ES2717657T3 - Métodos para la preparación de conjugados - Google Patents

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Nathan Fishkin
Michael Miller
Wei Li
Rajeeva Singh
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Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para la preparación de conjugados
Campo de la invención
Esta invención describe el uso de reactivos que reaccionan con imina para la preparación de conjugados de agentes de unión a células con fármacos citotóxicos de unión al ADN que contienen uno o más grupos funcionales imina. Antecedentes de la invención
Los anticuerpos monoclonales se están explorando cada vez más como agentes terapéuticos contra el cáncer. Muchos anticuerpos monoclonales contra antígenos de la superficie de las células cancerosas ya se han aprobaro para el tratamiento del cáncer, tales como rituximab para el linfoma no de Hodgkin, trastuzumab para el cáncer de mama, cetuximab para el cáncer de cabeza y cuello y colorrectal, cetuximab, panitimumab, y bevacizumab para el cáncer colorrectal, y alemtuzumab para leucemia linfocítica crónica (Strome, S. E., Sausville, E. A., y Mann, D., 2007, The Oncologist, 12, 1084-1095). Sin embargo, la actividad citotóxica de un anticuerpo “desnudo" puede limitarse a los mecanismos de inhibición de la función del receptor, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), y citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (ADCC).
Un enfoque para aumentar la actividad citotóxica del anticuerpo hacia las células cancerosas diana es conectar el anticuerpo con efectores citotóxicos (A. D. Ricart, y A. W. Tolcher, 2007, Nat. Clin. Pract. Oncol. 4, 245-255; Lambert, J., 2010, Drugs o f the Future 35, 471-480). El conjugado anticuerpo-fármaco citotóxico (ADC) se une específicamente a las células cancerosas, seguido por la internalización y degradación del conjugado, lo que da lugar a la liberación intracelular del fármaco tóxico y por último a la muerte de las células cancerosas. Los fármacos citotóxicos que se han empleado en la conexión con anticuerpos incluyen fármacos antitubulina tales como maitansinoides y auristatinas, fármacos de unión al ADN tales como calicheamicina que causa escisión del ADN de doble cadena específica de secuencia. Otra clase de fármacos citotóxicos de unión al ADN incluye pirrolobenzodiazepinas (PBD) que contienen imina, tales como 1,2,5-benzotiadiazepina-1,1-dióxido sustituido con N-2-imidazolil alquilo, Pat. U.S. 6 156 746), benzo-pirido o dipirido tiadiazepina (Wo 2004/069843), pirrolo [1,2-b] [1,2,5] benzotiadiazepinas y derivados de pirrol [1,2-b][1,2,5] benzodiazepina (WO2007/015280), derivados de tomaimicina (p. ej., pirrolo[1,4]benzodiazepinas), tales como los descritos en Wo 00/12508, WO2005/085260, WO2007/085930, EP 2019104, y la Patente de EE.UU: N. ° 6156746). Otros fármacos de benzodiazepina de unión al ADN se describen en la Publicación de Patente de EE.UU: N. ° 2010/0203007A1. Estos fármacos de benzodiazepina que contienen enlaces imina se unen al surco menor del ADN e interfieren con la función del ADN, dando lugar a la muerte de la célula.
Existe una necesidad de nuevos métodos para la preparación de conjugados de agente de unión a células y fármacos citotóxicos que portan un grupo imina.
Breve resumen de la invención
La presente invención describe el uso de reactivos que reaccionan con imina para el tratamiento de un fármaco que contiene imina, que dio lugar a una mejora inesperada en su reacción de conjugación con agentes de unión a células (CBA) tales como los anticuerpos. Los reactivos son tales que las propiedades del fármaco para la muerte celular no disminuyen y se mantiene completamente la integridad del CBA (anticuerpo).
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un CBA modificado a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde:
a) el CBA modificado comprende un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al CBA, y el residuo comprende el grupo conector y un grupo reactivo con tiol; y
b) el compuesto citotóxico modificado comprende un grupo tiol, y se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000003_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto citotóxico modificado se produce haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol con un reactivo que reacciona con imina, y en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000003_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (I') y (II') se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2 NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n'-NR9-(CH)na'-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na'-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; y L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2-formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
El compuesto citotóxico modificado se produce haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol con un reactivo que reacciona con imina.
En un segundo aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo que reacciona con imina, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector para formar el conjugado, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000005_0001
en donde:
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo de heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2 NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na'-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; y L está ausente, o cuando está presente, comprende un grupo tiol, y es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
En un tercer aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método:
a) hacer reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector, un grupo reactivo con el CBA (tal como un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina), y un grupo reactivo con el compuesto citotóxico modificado, para formar un segundo compuesto citotóxico modificado unido covalentemente a un residuo del agente de reticulación bifuncional, en donde el residuo comprende el grupo conector y el grupo reactivo con el CBA;
en donde el compuesto citotóxico modificado se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000006_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto citotóxico modificado se produce haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina con un reactivo que reacciona con imina, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000007_0001
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (I') y (II') se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2 NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na'-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; L está ausente, o cuando está presente, comprende un grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión); y
b) hacer reaccionar el segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a través del grupo reactivo con el CBA, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, para formar el conjugado.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico modificado se produce haciendo reaccionar un reactivo que reacciona con imina con un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo conector y el grupo reactivo. En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto citotóxico modificado y el grupo conector del conjugado se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000008_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, el grupo conector, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, el grupo conector, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo conector;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+;
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, halógeno o el grupo conector;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na'-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, el grupo conector, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo está opcionalmente sustituido con el grupo conector; fenilo o el anillo heterocíclico o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, en donde el sustituyente puede comprender el grupo conector.
Varios conjugados preferidos que pueden producirse de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención incluyen:
Figure imgf000010_0001
Ċ
Figure imgf000011_0001
en donde CBA es un agente de unión a células, tal como un anticuerpo, y r es un número entero entre 1-20, preferentemente entre 1-10 o 1-5.
Tal y como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a un grupo (p. ej., Rc, L, X' etc.) “es/ser” (o “no es”) el grupo conector o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, significa que el grupo “comprende” (o “no comprende”) el grupo conector o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 muestra los espectros de masa de conjugados de huMy9-6-2 deglicosilados preparados sin y con bisulfito, que contienen 1.4 DAR (A) y 3.1 DAR (B), respectivamente. DAR: relación fármaco anticuerpo.
La FIG. 2 muestra la citotoxicidad in vitro similar de los conjugados HuMy9-6-Fármaco 2 preparados sin y con bisulfito de sodio contra las células HL60 que expresan el antígeno CD33.
La FIG. 3 muestra la citotoxicidad in vitro similar de los conjugados Ab anti-CD22-Fármaco 2 preparados sin y con bisulfito de sodio contra las células BJAB que expresan el antígeno CD22.
La FIG. 4 muestra el análisis de HPLC de fase reversa del fármaco 2 y el fármaco 2 tratado con bisulfito de sodio. La FIG. 5 muestra el análisis de MS de huMy9-6 deglicosilado-SPDB-fármaco 1 preparado con y sin bisulfito de sodio usando 7 equivalentes molares de 1 por anticuerpo. A) Conjugado preparado sin bisulfito de sodio con un promedio de 1.4 de fármaco 1/Ab y especies de anticuerpo con hasta tres moléculas del fármaco 1 enlazadas. B) Conjugado preparado con bisulfito de sodio con un promedio de 2.5 de 1/Ab y especies de anticuerpo con hasta siete moléculas de fármaco 1 enlazadas.
La FIG. 6 muestra que la adición de la reacción de conjugación con bisulfito de sodio del fármaco 1 no produjo la fragmentación del anticuerpo (SDS-PAGE no reductora; análisis de gel en microplaca).
Las FIG. 7-11 muestran métodos ilustrativos de la presente invención para preparar un conjugado agente de unión a células-fármaco.
La FIG. 12 muestra el ánalisis de espectrometría de masa (MS) de My9-6 deglicosilado-SPDB-1 preparado conjugando un compuesto 1 que contiene el éster NHS (método reactivo de una etapa) directamente a lisinas del anticuerpo, o conjugando el compuesto 1d a un anticuerpo modificado con ditiopiridina (método de dos etapas). La FIG. 13 muestra los datos de MS de My9-6-sulfo-SPDB-1 preparado usando un método de dos etapas en diferentes condiciones de pH. El tiempo de reacción aumentado parece que se correlaciona con la citotoxicidad in vitro aumentada independiente del antígeno CD33 medida en las células HL60-QC pretratadas con 1 |jM de huMy9-6 sin conjugar. La muerte dependiente de antígeno para todos los conjugados fue igualmente alta (~4 pM CI50). Se prefiere un tiempo de reacción corto (1-3 h) para minimizar la fragmentación del anticuerpo y la muerte celular no específica in vitro para My9-6-sulfo-SPDB-1.
La FIG. 14 muestra los datos de MS para chKTI-sulfo-SPDB-1 preparado usando un método de dos etapas con diferentes relaciones de compuesto 1d/conector.
La FIG. 15 muestra el uso de reactantes de imina covalentes para mejorar las especificaciones del conjugado Ab­ fármaco (% de monómero y carga del fármaco).
La FIG. 16 muestra el esquema para la síntesis en dos etapas de los conjugados representativos anticuerpofármaco.
La FIG. 17 muestra la citotoxicidad in vitro y especificidad de los conjugados huMy9-6-SPDB-1f contra diversas líneas celulares. Obsérvese que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 18 muestra que la conjugación de los dímeros no reduce la afinidad de la unión del anticuerpo. Obsérvese que se añadió bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 19 muestra la actividad antitumoral in vivo del conjugado de huMy9-6. Obsérvese que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 20 muestra la citotoxicidad in vitro del conjugado huMy9-6-SPDB-1f frente a células positivas al antígeno. Obsérvese que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 21 muestra la citotoxicidad in vitro de huMy9-6-SPDB-1f (A), huMy9-6-sulfoSPDB-1f (B) y huMy9-6-BMPS-1f (C) contra células HL60/QC (Ag+) con y sin bloqueo de los sitios de unión al antígeno. Obsérveseque que en los tres experimentos (34A, 34B, y 34C), se añadieron bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 22 muestra la citotoxicidad in vitro de chB38.1-SPDB-1f (A), y chB38.1-sulfoSPDB-1f (B) contra las células COLO205 (Ag+). Obsérvese que en ambos experimentos, se añadió bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 23 muestra la eficacia in vivo de huMy9-6-SPDB-1f en ratones que portan HL60/QC. Obsérvese que se añadió bisulfito de sodio a la reacción de conjugación.
La FIG. 24 muestra actividad antiproliferativa comparando (A) huMy9-6-SPDB-1f, (B) huMy9-6-sulfoSPDB-1f, y (C) huMy9-6-BMPS-1f, frente a células OCI-AML3 (Ag+) con y sin bloqueo de los sitios de unión al antígeno. Obsérvese que, en los tres experimentos, se añadió bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 25 muestra la eficacia in vivo de huMy9-6-BMPS-1f en ratones que portan el tumor MOLM-13. Obsérvese que se añadió bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 26 muestra un esquema representativo de la síntesis de un conjugado de folato sulfonado / compuesto citotóxico. Obsérvese que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 27 muestra la eficacia in vivo de huMy9-6-fármaco 2 en ratones que portan el tumor MOLM-13. Obsérvese que se adicionó bisulfito de sodio a la reacción de conjugación para preparar el conjugado.
La FIG. 28 muestra la preparación de huMy9-6-sulfo-SPDB-1d usando el conector altamente reactivo 4-nitroPysulfo-SPDB.
Descripción detallada de la invención
A continuación, se hará referencia en detalle a ciertas realizaciones de la invención, cuyos ejemplos se ilustran en las estructuras y fórmulas adjuntas.
Definiciones
“Alquilo lineal o ramificado" tal y como se usa en el presente documento se refiere a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada saturado de uno a veinte átomos de carbono. Los ejemplos de alquilo incluyen metilo, etilo, 1 -propilo, 2-propilo, 1 -butilo, 2-metil-1-propilo, -CH2CH(CH3)2), 2-butilo, 2-metil-2-propilo, 1-pentilo, 2-pentilo, 3-pentilo, 2-metil-2-butilo, 3-metil-2-butilo, 3-metil-1-butilo, 2-metil-1 -butilo, 1-hexilo, 2-hexilo, 3-hexilo, 2-metil-2-pentilo, 3-metil-2-pentilo, 4-metil-2-pentilo, 3-metil-3-pentilo, 2-metil-3-pentilo, 2,3-dimetil-2-butilo, 3,3-dimetil-2-butilo, 1 -heptilo y 1-octilo. Preferentemente, el alquilo tiene de uno a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquilo tiene de uno a cuatro átomos de carbono.
“Alquenilo lineal o ramificado" se refiere un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o ramificada de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace doble carbono-carbono, en donde el radical alquenilo incluye radicales que tienen orientaciones “cis" y “trans", o alternativamente, orientaciones “E" y “Z". Los ejemplos incluyen etilenilo o vinilo (-CH=CH2) y alilo (-CH2CH=CH2). Preferentemente, el alquenilo tiene dos a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquilo tiene de dos a cuatro átomos de carbono.
“Alquinilo lineal o ramificado" se refiere a un radical hidrocarburo monovalente lineal o ramificado de dos a veinte átomos de carbono con al menos un sitio de insaturación, es decir, un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos incluyen etinilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo y hexinilo. Preferentemente, el alquinilo tiene de dos a diez átomos de carbono. Más preferentemente, el alquinilo tiene de dos a cuatro átomos de carbono.
El término “carbociclo", “carbociclilo" y “anillo carbocíclico" se refiere a un anillo monovalente no aromático, saturado o parcialmente insaturado que tiene de 3 a 12 átomos de carbono como un anillo monocíclico o de 7 a 12 átomos de carbono como un anillo bicíclico. Los carbociclos bicíclicos que tienen de 7 a 12 átomos pueden disponerse, por ejemplo, como un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6] , y los carbociclos bicíclicos que tienen 9 o 10 átomos en el anillo pueden disponerse como un sistema biciclo [5,6] o [6,6], o como sistemas puenteados tales como bicido[2.2.1]heptano, bicido[2.2.2]octano y bicido[3.2.2]nonano. Los ejemplos de carbociclos monocíclicos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, 1-ciclopent-1-enilo, 1-ciclopent-2-enilo, 1-ciclopent-3-enilo, ciclohexilo, 1-ciclohex-1-enilo, 1-ciclohex-2-enilo, 1-ciclohex-3-enilo, ciclohexadienilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclononilo, ciclodecilo, cicloundecilo y ciclododecilo.
Los términos “alquilo cíclico" y “ cicloalquilo” pueden usarse indistintamente. Se refieren a un radical de anillo carbocíclico saturado monovalente. Preferentemente, el alquilo cíclico es un radical de anillo monocíclico de 3 a 7 miembros. Más preferentemente, el alquilo cíclico es ciclohexilo.
El término “alquenilo cíclico” se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace doble en la estructura anular.
El término “alquinilo cíclico” se refiere a un radical de anillo carbocíclico que tiene al menos un enlace triple en la estructura anular.
“Arilo” significa un radical hidrocarburo aromático monovalente de 6-18 átomos de carbono derivado por la eliminación de un átomo de hitrógeno de un solo átomo de carbono de un sistema anular aromático parental. Algunos grupos arilo se representan en las estructuras ilustrativas como “Ar”. Arilo incluye radicales bicíclicos que comprenden un anillo aromático fusionado a un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo heterocíclico o carbocíclico aromático. Los grupos arilo típicos incluyen radicales derivados de benceno (fenilo), bencenos sustituidos, naftaleno, antraceno, indenilo, indanilo, 1,2-dihidronaftaleno y 1,2,3,4-tetrahidronaftilo. Preferentemente, el arilo es un grupo fenilo.
Los términos “heterociclo”, “heterociclilo”, y “anillo heterocíclico” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un radical carbocíclico saturado o parcialmente insaturado (es decir, que tiene uno o más enlaces dobles y/o triples dentro del anillo) de 3 a 18 átomos en el anillo en el cual al menos un átomo del anillo es un heteroátomo seleccionado de nitrógeno, oxígeno, fósforo, y azufre, siendo los átomos del anillo restantes C, donde uno o más átomos del anillo está opcionalmente sustituido independientemente con uno o más sustituyentes descritos a continuación. Un heterociclo puede ser un monociclo que tiene de 3 a 7 miembros anulares (de 2 a 6 átomos de carbono y 1 a 4 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S) o un biciclo que tiene de 7 a 10 miembros anulares (de 4 a 9 átomos de carbono y de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de N, O, P, y S), por ejemplo: un sistema biciclo [4,5], [5,5], [5,6], o [6,6]. Los heterociclos se describen en Paquette, Leo A.; “Principles of Modern Heterocyclic Chemistry” (W. A. Benjamin, Nueva York, 1968), particularmente los Capítulos 1, 3, 4, 6, 7, y 9; “The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs” (John Wiley & Sons, Nueva York, 1950 al presente), en particular los Volúmenes 13, 14, 16, 19, y 28; y J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. “Heterociclilo” incluye además radicales donde los radicales heterociclo se fusionan con un anillo saturado, parcialmente insaturado, o anillo heterocíclico o carbocíclico aromático. Los ejemplos de anillos heterocíclicos incluyen pirrolidinilo, tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, tetrahidrotienilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, tetrahidrotiopiranilo, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioxanilo, piperazinilo, homopiperazinilo, azetidinilo, oxetanilo, tietanilo, homopiperidinilo, oxepanilo, tiepanilo, oxazepinilo, diazepinilo, tiazepinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, indolinilo, 2H-piranilo, 4H-piranilo, dioxanilo, 1,3-dioxolanilo, pirazolinilo, ditianilo, ditiolanilo, dihidropiranilo, dihidrotienilo, dihidrofuranilo, pirazolidinilimidazolinilo, imidazolidinilo, 3-azabiciclo[3.1.0]hexanilo, 3-azabiciclo[4.1.0]heptanilo, y azabiciclo[2.2.2]hexanilo. Los restos espiro también se incluyen dentro del alcance de esta definición. Los ejemplos de un grupo heterocíclico en donde los átomos del anillo se sustituyen con restos oxo (=O) son pirimidinonilo y 1,1-dioxo-tiomorfolinilo.
El término “heteroarilo” se refiere a un radical aromático monovalente de 5 o 6 miembros anulares, e incluye sistemas anulares fusionados (al menos uno de los cuales es aromático) de 5-18 átomos, que contienen uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre. Los ejemplos de grupos heteroarilo son piridinilo (que incluyen, por ejemplo, 2-hidroxipiridinilo), imidazolilo, imidazopiridinilo, pirimidinilo (que incluyen, por ejemplo, 4-hidroxipirimidinilo), pirazolilo, triazolilo, pirazinilo, tetrazolilo, furilo, tienilo, isoxazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, pirrolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, bencimidazolilo, benzofuranilo, cinnolinilo, indazolilo, indolizinilo, ftalazinilo, piridazinilo, triazinilo, isoindolilo, pteridinilo, purinilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, furazanilo, benzofurazanilo, benzotiofenilo, benzotiazolilo, benzoxazolilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftiridinilo, y furopiridinilo.
Los grupos heterociclo o heteroarilo pueden estar unidos a carbono (unido a carbono) o nitrógeno (unido a nitrógeno) cuando esto sea posible. A modo de ejemplo, los heterociclos o heteroarilos unidos al carbono están unidos en la posición 2, 3, 4, 5, o 6 de una piridina, posición 3, 4, 5, o 6 de una piridazina, posición 2, 4, 5, o 6 de una pirimidina, posición 2, 3, 5, o 6 de una pirazina, posición 2, 3, 4, o 5 de un furano, tetrahidrofurano, tiofurano, tiofeno, pirrol o tetrahidropirrol, posición 2, 4, o 5 de un oxazol, imidazol o tiazol, posición 3, 4, o 5 de un isoxazol, pirazol, o isotiazol, posición 2 o 3 de una aziridina, posición 2, 3, o 4 de una azetidina, posición 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una quinolina o posición 1, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 de una isoquinolina.
A modo de ejemplo, los heterociclos o heteroarilos unidos al nitrógeno están unidos en la posición 1 de una aziridina, azetidina, pirrol, pirrolidina, 2-pirrolina, 3-pirrolina, imidazol, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazol, pirazolina, 2-pirazolina, 3-pirazolina, piperidina, piperazina, indol, indolina, 1H-indazol, posición 2 de un isoindol, o isoindolina, posición 4 de una morfolina, y posición 9 de un carbazol, u O-carbolina.
Los heteroátomos presentes en el heteroarilo o heterociclilo incluyen las formas oxidadas tales como NO, SO, y SO2.
El término “halo" o “halógeno" se refiere a F, Cl, Br o I.
El alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo descritos anteriormente pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes.
Si un sustituyente se describe como “sustituido", un sustituyente distinto del hidrógeno está en el lugar de un sustituyente hidrógeno en un carbono, oxígeno, azufre o nitrógeno del sustituyente. Así, por ejemplo, un sustituyente de alquilo sustituido es un sustituyente de alquilo en donde al menos un sustituyente distinto de hidrógeno está en el lugar de un sustituyente hidrógeno en el sustituyente de alquilo. Para ilustrar, el monofluoroalquilo es alquilo sustituido con un sustituyente fluoro, y difluoroalquilo es alquilo sustituido con dos sustituyentes fluoro. Debe reconocerse que, si hay más de una sustitución en un sustituyente, cada sustituyente distinto de hidrógeno puede ser idéntico o diferente (a menos que se afirme otra cosa).
Si un sustituyente se describe como que está “opcionalmente sustituido", el sustituyente puede estar (1) no sustituido, o (2) sustituido. Si un carbono de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el carbono (en la medida en que hay alguno) pueden separadamente y/o conjuntamente estar reemplazados con un sustituyente opcional seleccionado independientemente. Si un nitrógeno de un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con uno o más de una lista de sustituyentes, uno o más de los hidrógenos en el nitrógeno (en la medida en que hay alguno) pueden estar reemplazados cada uno con un sustituyente opcional seleccionado independientemente. Un sustituyente ilustrativo puede representarse como -NR'R'', en donde R' y R'' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos, pueden formar un anillo heterocíclico. El anillo heterocíclico formado a partir de R' y R'' junto con el átomo de nitrógeno al cual están unidos puede ser parcialmente o totalmente saturado. En una realización, el anillo heterocíclico consiste en 3 a 7 átomos. En otra realización, el anillo heterocíclico se selecciona del grupo que consiste en pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, piridilo y tiazolilo.
Esta descripción descriptiva usa los términos “sustituyente", “radical", y “grupo" indistintamente.
Si un grupo de sustituyentes se describen colectivamente como opcionalmente sustituidos por uno o más de una lista de sustituyentes, el grupo puede incluir: (1) sustituyentes insustituibles, (2) sustituyentes sustituibles que no están sustituidos por los sustituyentes opcionales, y/o (3) sustituyentes sustituibles que están sustituidos por uno o más de los sustituyentes opcionales.
Si un sustituyente se describe como opcionalmente sustituido con hasta un número particular de sustituyentes distintos de hidrógeno, ese sustituyente puede estar (1) no sustituido; o (2) sustituido por hasta ese número particular de sustituyentes distintos de hidrógeno o por hasta el número máximo de posiciones sustituibles en el sustituyente, lo que sea menor. Así, por ejemplo, si un sustituyente se describe como un heteroarilo opcionalmente sustituido con hasta 3 sustituyentes distintos de hidrógeno, entonces cualquier heteroarilo con menos de 3 posiciones sustituibles estaría opcionalmente sustituido con hasta sólo tantos sustituyentes distintos de hidrógeno como posiciones sustituibles presentes en el hetroarilo. Tales sustituyentes, en ejemplos no limitantes, pueden seleccionarse de un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo, heterociclilo, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR100, NR101R102, -NO2 , -NR101COR102, -SR100, un sulfóxido representado por -SOR101, una sulfona representada por -SO2R101, un sulfonato -SO3M, un sulfato -OSO3M, una sulfonamida representada por
-SO2NR101R102, ciano, un azido, -COR101, -OCOR101, -OCONR101R102 y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)nR101 en donde M es H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+ o K+); R101, R102 y R103 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-R104, en donde n es un número entero de 1 a 24, un arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, un anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono y un heteroarilo que tiene 5 a 10 átomos de carbono; y R104 es H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heterociclilo en los grupos representados por R100, R101, R102, R103 y R104 están opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, -OH, -CN, -NO2 y alquilo lineal o ramificado insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, los sustituyentes para el alquilo opcionalmente sustituido, alquenilo, alquinilo, alquilo cíclico, alquenilo cíclico, alquinilo cíclico, carbociclilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo descritos anteriormente incluyen halógeno, -CN, -NR102R103, -CF3 , -OR101, arilo, heteroarilo, heterociclilo, -SR101, -SOR101, -SO2R101 y -SO3M.
