ES2926808T3 - Proteínas insecticidas derivadas de plantas y métodos para su uso - Google Patents

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Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para controlar plagas. Los métodos implican la transformación de organismos con una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína insecticida. En particular, las secuencias de ácido nucleico son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad insecticida. Así, se proporcionan bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son ácidos nucleicos insecticidas y proteínas de especies bacterianas. Las secuencias encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en organismos de interés que incluyen plantas, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos). Las proteínas pesticidas encuentran uso para controlar, inhibir el crecimiento o matar poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros, hongos y nematodos y para producir composiciones con actividad insecticida. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas insecticidas derivadas de plantas y métodos para su uso
Referencia al listado de secuencias presentado electrónicamente
La copia oficial del listado de secuencias enviado electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias con formato ASCII, con un archivo denominado “6472WOPCT_SequenceJJsting” creado el 3 de junio de 2016 y con un tamaño de 4831 kilobytes, se presentó junto con la memoria descriptiva. El listado de secuencias contenido en este documento en formato ASCII es parte de la memoria descriptiva.
Campo
Esta descripción se refiere al campo de la biología molecular. Se proporcionan nuevos genes que codifican proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas, y las secuencias de ácido nucleico que las codifican, son útiles para preparar formulaciones plaguicidas y en la producción de plantas transgénicas resistentes a plagas.
Antecedentes
El control biológico de plagas de insectos de importancia agrícola usando un agente microbiano, tales como hongos, bacterias u otra especie de insecto, ofrece una alternativa ecológica y comercialmente atractiva a los plaguicidas químicos sintéticos. En términos generales, el uso de bioplaguicidas presenta un menor riesgo de contaminación y peligros ambientales, y los bioplaguicidas brindan una mayor especificidad para la diana que es característica de los insecticidas químicos tradicionales de amplio espectro. Además, los bioplaguicidas a menudo cuestan menos de producir, y por lo tanto mejoran el rendimiento económico para una amplia variedad de cultivos.
Se sabe que ciertas especies de microorganismos del género Bacillus poseen actividad plaguicida contra una variedad de plagas de insectos, incluyendo lepidópteros, dípteros, coleópteros, hemípteros y otros. Bacillus thuringiensis (bt) y Bacillus popilliae se encuentran entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad de los insectos también se ha atribuido a cepas de B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus y B. cereus. Los insecticidas microbianos, en particular los obtenidos a partir de cepas de Bacillus, han jugado un papel importante en la agricultura como alternativas al control químico de plagas.
Las plantas de cultivo se han desarrollado con mayor resistencia a los insectos mediante la ingeniería genética de plantas de cultivo para producir proteínas plaguicidas a partir de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón han sido manipuladas genéticamente para producir proteínas plaguicidas aisladas de cepas de Bt. Estos cultivos modificados genéticamente ahora se usan ampliamente en la agricultura, y han brindado al agricultor una alternativa ecológica a los métodos tradicionales de control de insectos. Si bien han demostrado tener mucho éxito comercial, estas plantas de cultivo resistentes a los insectos y modificadas genéticamente brindan resistencia solo a una gama limitada de plagas de insectos económicamente importantes. En algunos casos, los insectos pueden desarrollar resistencia a diferentes compuestos insecticidas, lo que plantea la necesidad de identificar agentes de control biológico alternativos para el control de plagas.
En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de nuevas proteínas plaguicidas con diferentes intervalos de actividad insecticida contra plagas de insectos, por ejemplo proteínas insecticidas que sean activas contra una variedad de insectos del orden Lepidoptera y el orden Coleoptera, incluyendo, pero sin limitarse a, plagas de insectos que han desarrollado resistencia a los insecticidas existentes.
El documento WO 2013/016617 A1 se refiere a proteínas variantes de AXMI205 y a métodos para su uso. El documento WO 2011/002992 A1 se refiere al gen plaguicida AXMI-205 y a métodos para su uso. El documento US 2014/274885 A1 se refiere a polipéptidos PHI-4 y a métodos para su uso. Rosado et al. (Cellular Microbiology 10.9 (2008): 1765-1774) se refiere a la familia MACPF/CDC de toxinas formadoras de poros. Morita-Yamamuro et al. (Plant and cell physiology 46.6 (2005): 902-912) se refieren al gen CAD1 de Arabidopsis que codifica una proteína que contiene un dominio MACPF, y a su papel en el control de la muerte celular programada en el sistema inmunológico de las plantas. Zaitseva et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences 116.8 (2019): 2897-2906) se refieren a la caracterización de la estructura-función de la proteína insecticida GNIP1Aa, un miembro de las familias MACPF y b-trípode.
Sumario
La invención proporciona un polipéptido insecticida recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, en el que la actividad insecticida es contra Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
La invención también proporciona un polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido insecticida de la invención.
La invención proporciona además un constructo de ADN que comprende el polinucleótido de la invención enlazado operativamente a las secuencias reguladoras 5’ y 3’.
La invención proporciona además una planta o célula vegetal transgénica que comprende el constructo de ADN de la invención como transgén.
La invención también proporciona una composición que comprende el polipéptido insecticida recombinante de la invención.
La invención proporciona además una proteína de fusión que comprende el polipéptido insecticida recombinante de la invención, en la que la proteína de fusión tiene actividad insecticida contra Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
La invención proporciona además un método para controlar una plaga de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte), que comprende poner en contacto la población de plagas de insectos con el polipéptido insecticida de la invención.
La invención también proporciona un método para inhibir el crecimiento o exterminar una plaga o población de plagas de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte), que comprende poner en contacto la plaga de insectos con una composición que comprende el polipéptido insecticida de la invención.
La invención proporciona adicionalmente el uso del polipéptido de la invención para inhibir el crecimiento o eliminar una plaga o población de plagas Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
En un aspecto, se describen composiciones y métodos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican secuencias para polipéptidos plaguicidas e insecticidas, vectores que comprenden esas moléculas de ácido nucleico, y células hospedantes que comprenden los vectores. Las composiciones también incluyen las secuencias de polipéptidos plaguicidas y anticuerpos contra esos polipéptidos. Las secuencias de ácido nucleico pueden usarse en constructos de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluyendo microorganismos y plantas. Las secuencias nucleotídicas o de aminoácidos pueden ser secuencias sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo que incluye, pero no se limita a, un microorganismo o una planta. Las composiciones también comprenden bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformadas.
En otro aspecto, se describen moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican perforinas de origen vegetal, incluyendo sustituciones, supresiones, inserciones, fragmentos y combinaciones de aminoácidos. En particular, se describen moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que codifican polipéptidos IPD079 que incluyen sustituciones, supresiones, inserciones, fragmentos y combinaciones de aminoácidos. Además, se engloban las secuencias de aminoácidos correspondientes a los polipéptidos IPD079. Se describen aquí moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes capaces de codificar polipéptidos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, y SEQ ID NO: 140, así como variantes de sustitución de aminoácidos, variantes de supresión, variantes de inserción, fragmentos de las mismas, y combinaciones de los mismos. También se incluyen las secuencias de ácido nucleico que son complementarias a una secuencia de ácido nucleico descrita aquí o que se hibridan con una secuencia descrita aquí.
En otro aspecto, se describen polipéptidos IPD079 aislados o recombinantes que incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, y SEQ ID NO: 140, así como variantes de sustitución de aminoácidos, variantes de supresión, variantes de inserción, fragmentos de las mismas, y combinaciones de los mismos.
En otro aspecto, se describen métodos para producir los polipéptidos, y para usar esos polipéptidos para controlar o exterminar plagas de lepidópteros, coleópteros, nematodos, hongos y/o dípteros. Las plantas transgénicas descritas aquí expresan una o más de las secuencias plaguicidas descritas aquí. En diversos aspectos, la planta transgénica comprende además uno o más genes adicionales para la resistencia a insectos, por ejemplo uno o más genes adicionales para controlar plagas de coleópteros, lepidópteros, hemípteros o nematodos. Un experto en la técnica entenderá que la planta transgénica también puede comprender cualquier gen que imparta un rasgo agronómico de interés.
En otro aspecto, también se incluyen métodos para detectar en una muestra los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos aquí. Se describe aquí un kit para detectar la presencia de una perforina de origen vegetal, que incluye, pero no se limita a, un polipéptido IPD079 de la descripción, o detectar la presencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido IPD079 en una muestra. El kit se puede proporcionar junto con todos los reactivos y muestras de control necesarios para llevar a cabo un método para detectar el agente deseado, así como las instrucciones de uso.
Las composiciones y los métodos descritos aquí son útiles para la producción de organismos con mayor resistencia o tolerancia a las plagas. Estos organismos, y las composiciones que comprenden los organismos, son deseables para fines agrícolas. Las composiciones descritas aquí también son útiles para generar proteínas alteradas o mejoradas que tienen actividad plaguicida, o para detectar la presencia de polipéptidos IPD079.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1A-11 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos, usando módulo ALIGNX® del Vector NTI® suite, de IPD079Aa, (SEQ ID NO: 2), IPD079Ab (SEQ ID NO: 4), IPD079Ac (SEQ ID NO: 6), IPD079Ad (SEQ ID NO: 8), IPD079Ae (SEQ ID NO: 10), IPD079Af (SEQ ID NO: 12), IPD079Ag (SEQ ID NO: 14), IPD079Ah (SEQ ID NO: 16), IPD079Ai (SEQ ID NO: 18), IPD079Aj (SEQ ID NO: 20), IPD079Ak (SEQ ID NO: 22), IPD079AI (SEQ ID NO: 26), IPD079Am (SEQ ID NO: 28), IPD079An (SEQ ID NO: 30), IPD079Ao (SEQ ID NO: 32), IPD079Ap (SEQ ID NO: 36), IPD079Aq (SEQ ID NO: 38), IPD079Ar (SEQ ID NO: 40), IPD079As (SEQ ID NO: 44), IPD079At (SEQ ID NO: 46), IPD079Au (SEQ ID NO: 48), IPD079Av (SEQ ID NO:50), IPD079Aw (SEQ ID NO: 52), IPD079Ax (SEQ ID NO: 54), IPD079Az (SEQ ID NO: 74), IPD079Ba (SEQ ID NO: 24), IPD079Bb (SEQ ID NO:34), IPD079Bc (SEQ ID NO: 42), IPD079Bd (SEQ ID NO: 76), IPD079Be (SEQ ID NO: 78), IPD079Bf (SEQ ID NO: 80), IPD079Bg (SEQ ID NO: 82), IPD079Bh (SEQ ID NO: 84), IPD079Bi (SEQ ID NO: 86), IPD079Bj (SEQ ID NO: 88), IPD079Bk (SEQ ID NO: 90), IPD079BI (SEQ ID NO: 92), e IPD079Bm (SEQ ID NO: 94). Se resalta la diversidad de secuencias.
La Fig. 2A-2J muestra una alineación de secuencias de aminoácidos, usando módulo ALIGNX® del Vector NTI® suite, de IPD079Eb (SEQ ID NO: 58), IPD079Ea (SEQ ID NO: 56), IPD079Eaa (SEQ ID NO: 132), IPD079Eab (SEQ ID NO:
134), IPD079Eac (SEQ ID NO: 136), IPD079Ead (SEQ ID NO: 138), IPD079Eae (SEQ ID NO: 140), IPD079Ec (SEQ ID NO: 60), IPD079Ed (SEQ ID NO: 62), IPD079Ee (SEQ ID NO: 64), IPD079Ef (SEQ ID NO: 66), IPD079Eg (SEQ ID NO: 68), IPD079Eh (SEQ ID NO: 70), IPD079Ei (SEQ ID NO: 96), IPD079Ej (SEQ ID NO: 98), IPD079Ek (SEQ ID NO:
100), IPD079EI (SEQ ID NO: 102), IPD079Em (SEQ ID NO: 104), IPD079En (SEQ ID NO: 106), IPD079Eo (SEQ ID NO: 108), IPD079Ep (SEQ ID NO: 110), IPD079Eq (SEQ ID NO: 112), IPD079Er (SEQ ID NO: 114), IPD079Es (SEQ ID NO: 116), IPD079Et (SEQ ID NO: 118), IPD079Eu (SEQ ID NO: 120), IPD079Ev (SEQ ID NO: 122), IPD079Ew (SEQ ID NO: 124), IPD079Ex (SEQ ID NO: 126), IPD079Ey (SEQ ID NO: 128), IPD079Ez (SEQ ID NO: 130 y IPD079Fa (SEQ ID NO: 142). Se resalta la diversidad de secuencias.
