ES2895480T3

ES2895480T3 - Anticuerpos reactivos con B7-H3, fragmentos inmunológicamente activos de los mismos y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2895480T3
Application number: ES15184260T
Authority: ES
Inventors: Deryk Loo; Ling Huang; Francine Zhifen Chen; Paul A Moore; Leslie S Johnson
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2010-03-04
Filing date: 2011-03-01
Publication date: 2022-02-21
Anticipated expiration: 2031-03-01
Also published as: RS59269B1; EP2542256A4; BR122016002916B1; NZ705128A; US9150656B2; MX345232B; MA34062B1; HRP20191483T1; ECSP12012139A; ZA201206556B; JP5998060B2; EA201270734A1; US20130149236A1; CO6630123A2; HUE045487T2; MY156358A; CN106279416B; PH12018501083A1; US20150259434A1; JP2017035086A

Abstract

Un reactivo de redireccionamiento de doble afinidad, comprendiendo dicho reactivo: (A) una cadena polipeptídica I que comprende un dominio de unión al epítopo VL de inmunoglobulina específico para unirse a B7-H3 y un dominio de unión al epítopo VH específico para unirse a una molécula distinta de B7-H3; y (B) una cadena polipeptídica II que comprende un dominio de unión al epítopo VH de inmunoglobulina específico para unirse a B7-H3 y un dominio de unión al epítopo VL específico para unirse a dicha molécula distinta de B7- H3; en donde las cadenas polipeptídicas I y II se asocian juntas para formar dominios de unión a epítopos funcionales capaces de unirse a B7-H3 y dicha molécula distinta de B7-H3, y en donde: (1) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 25, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33, respectivamente; o (2) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 9, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 17, respectivamente; o (3) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 41, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 49, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos reactivos con B7-H3, fragmentos inmunológicamente activos de los mismos y usos de los mismos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas:

La presente solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes de patente de los Estados Unidos con números de serie 61/310.692 (presentada el 4 de marzo de 2010; pendiente); 61/310.695 (presentada el 4 de marzo de 2010; pendiente) 61/311.057 (presentada el 5 de marzo de 2010; pendiente).

Referencia al listado de secuencias:

La presente solicitud incluye uno o más listados de secuencias de conformidad con 37 C.F.R. 1.821 et seq., que se desvelan tanto en papel como en medios legibles por ordenador.

Antecedentes de la invención:

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a anticuerpos y sus fragmentos que son inmunorreactivos para el mamífero y, más particularmente, el receptor B7-H3 humano y sus usos, particularmente en el tratamiento del cáncer y la inflamación. Por tanto, la invención concierne particularmente a anticuerpos reactivos con B7-H3 humanizados y sus fragmentos inmunorreactivos que son capaces de mediar, y más preferentemente potenciar la activación del sistema inmunitario contra las células cancerosas que están asociadas con una variedad de cánceres humanos.

Descripción de la técnica relacionada:

El crecimiento y la metástasis de los tumores depende en gran medida de su capacidad para evadir la vigilancia inmunitaria del hospedador y superar las defensas del hospedador. La mayoría de los tumores expresan antígenos que pueden ser reconocidos en un grado variable por el sistema inmunitario del hospedador, pero en muchos casos, se provoca una respuesta inmunitaria inadecuada debido a la activación ineficaz de los linfocitos T efectores (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors", Exper. Pharmacol. 181:291-328).

Los linfocitos T CD4+ son los organizadores esenciales de la mayoría de las respuestas inmunitarias y autoinmunitarias de los mamíferos (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48). Se ha descubierto que la activación de los linfocitos T colaboradores CD4+ está mediada por interacciones coestimuladoras entre las células presentadoras de antígeno y los linfocitos T CD4+ sin exposición previa. Se requieren dos interacciones (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating CoStimulation", Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90:297-339). En la primera interacción, una célula presentadora de antígeno debe presentar el antígeno diana relevante unido al complejo mayor de histocompatibilidad de la célula para que pueda unirse al receptor de células T ("TCR") de un linfocito T c D4+ sin exposición previa. En la segunda interacción, un ligando de la célula presentadora de antígeno debe unirse a un receptor CD28 del linfocito T CD4+ (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation", Immunol. Rev. 229:307-321). Los linfocitos T colaboradores CD4+ que experimentan ambas señales estimulantes son capaces de responder a las citocinas (como la interleucina-2 y la interleucina-12 para convertirse en linfocitos Th1). Estas células producen interferón-gamma (IFN-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), que median las respuestas inflamatorias para las células diana que expresan el antígeno diana. También se produce la activación y proliferación de linfocitos B, lo que da como resultado la producción de anticuerpos específicos para el antígeno diana (Bernard, A. et al. (2005) "T and B Cell Cooperation: A Dance of Life and Death", Transplantation 79:S8-S11). En ausencia de ambas señales coestimuladoras durante la interacción del TCR, los linfocitos T entran en un estado funcionalmente carente de respuesta, conocido como anergia clonal (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors", Exper. Pharmacol. 181:291-328). En estados patológicos, los linfocitos Th1 son los actores clave de diversas enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos, tales como la diabetes de tipo I, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules", Immunolog. Res.

28(1):39-48).

I. La superfamilia B7 y B7-H3

Las investigaciones sobre los ligandos del receptor CD28 han llevado a la caracterización de un conjunto de moléculas relacionadas conocidas como la superfamilia B7 (Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function", Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited", Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223,1-223,7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells". Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy", Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity", J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance", Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T Cell Costimulation", Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses", Microbes Infect.

6:759-766). Actualmente hay siete miembros conocidos de la familia: B7.1 (CD80), B7.2 (CD86), el ligando coestimulador inducible (ICOS-L), el ligando de muerte programada 1 (PD-L1), el ligando de muerte programada 2 (PD-L2), B7-H3 y B7-H4 (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol.

6:223,1-223,7).

Los miembros de la familia B7 son miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas con un dominio similar a la inmunoglobulina V y un dominio similar a la inmunoglobulina C (por ejemplo, IgV-IgC) (Sharpe, A.H. et al. (2002) "La superfamilia B7-CD28", Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Los dominios IgV e IgC de los miembros de la familia B7 están codificados por exones individuales, con exones adicionales que codifican secuencias líder, dominios transmembrana y citoplasmático. Los dominios citoplasmáticos son cortos, que varían en longitud de 19 a 62 restos de aminoácidos y pueden estar codificados por múltiples exones (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223,1-223,7). B7-H3 es único en el sentido de que la forma humana principal contiene dos dominios IgV-IgC en tándem extracelulares (es decir, IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223,1-223,7). Se prevé que los miembros de la familia B7 formen de manera consecutiva, homodímeros no covalentes en la superficie celular, y tales dímeros se han descubierto con respecto a B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86). B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) que presentan una doble especificidad para el receptor CD28 estimulante y el receptor CTLA-4 (CD152) inhibidor (Sharpe, AH et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126).

Aunque inicialmente se pensó que solo comprendía 2 dominios Ig (IgV-IgC) (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production", Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes", J. Immunol. 168:6294-6297) se ha identificado una variante de cuatro dominios extracelulares de inmunoglobulina ("4Ig-B7-H3") y se ha descubierto que es la forma humana más común de la proteína (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126). No se ha observado ninguna diferencia funcional entre estas dos formas, dado que la forma murina natural (2Ig) y la forma 4Ig humana presentan una función similar (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30):10277-10278). La molécula 4Ig-B7-H3 inhibe la lisis de células cancerosas mediada por linfocitos citolíticos naturales (Castriconi, R. et al. "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 101(34): 12640-12645). Se ha descubierto que la B7-H3 humana (forma 2Ig) promueve la activación de los linfocitos T y la producción de IFN-y al unirse a un posible receptor en los linfocitos T activados (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production", Nature Immunol. 2:269-274; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors", Cancer Res. 69(15):5275-6281). Tanto B7-H4 como B7-H1 son potentes inhibidores de la función inmunitaria cuando se expresan en células tumorales (Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity", J. Immunother. 30(3):251-260).

El modo de acción de B7-H3 es complejo, ya que la proteína media tanto la coestimulación como la co-inhibición de los linfocitos T (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30):10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity", Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition", J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3 se une a la transcrito 2 similar a (TREM) (TLT-2) y coestimula la activación de los linfocitos T, pero también se une a receptores aún no identificados para mediar en la inhibición conjunta de los linfocitos T. Además, B7-H3, a través de interacciones con receptores desconocidos es un inhibidor de los linfocitos citolíticos naturales y las células osteoblásticas (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30):10277-10278). La inhibición puede operar a través de interacciones con miembros de las principales vías de señalización a través de las cuales el receptor de linfocitos T (TCR) regula la transcripción de genes (por ejemplo, NFTA, NF-kB, o factores AP-1).

B7-H3 coestimula la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+. B7-H3 también estimula la producción de IFN-y y la actividad lítica de CD8+ (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production", Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol.

2:116-126). Sin embargo, la proteína también actúa posiblemente a través de factores n Fa T (factor nuclear para linfocitos T activados), NF-kB (factor nuclear kappa B) y AP-1 (proteína activadora-1) para inhibir la activación de los linfocitos T (Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4", Immunol. Rev.

229:145-151). También se cree que B7-H3 inhibe Th1, Th2 o Th17 in vivo (Prasad, DV et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells", J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice", Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4", Immunol. Rev. 229:145-151). Varios estudios independientes han demostrado que las células tumorales malignas humanas presentan un marcado aumento en la expresión de la proteína B7-H3 y que este aumento de expresión se asoció con una mayor gravedad de la enfermedad (Zang, X. et al. (2007) "The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition", Clin. Cancer Res.

13:5271-5279), lo que sugiere que los tumores aprovechan la B7-H3 como una vía de evasión inmunitaria (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30): 10277-10278).

Las moléculas que bloquean la capacidad de una molécula de B7 para unirse a un receptor de linfocitos T (por ejemplo, CD28) inhiben el sistema inmunitario y se han propuesto como tratamientos para enfermedades autoinmunes (Linsley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation", Immunolog. Rev. 229:307-321). Las células de neuroblastoma que expresan 4Ig-B7-H3 tratadas con anticuerpos anti-4Ig-B7-H3 fueron más susceptibles a los linfocitos citolíticos naturales. Sin embargo, no está claro si esta actividad se puede atribuir solo a anticuerpos contra la forma 4Ig-B7-H3 porque todos los anticuerpos reportados producidos contra 4Ig-B7-H3 también se unieron a las dos formas similares a Ig de B7H3 (Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains", J. Immunol. 172(4): 2352-2359 y Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 101(34):12640-12645).

B7-H3 no se expresa en linfocitos B o T, monocitos o células dendríticas en reposo, sino que es inducida en células dendríticas por IFN-y y en monocitos por GM-CSF (Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily", Nature Rev. Immunol. 2:116-126). El receptor o receptores que se unen a B7-H3 no se han caracterizado completamente. Los primeros trabajos sugirieron que uno de esos receptores necesitaría ser regulado positivamente rápida y transitoriamente en los linfocitos T después de la activación (Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells". Arthritis Res. Ther. 6:208-214). Recientemente, el receptor de transcrito 2 (TLT-2 o t Re ML2) similar a (TREM) (King, R.G. et al. (2006) "Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And B Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation", J. Immunol. 176:6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) "The TREM Receptor Family And Signal Integration", Nat. Immunol. 7:1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4", Immunol. Rev. 229:145-151), que se expresa en células mieloides ha demostrado ser capaz de unirse a B7-H3 y, por lo tanto, coestimular la activación de los linfocitos T CD8+ en particular (Zang, X. et al. (2003) "B7x: A Widely Expressed B7 Family Member That Inhibits T Cell Activation", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 100:10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) "Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 (TLT-2) Is A Counter-Receptor For B7-H3 And Enhances T Cell Responses", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.u U.) 105(30):10495-10500; Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role OfB7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30):10277-10278).

Además de su expresión en células de neuroblastoma, también se sabe que el antígeno B7-H3 humano se expresa en una diversidad de células cancerosas distintas (por ejemplo, cánceres gástrico, de ovario y de pulmón no microcítico). Se ha detectado inmunohistológicamente la expresión de la proteína B7-H3 en líneas de células tumorales (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production", Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation", Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes", J. Immunol. 168:6294-6297). Se ha encontrado expresión de ARNm en corazón, riñón, testículos, pulmón, hígado, páncreas, próstata, colon y células osteoblásticas (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands", Genome Biol. 6:223,1-223,7). A nivel de proteína, B7-H3 se encuentra en el hígado humano, pulmón, vejiga, testículos, próstata, mama, placenta y órganos linfoides (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 105(30): 10277-10278).

II. Anticuerpos terapéuticos

Además de sus usos conocidos en el diagnóstico, se ha demostrado que los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos. Por ejemplo, la inmunoterapia o el uso de anticuerpos con fines terapéuticos se ha utilizado en los últimos años para tratar el cáncer. La inmunoterapia pasiva implica el uso de anticuerpos monoclonales en tratamientos contra el cáncer (véase, por ejemplo, DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, OCTAVA EDICIÓN (2008), DeVita, V. et al. Eds., Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA, págs.

537-547, 2979-2990). Estos anticuerpos pueden tener una actividad biológica terapéutica inherente tanto por inhibición directa del crecimiento o supervivencia de las células tumorales como por su capacidad para reclutar la actividad natural de destrucción de células del sistema inmunitario del cuerpo. Estos agentes pueden administrarse solos o junto con radiación o agentes quimioterapéuticos. Rituximab y Trastuzumab, aprobados para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin y el cáncer de mama, respectivamente, son ejemplos de tales terapias. Como alternativa, los anticuerpos pueden usarse para fabricar conjugados de anticuerpos en los que el anticuerpo se une a un agente tóxico y dirige ese agente al tumor uniéndose específicamente al tumor. Gemtuzumab ozogamicina es un ejemplo de un conjugado de anticuerpos aprobado que se usa para el tratamiento de la leucemia.

Se han desvelado anticuerpos monoclonales que se unen a las células cancerosas y tienen usos potenciales para el diagnóstico y la terapia (véanse, por ejemplo, las siguientes solicitudes de patente que desvelan, entre otros, algunos pesos moleculares de las proteínas diana: la Patente de Estados Unidos N.° 6.054.561 (c-erbB-2 (Her2) de 200 kD y otros antígenos desconocidos de 40-200 KD de tamaño) y la Patente de Estados Unidos N.° 5.656.444 (proteína oncofetal de 50 kD y 55 kD)). Los ejemplos de anticuerpos en ensayos clínicos y/o aprobados para el tratamiento de tumores sólidos incluyen: Trastuzumab (antígeno: 180 kD, HER2/neu), Edrecolomab (antígeno: 40-50 kD, Ep-CAM), anti-glóbulos de grasa de la leche humana (HMFGl) (antígeno> 200 kD, Mucina APM), Cetuximab (antígenos: 150 kD y 170 kD, receptor EGF), Alemtuzumab (antígeno: 21-28 kD, CD52) y rituximab (antígeno: 35 kD, Cd 20).

Las dianas de antígeno de trastuzumab (receptor Her-2), que se usa para tratar el cáncer de mama, y cetuximab (receptor de EGF), que se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de varios cánceres, están presentes a algún nivel detectable en una gran cantidad de tejidos adultos humanos normales, incluida la piel, colon, pulmón, ovario, hígado y páncreas. El margen de seguridad en el uso de estos agentes terapéuticos lo proporciona posiblemente la diferencia en los niveles de expresión del antígeno o en el acceso o la actividad del anticuerpo en estos sitios.

Otro tipo de inmunoterapia es la inmunoterapia activa o vacunación, con un antígeno presente en un cáncer específico o una construcción de ADN que dirige la expresión del antígeno, que luego evoca la respuesta inmunitaria en el individuo, es decir, para inducir al individuo a producir activamente anticuerpos contra su propio cáncer. La inmunización activa no se ha utilizado con tanta frecuencia como la inmunoterapia pasiva o las inmunotoxinas.

Se han sugerido varios modelos de progresión de la enfermedad (incluido el cáncer). Las teorías van desde la causalidad por un solo evento infeccioso/transformador hasta la evolución de un tipo de tejido cada vez más "similar a una enfermedad" o "similar al cáncer" que, en última instancia, conduce a uno con capacidad totalmente patógena o maligna. Algunos argumentan que con el cáncer, por ejemplo, un solo evento mutacional es suficiente para causar malignidad, mientras que otros argumentan que las modificaciones posteriores también son necesarias. Algunos otros han sugerido que el aumento de la carga mutacional y el grado del tumor son necesarios tanto para el inicio como para la progresión de la neoplasia a través de un continuo de eventos de selección de mutaciones a nivel celular. Algunas dianas del cáncer se encuentran solo en tejidos tumorales, mientras que otros están presentes en tejidos normales y están regulados positivamente y/o sobreexpresados en tejidos tumorales. En dichas situaciones, algunos investigadores han sugerido que la sobreexpresión está relacionada con la adquisición de malignidad, mientras que otros sugieren que la sobreexpresión es simplemente un marcador de una tendencia en el camino hacia un estado de enfermedad creciente.

En algunos casos, las dianas de cáncer, como oncoproteínas expresadas o sobreexpresadas en tumores, se ha demostrado que están presentes durante el desarrollo embrionario y fetal y sirven como regulador del crecimiento y la diferenciación. Algunos investigadores han descubierto que la expresión de estas oncoproteínas durante el desarrollo embrionario y fetal parece estar restringida a tejidos específicos y también restringida a etapas específicas de desarrollo. En cambio, se ha demostrado que la expresión de estas oncoproteínas en el adulto está asociada con una sobreexpresión en el crecimiento tumoral y/o un mal funcionamiento de las proteínas supresoras de tumores.

Un anticuerpo de diagnóstico y/o terapéutico ideal sería específico para un antígeno presente en una gran cantidad de cánceres, pero ausente o presente solo a niveles bajos en cualquier tejido normal. El descubrimiento, la caracterización y el aislamiento de un nuevo anticuerpo capaz de unirse a un antígeno que está específicamente asociado con cáncer o cánceres sería útil de muchas formas. En primer lugar, el anticuerpo tendría actividad biológica contra dichas células cancerosas y podría reclutar la respuesta del sistema inmunitario para tratar así la enfermedad. El anticuerpo podría administrarse como agente terapéutico solo o en combinación con los tratamientos actuales o usarse para preparar inmunoconjugados ligados a agentes tóxicos. Un anticuerpo con la misma especificidad pero con baja o nula actividad biológica cuando se administra solo también podría ser útil porque un anticuerpo podría usarse para preparar un inmunoconjugado con un radioisótopo, una toxina, un agente quimioterapéutico o un liposoma que contiene un agente quimioterapéutico, siendo la forma conjugada biológicamente activa en virtud del anticuerpo que dirige la toxina a las células que contienen antígeno.

Tal como se ha analiza anteriormente, se han descrito anticuerpos y otras moléculas que se unen específicamente a B7-H3 (véanse, las patentes de Estados Unidos N.° 7.527.969; 7368554; 7358354; y 7.279.567; las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N.° US 20090087416; US 20090022747; US 20090018315; US2008116219; US20080081346; US 20050202536; US20030103963; US20020168762; las publicaciones de PCT N.° WO 2008/116219; WO 2006/016276; WO 2004/093894; WO 04/001381; WO 2002/32375; WO 2002/10187 y WO 2001/094413; EP 1292619B; Modak, S. et al. (Marzo de 1999) "Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS)", Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol.

40:474 (90a Reunión Anual de la Asociación Estadounidense para la Investigación del Cáncer; Philadelphia, Pensilvania, EE.UU.; 10-14 de abril de 1999; Modak, S. et al. (Marzo de 2000) "Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9", Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41:724; Modak, S. et al. (2001) "Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors", Cancer Res. 61(10):4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains", J. Immunol. 172(4):2352-2359; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors", Cáncer Res. 69(15):5275-6281).

No obstante, un aspecto deseable para un anticuerpo de diagnóstico y/o agente terapéutico ideal sería el descubrimiento y caracterización de nuevos anticuerpos capaces de mediar, y particularmente de mejorar la activación del sistema inmunitario contra las células cancerosas (especialmente las células cancerosas humanas) que están asociadas con una variedad de cánceres. Tales composiciones también serían útiles para el descubrimiento de fármacos (por ejemplo, moléculas pequeñas) y para la caracterización adicional de la regulación, el crecimiento y la diferenciación celular.

Por lo tanto, a pesar de todos los avances anteriores, persiste la necesidad de composiciones mejoradas capaces de unirse a las células cancerosas y de facilitar o mediar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas. Dichas composiciones se pueden usar para diagnosticar y tratar tales cánceres. Existe una necesidad adicional, basándose en los descubrimientos desvelados en el presente documento, para composiciones novedosas que reconocen específicamente dianas dobles en la superficie de las células y que, por lo tanto, pueden modular, ya sea reduciendo o mejorando, las capacidades de B7-H3 para mediar en la activación de los linfocitos T o reconociendo y destruyendo las células cancerosas que expresan B7-H3. Es un objeto de la presente invención identificar tales composiciones. Otro objeto es proporcionar nuevos compuestos para su uso en el ensayo de expresión de B7-H3.

Como se describe con detalle más adelante, la presente invención se refiere a nuevos anticuerpos, incluyendo en particular reactivos de redireccionamiento de afinidad doble ("DART™") que comprenden moduladores de la activación de linfocitos T B7-H3, que son capaces de influir en la activación de los linfocitos T, así como en los nuevos anticuerpos que se unen a los receptores B7-H3 de las células cancerosas y facilitan o median la muerte de dichas células. La presente invención está dirigida a tales composiciones y a sus usos en el diagnóstico y en el tratamiento de enfermedades como el cáncer.

Sumario de la invención:

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de acuerdo con la reivindicación 1 del presente documento. También se describe un anticuerpo aislado o un fragmento inmunorreactivo del mismo, en donde el anticuerpo aislado o el fragmento comprende un dominio variable que se une específicamente a un dominio extracelular de B7-H3, en donde el anticuerpo compite por unirse al B7-H3 con cualquiera de los anticuerpos: BRCA69D, BRCA84D o PRCA157.

También se describe el anticuerpo aislado descrito anteriormente o su fragmento inmunorreactivo, en donde el anticuerpo o el fragmento comprende un dominio variable que comprende:

(A) CDRi (SEQ ID NO: 21), CDR² (SEQ ID NO: 23) y CDR³ (SEQ ID NO: 25) de la cadena ligera de BRCA69D y CDR¹ (SEQ ID NO: 29), CDR² (SEQ ID NO: 31) y CDR³ (SEQ ID NO: 33) de la cadena pesada de BRCA69D; (B) CDR¹ (SEQ ID NO: 5), CDR² (SEQ ID NO: 7) y CDR³ (SEQ ID NO: 9) de la cadena ligera de BRCA84D y CDR¹ (SEQ ID NO: 13), CDR² (SEQ ID NO: 15) y CDR³ (SEQ ID NO: 17) de la cadena pesada de BRCA84D; o (C) CDR¹ (SEQ ID NO: 37), CDR² (SEQ ID NO: 39) y CDR³ (SEQ ID NO: 41) de la cadena ligera de PRCA157 y CDR¹ (SEQ ID NO: 45), CDR² (SEQ ID NO: 47) y CDR³ (SEQ ID NO: 49) de la cadena pesada de PRCA157.

Cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente o sus fragmentos inmunorreactivos pueden unirse a B7-H3 que se expresa endógenamente en la superficie de una célula cancerosa.

Cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente o sus fragmentos inmunorreactivos pueden unirse a B7-H3 que se internaliza al unirse a B7-H3 expresado en la superficie de una célula cancerosa.

Cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente o fragmentos inmunorreactivos de los mismos puede ser un anticuerpo monoclonal humanizado.

Cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente o fragmentos inmunorreactivos de los mismos puede ser un anticuerpo modificado que comprende una variante de región Fc de IgG1 humana, en donde la variante de región Fc de IgG1 humana comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a la región Fc del origen del anticuerpo, la modificación o modificaciones de aminoácidos que comprenden la modificación o modificaciones de aminoácidos que alteran la afinidad o avidez de la variante de región Fc para unirse a un FcyR de manera que el anticuerpo modificado presenta una función efectora mejorada con respecto al anticuerpo original.

También se describe cualquiera de los anticuerpos aislados descritos anteriormente o fragmentos inmunorreactivos de los mismos, en donde la modificación de la región Fc comprende:

(A) al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

(1) F243L;

(2) D270E;

(3) R292P;

(4) S298N;

(5) Y300L;

(6) V305I;

(7) A330V; y

(8) P396L;

(B) al menos una sustitución de dos restos de aminoácidos, estando seleccionadas las sustituciones del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2) F243L y R292P; y

(3) R292P y V305I;

(C) al menos una sustitución de tres restos de aminoácidos, estando seleccionadas las sustituciones del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L;

(D) al menos una sustitución de cuatro restos de aminoácidos, estando seleccionadas las sustituciones del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L;

o

(E) una sustitución de al menos los cinco restos de aminoácidos: F243L, R292P, Y300L, V305I y P396.

También se describe el anticuerpo descrito anteriormente, en donde el anticuerpo comprende sustituciones de:

(A) F243L, R292P y Y300L;

(B) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L; o

(C) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L.

También se describe el anticuerpo descrito anteriormente, en donde el anticuerpo comprende:

(A) un dominio variable que comprende CDR¹ (SEQ ID NO: 5), CDR² (SEQ ID NO: 7) y CDR³ (SEQ ID NO: 9) de la cadena ligera de BRCA84D y CDR¹ (SEQ ID NO: 13), CDR² (SEQ ID NO: 15) y CDR³ (SEQ ID NO: 17) de la cadena pesada de BRCA84D; y

(B) una modificación de la región Fc que comprende las sustituciones: L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

También se describe el anticuerpo descrito anteriormente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado.

También se describen los anticuerpos aislados descritos anteriormente o fragmentos inmunorreactivos de los mismos, en donde el anticuerpo comprende:

(A) una cadena ligera variable que tiene la secuencia de aminoácidos de hBRCA84D-2 VL (SEQ ID NO: 89); (B) una cadena pesada variable que tiene la secuencia de aminoácidos de hBRCA84D-2 VH (SEQ ID NO: 99); y (c ) una región Fc que tiene las sustituciones: L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

También se describe un hibridoma que secreta un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un dominio extracelular de B7-H3, en donde el anticuerpo compite por unirse al B7-H3 con cualquiera de los anticuerpos: BRCA69D, BRCA84D o PRCA157.

También se describe una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos aislados o fragmentos inmunorreactivos descritos anteriormente.

También se describe un reactivo de redireccionamiento de afinidad doble (DART™), comprendiendo el reactivo:

(A) una cadena polipeptídica I que comprende un dominio de unión al epítopo VL de inmunoglobulina específico para unirse a B7-H3 y un dominio de unión al epítopo VH específico para unirse a una molécula distinta de B7-H3; y

(B) una cadena polipeptídica II que comprende un dominio de unión al epítopo VH de inmunoglobulina específico para unirse a B7-H3 y un dominio de unión al epítopo VL específico para unirse a la molécula distinta de B7-H3;

en donde las cadenas polipeptídicas I y II se asocian juntas para formar dominios de unión a epítopos funcionales capaces de unirse a B7-H3 y la molécula distinta de B7-H3.

También se describe el reactivo de redireccionamiento de afinidad doble descrito anteriormente (DART™), en donde la molécula distinta de B7-H3 que puede estar unida por DART™ es un hapteno, y particularmente en donde el hapteno es isotiocianato de fluoresceína.

También se describe el reactivo de redireccionamiento de afinidad doble descrito anteriormente (DART™), en donde la molécula distinta de B7-H3 que puede unirse al DART™ es un receptor de linfocitos T o el receptor NKG2D.

También se describe el reactivo de redireccionamiento de afinidad doble descrito anteriormente (DART™), en donde la molécula distinta de B7-H3 que puede unirse al DART™ es un antígeno asociado a un tumor y, en particular, en donde el antígeno asociado al tumor se selecciona del grupo que consiste en A33; ADAM-9; ALCAM; BAGE; betacatenina; CA125; Carboxipeptidasa M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; Citoqueratina 8; EGF-R; EphA2; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp100; HER-2/neu; virus del papiloma humano E6; virus del papiloma humano E7; integrina alfa-V-beta-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferasa; oncostatina M; p15; PIPA; p Sa ; PSMA; ROR1; sTn; receptor de TNF-p; receptor de TNF-a; receptor de TNF-y; receptor de transferrina; y receptor de VEGF.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 en el presente documento. También se describe una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena polipeptídica de cualquiera de los reactivos de redireccionamiento de afinidad doble descritos anteriormente (DART™).

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 en el presente documento. También se describe una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los anticuerpos aislados o fragmentos inmunorreactivos o reactivos de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) descritos anteriormente y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe la composición farmacéutica descrita anteriormente, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que comprende:

(A) un dominio variable que comprende CDRi (SEQ ID NO: 5), CDR² (SEQ ID NO: 7) y CDR³ (SEQ ID NO: 9) de la cadena ligera de BRCA84D y CDR¹ (SEQ ID NO: 13), CDR² (SEQ ID NO: 15) y CDR³ (SEQ ID NO: 17) de la cadena pesada de BRCA84D; y

También se describe cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, que comprende además uno o más agentes contra el cáncer adicionales, y particularmente en donde el agente contra el cáncer adicional es un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, un agente terapéutico hormonal o un agente inmunoterapéutico.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un reactivo de redireccionamiento de afinidad doble o una composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 12 del presente documento. También se describe el uso de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos descritos anteriormente o reactivos de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) en el diagnóstico de cáncer, en donde el anticuerpo aislado, el fragmento inmunorreactivo o DART™ está marcado de forma detectable.

El uso descrito anteriormente se puede caracterizar porque el cáncer se caracteriza por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de acuerdo con la reivindicación 15 en el presente documento. También se describe el uso de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos o reactivos de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) descritos anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer en un paciente. La invención se refiere además a tales usos caracterizados porque el cáncer se caracteriza por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero.

Los usos descritos anteriormente pueden caracterizarse porque el uso comprende además la administración de una o más terapias contra el cáncer adicionales seleccionadas del grupo que consiste en quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia, terapia hormonal y cirugía.

Breve descripción de los dibujos:

Las Figuras 1A-1B muestran los resultados de las investigaciones de IHC realizadas con páncreas normal, hígado, muestras de tejido de pulmón y colon con BRCA84D a 0,625 pg/ml y 0,078 pg/ml (Figura 1A) y corazón normal, tejido renal y glándula suprarrenal con BRCA84D a 0,625 pg/ml (Figura 1B).

La Figura 2 muestra los resultados de las investigaciones de IHC realizadas con páncreas canceroso, mama, muestras de tejido de colon y pulmón con BRCA84D a 0,625 pg/ml y 0,078 pg/ml.

