los expertos en la materia apreciaran que puede incluirse el primer analisis, si se desea, en la forma de realizacion ilustrada en la Fig. 4. Como en la forma de realizacion representa en la Fig. 3, el flujo 123 de muestra conduce las celulas 150 a lo largo de la via 110 de flujo. Cuando las celulas 150 pasan a traves del punto 170, el segundo analisis (el cual, en la representacion de la Fig. 4, no sigue ningun primer analisis) caracteriza las celulas 150, segun lo antes descrito, para determinar la necesidad de modificar cada celula 150. Esto es, cuando cada celula 150 alcanza el punto 170, la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis dirige la energfa 174 hacia el punto 170, y la energfa 174 interactua con la celula 150, segun lo antes descrito. Por supuesto, la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis puede ser un laser ultravioleta y la energfa 174 puede interactuar con las moleculas de la tincion Hoechst 33342 fijadas al ADN del interior de la celula 150. La fuente 172 de iluminacion del segundo analisis puede estar orientada de modo que el haz 174 sea perpendicular al flujo 123 de muestra, como se representa en la Fig. 4. Sin embargo, la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis puede situarse tambien en angulo oblicuo con respecto al flujo 123 de muestra. Ademas, la energfa 174 puede pasar a traves de uno o mas elementos opticos (no mostrados) por ejemplo filtros, lentes, etc., lo que puede posibilitar que la fuente 172 de iluminacion del segundo analisis quede situada de manera diferente a la representada mediante la creacion de una via optica que no sea recta.

La energfa 176 resultante que irradia de la celula 150 se propaga hacia la lente 142 de objetivo, la cual esta situada de tal manera que el eje geometrico 144 optico (vease la Fig. 3) de la lente 142 de objetivo sea genericamente coaxial con el flujo 123 de muestra y opere para focalizar la energfa 176. El punto 178 focal de la lente 142 de objetivo esta situado genericamente en el punto 170 pero, como alternativa, puede estar situado para detectar la energfa 176 restante procedente de la celula 150 ligeramente despues de que la energfa 174 ilumine la celula 150. Uno o mas elementos opticos pueden dirigir la energfa 182 focalizada desde la lente 142 de objetivo hasta el detector 180. Por ejemplo, en la forma de realizacion representada en la Fig. 4, la energfa 182 focalizada pasa a traves de un divisor 202 de haz y del filtro 186 antes de llegar al detector 180. Otros elementos opticos (por ejemplo, lentes, espejos, filtros, etc.) pueden tambien afectar a la trayectoria de la energfa 182 focalizada entre la lente 142 de objetivo y el detector 180. Como en la forma de realizacion representada en la Fig. 3, en algunas formas de realizacion, la lente 142 de objetivo crea el punto 178 focal antes de la esquina 132 o de la convergencia del flujo 134 transversal y del flujo 123 de muestra. En otras formas de realizacion, la lente 142 de objetivo crea un punto focal (no mostrado) en o cerca de la esquina 132 o en la convergencia del flujo 134 transversal y el flujo 123 de muestra.

El controlador 166, segun lo antes descrito con respecto a la Fig. 3, opera para interpretar las senales recibidas (por medio de la conexion 184) a partir del detector 180 (y el detector 160 si el citometro 200 incluye el primer analisis) para determinar, para cada celula 150, si la celula 150 es parte de una subpoblacion de celulas deseada (por ejemplo, celulas espermaticas con un cromosoma X). El controlador 166 emite una senal sobre una conexion 206 hacia una fuente 204 de energfa controlable. La fuente 204 de energfa controlable opera de la misma manera que la fuente 196 de energfa controlable (Fig. 3). Sin embargo, en la forma de realizacion representada en la Fig. 4, la energfa 208 emitida por la fuente 204 de energfa controlable pasa a traves de la lente 142 de objetivo despues de pasar, en algunas formas de realizacion, a traves de uno o mas elementos opticos, por ejemplo un filtro 216. La lente 142 de objetivo opera para focalizar la energfa 208 en un punto 210 focal. En algunas formas de realizacion, la lente 142 de objetivo puede enfocar la energfa 208 procedente de la fuente 204 de energfa controlable de manera que la energfa 212 focalizada sea genericamente coaxial con el flujo 123 de muestra y de manera que el punto 210 quede situado mas cerca de la lente 142 de objetivo que el punto 170.

Los expertos en la materia apreciaran que existen multiples procedimientos para crear tanto el punto 210 focal como el punto 178 focal utilizando la misma lente. La Fig. 7 representa un procedimiento que el citometro 200 podna emplear para crear el punto 178 focal para la energfa 176 y el punto 210 focal para la energfa 212. La Fig. 7 representa que cuando la energfa 176 (indicada mediante lmeas continuas en la Fig. 7) pasa a traves de una lente 214 de la lente 142 de objetivo (no mostrada en la Fig. 7) desde el punto 178 focal (esto es, desde la celula 150 en el punto 170), la lente 214 actua sobre la energfa 176 de manera que los rayos de la energfa 176 son paralelos cuando salen de la lente 214. Por el contrario, los rayos de la energfa 208 son ligeramente convergentes cuando inciden sobre la lente 214 y, por consiguiente, convergen en el punto 210 focal despues de pasar por la lente 214. Por supuesto, existen otros procedimientos para crear tanto el punto 178 focal como el punto 210 focal, incluyendo el aprovechamiento del hecho de que diferentes longitudes de onda de energfa pueden refractar de manera diferente a traves del mismo material, o empleando lentes multifocales a modo de ejemplo y no de limitacion, las descritas en la patente estadounidense No. 6,010,647.

Con fines ilustrativos, la Fig. 5 representa otra forma de realizacion ejemplar de un citometro 220 de flujo de seleccion. El citometro 220 de flujo de seleccion incluye una via 110 de flujo como se describe en terminos generales en las Figs. 3 y 4. De modo similar al citometro 200 de flujo de seleccion representado en la Fig. 4, el citometro 220 de flujo de seleccion omite el primer analisis (asf como el equipamiento asociado con el primer analisis). El flujo 123 de muestra y, en particular, las celulas 150, fluyen hacia la lente 142 de objetivo. Como en las formas de realizacion anteriormente descritas, la lente 142 de objetivo crea un punto 178 focal en un punto 170 en la via 110 de flujo. La energfa 176 procedente de la celula 150 cuando la celula 150 llega hasta el punto 170, pasa a traves de la lente 142 de objetivo, la lente 142 de objetivo que esta situada de manera que el eje geometrico 144 optico de la lente 142 de objetivo es genericamente coaxial con el flujo 123 de muestra y opera para focalizar la energfa 176. El punto 178 focal de la lente 142 de objetivo esta situado genericamente en el punto 170 pero, como alternativa, puede estar situado para detectar la energfa 176 resultante procedente de la celula 150 ligeramente despues de que la energfa 174 ilumine la celula 150. Uno o mas elementos opticos (por ejemplo el divisor 202 de haz, el filtro 186, etc.) pueden dirigir la energfa 182 focalizada desde la lente 142 de objetivo hasta el detector 180.