La Fig. 3 muestra un gráfico de la competición homóloga del % de unión total del polipéptido IPD079Aa marcado con Alexa 1 nM (SEQ ID NO: 2) a las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) del gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW) frente a la concentración (nM) del polipéptido IPD079Aa sin marcar (SEQ ID NO: 2).
La Fig. 4 muestra un gráfico de la competición homóloga del % de unión total del polipéptido IPD079Ea marcado con Alexa 1 nM (SEQ ID NO: 56) a las vesículas de membrana del borde en cepillo (BBMV) del gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW) frente a la concentración (nM) del polipéptido IPD079Ea sin marcar (SEQ ID NO: 56).
La Fig. 5 muestra un gráfico de la puntuación de lesión del nódulo del gusano de la raíz del maíz (CRWNIS) para eventos individuales transformados con constructos PHP68039, PHP68040, PHP76130 y PHP76131 que contienen diseños de genes que codifican el polipéptido IPD079Aa (SEQ iD NO: 2) y el polipéptido IPD079Ea (SeQ ID NO : 56), en comparación con los eventos de control negativo que contenían el constructo que carecía de un polinucleótido IPD079 (vacío). Cada símbolo “+” representa un evento individual.
La Fig. 6A-6B muestra una alineación de secuencias de aminoácidos, usando módulo ALIGNX® del Vector NTI® suite, de IPD079Aa, (SEQ ID NO: 2), IPD079Ea (SEQ ID NO: 56), y las quimeras de IPD079: Chimera1 (SEQ ID NO: 1277), Chimera2 (SeQ ID NO: 1278), y Chimera3 (SEQ ID NO: 1276). Se destaca la diversidad de secuencias. Las posiciones de cruce de las quimeras se indican con un “▼” encima de la secuencia de IPD079Aa.
Descripción detallada
Como se usa aquí, las formas singulares “un”, “y” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de tales células, y la referencia a “la proteína” incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta descripción, a menos que se indique claramente lo contrario.
La presente descripción se refiere a composiciones y métodos para controlar plagas. Los métodos implican la transformación de organismos con secuencias de ácido nucleico que codifican perforinas de origen vegetal. Los métodos implican la transformación de organismos con secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos IPD079. En particular, las secuencias de ácido nucleico descritas aquí son útiles para preparar plantas y microorganismos que poseen actividad plaguicida. Así, se describen bacterias, plantas, células vegetales, tejidos vegetales y semillas transformadas. Las composiciones son secuencias de ácido nucleico o perforinas de especies vegetales. Las secuencias de ácido nucleico encuentran uso en la construcción de vectores de expresión para la transformación posterior en organismos de interés, como sondas para el aislamiento de otros genes homólogos (o parcialmente homólogos), y para la generación de perforina de origen vegetal alteradas, particularmente polipéptidos IPD079, por métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio, intercambio de dominios, o transposición de ADN. Las perforinas de origen vegetal encuentran uso para controlar o exterminar poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hongos, hemípteros y nematodos, y para producir composiciones con actividad plaguicida. Las plagas de insectos de interés incluyen, pero no se limitan a, especies de lepidópteros que incluyen, pero no se limitan a: gusano cogollero del maíz (CEW) (Helicoverpa zea), barrenador europeo del maíz (ECB) (Ostrinia nubilalis), polilla de espalda de diamante, por ejemplo Helicoverpa zea Boddie; falso medidor de la soja, por ejemplo, Pseudoplusia includens Walker; y oruga de la judía de terciopelo, por ejemplo Anticarsia gemmatalis Hübner, y especies de coleópteros, que incluyen, pero no se limitan a, el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera) - WCRW, gusano de la raíz del maíz del sur (Diabrotica undecimpunctata howardi) - SCRW, y gusano de la raíz del maíz del norte (Diabrotica barberi) - NCRW. Los polipéptidos IPD079 encuentran uso para controlar o exterminar poblaciones de plagas de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hongos, hemípteros y nematodos, y para producir composiciones con actividad plaguicida.
Por “toxina plaguicida” o “proteína plaguicida” se usa aquí para referirse a una toxina que tiene actividad tóxica contra una o más plagas, incluyendo, pero sin limitarse a, miembros de los órdenes Lepidoptera, Diptera, Hemiptera y Coleoptera, o el filo Nematoda, o una proteína que tiene homología con dicha proteína. Se han aislado proteínas plaguicidas de organismos que incluyen, por ejemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans y Paenibacillus popilliae. Las proteínas plaguicidas incluyen, pero no se limitan a: proteínas insecticidas de PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1-13); de Pseudomonas protegens cepa CHAO y Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386; n° de acceso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12343-12349) y de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50, y Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult.
89:159-168); proteínas insecticidas de Photorhabdus sp. y Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal, 3:101-118, y Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); patente US número 6.048.838, y patente US número 6.379.946; un polipéptido PIP-1 de la publicación de patente estadounidense US20140007292; un polipéptido AfIP-1A y/o AfIP-1 B de la publicación de patente estadounidense US20140033361; un polipéptido PHI-4 de la publicación de patente estadounidense US20140274885 y US20160040184; un polipéptido PIP-47 de la publicación PCT número WO2015/023846, un polipéptido PIP-72 de la publicación PCT número WO2015/038734; un polipéptido PtlP-50 y un polipéptido PtlP-65 de la publicación PCT número WO2015/120270; un polipéptido PtIP-83 de la publicación PCT número WO2015/120276; un polipéptido PtlP-96 del documento PCT número de serie PCT/US15/55502; un polipéptido IPD073 del documento PCT número de serie PCT/US16/32273, un polipéptido IPD082 del documento US número de serie 62/269482, y endotoxinas 5 que incluyen, pero no se limitan a, las clases Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71, Cry72, Cry73, y Cry 74 de genes de 5-endotoxina, y los genes citolíticos cyt1 y cyt2 de B. thuringiensis. Los miembros de estas clases de proteínas insecticidas de B. thuringiensis son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, a la que se puede acceder en Internet utilizando el prefijo “www”).
Los ejemplos de endotoxinas 5 también incluyen, pero no se limitan a, proteínas Cry1A de las patentes US números 5.880.275 y 7.858.849; una toxina DIG-3 o DIG-11 (eliminación N-terminal de variantes de a-hélice 1 y/o a-hélice 2 de proteínas cry, tales como Cry1A, Cry3A) de las patentes US números 8.304.604, 8.304.605, 8.476.226, y 9.006.520; Cry1B de la publicación de solicitud de patente US número 2006/0112447; Cry1C de la patente US número 6.033.874; Cry1F de las patentes US números 5.188.960 y 6.218.188; quimeras Cry1A/F de las patentes US números 7.070.982; 6.962.705 y 6.713.063); una proteína Cry2, tal como la proteína Cry2Ab de la patente US número 7.064.249); una proteína Cry3A que incluye, pero no se limita a, una proteína insecticida híbrida diseñada por ingeniería (eHIP) creada fusionando combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (publicación de solicitud de patente US número 2010/0017914); una proteína Cry4; una proteína Cry5; una proteína Cry6; proteínas Cry8 de las patentes US números 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 y 7.462.760; una proteína Cry9, tal como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; una proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7145-7151; una Cry22, una proteína Cry34Ab1 de las patentes US números 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593; una proteína CryET33 y cryET34 de las patentes US números 6.248.535, 6.326.351,6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 y 7.504.229; homólogos de CryET33 y CryET34 de la patente US número 8.796.026, publicación de patente US número 2012/0278954, y publicación PCT número WO 2012/139004; una proteína Cry35Ab1 de las patentes US números 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593; una proteína Cry46, una proteína Cry 51, una toxina binaria Cry; una TIC901 o una toxina relacionada; TIC807 de la patente US número 8.609.936; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 del documento WO 2007/027776; AXMI-027, AXMI-036 y AXMI-038 de la patente US número 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de la patente US número 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 y AXMI-021 del documento WO 2006/083891; AXMI-010 del documento WO 2005/038032; AXMI-003 del documento WO 2005/021585; AXMI-008 de la patente US número 7.351.881; AXMI-006 de publicación de solicitud de patente US número 2004/0216186; AXMI-007 de publicación de solicitud de patente US número 2004/0210965; AXMI-009 de la solicitud de patente US número 2004/0210964; AXMI-014 de publicación de solicitud de patente US número 2004/0197917; AXMI-004 de la patente US número 7.355.099; AXMI-028 y AXMI-029 del documento WO 2006/119457, patentes US números 7.622.572, 7.803925, 7.803.391, 7.811.598, 8.314.292; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080, AXMI-009, AXMI-014 y AXMI-004 del documento WO 2004/074462; AXMl-150 de la patente u S número 8.084.416; AXMI-205 de publicación de solicitud de patente US número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 y AXMI-064 de la patente US número 8.829.279 o la publicación de patente US número US20140344999; AXMI-R1 y proteínas relacionadas de la patente US número 8.299.217; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z y AXMI225z de la patente US número 8.686.124; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 y AXMI231 de la patente US número 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 y AXMI-184 de la patente US número 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 y AXMI-045 de la publicación de solicitud de patente US número 2013/0117884; AXMI-066 y AXMI-076 de la publicación de solicitud de patente US número 2009/0144852; AXMI128, AXMI130, AXMI131, AXMI133, AXMI140, AXMI141, AXMI142, AXMI143, AXMI144, AXMI146, AXMI148, AXMI149, AXMI152, AXMI153, AXMI154, AXMI155, AXMI156, AXMI157, AXMI158, AXMI162, AXMI165, AXMI166, AXMI167, AXMI168, AXMI169, AXMI170, AXMI171, AXMI172, AXMI173, AXMI174, AXMI175, AXMI176, AXMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de la patente US número 8.318.900 o la publicación de patente US número 2013/0055469; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXMI109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de la patente US número 8.461.421 y publicación de patente Us número 2013/0305412, proteínas cry tales como Cry1 A y Cry3A que tienen sitios proteolíticos modificados de patente US número 8.319.019; una proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 de patente US número 8.551.757. La actividad insecticida de las proteínas Cry es bien conocida por los expertos en la técnica (para una revisión, véase, van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). El uso de proteínas Cry como rasgos de plantas transgénicas es bien conocido por los expertos en la técnica, y las plantas transgénicas Cry que incluyen, pero no se limitan a, plantas que expresan Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1 Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c y CBI-Bt han recibido la aprobación regulatoria (véase, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9: 283-300, y el c ErA. (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. en ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database, a la que se puede acceder en la red mundial usando el prefijo “www"). Más de una proteína plaguicida bien conocida por un experto en la técnica también se puede expresar en plantas, tales como Vip3Ab y Cry1Fa (documento US2012/0317682); Cry1BE y Cry1F (documento US2012/0311746); Cry1CA y Cry1AB (documento US2012/0311745); Cry1F y CryCa (documento US2012/0317681); Cry1DA y Cry1BE (documento US2012/0331590); Cry1DA y Cry1Fa (documento US2012/0331589); Cry1AB y Cry1BE (documento US2012/0324606); Cry1Fa y Cry2Aa and Cry1I y Cry1E (documento US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa (documento US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab y Cry3Aa (documento US20130167268); y Cry3A y Cry1Ab o Vip3Aa (documento US20130116170). Las proteínas plaguicidas también incluyen lipasas insecticidas que incluyen lípido acil hidrolasas de la patente US número 7.491.869, y colesterol oxidasas tales como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Comun 15: 1406-1413). Las proteínas plaguicidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetales) de las patentes US números 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686, y 8.237.020 y similares. Otras proteínas VIP son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, a la que se puede acceder en la red mundial usando el prefijo “www"). Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de complejos de toxinas (TC), que se pueden obtener de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse, patentes US números 7.491.698 y 8.084.418). Algunas proteínas de TC tienen actividad insecticida “independiente”, y otras proteínas de TC aumentan la actividad de las toxinas independientes producidas por el mismo organismo dado. La toxicidad de una proteína de TC “autónoma” (de Fotorhabdus, Xenorhabdus o Paenibacillus, por ejemplo) puede mejorarse con uno o más “potenciadores” de proteína de TC derivados de un organismo fuente de un género diferente. Hay tres tipos principales de proteínas de TC. Como se menciona aquí, las proteínas de Clase A (“Proteína A”) son toxinas independientes. Las proteínas de Clase B (“Proteína B”) y las proteínas de Clase C (“Proteína C”) aumentan la toxicidad de las proteínas de Clase A. Ejemplos de proteínas de Clase A son TcbA, TcdA, XptA1 y XptA2. Ejemplos de proteínas de Clase B son TcaC, TcdB, XptB1Xb y XptC1Wi. Ejemplos de proteínas de Clase C son TccC, XptC1Xb y XptB1Wi. Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de veneno de araña, de serpiente y de escorpión. Los ejemplos de péptidos de veneno de araña incluyen, pero no se limita a, péptidos de licotoxina-1 y mutantes de los mismos (patente US número 8.334.366).