Las Figuras 3A-3D muestran una eliminación redirigida dependiente de la dosis mediada por los anticuerpos descritos. Las Figuras 3A-3B muestran la eliminación redirigida dependiente de la dosis de células de carcinoma renal A498 (con PBMC en reposo a las 18 horas (LDH)) por anticuerpos monoclonales reactivos contra B7-H3 (relación efector:diana de 20:1) (Figura 3A: BRCA68D, BRCA69D, PRCA157, GB8, TCR-4420; Figura 3B:

OVCA22, BRCA84D, TDH6, Te S7, TCR-4420). Las Figuras 3C-3D muestran la eliminación redirigida dependiente de la dosis de células de cáncer de pulmón A549 (con PBMC en reposo a las 18 horas (LDH)) mediante anticuerpos monoclonales reactivos contra B7-H3 (relación efector:diana de 30:1) (Figura 3C: Br Ca 84D, OVCA22, PRCA157, TES7; Figura 3D: TDH6, BRCA68D, BRCA69D).

Las Figuras 4A-4B muestran las capacidades de los anticuerpos anti-B7-H3 para unirse a B7H3-2Ig soluble (Figura 4A) y B7H3-4Ig B7-H3 soluble (Figura 4B) (la concentración de anticuerpos es 100 nM). Leyenda: (A) BLA8; (B) BRCA165; (C) BRCA68D; (D) BRCA69D; (E) BRCA84D; (F) GB8; (G) LUCA1; (H) LUCA50; (I) OVCA21;

(J) OVCA22; (K) PA20; (L) PRCA123; (M) SG24; (N) SG27; (O) STO9; (P) TDH4 (184-192); (Q) TDH4; (R) TDH5;

(S) TES7. La posición vertical de la leyenda se correlaciona con la posición de la curva correspondiente.

Las Figuras 5A-5S demuestran la afinidad de unión entre los antígenos en solución y los anticuerpos monoclonales capturados (líneas continuas; B7-H3(4Ig) 100 nM; líneas discontinuas; B7-H3, 100 nM).

Las Figuras 6A-6I muestran los resultados de los análisis BIACORE™ de anticuerpos B7-H3 inmovilizados contra B7-H3-2Ig (líneas grises discontinuas) o B7-H3-4Ig (líneas negras continuas). Los anticuerpos se titularon de 0. 063 |jM a 1 jM . El tiempo está en segundos.

La Figura 7 proporciona un análisis BIACORE™ de comparación de los anticuerpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 y SG27.

La Figura 8 proporciona un análisis BIACORE™ que demuestra que los anticuerpos BRCA68D, BRCA69D y PRCA157 no compiten con BRCA84D por unirse al B7-H3 humano.

Las Figuras 9A-9B muestran los resultados de estudios sobre la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 para internalizarse al unirse a las células cancerosas (Figura 9A, células CMC de próstata; Figura 9B, células pancreáticas Hs700t).

Las Figuras 10A-10F muestran la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 para bloquearse entre sí, revelando así epítopos superpuestos o distintos. Se empleó un exceso de diez veces de anticuerpo competidor.

Las Figuras 11A-11B muestran la alineación de los restos de aminoácidos de las cadenas ligeras variables (Figura 11A) o cadenas pesadas variables (Figura 11B) de BRCA84D y su derivado humanizado, hBRCA84D.

La Figura 12 muestra las afinidades de unión relativas de los derivados de la cadena ligera de hBRCA84D BRCA84D-3VL, BRCA84D-4VL y BRCA84D-5VL para B7-H3 humano.

La Figura 13 muestra las afinidades de unión relativas de los derivados de la cadena pesada de hBRCA84D BRCA84D-2VH, BRCA84D-3VH y BRCA84D-4VH para B7-H3 humano.

La Figura 14 muestra las afinidades de unión relativas de (1) anticuerpos que contienen hBRCA84D-2VL y hBRCA84D-2VH (ensayos 1 y 2), (2) BRCA84D quimérico, (3) anticuerpo que contiene hBRCA84D-5VL y BRCA84D-HC quimérico y (4) anticuerpo que contiene hBRCA84D-5VL y hBRCA84D-2VH.

La Figura 15 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 humanizados modificados con Fc para inhibir el crecimiento tumoral de células de carcinoma de vejiga urinaria HT-1197 in vivo en un sistema modelo de xenoinjerto murino. El anticuerpo hBRCA84D-2 modificado con Fc (que comprende modificaciones de Fc L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L) se administró a los ratones (a una dosis de 1 jg/kg, 10 jg/kg, o 20 jg/kg) 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la implantación de las células cancerosas.

La Figura 16 muestra la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 humanizados modificados con Fc para inhibir el crecimiento tumoral de las células del carcinoma renal A498 in vivo en un sistema modelo de xenoinjerto murino. El anticuerpo hBRCA84D-2 modificado con Fc (que comprende modificaciones de Fc L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L) se administró a los ratones (a una dosis de 1 jg/kg, 10 jg/kg, o 20 jg/kg) 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la implantación de las células cancerosas.

Las Figuras 17A-17D muestran la capacidad de hBRCA84D-2/anti-TCR DART™ ("T-DART ™") para mediar en la eliminación redirigida de células de cáncer de pulmón SK-MES-1, células de carcinoma renal A498, células de cáncer de próstata LNCaP y células de melanoma UACC-62.

Las Figuras 18A-18C muestran la desintegración farmacocinética de Mab1 anti-B7-H3 en el suero de ratones macho mCD16-/-, hCD16A_FOXN1 (Figuras 18A-18B). La Figura 18C muestra los perfiles farmacocinéticos previstos generados utilizando un modelo de 2 compartimentos con parámetros de la dosis de 5 mg/kg a 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 mg/kg.

La Figura 19 muestra la expresión relativa de HER2 y PRCA135 por la línea de cáncer de vejiga HT-1197.

La Figura 20 muestra la afinidad de unión de las variantes de hBRCA84D del anticuerpo anti-B7-H3 a las células HT-1197.

Las Figuras 21A-21C muestran los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para HT-1197. Los grupos de 8 ratones hembra recibieron vehículo o 10 mg/kg de control de IgG, o centuximab a una dosis de 1, 5 o 15 mg/kg o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,1, 0,5, 1, 5, o 10 mg/kg (Q7D x5). Las mediciones de los tumores se realizaron cada 3-4 días. La Figura 21A muestra la capacidad del anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. Comparaciones frente a control de IgG: Mab1 (1 y 5 mg/kg) frente a control de IgG *** desde el día 51; Mab1 (10 mg/kg) frente a control de IgG ** desde el día 48. La Figura 21B muestra la capacidad de centuximab para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. Cetuximab (7 mg/kg) frente a control de IgG ** desde el día 51; Cetuximab (15 mg/kg) frente a control de IgG *** desde el día 58. La Figura 21C compara los resultados obtenidos a las dosis máximas probadas.

Las Figuras 22A-22B muestran la expresión relativa de HER2 y PMSA por la línea de cáncer de vejiga HT-1376.

La Figura 23 muestra los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para HT-1376. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 1,0 mg/kg de anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 (Q7D x4).

La Figura 24 muestra los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para AGS. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 10 mg/kg de anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg (Q7D x5).

La Figura 25 muestra los resultados de un ensayo in vitro de citotoxicidad de células de cáncer de pulmón A549 tras la incubación con los anticuerpos hBRCA84D, anti-B7-H3, variantes de chBRCA84D y hBRCA84 (Fc Var1) (Relación E:T = 25:1; Efector = PBMC de humano; Lectura del ensayo LDH).

La Figura 26 muestra los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para A549. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 1,0 mg/kg de anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 (Q7D x4).

La Figura 27 muestra los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para CaLu3. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 0,5, 1 o 5 mg/kg (Q7D x5) de anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 o control de IgG (10 mg/ml).

Las Figuras 28A-28C muestran los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para células cancerosas de melanoma LOX-IMVI. Los grupos de 8 ratones hembra recibieron vehículo o 5 mg/kg de control de IgG, o docetaxel a una dosis de 5, 10 o 20 mg/kg o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. La Figura 28A muestra la capacidad del anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 28B muestra la capacidad del docetaxel para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 28C compara los resultados obtenidos a las dosis máximas probadas.

La Figura 29 muestra el resultado de un análisis de xenoinjerto murino para células de cáncer de melanoma UACC-62. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 5 mg/kg de control de IgG, o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg.

Las Figuras 30A-30C muestran los resultados de un análisis de xenoinjerto murino para células de cáncer de próstata 2rv. Los grupos de 8 ratones hembra recibieron vehículo o 10 mg/kg de control de IgG, o trastuzumab a una dosis de 1,7 o 15 mg/kg o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. La Figura 30A muestra la capacidad del anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 30B muestra la capacidad de trastuzumab para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 30C compara los resultados obtenidos a las dosis máximas probadas.

La Figura 31 muestra los resultados de un ensayo in vitro de citotoxicidad de células de cáncer renal A498 tras la incubación con los anticuerpos hBRCA84D, anti-B7-H3, variantes de chBRCA84D y hBRCA84 (Fc Var1) (Relación E:T = 25:1; Efector = PBm C de humano; Lectura del ensayo LDH).

La Figura 32 muestra el resultado de un análisis de xenoinjerto murino para células de cáncer renal A498. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 10 mg/kg de control de IgG, o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró centuximab (anticuerpo anti-EGRF) a un grupo de control de ratones a dosis de 1, 7 o 15 mg/kg.

Las Figuras 33A-33B muestran el resultado de un análisis de xenoinjerto murino para células de cáncer renal 786 0 en comparación con centuximab. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 10 mg/kg de control de IgG, o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró centuximab (anticuerpo anti-EGRF) a un grupo de control de ratones a dosis de 1,7 o 15 mg/kg.

La Figura 34 muestra el resultado de un análisis de xenoinjerto murino para células de cáncer renal 786-0 en comparación con paclitaxel. Los grupos de ratones recibieron vehículo o 5 mg/kg de control de IgG, o anticuerpo Mab1 anti-B7-H3 a una dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró paclitaxel a un grupo de control de ocho de tales ratones a una dosis de 2,5 mg/kg.

Descripción detallada de la invención:

I. Técnicas generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en las referencias, tales como, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Tercera edición (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, Nueva York, Nueva York; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. y Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, Nueva York, Nueva York; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, Nueva York; WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, Nueva York, Nueva York; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, Nueva York, Nueva York; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al., eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, Londres, Reino Unido; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, Reino Unido; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, EE.UU., Nueva York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, EE.UU., Nueva York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, Londres, Reino Unido); y DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, OCTAVA EDICIÓN, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA.

II. Definiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "B7-H3" se refiere a un miembro de la familia de proteínas B7 humana, una proteína de membrana de tipo I con dominios similares a Ig también conocida como CD276. El término "2Ig-B7-H3" indica la forma B7-H3 que comprende sólo dos dominios similares a Ig; el término "4Ig-B7-H3" denota la forma B7-H3 que comprende cuatro dominios similares a Ig (véase, Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes", J. Immunol. 168:6294-6297; Steinberger et al. (2004), "Molecular Characterization Of Human 4Ig-B7-H3, A Member Of The B7 Family With Four Ig-Like Domains", J. Immunol. 2004, 172(4):2352-2359 y Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 101(34):12640-12645). El antígeno "TES7" (WO 2008/066691) es un antígeno que comparte características de 4Ig-B7-H3. Por consiguiente, los anticuerpos que se unen específicamente a TES7 se unen a 4Ig-B7-H3. El antígeno TES7 puede tener más de un epítopo diferente y los epítopos pueden ser no lineales. Se sabe que varios anticuerpos anti-B7-H3 se unen a epítopos no lineales, incluyendo algunos solo presentes en la isoforma 4Ig-B7-H3. Actualmente se cree que TES7 puede estar sobreexpresado en ciertas células cancerosas en comparación con sus homólogos de tejido normal.

Se describen agonistas, antagonistas y otros moduladores de la función B7-H3. Estos agonistas, antagonistas y moduladores son polipéptidos que comprenden uno o más de los sitios determinantes antigénicos de B7-H3, o comprenden uno o más fragmentos de dichos sitios, variantes de tales sitios, o peptidomiméticos de tales sitios. Estos compuestos agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H37 se proporcionan en forma lineal o ciclada, y opcionalmente comprenden al menos un resto de aminoácido que no se encuentra comúnmente en la naturaleza o al menos un isóstero de amida. Estos compuestos pueden estar glucosilados.

Más específicamente, las expresiones "modulador de B7-H3" como se usan en el presente documento se definen como cualquier compuesto que (1) sea capaz de interrumpir o bloquear la interacción entre B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3; (2) es capaz de unirse a B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3; (3) contiene un sitio antigénico que puede usarse en la producción de anticuerpos capaces de unirse a B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3; (4) contiene un sitio antigénico que puede usarse en el cribado de anticuerpos capaces de unirse a B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3; (5) contiene un sitio antigénico que puede usarse en la producción de anticuerpos capaces de interrumpir o bloquear la interacción entre B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3; (6) contiene un sitio antigénico que puede usarse en el cribado de anticuerpos capaces de interrumpir o bloquear la interacción entre B7-H3 humano y sus ligandos naturales o un anticuerpo anti-B7-H3. Los moduladores de B7-H3 pueden ser "agonistas de B7-H3" o "antagonistas de B7-H3" dependiendo de si su actividad mejora la activación de los linfocitos T o inhibe la activación de los linfocitos T, respectivamente.

Los agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 incluyen variantes de B7-H3, antagonistas del péptido B7-H3, peptidomiméticos y moléculas pequeñas, anticuerpos anti-B7-H3 y variantes de inmunoglobulina, variantes de aminoácidos de B7-H3 humano, incluidas las variantes de sustitución, deleción y adición de aminoácidos, o cualquier combinación de las mismas, e inmunoglobulinas quiméricas. Los agonistas, los antagonistas y moduladores de B7-H3 se basan en la identificación de los dominios B7-H3 implicados en la unión de B7-H3 humano a sus ligandos naturales o anticuerpos anti-B7-H3. Por lo tanto, se describen agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 con estructuras moleculares que duplican o imitan uno o más de los dominios de unión anti-B7-H3 de B7-H3 humano.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "variante B7-H3" denota cualquier variante de aminoácidos de B7-H3 humano, incluyendo variantes de sustitución, deleción y adición de aminoácidos o cualquier combinación de las mismas. La definición abarca moléculas quiméricas tales como quimeras B7-H3 humanas/no humanas y otras moléculas híbridas. También se incluye en la definición cualquier fragmento de una variante de molécula B7-H3 que comprenda la región o regiones híbridas o variantes de la molécula.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse específicamente a una diana, tales como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, ubicado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se utiliza en el presente documento, el término no solo abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2 Fv), monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, variantes de origen natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, "BiTE®", moléculas "DART™" y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno de la especificidad requerida.

El término "BiTEs" (acopladores de linfocitos T biespecíficos) se refiere a una única molécula de cadena polipeptídica que tiene dos dominios de unión a antígeno, uno de los cuales se une a un antígeno de linfocitos T y el segundo de los cuales se une a un antígeno presente en la superficie de una diana (documento WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE®: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells", Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody", Science 321: 974-977).

El término "DART™" (reactivo de redireccionamiento de afinidad doble) se refiere a una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que se asocian (especialmente a través de una interacción covalente) para formar al menos dos sitios de unión al epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes. Cada una de las cadenas polipeptídicas de un DART™ comprende una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, pero estas regiones no interactúan para formar un sitio de unión al epítopo. En su lugar, la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de una de las cadenas polipeptídicas de DART™ (por ejemplo, la primera) interactúa con la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica de DART™ (por ejemplo, la segunda) para formar un sitio de unión al epítopo. De manera similar, la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina de una (por ejemplo, la primera) de las cadenas polipeptídicas DART™ interactúa con la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica de DART™ diferente (por ejemplo, la segunda) para formar un sitio de unión al epítopo. Los DART™ pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, etc., siendo capaces de este modo de unirse simultáneamente a uno, dos, tres o más epítopos diferentes (que pueden ser de antígenos iguales o diferentes). Los DART™ pueden ser adicionalmente monovalentes, bivalentes, trivalentes, tetravalentes, pentavalentes, hexavalentes, etc., siendo capaces de este modo de unirse simultáneamente a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más moléculas. Estos dos atributos de los DART™ (es decir, el grado de especificidad y valencia pueden combinarse, por ejemplo para producir anticuerpos biespecíficos (es decir, capaz de unir dos epítopos) que son tetravalentes (es decir, capaz de unir cuatro conjuntos de epítopos), etc. Las moléculas DART™ se desvelan en las publicaciones de PCT WO 2006/113665, WO 2008/157379 y WO 2010/080538.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos en donde el anticuerpo monoclonal comprende aminoácidos (naturales y no naturales) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2 Fv), monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unión a un antígeno. No se pretende que esta expresión esté limitada con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que este se fabrica (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). El término incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc., descritos anteriormente en la definición de "anticuerpo".

La expresión " anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula quimérica, preparada de forma general usando técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina procedente de una especie no humana, mientras que el resto de la estructura de inmunoglobulina de la molécula está basada en la estructura y/o en la secuencia de una inmunoglobulina humana. El dominio de unión a antígeno de tales anticuerpos puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo silvestre o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero sigue existiendo la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 86:4220-4224). Otro enfoque se centra no solamente en proporcionar regiones constantes derivadas de regiones humanas, sino en la modificación de las regiones variables, así como en una remodelación tan estrecha como sea posible de las mismas a la forma humana. Se sabe que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que varían en respuesta a los antígenos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones marco (FR) que están relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un antígeno particular, las regiones variables se pueden "remodelar" o "humanizar" injertando CDR que provienen de un anticuerpo no humano en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. La aplicación de este enfoque a diversos anticuerpos se ha notificado por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation", Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity", Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo", Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies ForAntiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 89:4285-4289; y Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen", J. Immunol. 148:1149-1154. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR procedentes de anticuerpos de ratón). En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que se han alterado con respecto al anticuerpo original, que también se denominan una o más CDR "que provienen de" una o más CDR del anticuerpo original.

Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que un anticuerpo o un polipéptido se une "específicamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con ese epítopo en relación con epítopos alternativos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo B7-H3 es un anticuerpo que se une a este epítopo B7-H3 con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración de la que se une a otros epítopos de B7-H3 o epítopos no de B7-H3. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une específicamente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Como tal, una "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva. De manera general, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión "específica".

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "inmunológicamente activo" en referencia a un epítopo que es o "permanece inmunológicamente activo" se refiere a la capacidad de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-B7-H3) para unirse al epítopo en diferentes condiciones, por ejemplo, después de que el epítopo haya sido sometido a condiciones reductoras y desnaturalizantes.

Diferentes funciones biológicas están asociadas con anticuerpos anti-B7-H3, incluyendo, pero no limitado a uno o más de: una capacidad para unirse específicamente a B7-H3 (y en particular a las moléculas B7-H3 que se expresan en las superficies de las células cancerosas, que incluyen, pero sin limitación, células cancerosas de riñón, próstata o pulmón); una capacidad para inhibir competitivamente la unión preferencial de un anticuerpo anti-B7-H3 conocido a B7-H3, incluyendo la capacidad de unirse preferentemente al mismo epítopo B7-H3 al que se une preferentemente el anticuerpo original; la capacidad de unirse a una porción de B7-H3 que está expuesta en la superficie de una célula viva in vitro o in vivo; la capacidad de unirse a una porción de B7-H3 que está expuesta en la superficie de las células cancerosas vivas, tal como, pero sin limitación, células cancerosas de próstata, pulmón o riñón; la capacidad de administrar un agente quimioterapéutico a las células cancerosas (tal como células cancerosas de riñón, próstata o pulmón) que expresan B7-H3 en su superficie; y/o una capacidad para administrar un agente terapéutico o marcador detectable en células cancerosas que expresan B7-H3 en su superficie. Tal como se analiza en el presente documento, los polipéptidos descritos (incluidos los anticuerpos) pueden tener una o más de estas características.

Un "anticuerpo anti-B7-H3 equivalente" o "polipéptido anti-B7-H3 equivalente" se refiere a un anticuerpo o polipéptido que tiene una o más funciones biológicas asociadas con un anticuerpo anti-B7-H3, tales como, por ejemplo, especificidad de unión.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "agente" se refiere a un compuesto biológico, químico o farmacéutico. Los ejemplos no limitantes incluyen moléculas orgánicas o inorgánicas simples o complejas, un péptido, una proteína, un oligonucleótido, un anticuerpo, un derivado de anticuerpo, fragmento de anticuerpo, un derivado de vitamina, un carbohidrato, una toxina o un compuesto quimioterapéutico. Se pueden sintetizar diversos compuestos, por ejemplo, moléculas pequeñas y oligómeros (por ejemplo, oligopéptidos y oligonucleótidos) y compuestos orgánicos sintéticos basados en diversas estructuras centrales. Además, diversas fuentes naturales pueden proporcionar compuestos para el cribado, tales como extractos de plantas o animales y similares.

Los agentes que se emplean en los métodos de la presente pueden seleccionarse aleatoriamente o seleccionarse o diseñarse racionalmente. Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que un agente se selecciona aleatoriamente cuando el agente se elige sin consideración previa o conocimiento del aminoácido específico u otros restos químicos implicados en la asociación de la molécula con su(s) miembro(s) de unión natural o anticuerpos conocidos. Un ejemplo de un agente seleccionado aleatoriamente es un agente que se identifica mediante el uso y el cribado de una biblioteca química o una biblioteca combinatoria de péptidos.

Tal como se utiliza en el presente documento, se dice que un agente se selecciona o diseña racionalmente cuando el agente se elige de forma no aleatoria que tiene en cuenta la secuencia del sitio diana y/o su conformación en relación con la acción del agente. Con respecto a los agentes anti-B7-H3, actualmente se cree que hay al menos tres epítopos en B7-H3 contra los cuales se pueden generar anticuerpos y por lo tanto al menos tres sitios de acción para agentes que bloquean la interacción B7-H3/anti-B7-H3. Se describen agentes que actúan en los sitios de interacción entre B7-H3 y su miembro de unión natural, aunque también se pueden considerar otros ligandos y sus sitios interactivos activos con B7-H3, si se conoce actualmente o se identifica posteriormente. Los agentes pueden seleccionarse racionalmente o diseñarse racionalmente utilizando las secuencias de péptidos que forman los sitios de contacto del receptor/ligando y/o del complejo de B7-H3/anticuerpo anti-B7-H3. Por ejemplo, un agente peptídico seleccionado racionalmente puede ser un péptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a un epítopo que aparece en B7-H3 cuando se expone en la superficie de una célula viva en su entorno natural. Dicho agente reducirá o bloqueará la asociación del anticuerpo anti-B7-H3 con B7-H3, o la asociación de B7-H3 con su ligando natural, según se desee, uniéndose al anticuerpo anti-B7-H3 o al ligando natural.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "marcado", con respecto a un anticuerpo, pretende abarcar el marcaje directo del anticuerpo mediante el acoplamiento (es decir, el enlace físico) de una sustancia detectable, como un agente radiactivo o un fluoróforo (por ejemplo, ficoeritrina (PE) o isotiocianato de fluoresceína (también conocido como fluoroisotiocianato o FITC)) al anticuerpo, así como un marcaje de la sonda o el anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "asociación", con respecto a un anticuerpo, incluye unión covalente y no covalente o unión de un agente (por ejemplo, agente quimioterapéutico) al anticuerpo. El anticuerpo puede asociarse con un agente (por ejemplo, agente quimioterapéutico) mediante unión directa o unión indirecta mediante unión a una plataforma común, de manera que el anticuerpo dirige la localización del agente a la célula cancerosa a la que se une el anticuerpo y en la que el anticuerpo y el agente no se disocian sustancialmente en condiciones fisiológicas de manera que el agente no se dirige a la misma célula cancerosa a la que se une el anticuerpo o de manera que la potencia del agente no disminuya.

La expresión "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un individuo y pueden usarse en un ensayo de diagnóstico o seguimiento. La definición abarca la saliva, la sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, como una muestra de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas de los mismos, y la progenie de los mismos, por ejemplo, células obtenidas de una muestra de tejido extraída de un individuo sospechoso de tener cáncer, en realizaciones preferidas de ovario, pulmón, próstata, páncreas, colon y tejido mamario. La definición también incluye muestras que hayan sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento respecto de determinados componentes, tales como proteínas o polinucleótidos, o embebido en una matriz semisólida o sólida con fines de seccionamiento. La expresión "muestra biológica" abarca una muestra clínica y asimismo, incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluido biológico y muestras de tejido.

La expresión "célula hospedadora" incluye una célula o cultivo celular individual que puede ser o ha sido un receptor de vector(es) para la incorporación de insertos polinucleotídicos. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una sola célula hospedadora, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN genómico) a la célula parental original debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Una célula hospedadora incluye células transfectadas in vivo con un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "retrasar el desarrollo de metástasis" significa aplazar, impedir, ralentizar, retardar, estabilizar y/o posponer el desarrollo de metástasis. Este retraso puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de los antecedentes del cáncer y/o del individuo que se trate. Como es evidente para un experto en la materia, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolla la metástasis.

Tal como se utiliza en el presente documento, una "cantidad eficaz" de una composición farmacéutica, en una realización, es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados que incluyen, sin limitación, resultados clínicos como la reducción del tamaño del tumor (en el contexto del cáncer, por ejemplo, cáncer de mama o de próstata), retraso del crecimiento de células cancerosas, retrasar el desarrollo de metástasis, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otro medicamento tal como a través del direccionamiento y/o la internalización, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A efectos de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación de (o destruir) células cancerosas y para reducir y/o retrasar el desarrollo o crecimiento, de metástasis de células cancerosas, ya sea directa o indirectamente. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, se puede considerar una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos, y se puede considerar que un único agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes diferentes, puede darse o se consigue un resultado deseable. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está dentro del conocimiento de la técnica. Las dosis típicas comprenden de 0,1 a 100 mg/kg/peso corporal. Las dosis preferidas comprenden de 1 a 100 mg/kg/peso corporal. Las dosis más preferidas comprenden de 10 a 100 mg/kg/peso corporal.

Tal como se utiliza en el presente documento, una molécula o agente de ácido nucleico, anticuerpo, composición o célula, etc., se dice que está "aislada" cuando esa molécula de ácido nucleico, agente, anticuerpo, composición, o célula, está sustancialmente separada de las moléculas de ácido nucleico contaminantes, anticuerpos, agentes, composiciones, o células, etc. presente de forma natural en su fuente original.

El término "individuo" se refiere a un animal vertebrado, preferentemente, un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, animales de granja, animales para el deporte, mascotas, primates, ratones y ratas. En la realización más preferida, el término individuo denota un ser humano.

Los términos "polipéptido", "oligopéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Se entiende que, debido a que los polipéptidos de la presente invención están basados en un anticuerpo, los polipéptidos pueden producirse como cadenas individuales o como cadenas asociadas.

También se describen peptidomiméticos de los agonistas, antagonistas y moduladores del péptido B7-H3 (incluidos los anticuerpos anti-B7-H3) descritos en el presente documento. Dichos peptidomiméticos incluyen péptidos en los que al menos un resto de aminoácido está sustituido con un resto de aminoácido que no se encuentra comúnmente en la naturaleza, tal como el isómero D del aminoácido o una especie N-alquilada del aminoácido. En otras realizaciones, los peptidomiméticos se construyen reemplazando al menos un enlace amida (-C(=O)-NH-) en un agonista, antagonista o moduladores del péptido B7-H3, con un isóstero de amida. Los isósteros de amida adecuados incluyen -CH²-NH-, -CH²-S-, -CH²-S(O)-, -CH²-S(O)²-, -CH²-CH²-, -CH=CH-(forma E o Z), -C(=O)-CH²-, -CH(CN)-NH-, -C(OH)-CH²- y -O-C(=O)-NH-. Los enlaces amida en un agonista, antagonista o modulador del péptido B7-H3 que son candidatos adecuados para el reemplazo con isósteros de amida incluyen enlaces que son hidrolizables por las esterasas o proteasas endógenas del sujeto en el que se pretende el tratamiento con el agonista, antagonista o modulador del péptido B7-H3.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "sustancialmente puro" se refiere a material que es al menos 50 % puro (es decir, libre de contaminantes), más preferentemente al menos 90 % puro, más preferentemente al menos 95 % puro, más preferentemente al menos 98 % puro, más preferentemente al menos 99 % puro, y más preferentemente más del 99 % puro.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "toxina" se refiere a cualquier sustancia que produzca una respuesta adversa dentro de una célula. Por ejemplo, una toxina dirigida a una célula cancerosa tendría un efecto adverso, efecto a veces deletéreo, en la célula cancerosa. Los ejemplos de toxinas incluyen, pero sin limitación, un taxano, un maitansinoide, una auristatina (por ejemplo, monometil auristatina (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina E (AE), etc.) las nucleobases comprenden aquellas desveladas en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.208.020; 5416064; 6333410; 6340701; 6372738; 6436931; 6441163; 6596757; 7276497; 7585857; o 7.851.432), una caliqueamicina, una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina), un análogo de CC-1065, docetaxel; catepsina B o E; ricina, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina diftérica y ribonucleasa; anticuerpos radiomarcados (por ejemplo, tiuxetan conjugado o marcado con un radioisótopo tóxico (por ejemplo, 90Y, 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, etc.).

Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" denotan un enfoque para obtener un resultado beneficioso o deseado que incluye preferentemente un resultado clínico beneficioso o deseado. Dichos resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células cancerosas u otras enfermas, reducir la metástasis de las células cancerosas que se encuentran en los cánceres, reducir el tamaño del tumor, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad, y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término cáncer pretende abarcar cánceres caracterizados por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células de transición), cáncer de hueso (adamantinoma, quistes óseos aneurismáticos, osteocondroma, osteosarcoma), un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales), una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejido blando, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero (carcinoma de cuello uterino, carcinoma de endometrio y leiomioma).

III. Métodos de producción de anticuerpos y polipéptidos

Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos monoclonales. Un método que puede emplearse es el método de Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity", Nature 256:495-497 o una modificación del mismo. Normalmente, los anticuerpos monoclonales se desarrollan en especies no humanas, tales como ratones. En general, se utiliza un ratón o una rata para la inmunización, pero también se pueden utilizar otros animales. Los anticuerpos se producen inmunizando ratones con una cantidad inmunogénica de células, extractos de células o preparaciones de proteínas que contienen B7-H3 humano. El inmunógeno puede ser, pero sin limitación, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, ácidos nucleicos o tejido. En una realización, se utilizan células de carcinoma de pulmón humano. Las células utilizadas para la inmunización, por ejemplo, testículo humano o adenocarcinoma pancreático o células del estómago, se pueden cultivar durante un período de tiempo (por ejemplo, al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células (por ejemplo, células de testículo, estómago o páncreas humano) se pueden usar como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, como Ribi. En general, las células deben mantenerse intactas y preferentemente viables cuando se usan como inmunógenos. Las células intactas pueden permitir que el animal inmunizado detecte mejor los antígenos que las células rotas. La utilización de adyuvantes desnaturalizantes o agresivos, por ejemplo, adyuvante de Freud, puede romper las células y, por lo tanto, se desaconseja. El inmunógeno se puede administrar varias veces a intervalos periódicos tales como, cada quince días o cada semana, o puede administrarse de tal manera que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo, en un tejido recombinante).