De nuevo con referencia a la Fig.5, el citometro 220 de flujo de seleccion representado incluye una fuente 222 de iluminacion de segundo analisis. La fuente 222 de iluminacion del segundo analisis emite la energfa 224, la cual puede ser la energfa 174 ultravioleta. La energfa 224 emitida a partir de la fuente 222 de iluminacion del segundo analisis se desplaza a traves de una via optica hacia la lente 142 de objetivo. La lente 142 de objetivo puede focalizar la energfa 224 sobre el punto 178 focal y, de esta manera, las trayectorias opticas de la energfa 176 y de la energfa 224 pueden superponerse hasta cierto punto. Diversas disposiciones de otros elementos opticos, por ejemplo el divisor 202 de haz y un filtro 226 pueden operar para dirigir la energfa 224 desde la fuente 222 de iluminacion del segundo analisis hasta la lente de objetivo y para dirigir la energfa 176 (desde la celula 150) desde la lente 142 de objetivo hasta el detector 180.

El controlador 166, segun lo antes descrito con respecto a las Figs. 3 y 4, opera para interpretar las senales recibidas (por medio de la conexion 184) procedentes del detector 180 (y del detector 160 si el citometro 200 incluye el primer analisis) para determinar, para cada celula 150, si la celula 150 es parte de una subpoblacion de celulas deseada. El controlador 166 emite una senal sobre una conexion 230 hacia una fuente 228 de energfa controlable. La fuente 228 de energfa controlable opera de la misma manera que la fuente 196 de energfa controlable (Fig. 3), emitiendo la energfa 232 dirigida en un punto 234.

Las Figs. 6A y 6B representan las porciones 235A y 235B, respectivamente, de otras formas de realizacion adicionales de un citometro de flujo de acuerdo con los procedimientos y aparatos contemplados. En cada una de las Figs. 6A y 6B, las celulas 236 se desplazan dentro de una corriente 237 a traves de una via 238 de flujo, via 238 de flujo que cambia la trayectoria en o alrededor de un punto 239, como se describio con respecto a la Fig. 2. La modelacion de los fluidos de y / o la formacion precisa de la via 238 de flujo y / o la corriente 237 de las celulas 236 a traves de la via 238 de flujo y / o la inclusion de elementos adicionales (no mostrados) para supervisar la posicion de las celulas 236, puede mejorar la incertidumbre en otro caso provocada por el cambio de la trayectoria en o alrededor del punto 239. De esta manera, la posicion y la identidad de las celulas individuals puede permanecer determinable despues de que la trayectoria cambie. La Fig. 6A representa una forma de realizacion en la que una fuente 240 de energfa controlable, que opera de la misma manera descrita con respecto a las Figs. 3, 4 y 5 (196, 204 y 228, respectivamente) esta situada de manera que la energfa 241 emitida incida sobre las celulas 236 despues de que las celulas 236, se desplacen mas alla del punto 239 en la via 238 de flujo. La Fig. 6A representa la energfa 241 desplazandose en perpendicular con respecto a la direccion en la que las celulas 236 fluyen a traves de la via 238 de flujo. Por supuesto, se puede apreciar que la fuente 240 de energfa controlable puede, como alternativa, estar situada de manera que la energfa 241 emitida se desplace genericamente de forma coaxial con la direccion en la que las celulas 236 fluyen a traves de la via 238 de flujo (por ejemplo, cambiando de nuevo la direccion de flujo y posicionando la fuente 240 de energfa controlable de manera que las celulas 236 de la via 238 de flujo se desplacen hacia la fuente 240 de energfa controlable).

Se debe apreciar que un citometro de flujo de seleccion de acuerdo con los procedimientos y aparatos contemplados, puede, como alternativa, emplear una configuracion de "chorro en aire", como se representa en la Fig. 6B. La Fig. 6B representa una tobera 242 que emite una corriente 243 de gotmulas 244. Una fuente de energfa controlable (no mostrada) altera de manera selectiva las gotmulas confiriendo una carga a una o mas de las gotmulas 244. A continuacion, y a modo de ejemplo y no de limitacion, un par de placas 245 electricamente cargadas pueden seleccionar la corriente 243 de gotmulas 244 dentro de unos receptaculos 246 de acuerdo con una determinacion mediante un detector (no mostrado), segun lo antes descrito.

La Fig. 8A representa la lente 142 de objetivo y una porcion de la via 110 de flujo que incluye la region 128 de interrogacion. Como es generalmente sabido, uno o mas elementos 250 de lente (por ejemplo, una lente delantera hemisferica, una lente del tipo menisco, etc.) actuan para crear un punto 252 focal nominal. En las formas de realizacion descritas con anterioridad con respecto a las Figs. 3 - 5, el punto 252 focal nominal esta dentro del flujo 123 de muestra y, en particular, dentro de la via de las celulas 150 a traves de la via 110 de flujo. El punto 252 focal nominal define un vertice de un volumen 254 genericamente conico entre el punto 252 focal nominal y un elemento 256 exterior de la lente 142 de objetivo que forma una base 253 del volumen 254 conico. El volumen 254 conico puede ser un volumen conico circular recto, pero puede tambien ser un volumen conico oblicuo. Un eje geometrico 258 del cono es genericamente coaxial con un eje geometrico 260 de la lente 142 de objetivo en formas de realizacion en las cuales el volumen 254 conico es un volumen conico circular recto. En dichas formas de realizacion los ejes geometricos 258 y 260 son tambien coaxiales con el eje geometrico de flujo 262 dentro de la via 110 de flujo, eje geometrico de flujo 262 que genericamente define la via que las celulas 150 recorren dentro de la via 110 de flujo.

En algunas formas de realizacion, el punto 252 focal de la lente 142 de objetivo es tal que el numero de interconexiones a traves de las cuales la superficie 264 lateral del volumen 254 conico pasa, resulta minimizado. Por ejemplo, y con referencia a la Fig. 8A, la pared 268A de la via de flujo forma una via 270A transversal genericamente cilmdrica y la pared 268B de la via de flujo forma una via 270B de flujo genericamente cilindrica que es genericamente coaxial con el eje geometrico del volumen 254 conico. El volumen 254 conico en la Fig. 8A pasa a traves unicamente de dos interconexiones cuando entra en y sale del material que comprende la pared 268A. El volumen 254 conico pasa a traves de una interconexion 272 entre el aire 276 y el material que comprende la pared 268A y a traves de una interconexion 274 entre el material que comprende la pared 268A y el fluido 278 de la via 110 de flujo. Ademas en algunas formas de realizacion, la pared 268A de la via 110 de flujo a traves de la cual pasa la superficie 264 lateral puede ser genericamente paralela a la base 253 del volumen 254 conico. Esto simplifica las interconexiones a traves de las cuales la energfa focalizada por la lente 142 de objetivo debe pasar (esto es, la energfa no pasa a traves de cualquier superficie curvilmea), cada una de dichas interconexiones puede, debido a la refraccion, afectar al punto 252 focal de la lente 142 de objetivo. Asf mismo, el volumen 254 conico puede estar formado por las secciones 255A, 255B y 255C de multiples conos 257, 259 y 261 unidos entre sf, como se muestra en la Fig. 8B, como es el caso cuando una o mas interconexiones (por ejemplo las interconexiones 272 y 274) se forman con materiales que presentan indices de refraccion diferentes.