En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 incluye secuencias de aminoácidos deducidas de las secuencias de ácido nucleico de longitud completa descritas aquí y secuencias de aminoácidos que son más cortas que las secuencias de longitud completa, ya sea debido al uso de un sitio de inicio en dirección 3’ alternativo o debido al procesamiento, que produce una proteína más corta que tiene actividad plaguicida. El procesamiento puede ocurrir en el organismo en el que se expresa la proteína, o en la plaga después de la ingestión de la proteína.
Por lo tanto, se describen aquí nuevas secuencias de ácido nucleico aisladas o recombinantes que confieren actividad plaguicida. También se describen las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos IPD079. La proteína resultante de la traducción de estos genes del polipéptido IPD079 permite que las células controlen o eliminen las plagas que la ingieren.
Moléculas de ácido nucleico, y variantes y fragmentos de las mismas
En algunos aspectos, moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican perforinas de origen vegetal o porciones biológicamente activas de las mismas, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. Un aspecto se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas o recombinantes que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos IPD079 o porciones biológicamente activas de los mismos, así como moléculas de ácido nucleico suficientes para usar como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas con regiones de homología de secuencia. Como se usa aquí, la expresión “molécula de ácido nucleico” se refiere a moléculas de ADN (por ejemplo, ADN recombinante, ADNc, ADN genómico, ADN de plástido, ADN mitocondrial) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferiblemente es ADN bicatenario.
Una molécula de ácido nucleico (o ADN) “aislada” se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo in vitro. Una molécula de ácido nucleico (o ADN) “recombinante” se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico (o ADN) que está en una célula hospedante bacteriana o vegetal recombinante. En algunos aspectos, un ácido nucleico “aislado” o “recombinante” está libre de secuencias (preferiblemente secuencias que codifican proteínas) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5’ y 3’ del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del que deriva el ácido nucleico. Para los fines de la descripción, “aislado” o “recombinante”, cuando se usa para referirse a moléculas de ácido nucleico, excluye los cromosomas aislados. Por ejemplo, en diversos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica los polipéptidos IPD079 puede contener menos de alrededor de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de ácido nucleico que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que deriva el ácido nucleico.
En algunos aspectos, una molécula de ácido nucleico aislada, que codifica una perforina de origen vegetal o un polipéptido IPD079, tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con la secuencia de ácido nucleico nativa o genómica. En algunos aspectos, el cambio en la secuencia de ácido nucleico nativa o genómica incluye, pero no se limita a: cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético; cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la sustitución, inserción, supresión y/o adición de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa o genómica; eliminación de uno o más intrones; eliminación de una o más regiones reguladoras en dirección 5’ o en dirección 3’; y supresión de la región no traducida 5’ y/o 3’ asociada con la secuencia de ácido nucleico genómica. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica las perforinas de origen vegetal, o el polipéptido IPD079 de la descripción, es una secuencia no genómica.
Se contempla una variedad de polinucleótidos que codifican perforinas de origen vegetal, y polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas. Dichos polinucleótidos son útiles para la producción de perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 de la descripción en células hospedantes cuando se enlazan operativamente a secuencias adecuadas promotoras, potenciadoras, de terminación de la transcripción, y/o de poliadenilación. Dichos polinucleótidos también son útiles como sondas para aislar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos que codifican perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos IPD079
Una fuente de polinucleótidos que codifican perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas es un helecho u otra especie vegetal primitiva. Una fuente de polinucleótidos que codifican polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas es un helecho u otra especie vegetal primitiva que contiene un polinucleótido IPD079 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139, que codifica un polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140. Los polinucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139 se pueden usar para expresar polipéptidos IPD079 en hospedantes bacterianos que incluyen, pero no se limita a, células hospedantes bacterianas de Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas y Rhizobium. Los polinucleótidos también son útiles como sondas para aislar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos que codifican polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas. Tales sondas se pueden usar para identificar polinucleótidos homólogos o sustancialmente homólogos derivados de especies de Pteridophyta.
Los polinucleótidos que codifican las perforinas de origen vegetal y los polipéptidos IPD079 de la descripción también se pueden sintetizar de novo a partir de la secuencia de las perforinas de origen vegetal o del polipéptido IPD079. La secuencia del gen del polinucleótido se puede deducir de una secuencia del polipéptido IPD079, mediante el uso del código genético. Se pueden usar programas informáticos tal como “BackTranslate” (GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, CA) para convertir una secuencia peptídica en la secuencia nucleotídica correspondiente que codifica el péptido. Los ejemplos de secuencias de perforinas de origen vegetal que se pueden usar para obtener las secuencias codificantes nucleotídicas correspondientes incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 158­ 1248. Los ejemplos de secuencias del polipéptido IPD079 que se pueden usar para obtener las secuencias codificantes nucleotídicas correspondientes incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID n O: 136, SEQ ID NO: 138, y SEQ ID NO: 140. Además, las secuencias de polinucleótidos sintéticas que codifican perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 de la descripción pueden diseñarse para que se expresen en plantas. La patente US número 5.500.365 describe un método para sintetizar genes de plantas para mejorar el nivel de expresión de la proteína codificada por el gen sintetizado. Este método se refiere a la modificación de las secuencias de genes estructurales del transgén exógeno, para hacer que la planta las transcriba, procese, traduzca y exprese de manera más eficaz. Las características de los genes que se expresan bien en plantas incluyen la eliminación de secuencias que pueden causar poliadenilación o ayuste de intrones no deseado en la región codificante de un transcrito génico mientras se retiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de la porción tóxica de la proteína insecticida. Un método similar para obtener una expresión mejorada de transgenes en plantas monocotiledóneas se describe en la patente US número 5.689.052.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 es un polinucleótido que tiene la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139, y variantes, fragmentos y complementos de las mismas. “Complemento” se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico que es suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico dada, de modo que puede hibridarse con la secuencia de ácido nucleico dada para formar así un dúplex estable. “Variantes de la secuencia de polinucleótidos” se usa aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico que, excepto por la degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica la perforina de origen vegetal o el polipéptido IPD079 es una secuencia de ácido nucleico no genómica. Como se usa aquí, una “secuencia de ácido nucleico no genómica” o “molécula de ácido nucleico no genómica” o “polinucleótido no genómico” se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene uno o más cambios en la secuencia de ácido nucleico en comparación con una secuencia de ácido nucleico nativa o genómica. En algunos aspectos, el cambio a una molécula de ácido nucleico nativa o genómica incluye, pero no se limita a: cambios en la secuencia de ácido nucleico debido a la degeneración del código genético; optimización de codones de la secuencia de ácido nucleico para expresión en plantas; cambios en la secuencia de ácido nucleico para introducir al menos una sustitución, inserción, eliminación y/o adición de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa o genómica; eliminación de uno o más intrones asociados con la secuencia de ácido nucleico genómico; inserción de uno o más intrones heterólogos; supresión de una o más regiones reguladoras en dirección 5’ o en dirección 3’ asociadas con la secuencia de ácido nucleico genómica; inserción de una o más regiones reguladoras en dirección 5’ o en dirección 3’ heterólogas; supresión de la región no traducida 5’ y/o 3’ asociada con la secuencia de ácido nucleico genómica; inserción de una región no traducida 5’ y/o 3’ heteróloga; y modificación de un sitio de poliadenilación. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica es un ADNc. En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico no genómica es una secuencia de ácido nucleico sintética.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 es un polinucleótido no genómico que tiene una secuencia nucleotídica que tiene al menos 50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, s Eq ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139, en la que el polipéptido IPD079 tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica un polipéptido IPD079 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140, que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1011, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más sustituciones de aminoácidos en comparación con el aminoácido nativo en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico codifica el polipéptido de perforina derivado de plantas de una cualquiera de SEQ ID NO: 158-1248.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico que codifica la perforina de origen vegetal o el polipéptido IPD079 deriva de una especie de helecho en la División Pteridophyta. La filogenia de los helechos como se usa aquí se basa en la clasificación de los heléchos existentes por A. R. Smith et al, TAXON, 55:705-731 (2006). Otras clasificaciones filogenéticas de los helechos existentes son conocidas por los expertos en la técnica. Se puede encontrar información adicional sobre la filogenia de los helechos en mobot.org/MOBOT/research/APweb/ (a la que se puede acceder usando el prefijo “www"), y Schuettpelz E. y Pryer K. M., TAXON 56: 1037-1050 (2007) basado en tres genes plástidos. Se pueden encontrar helechos adicionales y otras especies de plantas primitivas en homepages.caverock.net.nz/~bj/fern/list.htm (a la que se puede acceder usando el prefijo http://).
También se describen moléculas de ácido nucleico que codifican productos de transcripción y/o traducción que posteriormente se empalman para producir finalmente perforinas de origen vegetal funcionales o polipéptidos IPD079. El ayuste se puede lograr in vitro o in vivo, y puede implicar ayuste en cis o trans. El sustrato para el ayuste puede ser polinucleótidos (por ejemplo, transcritos de ARN) o polipéptidos. Un ejemplo de ayuste en cis de un polinucleótido es cuando se elimina un intrón insertado en una secuencia codificante, y las dos regiones exónicas flanqueantes se empalman para generar una secuencia codificante del polipéptido IPD079. Un ejemplo de ayuste en trans sería cuando un polinucleótido se codifica separando la secuencia codificante en dos o más fragmentos que pueden transcribirse por separado y luego empalmarse para formar la secuencia codificante del plaguicida de longitud completa. El uso de una secuencia potenciadora del ayuste, que se puede introducir en un constructo, puede facilitar el ayuste en cis o trans de polipéptidos (patentes US números 6.365.377 y 6.531.316). Por lo tanto, en algunos aspectos, los polinucleótidos no codifican directamente un polipéptido IPD079 de longitud completa, sino que codifican un fragmento o fragmentos de un polipéptido IPD079. Estos polinucleótidos se pueden usar para expresar un polipéptido IPD079 funcional a través de un mecanismo que implica ayuste, en el que el ayuste puede ocurrir a nivel polinucleotídico (por ejemplo, intrón/exón) y/o polipeptídico (por ejemplo, inteína/exteína). Esto puede ser útil, por ejemplo, para controlar la expresión de la actividad plaguicida, dado que un polipéptido plaguicida funcional solo se expresará si todos los fragmentos requeridos se expresan en un entorno que permita los procesos de ayuste para generar un producto funcional. En otro ejemplo, la introducción de una o más secuencias de inserción en un polinucleótido puede facilitar la recombinación con un polinucleótido de baja homología; el uso de un intrón o inteína para la secuencia de inserción facilita la eliminación de la secuencia intermedia, restaurando así la función de la variante codificada.