El término “compuesto" o “compuesto citotóxico", “dímero citotóxico" y “compuesto dímero citotóxico" se usan indistintamente. Se pretende que incluyan los compuestos para los cuales una estructura o fórmula o cualquier derivado biológicamente activo del mismo se ha descrito en la presente invención. El término incluye además, estereoisómeros, isómeros geométricos, tautómeros, solvatos, metabolitos, sales (p. ej., sales farmacéuticamente aceptables) y profármacos, y sales del profármaco de un compuesto de todas las fórmulas descritas en la presente invención. El término incluye además cualquier solvato, hidrato, y polimorfo de cualquiera de los anteriores. La mención específica de “estereoisómeros”, “isómeros geométricos", “tautómeros”, “solvatos”, “metabolitos”, “sal" “profármaco”, “sal de profármaco”, “conjugados”, “sal de conjugados”, “solvato”, “hidrato”, o “polimorfo” en ciertos aspectos de la invención descritos en esta solicitud no debe interpretarse como una omisión intencionada de esas formas en otros aspectos de la invención donde el término “compuesto” se usa sin mención de esas otras formas. En una realización, el compuesto citotóxico comprende un grupo conector o un grupo conector con un grupo reactivo unido a este. Alternativamente, el compuesto citotóxico no comprende un grupo conector o un grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo.
El término “conjugado” tal y como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto descrito en el presente documento o a un derivado del mismo que está unido a un agente de unión a células.
El término “conectable a un agente de unión a células” tal y como se usa en el presente documento se refiere a los compuestos descritos en el presente documento o a derivados de los mismos que comprenden al menos un grupo conector o un precursor del mismo adecuado para unir estos compuestos o derivados del mismo a un agente de unión a células.
El término “precursor” de un grupo dado se refiere a cualquier grupo que puede dar lugar a ese grupo por cualquier reacción de desprotección, una modificación química, o un acoplamiento.
La expresión “conectado a un agente de unión a células” se refiere a una molécula conjugada que comprende al menos uno de los compuestos descritos en el presente documento (p. ej., compuestos y compuestos de unión al fármaco descritos en el presente documento), o a un derivado del mismo unido a un agente de unión a células a través de un grupo conector adecuado o un precursor del mismo.
El término “quiral” se refiere a moléculas que tienen la propiedad de ausencia de superposición del equivalente de imagen especular, mientras el término “aquiral” se refiere a moléculas que son superponibles sobre el equivalente de imagen especular.
El término “estereoisómero” se refiere a compuestos que tienen constitución y conectividad química idéntica, pero orientaciones diferentes de sus átomos en el espacio que no pueden interconvertirse por la rotación alrededor de los enlaces simples.
“Diastereómero” se refiere a un estereoisómero con dos o más centros de quiralidad y cuyas moléculas no son imágenes especulares entre sí. Los diastereómeros tienen diferentes propiedades físicas, p. ej., puntos de fusión, puntos de ebullición, propiedades espectrales, y reactividades. Las mezclas de diastereómeros pueden separarse bajo procedimientos analíticos de alta resolución tales como cristalización, electroforesis y cromatografía.
“Enantiómeros” se refiere a dos estereoisómeros de un compuesto que son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Las definiciones estereoquímicas y convenciones usadas en el presente documento generalmente siguen S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, Nueva York; y Eliel, E. y Wilen, S., “Stereochemistry of Organic Compounds”, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 1994. Los compuestos para uso en la invención pueden contener centros asimétricos o quirales, y por lo tanto pueden existir en diferentes formas estereoisoméricas. Se pretende que todas las formas estereoisoméricas de los compuestos de la invención, que incluyen diastereómeros, enantiómeros y atropisómeros, así como mezclas de éstos tales como las mezclas racémicas, forman parte de la presente invención. Muchos compuestos orgánicos existen en formas ópticamente activas, es decir, tienen la capacidad de rotar el plano del plano de la luz polarizada. Al describir un compuesto ópticamente activo, los prefijos D y L, o R y S, se usan para denotar la configuración absoluta de la molécula alrededor de su(s) centro(s) quiral(es). Los prefijos d y I o (+) y (-) se emplean para designar el signo de rotación del plano de la luz polarizada por el compuesto, donde (-) o l significa que el compuesto es levorrotatorio. Un compuesto con el prefijo (+) o d es dextrorrotatorio. Para una estructura química dada, estos estereoisómeros son idénticos excepto porque son imágenes especulares entre sí. Un estereoisómero específico puede referirse además como un enantiómero, y una mezcla de esos isómeros se llama frecuentemente una mezcla enantiomérica. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se refiere como una mezcla racémica o un racemato, lo que puede ocurrir cuando no ha habido estereoselección o estereoespecificidad en una reacción o proceso químico. Los términos “mezcla racémica” y “racemato” se refieren a una mezcla equimolar de dos especies enantioméricas, desprovista de actividad óptica. El término “tautómero” o “forma tautomérica” se refiere a isómeros estructurales de diferentes energías que son interconvertibles a través de una barrera de baja energía. Por ejemplo, los tautómeros del protón (además conocidos como tautómeros prototrópicos) incluyen interconversiones a través de la migración de un protón, tal como isomerizaciones ceto-enol e imina-enamina. Los tautómeros de valencia incluyen interconversiones por reorganización de algunos de los electrones de unión.
El término “profármaco” tal y como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o forma de derivado de un compuesto para su uso en la invención que es capaz de ser enzimáticamente o hidrolíticamente activado o convertido en la forma parental más activa. Véase p. ej., Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen profármacos que contienen éster, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptidos, profármacos modificados de D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen plactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida, profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos de 5-fluocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que se pueden convertir en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse en una forma de profármaco para su uso en esta invención incluyen compuestos para su uso en la invención y agentes quimioterapéuticos tal como se ha descrito anteriormente.
El término “profármaco” también se refiere a un derivado de un compuesto que se puede hidrolizar, oxidar, o hacer reaccionar de otra forma bajo condiciones biológicas (in vitro o in vivo) para proporcionar un compuesto para su uso en esta invención. Los profármacos solamente se pueden hacer activos después de tal reacción en condiciones biológicas, o estos pueden tener actividad en sus formas sin reaccionar. Los ejemplos de profármacos contemplados en conexión con esta invención incluyen análogos o derivados de los compuestos de una cualquiera de las fórmulas descritas en el presente documento que comprenden restos biohidrolizables tales como amidas biohidrolizables, ésteres biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos biohidrolizables, ureidos biohidrolizables, y análogos de fosfato biohidrolizables. Otros ejemplos de profármacos incluyen derivados de compuestos de una cualquiera de las fórmulas descritas en el presente documento que comprenden los restos -NO, -NO2 , -ONO, o -ONO2. Los profármacos pueden prepararse típicamente usando métodos bien conocidos, tales como los descritos por Burger's Medicinal chemistry and Drug Discovery (1995) 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5a ed); véase además Goodman and Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8a ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, “Biotransformation of Drugs”.
Una forma preferida del profármaco de la invención incluye compuestos (con o sin grupos conectores) y conjugados de la invención que comprenden un aducto formado entre un enlace imina de los compuestos / conjugados y un reactivo que reacciona con imina.
La expresión “reactivo que reacciona con imina” se refiere a un reactivo que es capaz de reaccionar con un grupo imina. Los ejemplos de reactivo que reacciona con imina incluyen sulfitos (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32-o HSO2- formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono, di, tri, y tetra- tiofosfatos (PO3SH3 , PO2S2H3 , POS3H3 , PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), ésteres de tiofosfato ((R¡O)2PS(OR¡), R¡SH, R'SOH, RSO2H, RSO3H), varias aminas (hidroxil amina (p. ej., NH2OH), hidrazina (p. ej., NH2NH2), NH2O-R¡, R¡'NH-R¡, NH2-R¡), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 'tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2- formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, en donde R¡ y R¡' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2 , -CO2H, -SO3H, y -PO3 H; R¡ y R¡' puede estar además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferentemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; más preferentemente, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferentemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+. Preferentemente, el reactivo que reacciona con imina se selecciona de sulfitos, hidroxil amina, urea e hidrazina. Más preferentemente, el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
Tal y como se usa en el presente documento y a no ser que se indique otra cosa, los términos “amida biohidrolizable”, “éster biohidrolizable”, “carbamato biohidrolizable”, “carbonato biohidrolizable”, “ureido biohidrolizable” y “análogo de fosfato biohidrolizable” significa una amida, éster, carbamato, carbonato, ureido, o análogo de fosfato, respectivamente, que bien: 1) no destruye la actividad biológica del compuesto y confiere propiedades ventajosas a los compuestos in vivo , tales como captación, duración de la acción, o inicio de la acción; o 2) es en sí mismo biológicamente inactivo pero se convierte in vivo en un compuesto biológicamente activo. Los ejemplos de amidas biohidrolizables incluyen amidas de alquilo inferior, amidas de a-aminoácido, alcoxiacil amidas, y alquilaminoalquilcarbonil amidas. Los ejemplos de ésteres biohidrolizables incluyen ésteres de alquilo inferior, alcoxiaciloxiésteres, ésteres de alquil acilamino alquilo, y ésteres de colina. Los ejemplos de carbamatos biohidrolizables incluyen, pero sin limitarse a, alquilaminas inferiores, etilendiaminas sustituidas, aminoácidos, hidroxialquilaminas, aminas heterocíclicas y heteroaromáticas, y poliéter aminas. Particularmente, los profármacos y sales de profármaco favorecidos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos para su uso en esta invención cuando tales compuestos se administran a un mamífero.
La frase “sal farmacéuticamente aceptable” tal y como se usa en el presente documento, se refiere a sales orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables de un compuesto para uso en la invención. Las sales ilustrativas incluyen sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucuronato, sacarato, formato, benzoato, glutamato, metanosulfonato “mesilato”, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, pamoato (es decir, sales de 1,1'-metileno-bis-(2-hidroxi-3-naftoato)), sales de metales alcalinos (p. ej., sodio y potasio), sales de metales alcalinotérreos (p. ej., magnesio), y sales de amonio. Una sal farmacéuticamente aceptable puede implicar la inclusión de otra molécula tal como un ion acetato, un ion succinato u otro contraión. El contraión puede ser cualquier resto orgánico o inorgánico, que estabiliza la carga en el compuesto original. Además, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener más de un átomo cargado en su estructura. Los casos en los que múltiples átomos cargados son parte de la sal farmacéuticamente aceptable pueden tener múltiples contraiones. Por lo tanto, una sal farmacéuticamente aceptable puede tener uno o más átomos cargados y/o uno o más contraiones.
Si el compuesto para su uso en la invención es una base, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier método adecuado disponible en la técnica, por ejemplo, tratamiento de la base libre con un ácido inorgánico, tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, acido nítrico, ácido metanosulfónico y ácido fosfórico, o con un ácido orgánico, tal como ácido acético, ácido maleico, ácido succínico, ácido mandélico, ácido fumárico, ácido malónico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido glicólico, ácido salicilico, un ácido piranosidilo, tal como ácido glucurónico o ácido galacturónico, un alfa hidroxi ácido, tal como ácido cítrico o ácido tartárico, un aminoácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico, un ácido aromático, tal como ácido benzoico o ácido cinámico, un ácido sulfónico, tal como ácido p-toluenosulfónico o ácido etanosúlfonico.
Si el compuesto para uso en la invención es un ácido, la sal farmacéuticamente aceptable deseada puede prepararse por cualquier método adecuado, por ejemplo, tratamiento del ácido libre con una base inorgánica u orgánica, tal como una amina (primaria, secundaria o terciaria), un hidróxido de metal alcalino o hidróxido de metal alcalinotérreo. Los ejemplos ilustrativos de sales adecuadas incluyen sales orgánicas derivadas de aminoácidos, tales como glicina y arginina, amoníaco, aminas primarias, secundarias y terciarias, y aminas cíclicas, tales como piperidina, morfolina y piperazina, y sales inorgánicas derivadas del sodio, calcio, potasio, magnesio, manganeso, hierro, cobre, cinc, aluminio y litio.
Tal y como se usa en el presente documento, el término “solvato” significa un compuesto que incluye además una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de disolvente tal como, agua, isopropanol, acetona, etanol, metanol, DMSO, acetato de etilo, ácido acético, y etanolamina diclorometano o 2-propanol, unidos por fuerzas intermoleculares no covalentes. Los solvatos o hidratos de los compuestos se preparan fácilmente por adición de al menos un equivalente molar de un disolvente hidroxílico tales como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol o agua al compuesto para dar lugar a la solvatación o hidratación del resto imina.
Un “metabolito” es un producto producido a través del metabolismo en el cuerpo de un compuesto específico, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, o sal del mismo. Los metabolitos de un compuesto, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, pueden identificarse usando técnicas habituales conocidas en la técnica y sus actividades pueden determinarse usando ensayos tales como los descritos en el presente documento. Tales productos pueden producirse, por ejemplo, a partir de la oxidación, hidroxilación, reducción, hidrólisis, amidación, desamidación, esterificación, desesterificación y escisión enzimática, del compuesto administrado. En consecuencia, la invención incluye metabolitos de los compuestos, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, de la invención, que incluyen compuestos, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, producidos por un proceso que comprende poner en contacto un compuesto, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo, de esta invención con un mamífero durante un periodo de tiempo suficiente como para obtener un producto metabólico del mismo.
La frase “farmacéuticamente aceptable” indica que la sustancia o composición debe ser compatible químicamente y/o toxicológicamente, con los otros ingredientes que comprende una formulación, y/o el mamífero que se trata con la misma.
El término “grupo protector” o “resto protector” se refiere a un sustituyente que se emplea comúnmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras reaccionan otros grupos funcionales en el compuesto, un derivado del mismo, o un conjugado del mismo. Por ejemplo, un “grupo protector de amina” o un “resto protector de amino” es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Tales grupos son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, P. Wuts y T. Greene, 2007, Protective Groups in Organic Synthesis, Capítulo 7, J. Wiley & Sons, NJ) y ejemplificados por carbamatos tal como metil y etil carbamato, FMOC, etil carbamatos sustituidos, carbamatos escindidos por eliminación 1,6-p (además llamado “autoinmolativo”), derivados de ureas, amidas, péptidos, alquilo y arilo. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen acetilo, trifluoroacetilo, t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo (CBZ) y 9-fluorenilmetilenoxicarbonilo (Fmoc). Para una descripción general de los grupos protectores y su uso, véase P. G.M. Wuts & T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 2007.
El término “grupo saliente” se refiere a un grupo de resto cargado o no cargado que se aleja durante una sustitución o desplazamiento. Tales grupos salientes son bien conocidos en la técnica e incluyen halógenos, ésteres, alcoxi, hidroxilo, tosilatos, triflatos, mesilatos, nitrilos, azida, carbamato, disulfuros, tioésteres, tioéteres y compuestos de diazonio.
La expresión “agente de reticulación bifuncional”, “conector bifuncional” o “agentes de reticulación” se refiere a agentes modificadores que poseen dos grupos reactivos conectados a un “grupo conector”; uno de cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión a células mientras que el otro reacciona con el compuesto citotóxico para conectar los dos restos entre sí. Tales reticuladores bifuncionales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Isalm y Dent en Bioconjugation capítulo 5, p218-363, Groves Dictionaries Inc. Nueva York, 1999). Por ejemplo, los agentes de reticulación bifuncionales que permiten el enlace a través de un enlace tioéter incluyen N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) para introducir grupos maleimido, o con N-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. Otros agentes de reticulación bifuncionales que introducen grupos maleimido o grupos haloacetilo en un agente de unión a células son bien conocidos en la técnica (véanse las Solicitudes de Patente US 2008/0050310, 20050169933, disponibles en Pierce Biotechnology Inc., P.O. Box 117, Rockland, IL 61105, Estados Unidos) e incluyen bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), b M(PEO)2 , BM(PEO)3, N-(p-maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidobutírico (Gm BS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un análogo de SMCC de “cadena larga” (LC-SMCC), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico o sal de HCl (MPBH), N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil éster del ácido kmaleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), succinimidil-6-(pmaleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), succinimidil-(4-vinilsulfonilo)benzoato (Sv Sb), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4 bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(Y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(e-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(K-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), y sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB).
Los agentes de reticulación heterobifuncionales son agentes de reticulación bifuncionales que tienen dos grupos reactivos diferentes. Los agentes de reticulación heterobifuncionales que contienen un grupo N-hidroxisuccinimida que reacciona con amina (grupo NHS) y un grupo hidrazina que reacciona con carboilo pueden usarse además para reticular los compuestos citotóxicos descritos en el presente documento con un agente de unión a células (p. ej., un anticuerpo). Los ejemplos de tales agentes de reticulación heterobifuncionales comercialmente disponibles incluyen succinimidil 6-hidrazinonicotinamida acetona hidrazona (SANH), hidrocloruro de succinimidil 4-hidrazidotereftalato (SHTH) e hidrocloruro de succinimidil hidrazino nicotinato (SHNH). Los conjugados que portan un enlace ácido-lábil pueden prepararse además usando un derivado de benzodiazepina que porta hidrazina de la presente invención. Los ejemplos de agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse incluyen succinimidil-p-formil benzoato (SFB) y succinimidil-p-formilfenoxiacetato (SFPA).
Los agentes de reticulación bifuncionales que permiten el enlace del agente de unión a células con los compuestos citotóxicos a través de enlaces disulfuro incluyen N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, y otros agentes conocidos en la técnica que incluyen N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SpDB), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB) para introducir grupo ditiopiridilo. Otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para introducir grupos disulfuro son conocidos en la técnica y se describen en las Patentes U.S. 6913748, 6 716 821 y en las Publicaciones de Patentes US 20090274713 y 20100129314. Alternativamente, pueden usarse también agentes de reticulación tales como 2-iminotiolano, homocisteína tiolactona o anhídrido S-acetilsuccínico que introduce grupos tiol.
Un “conector””, “resto conector””, o “grupo conector”” tal y como se define en el presente documento, se refiere a un resto que conecta dos restos, tal como un agente de unión a células y un compuesto citotóxico, juntos. Un agente de reticulación bifuncional puede comprender dos grupos reactivos, uno en cada extremo de un resto conector, de modo que un grupo reactivo puede reaccionar primero con el compuesto citotóxico para proporcionar un compuesto que porta el resto conector y un segundo grupo reactivo, que puede reaccionar después con un agente de unión a células. Alternativamente, un extremo del agente de reticulación bifuncional puede reaccionar primero con el agente de unión a células para proporcionar un agente de unión a células que porta un resto conector y un segundo grupo reactivo, que puede reaccionar después con un compuesto citotóxico. El resto conector puede contener un enlace químico que permite la liberación del resto citotóxico en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles a ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles a peptidasa y enlaces lábiles a esterasa (véanse, por ejemplo, las Patentes US 5208020; 5475092; 6 441 163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 y 7414073). Los preferidos son los enlaces disulfuro, tioéter y enlaces lábiles a peptidasa. Otros conectores que pueden usarse en la presente invención incluyen conectores no escindibles, tales como los descritos en detalle en la publicación de EE.UU. número 20050169933, o conectores cargados o conectores hidrófilos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976.
En una realización, el grupo conector con un grupo reactivo unido en un extremo, tal como un éster reactivo, se selecciona de la siguiente “Lista 1”:
-O(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-O(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-O(CR20R21) m(alquinilo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-O(CR20R21) m(piperazino)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-O(CR20R21) m(pirrolo)t(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-O(CR20R21)mA’m-(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y"(CR24R2s)q(CO)tX",
-S(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-S(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-S(CR20R21) m(alquinilo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-S(CR20R21) m(piperazino)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-S(CR20R21) m(pirrolo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-S(CR20R21)mA”m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(CR26=CR27)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)pY”(CR24R25)q(CO)tX”,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(alquinilo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y”(CR24R25)q-(CO)tX”,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(piperazino)f(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)pY”(CR24R25)q(CO)tX”,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)m(pirrob)f(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y”(CR24R25)q-(CO)tX”,
-NR33(C=O)p"(CR20R21)mA”m"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y”(CR24R25)q(CO)tX”,
-(CR20R21)m(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21)m(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21) m(alquinilo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21) m(piperazmo)t'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41 )p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21)mA”m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(CR26=CR27)m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R4l)p"Y” (CR24R25)q(CO)tX” ,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)n"(alquinilo)n(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41VY”(CR24R25)q(CO)tX”,
-(CR20R21)m(CR29=N-NR30)rtA”m'(CR22R23)n(OCH2CH2)p(CR40R41)p"Y"(CR24R25)q(CO)tX”,
en donde:
m, n, p, q, m', n', t' son un número entero de 1 a 10, o son opcionalmente 0;
t, m”, n” y p” son 0 o 1;
X" se selecciona de OR36, SR37, NR38R39, en donde R36, R37, R38, R39 son H, o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 20 átomos de carbono y, o, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2K R37, opcionalmente, es un grupo protector de tiol cuando t = 1, COX'' forma un éster reactivo seleccionado de ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxi sulfo-succinimida, ésteres de paranitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo y sus derivados, en donde dichos derivados facilitan la formación del enlace amida;
Y'' está ausente o se selecciona de O, S, S-S o NR32, en donde R32 tiene la misma definición que la dada anteriormente para R, ocuando Y” no es S-S y t = 0, X” se selecciona de un grupo maleimido, un grupo haloacetilo o SR37, en donde R37 tiene la misma definición que anteriormente;
A” es un aminoácido seleccionado de glicina, alanina, leucina, valina, lisina, citrulina y glutamato o un polipéptido que contiene entre 2 a 20 unidades de aminoácidos;
R20, R21, R22, R23, R24, R25, R26, y R27 son iguales o diferentes y son H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 5 átomos de carbono;R29 y R30 son iguales o diferentes y son H o alquilo de 1 a 5 átomos de carbono;
R33 es H o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 12 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2K o R33 es -COR34, -CSR34, -SOR34, o -SO2R34, en donde R34 es H o alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 20 átomos de carbono o, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2K y
uno de R40 y R41 es opcionalmente un grupo funcional cargado negativamente o positivamente y el otro es H o alquilo, alquenilo, alquinilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
El término “aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural o aminoácidos que no son de origen natural representados por NH2-C(Raa'Raa)-C(=O)OH, en donde Raa y Raa' son cada uno independientemente H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heteroarilo o heterociclilo. El término “aminoácido" se refiere además al residuo correspondiente cuando un átomo de nitrógeno se elimina del extremo amino y/o carboxilo del aminoácido, tal como -NH-C(Raa'Raa)-C(=O)O-. El término “catión" se refiere a un ion con carga positiva. El catión puede ser monovalente (p. ej., Na+, K+, etc.), bivalente (p. ej., Ca2+, Mg2+, etc.) o multivalente (p. ej., Al3+ etc.). Preferentemente, el catión es monovalente.
La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz" significa esa cantidad del compuesto activo o conjugado que provoca la respuesta biológica deseada en un sujeto. Tal respuesta incluye alivio de los síntomas de la enfermedad o trastorno que se trata, prevención, inhibición o un retraso en la recurrencia del síntoma de la enfermedad o de la propia enfermedad, un aumento en la longevidad del sujeto comparado con la ausencia del tratamiento, o prevención, inhibición o retraso en la progresión del síntoma de la enfermedad o la propia enfermedad. La determinación de la cantidad eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada que se proporciona en el presente documento. La toxicidad y eficacia terapéutica del compuesto I puede determinarse por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares y en animales de experimentación. La cantidad eficaz del compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se administra a un sujeto dependerá del estadio, categoría y estado del mieloma múltiple y de características del sujeto, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia al fármaco. La cantidad eficaz del compuesto o conjugado de la presente invención u otro agente terapéutico que se va a administrar además dependerá de la vía de administración y la forma de dosificación. La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles plasmáticos del compuesto activo que son suficientes para mantener los efectos terapéuticos deseados.