En terminos generales, el volumen 254 conico debe pasar a traves de al menos las dos interconexiones 272 y 274. En algunas formas de realizacion de los procedimientos y aparatos descritos, la lente 142 de objetivo puede tener en cuenta una o mas de las interconexiones, por ejemplo para dar respuesta a un grosor y a un mdice de refraccion del material que forma las interconexiones (por ejemplo, la pared 268A). Ademas, en algunas formas de realizacion, la lente 142 de objetivo puede ser una lente banada en agua, y sumergida en agua, o sumergida en aceite, que utiliza un medio de inmersion (por ejemplo agua o aceite) que presenta un mdice de refraccion similar al del material que forma la interconexion (por ejemplo, la pared 268A). Asf, como se representa en la Fig. 9, algunas formas de realizacion reducen aun mas la distorsion del punto 252 focal minimizando las diferencias entre los respectivos indices de refraccion de los materiales a traves de los cuales pasa el volumen 254 conico. En la Fig. 9, por ejemplo, el volumen 254 conico puede pasar a traves del agua 280, la pared 268A, y el fluido 278 de la via 110 de flujo. La lente 142 de objetivo puede ser una lente de objetivo de inmersion en agua en la que, por ejemplo, la pared 268A sea de vidrio. Como alternativa, la lente 142 de objetivo puede ser una lente empapada en agua en situaciones en las que haya necesidad de corregir la refraccion provocada por la pared 268A, por ejemplo, cuando la pared 268A esta formada a partir de un material con un mdice de refraccion similar o igual al del fluido 278.

En otras formas de realizacion adicionales, y como se describe ampliamente en la solicitud depositada de manera conjunta (expediente de abogado no. 30752/44821), las paredes 268A y 268B de la via 110 de flujo pueden estar formadas con un material que presente un mdice de refraccion proximo del fluido 278 (esto es, un material que minimice la diferencia entre los indices de refraccion de los materiales a traves de los cuales pasa el volumen 254 conico). Por ejemplo, materiales que presenten un mdice de refraccion proximo al del agua incluyen materiales con un mdice de refraccion en el intervalo de entre 1,30 y 1,40, inclusive. Diversos materiales solidos de las familias de perfluoropolfmeros amorfos, fluoropolfmeros amorfos, y polfmeros perfluoroalcoxicos presentan unos indices de refraccion dentro de ese intervalo. A modo de ejemplo y no de limitacion, el Cytop™, fabricado por Asahi Glass Co., Ltd., y Teflon® AF y Teflon® PFA, fabricado por DuPont™, son tres materiales de este tipo.

En algunas formas de realizacion, los procedimientos o aparatos pueden tambien ajustar el mdice de refraccion del fluido 278 de manera que el mdice de refraccion del fluido 278 sea mas proximo al mdice de refraccion del material que forma las paredes 268A y / o 268B de la via 110 de flujo. En particular, los procedimientos o aparatos pueden ajustar el mdice de refraccion del fluido 278 para que se situe dentro de 0,02 del mdice de refraccion del material que forma las paredes 268A y / o 268B de la via 110 de flujo.

En algunos citometros, una porcion de la via 110 de flujo, incluyendo la region 128 de interrogacion, esta formada en un cuerpo 280, por ejemplo el cuerpo 280 mostrado en la Fig. 10. La Fig. 10 representa el cuerpo 280 como un cuboide rectangular, que presenta perforada o de cualquier otra forma conformada en su interior una porcion 281 de la via 110 de flujo. La porcion 281 incluye una primera porcion 282 de via de flujo genericamente perpendicular a una superficie 284 a traves de la cual la lente 142 de objetivo puede observar, y una segunda porcion 286 de via de flujo genericamente paralela a la superficie 284 y que cruza un extremo 288 de la primera seccion 282 de via de flujo mas proxima a la superficie 284. El cuerpo 280, el cual puede, por ejemplo, ser una cubeta, puede estar formado por un material de cuarzo pulido, vidrio, plastico u otro material generalmente conocido en la tecnica. En algunas formas de realizacion el cuerpo 280 puede estar formado, totalmente o en parte, por un material que presente un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive, por ejemplo Cytop™ o Teflon® AF.

En otra forma de realizacion, ilustrada en la Fig. 11, el cuerpo 280 incluye la porcion 281 de la via de flujo. La porcion 281 incluye la primera porcion 282 de la via de flujo genericamente perpendicular a la superficie 284 a traves de la cual la lente 142 de objetivo puede observar. Sin embargo, en la forma de realizacion representada en la Fig. 11, la segunda porcion 286 de la via de flujo forma un canal que incluye un borde 290 superior genericamente coplanar con la superficie 284. Un cubreobjetos 292 dispuesto encima de la superficie 284 puede, en algunas formas de realizacion, posibilitar el uso de una lente de objetivo corregida para su uso con dicho cubreobjeto, para eliminar o minimizar los efectos refractivos de las interconexiones entre materiales con diferentes indices refractivos.

En otras formas de realizacion adicionales, como se representa en la Fig. 12, el cuerpo 280 incluye un deposito 294 formado en la interseccion de la primera porcion 282 de la via de flujo y la segunda porcion 286 de la via de flujo. Por ejemplo, la primera porcion 282 de la via de flujo puede cruzar el deposito 294 en una superficie 296 de fondo genericamente planar que es genericamente paralela a la superficie 284. Dos partes 286A y 286B de la porcion 286 de la via de flujo pueden conectar con el deposito 294 en superficies opuestas del deposito 294, las cuales pueden genericamente tener la forma de un cilindro plano. La disposicion puede facilitar mayor flexibilidad al ajustar el punto 252 focal (Figs. 8 y 9) impidiendo, por ejemplo, que el volumen 254 conico pase a traves de la pared 286A de la via 270A de flujo transversalmente genericamente ciimdrica (Figs. 8 y 9).

La Fig. 13 representa una forma de realizacion similar en la que un borde 298 superior del deposito 294 es coplanar con la superficie 284 del cuerpo 280. Una lente de objetivo humedecida en agua (no mostrada) puede extenderse por el interior del deposito 294 y, al hacerlo, puede situarse en contacto con el fluido que fluye a traves de la via 110 de flujo, lo cual puede eliminar cualquier interconexion entre materiales de diferentes indices de refraccion.