Se describen aquí moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de estas secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos IPD079. “Fragmento”, como se usa aquí, se refiere a una parte de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079. Un fragmento de una secuencia de ácido nucleico puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido IPD079, o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando los métodos descritos a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 comprenden al menos alrededor de 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 390 o 420 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de ácido nucleico de longitud completa que codifica un polipéptido IPD079 descrito aquí, dependiendo del uso previsto. “Nucleótidos contiguos” se usa aquí para referirse a restos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Los fragmentos de las secuencias de ácido nucleico descritas aquí codificarán fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica del polipéptido IPD079, y, por lo tanto, retienen la actividad insecticida. “Retiene la actividad insecticida” se usa aquí para referirse a un polipéptido que tiene al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad insecticida del polipéptido de longitud completa. En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 tiene al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, 80%, 90%, 95% o más de la actividad insecticida del polipéptido IPD079Aa de longitud completa (SEQ ID NO: 2). En un aspecto, la actividad insecticida es contra especies de coleópteros. En un aspecto, la actividad insecticida es contra una especies de Diabrotica. En algunos aspectos, la actividad insecticida es contra una o más plagas de insectos del complejo del gusano de la raíz del maíz: gusano occidental de la raíz del maíz, Diabrotica virgifera; gusano de la raíz del maíz del norte, D. barberi; gusano de la raíz del maíz del sur o escarabajo manchado del pepino; Diabrotica undecimpunctata howardi, y el gusano de la raíz del maíz mexicano, D. virgifera zeae.
En algunos aspectos, un fragmento de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 que codifica una porción biológicamente activa de una proteína codificará al menos alrededor de 15, 20, 30, 50, 75, 100, 125 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en el polipéptido IPD079 de longitud completa de la descripción. En algunos aspectos, el fragmento es un truncamiento N-terminal y/o C-terminal de al menos alrededor de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 o más aminoácidos del extremo N-terminal y/o C-terminal con respecto a SEQ ID NO: 2, SEQ iD n O: 4, s Eq ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140 o variantes de las mismas, por ejemplo por proteólisis, inserción de un codón de inicio, eliminación de los codones que codifican los aminoácidos eliminados con la inserción concomitante de un codón de parada, o mediante la inserción de un codón de parada en la secuencia codificante.
En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 está codificado por una secuencia de ácido nucleico suficientemente homologa a la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, s Eq ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139. “Suficientemente homologa” se usa aquí para referirse a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que tiene una homología de secuencia al menos alrededor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos aquí usando parámetros estándar. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la homología correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de ácido nucleico teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares. En algunos aspectos, la homología de secuencia es contra la secuencia de longitud completa del polinucleótido que codifica un polipéptido IPD079, o contra la secuencia de longitud completa de un polipéptido IPD079.
En algunos aspectos, el ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 se selecciona de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137 o SEQ ID NO: 139.
En algunos aspectos, el ácido nucleico codifica un polipéptido IPD079 que tiene una identidad de secuencia al menos alrededor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en comparación con SEQ ID n O: 2, SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo ClustalW en módulo ALIGNX® del Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula a lo largo de toda la longitud del polipéptido usando el algoritmo ClustalW en el módulo ALIGNX del Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California) con todos los parámetros por defecto.
En algunos aspectos, el ácido nucleico codifica un polipéptido IPD079 que tiene una identidad de secuencia al menos alrededor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en comparación con SEQ ID n O: 2, SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94.
En algunos aspectos, el ácido nucleico codifica un polipéptido IPD079 que tiene una identidad de secuencia al menos alrededor de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en comparación con SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones (por ejemplo, posiciones que solapan) x 100). En un aspecto, las dos secuencias tienen la misma longitud. En otro aspecto, la comparación es a través de la totalidad de la secuencia de referencia (por ejemplo, a través de la totalidad de SEQ ID NO: 1). El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando técnicas similares a las que se describen a continuación, con o sin permitir espacios. Al calcular el porcentaje de identidad, normalmente se cuentan las coincidencias exactas.
Otro ejemplo no limitativo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Needleman y Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, usó el software GAP versión 10 para determinar la identidad o similitud de secuencia usando los siguientes parámetros por defecto: % de identidad y % de similitud para una secuencia de ácido nucleico usando un peso de espacio de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmpii; % de identidad o % de similitud para una secuencia de aminoácidos usando un peso de espacio de 8 y un peso de longitud de 2, y el programa de puntuación BLOSUM62. También se pueden usar programas equivalentes. “Programa equivalente” se utiliza aquí para referirse a cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene coincidencias idénticas de restos de nucleótidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia en comparación con la alineación correspondiente generada por GAP Versión 10.
Los aspectos también abarcan moléculas de ácido nucleico que codifican variantes del polipéptido IPD079. Las “variantes” del polipéptido IPD079 que codifican las secuencias de ácido nucleico incluyen aquellas secuencias que codifican los polipéptidos IPD079 descritos aquí pero que difieren de forma conservativa debido a la degeneración del código genético, así como aquellas que son suficientemente idénticas como se discutió anteriormente. Las variantes alélicas naturales se pueden identificar con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación, como se describen más abajo. Las secuencias de ácido nucleico variantes también incluyen secuencias de ácido nucleico derivadas sintéticamente que se han generado, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida al sitio, pero que aún codifican los polipéptidos IPD079 descritos como se describe a continuación.
La presente descripción proporciona polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos IPD079 descritos aquí. Los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que, debido a la degeneración del código genético, existe una multitud de secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos IPD079 de la presente descripción.
El experto en la técnica apreciará además que se pueden introducir cambios mediante la mutación de las secuencias de ácido nucleico, lo que conduce a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos IPD079 codificados, sin alterar la actividad biológica de las proteínas. Por lo tanto, se pueden crear moléculas de ácido nucleico variantes introduciendo una o más sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de nucleótidos en la secuencia de ácido nucleico correspondiente descrita aquí, de modo que se introduzcan una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en la proteína codificada. Las mutaciones se pueden introducir mediante técnicas estándar, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Tales secuencias de ácido nucleico variantes también están abarcadas por la presente descripción.
Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico variantes se pueden obtener introduciendo mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden seleccionar para detectar la capacidad de conferir actividad plaguicida para identificar mutantes que retengan la actividad. Después de la mutagénesis, la proteína codificada se puede expresar de forma recombinante, y la actividad de la proteína se puede determinar usando técnicas de ensayo estándar.
Los polinucleótidos de la descripción y fragmentos de los mismos se usan opcionalmente como sustratos para una variedad de reacciones de recombinación y recombinación recursiva, además de los métodos de clonación estándar como se expone, por ejemplo, en Ausubel, Berger y Sambrook, es decir, para producir homólogos de polipéptidos plaguicidas adicionales y fragmentos de los mismos con las propiedades deseadas. Se conocen diversas reacciones de este tipo, incluyendo las desarrolladas por los inventores y sus colaboradores. Métodos para producir una variante de cualquier ácido nucleico enumerado en el presente documento que comprende la recombinación recursiva de dicho polinucleótido con un segundo (o más) polinucleótido, formando así una biblioteca de polinucleótidos variantes descritos aquí, como son las bibliotecas producidas, las células que comprenden las bibliotecas, y cualquier polinucleótido recombinante producido por tales métodos. Además, dichos métodos comprenden opcionalmente la selección de un polinucleótido variante de tales bibliotecas basándose en la actividad plaguicida, tal como se hace en los casos en que dicha recombinación recursiva se realiza in vitro o in vivo.
Una variedad de protocolos de generación de diversidad, incluyendo los protocolos de recombinación recursiva de ácidos nucleicos, están disponibles y se describen completamente en la técnica. Los procedimientos se pueden usar por separado y/o en combinación para producir una o más variantes de un ácido nucleico o conjunto de ácidos nucleicos, así como variantes de proteínas codificadas. Individual y colectivamente, estos procedimientos proporcionan formas robustas y ampliamente aplicables de generar ácidos nucleicos diversificados y conjuntos de ácidos nucleicos (incluyendo, por ejemplo, bibliotecas de ácidos nucleicos) útiles, por ejemplo, para la ingeniería o evolución rápida de ácidos nucleicos, proteínas, rutas, células y/u organismos con características nuevas y/o mejoradas.
Aunque se hacen distinciones y clasificaciones en el curso de la discusión subsiguiente para mayor claridad, se apreciará que las técnicas a menudo no se excluyen mutuamente. De hecho, los diversos métodos se pueden usar individualmente o en combinación, en paralelo o en serie, para acceder a diversas variantes de secuencia.
El resultado de cualquiera de los procedimientos de generación de diversidad descritos aquí puede ser la generación de uno o más ácidos nucleicos, que pueden seleccionarse o cribarse para ácidos nucleicos con o que confieren propiedades deseables, o que codifican proteínas con o que confieren propiedades deseables. Después de la diversificación por uno o más de los métodos descritos aquí o disponibles de otro modo para un experto en la técnica, cualquier ácido nucleico que se produzca puede seleccionarse para una actividad o propiedad deseada, por ejemplo actividad plaguicida, o tal actividad a un pH deseado, etc. Esto puede incluir la identificación de cualquier actividad que pueda detectarse, por ejemplo, en un formato automatizado o automatizable, mediante cualquiera de los ensayos en la técnica; véase, por ejemplo, la discusión sobre detección de actividad insecticida, más arriba. Se puede evaluar una variedad de propiedades relacionadas (o incluso no relacionadas), en serie o en paralelo, a discreción del investigador.
Las descripciones de una variedad de procedimientos de generación de diversidad para generar secuencias de ácido nucleico modificadas, por ejemplo aquellos que codifican polipéptidos que tienen actividad plaguicida o fragmentos de los mismos, se encuentran en las siguientes publicaciones y las referencias citadas en ellas: Soong, et al., (2000) Nat Genet 25(4):436-439; Stemmer, et al., (1999) Tumor Targeting 4:1-4; Ness, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:893-896; Chang, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:793-797; Minshull y Stemmer, (1999) Curr Opin Chem Biol 3:284-290; Christians, et al., (1999) Nat Biotechnol 17:259-264; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; Crameri, et al., (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Zhang, et al., (1997) PNAS USA 94:4504-4509; Patten, et al., (1997) Curr Opin Biotechnol 8:724-733; Crameri, et al., (1996) Nat Med 2:100-103; Crameri, et al., (1996) Nat Biotechnol 14:315-319; Gates, et al., (1996) J Mol Biol 255:373-386; Stemmer, (1996) “Sexual PCR and Assembly PCR” en: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. págs. 447-457; Crameri y Stemmer, (1995) BioTechniques 18:194-195; Stemmer, et al., (1995) Gene, 164:49-53; Stemmer, (1995) Science 270: 1510; Stemmer, (1995) Bio/Technology 13:549-553; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391, y Stemmer, (1994) PNAS USA 91:10747-10751.
Los métodos mutacionales para generar diversidad incluyen, por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio (Ling, et al., (1997) Anal Biochem 254(2):157-178; Dale, et al., (1996) Methods Mol Biol 57:369-374; Smith, (1985) Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein y Shortle, (1985) Science 229:1193-1201; Carter, (1986) Biochem J 237:1-7 y Kunkel, (1987) “The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis” en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein and Lilley, eds., Springer Verlag, Berlín)); mutagénesis usando moldes que contienen uracilo (Kunkel, (1985) PNAS USA 82:488-492; Kunkel, et al., (1987) Methods Enzymol 154:367-382 y Bass, et al., (1988) Science 242:240-245); mutagénesis dirigida por oligonucleótidos (Zoller y Smith, (1983) Methods Enzymol 100:468-500; Zoller y Smith, (1987) Methods Enzymol 154:329-350 (1987); Zoller y Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-6500), mutagénesis de ADN modificado por fosforotioato (Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8749-8764; Taylor, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:8765-8787 (1985) ; Nakamaye y Eckstein, (1986) Nucl Acids Res 14:9679-9698; Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:791-802 y Sayers, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:803-814); mutagénesis que usa ADN dúplex con espacios (Kramer, et al., (1984) Nucl Acids Res 12:9441-9456; Kramer y Fritz, (1987) Methods Enzymol 154:350-367; Kramer, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:7207 y Fritz, et al., (1988) Nucl Acids Res 16:6987-6999).
