ES2844301T3 - Monosialogangliósido gm1 puro para uso médico - Google Patents

Monosialogangliósido gm1 puro para uso médico Download PDF

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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un monosialogangliósido GM1 de origen porcino que tiene una pureza del 99,0 % o más y que contiene menos del 0,1 % de fucosil-GM1, producido según un procedimiento de purificación que comprende separar el monosialogangliósido GM1 de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio y en el que la dicha mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el componente gangliósido principal se ha obtenido mediante hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática de un extracto lipídico.

Description

DESCRIPCIÓN
Monosialogangliósido gm1 puro para uso médico
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el monosialogangliósido GM1.
ANTECEDENTES
Los gangliósidos son una clase de glucoesfingolípidos que tienen uno o más residuos de ácido siálico y se encuentran abundantemente en el tejido cerebral y nervioso de humanos y animales. El monosialogangliósido GM1 es conocido por varias aplicaciones farmacéuticas, particularmente en la reparación y tratamiento de trastornos de los sistemas nerviosos central y periférico.
Los gangliósidos se extraen convenientemente del tejido cerebral bovino o porcino según el documento US 4849413. Para que sea adecuado para aplicaciones farmacéuticas, el monosialogangliósido GM1 debe a continuación aislarse y purificarse.
Es conocido el tratar la mezcla extraída de lípidos mediante procedimientos químicos o enzimáticos para transformar otros componentes gangliósidos en el monosialogangliósido GM1, para aumentar el rendimiento de monosialogangliósido GM1. Dichos procedimientos incluyen la hidrólisis ácida con un ácido débil, tal como se describe en el documento CN 1353112 o hidrólisis enzimática usando una sialidasa, por ejemplo tal como se describe en el documento US 5296360.
La purificación adicional de dicha mezcla lipídica mejorada GM1 por cromatografía de exclusión usando un eluyente cloroformo: metanol: agua 60:30:4,5 se describe en el documento EP 0150712. El documento EP 0489352 describe la purificación de una mezcla lipídica mejorada GM1 mediante la ultrafiltración de una solución de la mezcla lipídica con alfa-ciclo-dextrina, seguida de la extracción de GM1 por extracción con disolvente con etanol. Se informa que GM1 puede obtenerse con una pureza del 95 %.
El documento EP 0469352 describe un procedimiento para el aislamiento y purificación de monosialogangliósido a partir de una mezcla lipídica de partida mediante la formación de complejos con alfa-ciclodextrina.
Se ha demostrado previamente que dichos procedimientos tienen inconvenientes con respecto a la pureza y rendimiento de GM1, y con respecto al coste, la eficiencia y la eficacia cuando se aplican a escala industrial.
Para aplicaciones farmacéuticas, se requiere producir el gangliósido GM1 con alta pureza. En consecuencia, sigue existiendo una necesidad de procedimientos para obtener el gangliósido GM1 con alta pureza.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente que el gangliósido GM1 puede separarse eficazmente de otros gangliósidos mediante un procedimiento basado en cromatografía de intercambio iónico.
Según la presente invención, se ha descubierto que el gangliósido GM1 se puede preparar con alta pureza mediante un procedimiento en el que GM1 se separa de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio.
Según la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un monosialogangliósido GM1 de origen porcino, que tiene una pureza del 99,0 % o más y que contiene menos del 0,1 % de fucosil-GM1, producido según un procedimiento para el aislamiento y purificación del gangliósido GM1 según la reivindicación 1.
Según una realización preferida de la presente invención, el procedimiento comprende las etapas de:
(a) separar GM1 de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio,
(b) recuperación del soluto de la solución eluida,
(c) diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado de la etapa (b),
(d) adición de una sal de sodio y diafiltración de la solución resultante, y
(e) recuperación de GM1 en forma de su sal de sodio.
Ventajosamente, la presente invención permite la preparación del monogangliósido GM1 con alta pureza. Según la presente invención, el monosialogangliósido GM1 puede prepararse con una pureza superior al 99,0 %.
Además, el procedimiento utiliza ventajosamente etapas simples, es rentable y es adecuado para su aplicación a escala industrial. Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de las reivindicaciones y de la siguiente descripción detallada y ejemplos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En una realización preferida de la invención, el procedimiento de purificación para preparar monosialogangliósido GM1 con alta pureza comprende las etapas de;
(a) separación de GM1 de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio.