La expresión “grupo que reacciona con tiol" se refiere a un grupo funcional que reaccionará con un resto tiol. Los ejemplos de grupo que reacciona con tiol incluyen maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo (p. ej., haloacetamido) o un disulfuro (p. ej., -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo).
El término “éster reactivo" se refiere a un éster que contiene un grupo saliente que se desplaza fácilmente por un grupo amina o un grupo hidroxilo. Los ejemplos de éster reactivo incluyen éster de N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxi sulfosuccinimida, éster de nitrofenilo, éster de dinitrofenilo, éster de tetrafluorofenilo, éster de sulfotetraflurofenilo, y éster de pentafluorofenilo. Preferentemente, el éster reactivo es éster de N-hidroxisuccinimida (NHS).
La expresión “un fármaco que contiene imina" o “un compuesto citotóxico que contiene imina" se refiere a un compuesto descrito en el presente documento (sin un grupo conector) que tiene al menos un grupo funcional imina. Preferentemente, el fármaco que contiene imina contiene un grupo funcional imina.
Métodos de la presente invención
En un primer aspecto, la presente invención se dirige a un método como se define en la reivindicación 1.
En determinadas realizaciones, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico antes de reaccionar con el CBA modificado.
En determinadas realizaciones, el compuesto citotóxico y el resto del grupo conector del conjugado se representan por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000021_0001
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (Ib') y (IIb') se produce a partir de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo de heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2 NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2V-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; L está ausente, o cuando está presente, comprende un grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido
en donde al menos uno de X', Y', R6, Rc, Ri, R2 , R3 , R4 , Ri', R2 ', R3 ', R4 ', L (p. ej., a través de un grupo opcionalmente sustituido), está unido al grupo conector en las fórmulas (Ib') o (IIb').
En ciertas realizaciones, el CBA modificado se prepara haciendo reaccionar el CBA con el agente de reticulación bifuncional, comprendiendo dicho agente de reticulación bifuncional el grupo que reacciona con tiol y un grupo que reacciona con el CBA, ambos unidos al grupo conector.
En ciertas realizaciones, el grupo que reacciona con el CBA reacciona con un grupo amino del CBA (tal como el grupo amino de una cadena lateral de Lys), o con un grupo tiol del CBA (tal como el grupo tiol de una cadena lateral de Cys).
En ciertas realizaciones, el grupo que reacciona con tiol se selecciona del grupo que consiste en maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
Alternativamente, el grupo que reacciona con tiol puede ser maleimido, haloacetamido o -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
En ciertas realizaciones, el CBA modificado es:
Figure imgf000023_0001
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 8, en el que en la “etapa uno", un reactivo que reacciona con imina (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade al fármaco que contiene un tiol y se deja que reaccione y forme un fármaco modificado que porta el grupo tiol. El fármaco modificado se purifica opcionalmente para eliminar el exceso de reactivo que reacciona con imina. En la “etapa dos", el anticuerpo se modifica con un conector que contiene un grupo X que reacciona con tiol (maleimida, SSPy, vinil sulfona, etc), y reacciona con el fármaco modificado que porta el grupo tiol a pH 6-9 para generar un enlace disulfuro o tioéter estable entre el fármaco y el anticuerpo. En la "etapa tres", los productos secundarios (tales como el exceso de reactivo que reacciona con imina, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de las moléculas del fármaco conjugadas con el anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1-10.
Un ejemplo representativo de un método de conjugación de dos etapas se describe en la FIG. 16, en donde un anticuerpo se modifica primero con un agente de reticulación bifuncional dando lugar a un anticuerpo que posee un número deseado de conectores adecuados para la reacción con un compuesto dímero que tiene un resto de tiol libre. En este ejemplo, el anticuerpo huMy9-6 se modificó primero con SPDB para dar un anticuerpo con conectores que contienen el resto ditiopiridilo. El anticuerpo modificado se expuso después a un tiol libre, tal como 2a, generando el conjugado deseado huMy9-6-SPDB-2a. Los conectores que reaccionan con tiol adecuados adicionales que pueden usarse en reacciones similares se incluyen en la FIG 16.
El reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco que porta un grupo tiol en disolvente orgánico (p. ej., dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, etanol, metanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, o una mezcla de los mismos) o una mezcla de agua (p. ej., agua desionizada) y uno o más disolventes orgánicos. Cuando solo se usa el disolvente orgánico, el reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco a temperatura ambiente durante 30 min o más (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se complete). Preferentemente, el tiempo de incubación/reacción es aproximadamente 0-4 h, o 1-3 h. La mezcla resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) modificado con un grupo que reacciona con tiol tamponado a pH aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a -20 °C o -80 °C, y usarse después, mientras que mantiene su reactividad con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo). Si una mezcla de agua y de disolvente(s) orgánico(s) se usa como un sistema co-solvente miscible (p. ej., agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y del reactivo que reacciona con imina se usa inmediatamente o se mantiene congelada hasta su uso después de mezclar para hacer reaccionar con el agente de unión a células que porta un grupo que reacciona con tiol. Si una mezcla de agua y de disolvente(s) orgánico(s) se usa como un sistema co-solvente no miscible (p. ej., agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo que reacciona con imina se mezclan durante 10 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se complete), y la capa acuosa se recoge, se cuantifica para el fármaco y tiol reactivo (p. ej., por espectroscopia de UV y ensayo de Ellman con DTNB (reactivo 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzoico)) y se añade al agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) que porta un grupo que reacciona con tiol tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método tal como se define en la reividicación 2.
En ciertas realizaciones, el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) se pone en contacto con un fármaco (p. ej., el compuesto citotóxico que contiene imina) y un reactivo que reacciona con imina para formar una primera mezcla; y la primera mezcla se pone en contacto después con un agente de reticulación bifuncional para formar el conjugado agente de unión a células-fármaco. Preferentemente, el agente de reticulación bifucional se pone en contacto con la primera mezcla inmediatamente después de la formación de la primera mezcla. Alternativamente, la primera mezcla se mantuvo durante un intervalo de tiempo (p. ej., aproximadamente 1-10 min, aproximadamente 10-30 min, aproximadamente 30 min a 1 h, aproximadamente 1 a 5 h, aproximadamente 5 a 24 h, o aproximadamente 1 a 2 días) antes de ponerla en contacto con un agente de reticulación bifuncional.
En ciertas realizaciones, el método puede comprender además purificar el conjugado.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 10, en la cual en la “etapa 1", un reactivo que reacciona con imina (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade al CBA (p. ej., un anticuerpo), un fármaco que contiene un tiol, un agente de reticulación bifuncional que contiene tanto un grupo X que reacciona con tiol (maleimida, SSPy, vinil sulfona, etc) como un grupo éster reactivo, y se deja que proceda la reacción a pH 6­ 9 para generar un conjugado estable fármaco-anticuerpo. En la “etapa dos", los productos secundarios (tal como exceso de reactivo que reacciona con imina, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de moléculas del fármaco conjugadas con el anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1-10.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método como se define en la reividicación 3.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico se produce haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol de las siguientes fórmulas con un reactivo que reacciona con imina en una mezcla de reacción
Figure imgf000024_0001
En ciertas realizaciones, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico antes de la etapa a). En ciertas realizaciones, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico modificado antes de la etapa b).
En ciertas realizaciones, la mezcla de reacción se almacena congelada antes que se descongele la mezcla congelada y se lleve a cabo la etapa a).
En ciertas realizaciones, el método puede comprender además almacenar la mezcla de reacción de la etapa a) congelada antes de descongelar y antes que se lleve a cabo la etapa b).
En ciertas realizaciones, el agente de reticulación bifuncional es bis-maleimidohexano o BMPEO.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 11, en el cual en la “etapa 1", un reactivo que reacciona con imina (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade a un compuesto citotóxico que contiene un tiol. El compuesto citotóxico resultante se purifica opcionalmente, antes de que el compuesto citotóxico reaccione en la “etapa dos" con un agente de reticulación bifuncional (tal como un bismaleimidohexano o BMPEO) para producir un segundo fármaco modificado que porta un grupo que reacciona con tiol. Después, en la “etapa tres", se añade un CBA que contiene tiol (tal como anticuerpo) y la reacción se deja que proceda (a pH 6-9) para generar un conjugado fármaco-anticuerpo estable. En la “etapa cuatro", los productos secundarios (tales como exceso del reactivo que reacciona con imina, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan y se formula el conjugado. El número de moléculas del fármaco conjugadas con el anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1-10.
El reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco que porta un grupo que reacciona con tiol en disolvente orgánico (p. ej., dimetilacetamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido, acetonitrilo, etanol, metanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, o una mezcla de los mismos) o una mezcla de agua (p. ej., agua desionizada) y uno o más disolventes orgánicos. Cuando sólo se usa disolvente orgánico, el reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco a temperatura ambiente durante 30 min o más (por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que se complete la reacción). Preferentemente, el tiempo de incubación/reacción es de aproximadamente 0-4 h, o 1-3 h. La mezcla resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) modificado con un grupo que reacciona con tiol tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a -20 °C o -80 °C, y usarse después mientras mantiene su reactividad con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo). Si se usa una mezcla de agua y de disolvente(s) orgánico(s) como un sistema de co-solvente miscible (p. ej., agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y el reactivo que reacciona con imina se usa inmediatamente después de mezclar o se mantiene congelada hasta el uso para reaccionar con el agente de unión a células que porta un grupo que reacciona con tiol. Si se usa una mezcla de agua y de disolvente(s) orgánico(s) como un sistema co-solvente no-miscible (p. ej., agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo que reacciona con imina se mezclan durante 10 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se completa), y la capa acuosa se recoge, se cuantifica para el fármaco (p. ej., por espectroscopia de UV) y se añade al agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) que porta un grupo tiol tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En un cuarto aspecto, la presente invención se dirige a un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar un segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado comprende:
un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al compuesto citotóxico, y el residuo comprende el grupo conector y un grupo reactivo seleccionado de un éster reactivo y un grupo que reacciona con tiol y se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000025_0001
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado se produce al reaccionar un reactivo que reacciona con imina con un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo conector y el grupo reactivo y en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000026_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (Ia') y (IIa') se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo de heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato
-OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, halógeno o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n'-CRzR8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH)n'-O-(CH)na'- y -(CH2)n'-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; L está ausente, el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo está opcionalmente sustituido con el grupo conector con el grupo reactivo unido a él; fenilo o el anillo heterocíclico o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, en donde el sustituyente puede ser el grupo conector con el grupo reactivo unido a él; y el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2-formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
En ciertas realizaciones, el método puede comprender además purificar el compuesto citotóxico modificado antes de reaccionar con el CBA.
En ciertas realizaciones, el éster reactivo puede seleccionarse del grupo que consiste en éster de N-hidroxisuccinimida, éster de N-hidroxi sulfosuccinimida, éster de nitrofenilo, éster de dinitrofenilo, éster de tetrafluorofenilo, éster de sulfo-tetraflurofenilo, y éster de pentafluorofenilo. Preferentemente, el éster reactivo es éster de N-hidroxisuccinimida.
En ciertas realizaciones, el grupo que reacciona con tiol puede seleccionarse del grupo que consiste en maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida, un grupo basado en haloacetilo y un grupo disulfuro.
En ciertas realizaciones, el grupo que reacciona con tiol puede ser maleimido, haloacetamido o -SSRd, en donde Rd es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo, 2-nitropiridilo, 4-nitropiridilo, o 3-carboxi-4-nitropiridilo.
Un esquema de reacción ilustrativo se muestra en la FIG. 7, en el cual en la “etapa uno", un reactivo que reacciona con imina (mostrado en el esquema de reacción como un nucleófilo (Nuc:)) se añade al fármaco que contiene un éster reactivo (1c) y se dejan reaccionar para formar un fármaco modificado. El fármaco modificado puede ser opcionalmente purificado para eliminar el exceso de reactivo que reacciona con imina. En la “etapa dos", el fármaco modificado con un éster reactivo se hace reaccionar con un anticuerpo tamponado a pH 6-9. En la “etapa tres", los productos secundarios (tales como exceso del reactivo que reacciona con imina, el fármaco modificado que no reacciona con el anticuerpo, etc.) se eliminan, y se formula el conjugado. El número de moléculas de fármaco conjugadas al anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1 a 10.
Otro esquema de reacción que representa un método ilustrativo de la presente invención se muestra en la FIG. 9. En la “etapa uno", un reactivo que reacciona con imina se añade al fármaco que contiene un grupo que reacciona con tiol (donde R es un grupo maleimida, SSPy, etc.) y se dejan reaccionar y formar un fármaco modificado. El fármaco modificado se purifica opcionalmente para eliminar el exceso de reactivo que reacciona con imina. En la “etapa dos", el fármaco modificado se hace reaccionar con un anticuerpo que contiene un tiol reactivo para formar un conjugado anticuerpo-fármaco que tiene el anticuerpo unido covalentemente al fármaco a través de un enlace disulfuro o tioéter estable. Los anticuerpos con el grupo tiol reactivo pueden generarse por los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, al reducir los disulfuros intercadena, codificar genéticamente la cisteína, o modificar el anticuerpo con conectores que contienen tioles o tioles químicamente enmascarados. En la “etapa tres", el fármaco que no reacciona con el anticuerpo se elimina y se formula el conjugado. El número de moléculas de fármaco conjugadas al anticuerpo es igual a n, el cual puede ser, por ejemplo, de 1-10.
El reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco que porta un éster activado (p. ej., éster de N-hidroxisuccinimidilo, éster de pentafluorofenol, éster de sulfo N-hidroxisuccinimidilo) en un disolvente orgánico (p. ej., dimetil acetamida, etanol, cloruro de metileno, cloroformo, dioxano, o una mezcla de los mismos) o una mezcla de agua (p. ej., agua desionizada) y uno o más disolventes orgánicos. Cuando se usa sólo disolvente orgánico, el reactivo que reacciona con imina puede mezclarse con el fármaco a una temperatura de 0 a 100 °C, preferentemente a una temperatura de 0 a 30 °C, más preferentemente a temperatura ambiente durante 5 min o más (por ejemplo, aproximadamente 30 min, 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas o hasta que la reacción se complete). Preferentemente, el tiempo de incubación/reacción es de aproximadamente 0-4 h, o de 1-3 h. La mezcla de reacción resultante puede usarse inmediatamente para reaccionar con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 9. Alternativamente, la mezcla de reacción puede congelarse y almacenarse, por ejemplo, a aproximadamente -20 °C o
-80 °C y usarse después mientras mantiene su reactividad con el anticuerpo. Preferentemente, no se requiere la purificación de los productos intermedios. Cuando se usa una mezcla de agua y disolvente orgánico como un sistema de co-disolvente miscible (p. ej., agua y dimetilacetamida), la mezcla de reacción del fármaco y la imina se usa inmediatamente después de mezclar o se mantiene congelada hasta el uso para reaccionar con el agente de unión a células (p. ej., anticuerpo). Cuando se usa una mezcla de agua y disolvente orgánico como un sistema codisolvente no miscible (p. ej., agua y cloruro de metileno), el fármaco y el reactivo que reacciona con imina se mezclan durante 10 min o más, y la capa acuosa se recoge, se cuantifica para el fármaco y se añade al agente de unión a células (p. ej., anticuerpo) tamponado a pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 9.
En cualquiera de los aspectos anteriores, se puede usar una cantidad adecuada del reactivo que reacciona con imina. Por ejemplo, se pueden usar aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 equivalentes molares del reactivo que reacciona con imina respecto al fármaco. Preferentemente, se pueden usar de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes molares, más preferentemente, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 equivalentes molares, y aún más preferentemente, de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 equivalentes molares del reactivo que reacciona con imina.
Usando este procedimiento general, en cualquiera de los aspectos anteriores, puede usarse cualquiera de los siguientes reactivos que reaccionan con imina: sulfitos (H2SO3, H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono, di, tri, y tetratiofosfatos (PO3SH3 , PO2S2H3 , POS3H3 , PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), ésteres de tiofosfato ((R'O)2PS(OR¡), R¡SH, R'SOH, RSO2H, RSO3H), varias aminas (hidroxil amina (p. ej., NH2OH), hidrazina (p. ej., NH2NH2), NH2O-R¡, R¡'NH-R¡, NH2-R¡), NH2-CO-NH2 , NH2-C(=S)-NH2 , tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32 formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2-formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, en donde R¡ y R¡' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2 , -CO2H, -SO3H, y -PO3H; R¡ y R¡' pueden estar además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de de 1 a 6 átomos de carbono; y Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo (preferentemente, Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; más preferentemente, Rk es metilo, etilo o propilo). Preferentemente, el catión es un catión monovalente, tal como Na+ o K+.
Preferentemente, el reactivo que reacciona con imina se selecciona de sulfitos (p. ej., NaHSO3 o KHSO3). Más preferentemente, el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
En una realización, los fármacos modificados descritos en cualquiera de los aspectos anteriores se purifican antes de reaccionar con un agente de unión a células. Cualquier método adecuado conocido en la técnica puede usarse para purificar el fármaco modificado. Por ejemplo, el fármaco modificado puede purificarse por cromatografía en columna (p. ej., cromatografía en gel de sílice) o HPLC.
En otra realización, el conjugado agente de unión a células-fármaco preparado de acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores se purifica por filtración de flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración por adsorción, precipitación selectiva, filtración no absorbente o combinación de los mismos. Preferentemente, se usan la filtración de flujo tangencial (TFF, además conocida como filtración de flujo cruzado, ultrafiltración y diafiltración) y/o resinas para cromatografía de adsorción para la purificación de los conjugados.
Puede usarse cualquier sistema TFF adecuado, incluyendo un sistema tipo Pellicon (Millipore, Billerica, Mass.), un sistema Sartocon Cassette (Sartorius AG, Edgewood, N.Y.), y un sistema tipo Centrasette (Pall Corp., East Hills, N.Y.).
Puede utilizarse cualquier resina para cromatografía de adsorción adecuada. Las resinas para cromatografía de adsorción preferidas incluyen resinas para cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de inducción por carga hidrófoba (HCIC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de intercambio de iones en modo mixto, cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC), cromatografía con ligando-tinte, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase reversa, y combinaciones de los mismos. Los ejemplos de resinas de hidroxiapatita adecuadas incluyen hidroxiapatita cerámica (CHT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.), hidroxiapatita HA Ultrogel (Pall Corp., East Hills, N.Y.), y fluoroapatita cerámica (CFT Tipo I y Tipo II, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Un ejemplo de una resina HCIC adecuada es la resina MEP Hypercel (Pall Corp., East Hills, N.Y.). Los ejemplos de resinas HIC adecuadas incluyen resinas de Butil-Sefarosa, Hexil-Sefarosa, Fenil-Sefarosa, y Octil Sefarosa (todas de GE Healthcare, Piscataway, N.J.), así como resinas Macro-prep Metil y Macro-Prep t-Butil (Biorad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas de intercambio de iones adecuadas incluyen resinas de SP-Sefarosa, CM-Sefarosa, y Q-Sefarosa (todas de GE Healthcare, Piscataway, N.J.), y la resina Unosphere S (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de intercambiadores de iones en modo mixto adecuados incluyen la resina Bakerbond ABx (JT Baker, Phillipsburg N.J.). Los ejemplos de resinas IMAC adecuadas incluyen la resina de Sefarosa quelante (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) y la resina Profinity IMAC (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas con tinte-ligando adecuadas incluyen la resina Blue Sepharose (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) y la resina Affi-gel Blue (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Los ejemplos de resinas de afinidad adecuadas incluyen resina Proteína A Sefarosa (p. ej., MabSelect, GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el agente de unión a células es un anticuerpo, y las resinas de afinidad de lectina, p. ej., la resina Lentil Lectina Sefarosa (GE Healthcare, Piscataway, N.J.), donde el agente de unión a células porta sitios de unión a la lectina adecuados. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo específico para el agente de unión a células. Tal anticuerpo puede inmovilizarse en, por ejemplo, la resina Sefarosa 4 Fast Flow (GE Healthcare, Piscataway, N.J.). Los ejemplos de resinas de fase reversa adecuadas incluyen las resinas C4, C8, y C18 (Grace Vydac, Hesperia, Calif.).
Cualquier resina para cromatografía no adsorbente adecuada puede usarse en los métodos de la presente invención. Los ejemplos de resinas para cromatografía adecuadas incluyen las resinas SEPHADEXTM G-25, G-50, G-100, SEPHACRYL™ (p. ej., S-200 y S-300), resinas SUPERDEX™ (p. ej., SUPERDEX™ 75 y SUPERDEX™ 200), resinas BIO-GEL® (p. ej., P-6, P-10, P-30, P-60, y P-100), y otras conocidas por los expertos en la técnica. Fármacos que portan un resto conector
Los fármacos que pueden usarse en los presentes métodos incluyen los compuestos descritos en los documentos US2010/0316656, US 2010/003641, US2010/0203007.
En ciertas otras realizaciones, los compuestos citotóxicos que pueden conjugarse con los agentes de unión a células a través de un grupo conector no comprenden el grupo conector. En su lugar, puede requerirse un reactivo de reticulación bifuncional (que comprende el grupo conector) para conjugar el compuesto citotóxico sin conector con el CBA a través del grupo conector.
Así en la primera realización específica, un fármaco covalentemente conectado a un grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo, que puede usarse en los métodos de la presente invención (tal como en el método del reactivo de una etapa 1 como se describe en el cuarto aspecto de la invención anteriormente), o que puede ser un producto intermedio de los métodos de la invención (tal como el método descrito en el tercer aspecto de la invención), es un compuesto citotóxico que porta un grupo reactivo, tal como un éster reactivo o un grupo que reacciona con tiol (colectivamente “el grupo reactivo"), que comprende un grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, capaz de conectar covalentemente el compuesto citotóxico al CbA, en donde el compuesto citotóxico se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas (como se define en la reivindicación 1):
Figure imgf000030_0001
imina, los compuestos citotóxicos pueden representarse por una cualquiera de las siguientes fórmulas (tal como se define en la reivindicación 9):
Figure imgf000030_0002
opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo portan el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, o L es un grupo amina que porta el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo (es decir, -N(grupo conector)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo.
Varios compuestos representativos de las fórmulas (Ia') y (IIa') se enumeran a continuación:
Figure imgf000030_0003
Figure imgf000031_0001
En ciertas realizaciones,
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, y un grupo protector amina. Preferentemente, X' es -H, -OH, -Me o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo. Más preferentemente, X' es -H;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' se selecciona de -H u oxo. Más preferentemente, Y' es -H;
W es C=O;
Ri, R2 , R3 , R4, Ri ', R2 ', R3 ', y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -NR'R”, -NR'(C=O)R, -OR, -SR, -NO2 y el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo. Preferentemente, uno de R2 , R3 , R2 ', y R3 ' es el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo y el resto son -H;
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o fenilo;
R' y R” son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -H, -OH, -OR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o fenilo;
R6 es -ORc o -SRc, en donde Rc es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Aún más preferentemente, R6 es -OMe;
Z y Z' son -CH2-;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O-, -S-, -NR5 y oxo (C=O). Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O- y -S-. Más preferentemente, A y A' son -O-;
D y D' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos con uno o más (p. ej., 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, -OR, -NR'COR'', -SR, y -COR';
Preferentemente, D y D' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Más preferentemente, D y D' son alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono. Aún más preferentemente, D y D' son iguales o diferentes, y se seleccionan de un alquilo lineal que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
L está ausente, o se selecciona de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo portan el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, o L es un grupo amina que porta el grupo conector con el grupo reactivo unido a él (es decir, -N (grupo conector)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo.
En una segunda realización específica, para los dímeros citotóxicos (la) o (Ila), las variables son como las descritas más abajo:
W es C=O;
Ri, R2 , Ri', R2', R4 , y R4 ' son -H;
uno de R3 o R3' es opcionalmente el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo y el otro es -H;
R6 es -OMe;
Z y Z' son -CH2-;
X' es -H;
Y' es -H;
A y A' son -O-; y el resto de las variables son como las descritas en la primera realización específica.