Fig. 14 representa otra forma de realizacion adicional en la que un cubreobjetos 299 esta situado por encima del deposito al descubierto representado en la forma de realizacion de la Fig. 13.

La Fig. 15 ilustra un procedimiento 300 de seleccion de una subpoblacion deseada de celulas a partir de una muestra de celulas. En algunas forma de realizacion, el procedimiento 300 o una porcion del mismo, es almacenada en una memoria como un conjunto de instrucciones legibles por maquina que constituyen una rutina de control para uno o mas aparatos asociados. Un procesador puede leer las instrucciones dispuestas en la memoria y ejecutar las instrucciones para llevar a cabo el procedimiento 300. En otra forma de realizacion, el procedimiento 300 incluye varias rutinas, rutinas que pueden individualmente controlar uno o mas aparatos, pueden analizar los datos recogidos por los uno o mas aparatos, pueden efectuar una o mas determinaciones en base a los datos analizados, etc. Como es generalmente sabido, un tecnico o aparato puede marcar (por ejemplo aplicando una tincion Hoechst) una muestra para su analisis (por ejemplo una coleccion de celulas espermaticas) (bloque 305). El marcaje de las celulas puede llevarse a cabo dentro de un citometro de flujo de seleccion o en un proceso o procedimiento separado fuera del citometro de flujo de seleccion. Ademas, el marcado concreto de las celulas puede depender de la aplicacion citometrica.

En cualquier caso, despues del marcado de las celulas, un citometro de flujo de seleccion puede crear un flujo de fluido de vaina en una via de flujo (bloque 310). Mediante una entrada separada, el citometro de flujo de seleccion puede inyectar una muestra (esto es, las celulas marcadas) dentro de la v^a de flujo (bloque 315), de modo preferente en o cerca del centro del flujo del fluido de vaina. Tambien de modo preferente, la muestra entra en el flujo del fluido de vaina lentamente con respecto al flujo del fluido de vaina, de manera que las celulas dentro de la muestra (por ejemplo, las celulas espermaticas) se alineen con un eje geometrico largo paralelo al flujo del fluido de vaina, y de manera que las celulas fluyan dentro de un patron genericamente de hilera unica.

Cuando las celulas se desplazan a traves de una via de flujo, una fuente de energfa de excitacion, por ejemplo, un laser UV, ilumina la muestra (bloque 320). La fuente de energfa de excitacion puede continuamente iluminar la via de flujo, o una rutina que actue sobre el procesador puede controlar la fuente de energfa de excitacion para iluminar de manera selectiva la via de flujo (por ejemplo solo cuando se encuentre una muestra en la via de flujo).

Una lente de objetivo u otro medio de focalizacion opera para enfocar la energfa emitida, transmitida o reflejada a partir de cada celula (por ejemplo, luz fluorescente emitida por el marcaje) en una direccion coaxial con el flujo (bloque 325). Esto es, el flujo de vaina y la muestra combinados dentro de la via de flujo se desplazan genericamente hacia una lente de objetivo que presenta un eje geometrico optico genericamente coaxial con el flujo y , nominalmente cada celula dentro de la muestra pasa a traves de un punto focal de la lente de objetivo. Un detector recibe la energfa focalizada desde la lente de objetivo (bloque 330) y envfa una senal representativa de la energfa detectada hasta un controlador. En algunas formas de realizacion, el detector puede detectar individualmente la energfa focalizada a partir de mas de 40.000 celulas por segundo, puede detectar individualmente la energfa focalizada a partir de mas de 75.000 celulas por segundo, o puede detectar individualmente la energfa focalizada a partir de mas de 100.000 celulas por segundo.

El controlador recibe la senal representativa de la energfa detectada y analiza los datos (bloque 335) para determinar (en el bloque 340) si los datos representan una celula dentro de la subpoblacion deseada, una celula no situada dentro de la subpoblacion deseada, o una celula indeterminada que no puede determinarse como situada en la subpoblacion deseada ni determinase como situada en la subpoblacion deseada. En este ultimo caso, el controlador puede tratar la celula como si el detector determinase que la celula no se encontraba dentro de la subpoblacion deseada. Si el controlador determina que la celula no se encuentra en la subpoblacion deseada o es indeterminada, el controlador puede enviar una senal a una fuente de energfa controlable, por ejemplo un laser infrarrojo, para irradiar la celula (por ejemplo, para alterar la celula, destruir la celula, convertir en inviable la celula, etc.) (bloque 345). Como alternativa, si el controlador determina que la celula esta en la subpoblacion deseada, el controlador puede enviar una senal a la fuente de energfa controlable (o refrenar el envfo de una senal) de manera que la fuente de energfa controlable no irradie la celula (bloque 350).

El aparato puede agrupar las celulas para su uso y / o su procesamiento ulterior (por ejemplo, separacion de las celulas) al final del proceso. En algunas formas de realizacion, que pueden incluir la forma de realizacion representada en la Fig. 15, el controlador envfa una senal a la fuente de energfa controlable para mantener inalteradas (esto es, no irradiar) las celulas que se consideran dentro de la subpoblacion deseada, y la agrupacion resultante de celulas tratadas comprende una relacion de celulas de la subpoblacion deseada de celulas con respecto al total de celulas inalteradas mayor o igual a un 60%. Asf mismo, en algunas formas de realizacion, que pueden incluir la forma de realizacion representada en la Fig. 15, el controlador envfa una senal a la fuente de energfa controlable para mantener inalteradas (esto es, no irradiadas) las celulas que se ha determinado como subpoblacion deseada, y la agrupacion resultante de celulas procesadas comprende una relacion de celulas alteradas de la subpoblacion deseada con respecto a las celulas totales de la subpoblacion deseada inferior o igual a un 50%.

Por supuesto, el procedimiento descrito anteriormente refleja una o mas formas de realizacion de los procedimientos actualmente descritos, pero tambien puede abarcar una o mas etapas o rutinas adicionales, segun se ha descrito a lo largo de la presente memoria descriptiva con respecto a diversas formas de realizacion. Ademas, algunas formas de realizacion pueden omitir una o mas de las etapas o rutinas descritas con referencia al procedimiento 300. A modo de ejemplo y no de limitacion, en algunas formas de realizacion, el marcaje puede autofluorecer, eliminando asf la necesidad de iluminar la muestra con una fuente de energfa de iluminacion. Asf mismo, en algunas formas de realizacion (como se describio anteriormente), el procedimiento puede invertir los bloques 345 y 350, posibilitando que celulas determinadas que no se encuentren en la subpoblacion deseada pasen sin irradiacion por la fuente de energfa controlable, al tiempo que se determina que la fuente de energfa controlable irradie celulas que se ha determinado que se encuentren en la subpoblacion deseada.