(b) recuperación del soluto de la solución eluida de la etapa (c),
(c) diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado de la etapa (d), para eliminar las sales residuales de potasio o de cesio,
(d) adición de iones de sodio, preferentemente en forma de una sal de sodio adecuada, para desplazar los iones de potasio o cesio unidos a g M1, y diafiltración de la solución acuosa, para eliminar la sal de sodio residual, y (e) recuperación de GM1 en forma de su sal de sodio.
La mezcla lipídica se puede preparar a partir de un extracto lipídico bruto de tejido cerebral porcino.
Ventajosamente, la mezcla lipídica que contiene el monogangliósido GM1 como el componente gangliósido predominante puede prepararse a partir de un extracto lipídico que contenga al menos el 30 %, preferentemente al menos el 50 % y más preferentemente al menos el 70 % de una mezcla de gangliósidos. El resto del extracto lipídico puede estar compuesto generalmente por sulfátidos, cerebrósidos, ácidos grasos y proteínas.
Ventajosamente, el extracto lipídico puede someterse en primer lugar a una diafiltración a través de una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000 a 100000 Daltons, preferentemente aproximadamente 50000 Daltons, para desalar la solución. Para la diafiltración se puede usar cualquier membrana de diálisis convencional. Ventajosamente, se pueden usar casetes de filtro, por ejemplo, del tipo de casetes de polisulfona SARTOCON® (Sartorius), por ejemplo con un límite de aproximadamente 50000 Daltons.
Preferentemente, el extracto lipídico se somete a un tratamiento por hidrólisis para transformar otros componentes gangliósidos importantes, tales como GT1b, GD1a y GD1b, en GM1 para aumentar el contenido de GM1.
La hidrólisis se puede llevar a cabo usando procedimientos convencionales. Ventajosamente, la hidrólisis se puede llevar a cabo usando cualquiera de los dos procedimientos generales para la hidrólisis de gangliósidos conocidos en la bibliografía, a saber, hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática.
La hidrólisis ácida se puede llevar a cabo, por ejemplo, usando ácido mineral diluido, tal como ácido clorhídrico diluido, ácido sulfúrico y ácido nítrico. La hidrólisis ácida se puede efectuar ajustando el pH de una solución acuosa del extracto lipídico a un pH entre 3,5 y 5, preferentemente alrededor de pH 4,0, y calentando la solución a una temperatura preferentemente entre 90 °C y 100 °C durante el tiempo necesario para completar la conversión de los otros componentes gangliósidos importantes a GM1. El tiempo necesario para hidrolizar los gangliósidos importantes a GM1 depende del pH y la temperatura elegidos. En general, cuanto mayor sea el pH, mayor será el tiempo necesario para completar la hidrólisis, y cuanto mayor sea la temperatura de reacción, menor será el tiempo necesario para completar la hidrólisis. La reacción de hidrólisis se puede llevar a cabo generalmente durante 2 a 5 horas. Por ejemplo, cuando la hidrólisis se lleva a cabo a pH 4,0 y 95 °C el tiempo necesario para completar la reacción de hidrólisis es de aproximadamente 3 horas.
La hidrólisis enzimática se puede llevar a cabo usando cualquier sialidasa adecuada. Preferentemente, se puede usar la cepa S de Arthrobacter ureafaciens sialidasa o Vibrio cholerae sialidasa. Ventajosamente, la cepa S de Arthrobacter ureafaciens sialidasa y Vibrio cholerae sialidasa son activas sobre GT1a, GD1a, GD1b pero no sobre GM1. La hidrólisis enzimática se puede llevar a cabo, por ejemplo, ajustando el pH de una solución acuosa del extracto lipídico a un pH al que la enzima utilizada tenga su actividad óptima, por ejemplo entre pH 4 y pH 6, por ejemplo aproximadamente pH 5, añadiendo un tampón adecuado, tal como tampón de acetato, añadiendo iones Ca2+ en el caso de que la sialidasa sea una Vibrio cholerae sialidasa, y calentando la solución a una temperatura a la que la enzima utilizada tenga su actividad óptima, por ejemplo alrededor de 37 °C, durante el tiempo necesario para completar la transformación. La hidrólisis se puede llevar a cabo generalmente durante 12-24 horas, dependiendo de las unidades de enzima añadidas. La hidrólisis ácida es menos preferida ya que es un procedimiento de hidrólisis no específico y generalmente proporciona un rendimiento menor en GM1 debido a la conversión a otros gangliósidos. Además, el procedimiento de hidrólisis ácida conduce a la formación de impureza asialo-GM1.