En una tercera realización específica, los dímeros citotóxicos (unidos al grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo) de la fórmula (Ia') y (IIa') se representan por las siguientes fórmulas:
Figure imgf000032_0001
en donde:
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina. Preferentemente, X' es -H, -OH o -Me. Más preferentemente, X' es -H;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' se selecciona de -H o -Me. Más preferentemente, Y' es -H;
L', L'', y L''' son iguales o diferentes y se seleccionan independientemente de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol
-(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2 , -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3+M-, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, siempre que solo uno de L', L'' y L''' sea el grupo conector con el grupo reactivo unido a él. Preferentemente, L' es el grupo conector con el grupo reactivo unido a él. Alternativamente, uno de L', L'', o L”' es el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, mientras los otros son -H. Más preferentemente, L' es el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, y L'' y L''' son -H;
R6 es -ORc o -SRc, en donde Rc es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. Preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Aún más preferentemente, R6 es -OMe;
A y A' se seleccionan de -O- y -S-. Preferentemente, A y A' son -O-;
R es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo PEG (CH2CH2O)n-Rc;
n es un número entero de 1 a 24; y,
Rc es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
R' y R” son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, -OH, -OR, -NRRg', -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, un grupo PEG -(CH2CH2O)n-Rc, en donde n es un número entero de 1 a 24, preferentemente n es 2, 4 u 8; y Rg' es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o un grupo PEG (CH2CH2O)n-Rc;
G se selecciona de -CH- o -N-; y el resto de las variables son como las descritas en la primera realización específica. En una cuarta realización específica, para los dímeros citotóxicos de la fórmula (IAa') o (IIAa'), L' se representa por la fórmula:
-W'-Rx-V-Ry-J,
en donde:
W' y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o se selecciona de -CReRe-, -O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO2-, -CH2-S-, -CH2O-, -CH2NRS -O-(C=O)O-, -O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -C(=O)-N(Re)-, -N(Re)-C(=O)O-, -N(C(=O)Re)C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -(O-CH2-CH2V , -SS-, o -C(=O)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos;
Rx y Ry son iguales o diferentes, y cada uno independientemente está ausente o es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta de 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S;
Re y Re' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado 0 cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
n es un entero de 1 a 24; y
J comprende el grupo reactivo unido al mismo, y se selecciona de una maleimida, un haloacetamido, -SH, -SSRd, -CH2SH, -CH(Me)SH, -C(Me)2SH, y -COE, en donde -COE representa un éster reactivo seleccionado de éster de N-hidroxisuccinimda, éster de N-hidroxisulfosuccinimida, éster de nitrofenilo (p. ej., 2 o 4-nitrofenilo), éster de dinitrofenilo (p. ej., 2,4-dinitrofenilo), éster de sulfo-tetraflurofenilo (p. ej., 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo), y éster de pentafluorofenilo, y en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, y,
Rd se selecciona de fenilo, nitrofenilo (p. ej., 2 o 4-nitrofenilo), dinitrofenilo (p. ej., 2 o 4-nitrofenilo), carboxinitrofenilo (p. ej., 3-carboxi-4-nitrofenilo), piridilo o nitropiridilo (p. ej., 4-nitropiridilo).
Preferentemente, J es -SH, -SSRd, una maleimida, o un éster de N-hidroxisuccinimida.
Preferentemente, Re' es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk; n es un número entero de 2 a 8; preferentemente, Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2, y el resto de las variables son tal como se describió anteriormente en la tercera realización específica.
En otra realización preferida, V es un aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 8 aminoácidos. Más preferentemente, V es valina-citrulina, gly-gly-gly o ala-leu-ala-leu.
En otra realización preferida, W' es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=O)-; Re es -H, un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH2-O)n-Rk; Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; V está ausente, -(O-CH2-CH2V , -C(=O)-NH-, -S-, -NH-C(=O)-; Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y J es -SH, -SSRd o -COE (preferentemente, éster de N-hidroxisuccinimida). El resto de las variables es tal como se describió en la cuarta realización específica.
En otra realización preferida, W' es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=O)-; Re es H, -Me, o -(CH2-CH2-O)n-Me; n es un número entero de 2 a 6; Rx es un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 6 átomos de carbono; V y Ry están ausentes; y J es
-COE, preferentemente, éster de N-hidroxisuccinimida.
En una quinta realización específica, L' se representa por la siguiente fórmula:
-W'-[CRrR2”]a-V-[Cy]o-i-[CR3"R4"]b-COE,
en donde:
Ri-, R2", y R3" son cada uno independientemente -H o -Me;
R4-es -H, -Me, -SO3H, o -SO3-M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable;
a es un número entero de 0-2, b es un número entero de 0-3; y,
Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un heteroátomo de N, preferentemente, Cy es
Figure imgf000034_0001
En ciertas realizaciones, tal como en la cuarta o la quinta realizaciones específicas, W' es -N(Re)-.
En ciertas realizaciones, tal como en la cuarta o la quinta realizaciones específicas, Re es -(CH2-CH2-O)2-6- Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, tal como en la cuarta o la quinta realizaciones específicas, V es -S- o -SS-.
En una sexta realización específica, L', tal como en la cuarta o la quinta realizaciones específicas, se representa por la siguiente fórmula:
- NRe-[CRr- R2"]a-S-[CR3" R4-]b-COE.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico unido al grupo conector con el grupo reactivo unido a él, como en la 4a, 5a, y 6a realizaciones específicas, es:
Figure imgf000034_0002
en donde Y es -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En una séptima realización específica, L', tal como en la cuarta, la quinta, o la sexta realizaciones específicas, se representa por la siguiente fórmula:
- NRe-[CRr- R2"]a-S-Cy-[CR3" R4-]b-COE.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico unido al grupo conector con el grupo reactivo unido a él, como en la 4a, la 5a, o la 7a realizaciones específicas, es:
Figure imgf000035_0002
en donde Y es -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En una octava realización específica, los compuestos citotóxicos de la fórmula (la) y (Ila) se representan por las siguientes fórmulas:
Figure imgf000035_0001
en donde:
W está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo. lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
Zs es -H, -SRm;
Rm es Rd o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono que porta un éster reactivo, seleccionado de ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxi sulfo-succinimida, ésteres de para-nitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, ésteres de pentafluorofenilo;
Rd se selecciona de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo;
n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la cuarta realización específica.
Preferentemente, Rk es -H o -Me y n es un número entero de 2 a 8. Preferentemente, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables es como se describió anteriormente en la quinta realización específica.
En ciertas realizaciones, para los compuestos de la fórmula (IBa) y (IIBa) descritos en la octava realización específica, las variables son como las descritas a continuación:
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son ambos -O-;
R6 es -OMe;
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la octava realización específica.
Preferentemente, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1, 2 o 3. Más preferentemente, Rf y Rg son iguales o diferentes y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
En una novena realización específica, el compuesto citotóxico unido al grupo conector con el grupo reactivo unido a él, se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000036_0001
en donde:
Y se selecciona de -SO3M, -SO2M o -OSO3 M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+;
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector amina;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
A y A' se seleccionan de -O- y -S-;
W está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
G se selecciona de -CH- o -N-;
Zs es -H, o se selecciona de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; preferentemente q es 2;
n es un número entero de 2 a 6; preferentemente n es 4;
D es -H o -SO3M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+.
En ciertas realizaciones, Zs se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000039_0001
En ciertas realizaciones, tal como la novena realización específica, W' es -N(Re)-.
En ciertas realizaciones, Re es -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas realizaciones, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1,2 o 3.
En ciertas realizaciones, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
En una décima realización específica, las variables de la novena realización específica están representadas más abajo: Y es -SO3M; M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (p. ej., Na+); X' e Y' son ambos -H; A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 9a realizaciones específicas, Y se selecciona de -SO3 M, -SO2M y un sulfato -OSO3M. Preferentemente, Y es -SO3 M, en donde M es preferentemente -H, Na+ o K+. En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, W, cuando está presente, es C=O.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, Z y Z', cuando están presente, son -CH2-.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, y un grupo protector de amina. Preferentemente, X' es -H, -OH, -Me o el grupo conector con el grupo reactivo unido a él. Más preferentemente, X' es -H.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es -H u oxo. Más preferentemente, Y' es -H.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O-, -S-, -NR5-, y oxo -(C=O)-. Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O- y -S-. Más preferentemente, A y A' son -O-.
En cualquiera de las realizaciones anteriores, tal como la 1a a la 10a realizaciones específicas, D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, -OR, -NR'COR'', -SR y -COR'. Preferentemente, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono.
En una decimoprimera realización específica, los varios grupos de los compuestos citotóxicos de la primera, tercera, y novena realización específica, se representan más abajo: W es C=O; Ri, R2 , Ri', R2', R4 y R4 ' son -H; uno de R3 , o R3 ' es opcionalmente el grupo conector con el grupo reactivo unido a él y el otro es -H; R6 es -OMe; Z y Z' son -CH2-; X' es -H; Y' es -H; y A y A' son -O-.
En otra realización, el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo como en cualquiera de las realizaciones específicas anteriores es uno cualquiera de los enumerados en la Lista 1.
En otra realización, los dímeros citotóxicos sin un resto conector (tal como los restos conectores descritos anteriormente) unido a los mismos pueden reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional para formar un fármaco que porta un resto conector con un grupo reactivo unido al mismo, para ser usado en los métodos de la presente invención (p. ej., para reaccionar adicionalmente con un agente de unión a células para formar el conjugado fármaco-CBA). Alternativamente, los dímeros citotóxicos sin un resto conector (tal como los restos conectores descritos anteriormente) unido a los mismos pueden reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional y un reactivo de unión a células en una reacción de una etapa para formar directamente el conjugado fármaco-CBA. En cualquier caso, un reactivo que reacciona con imina puede añadirse a la mezcla de reacción para formar un aducto del reactivo que reacciona con imina-fármaco (tal como un aducto de bisulfito) antes de la reacción para crear el conjugado fármaco-CBA. Preferentemente, los dímeros citotóxicos sin un resto conector (tal como los restos conectores descritos anteriormente) unido a los mismos pueden pre-incubarse primero con el reactivo que reacciona con imina para formar el aducto, antes que la mezcla de reacción se use en las reacciones posteriores para formar el conjugado fármaco-CBA.
Así, en una decimosegunda realización específica, el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las fórmulas (I) y (II), tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000040_0001
siguientes fórmulas (I') y (II'), tal como se define en la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000040_0002
Preferentemente, X' es -H, o -Me. Más preferentemente, X' es -H.
Preferentemente, Y' se selecciona de -H u oxo. Más preferentemente, Y' es -H;
Preferentemente, 1,2, 3, o todos de R2 , R3 , R2 ' y R3 ' es-H;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable;
Preferentemente, R6 es -OMe o -SMe. Incluso más preferentemente, R6 es -OMe.
Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O- y -S-. Más preferentemente, A y A' son -O-. Las estructuras representativas de tales compuestos citotóxicos que contienen imina se muestran en la Tabla 15. Véanse los compuestos 1,3, 4, 5, y 1d.
En ciertas realizaciones,
W es C=O;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri', R2 ', R3', y R4' son -H;
Z y Z' son -CH2-;
A y A' son ambos -O-;
W es -(C=O)-;
G es -CH-;
R6 es -H, o alquilo lineal C1-C10 opcionalmente sustituido, ramificado C1-C10, o cíclico C3-C7, -O-alquilo, o -O-halo-alquilo, tal como -OMe;
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector de amina; y
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono.
Preferentemente, Y se selecciona de -SO3M, -SO2M, o -OSO3 M, y en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+.
Preferentemente, Y es -SO3M; M es -H o Na+.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000041_0001
en donde:
L', L'', y L''' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol
-(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2 , -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3M, un sulfato -OSO3M, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; y,
G se selecciona de -CH- o -N-.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico, cuando está presente, se representa por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000042_0002
En ciertas realizaciones, uno de L', L", o L"' porta el grupo tiol, mientras los otros son -H. Preferentemente, L' porta el grupo tiol, y L" y L"' son -H.
En ciertas realizaciones, A y A' son ambos -O-; R6 es -OMe; y G es -CH-.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico que contiene imina puede representarse por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000042_0001
en donde:
W' está ausente, o cuando está presente, se selecciona de -CReRe'-, -O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO2-, -CH2-S-, -CH2O-, -CH2NRS -O-(C=O)O-, -O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -C(=O)-N(Re)-, -N(Re)-C(=O)O-, -N(C(=O)Re)C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -(O-CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=O)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene de 2 a 8 aminoácidos;
Rx está ausente, o cuando está presente, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta de 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S;
Re y Re' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
n es un número entero del 1 al 24.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico, cuando está presente, puede representarse por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000043_0001
En ciertas realizaciones,
Y se selecciona de -SO3M, -SO2M o -OSO3 M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+;
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector de amina;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
A y A' se seleccionan de -O- y -S-;
W' está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
G se selecciona de -CH- o -N-.
En ciertas realizaciones, W' es -N(Re)-.
En ciertas realizaciones, Re es -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas realizaciones, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1,2 o 3.
En ciertas realizaciones, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
En ciertas realizaciones,
Y es -SO3 M, -SO2M, o un sulfato -OSO3M; preferentemente -SO3 M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (p. ej., Na+);
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son ambos -O-;
R6 es -OMe; y
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, el agente de reticulación bifuncional es: un resto basado en maleimido seleccionado de: N-succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato; o,
un resto basado en haloacetilo seleccionado de: N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y
N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2 , BM(PEO)3, N-(p-maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butirico hidrazidâ HCl (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SlAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(Y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(emaleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(K-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal y PEGn-Mal.
En ciertas realizaciones, el agente de reticulación bifuncional se selecciona del grupo que consiste en SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO. En ciertas realizaciones, el CBA modificado, cuando está presente, es:
Figure imgf000045_0001
En una decimotercera realización específica, el compuesto citotóxico que contiene imina es:
Figure imgf000045_0002
Los agentes de reticulación bifuncionales pueden ser cualquier conector bifuncional conocido en la técnica. Por ejemplo, los conectores bifuncionales que pueden usarse para preparar los compuestos de unión al fármaco son aquellos que forman enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles de ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles de peptidasa y enlaces lábiles de esterasa con los compuestos citotóxicos (véase, por ejemplo, las Patente de EE.UU. 5208020; 5475092; 6441 163; 6716821; 6913748; 7276497; 7276499; 7368565; 7388026 y 7414 073). Preferentemente, los agentes de reticulación bifuncionales son los que forman enlaces disulfuro, tioéter y enlaces lábiles de peptidasa con los compuestos citotóxicos. Otros agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse en la presente invención incluyen conectores no escindibles, tales como los descritos en la publicación de EE.UU. número US 2005/0169933, o conectores cargados o conectores hidrófilos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976. Los agentes de reticulación bifuncionales que pueden usarse para preparar los compuestos de unión al fármaco de la presente invención incluyen además los descritos en Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook.
En otra realización preferida, el fármaco (con o sin grupo conector con un grupo reactivo unido a él) que puede usarse en la presente invención es uno cualquiera de los compuestos mostrados en las Tablas 1-7. En otra realización preferida, el conjugado agente de unión a células-fármaco que puede prepararse por la presente invención es uno cualquiera de los conjugados mostrados en la Tabla 8.
Tabla 1. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención.
Figure imgf000046_0001
Tabla 2. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Figure imgf000047_0001
Tabla 3. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Figure imgf000048_0001
Tabla 4. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Figure imgf000049_0002
Tabla 5. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención.
Figure imgf000049_0001
Ċ
Figure imgf000050_0001
Tabla 6. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Figure imgf000050_0002
Ċ
Figure imgf000051_0001
Tabla 7. Estructuras de los compuestos representativos en la presente invención (continuación).
Figure imgf000051_0002
Figure imgf000052_0001
Tabla 8. Estructuras de los conjugados representativos en la presente invención.
Figure imgf000052_0002
En cualquiera de los compuestos o conjugados descritos anteriormente en las Tablas 1-8, el enlace doble imina puede reaccionar con / haber reaccionado con cualquier reactivo que reaccione con imina (tal como los descritos en el presente documento) de acuerdo con los métodos de la invención para formar aductos, que incluyen aductos de bisulfito. Tales aductos protegidos de imina en los compuestos de las Tablas 1-7 pueden usarse en reacciones adicionales de acuerdo con los métodos de la invención para producir los conjugados de la invención. Igualmente, los compuestos que comprenden aductos protegidos de imina pueden usarse en los métodos de la invención para producir los conjugados de la Tabla 8.
En el presente documento también se describen fármacos que portan opcionalmente un resto conector (p. ej., un grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo) que puede usarse en los métodos descritos en el presente documento, y se representan por la fórmula (A1) o (A2):
Figure imgf000053_0001
en donde:
la doble línea ="= entre N y C representa un enlace sencillo o un enlace doble, siempre que al menos uno de ="= entre N y C representa un enlace doble, y cuando es un enlace doble, X está ausente e Y es -H, y cuando es un enlace sencillo, X es -H o un resto protector de amina que convierte el compuesto en un profármaco; preferentemente, cuando es un enlace doble, X está ausente e Y es -H, y el enlace doble puede reaccionar con el reactivo que reacciona con imina de la invención para formar un aducto (tal como un aducto de bisulfito) antes de que el aducto se use en los métodos de la invención para producir conjugados fármaco-CBA;
Y se selecciona de -H, -OR, un éster representado por -OCOR', un carbonato representado por -OCOOR', un carbamato representado por -OCONR'R'', una amina o una hidroxil amina representada por -NR'R'', amida representada por -NRCOR', un péptido representado por -NRCOP, en donde P es un aminoácido o un polipéptido que contiene entre 2 a 20 unidades de aminoácidos, un tioéter representado por -SR', un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , -SO2M, -SO3M, -OSO3 M, un halógeno, ciano, un azido, o un tiol; en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+); o,
Y es un sulfito (HSO3 , HSO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra-tiofosfato (PO3SH3 , PO2S2H2 , POS3H2, PS4H2 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), éster de tio fosfato éster (R¡O)2PS(OR¡), R¡S-, R¡SO, RSO2 , R¡SO3, tiosulfato (HS2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (HS2O4 o una sal de S2O42-formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk')(S)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk'C(=O)NOH o una sal formada con un catión), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2- o una sal de HOCH2SO2- formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+) o una mezcla de los mismos, en donde R¡ es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, y -PO3H; R¡ puede estar además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; Rk' es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene; de 1 a 10 átomos de carbono, arilo heterociclilo o heteroarilo;
R, R', y R'' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20), un anillo heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 18 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, en donde el sustituyente se selecciona de halógeno, -OR7 , -NR8R9, -NO2, -NRCOR', -SR10, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -COR11, -OCOR11 o -OCONR11R12;
R7 , R8, R9 , R10, R11 y R12 se seleccionan cada uno independientemente de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20), un anillo heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 18 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 10 miembros que tiene anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, y Río es opcionalmente SR13 o COR13;
Rí3 se selecciona de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un sistema anular fusionado de 5 a 18 miembros, en donde al menos uno de los anillos es aromático, que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, arilo que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P, opcionalmente R11 es OR14, en donde R14 tiene la misma definición que R, opcionalmente R'' es -OH;
W es C=O, C=S, CH2 , BH, SO o SO2 ;
Rí, R2 , R3 , R4 , Rí', R2', R3', y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20), o un sustituyente seleccionado de un halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR7 , -NR8R9 , -NO2 , -NRCOR', -SR10, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3, una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -COR11, -OCOR11 o -OCONR11R12, en donde R7 , R8, R9, Río, R11 y R12 son tal como se definieron anteriormente, opcionalmente, uno cualquiera de Rí, R2 , R3, R4 , Rí', R2 ', R3 ', o R4 ' es el grupo conector con el grupo reactivo unido a él (si está presente), el cual puede seleccionarse de una unidad de polipirrolo, poli-indolilo, poli-imidazolilo, polipirrolo-imidazolilo, poli-pirrolo-indolilo o poliimidazolo-indolilo que porta opcionalmente el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
Z se selecciona de -(CH2)n-, en donde n es 1, 2 o 3, -CRí5Rí6, -NRí7, -O- o -S-, en donde Rí5, Rí6 y Rí7 se seleccionan cada uno independientemente de -H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20);
R6 es -OR, -SR o -NRR', en donde R y R' tienen la misma definición dada anteriormente, opcionalmente R6 es el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo (si está presente);
X' se selecciona de -CH2, -NR, -CO, -BH, -SO o -SO2 en donde R tiene la misma definición dada anteriormente; Y' es -O-, -CH2-, -NR o -S, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente;
Z' es -CH2 o -(CH2K donde n es 2, 3 o 4, siempre que X', Y' y Z' no sean todos CH2 al mismo tiempo;
A y A' son iguales o diferentes y se seleccionan de -O-, -CRR'O, S, -CRR'S, -NRí5 o -CRR'NHRí5, en donde R y R' tienen la misma definición dada anteriormente y en donde Rí5 tiene la misma definición que R;
D y D' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno cualquiera de halógeno, -OR7 , -NR8R9 , -NO2 , -NRCOR', -SRío, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -CORíí, -OCORíí o -OCONRííRí2, en donde las definiciones de R7 , R8, R9 , Río, Ríí y Rí2 son como se definieron anteriormente, o una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20);
L es un grupo fenilo opcional o anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados de O, S, N y P que está opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo (si está presente), o se selecciona de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituidos con uno cualquiera de halógeno, -OR7, -NR8R9 , -NO2 , -NRCOR', -SRío, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -CORíí, OCORíí o OCONRííRí2, en donde R7 , R8, R9, Río, Ríí y Rí2 tienen las mismas definiciones dadas anteriormente, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n, en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200, o 1-20); opcionalmente, el propio L es el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo; o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos; siempre que el compuesto no tenga más de un grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo.
En algunos fármacos de la fórmula (A1) o (A2):
la doble línea ~ entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace, siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente e Y es -H, y cuando sea un enlace simple, X es -H o un grupo protector de amina que convierte el compuesto en un profármaco;
Y se selecciona de -H, -OR, NR'R”, un sulfito -SO3M, o un bisulfito -OSO3M, en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+);
R se selecciona de -H, alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200 o 1-20), arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono, anillo heterocíclico que tiene de 3 a 10 átomos de carbono;
W es C=O, CH2 o SO2 ;
Ri, R2, R3 , R4 , Ri'. R2 '. R3 ' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -NO2 o el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente);
R6 es -OR18, en donde Ri8 tiene la misma definición que R;
Z se selecciona de -(CH2K en donde n es 1, 2 o 3, -CR15R16, -NR17, -O- o -S-, en donde R15, Ri6 y R17 se seleccionan cada uno independientemente de -H, alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200 o 1-20);
X' se selecciona de -CH2, o C=O;
Y' es -O-, -NR, o -S, en donde R es tal como se definió anteriormente;
Z' es -CH2- o -(CH2)2-;
A y A' son cada uno -O-;
D y D' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
L es un grupo fenilo opcional o un anillo heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos de carbono que está opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente), o se selecciona de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con uno cualquiera de halógeno, -OR7 , -NR8R9 , -NO2 , -NRCOR', -SR10, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -COR11, -OCOR11 o -OCONR11R12, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 2000 (preferentemente, 1-200 o 1-20); opcionalmente, el propio L es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo; o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos.