En una realización, los anticuerpos monoclonales que se unen a B7-H3 se obtienen utilizando células hospedadoras que sobreexpresan B7-H3 como inmunógeno. Tales células incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, células de carcinoma de pulmón humano y células de cáncer de colon humano.

Para monitorear la respuesta de anticuerpos, se puede obtener una pequeña muestra biológica (por ejemplo, sangre) del animal y analizar el título de anticuerpos contra el inmunógeno. El bazo y/o varios ganglios linfáticos grandes se pueden extirpar y disociar en células individuales. Si se desea, las células del bazo se pueden cribar (después de eliminar las células adherentes no específicamente) aplicando una suspensión celular a una placa o un pocillo recubierto con el antígeno. Los linfocitos B, que expresan inmunoglobulina unida a la membrana específica para el antígeno, se unirán a la placa y no se enjuagarán con el resto de la suspensión. Los linfocitos B resultantes, o todas las células del bazo disociadas, luego se pueden fusionar con células de mieloma (por ejemplo, X63-Ag8.653 y las del Instituto Salk, Centro de distribución celular, San Diego, CA). Se puede usar polietilenglicol (PEG) para fusionar el bazo o los linfocitos con las células del mieloma para formar un hibridoma. Luego, el hibridoma se cultiva en un medio selectivo (por ejemplo, hipoxantina, aminopterina, medio de timidina, también conocido como "medio HAT"). Los hibridomas resultantes se siembran luego en placas mediante dilución limitante y se analizan para la producción de anticuerpos que se unen específicamente al inmunógeno, usando, por ejemplo, FACS (clasificación de células activadas por fluorescencia) o cribado inmunohistoquímico (IHC). A continuación, los hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales seleccionados se cultivan in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo tisular o reactores de fibra hueca), o in vivo (por ejemplo, como ascitis en ratones).

Como otra alternativa a la técnica de fusión celular, los linfocitos B inmortalizados con el virus de Epstein-Barr (VEB) se pueden usar para producir anticuerpos monoclonales. Los hibridomas se expanden y subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se analizan para determinar la actividad antiinmunógena mediante procedimientos de ensayo convencionales (por ejemplo, FACS, IHQ, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, inmunoensayo de fluorescencia, etc.).

En otra alternativa, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 y cualquier otro anticuerpo equivalente se pueden secuenciar y producir de forma recombinante por cualquier medio conocido en la técnica (por ejemplo, humanización, uso de ratones transgénicos para producir anticuerpos completamente humanos, tecnología de presentación en fagos, etc.). En una realización, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 se secuencia y la secuencia polinucleotídica se clona luego en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped posteriormente puede expandirse y congelarse para su uso futuro.

La secuencia de polinucleótidos del anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 y cualquier otro anticuerpo equivalente puede usarse para manipulación genética para generar un anticuerpo "humanizado", para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. El principio general para humanizar un anticuerpo implica conservar la secuencia básica de la porción del anticuerpo que se une al antígeno, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanos. Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización (3) utilizar las metodologías/técnicas de humanización reales y (4) realizar la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.816.567; 5807715; 5866692; y 6.331.415.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpos "humanizadas" que comprenden un sitio de unión al antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o roedor modificado y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a dominios constantes humanos (véase, por ejemplo, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies", Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.u U.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen", J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody", Cancer Res. 47:3577-3583). Otras referencias describen CDR de roedores injertadas en una región marco (FR) de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity", Science 239:1534-1536; y Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse", Nature 321:522-525). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones marco de roedor revestidas de forma recombinante. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n.° 519.596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia las moléculas de anticuerpos anti-humano de roedores, lo que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Se describen otros métodos de humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse por Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins", Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 y en las patentes de Estados Unidos n.° 6.180.377; 6054297; 5997867; y 5.866.692.

También se describen fragmentos de región variable de cadena sencilla ("scFv") de anticuerpos de la presente invención, como muanti-B7-H3. Los fragmentos de región variable de cadena sencilla se preparan uniendo regiones variables de cadena ligera y/o pesada mediante el uso de un péptido de unión corto. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242:423-426) describe un ejemplo de péptidos enlazadores que forman un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxilo de una región variable y el extremo amino de la otra región variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242:423-426). Los enlazadores, a su vez, se pueden modificar para funciones adicionales, tales como la fijación de fármacos o la fijación a soportes sólidos. Las variantes monocatenarias pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el scFv se puede introducir en una célula hospedadora adecuada, ya sea eucariota, tal como una levadura, células vegetales, de insecto o de mamífero, o procariota, tal como E. coli. Se pueden preparar polinucleótidos que codifican el scFv de interés mediante manipulaciones de rutina tales como ligamiento de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

También se describen modificaciones de anticuerpos y polipéptidos que se unen a B7-H3 y sus agonistas, antagonistas y moduladores, incluyendo anticuerpos y polipéptidos funcionalmente equivalentes que no afectan significativamente a sus propiedades y variantes que tienen actividad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en el presente documento. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional o el uso de análogos químicos. Los restos de aminoácidos que se pueden sustituir de forma conservativa entre sí incluyen, pero sin limitación: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glucosilados y no glucosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glucosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos serían conservativas, es decir, el aminoácido sustituido poseería propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales sustituciones conservativas son conocidas en la técnica y se han proporcionado ejemplos anteriormente. Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden utilizar modificaciones, por ejemplo, para la fijación de marcadores para inmunoensayo, tales como la unión de restos radiactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos modificados se preparan usando procedimientos establecidos en la técnica y se pueden seleccionar usando ensayos estándar conocidos en la técnica.

También se describen proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de región de cadena ligera variable y al menos 10 aminoácidos de región de cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado públicamente. A efectos de la presente invención, una proteína de fusión de anticuerpos contiene uno o más dominios polipeptídicos que se unen específicamente a B7-H3 y otra secuencia de aminoácidos a la que no está unida en la molécula natural, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región.

Se pueden crear un polipéptido anti-B7-H3 y otros agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por síntesis o de forma recombinante. Un método para producir agonistas, antagonistas y moduladores del péptido B7-H3 implica la síntesis química del polipéptido, seguida de un tratamiento en condiciones oxidantes adecuadas para obtener la conformación natural, es decir, los enlaces correctos de puentes disulfuro. Esto se puede lograr utilizando metodologías bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Kelley, R. F. et al. (1990) En: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pág. 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; véanse también las patentes de Estados Unidos N.° 4.105.603; 3972859; 3842067; y 3.862.925).

Los polipéptidos se pueden preparar convenientemente usando síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis", Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century", Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

En otra alternativa más, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos mediante el uso de ratones disponibles comercialmente que han sido diseñados genéticamente para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. También pueden utilizarse animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Son ejemplos de dicha tecnología XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) y h Um AB-MOUSE® y TC MOUSE ™ (ambos de Medarex, Inc., Princeton, NJ).

En una alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante y expresarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante aislando primero los anticuerpos producidos en animales hospedadores, obteniendo la secuencia génica y usando la secuencia génica para expresar el anticuerpo de manera recombinante en células hospedadoras (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han desvelado métodos adecuados para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche (véase, por ejemplo, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants", Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice", Int. Rev. Immunol 13:65-93; y Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies", J. Immunol Methods 231:147-157). Los métodos adecuados para fabricar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, monocatenarios, etc. se conocen en la técnica. En otra alternativa, los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.565.332; 5580717; 5733743; 6265150; y Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology", Annu. Rev. Immunol.

12,433-455).

Los anticuerpos o la proteína de interés pueden someterse a secuenciación mediante degradación de Edman, que es bien conocida por los expertos en la materia. La información de péptidos generada por espectrometría de masas o degradación de Edman se puede usar para diseñar sondas o cebadores que se usan para clonar la proteína de interés.

Un método alternativo de clonación de la proteína de interés es mediante "panning" usando B7-H3 purificado o porciones del mismo para las células que expresan el anticuerpo o proteína de interés. B7-H3 existe en forma de "2Ig" y como forma de "4Ig". La secuencia de aminoácidos de la forma "2Ig" de B7-H3 humano es (SEQ ID NO: 1):

MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWALVGTDATLCC

SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYANRTALFPDLL

AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE

PNKDLRPGDT VTITCSSYRG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNVTTSQMANEQG

LFDVHSVLRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHGSVTITGQPMTFPPEALW

VTVGLSVCLI ALLVALAFVC WRKIKQSCEE ENAGAEDQDGEGEGSKTALQ

PLKHSDSKED DGQEIA

La secuencia de ADNc que codifica la forma "2Ig" de B7-H3 humano es (SEQ ID NO: 2):

atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca ctgtggttct gcctcacagg agccctggag gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccggggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcgt cctgcgggtg gtgctgggtg cgaatggcac ctacagctgc ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacggct ctgtcaccat cacagggcag cctatgacat tccccccaga ggccctgtgg gtgaccgtgg ggctgtctgt ctgtctcatt gcactgctgg tggccctggc tttcgtgtgc tggagaaaga tcaaacagag ctgtgaggag gagaatgcag gagctgagga ccaggatggg gagggagaag gctccaagac agccctgcag cctctgaaac actctgacag caaagaagat gatggacaag aaatagcc

La secuencia de aminoácidos de la forma "2Ig" de B7-H3 humano (SEQ ID NO: 1) (que se muestra en negrita y subrayado a continuación) está completamente incluida en la forma "4Ig" de B7-H3 humano (SEQ ID NO: 76):

MLRRRGSPGM GVHVGAALGA LWFCLTGALE VQVPEDPWA LVGTDATLCC

SFSPEPGFSL AQLNLIWQLT DTKQLVHSFA EGQDQGSAYA NRTALFPDLL

AQGNASLRLQ RVRVADEGSF TCFVSIRDFG SAAVSLQVAA PYSKPSMTLE

PNKDLRPGDT VTITCSSYQG YPEAEVFWQD GQGVPLTGNV TTSQMANEQG

LFDVHSILRV VLGANGTYSC LVRNPVLQQD AHSSVTITPQ RSPTGAVEVQ

VPEDPWALV GTDATLRCSF SPEPGFSLAQ LNLIWQLTDT KQLVHSFTEG

RDQGSAYANR TALFPDLLAQ GNASLRLQRV RVADEGSFTC FVSIRDFGSA

AVSLQVAAPY SKPSMTLEPN KDLRPGDTVT ITCSSYRGYP EAEVFWQDGQ

GVPLTGNVTT SQMANEQGLF DVHSVLRWL GANGTYSCLV RNPVLQQDAH

GSVTITGQPM TFPPEALWVT VGLSVCLIAL LVALAFVCWR KIKQSCEEEN

AGAEDQDGEG EGSKTALQPL KHSDSKEDDG QEIA

La secuencia de ADNc que codifica la forma "4Ig" de B7-H3 humano es (SEQ ID NO: 77); los restos que codifican la forma "2Ig" de B7-H3 se muestran en negrita y subrayados:

atgctgcgtc ggcggggcag ccctggcatg ggtgtgcatg tgggtgcagc cctgggagca ctgtggttct gcctcacagg agccctgqaq gtccaggtcc ctgaagaccc agtggtggca ctggtgggca ccgatgccac cctgtgctgc tccttctccc ctgagcctgg cttcagcctg gcacagctca acctcatctg gcagctgaca gataccaaac agctggtgca cagctttgct gagggccagg accagggcag cgcctatgcc aaccgcacgg ccctcttccc ggacctgctg gcacagggca acgcatccct gaggctgcag cgcgtgcgtg tggcggacga gggcagcttc acctgcttcg tgagcatccg ggatttcggc agcgctgccg tcagcctgca ggtggccgct ccctactcga agcccagcat gaccctggag cccaacaagg acctgcggcc aggggacacg gtgaccatca cgtgctccag ctaccagggc taccctgagg ctgaggtgtt ctggcaggat gggcagggtg tgcccctgac tggcaacgtg accacgtcgc agatggccaa cgagcagggc ttgtttgatg tgcacagcat cctgcgggtg gtgctgggtg caaatggcac ctacagctgc ctggtgcgca accccgtgct gcagcaggat gcgcacagct ctgtcaccat cacaccccag agaagcccca caggagccgt ggaggtccag gtccctgagg acccggtggt ggccctagtg ggcaccgatg ccaccctgcg ctgctccttc tcccccgagc ctggcttcag cctggcacag ctcaacctca tctggcagct gacagacacc aaacagctgg tgcacagttt caccgaaggc cgggaccagg gcagcgccta tgccaaccgc acggccctct tcccggacct gctggcacaa ggcaatgcat ccctgaggct gcagcgcgtg cgtgtggcgg acgagggcag cttcacctgc ttcgtgagca tccgggattt cggcagcgct gccgtcagcc tgcaggtggc cgctccctac

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El procedimiento de "panning" se puede realizar obteniendo una biblioteca de ADNc a partir de tejidos o células que expresan B7-H3, sobreexpresar los ADNc en un segundo tipo de célula, y seleccionar las células transfectadas del segundo tipo de célula para una unión específica a B7-H3. En la técnica se pueden encontrar descripciones detalladas de los métodos utilizados en la clonación de genes de mamíferos que codifican proteínas de la superficie celular mediante "panning' (véase, por ejemplo, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency Co S Cell Expression System", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 84:8573-8577 y Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation", Endocrinol. 140:5841-5854).

ADNc que codifica anticuerpos anti-B7-H3 y otros agonistas del péptido B7-H3, se pueden obtener antagonistas y moduladores mediante la transcripción inversa de los ARNm de un tipo de célula particular de acuerdo con métodos estándar en la técnica. De manera específica, el ARNm puede aislarse utilizando varias enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook et al., citado anteriormente o se extraen mediante resinas de unión a ácidos nucleicos disponibles siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes (p. ej., Qiagen, Invitrogen, Promega). Los ADNc sintetizados se introducen después en un vector de expresión para producir el anticuerpo o proteína de interés en células de un segundo tipo. Esto implica que un vector de expresión debe ser replicable en las células hospedadoras como episomas o como parte integral del ADN cromosómico. Vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, plásmidos, vectores víricos, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y cósmidos.

Los vectores que contienen polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula hospedadora por cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.

Cualquier célula hospedadora capaz de sobreexpresar ADN heterólogos puede usarse con el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células COS, HeLa y CHO. Preferentemente, las células hospedadoras expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente 10 veces mayor, incluso más preferentemente 20 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo o proteína endógena de interés, si están presentes, en las células hospedadoras. La selección de las células hospedadoras en busca de una unión específica a B7-H3 se realiza mediante un inmunoensayo o FACS. Puede identificarse una célula que sobreexpresa el anticuerpo o la proteína de interés.

También están disponibles varias técnicas que ahora pueden emplearse para producir agonistas, antagonistas y moduladores de péptido B7-H3 mutantes que codifican para adiciones, deleciones o cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante en relación con la molécula agonista, antagonista o moduladora del péptido B7-H3 original.

También se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de la presente invención. Los polipéptidos se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse mediante degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión) como se describe anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente mediante síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, podría producirse un polipéptido anti-B7-H3 mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado empleando el método de fase sólida.

IV. Métodos para el cribado de polipéptidos y anticuerpos monoclonales

Pueden usarse varios métodos para seleccionar polipéptidos y anticuerpos monoclonales que se unen a B7-H3. Se entiende que "unión" se refiere a una unión específica biológica o inmunológicamente relevante, y no se refiere a una unión no específica que pueda ocurrir, por ejemplo, cuando se usa una inmunoglobulina en una concentración muy alta contra una diana no específica. En una realización, los anticuerpos monoclonales se criban para determinar su unión a B7-H3 usando técnicas de cribado estándar. De esta manera, se obtuvo el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3. Los hibridomas preferidos son los que producen anticuerpos BRCA69D, BRCA84D o PRCA157.

Se pueden identificar anticuerpos monoclonales adicionales que se unen a B7-H3. Para este propósito, los anticuerpos monoclonales se analizan por su capacidad diferencial para unirse a tejidos cancerosos pero no a células no cancerosas. En una realización, se seleccionan los anticuerpos monoclonales que se unen a B7-H3 y que también presentan reactividad cruzada con células o tejidos cancerosos humanos, pero no a células o tejidos normales en el mismo grado. Un método que puede emplearse para el cribado es la inmunohistoquímica (IHC). Las técnicas inmunohistoquímicas estándar son conocidas por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, ANIMAL CELL CULTURE METHODS (J.P. Mather and D. Barnes, eds., Academic Press, NY, Vol. 57, capítulos 18 y 19, págs. 314 350, 1998). Pueden obtenerse muestras biológicas (por ejemplo, tejidos) de biopsias, autopsias o necropsias. Para determinar si B7-H3 está presente solo en células cancerosas, se pueden usar anticuerpos anti-B7-H3 para detectar la presencia de B7-H3 en tejidos de individuos con cáncer mientras que otros tejidos no cancerosos del individuo que padece cáncer o tejidos de individuos sin cáncer se usan como control. El tejido puede embeberse en una sustancia sólida o semisólida que evite el daño durante la congelación (por ejemplo, gel de agarosa u OCT) y luego se diseccionan para tinción. Se pueden usar cánceres de diferentes órganos y de diferentes grados para detectar anticuerpos monoclonales. Los ejemplos de tejidos que se pueden usar con fines de detección incluyen, entre otros, el ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñón, piel, tiroideo, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, hueso, tracto digestivo superior y páncreas. Los ejemplos de diferentes tipos de cáncer que se pueden usar con fines de detección incluyen, pero sin limitación, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, adenosarcomas, linfomas y leucemias.

En otra alternativa más, líneas de células cancerosas como HMEC (BioWhittaker CC-2251), HUVEC (células endoteliales primarias), BT-474 (n.° de ATCC HTB-20), MCF7 (n.° de ATCC HTB22), MDA-MB-175-VII (n.° de ATCC HB-25), MDA-MB-361 (n.° de ATCC HB-27), SKBR3 (n.° de ATCC HTB-30), A549 (n.° de ATCC CCL-185), Calu-3 (n.° de ATCC HTB-55), SKMES-I (n.° de ATCC HTB-58), ES-2 (n.° de ATCC CRL-1978), SKOV3 (n.° de ATCC HTB-77), Panc-1 (n.° de ATCC CRL-1469), AsPC-I (n.° de ATCC CRL-1682), HPAF-II (n.° de ATCC CRL-1997), Hs700T (n.° de ATCC HTB-174), Colo205 (n.° de ATCC CCL-222), HT-29 (n.° de ATCC HTB-38), SW480 (n.° de ATCC CCL-228), SW948 (n.° de ATCC CCL-237), 293 (n.° de ATCC CRL-1573), 786-O (n.° de ATCC CRL-1932), A498 (n.° de ATCC HTB-44), Caki-2 (n.° de ATCC HTB-47), COS-7 (n.° de ATCC CRL-1651), RL-65 (n.° de ATCC CRL-10345), SV-T2 (n.° de ATCC CCL-163.1), 22RV1 (n.° de ATCC CRL-2505), DU145 (n.° de ATCC HTB-81), LNCaP (n.° de ATCC CRL-1740), PC-3 (n.° de ATCC CRL-1435), HT29 (n.° de ATCC HTB-38), Hs746T (n.° de ATCC HTB-135), NCI-N87 (n.° de ATCC CRL-5822) y se pueden usar células normales de sus respectivos tejidos para seleccionar anticuerpos monoclonales que son específicos para tejido canceroso. Se pueden usar cultivos celulares primarios o de bajo pasaje que provienen de tejidos normales de diferentes órganos, incluidos, entre otros, riñón, ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñón, piel, tiroides, músculo liso aórtico y células endoteliales como controles negativos. Las células cancerosas o no cancerosas se pueden cultivar en portaobjetos de vidrio o cubreobjetos, o en superficies de plástico, o se pueden preparar en un dispositivo CellArray™, tal como se describe en el documento WO 01/43869, y cribarse para determinar la unión del anticuerpo usando IHC como se describió anteriormente para los tejidos. Como alternativa, las células pueden eliminarse de la superficie de crecimiento utilizando medios no proteolíticos y centrifugarse en un sedimento, que luego se embebe y se trata como tejidos para el análisis IHC como se describe anteriormente. Las células pueden inocularse en animales inmunodeficientes, se deja crecer un tumor, y luego se puede extraer este tumor, se embebe y se utiliza como fuente de tejido para análisis IHC. En otra alternativa, las células individuales pueden cribarse incubando con el anticuerpo primario, un anticuerpo secundario "indicador" ligado a una molécula fluorescente y luego se analiza usando una máquina de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Se puede utilizar cualquiera de varios sistemas de detección diferentes para detectar la unión de anticuerpos a la sección de tejido. Normalmente, la inmunohistoquímica implica la unión de un anticuerpo primario al tejido y luego se generó un anticuerpo secundario reactivo contra la especie a partir del anticuerpo primario y se conjugó con un marcador detectable (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, HRP o diaminobenzedina, DAB). Un método alternativo que puede usarse son los anticuerpos complementarios policlonales de imagen especular o polyMICA™ (anticuerpos policlonales complementarios de imagen especular; The Binding Site Limited, Birmingham, Reino Unido; Mangham, D.C. et al. (1999) "A Novel Immunohistochemical Detection System Using Mirror Image Complementary Antibodies (MICA)", Histopathology 35(2):129-33). La técnica PolyMICA™ puede usarse para probar la unión de anticuerpos primarios (por ejemplo, anticuerpos anti-B7-H3) al tejido normal y canceroso. Hay varios tipos de kits de detección polyMICA™ disponibles comercialmente: el producto N.° HK004.D es un kit de detección polyMICA™ que utiliza cromógeno DAB; el producto N.° HK004.A es un kit de detección polyMICA™ que utiliza cromógeno AEC. Como alternativa, el anticuerpo primario puede marcarse directamente con el marcador detectable.

La primera etapa en el cribado IHC para seleccionar un anticuerpo apropiado es la unión de anticuerpos primarios producidos en ratones (por ejemplo, anticuerpos anti-B7-H3) a uno o más inmunógenos (por ejemplo, células o muestras de tejido). En una realización, la muestra de tejido son secciones de tejido congelado de diferentes órganos. Las células o muestras de tejido pueden ser cancerosas o no cancerosas.

Se pueden preparar tejidos congelados, se diseccionan, con o sin fijación, y se realiza la IHC mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos por alguien familiarizado con la técnica (véase, por ejemplo, Stephan et al. (1999) "Distribution And Function Of The Adhesion Molecule BEN During Rat Development", Dev. Biol. 212:264-277 y Stephan et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation", Endocrinology 140:5841-5854).

V. Métodos de caracterización de anticuerpos anti-B7-H3

Se puede utilizar cualquiera de varios métodos para caracterizar los anticuerpos anti-B7-H3. Un método consiste en identificar el epítopo al que se une. El mapeo de epítopos está disponible comercialmente de varias fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Lelystad, Países Bajos). El mapeo de epítopos se puede usar para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo anti-B7-H3. El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un solo tramo de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción tridimensional de aminoácidos que no necesariamente pueden estar contenidos en un solo tramo.

Pueden aislarse o sintetizarse péptidos de diferentes longitudes (por ejemplo, preferentemente de al menos 4-6 aminoácidos de longitud) (por ejemplo, de forma recombinante) y usarse para ensayos de unión con el anticuerpo anti-B7-H3. El epítopo al que se une el anticuerpo anti-B7-H3 se puede determinar en un cribado sistemático utilizando péptidos solapantes que provienen de la secuencia extracelular y determinando la unión por el anticuerpo anti-B7-H3.

Otro método que se puede usar para caracterizar un anticuerpo anti-B7-H3 es usar ensayos de competencia con otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno, es decir, B7-H3 para determinar si los anticuerpos anti-B7-H3 se unen al mismo epítopo que otros anticuerpos. Pueden estar disponibles ejemplos de anticuerpos comercialmente disponibles para B7-H3 y pueden identificarse usando los ensayos de unión que se enseñan en el presente documento. Los expertos en la técnica conocen bien los ensayos de competición, y dichos procedimientos y datos ilustrativos se detallan con más detalle en los Ejemplos. Los anticuerpos anti-B7-H3 pueden caracterizarse adicionalmente por los tejidos, el tipo de cáncer o el tipo de tumor al que se unen.

Otro método para caracterizar los anticuerpos anti-B7-H3 es por el antígeno al que se une. Se utilizaron anticuerpos anti-B7-H3 en análisis por transferencia de Western con lisados celulares de varios cánceres humanos. Como sabe un experto en la materia, el análisis por transferencia de Western puede implicar la ejecución de lisados celulares y/o fracciones celulares en un gel desnaturalizante o no desnaturalizante, transfiriendo las proteínas al papel de nitrocelulosa y luego probando la transferencia con un anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo anti-B7-H3) para ver qué proteínas están unidas por el anticuerpo. B7-H3 está asociado con varios cánceres humanos de diferentes tejidos que incluyen, pero sin limitación a colon, mama, ovario, páncreas y pulmón.

VI. Métodos para diagnosticar el cáncer utilizando anticuerpos anti-B7-H3 y moduladores de B7-H3

Los anticuerpos monoclonales para B7-H3 elaborados mediante los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de células cancerosas en una variedad de tejidos, incluyendo, pero sin limitación, ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñón, páncreas, piel, tiroideo, cerebro, corazón, hígado, estómago, nervios, vasos sanguíneos, hueso y tracto digestivo superior, para fines de diagnóstico. Los anticuerpos monoclonales para B7-H3 elaborados mediante los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de células cancerosas o el nivel de las mismas, que circulan en la sangre después de su liberación desde un tumor sólido. Dicho antígeno en circulación puede ser un antígeno B7-H3 intacto, o un fragmento del mismo que conserva la capacidad de ser detectado según los métodos enseñados en el presente documento. Tal detección se puede realizar mediante análisis FACS usando métodos estándar comúnmente usados en la técnica.

Estos usos pueden implicar la formación de un complejo entre B7-H3 y un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales anti-B7-H3 producidos por los hibridomas BRCA84D, BRCA69D y PRCA157. La formación de tal complejo puede ser in vitro o in vivo. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 puede unirse a B7-H3 a través del dominio extracelular de B7-H3 y luego puede internalizarse.

En una realización preferida de los métodos de diagnóstico de la presente invención, el anticuerpo lleva un marcador detectable. Los ejemplos de marcadores que pueden usarse incluyen un agente radiactivo o un fluoróforo, tales como ficoeritrina o isotiocianato de fluoresceína (también conocido como fluoroisotiocianato o FITC).

Al igual que con otros anticuerpos conocidos utilizados comercialmente con fines diagnósticos y terapéuticos, el antígeno diana de la presente invención se expresa ampliamente en tejido normal. También está regulado positivamente en algunos tumores. Por lo tanto, las dosis y las vías de administración particulares de los anticuerpos de la presente invención, tal como se usan para agentes de diagnóstico o terapéuticos, se adaptarán al tumor particular o al estado de enfermedad en cuestión, así como al individuo en particular que está siendo tratado.

Un método de utilizar los anticuerpos para el diagnóstico es la formación de imágenes in vivo del tumor mediante la unión del anticuerpo a un agente radioactivo o radiopaco, administrando el anticuerpo al individuo y usando una radiografía u otra máquina de obtención de imágenes para visualizar la localización del anticuerpo marcado en la superficie de las células cancerosas que expresan el antígeno. El anticuerpo se administra a una concentración que promueve la unión en condiciones fisiológicas.

Las técnicas in vitro para la detección de B7-H3 son rutinarias en la técnica e incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), inmunoprecipitaciones, inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA) y análisis por transferencia de Western.

Los métodos de obtención de imágenes radioeléctricas de tumores o neoplasias, o de medición de la eficacia de un método de tratamiento con un anticuerpo radiomarcado, puede comprender la etapa de administrar un anticuerpo específico de tumor radiomarcado contra un individuo siguiendo la práctica descrita en el presente documento. El anticuerpo radiomarcado puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal que comprende un radiomarcaje, preferentemente seleccionado del grupo que consiste en Tecnecio-99m, Indio-111, Yodo-131, Renio-186, Renio-188, Samario-153, Lutecio-177, Cobre-64, Escandio-47, Itrio-90. Los anticuerpos monoclonales marcados con radionúclidos terapéuticos como Yodo-131, Renio-188, Holmio-166, Samario-153 y Escandio-47, que no comprometen la inmunorreactividad de los anticuerpos y no se degraden in vivo, son especialmente preferidos. El experto en la técnica apreciará que se conocen otros isótopos radiactivos y que pueden ser adecuados para aplicaciones específicas. La radiografía se puede realizar mediante tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía de emisión de positrones (TEP), tomografía por computadora (TC) o imágenes por resonancia magnética (IRM). Las imágenes correlativas, que permiten una mayor definición anatómica de la localización de metástasis localizadas por radioinmunoimagen, también se contemplan.

En otros métodos, las células cancerosas se eliminan y el tejido se prepara para inmunohistoquímica mediante métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, incrustación en un compuesto de congelación, congelación y disección, con o sin fijación; fijación y embebido en parafina con o sin varios métodos de recuperación de antígeno y contratinción). Los anticuerpos monoclonales también pueden usarse para identificar células cancerosas en diferentes etapas de desarrollo. Los anticuerpos también pueden usarse para determinar qué tumores de individuos expresan el antígeno en su superficie a un nivel predeterminado y, por lo tanto, son candidatos para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra dicho antígeno. Los anticuerpos pueden reconocer cánceres tanto primarios como metastatizantes que expresan B7-H3. Tal como se utiliza en el presente documento, la detección puede incluir detección cualitativa y/o cuantitativa y puede incluir comparar el nivel medido con una célula normal para un mayor nivel de expresión de B7-H3 en células cancerosas.

También se describen métodos para ayudar al diagnóstico de cáncer caracterizado por células cancerosas que expresan B7-H3 en un individuo usando cualquier anticuerpo que se una a B7-H3 y cualquier otro método que pueda usarse para determinar el nivel de expresión de B7-H3. Tal como se utiliza en el presente documento, métodos para "ayudar al diagnóstico" significa que estos métodos ayudan a hacer una determinación clínica con respecto a la clasificación, o la naturaleza, del cáncer, y pueden o no ser concluyentes con respecto al diagnóstico definitivo. Por consiguiente, un método para ayudar al diagnóstico de cáncer puede comprender la etapa de detectar el nivel de B7-H3 en una muestra biológica del individuo y/o determinar el nivel de expresión de B7-H3 en la muestra. Los anticuerpos que reconocen el antígeno o una parte del mismo también se pueden usar para crear inmunoensayos de diagnóstico para detectar el antígeno liberado o secretado de células cancerosas vivas o moribundas en los fluidos corporales, incluyendo, pero sin limitación, sangre, saliva, orina, líquido pulmonar o líquido ascítico.