Se prefieren los procedimientos de hidrólisis enzimática ya que generalmente proporcionan un mayor rendimiento en GM1 debido a la alta especificidad de la transformación química. Para la hidrólisis enzimática, se prefiere la Arthrobacter ureafaciens sialidasa ya que no requiere la adición de iones Ca2+ para su actividad. Además, debido a su peso molecular de 52000 Daltons (en comparación con 82000 Daltons para la Vibrio cholerae sialidasa), se puede lavar ventajosamente mediante diafiltración.
Para recuperar la mezcla lipídica así producida que tiene un contenido mejorado del monosialogangliósido GM1 de la solución de reacción, la solución de reacción puede diafiltrarse ventajosamente, por ejemplo, a través de una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000 a 100000 Dalton, preferentemente aproximadamente 50000 Dalton. Para la diafiltración se puede usar cualquier membrana de diálisis convencional. Ventajosamente, se pueden utilizar casetes de filtro, tales como del tipo de casetes de polisulfona SARTOCON® (Sartorius), preferentemente con un límite de 50000 Daltons. A continuación, se puede secar el permeado para obtener un polvo de la mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el componente principal de gangliósido. El secado se puede llevar a cabo mediante procedimientos convencionales. Ventajosamente, el secado puede llevarse a cabo mediante secado por pulverización o secado al vacío.
En general, la mezcla lipídica puede tener una concentración de GM1 de 10 a 200 g/l y preferentemente de al menos 100 g/l.
Según la presente invención, el gangliósido GM1 se separa de otros gangliósidos en la mezcla lipídica usando cromatografía de intercambio iónico.
Sorprendentemente, se ha descubierto que cuando se usa un eluyente que contiene iones de cesio o de potasio, es posible separar con éxito GM1 de otros monosialogangliósidos.
En general, se ha descubierto que las técnicas de intercambio iónico usadas convencionalmente no permiten la separación eficaz de GM1 de otros monosialogangliósidos. De particular interés es el monosialogangliósido fucosil-GM1 que está presente como una impureza de gangliósido importante en la mezcla lipídica porcina producida por los tratamientos de hidrólisis conocidos.
Las dos moléculas GM1 y fucosil-GM1 tienen propiedades físicas muy similares. Ambos tienen una sola carga negativa, proporcionada por el grupo carboxilo del ácido siálico, y tienen pesos moleculares similares; 1558 y 1704 respectivamente. En consecuencia, cuando se cargan en la columna de intercambiador de iones preequilibrada, la fuerza de unión de los dos gangliósidos con la resina es la misma.
Se ha observado que cuando se añade acetato de sodio al eluyente para aumentar la fuerza iónica del eluyente y proporcionar las condiciones para el desplazamiento de los gangliósidos, tanto el GM1 como el fucosil-GM1 se eluyen al mismo tiempo con la misma fuerza iónica. No se puede lograr la separación de los dos monosialogangliósidos.
Si bien los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que cuando se utilizan iones de cesio o potasio, por ejemplo mediante la adición de potasio metanólico o acetato de cesio, el GM1 y el fucosil-GM1 se eluyen por separado, eluyéndose primero el fucosil-GM1. La separación es completa y se pueden aislar cada uno de los gangliósidos GM1 y fucosil-GM1.
Si bien sin desear quedar ligado por teoría alguna, los inventores de la presente invención consideran que la separación observada puede atribuirse al hecho de que, contrariamente a la teoría convencional del intercambio iónico, los solutos GM1 y fucosil-GM1 no sólo se liberan de la columna en orden de su fuerza en la unión con la resina, sino también en orden de su afinidad por el contraión al que deben unirse para desprenderse del gel. En consecuencia, siguiendo esta teoría, si uno de los dos solutos tiene una afinidad diferente por el contraión, a continuación los solutos se liberarán con dos fuerzas iónicas diferentes y se puede producir la purificación.
Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que los monosialogangliósidos GM1 y Fuc-GM1 tienen la misma afinidad por el sodio pero no tienen la misma afinidad por el potasio o el cesio, a pesar de que los tres metales pertenecen al mismo grupo. Los presentes inventores han descubierto que Fuc-GM1 tiene una mayor afinidad por el potasio y el cesio que g M1, y se eluye primero.