En otros fármacos, las fórmulas (A1) o (A2) se representa por las fórmulas (A4) o (A5):
Figure imgf000055_0001
en donde:
la doble línea ~ entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace, siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente e Y -es H, y cuando sea un enlace simple, X es -H o un grupo protector de amina que convierte el compuesto en un profármaco;
Y se selecciona de -H, -OH, un éter representado por -OR, -NR'R”, un sulfito -SO3M, o un bisulfito -OSO3M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (tal como Na+);
R, R', y R” se seleccionan de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
uno de R2 , R3 , R2 ' y R3 ' es el grupo conector con un grupo reactivo unido a él (si está presente) y los otros son -H, -NRCOR' o -NO2;
R6 es -OR, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente;
Z es -CH2- o -NR, en donde R tiene la misma definición dada anteriormente;
A es -O- o -NR15;
L es -(CH2)nn-, en donde nn es 0 o un número entero entre 1 y 5, o un alquilo o alquenilo sustituido o insustituido que tiene de 2 a 4 átomos de carbono, en donde el sustituyente se selecciona de halógeno, -OR7, -NR8R9 , -NO2 , -NRCOR', -SR10, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfito -SO3 , un bisulfito -OSO3 , una sulfonamida representada por -SO2NRR', ciano, un azido, -COR11, -OCOR11, o -OCONR11R12; R7 , R8, R9, R10, R11, R12 y Ri 5 tienen la misma definición dada anteriormente;
opcionalmente, el propio L es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente);
uno de L', L'', o L”' es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente), mientras los otros son -H; preferentemente, L' es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente); y G es -CH- o -N-, o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos. Algunas veces, el compuesto de la fórmula (A1) o (A2) se representa preferentemente por los compuestos de las fórmulas (A6) o (A7):
Figure imgf000056_0001
en donde:
la doble línea ="= entre N y C representa un enlace simple o un doble enlace siempre que, cuando sea un doble enlace, X está ausente e Y es -H, y cuando sea un enlace simple, X es -H o un grupo protector de amina que convierte el compuesto en un profármaco;
Y se selecciona de -H, -OH, un éter representado por -OR, un sulfito -SO3, o un bisulfito -OSO3 ;
R se selecciona de alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; nn es 0 o un número entero de 1 a 5;
uno de R2 , R3 , R2 ' y R3 ' es el grupo conector con un grupo reactivo unido a él (si está presente) y los otros son -H, -NRCOR', o -NO2 ;
uno de L', L'' o L”' es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente), siempre que cuando uno de L', L'' o L”' es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo, los otros son -H (p. ej., si L' es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo, entonces L'' y L”' son -H);
G es -CH- o -N-, o sus solvatos farmacéuticamente aceptables, sales, hidratos o sales hidratadas, sus isómeros ópticos, racematos, diastereómeros, enantiómeros o las estructuras polimórficas cristalinas de estos compuestos. Algunas veces, uno de R2 , R3 , R2 ' y R3 ' de la fórmula (A4) y (A6) es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente), y se representa por la fórmula -W’-Rx-V-Ry-J, y el resto son -H; L'' y L''' de la fórmula (A5) y (A7) son -H, y L' es el grupo conector con un grupo reactivo unido a él (si está presente), y se representa por la fórmula
-W’-Rx-V-Ry-J
en donde:
W' está ausente, -CRcRe-, -O-, -O-C(=O)-, -S-, -CH2-S-, -O-(C=O)O-, -O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(Re)-C(=O)O-, o -C(=O)-;
Rx está ausente o es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
V está ausente, -(CH2-CH2-OV, -O-, -O-C(=O)-, -S-, -O-(C=O)O-, O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(Re)-C(=O)O-, -C(=O)-, un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos;
Ry está ausente o es un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rc,
n es un entero de 1 a 24; y
J es tal como se describió anteriormente en la cuarta realización específica.
Preferentemente, Rc es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rc; n es un número entero de 2 a 8; y el resto de las variables son tal como se describieron anteriormente en la cuarta realización específica.
Algunas veces, V es preferentemente un aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 8 aminoácidos. Más preferentemente, V es valina-citrulina, gly-gly-gly o ala-leu-ala-leu.
Preferentemente, J es -SH, -SSRd o -COE como se describió anteriormente.
Algunas veces, uno de R2 , R3 , R2 ' y R3 ' de la fórmula (A4) y (A6) es el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo (si está presente), y se representa por la fórmula -W’-Rx-S-Zs; L'' y L''' de la fórmula (A5) y (A7) son -H, y L' se representa por -W’-Rx-S-Zs, en donde las variables son como las descritas en la octava y novena realizaciones específicas.
Algunas veces, los compuestos de la fórmula (A1)-(A7) (con o sin pre-incubación del reactivo que reacciona con imina), si el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo no está ya presente, pueden reaccionar adicionalmente con un reactivo de reticulación bifuncional descrito anteriormente para formar un fármaco que contiene imina que porta el grupo conector con un grupo reactivo unido al mismo, que puede usarse en los métodos de la presente invención.
En ciertas realizaciones, el fármaco que contiene imina que porta el grupo conector con un grupo reactivo unido a él que puede usarse en los métodos de la presente invención se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000058_0001
en donde:
El “conector” se representa por la fórmula (a1), (a2), (a3), (a4), (a5), (a6), (a7) o (a8) descritas anteriormente (en la novena realización específica);
q es un número entero de 1 a 5;
n es un número entero de 2 a 6;
D es -H o -SO3M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+; y el resto de las variables es como se describió en la octava o novena realizaciones específicas.
Preferentemente, q es 2 y n es 4.
El conector se representa preferentemente por la fórmula (a1), (a4), (a5), (a9) o (a10) descritas anteriormente. Para los compuestos de la fórmula (A8) descritos inmediatamente antes, las variables pueden ser como las descritas a continuación:
W' es -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(CORe)-, -S- o -CH2-S-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de1 a 6 átomos de carbono; Re es -H, a alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino primario, secundario o terciario o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina;
n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son tal como se describieron anteriormente en la realización inmediatamente anterior.
Preferentemente, Rk es -H o -Me y n es un número entero de 2 a 8. Preferentemente, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Algunas veces, el conector se representa preferentemente por una cualquiera de la fórmula seleccionada de las fórmulas (a1), (a4), (a5), (a10) y (a11) mostradas anteriormente; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la novena realización específica.
Para los compuestos de la fórmula (A8) descritos en las realizaciones anteriores, las variables pueden ser como las descritas más abajo:
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son ambos -O-;
R6 es -OMe;
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y el resto de las variables es como se describió anteriormente.
Preferentemente, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1, 2 o 3. Más preferentemente, Rf y Rg son iguales o diferentes y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
Algunas veces, el conector se representa preferentemente por una cualquiera de la fórmula seleccionada de las fórmulas (a1), (a4), (a5), (a10) y (a11) mostradas anteriormente; y el resto de las variables son como se describió anteriormente.
Algunas veces, el fármaco de la fórmula (A1), (A2) o (A3) es preferentemente uno cualquiera de los compuestos mostrados en las Tablas 11-13 y el conjugado que puede preparase por el método de la presente invención es uno cualquiera de los conjugados mostrados en la Tabla 14.
Tabla 11. Estructuras de fármacos representativos que pueden usarse en los métodos de la presente invención.
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0002
Tabla 12. Estructuras de fármacos representativos que pueden usarse en los métodos de la presente invención. (continuación).
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Tabla 13. Estructuras de fármacos representativos que pueden usarse en los métodos de la presente invención. (continuación).
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000062_0002
Tabla 14. Estructuras de conjugados representativos que pueden prepararse por los métodos de la presente invención.
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Cualquiera de los compuestos de las Tablas 11-13 y cualquier conjugado de la Tabla 14 puede tener al menos uno de sus enlaces imina reaccionado con un reactivo que reacciona con imina objeto, formando así un aducto, tal como aducto de bisulfito.
En una realización, el fármaco que contiene imina que porta un resto conector es el que tiene un grupo éster reactivo, un tiol o un grupo que reacciona con tiol descrito anteriormente.
Alternativamente, el fármaco descrito anteriormente puede reaccionar además con el agente de reticulación bifuncional para formar un fármaco que porta un resto conector. Se puede usar cualquiera de los agentes de reticulación bifuncionales descritos.
Algunas veces, el fármaco que puede usarse en la presente invención es preferentemente uno cualquiera de los compuestos mostrados en la Tabla 15.
Figure imgf000064_0001
Agente de unión a células
La eficacia de los conjugados de la invención como agentes terapéuticos depende de la selección cuidadosa de un agente de unión a células adecuado. Los agentes de unión a células pueden ser de cualquier tipo actualmente conocido, o que se vaya a conocer e incluye péptidos y no péptidos. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales), linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas (tales como folato etc., que pueden unirse a un receptor de superficie celular para ello, p. ej., un receptor de folato), moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión a células.
En ciertas realizaciones, los agentes de unión a células son proteínas o polipéptidos, o compuestos que comprenden proteínas o polipéptidos. Preferentemente, las proteínas o polipéptidos comprenden uno o más residuos de Lys con grupos -NH2 de cadena lateral. Alternativamente o adicionalmente, las proteínas o polipéptidos comprenden uno o más residuos de Cys. Los grupos -SH de la cadena lateral de los residuos de Cys pueden estar intactos, o pueden estar en un enlace disulfuro que puede reducirse. Preferentemente, la reducción del enlace o enlaces disulfuro no afecta significativamente de forma negativa la función de unión a células de las proteínas o polipéptidos (p. ej., en el caso de anticuerpo o la parte de unión a antígeno del mismo, la reducción de los enlaces disulfuro no aumenta sustancialmente la disociación de cadenas ligeras / cadenas pesadas).
Los grupos -NH2 de la cadena lateral de Lys y/o los grupos -SH de la cadena lateral de Cys pueden unirse covalentemente a los conectores, que están a su vez conectados con los compuestos dímeros para su uso en la invención, conjugando así los agentes de unión a células con los compuestos dímeros para su uso en la invención. Cada uno de los agentes de unión a células basados en proteína pueden contener múltiples grupos -NH2 de la cadena lateral de Lys y/o grupos -SH de la cadena lateral de Cys disponibles para conectar los compuestos para su uso en la invención a través de los agentes de reticulación bifuncionales.
Los ejemplos más específicos de agentes de unión a células que pueden usarse incluyen:
anticuerpos policlonales;
anticuerpos monoclonales;
fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', y F(ab')2, Fv, minicuerpos, diacuerpos, tricuerpos, tetracuerpos (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960), Kim et al., Mol, Cancer Ther., 7: 2486-2497 (2008), Carter, Nature Revs., 6: 343-357 (2006));
interferones (p. ej., a, p, y);
linfoquinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
hormonas tales como insulina, TRH (hormona liberadora de tirotropina), MSH (hormona estimulante de los melanocitos), hormonas esteroides, tales como andrógenos y estrógenos;
factores de crecimiento y factores estimulantes de colonias tales como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF y GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));
transferrina (O'Keefe et al., J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985));
vitaminas, tales como folato;
Soportes de proteína basados en una secuencia consenso de repeticiones de fibronectina tipo III (FN3) (conocido además como Centirinas; Véase la Publicación de Patente de EE.Uu .2010/0255056);
Proteínas de Repetición de Anquirina Diseñadas (DARPins; Solicitud de Patente de EE.UU. N. ° 20040132028; 20090082274; 20110118146; 20110224100), C. Zahnd et al., 2010, Cancer Res., 70; 1595-1605); y, Proteínas de soporte con dominio de fibronectina (Adnectinas: Solicitud de Patente de EE.UU. N. ° 20070082365; 20080139791).
Las técnicas de los anticuerpos monoclonales permiten la producción de agentes de unión a células extremadamente específicos en la forma de anticuerpos monoclonales específicos. En la técnica son particularmente bien conocidas las técnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos mediante inmunización de ratones, ratas, hámsteres o cualquier otro mamífero con el antígeno de interés, tal como la célula diana intacta, los antígenos aislados a partir de la célula diana, los virus enteros, los virus enteros atenuados, y las proteínas virales, tales como las proteínas de la cubierta viral. También pueden usarse células humanas sensibilizadas. Otro método para crear anticuerpos monoclonales es el uso de bibliotecas de scFv en fagos (región variable de cadena sencilla), específicamente los scFv humanos (véase, p. ej., Griffiths et al., Patente de EE.UU. N. ° 5885 793 y 5969 108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Adicionalmente, también pueden usarse los anticuerpos modificados en superficie descritos en la Patente de Ee .UU: N. ° 5639641, como se pueden usar los anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. La selección del agente de unión a células adecuado es una cuestión de elección que depende de la población celular particular que se va a tomar como diana, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos si está disponible uno adecuado.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgGi de murino que se une específicamente al Antígeno CD33 {J.D. Griffin et al., 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las células diana expresan CD33 como en la enfermedad de leucemia mielógena aguda (AML). El agente de unión a células puede ser cualquier compuesto que se puede unir a una célula, ya sea de una manera específica o no específica. Generalmente, estos pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos), interferones, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina), o cualquier otra molécula o sustancia de unión a células.
Cuando el agente de unión a células es un anticuerpo, este se une a un antígeno que es un polipéptido y puede ser una molécula transmembrana (p. ej., un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento. Los antígenos ilustrativos incluyen moléculas tales como renina; una hormona de crecimiento, incluyendo la hormona de crecimiento humana y la hormona de crecimiento bovina; factor liberador de la hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimuladora de las tiroides; lipoproteínas; alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora de folículos; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor vmc, factor IX, factor tisular (TF), y factor de von Willebrands; factores anti­ coagulantes tales como proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador del plasminógeno, tal como la uroquinasa o la orina humana o activador tisular del plasminógeno (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral alfa y beta; encefalinasa; RANTES (expresada y secretada por células T normales reguladas tras la activación); proteína humana inflamatoria de macrófagos (MIP-1 alfa); una albúmina sérica tal como la albúmina de suero humano; sustancia inhibidora de Müller; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), tal como el CTLA-4; inhibina; activina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5, o 6 (NT-3, NT4, NT-5, o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-p; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tales como aFGF y bFGF; receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR2); factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta, que incluye TGF-p1, TGF-p2, TGF-p3, TGF-p4, o TGF-p5; factor de crecimiento similar a la insulina-I y II (IGF-I e IGF-II); des(l-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, Ps Ca , MUC1, m Uc 16, STEAP, CEA, TENB2, receptores EphA, receptores EphB, receptor de folato, FOLR1, mesotelina, cripto, alfavbeta6, integrinas, VEGF, vEGFR, eGfR, receptor de transferrina, IRTA1, IRTA2, IRTA3, IRTA4, IRTA5; proteínas CD tales como CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152 o un anticuerpo que se une a uno o más antígenos asociados a tumor o receptores de superficie celular descritos en la Publicación US N. ° 20080171040 o la Publicación US N. ° 20080305044; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso (BMP); un interferón, tal como interferón-alfa, beta y gamma, factores estimulantes de colonias (CSF), p. ej., M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleuquinas (IL), p. ej., IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor de aceleración de degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del VIH; proteínas de transporte; receptores de homing; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas, tales como CD11a, CD11b, CD11c, Cd 18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; endoglina, c-Met, 1GF1R, PSGR, NGEP, PSMA, PSCA, LGR5, B7H4, y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos anteriormente enumerados.
Además, GM-CSF, que se une a células mieloides puede usarse como un agente de unión a células para células enfermas de leucemia mielógena aguda. IL-2 que se une a células T activadas puede usarse para la prevención del rechazo de trasplante del injerto, para la terapia y prevención de la enfermedad de injerto contra huésped, y para el tratamiento de la leucemia aguda de células T. La MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento del melanoma, como pueden usarse anticuerpos dirigidos hacia los melanomas. El ácido fólico puede usarse para tomar como diana el receptor de folato expresado en tumores de ovario y otros tumores. El factor de crecimiento epidérmico puede usarse para tomar como diana los cánceres escamosos tales como de pulmón y de cabeza y cuello. La somatostatina puede usarse para tomar como diana los neuroblastomas y otros tipos de tumores.
Los cánceres de mama y testículos se pueden tomar como diana exitosamente con estrógeno (o análogos de estrógeno) o andrógeno (o análogos de andrógeno), respectivamente, como agentes de unión a células.
En una realización, el agente de unión a células son los anticuerpos monoclonales humanizados. En otra realización, el agente de unión a células es huMy9-6 u otros anticuerpos relacionados, que se describen en las Pat. de EE.UU. N. ° 7342110 y 7557189. En otra realización, el agente de unión a células es un anticuerpo anti-receptor de folato descrito en las Solicitudes Provisionales de EE.UU. N. ° 61/307 797, 61/346 595, 61/413 172 y la Solicitud de EE.UU. N. ° 13/033723 (publicada como US 2012-0009181 A1).
En ciertas realizaciones, el agente de unión a células puede ser un anticuerpo monoclonal o porciones de unión al antígeno de los mismos que comparten secuencias críticas para la unión al antígeno con un anticuerpo descrito en el presente documento, tales como huMy9-6 o sus anticuerpos relacionados descritos en las Pat. de EE.UU. N. ° 7 342110 y 7557189. Estos anticuerpos derivados pueden tener sustancialmente las mismas o idénticas (1) regiones CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada, (2) regiones CDR1, CDR2, y CDR3 de cadena ligera y/o cadena pesada, o (3) regiones de cadena ligera y/o cadena pesada, en comparación con un anticuerpo descrito en el presente documento. Las secuencias dentro de estas regiones pueden contener sustituciones conservativas de aminoácidos, que incluyen sustituciones dentro de estas regiones CDR. Preferentemente, no hay más de 1, 2, 3, 4, o 5 sustituciones conservativas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos derivados tienen una región de cadena ligera y/o una región de cadena pesada que es al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a un anticuerpo descrito en el presente documento. Estos anticuerpos derivados pueden tener sustancialmente la misma especificidad y/o afinidad de unión al antígeno diana en comparación con un anticuerpo descrito en el presente documento. Preferentemente, los valores de Kd y/o kdisoc de los anticuerpos derivados están dentro de 10 veces (ya sea superior o inferior), 5 veces (ya sea superior o inferior), 3 veces (ya sea superior o inferior) o 2 veces (ya sea superior o inferior) de un anticuerpo descrito en el presente documento. Estos anticuerpos derivados pueden ser anticuerpos completamente humanos, o anticuerpos humanizados, o anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos derivados pueden producirse de acuerdo con cualquiera de los métodos reconocidos en la técnica.
En una realización, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a un receptor 1 humano de folato, en donde el anticuerpo comprende: (a) una CDR1 de cadena pesada que comprende GYFMN (SEQ ID NO: 1); una CDR2 de cadena pesada que comprende RIHPYDGDTFYNQXaaiFXaa2Xaa3 (SEQ ID NO: 2); y una CDr3 de cadena pesada que comprende YDg SrAMDY (SEQ ID NO: 3); y (b) una CDR1 de cadena ligera que comprende KASQSVSFAGTSlMh (SeQ ID NO: 4); una CDr2 de cadena ligera que comprende RASNLEA (SEQ ID nO: 5); y una CDR3 de cadena ligera que comprende QQSREYPYT (SEQ ID NO: 6); en donde Xaa i se selecciona de K, Q, H, y R; Xaa2 se selecciona de Q, H, N, y R; y Xaa3 se selecciona de G, E, T, S, A, y V. Preferentemente, la secuencia de CDR2 de la cadena pesada comprende RIHPYDGDTFYNQKFQG (SEQ ID NO: 7).
En otra realización, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor 1 humano de folato que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de q v q lv q s g a e v v k p g a s v k is c k a s g y t f t g y f m n w v k q s p g q s le w ig r ih p y d g d t f y n q k f q g k a t lt v d k s s n t a h m e lls lt s e d f a v y y c t r y d g s r a m d y w g q g tt v t v s s a s t k g p s v f p la p s s k s t s g g t a a lg c lv k d y f p e p v t v s w n s g a lt s g v h t f p a v lq s s g ly s ls s v v t v p s s s lg t q t y ic n v n h k p s n t k v d k k v e p k s c d k t h t c p p c p a p e llg g p s v f l f p p k p k d t lm is r t p e v t c v v v d v s h e d p e v k f n w y v d g v e v h n a k t k p r e e q y n s t y r v v s v lt v lh q d w ln g k e y k c k v s n k a lp a p ie k t is k a k g q p r e p q v y t lp p s r d e lt k n q v s lt c lv k g f y p s d ia v e w e s NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 8).
En otra realización, el anticuerpo anti-folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo codificado por el ADN de plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los n.° de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra realización, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor 1 humano de folato que comprende la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de d iv lt q s p ls la v s lg q p a iis c k a s q s v s f a g t s lm h w y h q k p g q q p r ll iy r a s n le a g v p d r f s g s g s k t d f t ln i s p v e a e d a a t y y c q q s r e y p y t f g g g t k le ik r t v a a p s v f if p p s d e q lk s g t a s v v c l ln n f y p r e a k v q w k v d n ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9); o
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 10).
En otra realización el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al receptor 1 humano de folato que comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 8, y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 o la SEQ ID NO: 10. Preferentemente, el anticuerpo comprende la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 y la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (hu FOLR1).
En otra realización, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo codificado por el ADN del plásmido depositado en la ATCC el 7 de abril de 2010 y que tiene los n. ° de depósito de ATCC PTA-10772 y PTA-10773 o 10774.
En otra realización, el anticuerpo anti-receptor de folato es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende un dominio variable de cadena pesada al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSS NTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 11), y un dominio variable de cadena ligera al menos aproximadamente 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 12); o
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTI SPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 13).
Un agente de unión a células, tal como un anticuerpo, puede modificarse con un agente de reticulación heterobifuncional que porta un grupo que reacciona con amino, tales como grupo N-hidroxisuccinimida (grupo NHS), un maleimido que reacciona con tiol, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida o un grupo basado en haloacetilo, o un grupo tiol.
Los residuos de tiol en el anticuerpo pueden introducirse por una serie de métodos conocidos en la técnica, que incluyen: a) modificación del anticuerpo con reactivos que generan tiol tales como 2-iminotiolano u homocisteína tiolactona, o b) a través de la reacción con un agente de reticulación heterobifuncional que contiene disulfuro tal como SPP, SPDP, SPDB, sulfo-SPDB seguido por reducción del enlace disulfuro con DTT o TCEP para generar un tiol libre, c) mutagénesis para incorporar residuos no nativos de cisteína, tales como los anticuerpos modificados con cisteína (US2007/0092940 A1, US 2010/0003766 A1, US 7723485 B2), o d) reducción de los enlaces disulfuro nativos (del Rosario, R.B. et al., Cancer Res. Sppl. 1990, 50, 804s -808s).
Un grupo que reacciona con tiol, tal como maleimido, vinilpiridina, vinil sulfona, vinil sulfonamida o un grupo basado en haloacetilo en el anticuerpo puede introducirse modificando un anticuerpo con un agente de reticulación heterobifuncional que porta un grupo que reacciona con tiol (que incluye Sp Db , N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, sulfo-SMCC, SMCC, LC-SMCC, KMUA, BMPS, GMBS, sulfo-GMBS, EMCS, sulfo-EMCS, AMAS, SVSB, SPP, NHS-(PEG)n-mal, donde n = 1 a 24, preferentemente 2, 4, 8, 12, y 24). Los agentes de reticulación que comprenden un resto basado en maleimido incluyen N-succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexano-carboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), el cual es un análogo de “cadena larga" de SMCC (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), y N-(p-maleimidofenilo)isocianato (PMPI). Se han descrito los compuestos que reaccionan con tiol que contienen una vinilpiridina (Friedman M. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 1974 , 6, 183-185; Mak A. et al., Anal. Biochem. 1978, 84, 432-440). Se han descrito los compuestos que reaccionan con tiol que contienen una porción de vinil sulfona (Masri M. S. J. Protein Chem., 1988, 7, 49-54; Morpurgo, M. et al., Bioconjugate Chem. 1996, 7, 363-368). Los reactivos de reticulación que comprenden un resto basado en haloacetilo incluyen N-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SbA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP).
El anticuerpo modificado puede purificarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, filtración en gel, TFF o cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de afinidad.
Conjugados de agente de unión a células-fármaco
La presente invención proporciona métodos mejorados para producir conjugados de agente de unión a célulasfármaco, que comprenden un agente de unión a células unido a uno o más compuestos citotóxicos de la presente invención a través de una variedad de conectores, que incluyen conectores disulfuro, conectores tioéter, conectores unidos a amida, conectores lábiles con peptidasa, conectores lábiles en medio ácido, conectores lábiles con esterasa.
Los conjugados representativos que pueden prepararse usando los métodos de la invención incluyen anticuerpo/compuesto citotóxico, fragmento anticuerpo/compuesto citotóxico, factor de crecimiento epidérmico (EGF)/compuesto citotóxico, hormona estimulante de los melanocitos (MSH)/compuesto citotóxico, hormona estimulante de la tiroides (TSH)/compuesto citotóxico, somatostatina/compuesto citotóxico, folato/compuesto citotóxico, estrógeno/compuesto citotóxico, analógo de estrógeno/compuesto citotóxico, andrógeno/compuesto citotóxico, y análogo de andrógeno/ compuesto citotóxico. Un conjugado representativo folato/compuesto citotóxico se representa a continuación, con el aducto opcional-SO3Na en el enlace imina de uno de los dos monómeros del fármaco. Un esquema de síntesis representativo para este conjugado se muestra en la FIG. 26.