No todas las células en un tumor de interés particular expresarán B7-H3, y las células cancerosas en otros tejidos pueden expresar B7-H3, por lo tanto, se debe examinar a un individuo para detectar la presencia o ausencia de B7-H3 en células cancerosas para determinar la utilidad de la inmunoterapia en el individuo. Los anticuerpos anti-B7-H3 preparados mediante los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para determinar si un individuo diagnosticado con cáncer puede considerarse candidato para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra B7-H3. En una realización, se puede analizar un tumor canceroso o una muestra de biopsia para determinar la expresión de B7-H3, utilizando anticuerpos dirigidos contra B7-H3. Los individuos con células cancerosas que expresan B7-H3 son candidatos adecuados para inmunoterapia usando anticuerpos dirigidos contra B7-H3. La tinción con anticuerpo anti-B7-H3 también se puede usar para distinguir tejidos cancerosos de tejidos normales.

Los métodos de uso de anticuerpos anti-B7-H3 con fines de diagnóstico son útiles tanto antes como después de cualquier forma de tratamiento contra el cáncer, por ejemplo, quimioterapia o radioterapia, para determinar qué tumores tienen más probabilidades de responder a un tratamiento determinado, pronóstico para individuos con cáncer, subtipo de tumor u origen de la enfermedad metastásica y progresión de la enfermedad o respuesta al tratamiento.

Las composiciones de la presente invención también son adecuadas para el diagnóstico de enfermedades distintas del cáncer, utilizando los métodos descritos en general anteriormente en su aplicación con otras células enfermas (no cancerosas). Las patologías adecuadas para su uso en los métodos de documento incluyen, pero sin limitación, enfermedades o trastornos asociados con respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos. Los métodos descritos anteriormente pueden usarse para modular respuestas inflamatorias o autoinmunes en individuos. Las enfermedades y afecciones que resultan de la inflamación y los trastornos autoinmunes que pueden estar sujetos a diagnóstico y/o tratamiento usando las composiciones y métodos del presente documento incluyen, a modo de ilustración y no de limitación, esclerosis múltiple, meningitis, encefalitis, ictus, otros traumatismos cerebrales, enfermedad inflamatoria del intestino que incluye colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn, miastenia grave, lupus, artritis reumatoide, asma, diabetes aguda de inicio juvenil, demencia por SIDA, ateroesclerosis, nefritis, retinitis, dermatitis atópica, psoriasis, isquemia miocárdica y lesión pulmonar aguda mediada por leucocitos.

Otras indicaciones más para el uso diagnóstico y/o terapéutico de anticuerpos y otros agentes terapéuticos descritos en el presente documento incluyen la administración a individuos con riesgo de rechazo de órganos o injertos. En los últimos años se ha producido un notable aumento en la eficacia de las técnicas quirúrgicas para trasplantar tejidos y órganos tales como la piel, riñón, hígado, corazón, pulmón, páncreas y médula ósea. Quizás, el principal problema más notable es la falta de agentes satisfactorios para inducir inmunotolerancia en el receptor del aloinjerto o del órgano trasplantado. Cuando células u órganos alogénicas se trasplantan a un hospedador (es decir, el donante y el aceptor son individuos diferentes de la misma especie), es probable que el sistema inmunitario del hospedador organice una respuesta inmunitaria hacia los antígenos extraños en el trasplante (enfermedad del hospedador frente al injerto) que conduce a la destrucción del tejido trasplantado.

Los usos descritos en cualquier parte de la presente solicitud para los anticuerpos anti-B7-H3 también abarcan el uso de otros agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 como se describe en el presente documento. En dichas realizaciones, el anticuerpo de B7-H3 se sustituye por el agonista, antagonista de B7-H3 u otro modulador no de anticuerpo que no sea de anticuerpo en las etapas descritas, y se realizan alteraciones dentro del alcance del médico habitualmente experto para adaptar el método a la composición moduladora de B7-H3 sustituida.

Los anticuerpos monoclonales para B7-H3 elaborados mediante los métodos desvelados en el presente documento se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de células madre cancerosas humanas en una variedad de tejidos. Se ha planteado la hipótesis de que las células madre cancerosas (CMC) desempeñan un papel en el crecimiento tumoral y la metástasis (Ghotra, V.P. et al. (2009) "The Cancer Stem Cell Microenvironment And AntiCáncer Therapy", Int. J. Radiat. Biol. 85(11):955-962; Gupta, P.B. et al. (2009) "Cáncer Stem Cells: Mirage Or Reality?" Nat. Med. 15(9):1010-1012; Lawson, J.C. et al. (2009) "Cancer Stem Cells In Breast Cancer And Metastasis", Breast Cancer Res. Treat. 118(2):241-254; Hermann, P.C. et al. (2009) "Pancreatic Cancer Stem Cells--Insights And Perspectives", Expert Opin. Biol. Ther. 9(10):1271-1278; Schatton, T. et al. (2009) "Identification And Targeting Of Cancer Stem Cells", Bioessays 31(10):1038-1049; Mittal, S. et al. (2009) "Cancer Stem Cells: The Other Face Of Janus", Amer. J. Med. Sci. 338(2): 107-112; Alison, M.R. et al. (2009) "Stem Cells And Lung Cancer: Future Therapeutic Targets?" Expert Opin. Biol. Ther. 9(9):1127-1141; Charafe-Jauffret, E. et al. (2009) "Breast Cancer Stem Cells: Tools And Models To Rely On", BMC Cancer 9:202; Scopelliti, A. et al. (2009) "Therapeutic Implications Of Cancer Initiating Cells", Expert Opin. Biol. Ther. 9(8):1005-1016; la Publicación PCT WO 2008/091908). Bajo esta hipótesis, las CMC proporcionan un pequeño, subconjunto distinto de células dentro de cada tumor que son capaces de autorrenovación indefinida y de convertirse en células tumorales más adultas que tienen una capacidad de replicación relativamente limitada. Se ha planteado la hipótesis de que estas células madre cancerosas podrían ser más resistentes a los agentes quimioterapéuticos, a la radiación u otras condiciones tóxicas, y por lo tanto, persisten después de las terapias clínicas y luego se convierten en tumores secundarios, metástasis o son responsables de la recaída. Se ha sugerido que las CMC pueden surgir de células madre tisulares "normales" o de células progenitoras tisulares más diferenciadas.

Las células madre de cáncer humano tienen varias características definitorias. Tales características se describen en la publicación PCT WO 2008/091908. Los anticuerpos monoclonales contra las dianas de la superficie celular en las células madre cancerosas se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de células madre cancerosas en una variedad de tejidos. Los anticuerpos monoclonales para B7-H3 elaborados mediante los métodos desvelados en el presente documento también se pueden usar para identificar la presencia o ausencia de células madre cancerosas, o el nivel de células madre cancerosas en una muestra o tejido o en circulación después de su liberación de un tumor sólido. Dicho antígeno en circulación puede ser un antígeno B7-H3 intacto, o un fragmento del mismo que conserva la capacidad de ser detectado según los métodos enseñados en el presente documento. Tal detección se puede realizar mediante análisis FACS usando métodos estándar comúnmente usados en la técnica. En otra realización, tal detección puede efectuarse mediante análisis inmunohistoquímico de muestras de tejido usando métodos estándar comúnmente usados en la técnica.

Estos usos pueden implicar la formación de un complejo entre B7-H3 y un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 en las células madre cancerosas. Los ejemplos de tales anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, los anticuerpos monoclonales anti-B7-H3 producidos por los hibridomas BRCA84D, BRCA69D y PRCA157. La formación de tal complejo puede ser in vitro o in vivo.

Los usos descritos en la presente solicitud que mencionan su uso para anticuerpos anti-B7-H3 también abarcan el uso de otros agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 como se describe en el presente documento para el uso de identificación y tratamiento de células madre cancerosas. En dichas realizaciones, se utilizan los anticuerpos anti-B7-H3 y otros agonistas, antagonistas y moduladores de B7-H3 para la identificación, el diagnóstico o el tratamiento terapéutico de células madre cancerosas usando métodos similares descritos, y se realizan alteraciones dentro del alcance del médico experto para adaptar el método a la identificación/diagnóstico o tratamiento de células madre cancerosas.

VII. Composiciones preferidas

Se describen composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden anticuerpos anti-B7-H3, polipéptidos que provienen de anticuerpos anti-B7-H3, polinucleótidos que comprenden una secuencia que codifica anticuerpos anti-B7-H3 y otros agentes como se describe en el presente documento. Tal como se utiliza en el presente documento, las composiciones comprenden además uno o más anticuerpos, polipéptidos y/o proteínas que se unen a B7-H3, agonistas, antagonistas, moduladores de B7-H3 y/o uno o más polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican uno o más anticuerpos, polipéptidos y proteínas que se unen a B7-H3.

También se describen conjugados de cualquier agonista, antagonista o modulador del péptido B7-H3, y estructuras químicas adicionales que apoyan la función o funciones previstas del agonista, antagonista o modulador del péptido B7-H3 particular.

Estos conjugados incluyen el agonista, antagonista o modulador del péptido B7-H3 unido covalentemente a una macromolécula como cualquier matriz de soporte sólido insoluble utilizada en procedimientos de diagnóstico, cribado o purificación tratados en el presente documento. Los materiales de matriz adecuados incluyen cualquier sustancia que sea químicamente inerte, tiene una alta porosidad y un gran número de grupos funcionales capaces de formar enlaces covalentes con ligandos peptídicos. Ejemplos de materiales de matriz y procedimientos para la preparación de conjugados matriz-ligando se describen en Dean. et al. (Eds) AFFINITY Ch Ro MATOGRAPHY: A PrACTICAL APPROACH, IRL Press (1985); Lowe, "An Introduction to Affinity Chromatography", en Work et al. (eds) LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 7, Parte II, North-Holland (1979); Porath et al., "Biospecific Affinity Chromatography", en Neurath, H. et al. (eds), THE PROTEINS, 3a ed., Vol.

1, págs. 95-178 (1975); y Schott, H. AFFINITY CHROMATOGRAPHY, Macel Dekker, Inc. NY (1984).

También se describen en el presente documento conjugados de agonista, antagonista o modulador de B7-H3 y cualquier resto indicador usado en los procedimientos de diagnóstico tratados en el presente documento. El agonista, antagonista del péptido B7-H3, o los agentes moduladores, polipéptidos y proteínas, incluyendo los anticuerpos dirigidos contra B7-H3, se identifican y caracterizan además por cualquiera (uno o más) de los siguientes criterios:

(a) una capacidad para unirse específicamente a B7-H3 (y en particular a las moléculas B7-H3 que se expresan en las superficies de las células cancerosas, que incluyen, pero sin limitación, células cancerosas de riñón, próstata o pulmón);

(b) una capacidad para inhibir competitivamente la unión preferencial de un anticuerpo anti-B7-H3 conocido a B7-H3, incluyendo la capacidad de unirse preferentemente al mismo epítopo B7-H3 al que se une preferentemente el anticuerpo original;

(c) una capacidad de unirse a una porción de B7-H3 que está expuesta en la superficie de una célula viva in vitro o in vivo;

(d) una capacidad de unirse a una porción de B7-H3 que está expuesta en la superficie de las células cancerosas vivas que expresa B7-H3;

(e) una capacidad de administrar un agente quimioterapéutico a las células cancerosas (tal como células cancerosas de riñón, próstata o pulmón) que expresan B7-H3 en su superficie; y/o

(f) una capacidad para administrar un agente terapéutico o marcador detectable en células cancerosas (tales como, pero sin limitarse a, células de cáncer de próstata) que expresan B7-H3 en su superficie.

Un anticuerpo preferido presentará tinción IHC diferencial del tejido tumoral en relación con el tejido normal no canceroso, y además será capaz de probar en modelos de primates (y particularmente de mono cinomolgo) la eficacia de los anticuerpos. Los anticuerpos preferidos presentarán adicionalmente niveles deseables de afinidad y especificidad antigénica. Los anticuerpos preferidos presentarán adicionalmente niveles deseables de actividad inmunomoduladora e internalización celular.

En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser un anticuerpo producido por el hibridoma BRCA84D, BRCA69D o PRCA157, o su progenie. También se describen diversas formulaciones de anticuerpos producidos por estos hibridomas depositados y anticuerpos equivalentes o fragmentos polipeptídicos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2 Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de cualquiera de estos o anticuerpos equivalentes que comprenda un antígeno (B7-H3), sitio de reconocimiento de la especificidad requerida. También se describen anticuerpos humanos que muestran una o más de las características biológicas de un miembro de la familia anti-B7-H3. Los anticuerpos equivalentes de la familia anti-B7-H3 (incluidos los anticuerpos humanizados y los anticuerpos humanos), los fragmentos polipeptídicos y los polipéptidos que comprenden cualquiera de estos fragmentos se identifican y caracterizan por cualquiera (uno o más) de los cinco criterios descritos anteriormente. Las secuencias de dominio variable humanizado murinas e ilustrativas de un anticuerpo anti-B7-H3 se proporcionan en la publicación PCT WO 2008/066691.

BRCA84D, BRCA69D y PRCA157 son los anticuerpos B7-H3 preferidos debido a sus perfiles de IHC de tejido normal más claros, diferencial de IHC normal/tumor más fuerte, unión moderada a fuerte (BIACORE ™)/IHC), reactividad cruzada con B7-H3 de monos cinomolgos y potente actividad hacia moléculas DART™ universales ("UDART™ ") en relación con los otros anticuerpos. Las variantes quiméricas y humanizadas de estos anticuerpos preferidos, así como las variantes naturales, quiméricas y humanizadas de estos anticuerpos preferidos que poseen regiones Fc modificadas pueden proporcionarse como se describe a continuación. También se describen moléculas DART™ que poseen las regiones de unión al epítopo de dichos anticuerpos, particularmente en concierto con la(s) región(es) de unión al epítopo que se unen al receptor de linfocitos T, el receptor NKG2D, o un antígeno asociado a un tumor o un hapteno como la fluoresceína (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (también conocido como fluoroisotiocianato o FITC).

En algunas realizaciones, los anticuerpos, los polipéptidos y las proteínas que se unen a B7-H3 son anticuerpos, polipéptidos y proteínas que inhiben competitivamente la unión preferencial de un anticuerpo anti-B7-H3 especificado en el presente documento a B7-H3. En algunas realizaciones, los anticuerpos, los polipéptidos y las proteínas se unen preferentemente al mismo epítopo en B7-H3 como se une preferentemente el anticuerpo mu-anti-B7-H3.

También se describen cualquiera de los siguientes (o composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden cualquiera de los siguientes): (a) un anticuerpo producido por la célula hospedadora con un número de depósito identificado anteriormente o su progenie; (b) una forma humanizada de tal anticuerpo; (c) un anticuerpo que comprende una o más de las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada de dicho anticuerpo; (d) un anticuerpo quimérico que comprende regiones variables homólogas o que provienen de regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de tal anticuerpo, y regiones constantes homólogas o que provienen de regiones constantes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo humano; (e) un anticuerpo que comprende una o más de las CDR de cadena ligera y/o cadena pesada (al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) de dicho anticuerpo; (f) un anticuerpo que comprende una cadena pesada y/o ligera de dicho anticuerpo; (g) un anticuerpo humano que sea equivalente a dicho anticuerpo. Una forma humanizada del anticuerpo puede tener o no c Dr idénticas a ese anticuerpo original, o un anticuerpo producido por una célula hospedadora con un número de depósito identificado anteriormente. La determinación de las regiones CDR está dentro del conocimiento de la técnica. También se describe un anticuerpo que comprende al menos una CDR que es sustancialmente homóloga al menos a una CDR, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos 5 CDR de un anticuerpo producido por uno de los hibridomas depositados identificados anteriormente (o, en algunas realizaciones, sustancialmente homólogo a las 6 CDR de uno de estos anticuerpos, o que proviene de uno de estos anticuerpos), o anticuerpo producido por la célula hospedadora con un número de depósito identificado anteriormente. Otras realizaciones incluyen anticuerpos que tienen al menos dos, tres, cuatro, cinco, o seis CDR(s) que son sustancialmente homólogas al menos a dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado como se identifica en el presente documento, o que proviene de dicho anticuerpo. Se entiende que, a efectos de la presente invención, la especificidad de unión y/o la actividad general (que puede ser en términos de administrar un agente quimioterapéutico a las células cancerosas o dentro de ellas para reducir el crecimiento y/o la proliferación de células cancerosas, inducir la muerte celular apoptótica en la célula cancerosa, retrasar el desarrollo de metástasis y/o tratar paliativamente) generalmente se conserva, aunque el grado de actividad puede variar en comparación con un anticuerpo producido por un hibridoma depositado (puede ser mayor o menor). También se describen métodos para producir cualquiera de estos anticuerpos. Los métodos para preparar anticuerpos son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento.

También se describen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de la invención. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una o más de las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una o más de las CDR de cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende tres CDR de la cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo. En algunas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos del anticuerpo que tiene cualquiera de los siguientes: al menos 5 aminoácidos contiguos de una secuencia del anticuerpo original, al menos 8 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 10 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 20 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 25 aminoácidos contiguos, al menos aproximadamente 30 aminoácidos contiguos, en donde al menos 3 de los aminoácidos son de una región variable del anticuerpo. En una realización, la región variable es de una cadena ligera del anticuerpo original. En otra realización, la región variable es de una cadena pesada del anticuerpo. En otra realización, los 5 (o más) aminoácidos contiguos son de una región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo.

Las células que expresan B7-H3, una porción de B7-H3, los anticuerpos anti-B7-H3 u otros polipéptidos de unión a B7-H3 se pueden administrar directamente a un individuo para modular la actividad biológica de B7-H3 in vivo.

Los anticuerpos anti-B7-H3 preferidos son BRCA84D, BRCA69D y PRCA157, todos los cuales son anticuerpos murinos reactivos frente a la molécula B7-H3 humana. Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos codificantes de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable de BRCA84D, BRCA69D y PRCA157 se muestran a continuación junto con los respectivos dominios de CDR¹, CDR²y CDR³de cada una de esas cadenas. Los expertos en la técnica podrán, por tanto, construir anticuerpos que tengan tales CDR, así como derivados de los mismos, capaces de unirse a los epítopos reconocidos por BRCA84D, BRCA69D y PRCA157.

A. Secuencias de BRCA84D

(1) Secuencias de cadenas ligeras de BRCA84D

Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 3):

DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS

ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS

GTKLEIK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 4):

gacattgcga tgacccagtc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc gtcacctgca aggccagtca gaatgtggat actaatgtag cctggtatca acagaaacca gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa a

CDR¹de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 5): KASQNVDTNVA

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR¹de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 6): aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc

CDR²de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 7): SASYRYS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 8): tcggcatcct accggtacag t

CDR³de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 9): QQYNNYPFT

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena ligera variable BRCA84D (SEQ ID NO: 10): cagcaatata acaactatcc attcacg

(2) Secuencias de cadenas pesadas BRCA84D

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 11):

DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 12):

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca

CDR¹de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 13): FGMH

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR¹de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 14): tttggaatgcac

CDR²de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 15): YISSDSSAIYYADTVK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 16): tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag

CDR³de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 17): GRENIYYGSRLDY

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena pesada variable BRCA84D (SEQ ID NO: 18): gggagggaaaacatttacta cggtagtagg cttgactac

B. Secuencias de BRCA69D

(1) Secuencias de cadenas ligeras de BRCA69D

Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 19):

DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 20):

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcacgat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattgacaa cctggagcaa

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttcctccgac gttcggtgga ggcaccaaac tggaaatcaa a

CDRi de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 21): RASQDISNYLN

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDRi de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 22): agggcaagtc aggacattag taattattta aac

CDR²de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 23): YTSRLHS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 24): tacacatcac gattacactc a

CDR³de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 25): QQGNTLPPT

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena ligera variable BRCA69D (SEQ ID NO: 26): caacagggta atacgcttcc tccgacg

(2) Secuencias de cadenas pesadas BRCA69D

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 27):

QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT

IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG

IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 28):

caggttcagc tccagcagtc tggggctgag ctggcaagac ctggggcttc agtgaagttg tcctgcaagg cttctggcta cacctttact agctactgga tgcagtgggt aaaacagagg cctggacagg gtctggaatg gattgggact atttatcctg gagatggtga tactaggtac actcagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagata aatcctccag cacagcctac atgcaactca gcagcttggc atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaagaggg attccacggc tttggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca

CDR¹de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 29): SYWMQ

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR¹de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 30): agctactgga tgcag

CDR²de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 31): TIYPGDGDTR YTQKFKG

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 32):actatttatc ctggagatgg tgatactagg tacactcag aagttcaagg gc

CDR³de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 33): RGIPRLWYFD V

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena pesada variable BRCA69D (SEQ ID NO: 34): agagggattc cacggctttg gtacttcgat gtc

C. Secuencias de PRCA157

(1) Secuencias de cadenas ligeras de PRCA157

Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 35):

DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN

TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG

GGTNLEIK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 36):

gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga

aactgtcacc attacatgtc gagcaagtga gagtatttac agttatttag

catggtatca gcagaaacag ggaaaatctc ctcagctcct ggtctataat

acaaaaacct taccagaggg tgtgccatca aggttcagtg gcagtggatc

aggcacacag ttttctctga agatcaacag cctgcagcct gaagattttg

ggagatatta ctgtcaacat cattatggta ctcctccgtg gacgttcggt

ggaggcacca acctggaaat caaa

CDRi de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 37): RASESIYSYLA

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDRi de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 38): cgagcaagtg agagtattta cagttattta gca

CDR²de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 39): NTKTLPE

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 40): aatacaaaaa ccttaccaga g

CDR³de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 41): QHHYGTPPW

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena ligera variable PRCA157 (SEQ ID NO: 42): caacatcatt atggtactcc tccgtgg

(2) Secuencias de cadenas pesadas PRCA157

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 43):

EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT

INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD

GGAMDYWGQG TSVTVSS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO:44):

gaggtgcagc aggtggagtc ggggggagac ttagtgaagc ctggagggtc

cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt tcctatggca

tgtcttgggt tcgccagact ccagacaaga ggctggagtg ggtcgcaacc

attaatagtg gtggaagtaa cacctactat ccagacagtt tgaaggggcg

attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctttac ctgcaaatgc

gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgc aagacatgac

gggggagcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a

CDR¹de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 45): SYGMS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR¹de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 46): tcctatggca tgtct

CDR²de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 47): VATINSGGSN TYYPDSLKG

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 48): gtcgcaacca ttaatagtgg tggaagtaac acctactatc cagacagttt gaagggg

CDRa de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 49): HDGGAMDY

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena pesada variable PRCA157 (SEQ ID NO: 50): catgacgggg gagctatgga ctac

D. Anticuerpos B7-H3 diseñados genéticamente con Fc

En la función inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario da lugar a una amplia selección de respuestas, que varían de las funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de mastocitos y la fagocitosis hasta señales inmunomoduladoras, tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie de células especializadas en células hematopoyéticas. La diversidad de las respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos y los complejos inmunitarios se debe a la heterogeneidad estructural de los tres receptores de Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y FcyRIII (CD16) son receptores activadores (es decir, potencian el sistema inmunitario); FcyRIIB (CD32B) es un receptor inhibidor (es decir, atenúa el sistema inmunitario). La secuencia de aminoácidos de la región Fc de IgG1 se muestra a continuación (como SEQ ID NO: 51, numerada de acuerdo con Kabat et al., SEQUENCE OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5a Ed. Public Health Service, NIH, MD (1991) y en lo sucesivo denominado "Kabat EU"):

SEQ ID NO:51

PAPEL LGGPS VFLFPPKPKD TL MISRTPEV TCV WDVSHE DPEVKFNWYV

230 240 250 260 270

DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP

280 290 300 310 320

API EKTI SKA KGQPREPQVY TL PPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV

0000 ^{r n r \ \} u ^\ o/in

J 4U 00 c

-Ju 00 ^c uu 00 ^{n r}

/ u

EWESNGQPEN NYKTT PPVLD SDGSFFLYSK L TVDKSRWQQ GNVFSCSVMH

380 390 400 410 420

EALHNHYTQK SLSLSPGK

430 440

Los restos 230-341 son la región Fc CH2. Los restos 342-447 son la región Fc CH3.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc que tiene una o más modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, deleciones, inserciones) en una o más porciones, cuyas modificaciones aumentan la afinidad y la avidez de la variante de región Fc por un FcyR (incluidos los FcyR activadores e inhibidores). En algunas realizaciones, dichas una o más modificaciones de aminoácidos aumentan la afinidad de la variante de región Fc por FcyRIIIA y/o FcyRIIA. En otra realización, la variante de región Fc se une además específicamente a FcyRIIB con una afinidad menor que la región Fc del anticuerpo parental comparable (es decir, un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el anticuerpo descrito en el presente documento excepto por una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fc). En algunas realizaciones, tales modificaciones aumentan la afinidad de la variante de región Fc por FcyRIIIA y/o FcyRIIA y también mejoran la afinidad de la variante de región Fc por FcyRIIB en relación con el anticuerpo original. En otras realizaciones, dichas una o más modificaciones de aminoácidos aumentan la afinidad de la variante de región Fc por FcyRIIIA y/o FcyRIIA pero no alteran la afinidad de las variantes de regiones Fc por FcyRIIB con respecto a la región Fc del anticuerpo original. En otra realización, dichas modificaciones de uno o más aminoácidos mejoran la afinidad de la variante de región Fc por FcyRIIIA y FcyRIIA pero reducen la afinidad por FcyRIIB en relación con el anticuerpo original. El aumento de afinidad y/o avidez da como resultado una unión detectable a la actividad FcyR o relacionada con FcyR en células que expresan niveles bajos de FcyR cuando la actividad de unión de la molécula original (sin la región Fc modificada) no puede detectarse en las células. En otras realizaciones, la molécula modificada presenta una unión detectable en células que expresan antígenos diana del receptor no FcyR a una densidad de 30.000 a 20.000 moléculas/célula, a una densidad de 20.000 a 10.000 moléculas/célula, a una densidad de 10.000 a 5.000 moléculas/célula, a una densidad de 5.000 a 1.000 moléculas/célula, a una densidad de 1.000 a 200 moléculas/célula o a una densidad de 200 moléculas/célula o menos (pero al menos 10, 50, 100 o 150 moléculas/célula).

En otra realización, dichas una o más modificaciones de los aminoácidos de la región Fc reducen la afinidad y la avidez del anticuerpo por uno o más receptores FcyR. También se describen anticuerpos que comprenden una variante de región Fc, en la que dicha variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc de tipo silvestre, variante de región Fc que solo se une a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIIA. También se describen anticuerpos que comprenden una variante de región Fc, en la que dicha variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc de tipo silvestre, variante de región Fc que solo se une a un FcyR, en donde dicho FcyR es FcyRIIA.

Preferentemente, las propiedades de unión de las moléculas descritas en el presente documento se caracterizan por ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones de células efectoras mediadoras de FcyR (véase la Sección 5.2.7). Las afinidades y las propiedades de unión de las moléculas, por ejemplo, anticuerpos, hacia un FcyR se pueden determinar usando ensayos in vitro (ensayos bioquímicos o inmunológicos) conocidos en la técnica para determinar interacciones anticuerpo-antígeno o Fc-FcyR, es decir, la unión específica de un antígeno a un anticuerpo o la unión específica de una región Fc a un FcyR, respectivamente, incluyendo, pero sin limitación, ensayo de ELISA, ensayo de resonancia de plasmón superficial, ensayos de immunoprecipitación. En la mayoría de las realizaciones preferidas, las moléculas tienen propiedades de unión similares en modelos in vivo (tales como los descritos y desvelados en el presente documento) como aquellos ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye moléculas de la invención que no presenten el fenotipo deseado en los ensayos in vitro, pero que presenten el fenotipo deseado in vivo.

En algunas realizaciones, las moléculas descritas en el presente documento que comprenden una variante de región Fc comprenden al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, que poseen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más modificaciones de aminoácidos) en el dominio CH3 de la región Fc, que se define como que se extiende desde los aminoácidos 342-447. En otras realizaciones, las moléculas descritas en el presente documento que comprenden una variante de región Fc comprenden al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, que poseen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más modificaciones de aminoácidos) en el dominio CH2 de la región Fc, que se define como que se extiende desde los aminoácidos 231-341. En algunas realizaciones, las moléculas descritas en el presente documento comprenden al menos dos modificaciones de aminoácidos (por ejemplo, que posee 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más modificaciones de aminoácidos), en donde al menos una de tales modificaciones está en la región CH3 y al menos una de tales modificaciones está en la región CH2. También se describe la modificación de aminoácidos en la región de bisagra. También se describe la modificación de aminoácidos en el dominio CH1 de la región Fc, que se define como que se extiende desde los aminoácidos 216-230.

También se describen moléculas que comprenden una variante de región Fc en la que dicha variante confiere o tiene una actividad ADCC aumentada y/o una unión aumentada a FcyRIIA (CD32A), según se mide usando métodos conocidos por un experto en la técnica y ejemplificados en el presente documento. Los ensayos de ADCC usados de acuerdo con los métodos de la presente pueden ser dependientes de linfocitos citolíticos naturales o dependientes de macrófagos.

También se describen moléculas que comprenden una variante de región Fc en la que dicha variante confiere o tiene una actividad ADCC aumentada y/o una unión aumentada a FcyRIIIA (CD16A), según se mide usando métodos conocidos por un experto en la técnica y ejemplificados en el presente documento. Los ensayos de ADCC usados de acuerdo con los métodos de la presente pueden ser dependientes de linfocitos citolíticos naturales o dependientes de macrófagos.