El procedimiento de cromatografía de intercambio iónico de la presente descripción permite ventajosamente la separación eficaz de GM1 de fucosil-GM1. Además, el procedimiento de la presente descripción también permite ventajosamente la separación de GM1 de los ácidos grasos correspondientes. Los ácidos grasos tienen la misma carga que el gangliósido, pero una mayor afinidad por los iones de cesio o de potasio.
Para la cromatografía de intercambio iónico se puede usar cualquier resina adecuada. Ventajosamente, se puede usar una resina que tenga un grupo amino cuaternario, por ejemplo, FRACTOGEL® EMD TMAE (S) o resinas de Sepharose, por ejemplo, resinas Q-Sepharose HP.
En una primera etapa, la resina se equilibra con un disolvente adecuado. Los disolventes adecuados incluyen etanol, metanol o una mezcla de metanol y cloroformo. Preferentemente, el disolvente es metanol, porque es un disolvente en el que son solubles los gangliósidos y las sales de potasio y cesio.
A continuación, la columna se puede cargar con una solución de la mezcla lipídica en un disolvente de elución adecuado. El disolvente de elución debe contener los mismos componentes disolventes que el disolvente usado para equilibrar la resina. Preferentemente, el disolvente elegido es metanol. La elución preliminar con el disolvente de elución permite la elución de sustancias no unidas, por ejemplo, cerebrósidos.
A continuación, se añaden iones de potasio o cesio al disolvente de elución. Los iones de potasio o cesio se proporcionan preferentemente en forma de una solución metanólica de acetato de potasio o cesio, formiato, propionato o como una sal de otro ácido orgánico. Se prefiere una solución metanólica de acetato de sodio o potasio. Ventajosamente, el acetato de potasio o cesio puede estar presente en el eluyente en una cantidad suficiente para alterar una conductividad de 1100-1400 pS/cm, preferentemente una conductividad de 1200-1300 pS/cm en el eluyente. Esta solución de eluyente que contiene sal de sodio o potasio se puede pasar a través de la columna isocráticamente a cualquier caudal adecuado, por ejemplo, a un caudal de entre 100 ml/h a 140 ml/h. Cuando la separación se lleva a cabo usando el procedimiento de cromatografía de intercambio iónico según la presente invención, los ácidos grasos y Fuc-GM1 se eluyen antes que el GM1, mientras que los sulfátidos que permanecen unidos a la columna pueden eluirse durante el lavado de la columna.
El eluido que contiene GM1 se recoge y, ventajosamente, el disolvente de elución eluido de la columna se puede recuperar por destilación.
El soluto que contiene GM1 puede recuperarse secando la solución de eluido para producir un polvo que contiene el GM1. El secado se puede llevar a cabo usando procedimientos convencionales, por ejemplo, secado por pulverización o secado al vacío.
A continuación, el soluto que contiene GM1 puede purificarse mediante la diafiltración de una solución acuosa del mismo a través de una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000 a 100000 Dalton, preferentemente aproximadamente 50000 Dalton, para eliminar las sales residuales de potasio o cesio. Opcionalmente, se puede añadir a la solución un ácido mineral, tal como ácido sulfúrico acuoso, ácido nítrico o preferentemente ácido clorhídrico para ajustar a un pH entre 6 y 8, preferentemente aproximadamente pH 7 antes de la diafiltración.
A continuación, se pueden añadir a la solución iones de sodio, convenientemente en forma de una solución acuosa de una sal de sodio, preferentemente NaCl, para desplazar los iones de potasio o cesio unidos a GM1, y obtener GM1 en forma de sal de sodio fisiológico. A continuación, la solución puede someterse a una segunda diafiltración para eliminar la sal residual (por ejemplo, NaCl), usando una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000 a 100000 Dalton, preferentemente aproximadamente 50000 Dalton. Ventajosamente, se pueden utilizar casetes de filtro, tales como casetes del tipo de polisulfona SARTOCON® (Sartorius), preferentemente con un límite de 50000 Daltons.
A continuación, la solución se puede secar para recuperar el GM1 en forma de polvo. El secado se puede llevar a cabo mediante procedimientos convencionales. Ventajosamente, el secado puede llevarse a cabo mediante secado por pulverización o secado al vacío.