Figure imgf000069_0001
conjugado de folato/compuesto citotóxico
En una realización preferida, la presente invención proporciona métodos para producir conjugados que comprenden un compuesto dímero de indolinobenzodiazepina (p. ej., formulas (Ib'), (IIb'), (Iab'), (IIAb'), (IBb'), (IIBb'), (XIIIb'), (Xb'), etc.) y el agente de unión a células conectado a través de un enlace covalente. El conector puede escindirse en el sitio de las células proliferativas no deseadas/tumorales para suministrar el agente citotóxico a su diana de varias maneras. El conector puede escindirse, por ejemplo, por un pH bajo (hidrazona), ambiente reductor (disulfuro), proteólisis (enlace amida/péptido), o a través de una reacción enzimática (esterasa/glucosidasa).
En un aspecto preferido, los conjugados citotóxicos representativos que pueden producirse por los métodos de la invención son compuesto dímero anticuerpo/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero fragmento de anticuerpo/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero factor de crecimiento epidérmico (EGF)/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero hormona estimulante de los melanocitos (MSH)/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero hormona estimulante de la tiroides (TSH)/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero somatostatina/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero folato/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero estrógeno/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero análogo de estrógeno/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero inhibidor del antígeno prostático específico de membrana (PSMA)/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero inhibidor de matriptasa/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero proteínas de repetición de ankirina diseñada (DARPins)/indolinobenzodiazepina, compuesto dímero andrógeno/indolinobenzodiazepina y compuesto dímero análogo de andrógeno/indolinobenzodiazepina.
Así, en la decimocuarta realización específica, los métodos de la invención producen un conjugado que comprende: un compuesto citotóxico y un agente de unión a células (CBA), en donde el compuesto citotóxico se une covalentemente al CBA a través de un grupo conector, y en donde el compuesto citotóxico y el resto del grupo conector del conjugado se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000069_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (Ib') y (IIb') se produce a partir de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, el grupo conector, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, el grupo conector, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo conector;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+;
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo conector;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, halógeno o el grupo conector;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2V-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NRg-(CH2)na-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
Rg se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2)n-; L está ausente, es el grupo conector, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo está opcionalmente sustituido con el grupo conector; el fenilo o anillo heterocíclico o heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido, en donde el sustituyente puede comprender el grupo conector.
Un conjugado representativo se presenta más abajo (“Ab” representa un CBA, tal como un anticuerpo):
Figure imgf000071_0001
En ciertas realizaciones, Y es -SO2 M, -SO3M, o -OSO3M.
En ciertas realizaciones, los conjugados que pueden sintetizarse por los métodos de la invención incluyen los siguientes:
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000072_0001
en donde:
CBA es el agente de unión a células, r es un número entero de 1 a 10, Y es -H, un aducto de un bisulfito, un hidrosulfito, un metabisulfito, o sales de los mismos, o -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, L está ausente, o se selecciona de un grupo fenilo opcionalmente sustituido y un grupo piridilo opcionalmente sustituido, en donde el grupo fenilo y piridilo porta el grupo conector, o L es un grupo amina que porta el grupo conector (es decir, -N(grupo conector)-), o L es un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y que porta el grupo conector.
En la decimoquinta realización específica, el compuesto citotóxico unido al grupo conector se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000072_0002
Figure imgf000073_0001
en donde:
L', L'', y L''' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol
-(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2 , -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3M, un sulfato -OSO3M, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector, siempre que solo uno de L', L'', y L''' sea el grupo conector; y
G se selecciona de -CH- o -N-. Los grupos restantes son como se describieron en la decimocuarta realización específica anterior.
En ciertas realizaciones, uno de L', L'', o L”' es el grupo conector, mientras los otros son -H. Preferentemente, L' es el grupo conector, y L'' y L''' son -H.
En ciertas realizaciones, A y A' son ambos -O-, R6 es -OMe, y G es -CH-.
En la decimosexta realización específica, L' se representa por la siguiente fórmula:
-W'-Rx-V-Ry-J,
en donde:
W' y V son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o se seleccionan de -CReRe-, -O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO2-, -CH2-S-, -CH2O-, -CH2NRe-, -O-(C=O)O-, -O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -C(=O)-N(Re)-, -N(Re)-C(=O)O-, -N(C(=O)Re)C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -(O-CH2-CH2)n-, -SS-, o -C(=O)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos;
Rx y Ry son iguales o diferentes, y cada uno está independientemente ausente, o es un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta de 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S;
Re y Re' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, un alquilo, alquenilo, o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
n es un número entero de 1 a 24; y
J está covalentemente unido a CBA, y se selecciona de una succinimida, un acetamido, -S-, -SS-, -CH2S-, -CH(Me)S-,
-C(Me)2S-, -NRc1-, -CH2NRc1-, -NRc1N-, y -C(=O)-, en donde Rc1 es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, J es -S-, -SS-, una succinimida, o -C(=O)-.
En ciertas realizaciones, Re' es -H o -Me; Re es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk; n es un número entero de 2 a 8; y Rk es -H, -Me o -CH2CH2-NMe2 , y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la decimoquinta realización específica.
En ciertas realizaciones, V es un aminoácido o un péptido que tiene de 2 a 8 aminoácidos.
En ciertas realizaciones, V es valina-citrulina, gly-gly-gly, o ala-leu-ala-leu.
En ciertas realizaciones,
W es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=O)-;
Re es H, un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o -(CH2-CH2-O)n-Rk;
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
V está ausente, es -(O-CH2-CH2V , -C(=O)-NH-, -S-, -NH-C(=O)-;
Ry está ausente o es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y
J es -S-, -SS-, o -C(=O)-, y los grupos restantes son como los definidos en la decimosexta realización específica. En ciertas realizaciones,
W' es -O-, -N(Re)- o -N(Re)-C(=O)-;
Re es -H, -Me, o -(CH2-CH2-O)n-Me;
n es un número entero de 2 a 6;
Rx es un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 6 átomos de carbono;
V y Ry están ausentes; y
J es -C(=O)-. Los grupos restantes son como los definidos en la decimosexta realización específica.
En una decimoséptima realización específica, L' en la decimosexta realización específica se representa por la siguiente fórmula:
-W'-[CRrR2”]a-V-[Cy]o-i-[CR3"R4”]b-C(=O)-,
en donde:
Rr- , R2" , y R3" son cada uno independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono, preferentemente, -Me;
R4-- es -H, un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono (preferentemente, -Me), -SO3H, o -SO3-M+, en donde M+ es un catión farmacéuticamente aceptable;
a es un número entero de 0-5 (p. ej., de 0 a 2, 3, 4, o 5), y b es un número entero de 0-6 (p. ej., de 0 a 3, 4, 5, o 6); y, Cy es un anillo heterocíclico de 5 miembros opcionalmente sustituido que porta un heteroátomo de N, preferentemente Cy es
Figure imgf000074_0001
En ciertas realizaciones, tal como en la decimosexta o la decimoséptima realización específica, W' es -N(Re)-.
En ciertas realizaciones, tal como en la decimosexta o la decimoséptima realización específica, Re es -(CH2-CH2-O)2-6-Rk, en donde Rk es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, tal como en la decimosexta o la decimoséptima realización específica, V es -S- o -SS-. En una decimooctava realización específica, L' en la decimosexta o la decimoséptima realización específica se representa por la siguiente fórmula:
- NRe-[CRr - R2"]a-S-[CR3" R4-]b-C(=O)-.
En ciertas realizaciones, tal como en laa realizaciones específicas decimosexta a decimoséptima, el conjugado es:
Figure imgf000075_0001
en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, tal como en la realizaciones específicas decimosexta a la decimooctava, el anticuerpo es huMy9-6.
En una decimonovena realización específica, L' en la decimosexta o la decimoséptima realización específica se representa por la siguiente fórmula:
- NRe-[CRrR2"]a-S-Cy-[CR3"R4’]b-C(=O)-.
En ciertas realizaciones, tal como en las realizaciones específicas decimosexta, decimoséptima, y decimonovena, el conjugado es:
Figure imgf000075_0002
en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, tal como en las realizaciones específicas decimosexta, decimoséptima, y decimonovena, el anticuerpo es huMy9-6.
En la vigésima realización específica, el compuesto citotóxico unido al grupo conector se representa por la siguiente fórmula:
Figure imgf000076_0001
en donde:
W' está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S-, -CH2-S-, o -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
Zs está unido al CBA, y es bien un enlace, o -SRm-;
Rm es Rd o un alquilo lineal o ramificado sustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono que porta un éster reactivo, seleccionado de ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxiftalimida, ésteres de N-hidroxi sulfosuccinimida, ésteres de para-nitrofenilo, ésteres de dinitrofenilo, y ésteres de pentafluorofenilo;
Rd se selecciona de fenilo, nitrofenilo, dinitrofenilo, carboxinitrofenilo, piridilo o nitropiridilo; y
n es un número entero de 1 a 24; y el resto de las variables son como se describió anteriormente en la octava o decimoquinta realización específica.
En una vigésimo primera realización específica, el compuesto citotóxico unido al grupo conector se representa por la siguiente fórmula:
Figure imgf000076_0002
Figure imgf000077_0001
en donde:
W está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S-, -CH2-S-, o -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
n es un número entero de 2 a 6;
Zs está unido al CBA, y se selecciona de:
un enlace;
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000078_0001
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; y,
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+.
En ciertas realizaciones, Zs se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000078_0002
Figure imgf000079_0001
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, W' es -N(Re)-.
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, Re es -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, Rk es -H o -Me, n es 4, y q es 2.
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; y p es 0, 1,2 o 3.
En ciertas realizaciones, tal como la 21a realización específica, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
En una vigésimo segunda realización específica, el conjugado de la fórmula (VIIIb') y (Xb') descrito en la vigésimo primera realización específica, las variables son como las descritas a continuación:
Y es -SO3 M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (p. ej., Na+);
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son ambos -O-;
R6 es -OMe; y
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 21a, Y se selecciona de -SO3M, -SO2M y un sulfato
-OSO3M. Preferentemente, Y es -SO3M. Preferentemente, M es -H, Na+ o K+.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, W, cuando está presente, es C=O.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-. En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo conector, y un grupo protector de amina. En ciertas realizaciones, X' es -H, -OH, -Me o el grupo conector. Preferentemente, X' es -H.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, Y' es -H u oxo. Más preferentemente, -H.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O-, -S-, -N(R5)-, y oxo (C=O). Preferentemente, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O- y -S-. Más preferentemente, A y A' son -O-.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 22a, D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, -OR, -NR'COR'', -SR y -COR'. Preferentemente, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono.
En una vigésimo tercera realización específica, para los compuestos de la fórmula (Ibb') o (IIBb'), descritos en la vigésima realización específica, las variables son como las descritas a continuación:
Y es -SO3 M;
M es -H o Na+;
X' e Y' son ambos -H;
A y A' son ambos -O-;
R6 es -OMe;
Rx es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Preferentemente, Rx es -(CH2)p-(CRfRg)-, en donde Rf y Rg se seleccionan cada uno independientemente de -H o un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 4 átomos de carbono; p es 0, 1, 2 o 3. Más preferentemente, Rf y Rg son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H y -Me; y p es 1.
En una vigésimo cuarta realización específica, el conjugado de la presente invención tal como se describió en la decimocuarta, decimoquinta, o la vigésimo primera realización específica se representa por lo siguiente:
Y es -SO3 M, en donde M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable (p. ej., Na+);
W es C=O;
Ri, R2 , Ri', R2', R4 y R4 ' son -H;
uno de R3 , o R3 ' es opcionalmente el grupo conector y el otro es -H;
R6 es -OMe;
Z y Z' son -CH2 ;
X' es -H;
Y' es -H; y
A y A' son -O-.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, Y se selecciona de -SO3M, -SO2M y un sulfato -OSO3M. Preferentemente, Y es -SO3M.
En ciertas realizaciones, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, M es -H, Na+ o K+.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, W, cuando está presente, es C=O.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, Z y Z', cuando están presentes, son -CH2-.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, X' se selecciona del grupo que consiste en -H, -OH, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, el grupo conector, y un grupo protector de amina. En ciertas realizaciones, X' es -H, -OH, -Me o el grupo conector. En ciertas realizaciones, X' es -H.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como la 14a a la 24a realizaciones específicas, Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. En ciertas realizaciones, Y' es -H u oxo. En ciertas realizaciones, Y' es -H.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O-, -S-, -N(R5)-, y oxo (C=O). En ciertas realizaciones, A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -O- y -S-. En ciertas realizaciones, A y A' son -O-.
En cualquiera de las realizaciones específicas para el conjugado de la invención anteriores, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, D y D', cuando están presentes, son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2K en donde n es un número entero de 1 a 24, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, o un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo están opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en halógeno, -OR, -NR'COR'', -SR y -COR'. En ciertas realizaciones, D y D' son un alquilo lineal o ramificado que porta de 1 a 4 átomos de carbono.
En ciertas realizaciones, el conjugado de una cualquiera de las realizaciones descritas, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, puede comprender 1-10 compuestos citotóxicos, 2-9 compuestos citotóxicos, 3-8 compuestos citotóxicos, 4-7 compuestos citotóxicos, o 5-6 compuestos citotóxicos, comprendiendo cada compuesto citotóxico el grupo conector que une el compuesto citotóxico al CBA, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
En ciertas realizaciones, el conjugado de una cualquiera de las realizaciones descritas, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, puede comprender 1-10 compuestos citotóxicos, 2-9 compuestos citotóxicos, 3-8 compuestos citotóxicos, 4-7 compuestos citotóxicos, o 5-6 compuestos citotóxicos, comprendiendo cada compuesto citotóxico el grupo conector que une el compuesto citotóxico al CBA, y cada compuesto citotóxico en el conjugado es el mismo.
En ciertas realizaciones, el conjugado de una cualquiera de las realizaciones descritas, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, puede comprender 1-10 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), 2-9 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), 3-8 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), 4-7 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), o 5-6 compuestos citotóxicos totales y compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados), comprendiendo cada uno de los compuestos citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados) el grupo conector que une los compuestos citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados) al CBA, y cada uno de los compuestos citotóxicos o compuestos citotóxicos que contienen imina (no modificados) en el conjugado es el mismo (excepto para la modificación (bisulfito)).
En cualquiera de las realizaciones de conjugados, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, el agente de unión a células puede unirse a las células diana seleccionadas de células tumorales, células infectadas por virus, células infectadas por microorganismos, células infectadas por parásitos, células autoinmunes, células activadas, células mieloides, células T activadas, células B, o melanocitos; células que expresan los antígenos CD4, CD6, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37 , CD38, CD40, CD44, CD56, EpCAM, CanAg, CALLA, o Her-2; antígenos Her-3; o células que expresan el receptor del factor de crecimiento insulínico, receptor del factor de crecimiento epidérmico, y receptor de folato.
En cualquiera de las realizaciones de conjugados, tal como las realizaciones específicas 14a a 24a, el agente de unión a células puede ser un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un dominio de anticuerpo, un fragmento de dominio de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, una linfoquina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, o una molécula de transporte de nutrientes.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado en la superficie, un anticuerpo de cadena sencilla modificado en la superficie, o un fragmento de anticuerpo modificado en la superficie.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento del mismo anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena sencilla humanizado, o un fragmento de anticuerpo humanizado.
En una cualquiera de las realizaciones específicas en el presente documento, tales como las realizaciones específicas 1a - 24a, el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en sulfitos (H2SO3, H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono, di, tri, y tetra-tiofosfatos (PO3SH3 , PO2S2H3 , POS3H3 , PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), ésteres de tio fosfato ((R¡O)2PS(OR¡), R¡SH, R¡SOH, RSO2H, RSO3H), varias aminas (hidroxilamina (p. ej., NH2OH), hidrazina (p. ej., NH2NH2), NH2O-R¡, R¡'NH-R¡, NH2-R¡), NH2-CO-NH2 , NH2-C(=S)-NH2 'tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42-formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2- formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, en donde R¡ y R¡' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2, -CO2H, -SO3H, y -PO3 H; R¡ y R¡' pueden estar además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
Preferentemente, el reactivo que reacciona con imina es un sulfito. Más preferentemente, el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
En una cualquiera de las realizaciones específicas en el presente documento, tal como las realizaciones específicas 1a - 24a, se usan de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 equivalentes molares del reactivo que reacciona con imina respecto al compuesto citotóxico que contiene imina. En ciertas realizaciones, se usan de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 equivalentes molares del reactivo que reacciona con imina respecto al compuesto citotóxico que contiene imina. En ciertas realizaciones, se usan de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 equivalentes molares del reactivo que reacciona con imina respecto al compuesto citotóxico que contiene imina.
En una cualquiera de las realizaciones específicas en el presente documento, tal como las realizaciones específicas 1a - 24a, el agente de reticulación bifuncional une el agente citotóxico al agente de unión a células a través de un enlace tioéter, y puede tener un resto basado en maleimido o haloacetilo, en donde el agente de reticulación bifuncional que tiene el resto basado en maleimido se selecciona de: N-succinimidil 4-(maleimidometilo)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-ciclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), N-(pmaleimidofenilo)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato; y, en donde el agente de reticulación bifuncional que tiene el resto basado en haloacetilo se selecciona de: N-succinimidil-4-(yodoacetilo)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis-maleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2 , BM(PEO)3, N-(pmaleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico hidrazidâ HCl (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonilo)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bismaleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SlAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(Y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(s-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMCS), N-(K-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(pmaleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal y PEGn-Mal.
En ciertas realizaciones, el agente de reticulación bifuncional se selecciona del grupo que consiste en SMCC, Sulfo-SMCC, BMPS, GMBS, SIA, SIAB, N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, bis-maleimidohexano o BMPEO.
En cualquiera de las realizaciones, tales como las realizaciones específicas 1a - 24a, el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial, cromatografía de adsorción, filtración por adsorción, precipitación selectiva, filtración no absorbente o combinación de los mismos. Preferentemente, el conjugado se purifica por filtración en flujo tangencial y/o cromatografía de adsorción.
En ciertas realizaciones, tales como las realizaciones específicas 1a - 24a, el agente de unión a células (CBA) que porta el grupo que reacciona con tiol es:
Figure imgf000083_0001
Los compuestos o los conjugados preparados por los métodos de la invención incluyen específicamente:
Figure imgf000083_0002
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -H o -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable. En una 25a realización específica, la invención proporciona un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula:
Figure imgf000086_0001
comprendiendo el método hacer reaccionar un compuesto citotóxico de la siguiente fórmula,
Figure imgf000086_0002
con un CBA modificado de la siguiente fórmula, respectivamente, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9,
Figure imgf000086_0003
Figure imgf000087_0001
en donde:
r es un número entero de 1 a 10;
Y es un grupo saliente, y es un sulfito (HSO3, HSO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono-, di-, tri-, y tetra-tiofosfato (PO3SH3, PO2S2H2 , POS3H2, PS4H2 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), éster de tio fosfato (R¡O)2 PS(OR¡), R¡S-, R¡SO, RSO2, R'SO3, tiosulfato (HS2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (HS2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk')(S)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (Rk'C(=O)NOH o una sal formada con un catión), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2- o una sal de HOCH2SO2- formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+) o una mezcla de los mismos, en donde R¡ es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y está sustituido con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2 , -CO2H, -SO3H, y -PO3H; R¡ puede estar además opcionalmente sustituido con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; Rk' es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo; preferentemente, Y es -SO3M; y
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, Y es -SO3 M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, el compuesto citotóxico se produce haciendo reaccionar un reactivo que reacciona con imina con un compuesto citotóxico que contiene imina de la siguiente fórmula:
Figure imgf000087_0002
En ciertas realizaciones, el CBA es huMy9-6.
En una 26a realización específica, la invención proporciona un método para preparar un conjugado de la siguiente fórmula:
Figure imgf000088_0001
comprendiendo el método hacer reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo que reacciona con imina, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector para formar el conjugado,
en donde:
el compuesto citotóxico que contiene imina es:
Figure imgf000088_0002
el agente de reticulación bifuncional es:
Figure imgf000089_0001
el reactivo que reacciona con imina se selecciona de: sulfitos (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2-formada con un catión), metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión), mono, di, tri, y tetratiofosfatos (PO3SH3 , PO2S2H3 , POS3H3 , PS4H3 o una sal de PO3S3-, PO2S23-, POS33- o PS43- formada con un catión), ésteres de tio fosfato ((R¡O)2PS(OR¡), R¡SH, R'SOH, RSO2H, RSO3H), varias aminas (hidroxil amina (p. ej., NH2OH), hidrazina (p. ej., NH2NH2), NH2O-R¡, R¡'NH-R¡, NH2-R¡), NH2-CO-NH2, NH2-C(=S)-NH2 tiosulfato (H2S2O3 o una sal de S2O32- formada con un catión), ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión), fosforoditioato (P(=S)(ORk)(SH)(OH) o una sal del mismo formada con un catión), ácido hidroxámico (RkC(=O)NHOH o una sal formada con un catión), hidrazida (RkCONHNH2), sulfoxilato de formaldehído (HOCH2SO2H o una sal de HOCH2SO2-formada con un catión, tal como HOCH2SO2-Na+), nucleótido glicado (tal como GDP-manosa), fludarabina o una mezcla de los mismos, en donde R¡ y R¡' son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono y están sustituidos con al menos un sustituyente seleccionado de -N(Rj)2 , -CO2H, -SO3H, y -PO3H; R¡ y R¡' pueden estar además opcionalmente sustituidos con un sustituyente para un alquilo descrito en el presente documento; Rj es un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; Rk es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, arilo, heterociclilo o heteroarilo.
En ciertas realizaciones, Y es -SO3 M; y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones, el CBA es huMy9-6.
Citotoxicidad in vitro de compuestos y conjugados
Los compuestos citotóxicos y los conjugados de agente de unión a células-fármaco producidos por los métodos de la invención pueden evaluarse por su capacidad para suprimir la proliferación de diversas líneas celulares de cáncer in vitro. Por ejemplo, las líneas celulares tales como la línea de carcinoma de colon humano COLO 205, la línea celular de rabdomiosarcoma RH-30, y la línea celular de mieloma múltiple MOLP-8 pueden usarse para la evaluación de la citotoxicidad de estos compuestos y conjugados. Las células que se van a a evaluar se pueden exponer a los compuestos o conjugados durante 1-5 días y las fracciones supervivientes de células se miden en ensayos directos por métodos conocidos. Los valores de CI50 pueden calcularse después a partir de los resultados de los ensayos. Alternativamente o adicionalmente, puede usarse un cribado de la sensibilidad de la línea celular in vitro tal como el descrito por el Instituto Nacional del Cáncer de Estados Unidos (véase Voskoglou-Nomikos et al., 2003, Clinical Cancer Res. 9: 4227-4239, como una de las guías para determinar los tipos de cánceres que pueden ser sensibles al tratamiento con los compuestos o conjugados producidos por los métodos de la invención.
Los ejemplos de potencia y especificidad de la diana in vitro de los conjugados anticuerpo-agente citotóxico producidos por los métodos de la presente invención se muestran en la FIG. 17. Todos los conjugados son extremadamente citotóxicos en las células cancerosas positivas al antígeno con una CI50 en el intervalo picomolar bajo. Las líneas celulares negativas al antígeno permanecieron viables cuando se expusieron a los mismos conjugados. Los dímeros de indolinobenzodiazepina mostraron potencia específica de la diana siendo 160 veces menos potentes cuando se bloquearon con el anticuerpo huMy9-6 sin conjugar (anti-CD33) (FIG. 17) y 40 veces menos potentes cuando se bloquearon con el anticuerpo FOLR1 sin conjugar (anticuerpo anti-receptor folato) (resultado no mostrado). Por ejemplo, el conjugado huMy9-6-SPDB-1f que porta los aductos de bisulfito mató a las células HL60/QC positivas al antígeno con un valor de CI50 de 10.5 pM, mientras que la adición de un exceso de anticuerpo huMy9-6 sin conjugar redujo este efecto citotóxico (CI50 = 1.69 nM), demostrando la especificidad para el antígeno (FIG. 17A). Adicionalmente, el conjugado huMy9-6-SPDB-1f es además altamente potente tanto para la línea celular HL60/ATCC con un valor de CI50 de 21 pM como para la línea celular NB-4 con un valor de CI50 de 190 pM (FIGS. 17B y 17C).