Las variantes de Fc pueden combinarse con otras modificaciones de Fc, tales como las descritas en las Patentes de Estados Unidos N.° 7.632.497; 7521542; 7425619; 7416727; 7371826; 7355008; 7335742; 7332581; 7183387; 7122637; y 6.737.056; las publicaciones de PCT N.° WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; y en WO 04/063351; y en Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering therapeutic antibodies for improved function", Biochem. Soc. Trans. 30(4):487-490; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity", J. Biol. Chem. 26;277(30):26733-26740 y Shields, R.L. et al. (2001) "High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R", J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604). También se describe la combinación de una variante de Fc con otras modificaciones de Fc para proporcionar propiedades aditivas, sinérgicas o nuevas del anticuerpo modificado. Preferentemente, las variantes de Fc potencian el fenotipo de la modificación con la que se combinan. Por ejemplo, si una variante de Fc se combina con un mutante que se sabe que se une a FcyRIIIA con una mayor afinidad que una región Fc de tipo silvestre comparable; la combinación con un mutante descrito en el presente documento da como resultado un aumento mayor en la afinidad de FcyRIIIA.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc, en donde la variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, que poseen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más modificaciones de aminoácidos) en relación con una región Fc de tipo silvestre, tal que la molécula tenga una función efectora mejorada en relación con una molécula que comprende una región Fc de tipo silvestre, siempre que la variante de región Fc no tenga o no sea únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 243, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 439. También se describen tales anticuerpos que comprenden una variante de región Fc, en donde la variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido (por ejemplo, que poseen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más modificaciones de aminoácidos) en relación con una región Fc de tipo silvestre, tal que la molécula se una a un FcyR con una afinidad alterada con respecto a una molécula que comprende una región Fc de tipo silvestre, siempre que la variante de región Fc no tenga o no sea únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 243, 255, 258, 267, 269, 270, 276, 278, 280, 283, 285, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 300, 303, 305, 307, 309, 320, 322, 329, 332, 331, 337, 338, 340, 373, 376, 416, 419, 434, 435, 437, 438, 439 y no tenga una alanina en ninguna de las posiciones 256, 290, 298, 312, 326, 333, 334, 359, 360 o 430; una asparagina en la posición 268; una glutamina en la posición 272; una glutamina, serina o ácido aspártico en la posición 286; una serina en la posición 290; una metionina en la posición 301; una metionina, glutamina, ácido glutámico o arginina en la posición 320; un ácido glutámico en la posición 322; una asparagina, serina, ácido glutámico o ácido aspártico en la posición 326; una lisina en la posición 330; una glutamina en la posición 334; un ácido glutámico en la posición 334; una metionina en la posición 334; una histidina en la posición 334; una valina en la posición 334; una leucina en la posición 334; una glutamina en la posición 335; una lisina en la posición 335; o una treonina en la posición 339.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc, en donde la variante de la región Fc comprende tales anticuerpos que comprenden una variante de la región Fc, en donde la variante de la región Fc no tiene o no es únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 320, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 y no tiene una histidina, glutamina o tirosina en la posición 280; una serina, glicina, treonina o tirosina en la posición 290, una asparagina en la posición 294, una lisina en la posición 295; una prolina en la posición 296; una prolina, asparagina, ácido aspártico o valina en la posición 298; o una leucina o isoleucina en la posición 300. También se describen tales anticuerpos que comprenden una variante de región Fc, en donde dicha variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido en relación con una región Fc de tipo silvestre, de tal manera que la molécula se una a un FcyR con una afinidad reducida con respecto a la molécula que comprende una región Fc de tipo silvestre siempre que la variante de región Fc no tenga o no sea únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 243, 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439. También se describen tales anticuerpos que comprenden una variante de región Fc, en donde dicha variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido en relación con una región Fc de tipo silvestre, de tal manera que la molécula se una a un FcyR con una afinidad mejorada con respecto a una molécula que comprende una región Fc de tipo silvestre siempre que la variante de la región Fc no tenga o no sea únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc, en donde la variante de región Fc no incluye o no es únicamente una sustitución en una o más de las posiciones 330, 243, 247, 298, 241, 240, 244, 263, 262, 235, 269 o 328 y no tiene una leucina en la posición 243, una asparagina en la posición 298, una leucina en la posición 241 e isoleucina o una alanina en la posición 240, una histidina en la posición 244, una valina en la posición 330, o una isoleucina en la posición 328.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc con función efectora mejorada y/o afinidades alteradas por receptores activadores y/o inhibidores, en donde la variante de región Fc comprende: (a) cualquiera de 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las siguientes sustituciones: S239D, S298A, A330L, I332E, E333A o k334A; o (b) cualquiera de las combinaciones de sustituciones: (1) S298A, E333A y K334A; (2) S239D y I332E; o (3) S239D, A330L y I332E.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc con función efectora mejorada y/o afinidades alteradas por receptores activadores y/o inhibidores, en donde la variante de región Fc comprende una sustitución:

(1) en la posición 288 con asparagina, en la posición 330 con serina y en la posición 396 con leucina;

(2) en la posición 334 con ácido glutámico, en la posición 359 con asparagina y en la posición 366 con serina;

(3) en la posición 316 con ácido aspártico, en la posición 378 con valina y en la posición 399 con ácido glutámico; (4) en la posición 247 con leucina y una sustitución en la posición 421 con lisina;

(5) en la posición 392 con treonina y en la posición 396 con leucina;

(6) en la posición 221 con ácido glutámico, en la posición 270 con ácido glutámico, en la posición 308 con alanina, en la posición 311 con histidina, en la posición 396 con leucina y en la posición 402 con ácido aspártico;

(7) en la posición 419 con histidina y una sustitución en la posición 396 con leucina;

(8) en la posición 240 con alanina y en la posición 396 con leucina;

(9) en la posición 410 con histidina y en la posición 396 con leucina;

(10) en la posición 243 con leucina, en la posición 305 con isoleucina, en la posición 378 con ácido aspártico, en la posición 404 con serina y en la posición 396 con leucina;

(11) en la posición 255 con isoleucina y en la posición 396 con leucina;

(12) en la posición 370 con ácido glutámico y en la posición 396 con leucina;

(13) en la posición 270 con ácido glutámico;

o

(14) cualquier combinación de las sustituciones (1)-(12) anteriores.

También se describe un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 que comprende una variante de región Fc que comprende la sustitución: F243L, R292P y Y300L. También se describe un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 que comprende una variante de región Fc que comprende la sustitución: L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L. También se describe un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 que comprende una variante de región Fc que comprende la sustitución f243L, R292P, Y300l , V305I y P396L.

También se describe un anticuerpo que se une específicamente a B7-H3 que comprende una variante de región Fc que comprende una sustitución en la posición 396 con leucina, en la posición 270 con ácido glutámico y en la posición

243 con leucina. En otra realización específica, la molécula comprende además una o más modificaciones de aminoácidos como las desveladas en el presente documento.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc con función efectora mejorada y/o afinidades alteradas por receptores activadores y/o inhibidores, que tienen una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 119, 125, 132, 133, 141, 142, 147, 149, 162,

166, 185, 192, 202, 205, 210, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 224, 225, 227, 229, 231, 232, 233, 235,

240, 241, 242, 243, 244, 246, 247, 248, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 258, 261, 262, 263, 268, 269, 270, 272,

274, 275, 276, 279, 280, 281, 282, 284, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 298, 301, 303, 304, 305, 306, 307,

308, 309, 310, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 323, 326, 327, 328, 330, 333, 334, 335, 337, 339, 340,

343, 344, 345, 347, 348, 352, 353, 354, 355, 358, 359, 360, 361, 362, 365, 366, 367, 369, 370, 371, 372, 375, 377,

378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,

402, 404, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 414, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 427, 428, 431, 433,

435, 436, 438, 440, 441,442, 443, 446 o 447. Preferentemente, tales mutaciones dan como resultado moléculas a las que se les ha conferido una función mediada por células efectoras y, opcionalmente, tienen una afinidad alterada por un FcyR según se determina usando métodos desvelados y ejemplificados en el presente documento y conocidos por un experto en la técnica.

También se describen anticuerpos que se unen específicamente a B7-H3 que comprenden una variante de región Fc con función efectora alterada y/o afinidades alteradas por receptores activadores y/o inhibidores, que tiene:

(I) una modificación de aminoácido en una o más de las siguientes posiciones: 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262,

263, 269, 298, 328 o 330 y más preferentemente una o más de las siguientes modificaciones: V240A, V240I, F241L, F243L, P244H, S298n , L328I, A330V; en donde dichos anticuerpos presentan una función efectora alterada con respecto a los anticuerpos que tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación;

(II) una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 268, 269, 270, 272, 276, 278,

283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419,

430, 434, 435, 437, 438 o 439 y más preferentemente una o más de las siguientes modificaciones: D280H, D280Q, D280Y, K290G, K290S, K290T, K290Y, E294N, Q295K, Y296P, S298D, S298N, S298P, S298V, Y300I, Y300L; en donde dichos anticuerpos presentan una función efectora alterada con respecto a los anticuerpos que tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación;

(III) una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 255, 256, 258, 267, 268, 269,

270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 3 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 4 437, 438, 439, y más preferentemente una o más de las siguientes modificaciones: T256A, H268N, E272Q, N286D, N286Q, N286S, K290A, K290S, S298A, R301M, D312A, K320E, K320M, K320Q, K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326N, K326S, A330K, A339T, E333A, K334A, K334E, K334H, K334L, K334M, K334Q, K334V, T335K, T335Q, T359A, K360A, E430A; en donde dichos anticuerpos presentan una función efectora alterada con respecto a los anticuerpos que tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación;

(IV) una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 252, 254, 265, 268, 269, 270,

278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 3 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439; en donde dichos anticuerpos presentan una función efectora reducida con respecto a los anticuerpos que tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación;

(V) una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 280, 283, 285, 286, 290, 294,

295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430; en el que dichos anticuerpos presentan una función efectora mejorada en relación con los anticuerpos que tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación;

o

(VI) una modificación de aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: R255A, T256A, E258A, S267A, H268A, H268N, E272A, E272Q, N276A, D280A, E283A, H285A, N286A, N286D, N286Q, N286S, K290A, K290S, R301M, K320E, K320M, K320Q, K320R, K322E, K326A, K326D, K326E, K326S, A330K, P331A, T335Q, S337A, E430A; en donde dichos anticuerpos presentan una función efectora mejorada en relación con los anticuerpos que

tienen una región Fc de tipo silvestre que carece de dicha modificación.

También se describe el uso de cualquier variante de Fc conocida en la técnica, tal como los desvelados en Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models", Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function", Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement", J. Immunol.

166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma R", J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc", J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4", J. Immunol.

164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies", Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities", Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions", Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains", J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation", Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors", FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo", Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11", Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG", J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG", Nature 332:563-564; las patentes de Estados Unidos n.° 5.624.821; 5885573; 6194551; 7276586; y 7.317.091; y las publicaciones del PCT WO 00/42072 y PCT WO 99/58572.

También se describen moléculas que comprenden variantes de regiones Fc que consisten en o comprenden cualquiera de las mutaciones enumeradas en la tabla siguiente, en la Tabla 1.

continuación

continuación

continuación

continuación

En realizaciones específicas, la variante de región Fc de dichos anticuerpos antiB7-H3 tiene:

(1) una leucina en la posición 247, una lisina en la posición 421 y un ácido glutámico en la posición 270;

(2) una treonina en la posición 392, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270 y una leucina en la posición 243;

(3) una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; (4) una histidina en la posición 419, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270 y una leucina en la posición 243;

(5) una alanina en la posición 240, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270;

(6) una lisina en la posición 255 y una leucina en la posición 396;

(7) una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; (8) una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270 y una lisina en la posición 300;

(9) una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270 y una glicina en la posición 292;

(10) una lisina en la posición 255, una leucina en la posición 396, un ácido glutámico en la posición 270 y una leucina en la posición 243;

(11) un ácido glutámico en la posición 370, una leucina en la posición 396 y un ácido glutámico en la posición 270; (12) un ácido glutámico en la posición 270, un ácido aspártico en la posición 316 y una glicina en la posición 416; (13) una leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una isoleucina en la posición 305 y una leucina en la posición 396;

(14) una leucina en la posición 243, un ácido glutámico en la posición 270, una asparagina en la posición 392 y una leucina en la posición 396;

(15) una leucina en la posición 243, una leucina en la posición 255, un ácido glutámico en la posición 270 y una leucina en la posición 396;

(16) una glutamina en la posición 297; o

(17) cualquier combinación de las sustituciones (1)-(16) anteriores.

En algunas realizaciones, las moléculas comprenden además uno o más sitios de glucosilación, de modo que uno o más restos de carbohidratos se unen covalentemente a la molécula. Preferentemente, las moléculas con uno o más sitios de glicosilación y/o una o más modificaciones en la región Fc confieren o tienen una función efectora mediada por anticuerpos mejorada, por ejemplo, una actividad de ADCC mejorada, en comparación con un anticuerpo original. También se describen moléculas que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos que se sabe directa o indirectamente que interaccionan con un resto de carbohidrato del anticuerpo, incluidos, pero sin limitación, los aminoácidos en las posiciones 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 y 301. En la técnica se conocen aminoácidos que interaccionan directa o indirectamente con un resto de carbohidrato de un anticuerpo, véase, por ejemplo, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7.

También se describen moléculas que se han modificado mediante la introducción de uno o más sitios de glucosilación en uno o más sitios de las moléculas, preferentemente sin alterar la funcionalidad de las moléculas, por ejemplo, la actividad de unión al antígeno diana o FcyR. Se pueden introducir sitios de glicosilación en la región variable y/o constante de las moléculas. Tal como se utiliza en el presente documento, "sitios de glucosilación" incluye cualquier secuencia de aminoácidos específica en un anticuerpo a la que se unirá un oligosacárido (es decir, carbohidratos que contienen dos o más azúcares sencillos unidos entre sí) de forma específica y covalente. Las cadenas laterales de oligosacárido típicamente están unidas a la cadena principal de un anticuerpo a través de enlaces N u O. La N-glucosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a la cadena lateral de un resto de asparagina. La O-glucosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a un hidroxiaminoácido, por ejemplo, serina, treonina. Las moléculas pueden comprender uno o más sitios de glucosilación, incluyendo sitios de N-glucosilación y O-glucosilación. Puede utilizarse cualquier sitio de glucosilación para la glucosilación N-ligada u O-ligada conocido en la técnica. Un ejemplo de sitio de glucosilación N-ligada que es útil es la secuencia de aminoácidos: Asn-X-Thr/Ser, en donde X puede ser cualquier aminoácido y Thr/Ser indica una treonina o una serina. Dicho sitio o sitios pueden introducirse en una molécula usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1983, capítulo 8, págs. 106-116. Un método ilustrativo para introducir un sitio de glicosilación en una molécula puede comprender: modificar o mutar una secuencia de aminoácidos de la molécula de modo que se obtenga la secuencia Asn-X-Thr/Ser deseada.

También se describen métodos para modificar el contenido de carbohidratos de una molécula de la invención mediante la adición o deleción de un sitio de glucosilación. Los métodos para modificar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.218.149; el documento EP 0359096 B1; la publicación de Estados Unidos n.° US 2002/0028486; WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos n.° 2003/0115614; la patente de Estados Unidos N.° 6.218.149; la patente de los Estados Unidos N.° 6.472.511. También se describen métodos para modificar el contenido de carbohidratos de una molécula de la invención mediante la deleción de uno o más restos de carbohidratos endógenos de la molécula. El desplazamiento del sitio de glucosilación de la región Fc de un anticuerpo puede proporcionarse modificando las posiciones adyacentes a 297. También se describe la modificación de la posición 296 de modo que esté glucosilada la posición 296 y no la posición 297.

La función efectora también se puede modificar mediante técnicas tales como la introducción de uno o más restos de cisteína en la región Fc, lo cual permite la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región, obteniéndose como resultado la generación de un anticuerpo homodimérico que puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción de células mediada por el complemento y ADCC (Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies", J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity", J. Immunol. 148(9):2918-2922. Pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con la actividad antitumoral potenciada utilizando agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales tales como los que se describen en Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice", Cancer Research 53:2560-2565. Como alternativa, puede diseñarse mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene regiones Fc dobles y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge", Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

E. DART™ (reactivos de redireccionamiento de afinidad doble) de B7-H3

Tal como se ha analiza anteriormente, también se describen moléculas de "DART™" (reactivo de redireccionamiento de afinidad doble) que comprenden al menos dos cadenas polipeptídicas que forman al menos dos sitios de unión de epítopos, al menos uno de los cuales se une específicamente a B7-H3.

En realizaciones preferidas, la primera cadena polipeptídica del DART™ comprende:

(i) un dominio (A) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una primera inmunoglobulina (VL1) específica de un epítopo (1);

(ii) un dominio (B) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) específica de un epítopo (2); y

(iii) un dominio (C).

La segunda cadena polipeptídica de dicho DART™ comprende:

(i) un dominio (D) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de una segunda inmunoglobulina (VL2) específica del epítopo (2);

(ii) un dominio (E) que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de la primera inmunoglobulina (VH1) específica del epítopo (1); y

(iii) un dominio (F).

Los dominios DART™ (A) y (B) no se asocian entre sí para formar un sitio de unión al epítopo. De manera similar, los dominios DART™ (D) y (E) no se asocian entre sí para formar un sitio de unión al epítopo. En su lugar, los dominios DART™ (A) y (E) se asocian formando un sitio de unión que se une al epítopo (1); dichos dominios DART™ (B) y (D) se asocian formando un sitio de unión que se une al epítopo (2). Los dominios (C) y (F) están asociados covalentemente entre sí.

Cada cadena polipeptídica de la molécula DART™ contiene un dominio VL y un dominio VH, que se unen de manera covalente de modo que se impide el autoensamblaje de los dominios. La interacción de dos de las cadenas polipeptídicas producirá dos apareamientos VL-VH, formando dos sitios de unión al epítopo, es decir, una molécula bivalente. Ni el dominio VH ni el VL están restringidos a una posición dentro de la cadena polipeptídica, es decir, restringidos al extremo amino (N)-terminal o al extremo carboxilo (C)-terminal, ni los dominios están restringidos a sus posiciones relativas entre sí, es decir, el dominio VL puede ser N-terminal respecto al dominio VH y viceversa. La única restricción es que esté disponible una cadena polipeptídica complementaria para formar DART™ funcionales. Cuando los dominios VL y VH se obtienen del mismo anticuerpo, las dos cadenas polipeptídicas complementarias pueden ser idénticas. Por ejemplo, cuando los dominios de unión se derivan de un anticuerpo específico del epítopo A (es decir, el dominio de unión se forma a partir de una interacción VLa-VHa), cada polipéptido comprenderá un VHa y un VLa. La homodimerización de dos cadenas polipeptídicas de anticuerpo producirá la formación de dos sitios de unión VLa-VHa, dando lugar a un anticuerpo monoespecífico bivalente. Cuando los dominios VL y VH se derivan de anticuerpos específicos para diferentes antígenos, la formación de un DART™ biespecífico funcional requiere la interacción de dos cadenas polipeptídicas diferentes, es decir, la formación de un heterodímero. Por ejemplo, para un DART™ biespecífico, una cadena polipeptídica comprenderá un dominio VLa y un VLb; la homodimerización de dicha cadena dará lugar a la formación de dos sitios de unión VLa-VHb, bien de no unión o de unión impredecible. En cambio, cuando dos cadenas polipeptídicas diferentes tienen libertad para interaccionar, por ejemplo, en un sistema de expresión recombinante, comprendiendo una un VLa y un VHb y comprendiendo la otra un VLb y un VHa, se formarán dos sitios de unión distintos: VLa-VHa y VLb-VHb. Para todos los pares de cadenas polipeptídicas DART™, la posibilidad de desalineamiento o la ausencia de unión de las dos cadenas es una posibilidad, es decir, la interacción de los dominios VL-VL o VH-VH; sin embargo, la purificación de los diacuerpos funcionales se controla fácilmente basándose en la inmunoespecificidad del sitio de unión adecuadamente dimerizado usando cualquier método basado en la afinidad conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Una o más de las cadenas polipeptídicas del DART™ pueden comprender opcionalmente un dominio Fc o una parte del mismo (por ejemplo, un dominio CH2 o un dominio CH3). El dominio Fc o parte del mismo puede obtenerse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina incluyendo, pero sin limitación, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio Fc (o parte del mismo) se obtiene de IgG. En realizaciones específicas, el isotipo de IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de los mismos. En una realización, la molécula de diacuerpo comprende un dominio Fc, dominio Fc que comprende un dominio CH2 y un dominio CH3 seleccionados de manera independiente a partir de cualquier isotipo de inmunoglobulina (es decir, un dominio Fc que comprende el dominio CH2 derivado de IgG y el dominio CH3 derivado de IgE, o el dominio CH2 derivado de IgG1 y el dominio CH3 derivado de IgG2, etc.). El dominio Fc puede modificarse por ingeniería para dar una cadena polipeptídica que comprenda una molécula de diacuerpo en cualquier posición respecto a otros dominios o partes de dicha cadena polipeptídica (por ejemplo, el dominio Fc o parte del mismo, puede ser C-terminal para ambos dominios VL y VH del polipéptido de la cadena; puede ser N-terminal para los dominios VL y VH; o puede ser N-terminal a un dominio y c-terminal a otro (es decir, entre dos dominios de la cadena polipeptídica)).

Los dominios Fc de las cadenas polipeptídicas de las moléculas de DART™ preferentemente se dimerizan, dando lugar a la formación de una molécula de DART™ que presenta propiedades de tipo inmunoglobulina, por ejemplo, interacciones Fc-FcyR. Los diacuerpos que comprenden Fc pueden ser dímeros, por ejemplo, compuestos por dos cadenas polipeptídicas, que comprenden cada una un dominio VH, un dominio VL y un dominio Fc. La dimerización de dichas cadenas polipeptídicas da lugar a un DART™ bivalente que comprende un dominio Fc, aunque con una estructura distinta de la del anticuerpo bivalente no modificado. Dichas moléculas de DART™ presentarán fenotipos modificados con respecto a la inmunoglobulina de tipo silvestre, por ejemplo, semivida en suero modificada, propiedades de unión modificadas, etc. En otras realizaciones, las moléculas de DART™ que comprenden dominios Fc pueden ser tetrámeros. Dichos tetrámeros comprenden dos cadenas polipeptídicas 'más pesadas', es decir, una cadena polipeptídica que comprende un dominio VL, un VH y un Fc, y dos cadenas polipeptídicas 'más ligeras', es decir, cadena polipeptídica que comprende un dominio VL y un dominio VH. Las cadenas más ligeras y más pesadas interactúan para formar un monómero, y dichos monómeros interaccionan a través de sus dominios Fc no apareados para formar una molécula de tipo Ig. Dicho DART™ de tipo Ig es tetravalente y puede ser monoespecífico, biespecífico o tetraespecífico.

La formación de una molécula de diacuerpo tetraespecífica como se ha descrito anteriormente requiere la interacción de cuatro cadenas polipeptídicas diferentes. Es difícil lograr dichas interacciones de manera eficaz en un solo sistema de producción recombinante celular, debido a las múltiples variantes de los posibles apareamientos erróneos de las cadenas. Una solución para aumentar la probabilidad de apareamientos erróneos, es modificar por ingeniería mutaciones de tipo "botón en ojal" en los pares de cadenas polipeptídicas deseadas. Dichas mutaciones favorecen la heterodimerización frente a la homodimerización. Por ejemplo, con respecto a las interacciones Fc-Fc, una sustitución de aminoácidos (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un "botón", p. ej., triptófano) se puede introducir en el dominio CH2 o CH3 de manera que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio mutado de manera similar y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se haya modificado por ingeniería genética una mutación complementaria o adaptativa, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichas series de mutaciones pueden modificarse por ingeniería genética en cualquier par de polipéptidos que comprenda la molécula de diacuerpo y, además, modificarse por ingeniería genética en cualquier porción de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de modificación por ingeniería de proteínas para favorecer la heterodimerización frente a la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la ingeniería de moléculas de tipo inmunoglobulina, y se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization", Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library", J. Mol. Biol. 270: 26-35, y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis", J. Immunol. Methods 296:95-101.

También se describen moléculas de diacuerpo que comprenden variantes de dominios Fc o variantes de Fc-bisagra (o parte de los mismos), variante de dominio Fc que comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, inserción, deleción) con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre o dominio bisagra-Fc comparable (o parte de los mismos). Las moléculas que comprenden variantes de dominios Fc o dominios bisagra-Fc (o parte de los mismos) (por ejemplo, anticuerpos) normalmente tienen fenotipos alterados con respecto a moléculas que comprenden dominios Fc de tipo silvestre o dominios Fc-bisagra o partes de los mismos. El fenotipo variante se puede expresar como semivida en suero modificada, una estabilidad modificada, susceptibilidad modificada a enzimas celulares o función efectora modificada según lo determinado en un ensayo dependiente de linfocitos NK o dependiente de macrófagos. Las modificaciones del dominio Fc identificadas como alteración de la función efectora se desvelan anteriormente.

También se describen moléculas que comprenden un dominio bisagra. El dominio bisagra puede derivarse de cualquier isotipo o alotipo de inmunoglobulina, incluyendo IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, el dominio bisagra se deriva de IgG, en el que el isotipo de IgG es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de los mismos. Dicho dominio bisagra puede modificarse por ingeniería para dar una cadena polipeptídica que comprenda la molécula de diacuerpo junto con un dominio Fc de modo que la molécula de diacuerpo comprenda un dominio bisagra-Fc. En determinadas realizaciones, el dominio bisagra y Fc se seleccionan independientemente de cualquier isotipo de inmunoglobulina conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento. En otras realizaciones, el dominio bisagra y Fc están separados por al menos otro dominio de la cadena polipeptídica, por ejemplo, el dominio VL. El dominio bisagra, u opcionalmente, el dominio bisagra-Fc, pueden modificarse por ingeniería para dar un polipéptido en cualquier posición respecto a otros dominios o partes de la cadena polipeptídica. En determinadas realizaciones, una cadena polipeptídica comprende un dominio bisagra, dominio bisagra que está en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica, en el que dicha cadena polipeptídica no comprende un dominio Fc. En otras realizaciones más, una cadena polipeptídica comprende un dominio bisagra-Fc, dominio bisagra-Fc que está en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica. En realizaciones adicionales, una cadena polipeptídica comprende un dominio bisagra-Fc, dominio bisagra-Fc que está en el extremo N-terminal de la cadena polipeptídica.

Cada dominio de la cadena polipeptídica del DART™, es decir, el dominio VL, VH y Fc puede estar separado por un enlazador peptídico. El enlazador peptídico puede tener 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones, la secuencia de enlace de aminoácidos es GGGSGGGG (SEQ ID NO: 52) codificada por la secuencia de ácido nucleico ggaggcggat ccggaggcgg aggc (SEQ ID NO: 53). Las cadenas polipeptídicas de la molécula de DART™ se pueden modificar por ingeniería genética para que comprenda al menos un resto de cisteína que interaccione con un resto de cisteína homólogo de una segunda cadena polipeptídica de DART™ para formar un enlace disulfuro entre cadenas. Dichos enlaces disulfuro entre cadenas servirán para estabilizar la molécula de DART™, mejorando así la expresión y recuperación en los sistemas recombinantes, dando lugar a una formulación estable y sistemática y la mejora de la estabilidad del producto aislado y/o purificado in vivo. El resto de cisteína puede introducirse como un solo aminoácido o como parte de una secuencia de aminoácidos mayor, por ejemplo, un dominio bisagra, en cualquier parte de la cadena polipeptídica. En una realización específica, el resto de cisteína se puede diseñar genéticamente para que se produzca en el extremo C-terminal de la cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGC. En una realización específica, el extremo C-terminal de las cadenas polipeptídicas que comprenden la molécula DART™ comprende la secuencia de aminoácidos LGGC (SEQ ID NO: 54). En otra realización, el resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio bisagra, por ejemplo, EPKSCDKTHTCPP (SEQ ID NO: 55) o ESKYGPPCPS (SEQ ID NO: 56). En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica de la molécula de DART™ comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio bisagra de IgG, por ejemplo, SEQ ID NO:55 o SEQ ID NO:56. En otra realización, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica de una molécula DART ™ comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO:57), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos gttgagccca aatcttgt (SEQ ID NO:58). En otras realizaciones, el resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 59), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos ctgggaggct gcttcaacag gggagagtgt (SEQ ID NO:60). En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica que comprende el DART™ comprende la secuencia de aminoácidos LGGCFNRGEC (SEQ ID NO: 59).

En otras realizaciones más, el resto de cisteína se introduce en la cadena polipeptídica dentro de la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 61), que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos ttcaacaggg gagagtgt (SEQ ID NO: 62). En una realización específica, el extremo C-terminal de una cadena polipeptídica que comprende el DART™ comprende la secuencia de aminoácidos FNRGEC (SEQ ID NO: 61).

En determinadas realizaciones, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende la secuencia de aminoácidos LGGC (SEQ ID NO:54) y están unidas de manera covalente por un enlace disulfuro entre los restos de cisteína en las secuencias LGGC (SEQ ID NO:54). En otra realización específica, la molécula de diacuerpo comprende al menos dos cadenas polipeptídicas, una de las cuales comprende la secuencia FNRGEC (SEQ ID NO:61), mientras que la otra comprende un dominio bisagra (que contiene al menos un resto de cisteína), en donde dichas al menos dos cadenas polipeptídicas están unidas de manera covalente por un enlace disulfuro entre el resto de cisteína de FNRGEC (SEQ ID NO: 61) y un resto de cisteína en el dominio bisagra. En aspectos particulares, el resto de cisteína responsable del enlace disulfuro ubicado en el dominio bisagra es Cys-128 (según la numeración de acuerdo con el sistema Kabat EU; ubicado en el dominio de bisagra de una cadena pesada de IgG intacta no modificada) y el resto de cisteína homólogo en la SEQ ID NO:23 es Cys-214 (numerado según Kabat EU; ubicado en el C-terminal de una cadena ligera de IgG intacta no modificada) (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains", J. Biol. Chem. 280:14402-14412). En otras realizaciones más, el al menos un resto de cisteína se modifica por ingeniería para que se encuentre en el extremo N-terminal de la cadena de aminoácidos. Incluso en otras realizaciones, el al menos un resto de cisteína se modifica por ingeniería para que se encuentre en la parte enlazadora de la cadena polipeptídica de la molécula de diacuerpo. En realizaciones adicionales, el dominio Vh o VL se modifica por ingeniería para que comprenda al menos una modificación de aminoácidos respecto al dominio VH o VL precursor, de modo que la modificación de aminoácidos comprenda una sustitución de un aminoácido precursor por cisteína.

En otro aspecto más de dicha realización, el dominio (C) de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 57), que proviene del dominio bisagra de una IgG humana, y que puede estar codificada por la secuencia de nucleótidos gttgagccca aatcttgt (SEQ ID NO: 58). En otro aspecto de esta realización, el dominio (F) de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 57). En determinados aspectos de dicha realización, el dominio (C) de la primera cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO:61); y el dominio (F) de la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 57) o un dominio de bisagra. En otros aspectos de la dicha realización, el dominio (F) de la segunda cadena polipeptídica comprende los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, FNRGEC (SEQ ID NO:61); y el dominio (C) de la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 57) o un dominio de bisagra.

Como se apreciará en vista de lo anterior, los polipéptidos individuales de un DART™ biespecífico pueden formar dos especies de homodímeros y una especie de heterodímeros. Puede añadirse un polipéptido cargado al extremo C-terminal de uno, o más preferentemente, ambos polipéptidos DART™. Al seleccionar polipéptidos cargados de carga opuesta para los polipéptidos individuales del DART™ biespecífico, la inclusión de tales polipéptidos cargados favorece la formación de heterodímeros y disminuye la formación de homodímeros. Preferentemente, un polipéptido cargado positivamente contendrá un contenido sustancial de arginina, glutamina, histidina y/o lisina (o mezclas de tales aminoácidos) y un polipéptido cargado negativamente contendrán un contenido sustancial de aspartato o glutamato (o una mezcla de tales aminoácidos). Se prefieren particularmente los polipéptidos cargados positivamente que contienen un contenido sustancial de lisina y los polipéptidos cargados negativamente que contienen un contenido sustancial de glutamato. Para maximizar la atracción electrostática entre dichos polipéptidos cargados de manera opuesta, se prefiere emplear polipéptidos capaces de asumir espontáneamente una conformación helicoidal.