Los métodos adecuados adicionales incluyen la reparación de desemparejamientos de puntos (Kramer, et al., (1984) Cell 38:879-887), mutagénesis que usa cepas hospedantes deficientes en reparación (Carter, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:4431 -4443 y Carter, (1987) Methods in Enzymol 154:382-403), mutagénesis por supresión (Eghtedarzadeh y Henikoff, (1986) Nucl Acids Res 14:5115), restricción-selección y restricción-purificación (Wells, et al., (1986) Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423), mutagénesis por síntesis total de genes (Nambiar, et al., (1984) Science 223:1299-1301; Sakamar y Khorana, (1988) Nucl Acids Res 14:6361-6372; Wells, et al., (1985) Gene 34:315-323, y Grundstrom, et al., (1985) Nucl Acids Res 13:3305-3316), reparación de rotura de doble hebra (Mandecki, (1986) PNAS USA, 83:7177-7181, y Arnold, (1993) Curr Opin Biotech 4:450-455). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods Enzymol Volumen 154, que también describe controles útiles para solucionar problemas con diversos métodos de mutagénesis.
Se pueden encontrar detalles adicionales sobre diversos métodos de generación de diversidad en las siguientes patentes US, publicaciones y solicitudes PCT y publicaciones de la EPO: patente US número 5.723.323, patente US número 5.763.192, patente US número 5.814.476, patente US número 5.817.483, patente US número 5.824.514, patente US número 5.976.862, patente US número 5.605.793, patente US número 5.811.238, patente US número 5.830.721, patente US número 5.834.252, patente US número 5.837.458, WO 1995/22625, WO 1996/33207, WO 1997/20078, WO 1997/35966, WO 1999/41402, WO 1999/41383, WO 1999/41369, WO 1999/41368, EP 752008, EP 0932670, WO 1999/23107, WO 1999/21979, WO 1998/31837, WO 1998/27230, WO 1998/27230, WO 2000/00632, WO 2000/09679, WO 1998/42832, WO 1999/29902, WO 1998/41653, WO 1998/41622, WO 1998/42727, WO 2000/18906, WO 2000/04190, WO 2000/42561, WO 2000/42559, WO 2000/42560, WO 2001/23401 y PCT/US01/06775.
Las secuencias nucleotídicas descritas aquí también se pueden usar para aislar las secuencias correspondientes de plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, helechos y otras plantas primitivas. De esta manera, se pueden usar métodos, tales como PCR, hibridación y similares, para identificar dichas secuencias basándose en su homología de secuencia con las secuencias expuestas aquí. Las secuencias que se seleccionan en base a su identidad de secuencia con las secuencias completas expuestas aquí, o con fragmentos de las mismas, se describen en el presente documento. Dichas secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descritas. El término “ortólogos” se refiere a genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes que se encuentran en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias nucleotídicas y/o sus secuencias proteicas codificadas comparten una identidad sustancial como se define en otra parte aquí. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas entre las especies.
En un enfoque de PCR, se pueden diseñar cebadores oligonucleotídicos para uso en reacciones de PCR para amplificar las secuencias de ADN correspondientes a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York)), en adelante “Sambrook”. Véase también, Innis, et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, métodos que usan cebadores emparejados, cebadores anidados, cebadores específicos únicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente desemparejados, y similares.
Para identificar polipéptidos IPD079 potenciales procedentes de helechos, musgos u otras colecciones de plantas primitivas, los lisados de células de helechos, musgos u otras plantas primitivas pueden examinarse con anticuerpos generados contra polipéptidos IPD079 y/o polipéptidos IPD079 utilizando métodos de transferencia Western y/o ELISA. Este tipo de ensayos se puede realizar con un alto rendimiento. Las muestras positivas se pueden analizar más a fondo mediante diversas técnicas, tales como la purificación e identificación de proteínas basadas en anticuerpos. Los métodos para generar anticuerpos son bien conocidos en la técnica, como se analiza más adelante.
Alternativamente, el método de identificación de proteínas basado en espectrometría de masas se puede usar para identificar homólogos de polipéptidos IPD079 usando protocolos en la bibliografía (Scott Patterson, (1998), 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology publicado por John Wiley & Son Inc.). Específicamente, el método de identificación de proteínas basado en LC-MS/MS se usa para asociar los datos de MS de un lisado celular determinado o de muestras enriquecidas con el peso molecular deseado (extirpadas del gel de SDS-PAGE de bandas de peso molecular relevantes para polipéptidos IPD079) con la información de secuencia de polipéptidos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, y sus homólogos. Cualquier coincidencia en las secuencias peptídicas indica que es posible que se tengan proteínas homólogas en las muestras. Se pueden usar técnicas adicionales (purificación de proteínas y biología molecular) para aislar la proteína e identificar las secuencias de los homólogos.
En los métodos de hibridación, la totalidad o parte de la secuencia de ácido nucleico del plaguicida se puede usar para rastrear bibliotecas genómicas o de ADNc. Los métodos para la construcción de dichas bibliotecas genómicas y de ADNc son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook y Russell, (2001), más arriba. Las denominadas sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmentos de ARN u otros oligonucleótidos, y pueden estar marcadas con un grupo detectable tal como 32P o cualquier otro marcador detectable, tales como otros radioisótopos, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Las sondas para la hibridación se pueden obtener marcando oligonucleótidos sintéticos basados en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido IPD079 conocida descrita aquí. Además, se pueden usar cebadores degenerados, diseñados sobre la base de nucleótidos o restos de aminoácidos conservados en la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos codificada. La sonda normalmente comprende una región de secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con al menos alrededor de 12, al menos alrededor de 25, al menos alrededor de 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 nucleótidos consecutivos de secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 de la descripción o un fragmento o variante del mismo. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación son generalmente conocidos en la técnica, y se describen en Sambrook y Russell, (2001), más arriba.
Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico completa, que codifica un polipéptido IPD079, descrita aquí, o una o más porciones de la misma, puede usarse como una sonda capaz de hibridarse específicamente con secuencias de ácido nucleico correspondientes que codifican secuencias similares al polipéptido IPD079 y ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica en una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas y tienen preferiblemente una longitud de al menos alrededor de 10 nucleótidos o al menos alrededor de 20 nucleótidos. Tales sondas pueden usarse para amplificar secuencias plaguicidas correspondientes de un organismo escogido por PCR. Esta técnica se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales de un organismo deseado, o como ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la selección de hibridación de bibliotecas de ADN en placas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).
La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo en condiciones rigurosas. “Condiciones rigurosas” o “condiciones de hibridación rigurosas” se usa aquí para referirse a las condiciones en las que una sonda se hibridará con su secuencia diana en un grado detectable mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces con respecto al fondo). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia, y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la rigurosidad de las condiciones de hibridación y/o lavado, se pueden identificar secuencias diana que son 100% complementarias a la sonda (sondaje homólogo). Alternativamente, las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para permitir algunos desemparejamientos en las secuencias para que se detecten grados más bajos de similitud (sondaje heterólogo). Generalmente, una sonda tiene menos de alrededor de 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menos de 500 nucleótidos de longitud.
Proteínas y variantes y fragmentos de las mismas
Las perforinas de origen vegetal y los polipéptidos IPD079 también están abarcados en la descripción. “Perforinas de origen vegetal”, como se usa aquí, se refiere a un polipéptido aislado de una planta o identificado por proteómica a partir de un genoma o transcriptoma vegetal que comprende un dominio MAC/Perforina (MACPF) Pfam (PF01823) o una variante del mismo. “Polipéptido IPD079” y “proteína IPD079”, como se usan aquí, se refieren indistintamente a un polipéptido de perforina derivado de plantas que tiene actividad insecticida que incluye, pero no se limita a, actividad insecticida contra una o más plagas de insectos de los órdenes Lepidoptera y/o Coleoptera, y es suficientemente homólogo a la proteína de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 56. Se contempla una variedad de polipéptidos IPD079. En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 deriva de una especie de helecho en la División Pteridophyta. Las fuentes de perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas provienen de especies vegetales seleccionadas de, pero sin limitarse a, especies de Adiantum, Adonis, Aglaomorpha, Asparagus, Asplenium, Bignonia, Blechnum, Bolbitis, Campyloneurum, Celosia, Cissus, Colysis, Davallia, Didymochlaena, Doellingeria, Dryopteris, Elaphoglossum, Equisetum, Hedera, Huperzia, Lycopodium, Lygodium, Marsilea, Matteuccia, Microsorum, Nephrolepis, Onoclea, Ophioglossum, Pandorea, Pellaea, Phormium, Platycerium, Polypodium, Polystichium, Prostanthera, Psilotum, Pteris, Rumohra, Schizophragma, Selaginella, Sphaeropteris, Stenochiaena, Symphoricarpos, Thelypteris, Tupidanthus, Verbascum, Vernonia, y Waldsteinia. Las fuentes de perforinas de origen vegetal y polipéptidos IPD079 o proteínas relacionadas son helechos y otras especies de plantas primitivas seleccionadas de, pero sin limitarse a, especies de Huperzia, Ophioglossum, Lycopodium, y Platicerium. “Polipéptido IPD094” y “proteína IPD094”, como se usan aquí, se refieren indistintamente a un polipéptido de perforina derivado de plantas que tiene actividad insecticida, incluyendo, pero sin limitarse a, actividad insecticida contra una o más plagas de insectos de los órdenes Lepidoptera y/o Coleoptera, y es suficientemente homólogo a la proteína de SEQ ID NO: 144.
“Suficientemente homólogo” se usa aquí para referirse a una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia al menos alrededor de 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos aquí usando parámetros estándar. El término “alrededor de”, cuando se usa aquí en contexto con porcentaje de identidad de secuencia, significa /- 0,5%. En algunos aspectos, la homología de secuencia es contra la secuencia de longitud completa del polipéptido. Un experto en la técnica reconocerá que estos valores pueden ajustarse apropiadamente para determinar la correspondiente homología de proteínas teniendo en cuenta la similitud de aminoácidos y similares. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula usando el algoritmo ClustalW en el módulo ALIGNX® del Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto. En algunos aspectos, la identidad de secuencia se calcula en toda la longitud del polipéptido usando el algoritmo ClustalW en el módulo ALIGNX® del Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) con todos los parámetros por defecto.
Como se usa aquí, los términos “proteína”, “molécula peptídica” o “polipéptido” incluyen cualquier molécula que comprenda cinco o más aminoácidos. Es bien sabido en la técnica que las moléculas de proteínas, péptidos o polipéptidos pueden sufrir modificaciones, incluyendo modificaciones postraduccionales, tales como, pero sin limitarse a, formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, fosforilación u oligomerización. Por lo tanto, como se usa aquí, los términos “proteína”, “molécula peptídica” o “polipéptido” incluyen cualquier proteína que se modifica mediante cualquier proceso biológico o no biológico. Los términos “aminoácido” y “aminoácidos” se refieren a todos los L-aminoácidos de origen natural.
Una “proteína recombinante” se usa aquí para referirse a una proteína que ya no se encuentra en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula hospedante bacteriana o vegetal recombinante. Un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones proteicas que tienen menos de alrededor de 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de proteína no plaguicida (también denominada aquí como “proteína contaminante”).
“Fragmentos” o “porciones biológicamente activas” incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas al polipéptido y que exhiben actividad insecticida. Tales porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes, y evaluarse en cuanto a actividad insecticida.
“Variantes”, como se usa aquí, se refiere a proteínas o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos original. Las variantes pueden estar en forma de sustituciones de aminoácidos; supresiones, que incluyen, pero no se limitan a, la supresión de aminoácidos en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal; y adiciones, que incluyen, pero no se limitan a, N-terminal y/o C-terminal, en comparación con el polipéptido nativo.