El efecto de la conjugación en la unión del anticuerpo se midió comparando la unión tanto del anticuerpo huMy9-6 sin conjugar como del conjugado huMy9-6-SPDB-1f hacia la línea celular HL60/QC (FIG. 18). El análisis FACS reveló que no existe cambio en la capacidad de unión del conjugado al anticuerpo desnudo indicando que no existe compromiso en la unión debido a la conjugación del agente citotóxico al anticuerpo.
En un ejemplo, se midió la eficacia in vivo de un conjugado agente de unión a células/agente citotóxico. Se trataron ratones desnudos que portan tumores HL60/QC humanos con el conjugado huMy9-6-SPDB-1f y se observó una regresión significativa del tumor a múltiples dosis mientras que en los ratones sin tratar los tumores crecieron rápidamente (FIG. 19). Se observó actividad a dosis tan bajas como 20 jg/kg que es al menos 35 veces inferior que la dosis máxima tolerada.
El efecto de la saturación de imina frente a la tolerabilidad se muestra en la Tabla 9. Se ensayó di-imina huFOLR1-fármaco 1 en múltiples dosis y se encontró que todas son altamente tóxicas quedando solamente supervivientes en el grupo de ensayo más bajo ensayado a 50 jg/kg. En contraste, se encontró que los conjugados mono-imina huF0LR1-fármaco2 parcialmente reducidos y huFOLR1-SPDB-IGN (huFOLR1-SPDB-1f) tienen una tolerancia significativamente mejorada con el conjugado huF0LR1-SPDB-IGN (huF0LR1-SPDB-1f) mostrando un 100 % de supervivencia animal a las dosis más altas probadas de 560 jg/kg.
Ejemplificación
Ejemplo 1
El anticuerpo My9-6 humanizado a 2 mg/ml se conjugó con 9 equivalentes molares de éster de 2-NHS (compuesto 2) durante 3 h a 25 °C en PBS al 85 %, a pH 7.4, que contenía DMA al 15 % (v/v) y se purificó después en una columna de desalado G25 en PBS, a pH 7.4, para eliminar el fármaco no conjugado que no había reaccionado o hidrolizado. El conjugado se dializó en tampón de Histidina 10 mM, Glicina 250 mM, a pH 6.5, que contenía sacarosa al 1 %. La relación fármaco/anticuerpo en el conjugado (DAR) se determinó como 1.4 DAR basado en la absorbancia de UV a 280 y 320 nm y el cálculo usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm y 320 nm.
El conjugado se analizó para el % de monómero por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna TSK-Gel G300SWXL (7.8 mm x 300 mm, 5 jm de tamaño de partícula) usando una fase móvil isocrática de perclorato sódico 400 mM, tampón de fosfato potásico 150 mM, a pH 7.0, a 1 ml/min. Los porcentajes de monómero (% de monómero) y agregado se determinaron monitorizando la absorbancia de UV de todas las especies de anticuerpos a 280 nm y midiendo el área bajo la curva (AUC) de cada pico de anticuerpo. Además, los porcentajes (%) del fármaco 2 tanto en el monómero como en el agregado se determinaron monitorizando la absorbancia de UV de todas las especies de anticuerpos a 320 nm y 280 nm y midiendo el AUC de cada pico de anticuerpo. El % de monómero del conjugado huMy9-6-2 que contiene 1.4 DAR fue del 91 %. El % de 2 en el monómero fue del 80 %.
Para el ensayo con el fármaco libre (sin conjugar), el conjugado se extrajo con acetona para eliminar la proteína, se secó, y reconstituyó en la fase móvil y se inyectó en una columna HPLC de fase reversa VYDAC 208TP C8 (4.6 x 250 mm, 7 jm de tamaño de partícula) usando un gradiente lineal de acetonitrilo al 20 % y agua desionizada al 80 % hasta acetonitrilo al 100 %, todos conteniendo ácido acético al 0.025 %, a 1 ml/min durante 48 min y se comparó con los estándares de fármacos metil-éster. El porcentaje de fármaco libre, sin conjugar en el conjugado se determinó como <1 % del fármaco conjugado.
El conjugado huMy9-6-2 con 1.4 de relación fármaco/anticuerpo (DAR) se analizó por espectrometría de masas (MS) después de la desglicolisación (FIG. 1A). La MS del conjugado mostró el anticuerpo sin conjugar (D0) como el pico más alto, con un pico más pequeño D1 (anticuerpo con 1 fármaco unido), y picos mucho más pequeños D2 y d3 de 2 y 3 fármacos unidos por anticuerpo. La eficacia de la conjugación fue baja con una DAR del conjugado de 1.4 después de la conjugación con un exceso molar de 9 veces del éster de 2-NHS sobre el anticuerpo.
Ejemplo 2
Para la conjugación del éster de 2-NHS (compuesto 2) usando bisulfito sódico, el éster de 2-NHS (compuesto 2) se pre-incubó con 0.9 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHS03 recién preparado en agua desionizada) con DMA (dimetilacetamida) al 66 % en agua durante 30 min a 25 oC. El anticuerpo HuMy9-6 a 2 mg/ml se conjugó con 9 equivalentes molares de éster de 2-NHS (con adición de NaHSO3) durante 3 h a 25 oC en PBS al 85 %, a DMA al 15 % (v/v) y se purificó después en una columna de desalado G25 en PBS, a pH 7.4 para eliminar el fármaco que no había reaccionado o hidrolizado. El conjugado se dializó en tampón de histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 %, a pH 6.5.
La DAR del conjugado huMy9-6-2 preparado usando bisulfito sódico se midió por espectrofotometría de UV a 280 y 320 nm y se calculó que era de 3.1 DAR. El % de monómero del conjugado fue del 95 % y el % de 2 en el monómero fue del 91 %. La MS del conjugado preparado usando bisulfito sódico a continuación de la desglicosilación mostró el pico más alto de D1 con un fármaco unido, y además los picos D2, D3, D4, D5, D6 con 2-6 fármacos unidos por anticuerpo (FIG. 1B).
El conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico mostró una incorporación de fármaco de 3.1 DAR mucho mayor que el conjugado preparado sin bisulfito sódico con 1.4 DAR. La MS del conjugado de 3.1 DAR preparado con bisulfito sódico mostró picos del conjugado de 1-6 fármacos unidos con el pico D1 más alto de 1 fármaco unido. Por el contrario, la MS del conjugado de 1.4 DAR preparado sin bisulfito sódico mostró el pico más alto de anticuerpo sin conjugar (D0) y picos D1, D2 y D3 mucho menores del conjugado de fármaco unido. El % de fármaco en el monómero para el conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico fue 91 %, lo cual fue superior que el 80 % de fármaco en el monómero para el conjugado huMy9-6-2 preparado sin bisulfito sódico. La calidad global del conjugado para el conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico, por lo tanto, fue muy superior que por el procedimiento tradicional de conjugación sin bisulfito sódico.
Las conjugaciones de los ésteres de NHS de fármacos diversos (1, 2, 3, y 4) con el anticuerpo se realizaron en presencia de bisulfito sódico (NaHSO3) y se compararon con el método tradicional de conjugación sin NaHSO3. Los resultados se muestran en la Tabla 16. En todos los casos, la adición de bisulfito sódico en la conjugación mostró conjugados con una calidad significativamente mejor de DAR superior y % superior de fármaco en el monómero que los conjugados preparados sin la adición de bisulfito sódico.
Tabla 16. Comparaciones de las conjugaciones del anticuerpo con diversos ésteres de NHS del fármaco sin y con adición de bisulfito sódico (NaHSO3)
Figure imgf000091_0001
El conjugado huMy9-6-2 preparado con bisulfito sódico mostró una citotoxicidad in vitro similar a la del conjugado preparado sin bisulfito sódico (FIG. 2). Por lo tanto, un conjugado de mejor calidad de DAR superior y % superior de fármaco en el monómero se preparó usando bisulfito sódico sin pérdida alguna de la potencia de citotoxicidad. Un conjugado de anticuerpo anti-CD22-2 preparado con bisulfito sódico mostró una citotoxicidad in vitro similar a la del conjugado preparado sin bisulfito sódico (FIG. 3).
El conjugado huMy9-6-2 preparado usando bisulfito sódico se analizó mediante SDS-PAGE no-reductora usando un analizador por chip del gel. El conjugado mostró sólo la banda del anticuerpo intacta; no se observaron bandas de cadenas pesada y ligera, mostrando una ventaja inesperada de que el bisulfito sódico adicionado no causó ninguna reducción indeseada de los enlaces disulfuros intercatenarios nativos en el anticuerpo.
El éster de 2-NHS o los ésteres de SPDB-NHS de 3, 4, 1, y 5 se pre-incubaron con 0.5 a 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHSO3 recién preparado en agua desionizada) en DMA (dimetilacetamida) al 66-98 % en agua de 15 min a 4 h a 25 °C. Algunas de estas reacciones se dejaron además toda la noche a 4 °C y se usaron para las conjugaciones 20 h después.
El éster de 2-NHS en DMA tratado con bisulfito sódico o sin adicionar bisulfito sódico se analizó por HPLC usando una columna de fase reversa VYDAC C8 con un gradiente lineal de acetonitrilo al 20 % y agua desionizada al 80 % hasta acetonitrilo al 100 %, todos conteniendo ácido acético al 0.025 %, a 1 ml/min durante 48 min. Como se muestra en la FIG. 4, el éster de 2-NHS parental eluyó en ~23 min. Después de 30 min de tratamiento con 0.9 equivalentes molares de NaHSO3 en DMA al 66 % en agua a 25 °C, una mayoría del 2-NHS se convirtió en la forma sulfonatada, más polar que eluyó en ~14 min. De forma inesperada, no se observó ningún pico indeseable de 2 hidrolizado sulfonatado. Por lo tanto, se observó una reacción sorprendentemente favorable de bisulfito sódico hacia la adición del enlace imina sin reacción con el éster de NHS.
Del mismo modo, los ésteres de NHS del fármaco se tratan con reactivos que reaccionan con imina distintos del bisulfito sódico antes de la conjugación con el anticuerpo. Un enfoque alternativo de la conjugación es tratar una mezcla del éster de NHS del fármaco y anticuerpo con el bisulfito sódico u otro reactivo que reacciona con imina.
Ejemplo 3
El conjugado de anticuerpo-SPDB-1 unido por disulfuro se preparó usando el 1-SPDB-éster de NHS sintetizado (compuesto 1c). El 1-SPDB-éster de NHS se pretrató con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (usando una disolución de NaHSO3 recién preparada en agua) en DMA al 96-98 % en agua durante 4-5 h a 25 °C. El 1-SPDB-éster de NHS tratado con bisulfito sódico en DMA se analizó usando la columna de HPLC de fase reversa VYDAC C8 con un gradiente lineal de acetonitrilo al 20 % y agua desionizada al 80 % que contenía ácido acético al 0.025 % a 1 ml/min durante 48 min. El análisis de HPLC de fase reversa mostró sólo la reacción deseada de adición de bisulfito al enlace imina, sin la reacción indeseada del bisulfito con el éster de NHS.
Para la conjugación, un anticuerpo humanizado a 2 mg/ml se hizo reaccionar con 5-7 equivalentes molares de 1-SPDB-éster de NHS (pre-tratado con NaHSO3) durante 6 h a 25 °C en tampón acuoso de PBS al 85 %, a pH 7.4, que contenía N,N-dimetilacetamida (DMA) al 15 % y se purificó después en una columna de filtración en gel G25 en PBS, a pH 7.4, para eliminar el fármaco que no había reaccionado o hidrolizado. Los conjugados de anticuerpo humanizado-SPDB-1 se dializaron en tampón de Histidina 10 mM, Glicina 250 mM, sacarosa al 1 %, a pH 6.5. Se midieron las relaciones fármaco/anticuerpo (DAR) de los conjugados y eran 2.2-2.9 mediante las mediciones de absorbancia de UV a 280 y 320 nm y usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm y 320 nm. El porcentaje de monómero en la preparación de conjugado se determinó por SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) como el 90 %. Basado en la absorbancia UV del pico de monómero en SEC se demostró además que el pico de monómero del conjugado tenía moléculas de fármaco unidas. Se mostró que el % de fármaco sin conjugar por extracción con acetona y HPLC de fase reversa era menos del 1 %.
La MS de los conjugados de anticuerpo desglicosilado-SPDB-1 preparados con bisulfito sódico adicionado antes de la conjugación mostró un conjugado muy superior que el obtenido sin la conjugación con bisulfito sódico (FIG. 5). La MS del conjugado preparado sin bisulfito sódico tuvo un promedio de 1.4 de 1/Ab y especies de anticuerpos con hasta tres moléculas de 1 unidas (FIG. 5A). Por el contrario, la MS del conjugado preparado con bisulfito sódico mostró un promedio de 2.5 de 1/Ab y especies de anticuerpos con hasta siete moléculas de 1 unidas (FIG. 5B).
El conjugado de anticuerpo-SPDB-1 unido por disulfuro preparado usando bisulfito sódico mostró sólo la banda del anticuerpo intacto mediante el análisis con chip en gel de SDS-PAGE no-reductora. El ensayo del chip en el gel se realizó usando chip de proteínas Agilent Protein 230 y se analizó usando un bioanalizador Agilent 2300. No se observaron bandas de cadenas pesadas ni ligeras, mostrando una ventaja inesperada de que el bisulfito sódico adicionado no causó ninguna reducción indeseada de los enlaces disulfuros intercatenarios en el anticuerpo nativo (FIG. 6). El fármaco unido obtenido en el conjugado de anticuerpo-SPDB-1 preparado usando bisulfito sódico demostró sorprendentemente además que el conector de disulfuro en el conjugado fue estable con el bisulfito sódico adicionado.
Ejemplo 4
Para la preparación del conjugado, el 1f-SPDB-éster de NHS (compuesto 1c, FIG. 7) se pre-incubó con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (NaHSO3 recién preparado en agua desionizada) en DMA (dimetilacetamida) al 96 % en agua durante 5 h a 25 °C y después se incubó toda la noche a 4 °C hasta que fuera necesario para la conjugación. El anticuerpo humanizado a 2-3 mg/ml se derivatizó con 8 equivalentes molares del 1f-SPDB-éster de NHS en ausencia o presencia de bisulfito sódico (-/+ NaHSO3) durante 4 h a 25 °C en tampón acuoso HEPES 50 mM al al 95 %, a pH 8.5, que contenía DMA al 5 % (v/v) y después ambos se purificaron en columnas de desalado G25 en PBS, a pH 7.4, para eliminar el fármaco que no había reaccionado, hidrolizado. Los conjugados se dializaron en tampón de histidina 10 mM, glicina 250 mM, sacarosa al 1 %, a pH 6.5. La DAR del conjugado se midió por espectrofotometría de UV a 280 y 320 nm. El % de monómero y el % de fármaco en el monómero en el conjugado se determinaron por SEC. El fármaco sin conjugar en el conjugado se determinó mediante HPLC de fase reversa después de la extracción con acetona. Estas conjugaciones se realizaron con diversos anticuerpos humanizados.
Ejemplo 5
Para conjugar los tioles del fármaco con el conector de disulfuro reactivo incorporado en el anticuerpo, el mAb humanizado a 8 mg/ml se derivatiza con 4-6 equivalentes molares del conector SPDB heterobifuncional durante 1.5 h a 25 °C en tampón acuoso de PBS al 90 %, a pH 7.5, con DMA al 5 % (v/v) y se purifica después en una columna de desalado G25 en el tampón de citrato 35 mM, EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, a pH 5.5 para eliminar el conector que no ha reaccionado, hidrolizado. La LAR (relación conector anticuerpo) se mide por absorbancia de UV a 280 y 343 nm sin y con ditiotreitol 50 mM adicionado (para medir el anticuerpo total y SPy liberado). El anticuerpo modificado con SPDB a 2 mg/ml se hace reaccionar con 2 equivalentes molares de tiol del fármaco tratado con bisulfito sódico por conector durante 2 a 20 h a 25 °C en tampón de fosfato potásico 50 mM al 85-90 %, NaCl 50 mM, a pH 7.5 y se purifica después en una columna de desalado G25 en PBS, a pH 7.4, para eliminar el fármaco que no ha reaccionado, hidrolizado. La DAR del conjugado de anticuerpo-SPDB-fármaco se mide por la absorbancia de UV a 280 y 320 nm y el porcentaje de monómero y porcentaje de fármaco en el monómero en la preparación del conjugado se determina por SEC.
Ejemplo 6 Preparación de huMy9-6-sulfo-SPDB-1 (método de 2-etapas)
Figure imgf000093_0002
Una reacción que contenía 6 mg/ml del anticuerpo HuMy9-6 y 9 equivalentes molares del conector sulfo-SPDB (preparación madre 20 mM en DMA) se incubó durante 3 h a 25 °C en tampón EPPS 50 mM a pH 8. El conector sin reaccionar se eliminó usando una columna de desalado NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) y se determinó que la relación del conector al anticuerpo (LAR) era 3.7 basado en la concentración del anticuerpo y concentración de la tiopiridina liberada por DTT por uV-Vis (£343 nm= 8,080 cm-1M-1 para 2-tiopiridona).
El huMy9-6 modificado con sulfo-SPDB se diluyó a 2 mg/ml en EPPS 50 mM a pH 8.5, DMA al 10 % en v/v, y se hizo reaccionar con 2 equivalentes molares del compuesto 1d por conector (preparación madre 5 mM en DMA; 7.4 equivalentes por anticuerpo) durante 3 h a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en Glicina 250 mM, Histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 0.01 %, bisulfito sódico 50|jM a pH 6.2 usando una columna de desalado (G-25 Sephadex, grado fino, GE Healthcare).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2.9 moléculas del compuesto 1 unidas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar £330 nm= 15,484 cm-1M-1 y £280 nm= 30, 115 cm-1M-1 para el compuesto 1, y £280 nm= 207,000 cm-1M-1 para el anticuerpo My9-6), 97.8 % de monómero (por cromatografía de exclusión de tamaño), <1 % de compuesto 1 sin conjugar (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento del 60 % basado en la cantidad del anticuerpo usado, y un rendimiento global del 18 % basado en la cantidad de compuesto 1d usado. El conjugado preparado usando este método se podría concentrar (por celda agitada o dispositivo de filtro centrífugo Amicon) hasta >3 mg/ml sin la precipitación del conjugado.
Ejemplo 7 Preparación de huMy9-6-SPDB-1
Figure imgf000093_0001
Método 1 (método reactivo de una etapa):
Una reacción que contenía 2 mg/ml de anticuerpo HuMy9-6 y 7 equivalentes molares de 1-SPDB-NHS (pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito sódico en 90:10 DMA:agua, en v/v durante 1 h a 25 °C y toda la noche después a 4 °C) en tampón HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico) 50 mM a pH 8.5 y codisolvente DMA (N,N-Dimetilacetamida) al 10 % en v/v se dejó incubar durante 3 h a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en el tampón de formulación de Glicina 250 mM, Histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, Tween al 0.01 %, bisulfito sódico 50 |jM, usando las columnas de desalado NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). La diálisis se realizó en el mismo tampón durante 4 horas a temperatura ambiente utilizando casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 4.0 moléculas del compuesto 1 unidas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar £330 nm_ 15,484 cm-1M 1 y £280 nm= 30,115 cm-1M-1 para el compuesto 1, y £280 nm= 207,000 cm-1M-1 para el anticuerpo My9-6), el 92 % de monómero (por cromatografía de exclusión de tamaño, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto 1 sin conjugar (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa) un rendimiento del 72 % basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global del 40 % basado en la cantidad de 1-SPDB-NHS usado, y una concentración final de proteína de 1.0 mg/ml.
Método 2 (método de dos-etapas):
Una reacción que contenía 4.8 mg/ml de anticuerpo HuMy9-6 y 6 equivalentes molares de conector SPDB (preparación madre 18.5 mM en etanol) se incubó durante 3 h a 25 °C en PBS pH 7.4. El conector sin reaccionar se eliminó usando una columna de desalado NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare) y se determinó que la relación del conector al anticuerpo (LAR) era 4.0 basado en la concentración del anticuerpo y la concentración de 2-tiopiridona liberada por DTT por UV-Vis (£343 nm= 8,080 cm-1M-1 para 2-tiopiridona).
El huMy9-6 modificado con SPDB se diluyó a 2 mg/ml con EPPS 50 mM a pH 8.5, DMA al 10 % en v/v y se hizo reaccionar con 1.75 equivalentes molares del compuesto 1d por conector (preparación madre 5 mM en DMA; 7 equivalentes por anticuerpo) durante 3 h a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y se intercambió el tampón en Glicina 250 mM, Histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 al 0.01 %, bisulfito sódico 50j M a pH 6.2 usando una columna de desalado (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.8 moléculas del compuesto 1 unidas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar £330 nm= 15,484 cm-1M-1 y £280 nm= 30,115 cm-1M-1 para el compuesto 1, y £280 nm= 207,000 cm-1M-1 para el anticuerpo My9-6), el 91.6 % de monómero (por cromatografía de exclusión de tamaño, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto 1 sin conjugar (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento del 40 % basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global del 22 % basado en la cantidad de compuesto 1d usado, y una concentración final de proteína de 0.5 mg/ml.
Ejemplo 8 Preparación de huMy9-6-CX1-1-1
Figure imgf000094_0001
Método 1 (método reactivo de una etapa in-situ):
Una disolución de DMA que contenía el compuesto 1d 1.9 mM, conector CX1-1 heterobifuncional 1 mM con grupos N-hidroxisuccinimida (NHS) y maleimida, y diisopropil etil amina (DIPEA) 20 mM se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 8 min. Después, se añadió ácido maleimido propiónico (MPA) 3 mM para extinguir el exceso del compuesto 1d. La mezcla de reacción de 1-CX1-1-NHS se almacenó congelada a -80 °C, y después de descongelada se adicionó en dos porciones a una disolución tamponada de huMy9-6 a 25 °C (2 mg/ml, EPPS 100 mM, a pH 8.0, DMA al 10 % en v/v); 4.8 equivalentes molares por anticuerpo (basado en la concentración del conector) seguido por 4.2 equivalentes 30 min después. Después de 2 h de reacción, el conjugado se purificó y se intercambió el tampón en Glicina 250 mM, Histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 al 0.01 %, bisulfito sódico 50 j M a pH 6.2 usando una columna de desalado (Quick-spin protein, resina G-25 fina, Roche), diálisis, y finalmente filtración estéril por 0.22 jm.
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.3 moléculas del compuesto 1 unidas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar £330 nm = 15,484 cm-1M-1 y £280 nm = 30,115 cm-1M-1 para el compuesto 1, y £280 nm = 207,000 cm-1M-1 para el anticuerpo My9-6), el 95 % de monómero (por cromatografía de exclusión por tamaño, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % compuesto 1 sin conjugar (por extracción con acetona/ HPLC de fase reversa), un rendimiento del 45 % basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global del 17 % basado en la cantidad de compuesto 1d usado, y una concentración final de proteína de 0.7 mg/ml.
Método 2 (método de una etapa):
A una solución tamponada de anticuerpo HuMy9-6 (2 mg/ml, EPPS 50 mM, a pH 8.5, DMA al 8 % en v/v) se adicionaron 14 equivalentes molares del compuesto 1d (preparación madre 5 mM en DMA) seguido por 7 equivalentes molares del conector CX1-1 (disolución de preparación madre 15 mM en etanol) y se incubó durante 3 h a 25 °C.
Después de la reacción, el conjugado se purificó y se intercambió el tampón en Glicina 250 mM, Histidina 10 mM, sacarosa al 1 %, Tween-20 al 0.01 %, bisulfito sódico 50 |jM a pH 6.2 usando una columna de desalado (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare), seguido por 2 * diálisis a 4 °C en casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20,000 MWCO).
Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 3.4 moléculas del compuesto 1 unidas por anticuerpo (por UV-Vis usando los coeficientes de extinción molar £330 nm = 15,484 cm-1M-1 y £280 nm = 30,115 cm-1M-1 para el compuesto 1, y £280 nm = 207,000 cm-1M-1 para el anticuerpo My9-6), 90 % de monómero (por cromatografía de exclusión por tamaño, TSK3000, TOSOH Biosciences), <1 % de compuesto 1 sin conjugar (por extracción con acetona/HPLC de fase reversa), un rendimiento del 44 % basado en la cantidad del anticuerpo usado, un rendimiento global del 11 % basado en la cantidad de compuesto 1d usado, y una concentración final de proteína de 1.48 mg/ml.