Por lo tanto, en una realización preferida, una "hélice E" cargada positivamente se añadirá a uno de los polipéptidos que se utilizan para formar un DART™ biespecífico y se añadirá una "hélice K" cargada negativamente al segundo de los polipéptidos DART™. Una hélice E particularmente preferida tendrá la secuencia: (EVAALEK)4 [es decir (SEQ ID NO:63) EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK]. Una hélice K particularmente preferida tendrá la secuencia: (KVAALKE)4 [es decir (SEQ ID NO:64) KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE].

Un polipéptido DART™ preferido que posea tal hélice E tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio Vh ]-[(EVAALe K)4]-GGGNS, donde VL es el dominio de Ig ligera variable de DART™, GGGS-GGGG es Se Q ID NO: 52, VH es el dominio de Ig pesada variable de DART™, (EVAALEK)4 es SEQ ID NO:63, y GGGNS es SEQ ID NO:65. Un polipéptido DART™ preferido que posea tal hélice K tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(KVAALKE)4]-GGGNS, donde VL es el dominio de Ig ligera variable de DART™, GGGSGGGG es SEQ ID NO:52, VH es el dominio de Ig pesada variable de DART™, (KVAALKE)4 es SEQ ID NO:64, y GGGNS es SEQ ID NO:65.

En una realización adicional, las regiones Fc se pueden unir a las hélices E y/o K de las hélices E o K de los DART™. Es deseable promover la separación entre las regiones Fc y el dominio VH de DART™ de un DART™ que contiene Fc en los casos en los que una disposición menos separada de dichos dominios da como resultado una interacción reducida entre dichos dominios y sus ligandos de unión o interfiere de otro modo con el montaje de DART™. Aunque se pueden emplear separadores de cualquier secuencia de aminoácidos, es preferible emplear separadores que formen bobinas de hélice a, para extender y proyectar al máximo el dominio Fc lejos de los dominios variables. Debido a que los polipéptidos enrollados de carga opuesta descritos anteriormente funcionan adicionalmente para promover la formación de heterodímeros, tales moléculas son separadores particularmente preferidos. Tales moléculas de Fc-DART™ que contienen hélices proporcionan beneficios similares a los de Fc-DARt ™, incluida la mejora de la vida media en suero y el reclutamiento de la función efectora. Los polipéptidos de hélice E y K descritos anteriormente son particularmente preferidos para este propósito. Por lo tanto, en una realización preferida, el DART™ que contiene Fc hélice E tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(EVAALEK)4]-GGG-Dominio FC comenzando con D234 (numeración de Kabat), donde VL es el dominio de Ig ligera variable de DARt ™, GGGSGGGG es SEQ ID NO:52, VH es el dominio de Ig pesada variable de DART™ y (EVAALEK)4 es SEQ ID NO:63. De manera similar, en una realización preferida, el DART™ que contiene Fc de hélice K tendrá la secuencia general: [Dominio VL]-[GGGSGGGG]-[Dominio VH]-[(KVAALKE)4]-GGG-Dominio FC comenzando con D234 (numeración de Kabat), donde VL es el dominio de Ig ligera variable de DART™, GGGSGGGG es SEQ ID NO:51, VH es el dominio de Ig pesada variable de DART™ y (KVAALKE)4 es SEQ ID NO:64.

Como se ha indicado anteriormente, una molécula de DART™ que contiene una hélice o una molécula de DART™ que contiene Fc que contiene una hélice puede contener solo un separador de hélice de este tipo, o puede contener más de uno de estos separadores (por ejemplo, dos separadores, preferiblemente de carga opuesta, de los cuales uno está ligado a cada uno de los dominios VH de los polipéptidos de DART™). Al unir la región Fc a dicha(s) molécula(s) de separación, se mejora la capacidad de hacer versiones bivalentes, tetravalentes, etc. de las moléculas Fc-DART™ mediante intercambio de cadenas. Por tanto, se pueden producir moléculas Fc-DART™ que formen monómeros o dímeros dependiendo de si el dominio Fc está unido a uno o ambos dominios VH de DART™

1. Versatilidad de las moléculas B7-H3 DART™

Los DART™ biespecíficos pueden unirse simultáneamente a dos epítopos separados y distintos. En ciertas realizaciones, los epítopos son del mismo antígeno. En otras realizaciones, los epítopos son de antígenos diferentes. En realizaciones preferidas, al menos un sitio de unión al epítopo es específico de un determinante expresado en una célula efectora inmunitaria (por ejemplo, CD3, CD16, CD32, CD64, receptor de linfocitos T, etc.) que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleares. En una realización, la molécula de DART™ se une al determinante de células efectoras y también activa dicha célula efectora. En este sentido, las moléculas de DART™ pueden presentar una funcionalidad similar a la Ig independientemente de si comprenden además un dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de la función efectora conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC)). En ciertas realizaciones, el DART™ biespecífico de la invención se une tanto a un antígeno del cáncer en una célula tumoral como a un determinante de células efectoras mientras activa dicha célula. En realizaciones alternativas, la molécula biespecífica DART™ o DART™ puede inhibir la activación de una diana, por ejemplo, célula efectora, al unir simultáneamente, y así enlazar, un receptor activador e inhibidor en la misma célula (por ejemplo, une CD32A y CD32B, BCR y CD32b , o IgERI y CD32B) como se describe anteriormente (véase, Sección de antecedentes). En un aspecto más de la presente realización, el DART™ biespecífico puede presentar propiedades antivíricas uniendo simultáneamente dos epítopos neutralizantes en un virus (por ejemplo, epítopos de VRS; epítopos de WNV tales como E16 y E53).

2. Moléculas universales B7-H3 DART ™

En una realización, las moléculas DART™ biespecíficas se pueden construir para comprender un dominio de unión de epítopo que se une específicamente a B7-H3 y un segundo dominio de unión de epítopo que se une específicamente a un hapteno, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (también conocido como fluoroisotiocianato o FITC). Dicho DART™ sirve como adaptador universal ("UDART™"), capaz de coligar B7-H3 con moléculas que interaccionan con los miembros de unión conjugados con fluoresceína. Por ejemplo, el brazo reactivo con FITC del DART™ puede usarse para unirse a un anticuerpo marcado con FITC que está unido a una diana no B7-H3 involucrada en la agrupación intercelular, el reclutamiento intercelular, el reclutamiento libre de células, múltiples dianas, etc. La versión quimérica Fv de ratón/Fc humana del MAb anti-fluoresceína, 4420 puede emplearse como fuente de dominios CDR específicos de FITC (Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli", J. Immunol. 152(11): 5368-5374).

3. Moléculas B7-H3 DART™ específicas de células diana

Las moléculas biespecíficas DART™ ofrecen oportunidades únicas para dirigirse a tipos de células específicos. Por ejemplo, el DART™ o la molécula de DART™ biespecífica puede modificarse por ingeniería para comprender una combinación de sitios de unión al epítopo que reconozcan una serie de antígenos únicos frente a un tipo de célula o tejido diana. Además, cuando cualquiera o ambos antígenos individuales esté/n normalmente separados en otros tipos de tejido y/o célula, es posible usar dominios de unión de baja afinidad con el fin de construir el DART™ o la molécula de DART™. Dichos dominios de unión de baja afinidad serán incapaces de unirse al epítopo o antígeno con suficiente avidez con fines terapéuticos. Sin embargo, cuando están presentes epítopos o antígenos en una sola célula o tejido diana, la avidez del DART™ o la molécula de DART™ hacia la célula o el tejido, con respecto a la célula o al tejido que expresa solo uno de los antígenos, aumentará de modo que la célula o el tejido pueda seleccionarse como diana de manera eficaz. Dicha molécula biespecífica puede presentar una mejor unión a uno o ambos de sus antígenos diana en células que expresen dichos antígenos con respecto a un DART™ monoespecífico o un anticuerpo con una especificidad solo hacia uno de los antígenos.

Por ejemplo, los DART™ específicos de B7-H3 pueden construirse para que comprendan un dominio que sea un ligando de unión para el receptor del Natural Killer Group 2D (NKG2D). El receptor NKG2D se expresa en todos los linfocitos citolíticos naturales humanos (y de otros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA", Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing", Immunity 17(1):19-29) así como en todas las células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8ap T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells", Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing", Immunity 17(1):19-29). Estos ligandos de unión, y particularmente los que no se expresan en células normales, incluyen la molécula de histocompatibilidad 60 (H60), el producto del gen-1 inducible temprano del ácido retinoico (RAE-1) y el transcrito de tipo proteína de unión a UL16 murino 1 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands", Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells", Blood 106:1711-1717). Los ligandos adicionales reactivos con la NKG2D humana incluyen las moléculas polimórficas relacionadas con la cadena del MHC de clase I MICA y MICB (Diefenbach, A. et al. (1999) "Natural Killer Cells: Stress Out, Turn On, Tune In", Curr. Biol. 9(22):R851-R8533; Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA", Science 285(5428):727-729; Stephens, H.A. (2001) "MICA And MICB Genes: Can The Enigma Of Their Polymorphism Be Resolved?" Trends Immunol. 22:378-385. La secuencia de MICA es SEQ ID NO:66:

MGLGPVFLLL AGIFPFAPPG AAAEPHSLRY NLTVLSWDGS VQSGFLTEVH

LDGQPFLRCD RQKCRAKPQG QWAEDVLGNK TWDRETRDLT GNGKDLRMTL

AHIKDQKEGL HSLQEIRVCE 1HEDNSTRSS QHFYYDGELF LSQNLETKEW

TMPQSSRAQT LAMNVRNFLK EDAMKTKTHY HAMHADCLQE LRRYLKSGVV

LRRTVPPMVN VTRSEASEGN ITVTCRASGF YPWNITLSWR QDGVSLSHDT

QQWGDVLPDG NGTYQTWVAT RICQGEEQRF TCYMEHSGNH STHPVPSGKV

LVLQSHWQTF HVSAVAAAAI FVIIIFYVRC CKKKTSAAEG PELVSLQVLD

QHPVGTSDHR DATQLGFQPL MSDLGSTGST EGA

La secuencia de MICB es SEQ ID NO:67:

PHSLRYNLMV LSQDGSVQSG FLAEGHLDGQ PFLRYDRQKR RAKPQGQWAE

DVLGAKTWDT ETEDLTENGQ DLRRTLTHIK DQKGGLHSLQ EIRVCE1HED

SSTRGSRHFY YDGELFLSQN LETQESTVPQ SSRAQTLAMN VTNFWKEDAM

KTKTHYRAMQ ADCLQKLQLP PMVNVICSEV SEGNITVTCR ASSFYPRNIT

LTWRQDGVSL SHNTQQWGDV LPDGNGTYQT WVATRIRQGE EQRFTCYMEH

SGNHGTHPVP SGKALVLQSQ RTDFPYVSAA MPCFVIIIIL CVPCCKKKTS

AAEGP

Como alternativa, las moléculas DART™ pueden construirse para comprender un dominio que es un ligando de unión para el receptor de linfocitos T ("TCR") o para CD3 (el correceptor de linfocitos T). El TCR se expresa de forma nativa por linfocitos T CD4+ o CD8+, y permite que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y se presentan por proteínas del MHC de clase I o clase II de células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de citocinas y a la lisis de la célula presentadora de antígeno (véase, por ejemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes", Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy", Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation", Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes", Am. J. Ther. 12(6):534-550). CD3 es el receptor que se une al TCR (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer", Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex", Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (Epub 12 de octubre de 2009) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity", Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (Epub 9 de junio de 2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy", Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation", Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression", Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).

Al construir tales moléculas DART™ para que comprendan adicionalmente al menos un dominio de unión a epítopo capaz de unirse a, por ejemplo, un receptor presente en la superficie de una célula diana, tales moléculas DART™ serán moléculas DART™ y, por lo tanto, serán capaces de unirse a las células diana y, por lo tanto, harán que las células diana muestren el ligando de unión para el receptor Natural Killer Group 2D (NKG2D) o para el TCR (lo que esté presente en el DART™ unido a la célula diana) (véase, por ejemplo, Germain, C. et al. (2008) "Redirecting NK Cells Mediated Tumor Cell Lysis By A New Recombinant Bifunctional Protein", Prot. Engineer. Design Selection 21(11):665-672). Dichos DART™ se pueden usar para redirigir cualquier célula diana deseada a una célula que sea diana de lisis celular mediada por linfocitos citolíticos naturales o citotoxicidad mediada por linfocitos T. En una realización, el dominio de unión al epítopo del DART™ capaz de unirse a un receptor presente en la superficie de una célula diana es un epítopo que se une a un antígeno asociado al tumor para redirigir dichas células cancerosas a sustratos para la lisis celular mediada por linfocitos citolíticos naturales o citotoxicidad mediada por linfocitos T. De particular interés son los antígenos asociados a tumores que son un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovario, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello uterino, un antígeno de carcinoma de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículo, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una neoplasia maligna de células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con el linfoma no Hodgkin o un antígeno asociado con la leucemia linfocítica crónica.

Los antígenos asociados a tumores adecuados para tal uso incluyen A33 (un antígeno de carcinoma colorrectal; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); CA125 (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81); CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol.

33(2):167-73; CD19 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther.

40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); Cd 56 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); Ce a (antígeno carcinoembrionario; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CTLA4 (Peggs, K.S. et al.

2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13); EGF-R (receptor de factor de crecimiento epidérmico; Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-40; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-38); GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer.

118(1):123-8); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-25); gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); HER-2/neu (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); virus del papiloma humano E6/virus del papiloma humano E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; KSA (17-1A) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C.

2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); N-acetilglucosaminiltransferasa (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); PSA (antígeno específico de próstata; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol.

57(4):301-11); PSm A (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-80); sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther. 1(5):881-91); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-p; o receptor de TNF-y; van Horssen, R. et al. ²⁰⁰⁶Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4): 327-64); o receptor de VEGF (O'Dwyer. P.J. 2006 Oncologist. 11(9):992-8).

Antígenos asociados a tumores adicionales para tal uso (y publicaciones que desvelan anticuerpos específicamente reactivos para tales antígenos) incluyen a Da M-9 (Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2006/0172350; publicación de PCT n.° WO 06/084075); ALCAM (publicación de PCT n.° WO 03/093443); Carboxipeptidasa M (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0166291); CD46 (patente de Estados Unidos n.° 7.148.038; publicación de PCT n.° WO 03/032814); Citoqueratina 8 (publicación de p Ct n.° WO 03/024191); Receptores de efrina (y, en particular, EphA2 (patente de Estados Unidos N.° 7.569.672; publicación de PCT n.° WO 06/084226); Integrina Alfa-V-Beta-6 (publicación de PCT n.° WO 03/087340); JAM-3 (publicación de PCT n.° WO 06/084078); KID3 (publicación de PCT n.° WO 05/028498); KID31 (publicación de PCT n.° WO 06/076584); LUCA-2 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172349; publicación de PCT n.° WO 06/083852); Oncostatina M (receptor de oncostatina beta) (patente de Estados Unidos n.° 7.572.896; publicación de PCT n.° WO 06/084092); PIPA (patente de Estados Unidos n.° 7.405.061; publicación de PCT n.° WO 04/043239); ROR1 (patente de Estados Unidos n.° 5.843.749); y el receptor de transferrina (Patente de Estados Unidos N.° 7.572.895; publicación de PCT N.° WO 05/121179).

También son de interés los antígenos específicos de agentes infecciosos particulares, por ejemplo, agentes víricos que incluyen, pero sin limitación, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis B (HBV), la gripe, el virus del papiloma humano (VPH), el de pie y mano (coxsackievirus), el virus de la rabia, el virus del herpes simple (VHS) y los agentes causantes de la gastroenteritis, incluidos los rotavirus, adenovirus, calicivirus, astrovirus y virus de Norwalk; agentes bacterianos que incluyen, pero sin limitación, E. coli, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumoniae, agentes fúngicos y parásitos como Giardi.

En algunas realizaciones, las moléculas se modifican por ingeniería genética para que comprendan un patrón de glicosilación modificado o una glicoforma modificada con respecto a la parte comparable de la molécula molde. Las glicoformas modificadas por ingeniería pueden ser útiles para diversos fines, incluyendo, pero sin limitación, mejorar la función efectora. Las glicoformas modificadas por ingeniería se pueden generar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia, por ejemplo, usando cepas modificadas por ingeniería o de expresión variable, mediante la expresión conjunta con una o más enzimas, por ejemplo, DI N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), mediante la expresión de un DART™ en diversos organismos o estirpes celulares de diversos organismos, o modificando el/los hidrato/s de carbono después de que el DART™ haya sido expresado y purificado. Los métodos para generar glicoformas modificadas por ingeniería son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, las descritas en Umana et al. (1999) "Engineered Glycoforms Of An Antineuroblastoma IgG1 With Optimized Antibody-Dependent Cellular Cytotoxic Activity, "Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In Adcc Through Higher Affinity For Fc Gamma RIII", Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG1 N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity", J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al. (2003) "The Absence Of Fucose But Not The Presence Of Galactose Or Bisecting N-Acetylglucosamine Of Human IgG1 Complex-Type Oligosaccharides Shows The Critical Role Of Enhancing Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity", J Biol Chem 278:3466-3473) US 6.602.684; USSN 10/277370; USSN 10/113929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, NJ); tecnología de ingeniería de glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zúrich, Suiza). Véase, por ejemplo, WO 00061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al. (2004) "Fucose Depletion From Human IgG1 Oligosaccharide Enhances Binding Enthalpy And Association Rate Between IgG1 And FcGammaRIIIA", JMB, 336: 1239-49.

También se describe la incorporación de aminoácidos no naturales para generar los DART™ descritos en el presente documento. Dichos métodos son conocidos por los expertos en la materia, tales como los que usan la maquinaria biosintética natural para permitir la incorporación de aminoácidos no naturales a proteínas, véase, por ejemplo, Wang et al. (2002) "Expanding The Genetic Code", Chem. Comm. 1: 1-11; Wang et al. (2001) "Expanding The Genetic Code Of Escherichia coli", Science, 292: 498-500; van Hest et al. (2001) "Protein-Based Materials, Toward A New Level Of Structural Control", Chem. Comm. 19: 1897-1904. Las estrategias alternativas se centran en las enzimas responsables de la biosíntesis de aminoacil-ARNt, véase, por ejemplo, Tang et al. (2001) "Biosynthesis Of A Highly Stable Coiled-Coil Protein Containing Hexafluoroleucine In An Engineered Bacterial Host", J. Am. Chem. Soc. 123(44): 11089-11090; Kiick et al. (2001) "Identification Of An Expanded Set Of Translationally Active Methionine Analogues In Escherichia coli", FEBS Lett. 502(1-2):25-30. También se describen métodos para modificar un dominio VL, VH o Fc de una molécula de la invención mediante la adición o deleción de un sitio de glucosilación. Los métodos para modificar los carbohidratos de proteínas son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 6.218.149; el documento EP 0359096 B1; la publicación de Estados Unidos n.° US 2002/0028486; WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos n.° 2003/0115614; la patente de Estados Unidos N.° 6.218.149; la patente de los Estados Unidos N.° 6.472.511.

VIII. Métodos de uso de moduladores B7-H3 y anticuerpos anti-B7-H3 con fines terapéuticos

Los anticuerpos monoclonales de B7-H3 pueden usarse con fines terapéuticos en individuos con cáncer u otras enfermedades. La terapia con anticuerpos anti-B7-H3 puede implicar la formación de complejos tanto in vitro como in vivo tal como se describió anteriormente. En una realización, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 puede unirse y reducir la proliferación de células cancerosas. Se entiende que el anticuerpo se administra a una concentración que promueve la unión a condiciones fisiológicas (por ejemplo, in vivo). En otra realización, los anticuerpos monoclonales contra B7-H3 se pueden usar para inmunoterapia dirigida a células cancerosas de diferentes tejidos como el colon, pulmón, mama, próstata, ovario, páncreas, riñón y otros tipos de cáncer como el sarcoma. En otra realización, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 solo puede unirse y reducir la división celular en la célula cancerosa. En otra realización, el anticuerpo monoclonal anti-B7-H3 puede unirse a células cancerosas y retrasar el desarrollo de metástasis. En otra realización más, un individuo con cáncer recibe tratamiento paliativo con anticuerpo anti-B7-H3. El tratamiento paliativo de un individuo con cáncer implica tratar o disminuir los síntomas adversos de la enfermedad, o los síntomas iatrogénicos que resultan de otros tratamientos administrados para la enfermedad sin afectar directamente la progresión del cáncer. Esto incluye tratamientos para aliviar el dolor, soporte nutricional, problemas sexuales, trastorno psicológico, depresión, fatiga, trastornos psiquiátricos, náuseas, vómitos, etc.

En dichas situaciones, el anticuerpo anti-B7-H3 se puede administrar con agentes que mejoran o dirigen la propia respuesta inmunitaria de un individuo, como un agente que refuerza la ADCC.

En otra realización más, el anticuerpo anti-B7-H3 está conjugado o asociado con una molécula radiactiva, toxina (por ejemplo, caliqueamicina), molécula quimioterapéutica, liposomas u otras vesículas que contienen compuestos quimioterapéuticos y se administran a un individuo que necesita dicho tratamiento para dirigir estos compuestos a la célula cancerosa que contiene el antígeno reconocido por el anticuerpo y así eliminar las células cancerosas o enfermas. Sin limitarse a ninguna teoría particular, el anticuerpo anti-B7-H3 es internalizado por la célula que lleva B7-H3 en su superficie, liberando así el resto conjugado a la célula para inducir el efecto terapéutico. En otra realización más, el anticuerpo puede emplearse como terapia adyuvante en el momento de la extirpación quirúrgica de un cáncer que expresa el antígeno para retrasar el desarrollo de metástasis. El anticuerpo también se puede administrar antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) en un individuo con un tumor que expresa el antígeno para disminuir el tamaño del tumor y así permitir o simplificar la cirugía, tejido de repuesto durante la cirugía y/o disminuir la desfiguración resultante.

Se contempla la dosificación del ciclo celular. En dichas realizaciones, se usa un agente quimioterapéutico para sincronizar el ciclo celular del tumor u otras células diana enfermas en una etapa predeterminada. Posteriormente, se realiza la administración del anticuerpo anti-B7-H3 descrito en el presente documento (solo o con un resto terapéutico adicional). En realizaciones alternativas, se usa un anticuerpo anti-B7-H3 para sincronizar el ciclo celular y reducir la división celular antes de la administración de una segunda ronda de tratamiento; la segunda ronda puede ser la administración de un anticuerpo anti-B7-H3 y/o un resto terapéutico adicional.

Los agentes quimioterapéuticos incluyen moléculas radiactivas, toxinas, también conocidos como citotoxinas o agentes citotóxicos, que incluye cualquier agente que sea perjudicial para la viabilidad de las células cancerosas, agentes y liposomas u otras vesículas que contienen compuestos quimioterapéuticos. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, 1-deshidrotestosterona, 5-fluorouracil decarbazina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, actinomicina D, adriamicina, aldesleucina, agentes alquilantes, alopurinol sódico, altretamina, amifostina, anastrozol, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), diaminodicloroplatino, antraciclinas, antibióticos, antimetabolitos, asparaginasa, BCG en vivo (intravesical), fosfato sódico de betametasona y acetato de betametasona, bicalutamida, sulfato de bleomicina, busulfano, leucuorina cálcica, calicheamicina, capecitabina, carboplatino, lomustina (CCNU), carmustina (BSNU), clorambucilo, cisplatino, cladribina, colchicina, estrógenos conjugados, ciclofosfamida, ciclotosfamida, citarabina, citarabina, citocalasina B, citoxano, dacarbazina, dactinomicina, dactinomicina (anteriormente actinomicina), daunirrubicina HCL, citrato de daunorucbicina, denileucina diftitox, dexrazoxano, dibromomanitol, dihidroxiantracindiona, docetaxel, dolasetronmesilato, doxorrubicina HCL, dronabinol, L-asparaginasa de E. coli, emetina, epoetina alfa, L-asparaginasa de Erwinia, estrógenos esterificados, estradiol, fosfato sódico de estramustina, bromuro de etidio, etinilestradiol, etidronato, factor de etopósido citrororum, fosfato de etopósido, filgrastim, floxuridina, fluconazol, fosfato de fludarabina, fluorouracilo, flutamida, ácido folínico, gemcitabina HCL, glucocorticoides, acetato de goserelina, gramicidina D, granisetrón HCL, hidroxiurea, idarrubicina HCL, ifosfamida, interferón alfa-2b, irinotecán HCL, letrozol, leucovorina cálcica, acetato de leuprolida, levamisol HCL, lidocaína, lomustina, maitansinoide, mecloretamina HCL, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán HCL, mercaptipurina, mesna, metotrexato, metiltestosterona, mitramicina, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, acetato de octreotida, ondansetrón HCL, paclitaxel, pamidronato disódico, pentostatina, pilocarpina HCL, plimicina, prolifeprospan 20 (con implante de carmustina), porfímero sódico, procaína, procarbazina HCL, propranolol, rituximab, sargramostim, estreptozotocina, tamoxifeno, taxol, tenipósido, tenopósido, testolactona, tetracaína, tioepa clorambucilo, tioguanina, tiotepa, topotecán HCL, citrato de toremifeno, trastuzumab, tretinoína, valrrubicina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina y tartrato de vinorelbina.

En una realización preferida, la citotoxina es especialmente eficaz para dividir o dividir rápidamente las células, de tal manera que las células que no se dividen estén relativamente a salvo de los efectos tóxicos.

Los anticuerpos pueden internalizarse dentro de las células enfermas o de carcinoma a las que se unen y, por lo tanto, son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, administrar a las células toxinas que necesitan ser internalizadas por su actividad adversa. Ejemplos de tales toxinas incluyen, pero sin limitación, saporina, calicheamicina, auristatina y maitansinoide.

Los anticuerpos o polipéptidos pueden asociarse (incluidos conjugados o enlazados) a una molécula radiactiva, una toxina u otros agentes terapéuticos, o liposomas u otras vesículas que contienen agentes terapéuticos de forma covalente o no covalente, directa o indirectamente. El anticuerpo puede estar ligado a la molécula radiactiva, la toxina, o la molécula quimioterapéutica en cualquier lugar a lo largo del anticuerpo, siempre que el anticuerpo pueda unirse a su diana B7-H3.

Se puede administrar una toxina o un agente quimioterapéutico al mismo tiempo que (antes, después o durante la administración), o acoplado (por ejemplo, unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de un grupo enlazador, o, como alternativa, a través de una molécula de enlace con sitios de unión apropiados, tal como una molécula plataforma como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.552.391). La toxina y el agente quimioterapéutico se pueden acoplar directamente a las proteínas diana particulares utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Los anticuerpos o polipéptidos también pueden unirse a un agente quimioterapéutico a través de un microvehículo. El término "microvehículo" se refiere a una partícula biodegradable o no biodegradable que es insoluble en agua y que tiene un tamaño de menos de aproximadamente 150 pm, 120 pm o 100 pm de tamaño, más comúnmente menos de aproximadamente 50-60 pm, preferentemente menos de aproximadamente 10, 5, 2,5, 2 o 1,5 pm. Los microvehículos incluyen "nanovehículos", que son microvehículos que tienen un tamaño de menos de aproximadamente 1 pm, preferentemente menos de aproximadamente 500 nm. Dichas partículas son conocidas en la técnica. Los microvehículos de fase sólida pueden ser partículas formadas a partir de polímeros naturales biocompatibles, polímeros sintéticos o copolímeros sintéticos, que pueden incluir o excluir microvehículos formados a partir de agarosa o agarosa reticulada, así como otros materiales biodegradables conocidos en la técnica. Los microvehículos de fase sólida biodegradables se pueden formar a partir de polímeros que son degradables (por ejemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y sus copolímeros) o erosionable (por ejemplo, poli(ortoésteres), tales como 3,9-dietiliden-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU) o poli(anhídridos), tales como poli(anhídridos) de ácido sebácico) en condiciones fisiológicas de mamíferos. Los microvehículos también pueden ser en fase líquida (por ejemplo, a base de aceite o lípidos), tales como liposomas, iscoms (complejos inmunoestimulantes), que son complejos estables de colesterol y fosfolípidos, saponina con actividad adyuvante) sin antígeno, o gotitas o micelas que se encuentran en emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, siempre que los microvehículos en fase líquida sean biodegradables. Los microvehículos biodegradables en fase líquida normalmente incorporan un aceite biodegradable, una serie de los cuales son conocidos en la técnica, incluyendo escualeno y aceites vegetales. Los microvehículos son típicamente de forma esférica, pero los microvehículos que se desvían de la forma esférica también son aceptables (por ejemplo, elipsoide, en forma de varilla, etc.). Por su naturaleza insoluble (con respecto al agua), los microvehículos se pueden filtrar a partir de agua y soluciones (acuosas) a base de agua.

Los conjugados de anticuerpo o polipéptido pueden incluir un enlazador bifuncional que contiene tanto un grupo capaz de acoplarse a un agente tóxico o agente quimioterapéutico como un grupo capaz de acoplarse al anticuerpo. Un enlazador puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente con el fin de evitar interferencias con las capacidades de unión. Un enlazador puede ser escindible o no escindible. Un enlazador también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo y, por tanto, aumentar la eficacia de acoplamiento. Un aumento de la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes o grupos funcionales en agentes, que de otro modo no sería posible. El enlazador bifuncional se puede acoplar al anticuerpo por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, un enlazador que contiene un resto de éster activo, como un éster de N-hidroxisuccinimida, puede usarse para acoplarse a restos de lisina en el anticuerpo a través de un enlace amida. En otro ejemplo, un enlazador que contiene un resto de hidrazina o amina nucleófila puede acoplarse a grupos aldehído producidos por oxidación glicolítica de restos de carbohidrato de anticuerpos. Además de estos métodos directos de acoplamiento, el enlazador se puede acoplar indirectamente al anticuerpo por medio de un vehículo intermedio tal como un aminodextrano. En estas realizaciones, el enlace modificado es a través de lisina, carbohidrato o un vehículo intermedio. En una realización, el enlazador está acoplado en sitios selectivamente a restos de tiol libres en la proteína. Los restos que son adecuados para el acoplamiento selectivo a grupos tiol en proteínas son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos incluyen compuestos de disulfuro, compuestos de a-halocarbonilo y ahalocarboxilo y maleimidas. Cuando está presente una función amina nucleófila en la misma molécula que un grupo α-halocarbonilo o carboxilo, existe la posibilidad de que se produzca la ciclación mediante la alquilación intramolecular de la amina. Los métodos para prevenir este problema son bien conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante la preparación de moléculas en las que las funciones amina y α-halo están separadas por grupos inflexibles, tales como grupos arilo o trans-alquenos, que hacen que la ciclación no deseada sea estereoquímicamente desfavorecida. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.441.163 para la preparación de conjugados de maitansinoides y anticuerpos mediante un resto disulfuro.