El GM1 obtenido según la presente invención tiene un grado de pureza de aproximadamente 99,0 al 99,9 %. El GM1 obtenido según la presente invención contiene menos del 0,1 % de impureza fucosil-GM1,
La presente invención permite ventajosamente una separación eficiente de GM1 de otros monosialogangliósidos. Particularmente, la presente invención permite la separación de GM1 de la impureza fucosil-GM1.
Ventajosamente, la presente invención permite la preparación del monosialogangliósido GM1 con un buen rendimiento y un alto nivel de pureza.
El GM1 purificado según la presente invención puede usarse en el tratamiento de sujetos humanos o animales. En particular, el GM1 purificado según la presente invención está previsto para el tratamiento de seres humanos o mamíferos, en particular para la reparación y tratamiento de trastornos y enfermedades de los sistemas nerviosos central y periférico, que incluyen accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer, disquenisia tardía, esclerosis lateral amiotrófica, neuropatías periféricas y neuropatía autonómica. Según una realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención, en la que el eluyente comprende acetato de potasio o cesio.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica, en la que el eluyente es una solución metanólica de acetato de potasio o cesio.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención, en la que la diafiltración se lleva a cabo usando una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000-100000 Daltons.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención, en la que la recuperación de GM1 en la etapa (e) comprende el secado de la solución de permeado mediante secado por pulverización o secado al vacío para producir un polvo.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención, en la que la mezcla lipídica se obtiene por hidrólisis de un extracto lipídico de tejido cerebral porcino que contiene una mezcla de gangliósido que tiene una pureza de al menos un 50 %.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención, en la que la mezcla lipídica se obtiene por hidrólisis de un extracto lipídico de tejido cerebral porcino que contiene una mezcla de gangliósido que tiene una pureza de al menos un 50 % y en la que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo tratando el extracto lipídico de tejido cerebral porcino con una cepa S de Arthrobacter ureafaciens sialidasa o Vibrio cholerae sialidasa.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención para su uso como medicamento.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención para su uso en la reparación y tratamiento de trastornos y enfermedades de los sistemas nerviosos central y periférico.
Según otra realización particular, se proporciona una composición farmacéutica según la invención para su uso en la reparación y tratamiento de trastornos y enfermedades de los sistemas nerviosos central y periférico, en la que las enfermedades o trastornos se seleccionan entre accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer, disquenisia tardía, esclerosis lateral amiotrófica, neuropatías periféricas y neuropatía autonómica.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Preparación de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como principal gangliósido
El extracto lipídico que contiene una mezcla de gangliósidos que tiene una pureza del 70 % se disuelve en agua purificada a una concentración de aproximadamente 25 g/l. A continuación, esta solución se diafiltra a través de casetes de filtro de polisulfona SARTOCON® (Sartorius) con un límite de 50000 Daltons.
A continuación se equilibran 200 l de la solución a pH 5,5 mediante la adición de tampón acetato 50 mM y cloruro de calcio 4 mM. Se añaden 30000 U de Vibrio cholerae sialidasa y la solución se calienta a 37 °C durante 12 h para completar la transformación de otros gangliósidos importantes (GT1b, GD1a, GD1b) en GM1. La solución resultante tiene una concentración de GM1 de 14-15 g/l.
Después de la hidrólisis enzimática, la solución se diafiltra a través de casetes de filtro con un límite de 50000 Dalton. A continuación se añade NaCl 1 M al retenido y la solución se somete a una segunda diafiltración. Después de la segunda diafiltración, el retenido se concentra a una concentración de GM1 de 100 g/l dejando fluir el permeado sin reposición de agua. A continuación, la solución se seca al vacío para obtener aproximadamente 3200 g de un polvo que tiene una concentración de GM1 del 85 % medida por HPLC.
Purificación de GM1 de la mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como principal gangliósido
Se prepara una solución metanólica a una concentración de 10 g/l usando el polvo obtenido en la etapa anterior, y la solución se filtra a través de un filtro de cartucho Sartopore de 0,22pm (fabricado por Sartorius AG).
Para cada ciclo, se cargan a continuación 7 litros de la solución filtrada en una columna FPLC que contiene 20 l de resina Fractogel® EMD TMAE (S) equilibrada en metanol. A continuación, la columna se eluye con metanol: solución metanólica de acetato de potasio que tiene una conductividad de 1200-1300 pS/cm, a un caudal de 120 l/h. Los ciclos se repitieron hasta el final de la solución GM1.