Los procedimientos y aparatos proporcionan una pluralidad de importantes ventajas con respecto a los citometros de flujo de seleccion actualmente desarrollados. Una ventaja es que los procedimientos y aparatos actualmente descritos no someten las celulas de analitos, las cuales en algunas formas de realizacion son celulas espermaticas de mairnfero, a la configuracion de chorro en aire generalmente utilizada en citometros de flujo de seleccion. El resultado es que un citometro de acuerdo con las formas de realizacion actualmente descritas no expone las celulas de analitos al entorno circundante del citometro o a la colision resultante de la gotfcula seleccionada con un receptaculo, y no experimentan las presiones y los cambios de presiones asociados con una tobera de la configuracion de chorro en aire. Esto posibilita el uso del citometro fuera de un entorno que desarrolle unas condiciones estrictas de control de la cafda del aire y de la temperatura (por ejemplo, en el exterior de un entorno de "sala limpia"). De hecho, el propio citometro puede desarrollar el control de la temperatura para extender la viabilidad de las celulas de analitos. Ademas, los procedimientos y aparatos actualmente descritos pueden detectar y alterar las celulas de analitos mas rapido y / o con mas precision. En parte debido a la alineacion genericamente coaxial de la lente de objetivo con el flujo del analito a traves del area de interrogacion que mitiga y / o elimina los problemas asociados con la emision anisotropica de energfa procedente del analito, en particular en formas de realizacion utilizadas para seleccionar muchas tipos de celulas espermaticas de mairnfero. Tras la lectura de la presente descripcion de los procedimientos y aparatos divulgados en la presente memoria, resultaran evidentes para los expertos en la materia otras ventajas de los procedimientos y aparatos actualmente descritos.

Aunque el texto precedente revela una descripcion detallada de numerosas formas de realizacion, se debe entender que el alcance de proteccion se define por las expresiones de las reivindicaciones posteriores. La descripcion detallada debe considerarse unicamente como ejemplar y no describe cualquier posible forma de realizacion en cuanto la descripcion de cualquier forma de realizacion no sena practico, o sena imposible.

La memoria descriptiva expuesta describe al menos los siguientes aspectos:

1. Un procedimiento de seleccion de un primer conjunto de celulas a partir de una poblacion de celulas que incluye el primer conjunto de celulas y un segundo conjunto de celulas, comprendiendo el procedimiento: el marcaje de la poblacion de celulas de manera que el primer conjunto de celulas pueda distinguirse del segundo conjunto de celulas;

la provision de una primera via de flujo que presenta un extremo distal, un extremo proximal, un area de interrogacion dispuesta entre el extremo proximal y el extremo distal, y un eje geometrico de flujo;

la creacion de un flujo de vaina de un fluido de vaina a traves de la primera via de flujo, desplazandose el flujo de vaina hacia el extremo proximal en un primer caudal;

la inyeccion dentro del flujo de vaina, en un punto corriente arriba desde el extremo proximal, de un flujo de muestra que incluye la poblacion de celulas, presentando el flujo de muestra inicialmente un segundo caudal inferior al primer caudal;

la provision de una fuente de energfa de excitacion, siendo la energfa emitida a partir de la fuente de energfa de excitacion que actua sobre celulas individuales a medida que pasan a traves del area de interrogacion y provocando la emision o la transmision de una radiacion secundaria a partir de las celulas;

la utilizacion de una lente de objetivo que presenta un eje geometrico optico alineado de forma generica coaxialmente con el eje geometrico de flujo para focalizar la radiacion secundaria a partir de las celulas individuales a medida que las celulas pasan a traves del area de interrogacion; la deteccion de la radiacion secundaria focalizada a partir de las celulas individuales; la determinacion, a partir de la radiacion secundaria detectada, acerca de si las celulas individuales estan en el primer conjunto o en el segundo conjunto; y

la seleccion de celulas determinadas como incluidas en el primer conjunto.

2. El procedimiento del aspecto 1, en el que la seleccion de celulas determinadas como situadas en el primer conjunto comprende la adopcion de una medida entre la derivatizacion, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la interrupcion o la fragmentacion de celulas no determinadas como dispuestas en el primer conjunto.

3. El procedimiento del aspecto 1, en el que la seleccion de celulas determinadas como incluidas en el primer conjunto comprende la expulsion de las celulas de una corriente a partir de una tobera, la creacion de una pluralidad de gotfculas de la corriente, la aplicacion de manera selectiva de una carga sobre las gotfculas y la seleccion de las gotfculas de acuerdo con la carga de cada gotfcula.

4. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 3, en el que el marcaje de la poblacion de celulas comprende la tincion de las celulas.

5. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 4, en el que la emision de una radiacion secundaria comprende la emision de luz fluorescente.

6. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 5, en el que la energfa emitida a partir de la fuente de energfa de excitacion pasa traves de la lente de objetivo.

7. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 6, en el que las celulas son celulas espermaticas y en el que el primer conjunto de celulas comprende o bien celulas con un cromosoma X o bien con celulas con un cromosoma Y.

8. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 7, en el que la seleccion de las celulas determinadas como pertenecientes al primer conjunto comprende la utilizacion de una fuente de energfa de diferenciacion para irradiar celulas no determinadas como pertenecientes al primer conjunto.

9. El procedimiento del aspecto 8, en el que la fuente de energfa de diferenciacion es un laser infrarrojo proximo.

10. El procedimiento del aspecto 8 o del aspecto 9, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa de diferenciacion pasa a traves de la lente de objetivo.

11. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 10, en el que la provision de una fuente de energfa de excitacion comprende la provision de un laser ultravioleta.

12. El procedimiento del aspecto 10, que comprende ademas:

la seleccion de una combinacion de una longitud de onda de la fuente de energfa de diferenciacion, el primer caudal, el segundo caudal y la lente de objetivo de manera que un punto focal nominal de la lente de objetivo y un punto focal nominal de la fuente de energfa de diferenciacion estan separadas por la distancia que las celulas individuales recorreran a traves de la via de flujo entre la deteccion de la radiacion secundaria focalizada y la utilizacion de la fuente de energfa de diferenciacion para irradiar celulas no determinadas como incluidas en el primer conjunto.

13. El procedimiento del aspecto 8 o del aspecto 10, en el que la provision de una fuente de energfa de excitacion comprende la provision de una salida atenuada a partir de la fuente de energfa de diferenciacion.

14. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 13, que comprende ademas la provision de una segunda via de flujo transversal al eje geometrico de flujo y dispuesta en el extremo proximal de la primera via de flujo, de manera que, despues de atravesar el area de interrogacion y llegar hasta el extremo proximal de la primera via de flujo, las celulas se desplazan hacia el interior de la segunda via de flujo y se alejan del area de interrogacion.

15. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 14, en el que la provision de una via de flujo comprende ademas la provision de una via de flujo formada con un material que presenta un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive.

16. El procedimiento de cualquiera de los aspectos 1 a 15, que comprende ademas el ajuste del mdice de refraccion de una solucion que contiene la poblacion de celulas de manera que el mdice de refraccion de la solucion se situa dentro del 0,02 del mdice de refraccion del material que forma el material de flujo.