Uno de los enlazadores escindibles que se puede utilizar para la preparación de conjugados de anticuerpo-fármaco es un enlazador lábil al ácido basado en ácido cis-aconítico que aprovecha el entorno ácido de diferentes compartimentos intracelulares, como los endosomas que se encuentran durante la endocitosis mediada por receptores y los lisosomas. Véase, por ejemplo, Shen, W.C. et al. (1981) ("cis-Aconityl Spacer Between Daunomycin And Macromolecular Carriers: A Model Of pH-Sensitive Linkage Releasing Drug From A Lysosomotropic Conjugate", Biochem. Biophys. Res. Comtnun. 102:1048-1054 (1981)) para la preparación de conjugados de daunorrubicina con vehículos macromoleculares; Yang et al. (1988) ("Pharmacokinetics And Mechanism Of Action Of A Doxorubicin-Monoclonal Antibody 9.2.27 Conjugate Directed To A Human Melanoma Proteoglycan", J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159) para la preparación de conjugados de daunorrubicina a un anticuerpo anti-melanoma; Dillman et al. (1988) ("Superiority Of An Acid-Labile Daunorubicin-Monoclonal Antibody Immunoconjugate Compared To Free Drug", Cancer Res. 48:6097-6102) para usar un enlazador lábil a los ácidos de una manera similar para preparar conjugados de daunorrubicina con un anticuerpo anti-linfocitos T; y Trouet et al. (1982) "A Covalent Linkage Between Daunorubicin And Proteins That Is Stable In Serum And Reversible By Lysosomal Hydrolases, As Required For A Lysosomotropic Drug-Carrier Conjugate: In Vitro And In Vivo Studies", Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.Uu .) 79:626-629) para unir daunorrubicina a un anticuerpo a través de un brazo espaciador de péptidos.

Un anticuerpo (o polipéptido) se puede conjugar (unir) a una molécula radiactiva o toxina mediante cualquier método conocido en la técnica. Para una discusión de los métodos para el radiomarcaje de anticuerpos (véase, CANCER THERAPY WITH MONOCLONAL ANTIBODIES, D.M. Goldenberg (Ed.) CRC Press, Boca Raton, 1995). Las toxinas adecuadas incluyen taxanos, maitansinoides, auristatinas (por ejemplo, monometil auristatina (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), auristatina E (AE), etc.) las nucleobases comprenden aquellas desveladas en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.208.020; 5416064; 6333410; 6340701; 6372738; 6436931; 6441163; 6596757; 7276497; 7585857; o 7.851.432), caliqueamicina, antraciclinas (por ejemplo, doxorrubicina), análogo de CC-1065, docetaxel; catepsina B o E; ricina, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina diftérica y ribonucleasa; tiuxetan o radioisótopo tóxico (tal como 90Y; 131I, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, etc.).

Como alternativa, un anticuerpo se puede conjugar con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo tal como se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.676.980. La formación de anticuerpos reticulados puede dirigir el sistema inmunitario a tipos específicos de células, por ejemplo, células cancerosas o enfermas que expresan B7-H3.

También se describen métodos para retrasar el desarrollo de metástasis en un individuo con cáncer (que incluyen, pero sin limitación, próstata, cáncer de pulmón o de riñón) usando un anticuerpo anti-B7-H3 u otras realizaciones que se unen a B7-H3 en combinación con un agente quimioterapéutico, o unido a un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una forma humanizada o quimérica de un anticuerpo anti-B7-H3 no humano.

En otra realización más, el anticuerpo puede emplearse como terapia adyuvante en el momento de la extirpación quirúrgica de un cáncer que expresa el antígeno para retrasar el desarrollo de metástasis. El anticuerpo o anticuerpo asociado con un agente quimioterapéutico también se puede administrar antes de la cirugía (terapia neoadyuvante) en un individuo con un tumor que expresa el antígeno para disminuir el tamaño del tumor y así permitir o simplificar la cirugía, tejido de repuesto durante la cirugía y/o disminuir la desfiguración resultante.

En otra realización más, cualquiera de las composiciones de unión a B7-H3 descritas en el presente documento puede unirse a células cancerosas que expresan B7-H3 e inducir una respuesta inmunitaria activa contra las células cancerosas que expresan B7-H3. En algunos casos, la respuesta inmunitaria activa puede causar la muerte de las células cancerosas (por ejemplo, unión de anticuerpos a células cancerosas que inducen la muerte celular apoptótica), o inhibir el crecimiento (por ejemplo, bloquear la progresión del ciclo de células) de las células cancerosas. En otros casos, cualquiera de los nuevos anticuerpos descritos en el presente documento puede unirse a células cancerosas y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) puede eliminar las células cancerosas a las que se une el anti-B7-H3. Por consiguiente, también se describen métodos para estimular una respuesta inmunitaria que comprenden administrar cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.

En algunos casos, la unión de anticuerpos también puede activar respuestas inmunitarias tanto celulares como humorales y reclutar más linfocitos citolíticos naturales o aumentar la producción de citocinas (por ejemplo, IL-2, IFNgamma, IL-12, TNF-alfa, TNF-beta, etc.) que activan aún más el sistema inmunitario de un individuo para destruir las células cancerosas. En otra realización más, los anticuerpos anti-B7-H3 pueden unirse a células cancerosas y los macrófagos u otras células fagocíticas pueden opsonizar las células cancerosas.

Se pueden usar para la administración diversas formulaciones de anticuerpos anti-B7-H3 o fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-B7-H3 o fragmentos de los mismos se pueden administrar puros. Además del agente farmacológicamente activo, las composiciones descritas en el presente documento pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que son bien conocidos en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz o que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente para la administración al lugar de la acción. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, entre otros, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos según sea apropiado para suspensiones inyectables oleosas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetil celulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. Los liposomas también se pueden usar para encapsular el agente para su administración a la célula.

La formulación farmacéutica para administración sistémica puede formularse para administración enteral, parenteral o tópica. De hecho, los tres tipos de formulación se pueden usar simultáneamente para lograr la administración sistémica del principio activo. Los excipientes y las formulaciones para la administración de fármacos por vía parenteral y no parenteral se establecen en REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, 21a Edición, Lippincott Williams & Wilkins Publishing (2005). Las formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas de gelatina duras o blandas, píldoras, comprimidos, incluyendo comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de los mismos. De manera general, estos agentes están formulados para su administración mediante inyección {por ejemplo, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, etc.), aunque otras formas de administración (por ejemplo, oral, mucosal, etc.) también se pueden usar. Por consiguiente, los anticuerpos anti-B7-H3 se combinan preferentemente con vehículos farmacéuticamente aceptables como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y similares.

El régimen de dosificación particular, es decir, dosis, sincronización y repetición, dependerá del individuo en particular y del historial médico de ese individuo. De manera general, una dosis de al menos aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, más preferentemente al menos aproximadamente 250 pl de peso corporal, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, incluso más preferentemente se administra al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.

Consideraciones empíricas, tales como la vida media, generalmente contribuirán a la determinación de la dosis. Los anticuerpos, que son compatibles con el sistema inmunitario humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, se pueden utilizar para prolongar la vida media del anticuerpo y evitar que el sistema inmunitario del hospedador ataque al anticuerpo. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el transcurso de la terapia y se basa en la reducción del número de células cancerosas, el mantenimiento de la reducción de células cancerosas, la reducción de la proliferación de células cancerosas o el retraso del desarrollo de metástasis. Como alternativa, pueden ser apropiadas las formulaciones de liberación continua sostenida de anticuerpos anti-B7-H3. Se conocen en la técnica diversas formulaciones y dispositivos para lograr una liberación sostenida.

En una realización, las dosis de anticuerpos anti-B7-H3 pueden determinarse empíricamente en individuos que han recibido una o más administraciones. Los individuos reciben dosis en aumento de un anticuerpo anti-B7-H3. Para evaluar la eficacia de los anticuerpos anti-B7-H3, se puede seguir un marcador de la patología del cáncer específico. Estos incluyen mediciones directas del tamaño del tumor mediante palpación u observación visual, medición indirecta del tamaño del tumor mediante rayos X u otras técnicas de formación de imágenes; una mejora evaluada mediante biopsia tumoral directa y examen microscópico de la muestra tumoral; la medición de un marcador tumoral indirecto (por ejemplo, PSA para cáncer de próstata), una disminución del dolor o la parálisis; habla mejorada, visión, respiración u otra discapacidad asociada con el tumor; aumento del apetito; o un aumento en la calidad de vida medida por pruebas aceptadas o una prolongación de la supervivencia. Será evidente para un experto en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, del tipo de cáncer, de la etapa del cáncer, de si el cáncer ha comenzado a hacer metástasis a otra ubicación en el individuo y de los tratamientos anteriores y concurrentes que se están utilizando.

Otras formulaciones incluyen formas de administración adecuadas conocidas en la técnica que incluyen, pero sin limitación, vehículos tales como liposomas. Véase, por ejemplo, Mahato et al. (1997) "Cationic Lipid-Based Gene Delivery Systems: Pharmaceutical Perspectives", Pharm. Res. 14:853-859. Las preparaciones liposómicas incluyen, pero sin limitación, citofectinas, vesículas multilaminares y vesículas unilaminares.

En algunas realizaciones, puede estar presente más de un anticuerpo. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Tales composiciones pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco anticuerpos diferentes que son reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas o adenosarcomas. El anticuerpo anti-B7-H3 se puede mezclar con uno o más anticuerpos reactivos contra carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas o adenosarcomas en órganos que incluyen, entre otros, ovario, mama, pulmón, próstata, colon, riñón, piel, tiroideo, hueso, tracto digestivo superior y páncreas. En una realización, se utiliza una mezcla de diferentes anticuerpos anti-B7-H3. Una mezcla de anticuerpos, como a menudo se denotan en la técnica, puede ser particularmente útiles en el tratamiento de una gama más amplia de población de individuos.

Habiendo ahora descrito de forma general la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no tienen por objeto ser limitantes de la presente invención a menos que se especifique.

Ejemplo 1

Investigaciones de inmunohistocompatibilidad

Se generó un panel de 49 mAb a partir de inmunizaciones de células tumorales/células progenitoras fetales. Se evaluó la capacidad de los anticuerpos para presentar tinción IHC diferencial del tejido tumoral en relación con tejido normal, no canceroso, la capacidad de uso en modelos de primates (y particularmente de monos cinomolgos) de eficacia de anticuerpos, los niveles de afinidad y especificidad antigénica y los niveles de actividad inmunomoduladora e internalización celular. 21 de los mAb se identificaron inicialmente mediante análisis de MS y/o unión a células B7-H3-CHO. Los 28 mAb restantes se identificaron reexaminando la biblioteca mediante ELISA con proteína B7-H3. Las características de 46 de los 49 miembros del panel se proporcionan en la Tabla 2.

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La tinción de IHC confirmó que el panel comprendía anticuerpos que provocaron un tumor fuerte en el diferencial de unión al tejido normal en muchos de los anticuerpos identificados, presentó una variedad de propiedades de unión por análisis BIACORE™, presentó reactividad a un intervalo de epítopos solapantes y no solapantes y presentó un intervalo de especificidad a 4 Ig frente a 2 Ig de B7-H3. Las características de los nueve mejores candidatos se muestran en Tabla 3 y en la Tabla 4.

La Tabla 5 proporciona un resumen de los perfiles de actividad de estos anticuerpos.

Un análisis de las actividades de los anticuerpos que se muestran en la Tabla 6 reveló que sus respectivos perfiles diferían y que cada anticuerpo estaba asociado con ventajas y desventajas entre sí (Tabla 6).

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Dado que BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D y PRCA157 presentaron perfiles IHC de tejido normal más claros, diferencial de IHC normal/tumor más fuerte, unión de moderada a fuerte (BIACORE™ / IHC), reactividad cruzada con B7-H3 de monos cinomolgos y potente actividad UDART™, estas especies de anticuerpos se seleccionaron para su posterior desarrollo. Estos anticuerpos diferían de TES7 y OVCA2, que presentaron baja afinidad (en el ensayo BIACORE™) y ninguna reactividad cruzada con B7-H3 de monos cinomolgos. Estos anticuerpos difieren de SG27, que presentó baja afinidad (en el ensayo BIACORE™), bajo rendimiento de IHC (unión débil) y menor actividad de UDART™. Estos anticuerpos difieren de GB8, que presentó baja afinidad (en el ensayo BIACORE™), diferencial de tumor/normal de IHC deficiente y menor actividad de UDART™.

Usando células de control positivo Caki-2 y Hs700T, las investigaciones de IHC revelaron que cada uno de los anticuerpos presentaba una concentración óptima diferente y una concentración diferencial diferente entre sí (Tabla 7).

Usando las concentraciones óptimas y los diferenciales indicados en la Tabla 7, se determinaron las respuestas IHC de los anticuerpos B7-H3 en tejidos humanos. Los resultados de estos análisis para la glándula suprarrenal, el hígado, el páncreas, el riñón, el pulmón y el colon se muestran en las Tablas 8A-8b y en las Tablas 9A-9B (todos los anticuerpos presentaron respuestas IHC negativas para el tejido cardíaco).

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Las investigaciones de IHC realizadas con muestras de cáncer demostraron que los anticuerpos B7-H3 podrían usarse para identificar y diagnosticar el cáncer en múltiples fuentes de tejido (Tabla 10). En la Tabla 10, los números indican el número de signos positivos (1 = , 2 = +, 3 = ++); cada número se refiere a una muestra analizada diferente.

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Para las células de cáncer de próstata, mama, colon y pulmón tratadas con el anticuerpo de B7-H3 BRCA84D, la tinción de la muestra de tumor estaba presente en las células tumorales y las células del estroma, incluida la vasculatura del tumor. En algunas muestras de tumores, la tinción del estroma fue mucho más fuerte que la de las células tumorales. Cuando se tituló el mAb BRCA84D a una concentración más baja, algunos casos mostraron una tinción reducida en las células tumorales, pero aún mantenía una fuerte tinción estromal. Tras teñir con BRCA84D a 0,625 |jg/ml, las células de cáncer de próstata presentaron una IHC de 3/3+; las células de cáncer de mama presentaron una IHC de 4/4+; las células de cáncer de colon presentaron una IHC de 4/4+ y las células de cáncer de pulmón presentaron una IHC de 4/4+. Tras teñir con BRCA84D a 0,078 jg/ml, las células de cáncer de próstata presentaron una IHC de 3/4+; las células de cáncer de mama presentaron una IHC de 5/5+; las células de cáncer de colon presentaron una IHC de 4/4+ y las células de cáncer de pulmón presentaron una IHC de 3/4+.

El hígado normal se trató con el anticuerpo de B7-H3 BRCA68D, y se observó tinción en los hepatocitos y las células de revestimiento sinusoide. El páncreas normal teñido con el anticuerpo de B7-H3 BRCA68D mostró tinción multifocal en la fibra de colágeno y el epitelio. Las células de glándula suprarrenal normales tratadas con anticuerpo de B7-H3 BRCA68D, presentaron tinción en la corteza. Tras teñir con BRCA68D a 0,156 jg/ml, las células de cáncer gástrico, de riñón y de ovario presentaron todas una IHC de 5/5+.

Se realizaron análisis adicionales de tinción IHC en muestras de tejidos de cáncer gástrico, de riñón y de ovario. Los resultados de tales análisis se muestran en la Tabla 12. En la Tabla 11, los números indican el número de signos positivos (1= , 2= +, 3 = ++); cada número se refiere a una muestra analizada diferente.

En resumen, todos los mAb probados mostraron diversos grados de intensidad de tinción en hígado normal, páncreas, colon y pulmón. La Figura 1A muestra los resultados de las investigaciones de IHC realizadas con páncreas normal, hígado, muestras de tejido de pulmón y colon con BRCA84D a 0,625 pg/ml y 0,078 pg/ml. La tinción del hígado estaba relativamente restringida en las células de revestimiento sinusoide (fibroblasto y células de Kupffer) con BRCA84D y TES7. OVCA22 mostró tinción de hepatocitos de membrana además de la de las células de revestimiento sinusoides a la concentración óptima. Sin embargo, la tinción en los hepatocitos desapareció a la concentración diferencial. Todos los demás mAb mostraron tinción en los hepatocitos, incluida la tinción de la membrana o del citoplasma tanto a la concentración óptima como a la diferencial. Se observó tinción de páncreas en la fibra de colágeno principalmente y en un pequeño porcentaje del epitelio (células acinares y/o células de los conductos intercalados). La tinción en el epitelio disminuyó o desapareció a concentración diferencial. La tinción de colon estaba relativamente restringida en la membrana apical del epitelio de la cripta y el fibroblasto en la mucosa. No se observó unión en los nódulos linfoides del colon. El pulmón mostró una tinción muy débil y en parches en el epitelio con BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D y GB8. Sin embargo, la tinción desapareció a la concentración diferencial. No se observó tinción en pulmón con TES7, OVCA22 y PRCA157 en ambas concentraciones. Se observó tinción de la corteza suprarrenal con casi todos los mAb a una concentración óptima, excepto BRCA84D. La tinción en las glándulas suprarrenales obviamente disminuyó con TES7 y OVCA22 a concentración diferencial. El corazón y el riñón no mostraron tinciones obvias con todos los mAb (Figura 1B). A la luz de estas propiedades, BRCA84D fue considerado el mejor de los mAb, seguido en orden por (2) TES7, (3) OVCA22, (4) el grupo BRCA68D, BRCA69D y PRCA157, y por último (5) GB8.

Todos los mAb incluidos en el estudio mostraron tinción positiva en 4 tipos de cáncer a la concentración óptima. A la concentración diferencial, BRCA84D todavía mantuvo una buena tinción en el cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer de colon. TES7 mantuvo una buena tinción en 4 tipos de cáncer del estudio. Los mAb restantes mostraron varias intensidades de tinción en diferentes tipos de tumores. Se observó tinción de la muestra de tumor en células tumorales y células estromales, incluida la vasculatura. Algunas muestras de tumores mostraron tinción positiva solo en la vasculatura, es decir, BRCA84D, BRCA69D, TES7 y PRCA157. Algunos tumores mostraron una tinción estromal más fuerte que la tinción de células tumorales. Cuando se valoraron los mAb para reducir la concentración en estas muestras, algunos casos mostraron tinción reducida o nula en las células tumorales, pero aún mantenía una fuerte tinción estromal. En general, en términos de expresión en tejidos humanos normales y expresión diferencial en tejidos normales frente a tumores, el orden de mAb desde el mejor rendimiento de IHC hasta el peor rendimiento es el siguiente: (1) BRCA84D, (2) TES7, (3) OVCA22, (4) el grupo BRCA68D, BRCA69D y PRCA157, y por último (5) GB8. La Tabla 12 y la Figura 2 muestran resultados para el anticuerpo BRCA84D.

Ejemplo 2

Reactividad cruzada de B7-H3 con mono cinomolgo

La secuencia del B7-H3 del mono cinomolgo comparte aproximadamente un 90 % de homología con su homólogo humano, sugiriendo que el mono cinomolgo es un modelo excelente para las interacciones humanas de B7-H3. Se llevaron a cabo investigaciones para evaluar la reactividad cruzada de los candidatos de B7H3 BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D, TES7, OVCA22 y PRCA157 con glándula suprarrenal, hígado, riñón, páncreas y pulmón, así como un caso de placenta a término de mono cinomolgo, con el fin de comparar cualquier reactividad cruzada con la intensidad de la tinción y los patrones de tinción observados para los tejidos humanos.

La concentración de tinción para cada Mab probado es la concentración óptima que se determinó en las células de control positivo Caki-2 y Hs700T (véase la Tabla 8). Se seleccionó el anti-B7-H3 humano de cabra comercial (con reacción cruzada con cinomolgo) como un anticuerpo de control positivo para teñir el tejido placentario de cinomolgo. Se aplicaron los correspondientes controles de isotipo en cada ejecución de los experimentos. Los resultados de estas investigaciones se muestran en la Tabla 13.

La investigación de la tinción IHC de BRCA84D (0,625 pg/ml) en placenta de cinomolgo mostró tinción en células deciduales, pero no en las vellosidades. No se observó tinción en el hígado ni en el páncreas, sin embargo, se observó tinción de células de revestimiento sinusoide en hígado humano y se observó tinción localizada de fibra y epitelio en tejido de páncreas humano.

La investigación de la tinción IHC de BRCA68D (0,156 pg/ml) en placenta de cinomolgo mostró tinción en células deciduales, células mesenquimales (endotelio y fibroblastos) y vellosidades. La tinción estaba presente en la membrana de los hepatocitos y el citoplasma de los fibroblastos hepáticos, así como en la fibra pancreática y en el citoplasma del epitelio pancreático. Por lo tanto, el tejido de hígado y páncreas humano y de cinomolgo presentan patrones de tinción similares con BRCA68D.

En resumen, BRCA84D, BRCA68D, BRCA69D y PRCA157 mostraron reactividad cruzada en los tejidos de cinomolgo. BRCA84D no mostró tinción en hígado y páncreas de mono; tal tinción se observó en el hígado y los tejidos pancreáticos humanos. BRCA68D y BRCA69D mostraron una intensidad de tinción y patrones de tinción similares en los tejidos de los monos. Aunque BRCA68D, BRCA69D y PRCA157 mostraron un patrón de tinción comparable al de los tejidos humanos, la intensidad de la tinción no es idéntica a la de los tejidos humanos en condiciones óptimas. TES7 y OVCA22 no mostraron tinción en tejidos de mono en condiciones óptimas.

Se proporciona un resumen de los resultados comparativos de la tinción de IHC en tejido de cinomolgo y tejido humano en la Tabla 14.

Ejemplo 3

Los mAb B7-H3 se unen a múltiples líneas celulares de cáncer de la ATCC

Se descubrió que los anticuerpos descritos en el presente documento eran capaces de unirse a múltiples líneas de células cancerosas contenidas en las colecciones de la American Type Culture Collection. La Tabla 15 y la Tabla 16 resumen los resultados de unión.

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Ejemplo 4

Eliminación redirigida de mAb B7-H3

Los anticuerpos descritos en el presente documento se unen a B7-H3 presente en la superficie de las células cancerosas. Usando métodos convencionales, tales anticuerpos pueden marcarse con fluoresceína, tal como se describe anteriormente. Cuando dichas moléculas marcadas se incuban en presencia de moléculas UDART™ que tienen un dominio de unión al epítopo que se une al receptor de linfocitos T y un dominio de unión al epítopo que se une a la fluoresceína ("TCR-UDART™"), pueden unirse a las moléculas DART™ y, por lo tanto, localizarse en la superficie de las células que expresan B7-H3 y causar una muerte redireccionada.

A. Eliminación redirigida de células de carcinoma renal A498

Para demostrar tal eliminación redirigida, se incubaron anticuerpos B7-H3 marcados con fluoresceína con dichas moléculas TCR-UDART™ y se evaluó la capacidad de las moléculas para mediar la citotoxicidad de las células del carcinoma renal A498. (Tabla 17). Basándose en los resultados obtenidos, se concluyó que los principales candidatos eran: RECA13, BRCA68D, BRCA69D y TDH6.

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Se incubaron células de carcinoma renal A498 con diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales reactivos contra B7-H3 con el fin de determinar la eliminación redirigida dependiente de la dosis mediada por los anticuerpos. Los resultados de los experimentos (Figuras 3A-3B) muestran que la eliminación redirigida dependía de la dosis.

B. Eliminación redirigida de células de cáncer de pulmón A549

Para demostrar aún más esta eliminación redirigida, los anticuerpos B7-H3 marcados con fluoresceína se incubaron con las moléculas TCR-UDART™ descritas anteriormente o con moléculas UDART™ que tienen un dominio de unión a epítopo que se une a CD16 y un dominio de unión a epítopo que se une a fluoresceína ("CD16-UDART™"), y se evaluó la capacidad de las moléculas para mediar la citotoxicidad de las células de cáncer de pulmón A549 (Tabla 18). Los resultados de los experimentos (Figuras 3C-3D) muestran que la eliminación redirigida dependía de la dosis. Basándose en los resultados obtenidos, se concluyó que los principales candidatos eran: BLA8, BRCA68D, BRCA69D y BRCA84D.

C. Eliminación redirigida de células de cáncer de próstata LNcap

Para demostrar aún más esta eliminación redirigida, los anticuerpos B7-H3 marcados con fluoresceína se incubaron con las moléculas TCR-UDART ™ descritas anteriormente o con moléculas UDART ™ que tienen un dominio de unión a epítopo que se une a CD16 y un dominio de unión a epítopo que se une a fluoresceína ("CD16-UDART™"), y se evaluó la capacidad de las moléculas para mediar la citotoxicidad de las células de cáncer de próstata LNcap (Tabla 19). Basándose en los resultados obtenidos, se concluyó que los principales candidatos eran: BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D y PRCA157.

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Ejemplo 5

Capacidad de los mAb B7-H3 para unirse a B7H3-2Ig soluble y B7H3-4Ig soluble

Tal como se ha analiza anteriormente, B7-H3 existe tanto en una forma que contiene 4 dominios Ig (B7H3-4I g) como en una forma que contiene 2 dominios Ig (B7H3-2Ig). Los anticuerpos anti-B7-H3 descritos en el presente documento se probaron para determinar su capacidad para unirse a B7H3-2lg soluble (Figura 4A) y B7H3-4Ig B7-H3 soluble (Figura 4B). Se descubrió que los anticuerpos presentaban una amplia gama de características de unión. Se descubrió que los anticuerpos PRCA123, TDH5, BlA8, BRCA68D y SG24 presentan la unión más fuerte a B7H3-2Ig soluble y se descubrió que los anticuerpos TES7, LUCA50, BRCA165, Ov Ca 22, STO9 y PA20 presentaban la unión más débil a B7H3-2Ig soluble. Se descubrió que los anticuerpos PRCA123, BRCA69A, BLA8 y BRCA68D presentan la unión más fuerte a B7H3-4Ig soluble y se descubrió que los anticuerpos TES7, OVCA21, BRCA165 y ST09 presentaban la unión más débil a B7H3-4Ig soluble.

Ejemplo 6

Unión por afinidad de antígenos en solución a anticuerpos monoclonales capturados

Para demostrar la afinidad de unión entre los antígenos en solución y los anticuerpos monoclonales capturados, los anticuerpos se capturaron en fragmentos Fab2 específicos de Fc de IgG inmovilizados a un nivel de 100-200 UR. Los antígenos B7-H3 y B7-H3 (4 Ig) se inyectaron sobre los anticuerpos capturados a una concentración de 100 nM (velocidad de flujo de 20 pl/min durante 120 segundos y se midió la unión. Las respuestas de unión se normalizaron al mismo nivel de mAb capturado y la respuesta de unión al control de anticuerpo m2B6 (mIgGI) se restó como blanco. Los resultados de este análisis (Figuras 5A-5S; líneas continuas; B7-H3(4Ig) 100 nM; líneas discontinuas; B7-H3, 100 nM)) demuestran que los anticuerpos descritos en el presente documento presentan una fuerte unión a B7-H3(4Ig).

Ejemplo 7

Análisis BIACORE™: Titulación de mAb B7-H3 para B7-H3 inmovilizado

Para demostrar las afinidades de unión relativas de B7-H3-2Ig y B7-H3-4Ig por los anticuerpos descritos en el presente documento, se realizó un análisis BIACORE™. Se permitió que los anticuerpos B7-H3 descritos en el presente documento se unieran a B7-H3-2Ig inmovilizado o a B7-H3-4Ig y se evaluó la titulación de la unión a lo largo del tiempo (Figuras 6A-6I). Se descubrió que TDH5, PRCA123, BLA8, BRCA69 tienen una alta afinidad tanto por B7-H3-2Ig como por B7-H3-4Ig. Sin embargo, se encontró que su(s) epítopo(s) estaba(n) en su mayoría excluido(s) en la molécula B7-H3-4Ig, con solo unos pocos disponibles. Se descubrió que OVCA22 tiene una afinidad muy baja tanto por B7-H3-2Ig como por B7-H3-4Ig, estando su epítopo igualmente disponible en ambas moléculas. Sin embargo, es probable que solo la forma B7-H3-4Ig proporcione suficiente proximidad para la unión bivalente del anticuerpo (baja disociación), mientras que la B7-H3-2Ig se puede unir sólo de forma monovalente. Se descubrió que TDH6 apenas tenía afinidad en este formato, con unión a 2Ig probable que sea inespecífica. Se descubrió que TES7 y PA20 eran anticuerpos específicos de B7-H4-4Ig con baja afinidad. Es probable que TES7 tenga una tasa de asociación baja y una tasa de disociación más alta que la PA20. Se descubrió que BRCA84D era un anticuerpo de afinidad intermedia con la posibilidad de múltiples sitios de unión tanto en B7-H3-2Ig como en B7-H3-4Ig. Basado en el análisis BIACORe ™, BRCA84D debido a su sitio de unión inusual se consideró un anticuerpo preferido. TES7 y PA20 se consideraron candidatos para la unión específica a superficies de antígenos de alta densidad y uno de anticuerpos de alta afinidad y baja especificidad (por ejemplo, BRCA69D u otro).

La Figura 7 proporciona un análisis BIACORE™ de comparación de los anticuerpos PRCA157, BRCA69D, BLA8, PA20, BRCA84D, GB8 y SG27, que ilustra que los anticuerpos anti-B7-H3 descritos en el presente documento pueden presentar una variedad de propiedades de unión.

La Figura 8 demuestra la especificidad no competitiva de varios de los anticuerpos anti-B7-H3 descritos en el presente documento. En el experimento, se incubaron moléculas de B7-H3 humanas en presencia del anticuerpo BRCA84D y se sometieron a análisis BIACORE™. Después de aproximadamente 3 minutos, se añadió a la reacción un segundo anticuerpo anti-B7-H3. Si el segundo anticuerpo compitió con BRCA84D, encontraría los sitios de B7-H3 ocluidos y no podría unirse. Los resultados indican que los anticuerpos BRCA68D, BRCA69D y PRCA157 no compiten con BRCA84D por unirse al B7-H3 humano.

Ejemplo 8

Los mAb anti-B7-H3 se internalizan en las líneas celulares CMC y de ATCC

Se investigó la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 descritos en el presente documento para internalizarse tras la unión a células cancerosas. Se incubaron células prostáticas CMC y células pancreáticas Hs700t con un anticuerpo anti-B7-H3. La viabilidad de las células se determinó después de la incubación en presencia de un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con saporina que será tóxico para las células si se une al anticuerpo primario y se internaliza. Los resultados de esta investigación para células CMC de próstata (Figura 9A) y para células pancreáticas Hs700t (Figura 9B) demuestran la capacidad de los anticuerpos descritos en el presente documento para internalizarse en las células.