Perforinas de origen vegetal
En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal comprende un dominio Pfam MAC/Perforina (MACPF) (PF01823). En algunos aspectos, las perforinas de origen vegetal se identifican usando métodos proteómicos conocidos por los expertos en la técnica. En algunos aspectos, las perforinas de origen vegetal se identifican mediante BLAST y/o HMMSearch. En algunos aspectos, las perforinas de origen vegetal coincidían con el perfil HMM de Pfam ID# IPR020864 con un valor E inferior a 0,01 y con una longitud superior a 250 aminoácidos. En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal tiene una identidad de secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con cualquiera de SEQ ID NOs: 158-1248. En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal comprende la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cualquiera de SEQ ID NOs: 158-1248, homólogos de la misma o variantes de la misma. En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal tiene una identidad de secuencia de aminoácidos al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor con el polipéptido IPD094 de SEQ ID NO: 144. En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal es un polipéptido IPD094 de la descripción, homólogos del mismo o variantes del mismo. En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal es un polipéptido IPD079 de la descripción.
Polipéptidos IPD079
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140, en el que el polipéptido IPD079 tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94, en el que el polipéptido IPD079 tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 40%, 45%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140, en el que el polipéptido IPD079 tiene actividad insecticida.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad en toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94 que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más sustituciones de aminoácidos en comparación con el aminoácido nativo en la posición correspondiente de SeQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140 que tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más sustituciones de aminoácidos en comparación con el aminoácido nativo en la posición correspondiente de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, s Eq ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140.
En algunos aspectos, la identidad de la secuencia es a lo largo de toda la longitud del polipéptido, calculada usando el algoritmo ClustalW en módulo ALIGNX® del Vector NTI® Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.), con todos los parámetros por defecto.
En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92 o SEQ ID NO: 94.
En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140.
El fragmento o las porciones biológicamente activas de los polipéptidos IPD079 incluyen fragmentos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140, en el que el polipéptido IPD079 tiene actividad insecticida. Tales porciones biológicamente activas pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse en cuanto a actividad insecticida.
En algunos aspectos, el fragmento del polipéptido IPD079 es un truncamiento N-terminal y/o C-terminal de al menos alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34 o más aminoácidos del extremo N-terminal y/o C-terminal con respecto a s Eq ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 o SEQ ID NO: 140, por ejemplo por proteólisis, por inserción de un codón de inicio, por eliminación de los codones que codifican los aminoácidos eliminados e inserción concomitante de un codón de inicio, y/o inserción de un codón de parada.
Análisis filogenéticos, de motivos de secuencia, y estructurales para familias de proteínas insecticidas
Puede emplearse un método de análisis de secuencias y estructuras, y puede estar compuesto por cuatro componentes: construcción de árboles filogenéticos, hallazgo de motivos de secuencias de proteínas, predicción de estructuras secundarias, y alineación de secuencias de proteínas y estructuras secundarias. Los detalles sobre cada componente se ilustran a continuación.
1) Construcción del árbol filogenético
El análisis filogenético se puede realizar usando el software MEGA5. Las secuencias de proteínas se sometieron a análisis ClustalW versión 2 (Larkin MA et al (2007) Bioinformatics 23(21): 2947-2948) para la alineación de secuencias múltiples. Después, la historia evolutiva se infiere mediante el método de máxima verosimilitud basado en el modelo basado en la matriz JTT. Se obtiene el árbol con el logaritmo de probabilidad más alto, se exporta en formato Newick, y se procesa adicionalmente para extraer las ID de secuencia en el mismo orden en que aparecieron en el árbol. Unos pocos clados que representan subfamilias pueden identificarse manualmente para cada familia de proteínas insecticidas.
2) Hallazgo de motivos de secuencias de proteínas
Las secuencias de proteínas se reordenan de acuerdo con el árbol filogenético construido previamente y se alimentan a la herramienta de análisis MOTIF MEME (Multiple EM for MOTIF Elicitation) (Bailey T.L. y Elkan C., Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, págs. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994.) para la identificación de motivos de secuencia clave. MEME está configurado de la siguiente manera: número mínimo de sitios 2, anchura mínima de motivos 5, y número máximo de motivos 30. Los motivos de secuencia únicos para cada subfamilia se identificaron mediante observación visual. La distribución de los motivos en toda la familia de genes se puede visualizar en una página web HTML. Los motivos están numerados con respecto a la clasificación del valor E para cada motivo.
3) Predicción de estructura secundaria
PSIPRED, método de predicción de estructura secundaria mejor clasificado (Jones DT. (1999) J. Mol. Biol. 292: 195-202), puede instalarse en un servidor Linux local y usarse para la predicción de estructuras secundarias de proteínas. La herramienta proporciona una predicción precisa de la estructura usando dos redes neuronales de avance basadas en la salida de PSI-BLAST. La base de datos PSI-BLAST se crea eliminando regiones de baja complejidad, transmembrana y bobina en espiral en Uniref100. Los resultados de PSIPRED contienen las estructuras secundarias (hélice alfa: H, hebra beta: E, y bobina: C) y las puntuaciones de confianza correspondientes para cada aminoácido en una secuencia de proteína dada.
4) Alineación de secuencias de proteínas y estructuras secundarias
Se puede desarrollar para todas las proteínas una secuencia de comandos para generar una alineación de estructura secundaria con espacios según la alineación de secuencias de proteínas múltiples de la etapa 1. Todas las secuencias y estructuras de proteínas alineadas se concatenan en un solo archivo FASTA, y después se importan a MEGA para la visualización e identificación de estructuras conservadas.
En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 tiene un peso molecular calculado de entre alrededor de 30 kD y alrededor de 70 kD, entre alrededor de 40 kD y alrededor de 60 kD, entre alrededor de 45 kD y alrededor de 55 kD, y entre alrededor de 47,5 kD y alrededor de 52,5 kD. “Alrededor de”, con respecto al peso molecular, significa ± 1 kD.
En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 tiene una propiedad física modificada. Como se usa aquí, la expresión “propiedad física” se refiere a cualquier parámetro adecuado para describir las características físico-químicas de una proteína. Como se usa aquí, “propiedad física de interés” y “propiedad de interés” se usan indistintamente para referirse a las propiedades físicas de las proteínas que se están investigando y/o modificando. Los ejemplos de propiedades físicas incluyen, pero no se limitan a, carga superficial neta y distribución de carga en la superficie de la proteína, hidrofobia neta y distribución de restos hidrófobos en la superficie de la proteína, densidad de carga superficial, densidad de hidrofobia superficial, recuento total de grupos ionizables superficiales, tensión superficial, tamaño de la proteína y su distribución en disolución, temperatura de fusión, capacidad calorífica, y segundo coeficiente virial. Los ejemplos de propiedades físicas también incluyen, pero no se limitan a, solubilidad, plegamiento, estabilidad, y digestibilidad. En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 ha aumentado la digestibilidad de los fragmentos proteolíticos en el intestino de un insecto. Los modelos para la digestión por fluidos gástricos simulados son conocidos por los expertos en la técnica (Fuchs, R.L. and J.D. Astwood. Food Technology 50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al Nature Biotechnology 14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al J. Agric Food Chem. 50: 7154-7160, 2002).
En algunos aspectos, las variantes incluyen polipéptidos que difieren en la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las variantes de proteínas abarcadas por la descripción son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad biológica deseada (es decir, actividad plaguicida) de la proteína nativa. En algunos aspectos, la variante tendrá al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80% o más de la actividad insecticida de la proteína nativa. En algunos aspectos, las variantes pueden tener una actividad mejorada sobre la proteína nativa.
Los genes bacterianos a menudo poseen múltiples codones de iniciación de metionina en las proximidades del inicio del marco de lectura abierto. A menudo, el inicio de la traducción en uno o más de estos codones de inicio conducirá a la generación de una proteína funcional. Estos codones de inicio pueden incluir codones ATG. Sin embargo, bacterias tales como Bacillus sp. también reconocen el codón GTG como codón de inicio, y las proteínas que inician la traducción en los codones GTG contienen una metionina en el primer aminoácido. En raras ocasiones, la traducción en los sistemas bacterianos puede iniciarse en un codón TTG, aunque en este caso el TTG codifica una metionina. Además, a menudo no se determina a priori cuáles de estos codones se usan de forma natural en la bacteria. Por tanto, se entiende que el uso de uno de los codones alternativos de metionina también puede conducir a la generación de proteínas plaguicidas. Estas proteínas plaguicidas están abarcadas en la presente descripción, y pueden usarse en los métodos de la presente descripción. Se entenderá que, cuando se exprese en plantas, será necesario alterar el codón de inicio alternativo a ATG para una traducción adecuada.
Un experto en la técnica entiende que la secuencia codificante polinucleotídica puede modificarse para añadir un codón en la penúltima posición después del codón de inicio de metionina, para crear un sitio de enzima de restricción para fines de clonación recombinante y/o para fines de expresión. En algunos aspectos, el polipéptido IPD079 comprende además un resto de alanina en la penúltima posición después de la metionina iniciadora de la traducción.
En algunos aspectos, la metionina iniciadora de la traducción del polipéptido IPD079 se escinde después de la traducción. Un experto en la técnica entiende que la metionina aminopeptidasa puede eliminar en muchos sistemas de expresión celular la metionina iniciadora de la traducción N-terminal.
Las perforinas de origen vegetal que incluyen pero no se limitan al polipéptido IPD079 pueden expresarse como una proteína precursora con una secuencia intermedia que cataliza el ayuste de proteínas postraduccional de múltiples etapas. El ayuste de proteínas implica la escisión de una secuencia intermedia de un polipéptido, con la unión concomitante de las secuencias flanqueantes para producir un nuevo polipéptido (Chong, et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:22159-22168). Esta secuencia intermedia o elemento de ayuste de proteínas, denominado inteínas, que catalizan su propia escisión a través de tres reacciones coordinadas en las uniones de ayuste N-terminal y C-terminal: un reordenamiento de acilo de la cisteína o serina N-terminal; una reacción de transesterificación entre los dos extremos para formar un éster ramificado o un tioéster intermedio, y la escisión del enlace peptídico acoplada a la ciclación de la asparagina C-terminal de la inteína para liberar la inteína (Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem., 275:9091-9094. La elucidación del mecanismo de ayuste de proteínas ha dado lugar a una serie de aplicaciones basadas en internas (Comb, et al., patente US número 5.496.714; Comb, et al., patente US número 5.834.247; Camarero y Muir, (1999) J. Amer. Chem. Soc. 121:5597-5598; Chong, et al., (1997) Gene 192:271-281, Chong, et al., (1998) Nucleic Acids Res. 26:5109-5115; Chong, et al., (1998) J. Biol. Chem.
273:10567-10577; Cotton, et al., (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:1100-1101; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:18359-18363; Evans, et al., (1999) J. Biol. Chem. 274:3923-3926; Evans, et al., (1998) Protein Sci. 7:2256-2264; Evans, et al., (2000) J. Biol. Chem. 275:9091 -9094; Iwai y Pluckthun, (1999) FEBS Lett.459:166-172; Mathys, et al., (1999) Gene 231:1 -13; Mills, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3543-3548; Muir, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705 6710; Otomo, et al., (1999) Biochemistry 38:16040-16044; Otomo, et al., (1999) J. Biolmol. NMR 14:105-114; Scott, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:13638-13643; Severinov and Muir, (1998) J. Biol. Chem. 273:16205-16209; Shingledecker, et al., (1998) Gene 207:187-195; Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926; Southworth, et al., (1999) Biotechniques 27:110-120; Wood, et al., (1999) Nat. Biotechnol. 17:889-892; Wu, et al., (1998a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9226-9231; Wu, et al., (1998b) Biochim Biophys Acta 1387:422-432; Xu, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:388-393; Yamazaki, et al., (1998) J. Am. Chem. Soc., 120:5591-5592). Para la aplicación de inteínas en transgenes vegetales, véanse, Yang, et al., (Transgene Res 15:583-593 (2006)) y Evans, et al., (Annu. Rev. Plant Biol. 56:375-392 (2005)).