17. Un aparato para detectar y alternar de manera selectiva una subpoblacion deseada de celulas de una poblacion de celulas de muestra, comprendiendo el aparato:

una via de flujo de fluido que presenta:

un primera seccion de flujo que presenta un eje geometrico de flujo, y

una segunda seccion de flujo,

cruzandose las primera y segunda secciones de flujo en un extremo de medicion de la primera seccion de flujo;

un area de interrogacion dispuesta en o cerca del extremo de medicion de la primera seccion de flujo;

una entrada de fluido de vaina e comunicacion de flujo de fluido con la via de flujo de fluido; un entrada de muestra en comunicacion de flujo de fluido con la via de flujo de fluido;

una lente de objetivo que presenta un punto focal nominal y un eje geometrico optico y dispuesta en el extremo de medicion de la primera seccion de flujo, estando la lente de objetivo alineada con la primera seccion de flujo de manera que el punto focal nominal se situe a lo largo del eje geometrico de flujo y en el area de interrogacion y de manera que el eje geometrico optico esta alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico de flujo;

un detector dispuesto para detectar la luz focalizada por la lente de objetivo;

una rutina logica acoplada de manera comunicativa al detector, operable para determinar si una celula de la poblacion de celulas de muestra es una entre la subpoblacion deseada de celulas, y ademas operable para emitir una senal en base a la determinacion de si la celula es una entre la subpoblacion deseada de celulas; y

una fuente de energfa controlable acoplada de manera comunicativa a la rutina logica y operable para alterar de manera significativa o bien celulas de la subpoblacion deseada de celulas o bien celulas no situadas en la subpoblacion deseada de celulas de acuerdo con al menos la salida de senal procedente de la rutina logica.

18. El aparato del aspecto 17, en el que la fuente de energfa controlable altera de manera selectiva celulas mediante derivatizacion, destruccion, deterioro, modificacion, perturbacion o fragmentacion de una o mas celulas no determinadas como pertenecientes a la subpoblacion deseada.

19. El aparato del aspecto 17 o del aspecto 18, que comprende ademas una fuente de energfa de excitacion.

20. El aparato del aspecto 19, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa de excitacion pasa a traves de la lente de objetivo.

21. El aparato del aspecto 19 o del aspecto 20, en el que la fuente de energfa de excitacion comprende un atenuador que presenta la fuente de energfa controlable como entrada.

22. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 21, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa controlable pasa a traves de la lente de objetivo.

23. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 22, en el que la fuente de energfa controlable comprende un laser.

24. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 23, en el que la fuente de energfa controlable comprende un laser infrarrojo proximo.

25. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 24, que comprende ademas un cuerpo en el que se forma la via de flujo.

26. El aparato del aspecto 25, que comprende ademas una ranura que forma la segunda seccion de flujo en una primera superficie del cuerpo, en el que el extremo de medicion de la primera seccion de flujo cruza la ranura en la primera superficie.

27. El aparato del aspecto 25, que comprende ademas:

un primer canal interior a traves del cuerpo, extendiendose desde una primera superficie del cuerpo hasta un punto del cuerpo y que forma la primera seccion de flujo; y

un segundo canal interior a traves del cuerpo, que se extiende desde el punto del cuerpo hasta una segunda superficie del cuerpo.

28. El aparato de cualquiera de los aspectos 25 a 27, en el que el cuerpo esta formado por un material con un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive.

29. El aparato del aspecto 28, en el que el material comprende un perfluoropolfmero amorfo, un fluoropolfmero amorfo, o un polfmero perfluoroalcoxi.

30. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 29, en el que la lente de objetivo es o bien una lente de inmersion en agua o bien una lente empapada en agua.

31. El aparato de cualquiera de los aspectos 17 a 30, en el que la poblacion de celulas de muestra comprende celulas espermaticas.

32. El aparato del aspecto 31, en el que la poblacion deseada de celulas comprende o bien celulas con un cromosoma X o celulas con un cromosoma Y.

33. Un sistema para la deteccion y la alteracion de manera selectiva de una subpoblacion deseada de celulas de una poblacion de celulas de muestra, comprendiendo el sistema:

una via de flujo de fluido que presenta un eje geometrico de flujo;

un area de interrogacion dispuesta dentro de la via de flujo de fluido;

una entrada de fluido de vaina en comunicacion de flujo de fluido con la via de flujo de fluido; una primera bomba en comunicacion de flujo de fluido con la entrada de fluido de vaina;

una entrada de fluido de muestra en comunicacion de flujo de fluido con la via de flujo de fluido; una segunda bomba en comunicacion de flujo de fluido con la entrada de fluido de muestra; una lente de objetivo que presenta un punto focal nominal y un eje geometrico optico y dispuesta de manera que el punto focal nominal se situa a lo largo del eje geometrico del flujo y en el area de interrogacion y de manera que el eje geometrico optico esta alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico de flujo en el area de interrogacion;

un detector dispuesto para detectar la luz focalizada por la lente de objetivo;

una fuente de energfa controlable;

un procesador acoplado de manera comunicativa a un medio de almacenamiento elegible por ordenador, al detector y a la fuente de energfa controlabe; y

en el que el procesador y la fuente de energfa controlable cooperan para alterar de manera selectiva, de acuerdo con una salida procedente del procesador, o bien celulas de la subpoblacion deseada de celulas o bien celulas de la subpoblacion no deseada de celulas.

34. El sistema del aspecto 33, en el que asf mismo el procesador y la fuente de energfa controlable cooperan para alterar de manera selectiva celulas de la subpoblacion deseada de celulas mediante derivatizacion, destruccion, deterioro, modificacion, perturbacion o fragmentacion de una o mas celulas no determinadas como incluidas en la subpoblacion deseada de celulas.

35. El sistema del aspecto 33 o del aspecto 34, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa controlable pasa a traves de la lente de objetivo.

36. El sistema de cualquiera de los aspectos 33 a 35, en el que la fuente de energfa controlable comprende un laser infrarrojo proximo.

37. El sistema de cualquiera de los aspectos 33 a 35, que comprende ademas un cuerpo formado por un material que presenta un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive.

38. El sistema de cualquiera de los aspectos 33 a 37, en el que la poblacion de celulas de muestra comprende celulas espermaticas.

39. El sistema del aspecto 38, en el que la subpoblacion deseada es o bien de celulas con un cromosoma X o celulas con un cromosoma Y.