Ejemplo 9

Análisis de unión y bloqueo cruzado de mAb B7-H3 mediante ELISA

Para explorar la reactividad cruzada de los anticuerpos descritos en el presente documento y los epítopos reconocidos por dichos anticuerpos, se midió el grado de unión que se produce en presencia de un anticuerpo competidor de B7-H3. Los resultados de este análisis se muestran en Figuras 10A-10F, y muestran que BRCA68D compite con BRCA69D. También se descubrió que TES7 y OVCA22 compiten entre sí, pero se descubrió que TES7 y no OVCA22 también compiten con BRCA68D y BRCA69D. Se descubrió que GB8 compite con SG27 por la unión a B7-H3-2Ig pero no a B7-H3-4Ig. Los datos se resumen en la Tabla 20 y muestran al menos cuatro epítopos distintos para B7-H3-4Ig (es decir, el epítopo reconocido por SG27, el epítopo reconocido por GB8, el epítopo reconocido por OVCA22 y TES7, y el epítopo reconocido por BRCA68D, BRCA69D y TES7) y al menos dos epítopos para B7-H3-2Ig (es decir, el epítopo reconocido por SG27 y GB8, y el epítopo reconocido por BRCA68D y BRCA69D).

Los atributos de los anticuerpos anti-B7-H3 clave descritos en el presente documento se muestran en la Tabla 21.

Basado en su tinción diferencial presentada de tejidos normales y cancerosos, su capacidad para unirse a B7-H3-4Ig así como a B7-H3-2Ig, sus afinidades de unión medidas por el análisis BIACORE™ descrito anteriormente y su capacidad para unirse a los anticuerpos de B7H3 de cinomolgo, se consideró que BRCA68D, BRCA69D, BRCA84D y PRCA157 eran los anticuerpos más preferidos

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Ejemplo 10

Anticuerpos anti-B7-H3 humanizados

El anticuerpo monoclonal BRCA84D se humanizó para producir anticuerpos (designados genéricamente en el presente documento como "hBRCA84D") que ofrecen un potencial terapéutico humano mejorado. Las secuencias de la cadena ligera variable y la cadena pesada variable, y sus respectivas secuencias de aminoácidos y polinucleótidos de un anticuerpo humanizado resultante (designado en el presente documento como "hBRCA84D-1") se proporcionan a continuación:

Cadena ligera variable humanizada BRCA84D-1 (SEQ ID NO: 68):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 69):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

CDR¹de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO:70): KASQNVDTNVA

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR¹de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO:71): aaggccagtc agaatgtgga tactaatgta gcc

CDR²de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 72): SASYRYS

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 73): tcggcatcct accggtacag t

CDR³de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 74): QQYNNYPFT

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena ligera variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 75): cagcaatata acaactatcc attcacg

Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO:80):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCARGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

S e cu e n c ia de p o lin u c le ó tid o s que co d ifica la cad en a p e sad a va ria b le B R C A 84D -1 h u m a n iza d a (S E Q ID NO:81): gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc

cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca

tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac

atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag

gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga

actccctgcg ggacgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggccgg

gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac

cgtgaccgtg tcctct

CDRi de cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO:82): FGMH

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDRi de cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 83): tttggaatgcac

CDR²de cadena pesada variable BRCA84D humanizada (SEQ ID NO:84): YISSDSSAIYYADTVK

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR²de cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 85): tacattagta gtgacagtag tgccatctac tatgcagaca cagtgaag

CDR³de cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO:86): GRENIYYGSRLDY

Secuencia de polinucleótidos que codifica la CDR³de cadena pesada variable BRCA84D-1 humanizada (SEQ ID NO: 87): gggagggaaa acatttacta cggtagtagg cttgactac

Para obtener especies de hBRCA84D que presenten una afinidad mejorada por B7-H3 humano, los polinucleótidos que codifican las cadenas ligeras o pesadas de hBRCA84D-1 (es decir, hBRCA84D-1VL o hBRCA84D-1VH, respectivamente) fueron sometidos a mutagénesis, y derivados de la cadena ligera hBRCA84D-1 mutados hBRCA84D-2VL, hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL, hBRCA84D-5VL y hBRCA84D-6VL y derivados de cadena pesada hBRCA84D-1 mutados hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH y hBRCA84D-4VH se aislaron y caracterizaron. Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas variables de estos anticuerpos se presentan a continuación:

hBRCA84D-2VL (SEQ ID NO:89):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-2VL (SEQ ID NO:90):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga

cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg

cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc

gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc

tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg

ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag

ggcaccaagc tggaaatcaa g

hBRCA84D-3VL (SEQ ID NO:91):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-3VL (SEQ ID NO:92):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgtcc gtcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

hBRCA84D-4VL (SEQ ID NO:93):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKLLIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-4VL (SEQ ID NO:94):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggccaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

hBRCA84D-5VL (SEQ ID NO:95):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKALIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-5VL (SEQ ID NO:96):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggccaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc

tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

hBRCA84D-6VL (SEQ ID NO:97):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFAEYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

P o lin u c le ó tid o que co d ifica h B R C A 84 D -6 V L (SEQ ID NO:98):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaagctgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccgagtacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa g

hBRCA84D-2VH (SEQ ID NO:99):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-2VH (SEQ ID NO:100):

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga actccctgcg ggacgaggac accgccgtgt actactgcgg cagaggccgg gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg tcctct

hBRCA84D-3VH (SEQ ID NO:101):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAMYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

Polinucleótido que codifica hBRCA84D-3VH (SEQ ID NO:102):

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga actccctgcg ggacgaggac accgccatgt actactgcgg cagaggccgg gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg tcctct

hBRCA84D-4VH (SEQ ID NO:103):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRSED TAVYYCARGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

P o lin u c le ó tid o que co d ifica h B R C A 84 D -4 V H (SEQ ID NO:104):

gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agcttcggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg gactggaatg ggtggcctac atctcctccg actcctccgc catctactac gccgacaccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggaca acgccaagaa ctccctgtac ctgcagatga actccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaggccgg gagaatatct actacggctc ccggctggat tattggggcc agggcaccac cgtgaccgtg tcctct

La Tabla 22 enumera las mutaciones de cadena ligera variable y cadena pesada variable de hBRCA84D estudiadas; los números se refieren al sistema de numeración de Kabat utilizado en las Figuras 11A y 11B.

Las afinidades de unión relativas de los derivados de la cadena ligera de hBRCA84D hBRCA84D-3VL, hBRCA84D-4VL y hBRCA84D-5VL para B7-H3 humano se determinaron formando anticuerpos que contienen estas regiones variables de cadena ligera y una cadena pesada quimérica BRCA84D-1VH (Figura 12). Se descubrió que BRCA84D-5VL (K42Q, L46A) tiene la mayor afinidad de unión del hBRCA84D-VL probado. Por tanto, se utilizó BRCA84D-5VL como cadena ligera para investigar las afinidades de unión relativas de las cadenas pesadas de hBRCA84D de hBRCA84D-1VH, hBRCA84D-2VH, hBRCA84D-3VH y hBRCA84D-4VH para B7-H3 humano (Figura 13). Se descubrió que hBRCA84D-2VH (A93G) tiene la mayor afinidad de unión de hBRCA84D-VH probado.

Las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos codificantes del BRCA84D-1 quimérico son las siguientes:

Cadena ligera chBRCA84D (SEQ ID NO: 105):

DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS

ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS

GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

Polinucleótido que codifica la cadena ligera chBRCA84D (SEQ ID NO: 106):

gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcaacaa tgtgcagtct gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacaact atccattcac gttcggctcg gggacaaagt tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag

Cadena pesada chBRCA84D (SEQ ID NO: 107):

DVQLVESGGG LVQPGGSRKL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL

VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT

QTYICNVNHK PSNTKVDKRV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP

KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ

YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE

PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP

PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP

GK

Polinucleótido que codifica la cadena pesada chBRCA84D (SEQ ID NO: 108):

gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc ccggaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctttggaa tgcactgggt tcgtcaggct ccagagaagg ggctggagtg ggtcgcatac attagtagtg acagtagtgc catctactat gcagacacag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atcccaagaa caccctgttc ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgg aagagggagg gaaaacattt actacggtag taggcttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga

C t y y C tC j ’clcl. t y y C a d y y a y t a C a d y t y C a a Cj’Cj’t C t C C d d C a d a y C C C t C C cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga

Las afinidades de unión relativas de los anticuerpos que contienen: (1) hBRCA84D-2VL y hBRCA84D-2VH (dos ensayos), (2) BRCA84D quimérico, (3) anticuerpo que contiene hBRCA84D-5VL y BRCA84D-HC quimérico, y (4) anticuerpo que contiene hBRCA84D-5VL y hBRCA84D-2VH se compararon. Los resultados se muestran en la Figura 14.

Ejemplo 11

Los anticuerpos anti-B7-H3 humanizados inhiben el crecimiento tumoral en xenoinjertos

Para demostrar la capacidad de los anticuerpos anti-B7-H3 humanizados para inhibir el crecimiento tumoral in vivo, se estudió el crecimiento tumoral de células de carcinoma de vejiga urinaria HT-1197 y de células de carcinoma renal A498 en un xenoinjerto murino. El anticuerpo humanizado hBRCA84D-2 (cadena VL de hBRCA84D-2/cadena VL de hBRCA84D-2) se modificó para comprender una región Fc con sustituciones L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L. El anticuerpo hBRCA84D-2 modificado con Fc se administró a los ratones (a una dosis de 1 pg/kg, 10 pg/kg, o 20 pg/kg) 7 días, 14 días, 21 días y 28 días después de la implantación de las células cancerosas. Los resultados muestran que a todas las dosis, el anticuerpo hBRCA84D-2 modificado con Fc administrado era capaz de inhibir el crecimiento tumoral de las células de carcinoma de vejiga urinaria HT-1197. (Figura 15) y de células de carcinoma renal A498 (Figura 16).

Ejemplo 12

Los reactivos de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) específicos para B7-H3 y el receptor de linfocitos T median la potente eliminación redirigida de linfocitos T

Se prepararon reactivos de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) específicos para B7-H3 y el receptor de linfocitos T ("TCR") y para el receptor Natural Killer Group 2D (NKG2D). Dichos DART™ tienen la capacidad de localizar un linfocito T (uniendo dicho linfocito T a la porción de unión a TCR de un DART™ de unión a TCR) o localizar un linfocito citolítico natural (uniendo dicho linfocito citolítico natural a la NKG2D -porción de unión de un DART™ de unión a NKG2D) a la ubicación de una célula cancerosa (uniendo dicha célula cancerosa a la parte de unión a B7-H3 del DART™). El linfocito T localizado o el linfocito citolítico natural pueden mediar entonces en la destrucción de la célula cancerosa en un proceso denominado en el presente documento eliminación "redirigida".

El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) específico para B7-H3 y el receptor de linfocitos T ("TCR") se construyó con los dominios variables anti-B7-H3 de los dominios variables hBRCA84D-2 y anti-TCR:

Cadena TCR VL x hBRCA84D VH-2-hélice E DART™ (SEQ ID NO: 109):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT

SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSSFGMHW

VRQAPGKGLE WVAYISSDSS AIYYADTVKG RFTISRDNAK NSLYLQMNSL

RDEDTAVYYC GRGRENIYYG SRLDYWGQGT TVTVSSGGCG GGEVAALEKE

VAALEKEVAA LEKEVAALEK

Polinucleótidos que codifican la cadena TCR VL x hBRCA84D VH-2-hélice E DART™ (SEQ ID NO: 110):

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agcgctggat ctatgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg ttcagcggca gtggatctgg gacagaattt actctcacaa tcagcagcct gcagcctgaa gattttgcaa cttattactg tcagcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt tggccagggg accaagcttg agatcaaagg aggcggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtcgag tctggcggag gactggtgca gcctggcggc tccctgagac tgtcttgcgc cgcctccggc ttcaccttct ccagcttcgg catgcactgg gtccgccagg ctccaggcaa gggactggaa tgggtggcct acatctcctc cgactcctcc gccatctact acgccgacac cgtgaagggc aggttcacca tctcccggga caacgccaag aactccctgt acctgcagat gaactccctg cgggacgagg acaccgccgt gtactactgc ggcagaggcc gggagaatat ctactacggc tcccggctgg attattgggg ccagggcacc accgtgaccg tgtcctccgg aggatgtggc ggtggagaag tggccgcact ggagaaagag gttgctgctt tggagaagga ggtcgctgca cttgaaaagg aggtcgcagc cctggagaaa

Cadena hBRCA84DVL-2 x TCR VH - hélice K (SEQ ID NO: 111):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYKFTSYVMH

WVRQAPGQGL EWIGYINPYN DVTKYNEKFK GRVTITADKS TSTAYLQMNS

LRSEDTAVHY CARGSYYDYD GFVYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAALKEKV

AALKEKVAAL KEKVAALKE

Polinucleótidos que codifican la cadena hBRCA84DVL-2 x TCR VH - hélice K (SEQ ID NO: 112):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt tcagctggtg cagtctggag ctgaggtgaa gaagcctggg gcctcagtga aggtctcctg caaggccagc ggttacaagt ttaccagcta cgtgatgcac tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatcg gatatattaa tccttacaat gatgttacta agtacaatga gaagttcaaa ggcagagtca cgattaccgc ggacaaatcc acgagcacag cctacctgca gatgaacagc ctgagatccg aggacacggc cgtgcactac tgtgcgagag ggagctacta tgattacgac gggtttgttt actggggcca agggactctg gtcactgtga

gctccggagg atgtggcggt ggaaaagtgg ccgcactgaa ggagaaagtt gctgctttga aagagaaggt cgccgcactt aaggaaaagg tcgcagccct gaaagag

El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble (DART™) específico para B7-H3 y el receptor Natural Killer Group 2D (NKG2D) se construyó con los dominios variables anti-B7-H3 de hBRCA84D-2 y dominios variables anti-TCR:

Cadena NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-hélice E DART™ (SEQ ID NO: 113):

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY

YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV

FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSSF

GMHWVRQAPG KGLEWVAYIS SDSSAIYYAD TVKGRFTISR DNAKNSLYLQ

MNSLRDEDTA VYYCGRGREN IYYGSRLDYW GQGTTVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEKE VAALEKEVA ALEK

Polinucleótidos que codifican la cadena NKG2D VL x hBRCA84D VH-2-hélice E DART™ (SEQ ID NO: 114):

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc aatcaccatc tcctgttctg gaagcagctc caacatcgga aataatgctg ttaactggta ccagcagctc ccaggaaagg ctcccaaact cctcatctat tatgatgacc tactgccctc aggggtctct gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagccttcc tggccatcag tgggctccag tctgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg acagcctgaa tggtccagtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggaggcggat ccggcggcgg aggcgaggtg cagctggtcg agtctggcgg aggactggtg cagcctggcg gctccctgag actgtcttgc gccgcctccg gcttcacctt ctccagcttc ggcatgcact gggtccgcca ggctccaggc aagggactgg aatgggtggc ctacatctcc tccgactcct ccgccatcta ctacgccgac accgtgaagg gcaggttcac catctcccgg gacaacgcca agaactccct gtacctgcag atgaactccc tgcgggacga ggacaccgcc gtgtactact gcggcagagg ccgggagaat atctactacg gctcccggct ggattattgg ggccagggca ccaccgtgac cgtgtcctcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aa

Cadena hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - hélice K (SEQ ID NO: 115):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GKAPKALIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV ESGGGLVKPG GSLRLSCAAS GFTFSSYGMH

WVRQAPGKGL EWVAFIRYDG SNKYYADSVK GRFTISRDNS KNTLYLQMNS

LRAEDTAVYY CAKDRGLGDG TYFDYWGQGT TVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

Polinudeótidos que codifican la cadena hBRCA84DVL-2 x NKG2D VH - hélice K (SEQ ID NO: 116):

gacatccagc tgacccagtc cccctccttc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc atcacatgca aggcctccca gaacgtggac accaacgtgg cctggtatca gcagaagcct ggcaaggccc ctaaggcgct gatctactcc gcctcctacc ggtactccgg cgtgccttcc aggttctccg gctccggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacaact accctttcac cttcggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gggaggcgga tccggcggcg gaggccaggt acagctggtg gagtctgggg gaggcctggt caagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcgtct ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg catttatacg gtatgatgga agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac tgtgcgaaag atcgaggttt gggggatgga acctactttg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

Con el fin de demostrar la capacidad de DART™ para mediar en dicha eliminación redirigida de células cancerosas, la hBRCA84D-2/anti-TCR DART™ ("T-DART ™") descrita anteriormente, hBRCA84D-2, hBRCA84D-2 (Fc modificado: L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L) y un control TCR-DART™ se incubaron a diversas concentraciones con células cancerosas diana (células de cáncer de pulmón SK-MES-1, células de carcinoma renal A498, células de cáncer de próstata LNCaP, o células de melanoma UACC-62) y PBMC efectoras en reposo (proporción E:T = 30:1) y se determinó la citotoxicidad (ensayo LDH). Los resultados de estas investigaciones se muestran en las Figuras 17A-17D y demuestran la capacidad de hBRCA84D-2/anti-TCR DART™ ("T-DART™") para mediar en la eliminación redirigida de células cancerosas.

Ejemplo 13

Perfil farmacocinético en ratones libres de tumores

Se inyectó anticuerpo anti-B7-H3 (Mab1) en ratones mCD16-/-, hCD16A_FOXN1 (5 mg/kg; IV) y se analizó el suero (antes de la dosis y) a los 2, 15, 30 minutos y 1, 2, 4, 6 horas y 1, 2, 3, 6, 8, 14, 21 y 28 días después de la inyección. Se descubrió que el anticuerpo tenía una T ^ de 10,54 días y una Cmáx de 43,493 pg/ml. Se descubrió que la concentración de anticuerpos a lo largo del tiempo era bifásica, que se ajusta en un modelo de dos componentes (Figuras 18A-18B). Los perfiles farmacocinéticos previstos generados utilizando un modelo de 2 compartimentos con parámetros de la dosis de 5 mg/kg se muestran en la Figura 18C.

Ejemplo 14

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para unirse a células cancerosas de vejiga urinaria HT-1197 y prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en un modelo de xenoinjerto murino

Se evaluó la capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 (Mab1) descrito anteriormente para unirse a HT-1197, una línea celular de carcinoma de vejiga urinaria que expresa B7-H3 humano. Tal como se muestra en la Figura 19, tales células presentan una mayor expresión de PRCA135 que HER2 y, por lo tanto, son particularmente adecuadas para evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos descritos en el presente documento para remediar los tumores HT-1197. De acuerdo con esta conclusión, se descubrió que las variantes de hBRCA84D del anticuerpo anti-B7-H3 eran capaces de unirse a células HT-1197. La Figura 20 muestra la afinidad de unión de los anticuerpos Mab1 a las células HT-1197.

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 8 x 106 células HT-1197. Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación por vía intravenosa Q7D x5 usando dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg (ocho ratones hembra por dosis). Se administró centuximab (anticuerpo anti-EGRF) a un grupo de control de ratones a dosis de 1, 5 o 15 mg/kg (ocho ratones hembra por dosis). También se inyectaron ocho ratones hembra con vehículo o con 10 mg/kg de control de IgG. Las mediciones de los tumores se realizaron cada 3 4 días. Los resultados del experimento (Figura 21A) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de vejiga urinaria en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 21b muestra los resultados obtenidos con centimab. Una comparación de las Figuras 21A y 21B demuestra que los anticuerpos descritos en el presente documento son más eficaces que el centimab para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de vejiga urinaria en el modelo de xenoinjerto murino. La Figura 21C compara los resultados obtenidos a las dosis máximas probadas.

Ejemplo 15

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para unirse a células cancerosas de vejiga urinaria HT-1376 y prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en un modelo de xenoinjerto murino

Se evaluó la capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 (Mab1) descrito anteriormente para unirse a HT-1376, una línea celular de carcinoma de vejiga urinaria que expresa B7-H3 humano. Tal como se muestra en las Figuras 22A-22B, tales células presentan una mayor expresión de PRCA135 que HER2 o PMSA y, por lo tanto, son particularmente adecuadas para evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos descritos en el presente documento para remediar los tumores HT-1376. De acuerdo con esta conclusión, se descubrió que las variantes de hBRCA84D del anticuerpo anti-B7-H3 eran capaces de unirse a células HT-1197. Las Figuras 22A-22B muestran la afinidad de unión de los anticuerpos Mab1 a las células HT-1197.

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 5 x 106 células HT-1376. Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación vía iv Q7D x4 a una dosis de 1 mg/kg. Los resultados del experimento (Figura 23) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de vejiga urinaria en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 16

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para unirse a las células cancerosas

El anticuerpo anti-B7-H3 BRCA84D se evaluó mediante análisis FACS para determinar su capacidad para unirse a: células de cáncer colorrectal SW480 y SW620; células de cáncer gástrico AGS; células de melanoma M-14 y LOX IMVI; células de cáncer de próstata 22rv; células de cáncer de páncreas AsPC-1 y BxPc-3; células de cáncer renal A498 y 786-0. Se descubrió que el anticuerpo podía unirse a todas esas células.

Ejemplo 17

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores gástricos en un modelo de xenoinjerto murino

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 5 x 106 células AGS. Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F l2 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación por vía intravenosa Q7D x5 usando dosis de 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Los resultados del experimento (Figura 24) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores gástricos en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 18

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para unirse a las células del cáncer de pulmón y prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en un modelo de xenoinjerto murino

Las células de cáncer de pulmón A549 se incubaron en presencia de hBRCA84D, la variante de chBRCA84D y hBRCA84 (0264 Fc) y se determinó el efecto citotóxico de estos anticuerpos. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 25, e indican que los tres anticuerpos eran citotóxicos para las células A549.

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 8 x 106 células A549. Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación vía iv Q7D x4 usando una dosis de 1 mg/kg. Los resultados del experimento (Figura 26) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de pulmón en el modelo de xenoinjerto murino.

El análisis FACS se realizó en células de cáncer de pulmón CaLu3 para determinar si tales células se unen a anticuerpos anti-B7-H3. El experimento confirmó que tales células expresan B7-H3 y se unen a los anticuerpos descritos en el presente documento. Para determinar si los anticuerpos descritos en el presente documento fueron eficaces para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de pulmón, los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 5 x 106 células CaLu3. Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación vía iv Q7D x4 usando una dosis de 0,5, 1 o 5 mg/kg. Los resultados del experimento (Figura 27) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de pulmón en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 19

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de melanoma LOX en un modelo de xenoinjerto murino

Los ratones (ocho hembras mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con células cancerosas de melanoma LOX-IMVI y luego se inocularon iv/Q7D x3 con control de PBS, control de IgG (5/mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5 o 10 mg/kg) o ip/BIWx2 con Doxetaxel (5, 10 o 20 mg/kg). Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días posteriores a la implantación. Los resultados del experimento (Figuras 28A-28C) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de melanoma en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 20

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de melanoma UACC-62 en un modelo de xenoinjerto murino

Los ratones (ocho hembras mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con células de cáncer de melanoma UACC-62 y luego se inocularon iv/Q7D x5 con control de PBS, control de IgG (5/mg/kg) o Mab1 (0,5, 1, 5 o 10 mg/kg). Las células tumorales se implantaron en 200 pl de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días posteriores a la implantación. Los resultados del experimento (Figura 29) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de melanoma en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 21

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para prevenir o inhibir el desarrollo del tumor de próstata 22rv en un modelo de xenoinjerto murino

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 6 x 106 células de cáncer de próstata 22rv y luego se inocularon iv/Q7D x4 con control de PBS, IgG (10 mg/kg), Mab1 (0,5, 1, 5 o 10 mg/kg; Q7D x5) o trastuzumab (1. 7 o 15 mg/kg). Las células tumorales se implantaron en 200 j l de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días posteriores a la implantación. Los resultados del experimento (Figuras 30A-30C) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer de próstata en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 22

Capacidad del anticuerpo anti-B7-H3 para unirse a las células del cáncer de riñón y prevenir o inhibir el desarrollo de tumores en un modelo de xenoinjerto murino

Se incubaron células de cáncer renal A498 en presencia de hBRCA84D, la variante de chBRCA84D y hBRCA84 (0264 Fc) y se determinó el efecto citotóxico de estos anticuerpos. Los resultados de este experimento se muestran en la Figura 31, e indican que los tres anticuerpos eran citotóxicos para las células A498.

El análisis IHC del tejido tumoral del xenoinjerto A498 se realizó usando anticuerpo BRCA84D biotinilado (20 jg/ml), BRCA69D (5 jg/m l) y anticuerpo anti-Her2 (20 jg/ml). Se descubrió que el anticuerpo BRCA84D se une al 20-40 % del tejido tumoral (débil a moderadamente: o +); Se descubrió que BRCA69D se une al 80-100 % del tejido tumoral (de moderada a fuerte: + o ++). Se descubrió que el anticuerpo BRCA84D se une débilmente al 40 % del tejido tumoral UMUC-3 (+); Se descubrió que BRCA69D se une de forma moderada o fuerte al 70 % de dicho tejido tumoral (++ o ++); se descubrió que el anticuerpo anti-Her2 se une de forma variable al 20 % de dicho tejido tumoral (+ -+++). Como controles, se descubrió que el anticuerpo anti-Her2 se une a células SKBR-3 (+++) y se descubrió que BRCA84D y BRCA69D pueden unirse a células Hs 700T (+++)

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con 5 x 106 células de cáncer renal A498. Las células tumorales se implantaron en 200 j l de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación por vía intravenosa Q7D x5 usando dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró centuximab (anticuerpo anti-EGRF) a un grupo de control de ratones a dosis de 1, 7 o 15 mg/kg. Se inyectaron ratones de control adicionales con vehículo o con 10 mg/kg de control de IgG. Los resultados del experimento (Figura 32) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer renal en el modelo de xenoinjerto murino.

Los ratones (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron alternativamente por vía subcutánea en sus flancos con 5 x 106 células cancerosas renales 786-0. Las células tumorales se implantaron en 200 j l de Medio F12 de Ham diluido a 1:1 con MATRIGEL™. El tratamiento con Mab1 se inició dentro de los 7 días de la implantación por vía intravenosa Q7D x5 usando dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró centuximab (anticuerpo anti-EGRF) a un grupo de control de ratones a dosis de 1,7 o 15 mg/kg. Se inyectaron ratones de control adicionales con vehículo o con 10 mg/kg de control de IgG. Los resultados del experimento (Figuras 33A-33B) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer renal en el modelo de xenoinjerto murino.

La actividad de Mab1 se comparó con la de paclitaxel, un inhibidor mitótico utilizado en la quimioterapia contra el cáncer. Los grupos de ocho ratones hembra (mCD16-/-, hCD16A+_FoxN1) se implantaron por vía subcutánea en sus flancos con células cancerosas renales 786-0 y luego se les proporcionó Mab1 vía Q7D iv a dosis de 0,1, 0,5, 1, 5 o 10 mg/kg. Se administró paclitaxel a un grupo de control de ocho de estos ratones a una dosis de 2,5 mg/kg los días 21, 28 y 35 del estudio. Se inyectaron ratones de control adicionales (siete hembras por grupo) con vehículo o con 5 mg/kg de control de IgG. Los resultados del experimento (Figura 34) muestran que Mab1 era capaz de prevenir o inhibir el desarrollo de tumores de cáncer renal en el modelo de xenoinjerto murino.

Ejemplo 23

Estudio de toxicología del mono cinomolgo

Se realiza un estudio de toxicología de monos cinomolgos para evaluar el perfil de toxicología aguda después de una dosis única de Mab1, determinar el perfil farmacocinético de Mab1, establecer una relación tiempo frente a la dosis para la inducción de citocinas asociadas con la activación de células efectoras, y evaluar el efecto del tratamiento farmacológico sobre el nivel de leucocitos circulantes (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales y linfocitos T).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un reactivo de redireccionamiento de doble afinidad, comprendiendo dicho reactivo:

(B) una cadena polipeptídica II que comprende un dominio de unión al epítopo VH de inmunoglobulina específico para unirse a B7-H3 y un dominio de unión al epítopo VL específico para unirse a dicha molécula distinta de B7-H3;

en donde las cadenas polipeptídicas I y II se asocian juntas para formar dominios de unión a epítopos funcionales capaces de unirse a B7-H3 y dicha molécula distinta de B7-H3, y en donde:

(1) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 25, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33, respectivamente; o

(2) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID No : 7 y la SEQ ID NO: 9, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 17, respectivamente; o

(3) dicha cadena polipeptídica I comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID n O: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 41, respectivamente, y dicha cadena polipeptídica II comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 49, respectivamente.

2. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de unión al epítopo VL específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la Se Q ID NO: 21, la SEQ ID NO: 23 y la SEQ ID NO: 25, respectivamente, y dicho dominio de unión al epítopo de VH específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 31 y la SEQ ID NO: 33, respectivamente.

3. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de unión al epítopo VL específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 9, respectivamente, y dicho dominio de unión al epítopo de VH específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la Se Q ID NO: 13, la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 17, respectivamente.

4. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de unión al epítopo VL específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la Se Q ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 41, respectivamente, y dicho dominio de unión al epítopo de VH específico para la unión de B7-H3 comprende CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45, la SEQ ID NO: 47 y la SEQ ID NO: 49, respectivamente.

5. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de la reivindicación 1, que comprende:

(A) un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 89; y (B) un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 99.

6. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicho reactivo comprende al menos una parte de una región Fc.

7. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

(A) dicha cadena polipeptídica I comprende adicionalmente un dominio en espiral E y dicha cadena polipeptídica II comprende adicionalmente un dominio en espiral K; o

(B) dicha cadena polipeptídica I comprende adicionalmente un dominio en espiral K y dicha cadena polipeptídica II comprende adicionalmente un dominio en espiral E.

8. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha molécula distinta de B7-H3 es:

(A) un hapteno, en el que opcionalmente dicho hapteno es isotiocianato de fluoresceína;

(B) un receptor de linfocitos T, CD3 (el correceptor de linfocitos T) o el receptor NKG2D; o

(C) un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en A33;

ADAM-9; ALCAM; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidasa M; CD103; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD36; CD40/CD154; CD45; CD46; CD5; CD56; CD79a/CD79b; CDK4; CEA; CTLA4; Citoqueratina 8; EGF-R; EphA2; ErbBl; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; gp100; HER-2/neu; virus del papiloma humano E6; virus del papiloma humano E7; integrina alfa-V-beta-6; JAM-3; K iD3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; Ma Rt ; MUC-1; MUM-1; Nacetilglucosaminiltransferasa; oncostatina M; p15; PIPA; PSA; PSMA; ROR1; sTn; receptor de TNF-p; receptor de TNF-a; receptor de TNF-y; receptor de transferrina; y receptor de VEGF.

9. Una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena polipeptídica del reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. Una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente eficaz del reactivo de redireccionamiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y (ii) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, que comprende además uno o más agentes contra el cáncer adicionales seleccionados del grupo que consiste en un agente quimioterapéutico, un agente radioterapéutico, agente terapéutico hormonal, una toxina y un agente inmunoterapéutico.

12. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10-11, para su uso en el diagnóstico del cáncer, en el que dicha molécula de unión a B7-H3 está marcada de forma detectable.

13. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10-11, para su uso en el tratamiento de cáncer en un paciente.

14. El reactivo de redireccionamiento de afinidad doble para su uso de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, en donde dicho cáncer se caracteriza por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de hueso, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomiosarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero.

15. Uso del reactivo de redireccionamiento de afinidad doble de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o de la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 10-11, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.