La perforina de origen vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, un polipéptido IPD079, puede estar codificada por dos genes distintos, en la que la proteína precursora proviene de los dos genes, denominada inteína dividida, y las dos porciones del precursor están unidas por la formación de un enlace peptídico. Esta formación de enlaces peptídicos se logra mediante ayuste en trans mediado por inteínas. Para este fin, un primer y un segundo casete de expresión que comprenden los dos genes disitntos codifican además las inteínas capaces de mediar en el ayuste en trans de proteínas. Mediante ayuste en trans, las proteínas y los polipéptidos codificados por los fragmentos primero y segundo pueden unirse mediante la formación de enlaces peptídicos. Las proteínas de ayuste en trans pueden seleccionarse de los genomas nucleolares y organulares de diferentes organismos, incluidos eucariotas, arqueobacterias y eubacterias. Los inteínas que pueden usarse se enumeran en neb.com/neb/inteins.html, a la que se puede acceder en la red mundial usando el prefijo “www"). La secuencia nucleotídica que codifica una inteína puede dividirse en una parte 5’ y una 3’ que codifican la parte 5’ y 3’ de la inteína, respectivamente. Las porciones de secuencia que no son necesarias para el ayuste de inteínas (por ejemplo, el dominio de la endonucleasa receptora) pueden eliminarse. La secuencia codificante de la inteína se divide de manera que las partes 5’ y 3’ son capaces de empalmarse en trans. Para seleccionar un sitio de división adecuado de la secuencia codificante de la inteína, se pueden seguir las consideraciones publicadas por Southworth, et al., (1998) EMBO J. 17:918-926. En la construcción del primer y segundo casete de expresión, la secuencia codificante de inteína 5’ está unida al extremo 3’ del primer fragmento que codifica la parte N-terminal del polipéptido IPD079, y la secuencia codificante de inteína 3’ está unida al extremo 5’ del segundo fragmento que codifica la parte C-terminal del polipéptido IPD079.
En general, las parejas del ayuste en trans pueden diseñarse usando cualquier inteína dividida, incluyendo cualquier inteína dividida natural o artificialmente. Se conocen varias inteína divididas de forma natural, por ejemplo: la inteína dividida del gen DnaE de Synechocystis sp. PCC6803 (véanse, Wu, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(16):9226-31 y Evans, et al., (2000) J Biol Chem. 275(13):9091-4, y del gen DnaE de Nostoc puntiforme (véase, Iwai, et al., (2006) FEBs Lett. 580(7):1853-8). Las inteínas no divididas se han dividido artificialmente en el laboratorio para crear nuevas inteínas divididas, por ejemplo: la inteína dividida artificialmente Ssp DnaB (ver, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta.
1387:422-32) y la inteína dividida Sce VMA (véase, Brenzel, et al., (2006) Bioquímica. 45(6):1571 -8) y una mini-inteína fúngica dividida artificialmente (véase, Elleuche, et al., (2007) Biochem Biophys Res Commun. 355(3):830-4). También hay bases de datos de inteínas disponibles que catalogan las inteínas conocidas (véase, por ejemplo, la base de datos en línea disponible en: bioinformatics.weizmann.ac.il/~pietro/inteins/Inteinstable.html, a la que se puede acceder en Internet usando el prefijo “www").
Las inteínas no divididas de origen natural pueden tener actividades de endonucleasa u otras actividades enzimáticas que normalmente se pueden eliminar al diseñar una inteína dividida, dividida artificialmente. Tales mini-inteínas o mini-inteínas divididas minimizadas son bien conocidas en la técnica y típicamente tienen una longitud de menos de 200 restos de aminoácidos (véase, Wu, et al., (1998) Biochim Biophys Acta. 1387:422-32). Las inteínas divididas adecuadas pueden tener otros elementos polipeptídicos que permiten la purificación añadidos a su estructura, siempre que tales elementos no inhiban el ayuste de la inteína dividida, o se añadan de una manera que permita eliminarlos antes del ayuste. Se ha dado a conocer que el ayuste de proteínas usa proteínas que comprenden dominios similares a la inteína bacteriana (BIL) (véase, Amitai, et al., (2003) Mol Microbiol. 47:61-73) y dominios de autoprocesamiento hedgehog (Hog) (este último se combina con inteínas cuando se hace referencia a ellos como la superfamilia Hog/inteína o la familia HINT (véase, Dassa, et al., (2004) J Biol Chem. 279:32001-7), y dominios tales como estos también pueden usarse para preparar internas divididas artificialmente. En particular, los miembros de tales familias que no se ayustan pueden modificarse mediante metodologías de biología molecular para introducir o restaurar la actividad de ayuste en tales especies relacionadas. Estudios recientes demuestran que el ayuste puede observarse cuando se permite que un componente de inteína dividida N-terminal reaccione con un componente de inteína dividida C-terminal que no se encuentra en la naturaleza como su “pareja"; por ejemplo, se ha observado que el ayuste utiliza parejas que tienen tan solo un 30 a 50% de homología con la pareja de ayuste “natural" (véase, Dassa, et al., (2007) Biochemistry. 46(1):322-30). Se ha demostrado que otras mezclas de parejas de inteínas divididas dispares no reaccionan entre sí (véase, Brenzel, et al., (2006) Biochemistry. 45(6):1571 -8). Sin embargo, está dentro de la capacidad de un experto en la técnica relevante determinar si un par particular de polipéptidos es capaz de asociarse entre sí para proporcionar una inteína funcional, usando métodos habituales y sin el ejercicio de la habilidad inventiva.
Las perforinas de origen vegetal, que incluyen, pero no se limitan a, un polipéptido IPD079, pueden ser una variante permutada circular. En ciertos aspectos, el polipéptido IPD079 es una variante permutada circular del polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140.
El desarrollo de métodos de ADN recombinante ha hecho posible estudiar los efectos de la transposición de secuencias sobre el plegamiento, la estructura y la función de las proteínas. El enfoque usado para crear nuevas secuencias se parece al de los pares de proteínas naturales que están relacionados por la reorganización lineal de sus secuencias de aminoácidos (Cunningham, et al.,(1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:3218-3222; Teather y Erfle, (1990) J. Bacteriol.
172:3837-3841; Schimming, et al., (1992) Eur. J. Biochem. 204:13-19; Yamiuchi y Minamikawa, (1991) FEBS Lett.
260:127-130; MacGregor, et al., (1996) FEBS Lett. 378:263-266). La primera aplicación in vitro de este tipo de reordenamiento de proteínas fue descrita por Goldenberg y Creighton (J. Mol. Biol. 165:407-413, 1983). Al crear una variante permutada circular, se selecciona un nuevo N-terminal en un sitio interno (punto de ruptura) de la secuencia original, la nueva secuencia tiene el mismo orden de aminoácidos que la original desde el punto de ruptura hasta que alcanza un aminoácido que está en o cerca del extremo C-terminal original. En este punto, la nueva secuencia se une, ya sea directamente o a través de una porción adicional de la secuencia (enlazador), a un aminoácido que está en o cerca del extremo N-terminal original, y la nueva secuencia continúa con la misma secuencia que la original hasta que alcanza un punto que está en o cerca del aminoácido que estaba N-terminal al sitio del punto de ruptura de la secuencia original, formando este resto el nuevo extremo C-terminal de la cadena. La longitud de la secuencia de aminoácidos del enlazador se puede seleccionar empíricamente o con la orientación de la información estructural, o usando una combinación de los dos enfoques. Cuando no se dispone de información estructural, se puede preparar una pequeña serie de enlazadores para realizar ensayos usando un diseño cuya longitud varía para abarcar un intervalo de 0 a 50 Á y cuya secuencia se escoge para que sea consistente con la exposición de la superficie (hidrofilia, Hopp y Woods, (1983) Mol. inmunol. 20:483-489; Kyte y Doolittle, (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132; área de superficie expuesta al disolvente, Lee y Richards, (1971) J. Mol. Biol. 55:379-400) y la capacidad de adoptar la conformación necesaria sin alterar la configuración del polipéptido plaguicida (conformacionalmente flexible; Karplus y Schulz, (1985) Naturwissenschaften 72:212-213). Suponiendo un promedio de traducción de 2,0 a 3,8 Á por resto, esto significaría que la longitud de ensayo estaría entre 0 y 30 restos, siendo 0 a 15 restos el intervalo preferido. Un ejemplo de una serie empírica de este tipo sería construir enlazadores usando una secuencia de casete tal como Gly-Gly-Gly-Ser repetida n veces, en la que n es 1, 2, 3 o 4. Los expertos en la técnica reconocerán que hay muchas de tales secuencias que varían en longitud o composición, que pueden servir como enlazadores con la consideración principal de que no sean ni excesivamente largas ni cortas (vésae, Sandhu, (1992) Critical Rev. Biotech. 12:437-462); si son demasiado largos, los efectos de la entropía probablemente desestabilizarán el pliegue tridimensional, y también pueden hacer que el plegamiento sea cinéticamente poco práctico, y si son demasiado cortos, probablemente desestabilizarán la molécula debido a la tensión estérica o torsional. Los expertos en el análisis de la información estructural de proteínas reconocerán que el uso de la distancia entre los extremos de la cadena, definida como la distancia entre los carbonos c-alfa, se puede usar para definir la longitud de la secuencia a usar, o al menos para limitar la número de posibilidades que deben ensayarse en una selección empírica de enlazadores. También reconocerán que, a veces, las posiciones de los extremos de la cadena polipeptídica están mal definidas en los modelos estructurales derivados de la difracción de rayos X o los datos de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, y que cuando sea cierto, esta situación se necesitará, por lo tanto, tener en cuenta para estimar adecuadamente la longitud del enlazador requerido. De aquellos restos cuyas posiciones están bien definidas, se seleccionan dos restos que están en una secuencia cercana a los extremos de la cadena, y la distancia entre sus carbonos c-alfa se usa para calcular una longitud aproximada para un enlazador entre ellos. Usando la longitud calculada como guía, se seleccionan enlazadores con un intervalo de número de restos (calculado usando de 2 a 3,8 Á por resto). Estos enlazadores pueden estar compuestos por la secuencia original, acortada o alargada según sea necesario, y cuando se alargan los restos adicionales pueden escogerse para que sean flexibles e hidrofílicos como se describe anteriormente; u opcionalmente, la secuencia original puede sustituirse por el uso de una serie de enlazadores, siendo un ejemplo el enfoque del casete Gly-Gly-Gly-Ser mencionado anteriormente; u opcionalmente puede usarse una combinación de la secuencia original y la nueva secuencia que tiene la longitud total apropiada. Se pueden preparar secuencias de polipéptidos plaguicidas capaces de plegarse a estados biológicamente activos mediante la selección apropiada de las posiciones inicial (extremo amino) y final (extremo carboxilo) desde dentro de la cadena polipeptídica original mientras se usa la secuencia enlazadora como se describe anteriormente. Los extremos amino y carboxilo se seleccionan dentro de un tramo común de secuencia, denominado región de punto de ruptura, usando las pautas que se describen a continuación. De este modo, se genera una nueva secuencia de aminoácidos seleccionando los extremos amino y carboxilo dentro de la misma región de punto de ruptura. En muchos casos, la selección de los nuevos extremos será tal que la posición original del extremo carboxilo preceda inmediatamente a la del extremo amino. Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que pueden funcionar las selecciones de extremos en cualquier lugar dentro de la región, y que esto conducirá efectivamente a supresiones o adiciones a las porciones amino o carboxilo de la nueva secuencia. Es un principio central de la biología molecular que la secuencia primaria de aminoácidos de una proteína dicta el plegamiento a la estructura tridimensional necesaria para la expresión de su función biológica. Los expertos en la técnica conocen métodos para obtener e interpretar información estructural tridimensional usando difracción de rayos X de cristales de proteína individuales o espectroscopia de resonancia magnética nuclear de disoluciones de proteínas. Los ejemplos de información estructural que son relevantes para la identificación de las regiones de punto de ruptura incluyen la ubicación y el tipo de estructura secundaria de la proteína (hélices alfa y 3-10, láminas beta paralelas y antiparalelas, inversiones y giros de cadena, y bucles; Kabsch y Sander, (1983) Biopolymers 22:2577-2637; el grado de exposición a los disolventes de los restos de aminoácidos, la extensión y el tipo de interacciones de los restos entre sí (Chothia, (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:537-572), y la distribución estática y dinámica de conformaciones a lo largo de la cadena polipeptídica (Alber y Mathews, (1987) Methods Enzymol.