40. Un procedimiento de deteccion y alteracion de manera selectiva de una subpoblacion de celulas de una poblacion de celulas de muestra, encuadrado el procedimiento en un conjunto de instrucciones legibles por maquina ejecutadas en un procesador y almacenados en un medio tangible, comprendiendo el procedimiento:

el control del flujo de una poblacion de celulas de muestra a traves de una grna de flujo que presenta un eje geometrico de flujo;

el control de una fuente de iluminacion para iluminar un area de interrogacion a traves de la cual pasan las celulas de la poblacion de celulas de muestra;

la recepcion de datos procedentes de un detector de una via optica que presenta una lente de objetivo, presentando la lente de objetivo un eje geometrico optico y un punto focal nominal, estando el eje geometrico optico alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico de flujo, estando el punto focal nominal dentro del area de interrogacion;

la determinacion, a partir de los datos recibidos, de la presencia en el area de interrogacion de una de las celulas de la poblacion de celulas de muestra;

la determinacion a partir de los datos recibidos acerca de si una de las celulas de muestra es una entre la subpoblacion de celulas deseada; y

el control de una fuente de energfa de seleccion de celulas de acuerdo con al menos la determinacion de si una de las celulas de muestra es parte de la subpoblacion de celulas deseada.

41. El procedimiento del aspecto 40, en el que el control de la fuente de energfa de seleccion de celulas comprende:

la determinacion de la velocidad de flujo a traves del area de interrogacion de una de las celulas de muestra; y

la irradiacion de forma selectiva de una de las celulas mediante el control de la fuente de energfa de seleccion de celulas de acuerdo con la velocidad determinada de flujo de una de las celulas de muestra a traves de la via de flujo.

42. El procedimiento del aspecto 40, en el que el control de la fuente de energfa de seleccion de celulas comprende la aplicacion de manera selectiva de una carga a una goticula que contiene una de las celulas.

43. Un sistema para la deteccion y la alteracion de manera selectiva de una subpoblacion deseada de celulas de una poblacion de celulas de muestra, comprendiendo el sistema:

una via de flujo que presenta un area de interrogacion y un eje geometrico de flujo del area de interrogacion;

unos medios de control para el control de un flujo de la poblacion de celulas de muestra a traves de la via de flujo;

unos medios de iluminacion para la iluminacion de las celulas de muestra cuando pasan a traves del area de interrogacion;

una lente de objetivo que presenta un eje geometrico optico y un punto focal nominal, estando el eje geometrico optico genericamente alineado de manera coaxial con el eje geometrico de flujo, estando el punto focal nominal dentro del area de interrogacion;

unos medios de deteccion para detectar la energfa focalizada por la lente de objetivo y proporcionar datos relacionados con la energfa detectada;

unos medios de procesamiento para recibir los datos relacionados con la energfa detectada y para determinar si las celulas de muestra individuales que pasan a traves del area de interrogacion son una entre la subpoblacion deseada;

unos medios de seleccion de celulas para irradiar de manera selectiva las celulas de muestra; y unos medios de control de seleccion de celulas para controlar los medios de seleccion de celulas de acuerdo con al menos la determinacion de si las celulas de muestra individuales son una entre la subpoblacion deseada.

44. El sistema del aspecto 43, en el que la poblacion de celulas de muestra comprende una poblacion de celulas espermaticas y en el que la subpoblacion deseada de celulas comprende celulas espermaticas con un cromosoma X.

45. El sistema del aspecto 43, en el que la poblacion de celulas de muestra comprende una poblacion de celulas espermaticas y en el que la subpoblacion de celulas deseada comprende celulas espermaticas con un cromosoma Y.

46. El sistema de cualquiera de los aspectos 43 a 45, en el que la energfa emitida por los medios de seleccion de celulas pasa a traves de la lente de objetivo antes de alcanzar las celulas de muestra.

47. El sistema de cualquiera de los aspectos 43 a 46, en el que al menos una parte de la via de flujo esta formada de un material con un mdice de refraccion entre 1,30 y 1,40, inclusive.

48. Un proceso de deteccion y alteracion de manera selectiva de una subpoblacion deseada de celulas de una poblacion de celulas de muestra, comprendiendo el proceso:

la creacion de un flujo que porta una procesion generalmente en una fila de celulas de muestra a traves de una via de flujo;

la iluminacion de las celulas de muestra cuando las celulas de muestra pasan a traves de un area de interrogacion de las vfas de flujo;

el posicionamiento de una lente de objetivo de manera que:

un eje geometrico optico de la lente de objetivo es genericamente coaxial con una via de flujo; el flujo se desplaza a traves de la via de fuljo hacia la lente de objetivo; y

la lente de objetivo presenta un punto focal nominal en el area de interrogacion;

la deteccion de un parametro de celulas de muestra individuales cuando las celulas de muestra pasan a traves del area de interrogacion;

la interpretacion del parametro detectado de las celulas de muestra individuales para determinar si las celulas de muestra individuales son una entre la subpoblacion deseada;

la derivatizacion de manera selectiva, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la perturbacion o la fragmentacion de una o mas entre la poblacion de celulas de muestra de acuerdo con la determinacion de si las celulas de muestra individuales con una entre la subpoblacion deseada de celulas; y

la recogida de la poblacion resultante de celulas procesadas.

49. El proceso del aspecto 48:

en el que la poblacion de celulas de muestra comprende celulas espermaticas:

en el que la subpoblacion deseada de celulas comprende o bien celulas con un cromosoma X o bien celulas con un cromosoma Y; y

en el que la deteccion de un parametro de las celulas de muestra individuales cuando las celulas de muestra pasan a traves del area de interrogacion comprende la deteccion del parametro de mas de 40,000 celulas de muestra por segundo, cuando las celulas pasan a traves del area de interrogacion.

50. El proceso del aspecto 48, en el que la deteccion de un parametro de las celulas de muestra individuales cuando las celulas de muestra pasan a traves del area de interrogacion comprende la deteccion del parametro de mas de 75,000 celulas de muestra de segundo cuando las celulas pasan a traves del area de interrogacion.

51. El proceso del aspecto 48, en el que la deteccion de un parametro de las celulas de muestra individuales cuando las celulas de muestra pasan a traves del area de interrogacion comprende la deteccion del parametro de mas de 100,000 celulas de muestra por segundo cuando las celulas pasan a traves del area de interrogacion.

52. El proceso de cualquiera de los aspectos 48 a 51, en el que las celulas determinadas como pertenecientes a la subpoblacion deseada no son alteradas por la derivacion de manera selectiva, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la perturbacion o la fragmentacion de las celulas y en el que la poblacion resultante de celulas procesadas comprende una relacion de celulas de la subpoblacion deseada de celulas con respecto a las celulas inalteradas totales superior o igual a un 60%.

53. El proceso de cualquiera de los aspectos 48 a 51, en el que las celulas determinadas como pertenecientes a la subpoblacion deseada son alteradas mediante la derivatizacion de manera selectiva, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la perturbacion o la fragmentacion de las celulas, y en el que la poblacion resultante de celulas procesadas comprende una relacion de celulas de la subpoblacion deseada de celulas con respecto a las celulas alteradas superior o igual a un 60%.