Ejemplo 9 Análisis por MS del My9-6-SPDB-1f desglicosilado
Se preparó My9-6-SPDB-1f bien conjugando un éster de NHS que contenía el compuesto 1f directamente con las lisinas del anticuerpo (es decir, el método reactivo de una etapa como se describió anteriormente), o conjugando el compuesto 1d con un anticuerpo modificado con ditiopiridina (es decir, el método de dos etapas como se describió anteriormente). Los análisis por espectrometría de masa (MS) del My9-6-SPDB-1f desglicosilado se llevaron a cabo después tal como se describió anteriormente.
El método reactivo de una etapa dio un conjugado con 0-9 modificaciones del compuesto 1f, una distribución asimétrica del fármaco conjugado, y una cantidad significativa de anticuerpo sin conjugar. Por otra parte, el conjugado hecho con el método de dos etapas tuvo un perfil de MS con 0-6 modificaciones del compuesto 1f, una distribución simétrica del fármaco conjugado, y muy poco anticuerpo sin conjugar. Véase la FIG. 12. Ambos conjugados tuvieron un promedio similar de la relación compuesto 1f/anticuerpo de ~4 por análisis de UV-vis.
Ejemplo 10 Efecto del pH en la síntesis de My9-6-sulfo-SPDB-1 en dos etapas
Los datos de la MS para My9-6-sulfo-SPDB-1f preparado usando un método de dos etapas bajo diferentes condiciones de pH se mostraron en la FIG. 13. En resumen, el My9-6-sulfoSPDB (3.7 conectores/anticuerpo) se hizo reaccionar con 3 equivalentes del compuesto 1d por conector (o aproximadamente 11.1 equivalentes por anticuerpo) durante 18 h a pH 6, 7, 8, y 8.5. Los datos de la MS mostraron una disminución en el conector sin reaccionar (picos satélites 260 amu) con el aumento del pH de reacción. Así, parece que el pH afecta la reacción de conjugación en la síntesis del conjugado de My9-6-sulfo-SPDB-1f. Específicamente, se requiere un pH de > 8 para que el compuesto 1d reaccione completamente con el conector sulfo-SPDB en el anticuerpo.
Ejemplo 11 Efecto de la relación compuesto / conector en la síntesis en dos etapas de chKTI-sulfo-SPDB-1
La FIG. 14 muestra los datos de MS de chKTI-sulfo-SPDB-1 preparado usando un método de dos-etapas con diferentes relaciones compuesto 1d / conector. El chKTI-sulfoSPDB (3.7 de conector /anticuerpo) se hizo reaccionar con 1.1, 1.3, 1.5 o 2 equivalentes de compuesto 1d por conector durante 3 h, a 25 °C, a pH 8.5. La MS mostró una disminución en el conector sin reaccionar (picos satélites de 260 amu) con el aumento de equivalentes de compuesto 1d por conector. Parece que, bajo esta condición, se requiere una relación del compuesto 1d / conector de >1.3 para reaccionar completamente con el conector sulfo-SPDB en el anticuerpo. El aumento de los equivalentes de compuesto 1d por encima de 1.5 por conector condujo a un aumento de la fragmentación del anticuerpo (14-19 %) mientras que 1.1-1.3 de compuesto 1d / conector no causó una fragmentación significativa del anticuerpo.
Ejemplo 12 Preparación del conjugado anticuerpo-SPDB-fármaco
El compuesto 1c se pre-trató con 3 equivalentes molares de bisulfito sódico (usando una disolución recién preparada de NaHSO3 en agua) en DMA al 96-98 % en agua durante 4-5 h a 25 °C. Para la conjugación, el anticuerpo humanizado a 2 mg/ml se hizo reaccionar con 5-7 equivalentes molares del compuesto 1c (pre-tratado con NaHSO3) durante 6 h a 25 °C en PBS al 85-90 %, a pH 7.4, tampón acuoso, o HEPES 50 mM, a pH 8.5, tampón acuoso, que contenía N,N-dimetilacetamida (DMA) al 10-15 % y se purificó después en una columna de filtración en gel G25 en PBS, a pH 7.4, para eliminar el compuesto que no había reaccionado o hidrolizado. Los conjugados de anticuerpo humanizado-SPDB-fármaco se dializaron en tampón de Histidina 10 mM, Glicina 250 mM, sacarosa al 1 %, a pH 6.5. Se midió que la relación fármaco anticuerpo (DAR) de los conjugados era de 2.2-2.9 por mediciones de absorbancia de UV a 280 y 320 nm y usando los coeficientes de extinción del fármaco y anticuerpo a 280 nm (215,000 M-1cm-1) y 320 nm (9137 M-1cm-1). El porcentaje de monómero en los conjugados se determinó como >90 % por SEC (cromatografía de exclusión por tamaño) usando la columna TSK-Gel G300SWXL (7.8 mm * 300 mm, 5 |jm de tamaño de partícula). Basado en la absorbancia de UV del pico de monómero en SEC se demostró además que los picos del conjugado del monómero tenían moléculas de fármaco unidas. Para el ensayo de fármaco libre (sin conjugar), el conjugado se extrajo con acetona para eliminar la proteína, se secó, y se reconstituyó en la fase móvil y se inyectó en una columna de HPLC de fase reversa VYDAC 208TP C8 (4.6 * 250 mm, 7 jm de tamaño de partícula) y se comparó con los estándares. El porcentaje del compuesto de fármaco libre en el conjugado se determinó como <0.5 % del compuesto fármaco conjugado.
Preparación del conjugado Ab humanizado-SPDB-2a:
El Ab humanizado a 8 mg/ml se derivatizó con 4-6 equivalentes molares del conector heterobifuncional SPDB durante 1.5 h a 25 °C en PBS al 95 %, a pH 7.4, que contenía DMA al 5 % (v/v), y se purificó después sobre una columna de desalado G25 en tampón citrato (tampón citrato 35 mM, a pH 5.5, que contenía EDTA 2 mM, NaCl 150 mM) para eliminar el conector que no había reaccionado. Las LAR (relación conector anticuerpo) se midieron usando la absorbancia de UV a 2 8 0 y 343 nm sin y con la adición de ditiotreitol 50 mM (para medir el anticuerpo total y SPy liberada por ditiotreitol) y se determinó que era de 2.7-4.1 LAR. El anticuerpo modificado con SPDB a 2 mg/ml se hizo reaccionar con 2 equivalentes molares del compuesto 2a (sal de HCl) por SPDB unido durante 20 h a temperatura ambiente en tampón citrato al 85 %, DMA al 15 % (v/v) y se purificó después sobre una columna de desalado G25 en PBS, a pH 7.4 para eliminar el compuesto fármaco sin conjugar. La DAR del conjugado de Ab humanizado-SPDB-2a final se midió por espectrofotometría de UV a 280 y 350 nm y se calculó que era ~1.7-2.1 DAR. El porcentaje de monómero y compuesto de fármaco unido en el monómero en el conjugado se determinó mediante HPLC usando una columna SEC (cromatografía de exclusión por tamaño). Véase la FIG. 16.
Ejemplo 13 Uso de reactantes de imina covalentes para mejorar las especificaciones del conjugado Ab-fármaco (% de monómero y carga de fármaco)
La formación del aducto se llevó a cabo con 5 equivalentes molares de reactante imina sobre NHS-BMPS-1 en DMSO al 90 %/ PBS al 10 % a pH 7.4 durante 4 h a 25 °C. La mezcla de reacción se adicionó después al anticuerpo HuMy9-6 (4 equivalentes molares de fármaco, 2 mg/ml, DMSO al 10 % en v/v, tampón HEPES 50 mM, a pH 8.5, 5 h, 25 °C). Los conjugados preparados usando hidrosulfito sódico, bisulfito sódico, o metabisulfito sódico tuvieron relaciones fármaco/Ab similares y % de monómero, mientras que los conjugados preparados sin tratamiento con aditivo condujeron a muy poca incorporación de fármaco.
Ejemplo 14 Estudio de tolerabilidad in vivo de los conjugados huFOLR-1
La tolerabilidad in vivo de los conjugados huFOLR-1 se investigó en ratones hembras CD-1. Los animales se observaron siete días antes de la iniciación del estudio y se encontró que carecían de enfermedades o afecciones. A los ratones se les administró una única inyección i.v. del conjugado que porta el bisulfito y los animales se monitorizaron diariamente para la pérdida de peso corporal, morbilidad o mortalidad. La Tabla 9 muestra que para el huFOLR1-fármaco1, el conjugado se toleró sólo a la dosis más baja ensayada de 50 jg/kg. Por el contrario, se encontró que tanto los conjugados mono-imina huFOLR1-fármaco2 como huFOLR1-SPDB-1f eran mejor tolerados con una dosis máxima tolerada de <198 jg/kg y >560 jg/kg respectivamente.
Tabla 9 Datos de comparación de tolerabilidad para los conjugados (A) huFOLR1-fármaco1, (B) huFOLR1-fármaco2, y (C) huFOLR1-SPDB-1f.
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Ejemplo 15 Efecto del propilenglicol en la formulación y conjugación
Este ejemplo demuestra que las presentes reacciones de conjugación llevadas a cabo en presencia de propilenglicol como co-disolvente no muestran precipitación de los conjugados, y que se puede usar tanto como el 40 % (y posiblemente incluso más) de propilenglicol sin una disminución en el % de monómero del conjugado resultante (en presencia de 2 % de dimetilacetamida - datos no mostrados).
De mayor importancia, la presencia de propilenglicol durante la purificación conduce a un aumento significativo en el rendimiento (Tabla 10).
Aunque no se desea estar limitado por ninguna teoría en particular, los solicitantes creen que una fuente principal de los problemas durante la conjugación de los presentes conjugados es la hidrofobicidad inherente de los componentes moleculares de los conjugados. Esto puede explicar, al menos parcialmente, los bajos rendimientos purificados, y a veces los perfiles de distribución de masa aberrantes observados con las presentes conjugaciones. Es digno mencionar además que la adición de isopropanol durante la cromatografía de exclusión por tamaño de los presentes conjugados disminuye en gran medida la población aparente agregada. Esta observación sugiere que codisolventes pequeños hidrofóbicos pueden aumentar la solubilidad del fármaco y del conjugado de la invención. Así, en las presentes reacciones de conjugación, las etapas de purificación después de la reacción, y/o la formulación de los conjugados formados, se llevan a cabo preferentemente en presencia de codisolventes pequeños hidrofóbicos, tales como propilenglicol (p. ej., 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 %).
El anticuerpo-sulfo-SPDB se preparó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente por la adición de la forma de éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) de sulfo-SPDB al anticuerpo (huMy9-6) en agua que contenía DMA al 3 %, y tamponada a pH 8.5 durante 3 horas. El producto intermedio resultante (anticuerpo-sulfo-SPDB) se purificó en Sephadex G25 para eliminar el exceso de conector. El anticuerpo y el conector se cuantificaron mediante espectroscopía de UV-vis midiendo la absorbancia a 280 nm en ausencia del agente reductor, y a 343 nm en presencia de DTT ~50 mM para medir la liberación de 2-tiopiridina del conector conjugado.
Para conjugar el fármaco, el anticuerpo-sulfo-SPDB preparado anteriormente se hizo reaccionar a 2 mg/ml de anticuerpo con un exceso molar de 2 veces del compuesto 1 d en presencia de los co-disolventes indicados, y manteniendo el pH a 8.5 con tampón EPPS (concentración final de 60 mM). La dimetilacetamida (SAFC) y el propilenglicol (Alfa Aesar) se usaron como se recibieron sin purificación adicional. Todos los tampones se esterilizaron por el paso a través del filtro de 0.22 micrómetros (Corning) y el agua se purificó por ósmosis inversa /

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un CBA modificado a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde:
a) el CBA modificado comprende un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al CBA, y el residuo comprende el grupo conector y un grupo que reacciona con tiol; y
b) el compuesto citotóxico modificado comprende un grupo tiol, y se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000110_0001
haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo tiol con un reactivo que reacciona con imina, y en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000110_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (I') y (II') se produce a partir de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na'-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-,
-CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; y
L está ausente, o cuando está presente, comprende el grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
2. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo que reacciona con imina, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector para formar el conjugado, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000112_0001
en donde:
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2V-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; y L está ausente, o cuando está presente, comprende un grupo tiol, y es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
3. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método:
a) hacer reaccionar un compuesto citotóxico modificado con un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector, un grupo reactivo con el CBA (tal como un grupo tiol, un grupo maleimida, un grupo haloacetamida, o un grupo amina), y un grupo reactivo con el compuesto citotóxico modificado, para formar un segundo compuesto citotóxico modificado unido covalentemente a un residuo del agente de reticulación bifuncional, en donde el residuo comprende el grupo conector y el grupo reactivo con el CBA;
en donde el compuesto citotóxico modificado se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000113_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el compuesto citotóxico modificado se produce haciendo reaccionar un compuesto citotóxico que contiene imina con un reactivo que reacciona con imina, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
Figure imgf000114_0001
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (I') y (II') se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, o, halógeno;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2V-, -(CH2)n-CR7R8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n'-O-(CH2)na- y -(CH2)n'-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta de 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; L está ausente, o cuando está presente, comprende un grupo tiol, o es una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo, alquenilo, fenilo, o anillo heterocíclico o heteroarilo está opcionalmente sustituido; y
el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión); y
b) hacer reaccionar el segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a través del grupo reactivo con el CBA, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, para formar el conjugado.
4. El método de la reivindicación 3, en donde el compuesto citotóxico modificado comprende un grupo tiol, y el grupo reactivo con el compuesto citotóxico modificado es un grupo que reacciona con tiol.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000115_0001
en donde:
L', L'', y L''' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2 , -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3M, un sulfato -OSO3 M, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'';
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable; y,
G se selecciona de -CH- o -N-.
6. El método de la reivindicación 5, en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000116_0001
en donde:
W' está ausente, o cuando está presente, se selecciona de -CReRe'-, -O-, -O-C(=O)-, -C(=O)-O-, -S-, -SO-, -SO2-, -CH2-S-, -CH2O-, -CH2NRe-, -O-(C=O)O-, -O-(C=O)N(Re)-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -C(=O)-N(Re)-, -N(Re)-C(=O)O-, -N(C(=O)Re)C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -(O-CH2-CH2V , -SS-, o -C(=O)-, o un aminoácido, o un péptido que tiene 2 a 8 aminoácidos;
Rx está ausente, o cuando está presente, es un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo que porta de 6 a 10 átomos de carbono o un anillo heterocíclico de 3 a 8 miembros que porta de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N o S;
Re y Re' son iguales o diferentes, y se seleccionan de -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) 0 amino terciario
(-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde r i°i y r102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; preferentemente, R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono;
n es un número entero del 1 al 24.
7. El método de la reivindicación 6, en donde:
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector de amina;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
A y A' se seleccionan de -O- y -S-;
W' está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
G se selecciona de -CH- o -N-.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el agente de reticulación bifuncional se selecciona de: N-succinimidil 4-(maleimidometil)cidohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometilo)-cidohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato) (LC-SMCC), N-succinimidil éster del ácido k-maleimidoundecanoico (KMUA), N-succinimidil éster del ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), N-hidroxisuccinimida éster del ácido £-maleimidocaproico (EMCS), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS), N-(amaleimidoacetoxi)-succinimida éster (AMAS), succinimidil-6-(p-maleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenilo)-butirato (SMPB), N-(p-maleimidofenil)isocianato (PMPI), N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bismaleimidopolietilenglicol (BMPEO), BM(PEO)2 , BM(PEO)3, N-(p-maleimidopropiloxi)succinimida éster (BMPS), ácido 5-maleimidovalérico NHS, HBVS, ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butirico hidrazidâ HCl (MPBH), Succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimido-metilo)ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMcC), sulfosuccinimidil(4-yodo-acetil)aminobenzoato (sulfo-SIAB), m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida éster (sulfo-MBS), N-(Y-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-GMBS), N-(£-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido éster (sulfo-EMcS), N-(kmaleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida éster (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenilo)butirato (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal, PEGn-Mal, N-succinimidil-4-(4-nitropiridil-2-ditio)butanoato, N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)pentanoato (SPP), N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB) y N-succinimidil-4-(2-piridilditio)2-sulfo butanoato (sulfo-SPDB).
9. Un método para preparar un conjugado que comprende un agente de unión a células (CBA) conjugado con un compuesto citotóxico con un grupo conector, comprendiendo el método hacer reaccionar un segundo compuesto citotóxico modificado con el CBA a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado comprende:
un residuo de un agente de reticulación bifuncional unido al compuesto citotóxico, y el residuo comprende el grupo conector y un grupo reactivo seleccionado de un éster reactivo y un grupo que reacciona con tiol y se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000117_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado se produce al reaccionar un reactivo que reacciona con imina con un compuesto citotóxico que contiene imina que porta el grupo conector y el grupo reactivo
y en donde el compuesto citotóxico que contiene imina se representa por una de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000117_0002
Figure imgf000118_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,
en donde:
el resto -C(Y)-N(H)- en las fórmulas (Ia') y (IIa') se produce de la reacción del reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina;
X' se selecciona de -H, un grupo protector de amina, el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
Y' se selecciona de -H, un grupo oxo, el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un arilo de 6 a 18 miembros opcionalmente sustituido, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos;
Rc es -H o un alquilo lineal o ramificado sustituido o insustituido que tiene de 1 a 4 átomos de carbono, o el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
Ri, R2 , R3, R4 , Ri ', R2', R3' y R4 ' se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2)n-Rc, halógeno, guanidinio [-NH(C=NH)NH2], -OR, -NR'R'', -NO2, -NCO, -NR'COR'', -SR, un sulfóxido representado por -SOR', una sulfona representada por -SO2R', un sulfonato -SO3-M+, un sulfato -OSO3-M+, una sulfonamida representada por -SO2NR'R'', ciano, un azido, -COR', -OCOR', -OCONR'R'' y el grupo conector con el grupo reactivo unido al mismo;
R, para cada aparición, se selecciona independientemente del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, un arilo opcionalmente sustituido que tiene de 6 a 18 átomos de carbono, un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene uno o más heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno, y azufre, o un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que contiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
R' y R'' se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -OR, -NHR, -NR2 , -COR, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(CH2CH2O)n-Rc, y un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P;
n es un número entero de 1 a 24;
W se selecciona de C=O, C=S, CH2 , BH, SO y SO2;
R6 es -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO2, halógeno o el grupo conector con el grupo reactivo unido a él;
Z y Z' se seleccionan independientemente de -(CH2)n-, -(CH2)n'-CRzR8-(CH2)na-, -(CH2)n-NR9-(CH2)na-, -(CH2)n-O-(CH2)na- y -(CH2)n-S-(CH2)na-;
n' y na' son iguales o diferentes, y se seleccionan de 0, 1,2 y 3;
R7 y R8 son iguales o diferentes, y se seleccionan cada uno independientemente de -H, -OH, -SH, -COOH, -NHR', una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V , un aminoácido, una unidad peptídica que porta de 2 a 6 aminoácidos, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
R9 se selecciona independientemente de -H, un alquilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, una unidad de polietilenglicol -(OCH2CH2V ;
A y A' son iguales o diferentes, y se seleccionan independientemente de -O-, oxo (-C(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -N(R5)- y -CRR'N(R5)-,
R5 para cada aparición es independientemente -H o un alquilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
D y D' son iguales o diferentes, y están independientemente ausentes o se seleccionan del grupo que consiste en un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico opcionalmente sustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un aminoácido, un péptido que porta 2 a 6 aminoácidos, y una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V ; L está ausente, el grupo conector con el grupo reactivo unido a él, una unidad de polietilenglicol (-OCH2CH2V , un alquilo o alquenilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo fenilo, un anillo heterocíclico de 3 a 18 miembros o un anillo heteroarilo de 5 a 18 miembros que tiene de 1 a 6 heteroátomos seleccionados independientemente de O, S, N y P, en donde el alquilo o alquenilo está opcionalmente sustituido con el grupo conector con el grupo reactivo unido a él; fenilo o el anillo heterocíclico o heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos, en donde el sustituyente puede ser el grupo conector con el grupo reactivo unido a él; y el reactivo que reacciona con imina se selecciona del grupo que consiste en un sulfito (H2SO3 , H2SO2 o una sal de HSO3-, SO32- o HSO2- formada con un catión), un metabisulfito (H2S2O5 o una sal de S2O52- formada con un catión) y una ditionita (H2S2O4 o una sal de S2O42- formada con un catión).
10. El método de la reivindicación 3 o reivindicación 9, en donde el segundo compuesto citotóxico modificado se representa por una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000119_0001
en donde:
Y se selecciona de -SO3M, -SO2M o -OSO3 M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable tal como Na+ o K+;
X' se selecciona del grupo que consiste en -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, fenilo, y un grupo protector de amina;
Y' se selecciona del grupo que consiste en -H, un grupo oxo, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico sustituido o insustituido que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
A y A' se seleccionan de -O- y -S-;
W está ausente, o se selecciona de -O-, -N(Re)-, -N(Re)-C(=O)-, -N(C(=O)Re)-, -S- o -CH2-S-, -CH2NRe-;
Rx está ausente o se selecciona de un alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono; Re es -H, un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono o -(CH2-CH2-O)n-Rk, en donde Rk es un -H, un alquilo lineal, ramificado, cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, que porta opcionalmente un grupo amino secundario (p. ej., -NHR101) o amino terciario (-NR101R102) o un heterociclo de 5 o 6 miembros que contiene nitrógeno, tal como piperidina o morfolina, en donde R101 y R102 son cada uno independientemente un alquilo, alquenilo o alquinilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;
G se selecciona de -CH- o -N-;
Zs se selecciona de una cualquiera de las siguientes fórmulas:
Figure imgf000121_0001
en donde:
q es un número entero de 1 a 5; preferentemente q es 2;
n es un número entero de 2 a 6; preferentemente n es 4;
D es -H o -SO3M;
M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable, tal como Na+ o K+.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el conjugado es:
Figure imgf000121_0002
Figure imgf000122_0001
en donde r es un número entero de 1 a 10, Y es -SO3M, y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el agente de unión a células es un anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo monoclonal de cadena sencilla, o un fragmento de anticuerpo monoclonal que se une específicamente a una célula diana, un anticuerpo quimérico, un fragmento de anticuerpo quimérico que se une específicamente a la célula diana, un dominio de anticuerpo, un fragmento de dominio de anticuerpo que se une específicamente a la célula diana, una linfoquina, una hormona, una vitamina, un factor de crecimiento, un factor estimulante de colonias, o una molécula de transporte de nutrientes.
13. El método de la reivindicación 1, en donde el método es para preparar un conjugado de la siguiente fórmula:
Figure imgf000123_0001
y el método comprende hacer reaccionar un compuesto citotóxico modificado producido al hacer reaccionar un reactivo que reacciona con imina con un compuesto citotóxico que contiene imina de la siguiente fórmula,
Figure imgf000124_0001
con un CBA modificado de la siguiente fórmula, respectivamente, a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9,
Figure imgf000124_0002
en donde:
r es un entero de 1 a 1 0 ; y
en donde el resto -C(Y)-N(H)- en los conjugados se produce de hacer reaccionar el reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el compuesto citotóxico modificado tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000124_0003
en donde Y es -SO3M y M es -H o un catión farmacéuticamente aceptable.
15. El método de la reivindicación 2, en donde el método es para preparar un conjugado de la siguiente fórmula:
Figure imgf000125_0001
y el método comprende hacer reaccionar el CBA con un compuesto citotóxico que contiene imina, un reactivo que reacciona con imina, y un agente de reticulación bifuncional que comprende el grupo conector para formar el conjugado,
en donde:
el compuesto citotóxico que contiene imina es:
Figure imgf000126_0001
el agente de reticulación bifuncional es:
Figure imgf000126_0002
en donde el resto -C(Y)-N(H)- en los conjugados se produce de hacer reaccionar el reactivo que reacciona con imina con el compuesto citotóxico que contiene imina.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el reactivo que reacciona con imina es NaHSO3 o KHSO3.
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