El eluido (aproximadamente 60-70 l) se concentra continuamente por destilación y a continuación se seca para obtener un polvo y se recupera el metanol. El polvo así obtenido es una mezcla de GM1 puro y acetato de potasio.
El polvo así obtenido se disuelve en agua purificada hasta una concentración de 25 g/l y se equilibra a pH 7 mediante la adición de HCl al 18 %. La solución se diafiltra a través de casetes de filtro con un límite de 50000 Dalton. A continuación, se añade NaCl 1 M y la solución se diafiltra de nuevo a través de casetes de filtro con un límite de 50000 Dalton. Después de esta segunda diafiltración, el retenido se concentra hasta 100-120 g/l dejando fluir el permeado sin reposición de agua.
La solución concentrada se filtra a continuación a través de un filtro de 0,22 pm y se seca mediante secado por pulverización para proporcionar aproximadamente 2700 g de un polvo de g M1 de color blanco a blanco-beige, identificado por TLC, teniendo este polvo de GM1 una pureza del 99,8 % medida por HPLC. El polvo de GM1 resultante tiene un contenido de Fuc-GM1 inferior al 0,1 %, medido por HPLC.
Ejemplo comparativo
El procedimiento de preparación y purificación de GM1 se llevó a cabo como en el ejemplo 1 anterior, excepto que en la cromatografía en columna, el metanol: solución metanólica de acetato de potasio se reemplazó por un metanol: solución metanólica de acetato de sodio.
Se obtuvieron 3100 g de un polvo de GM1 que contenía un 91 % de GM1 y un 8 % de Fuc-GM1, medidos por HPLC. De los ejemplos anteriores puede observarse que se obtiene una pureza mucho menor de GM1 cuando se usa acetato de sodio para la elución de GM1. Esto puede atribuirse al hecho de que el contraión de sodio no marca ninguna diferencia entre GM1 y Fuc-GM1 en el procedimiento de elución, en comparación con los contraiones de potasio o cesio, que por el contrario separan completamente ambos picos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende un monosialogangliósido GM1 de origen porcino que tiene una pureza del 99,0 % o más y que contiene menos del 0,1 % de fucosil-GM1, producido según un procedimiento de purificación que comprende separar el monosialogangliósido GM1 de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido g M1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio y en el que la dicha mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el componente gangliósido principal se ha obtenido mediante hidrólisis ácida o hidrólisis enzimática de un extracto lipídico.
2. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el procedimiento de purificación comprende las etapas de:
(a) separación de GM1 de una mezcla lipídica que contiene el monosialogangliósido GM1 como el principal componente gangliósido mediante cromatografía en columna de intercambio iónico usando un eluyente que comprende iones de potasio o de cesio,
(b) recuperación del soluto de la solución eluida,
(c) diafiltración de una solución acuosa del soluto recuperado de la etapa (b),
(d) adición de una sal de sodio y diafiltración de la solución acuosa resultante,
(e) recuperación de GM1 en forma de su sal de sodio.
3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que el eluyente comprende acetato de potasio o de cesio.
4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3, en la que el eluyente es una solución metanólica de acetato de potasio o de cesio.
5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la diafiltración se lleva a cabo usando una membrana que tiene un tamaño de poro de 10000-100000 Daltons.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2, en la que la recuperación de GM1 en la etapa (e) comprende el secado de la solución de permeado mediante secado por pulverización o secado al vacío para producir un polvo.
7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que la mezcla lipídica se obtiene por hidrólisis de un extracto lipídico de tejido cerebral porcino que contiene una mezcla de gangliósido que tiene una pureza de al menos el 50 %.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que la hidrólisis enzimática se lleva a cabo tratando el extracto lipídico de tejido cerebral porcino con una cepa S de Arthrobacter ureafaciens sialidasa o Vibrio cholerae sialidasa
9. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso como medicamento.
10. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la reparación y tratamiento de trastornos y enfermedades de los sistemas nerviosos central y periférico.
11. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 10, en la que las enfermedades o trastornos se seleccionan entre accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer, disquenisia tardía, esclerosis lateral amiotrófica, neuropatías periféricas y neuropatía autonómica.
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