54. El proceso de cualquiera de los aspectos 48 a 53, en el que las celulas determinadas como pertenecientes a la subpoblacion deseada no son alteradas mediante la derivatizacion de manera selectiva, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la perturbacion o la fragmentacion de las celulas, y en el que la poblacion resultante de celulas procesadas comprende una relacion de celulas alteradas de la subpoblacion deseada con respecto a las celulas totales de la subpoblacion deseada inferior o igual a un 50%.

55. El proceso de cualquiera de los aspectos 48 a 53, en el que las celulas determinadas como pertenecientes a la subpoblacion deseada no son alteradas mediante la derivatizacion de manera selectiva, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la perturbacion o la fragmentacion de las celulas, y en el que la poblacion resultante de celulas procesadas comprende una relacion de celulas inalteradas de la subpoblacion deseada con respecto a las celulas totales de la subpoblacion deseada inferior o igual a un 50%.

Claims

REIVINDICACIONES

1. - Un procedimiento de seleccion de un primer conjunto de celulas a partir de una poblacion de celulas que incluye el primer conjunto de celulas y un segundo conjunto de celulas, comprendiendo el procedimiento:

el marcaje de la poblacion de celulas de manera que el primer conjunto de celulas pueda distinguirse del segundo conjunto de celulas;

la provision de una primera via (110) de flujo que presenta un extremo distal, un extremo proximal, un area (128) de interrogacion dispuesta entre el extremo proximal y el extremo distal y un eje geometrico de flujo; la creacion de un flujo (116) de vaina de un fluido de vaina a traves de la primera via de flujo, desplazandose el flujo de vaina hacia el extremo proximal en un primer caudal;

la inyeccion dentro del flujo de vaina, en un punto corriente arriba a partir del extremo proximal, de un flujo (120) de muestra que incluye la poblacion de celulas, presentando el flujo de muestra inicialmente un segundo caudal inferior al primer caudal;

la provision de una fuente de energfa de excitacion, actuando la energfa emitida por la fuente de energfa de excitacion sobre celulas individuales cuando pasan a traves del area de interrogacion y provocando la emision o la transmision de una radiacion secundaria procedente de las celulas;

la utilizacion de una lente (142) de objetivo que presenta un eje geometrico (144) optico alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico (130) de flujo para focalizar la radiacion secundaria procedente de las celulas individuales cuando las celulas pasan a traves del area de interrogacion;

la deteccion de la radiacion secundaria focalizada procedente de las celulas individuales;

la determinacion, a partir de la radiacion secundaria detectada, de si las celulas individuales estan en el primer conjunto o en el segundo conjunto; y

la seleccion de celulas determinadas como incluidas en el primer conjunto.

2. - El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa de excitacion pasa a traves de la lente de objetivo.

3. - El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la seleccion de celulas determinadas como incluidas en el primer conjunto comprende la utilizacion de una fuente de energfa de diferenciacion para irradiar celulas no determinadas como pertenecientes al primer conjunto.

4. - El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la seleccion de celulas determinadas como pertenecientes al primer conjunto comprende una medida entre la derivatizacion, la destruccion, el deterioro, la modificacion, la interrupcion o la fragmentacion de celulas no determinadas como pertenecientes al primer conjunto.

5. - El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas la provision de una segunda via de flujo transversal con respecto al eje geometrico de flujo y dispuesta en el extremo proximal de la primera via de flujo, de manera que, despues de atravesar el area de interrogacion y llegar hasta el extremo proximal de la primera via de flujo, las celulas se desplazan hasta el interior de la segunda via de flujo y se alejan del area de interrogacion.

6. - El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la provision de una via de flujo comprende ademas la provision de una via de flujo de la que al menos una porcion esta formada por un material que presenta un mdice de refraccion en el intervalo de entre 1,30 y 1,40, inclusive.

7. - El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende ademas el ajuste del mdice de refraccion de una solucion que contiene la poblacion de celulas de manera que el mdice de refraccion de la solucion sea como maximo de 0,2 del mdice de refraccion del material que forma la region de interrogacion de la via de flujo.

8. - Un aparato para la deteccion y la alteracion de manera selectiva de una subpoblacion deseada de celulas de una poblacion de celulas de muestra, comprendiendo el aparato:

una via (110) de flujo de fluido que presenta:

una primera seccion de flujo que presenta un eje geometrico (130) de flujo, y

una segunda seccion de flujo,

cruzandose la primera y la segunda secciones de flujo en un extremo de medicion de la primera seccion de flujo;

un area (128) de interrogacion dispuesta en o cerca del extremo de medicion de la primera seccion de flujo; una entrada (114) de fluido de vaina en comunicacion de flujo de fluido con la v^a de flujo de fluido; una lente (142) de objetivo que presenta un punto focal nominal y un eje geometrico (144) optico, y dispuesta en el extremo de medicion de la primera seccion de flujo, estando la lente de objetivo alineada con la primera seccion de flujo de manera que el punto focal nominal se situe a lo largo del eje geometrico de flujo y en el area de interrogacion y de manera que el eje geometrico optico este alineado genericamente de forma coaxial con el eje geometrico de flujo;

un detector dispuesto para detectar la luz focalizada por la lente de objetivo;

una rutina logica acoplada de manera comunicativa al detector, operable para determinar si una celula de la poblacion de celulas de muestra es una entre la subpoblacion deseada de celulas y, asf mismo, operable para emitir una senal en base a la determinacion de si la celula es una entre la subpoblacion deseada de celulas; y

Una fuente de energfa controlable acoplada de manera comunicativa a la rutina logica y operable para alterar de manera selectiva o bien celulas de la subpoblacion deseada de celulas o bien celulas no de la subpoblacion deseada de celulas de acuerdo con al menos la salida de senal procedente de la rutina logica.

9. - El aparato de la reivindicacion 8, que comprende ademas una fuente de energfa de excitacion.

10. - El aparato de la reivindicacion 9, en el que la fuente de energfa de excitacion comprende un atenuador que incluye la fuente de energfa controlable como entrada.

11. - El aparato de cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la energfa emitida por la fuente de energfa controlable pasa a traves de la lente de objetivo.

12. - El aparato de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende ademas:

un cuerpo en el que esta formada la via de flujo; y

una ranura que forma la segunda seccion de flujo en una primera superficie del cuerpo,

en el que el extremo de medicion de la primera seccion de flujo cruza la ranura en la primera superficie.

13. - El aparato de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende ademas:

un cuerpo en el que se forma la via de flujo;

un primer canal interior a traves del cuerpo, que se extiende desde una primera superficie del cuerpo hasta un punto del cuerpo y que forma la primera seccion de flujo; y

un segundo canal interior a traves del cuerpo que se extiende desde el punto del cuerpo hasta una segunda superficie del cuerpo.

14. - El aparato de cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, en el que el cuerpo esta formado por un material que presenta un mdice de retraccion de entre 1,30 y 1,40 inclusive.

15. - El aparato de la reivindicacion 14, en el que el material comprende un perfluoropolfmero amorfo, un fluoropolfmero amorfo, o un polfmero perfluoroalcoxi.