154:511-533). En algunos casos, se conoce información adicional sobre la exposición de los restos a los disolventes; un ejemplo es un sitio de unión postraduccional de hidrato de carbono que está necesariamente en la superficie de la proteína. Cuando no se dispone de información estructural experimental o no es factible obtenerla, también se dispone de métodos para analizar la secuencia primaria de aminoácidos con el fin de realizar predicciones de la estructura terciaria y secundaria de la proteína, la accesibilidad del disolvente, y la aparición de giros y bucles. Los métodos bioquímicos también son aplicables a veces para determinar empíricamente la exposición de la superficie cuando los métodos estructurales directos no son factibles; por ejemplo, usando la identificación de sitios de escisión de cadena después de una proteólisis limitada a fin de inferir la exposición superficial (Gentile y Salvatore, (1993) Eur. J. Biochem. 218:603-621). Por lo tanto, usando la información estructural derivada experimentalmente o métodos predictivos (por ejemplo, Srinivisan y Rose, (1995) Proteins: Struct., Funct. & Genetics 22:81-99), la secuencia de aminoácidos original se inspecciona para clasificar las regiones según sean o no parte integral del mantenimiento de la estructura secundaria y terciaria. La aparición de secuencias dentro de regiones que se sabe que están implicadas en la estructura secundaria periódica (hélices alfa y 3-10, láminas beta paralelas y antiparalelas) son regiones que deben evitarse. De manera similar, es más probable que las regiones de la secuencia de aminoácidos que se observan o se prevé que tengan un grado bajo de exposición al disolvente formen parte del llamado núcleo hidrófobo de la proteína, y también deben evitarse para la selección de extremos amino y carboxilo. Por el contrario, aquellas regiones que se sabe o se prevé que están en giros o bucles superficiales, y especialmente aquellas regiones que se sabe que no son necesarias para la actividad biológica, son los sitios preferidos para la ubicación de los extremos de la cadena polipeptídica. Los tramos continuos de la secuencia de aminoácidos que se prefieren en base a los criterios anteriores se denominan región de punto de ruptura. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos IPD079 circulares permutados con un nuevo extremo N/C terminal que contienen una región enlazadora que separa el extremo C y el extremo N originales pueden prepararse esencialmente siguiendo el método descrito en Mullins et al., (1994) J. Am. Chem. Soc. 116:5529-5533. Se usan múltiples etapas de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para reorganizar la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína. Los polinucleótidos que codifican polipéptidos IPD079 permutados circulares con un nuevo extremo N/extremo C que contienen una región enlazadora que separa el extremo C y el extremo N originales pueden obtenerse basándose en el método de duplicación en tándem descrito en Horlick et al., (1992) Protein Eng. 5:427-431. La amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los nuevos genes N-terminal/C-terminal se realiza usando una plantilla de ADN duplicada en tándem.
En otro aspecto, se describen proteínas de fusión que comprenden perforinas de origen vegetal, que incluyen, pero no se limita a, los polipéptidos IPD079 de la descripción. En algunos aspectos, las proteínas de fusión comprenden un polipéptido IPD079 que incluye, pero no se limita a, el polipéptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID n O: 140, y fragmentos activos de los mismos.
Los métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica. Los polinucleótidos que codifican perforinas de origen vegetal o un polipéptido IPD079 pueden fusionarse con secuencias señal que dirigirán la localización de la proteína a compartimentos particulares de una célula procariota o eucariota, y/o dirigirán la secreción del polipéptido IPD079 descrito aquí a partir de una célula procariota o eucariota. Por ejemplo, en E. coli, se puede desear dirigir la expresión de la proteína al espacio periplásmico. Los ejemplos de secuencias señal o proteínas (o fragmentos de las mismas) a las que se puede fusionar el polipéptido IPD079 para dirigir la expresión del polipéptido al espacio periplásmico de las bacterias incluyen, pero no se limita a, la secuencia señal peIB, la secuencia señal de la proteína de unión a maltosa (MBP), MBP, la secuencia señal de ompA, la secuencia señal de la subunidad B de la enterotoxina lábil al calor de E. coli periplásmica, y la secuencia señal de la fosfatasa alcalina. Varios vectores están disponibles comercialmente para la construcción de proteínas de fusión que dirigirán la localización de una proteína, tales como la serie de vectores pMAL (particularmente la serie pMAL-p) disponible de New England Biolabs. El polipéptido IPD079 puede fusionarse con la secuencia de señal de pectato liasa peIB para aumentar la eficiencia de la expresión y purificación de tales polipéptidos en bacterias gramnegativas (véanse, las patentes US números 5.576.195 y 5.846.818). Las fusiones de péptidos de tránsito de plástido/polipéptidos vegetales son bien conocidas en la técnica (véase, patente US número 7.193.133). Los péptidos de tránsito de apoplasto, tales como la señal de secreción de alfa-amilasa de arroz o cebada, también son bien conocidos en la técnica. El péptido de tránsito de plástido generalmente se fusiona en el extremo N con el polipéptido al que se dirige (por ejemplo, la pareja de fusión). La proteína de fusión puede consistir esencialmente en el péptido de tránsito de plástido y el polipéptido IPD079 al que se dirige. La proteína de fusión puede comprender el péptido de tránsito de plástido y el polipéptido al que se dirige. En tales aspectos, el péptido de tránsito de plástido está preferentemente en el extremo N-terminal de la proteína de fusión. Sin embargo, los restos de aminoácidos adicionales pueden ser N-terminales para el péptido de tránsito de plástido siempre que la proteína de fusión esté dirigida al menos parcialmente a un plástido. El péptido de tránsito de plástido puede estar en la mitad N-terminal, el tercio N-terminal o el cuarto N-terminal de la proteína de fusión. La mayor parte o la totalidad del péptido de tránsito de plástido generalmente se escinde de la proteína de fusión tras la inserción en el plástido. La posición de escisión puede variar ligeramente entre especies vegetales, en diferentes etapas de desarrollo de la planta, como resultado de condiciones intercelulares específicas o la combinación particular de péptido de tránsito/pareja de fusión usada. La escisión del péptido de tránsito de plástido puede ser homogénea, de modo que el sitio de escisión sea idéntico en una población de proteínas de fusión. El péptido de tránsito de plástido puede no ser homogéneo, de modo que el sitio de escisión varía en 1-10 aminoácidos en una población de proteínas de fusión. El péptido de tránsito de plastidos se puede fusionar de forma recombinante con una segunda proteína en una de varias formas. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción en la secuencia nucleotídica del péptido de tránsito en una posición correspondiente a su extremo C-terminal, y se puede diseñar el mismo sitio o uno compatible en la secuencia nucleotídica de la proteína a la que se dirige su extremo N-terminal. Se debe tener cuidado al diseñar estos sitios, para garantizar que las secuencias codificantes del péptido de tránsito y la segunda proteína se mantengan “en marco” para permitir la síntesis de la proteína de fusión deseada. En algunos casos, puede ser preferible eliminar el codón iniciador de metionina de la segunda proteína cuando se introduce el nuevo sitio de restricción. La introducción de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en ambas moléculas originales, y su posterior unión a través de técnicas de ADN recombinante, puede dar como esultado la adición de uno o más aminoácidos adicionales entre el péptido de tránsito y la segunda proteína. Por lo general, esto no afecta la actividad de direccionamiento, siempre que el sitio de escisión del péptido de tránsito permanezca accesible y la función de la segunda proteína no se altere por la adición de estos aminoácidos adicionales en su extremo N-terminal. Alternativamente, un experto en la técnica puede crear un sitio de escisión preciso entre el péptido de tránsito y la segunda proteína (con o sin su iniciador metionina) usando la síntesis de genes (Stemmer, et al., (1995) Gene 164: 49-53) o métodos similares. Además, la fusión del péptido de tránsito puede incluir intencionadamente aminoácidos cadena abajo del sitio de escisión. Los aminoácidos en el extremo N-terminal de la proteína madura pueden afectar la capacidad del péptido de tránsito para dirigir las proteínas a los plástidos y/o la eficacia de la escisión tras la importación de proteínas. Esto puede depender de la proteína a la que se dirige. Véase, por ejemplo, Comai, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263(29): 15104-9.
En algunos aspectos, se proporcionan proteínas de fusión que comprenden una perforina de origen vegetal, que incluye, pero no se limita a, un polipéptido IPD079 y un polipéptido insecticida unidos por un enlazador de aminoácidos. En algunos aspectos, las proteínas de fusión se describen representadas por una fórmula seleccionada del grupo que consiste en:
R1-L-D2, R2-L-R1, R1-R2 o R2-R1
en los que R1 es una perforina de origen vegetal o un polipéptido IPD079, R2 es una proteína de interés. El polipéptido R1 se fusiona directamente o a través de un segmento enlazador (L) al polipéptido R2. El término “directamente” define fusiones en las que los polipéptidos se unen sin un enlazador peptídico. Por tanto, “L” representa un enlace químico o segmento polipeptídico al que tanto R1 como R2 están fusionados en marco; más comúnmente, L es un péptido lineal al que R1 y R2 están unidos por enlaces de amida que unen el extremo carboxi de R1 al extremo amino de L, y el extremo carboxi de L al término amino de R2. Por “fusionado en marco” se entiende que no hay terminación de traducción o interrupción entre los marcos de lectura de R1 y R2. El grupo enlazante (L) es generalmente un polipéptido de entre 1 y 500 aminoácidos de longitud. Los enlazadores que unen las dos moléculas están preferiblemente diseñados para (1) permitir que las dos moléculas se plieguen y actúen independientemente una de la otra, (2) no tener una propensión a desarrollar una estructura secundaria ordenada que podría interferir con los dominios funcionales de las dos proteínas, (3) tener una característica hidrófoba o cargada mínima que podría interactuar con los dominios de proteínas funcionales, y (4) proporcionar separación estérica de R1 y R2, tal que R1 y R2 podrían interactuar simultáneamente con sus correspondientes receptores en una sola célula. Normalmente, los aminoácidos de superficie en las regiones de proteínas flexibles incluyen Gly, Asn y Ser. Se esperaría que virtualmente cualquier permutación de secuencias de aminoácidos que contengan Gly, Asn y Ser satisfagan los criterios anteriores para una secuencia enlazadora. También pueden usarse otros aminoácidos neutros, tales como Thr y Ala, en la secuencia enlazadora. También se pueden incluir aminoácidos adicionales en los enlazadores debido a la adición de sitios de restricción únicos en la secuencia del enlazador para facilitar la construcción de las fusiones.
En algunos aspectos, los enlazadores comprenden secuencias seleccionadas del grupo de fórmulas: (Gly3Ser)n, (Gly4Ser)n, (Gly5Ser)n, (GlynSer)n o (AlaGlySer)n en las que n es un número entero. Un ejemplo de un enlazador altamente flexible es la región espaciadora rica en (GlySer) presente dentro de la proteína pIII de los bacteriófagos filamentosos, por ejemplo bacteriófagos M13 o fd (Schaller, et al., 1975). Esta región proporciona una región espaciadora larga y flexible entre dos dominios de la proteína de superficie pIII. También se incluyen enlazadores en los que se incluye una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa. Tal sitio de escisión puede ser valioso para separar los componentes individuales de la fusión para determinar si están correctamente plegados y activos in vitro. Los ejemplos de dviersas endopeptidasas incluyen, pero no se limitan a, plasmina, enteroquinasa, kalikerina, uroquinasa, activador del plasminógeno tisular, clostripaína, quimosina, colagenasa, proteasa de veneno de víbora de Russell, enzima de escisión posprolina, proteasa V8, trombina y factor Xa. En algunos aspectos, el enlazador comprende los aminoácidos EEKKN (SEQ ID NO: 157) del vehículo de expresión multigénica (MGEV), que es escindido por proteasas vacuolares como se describe en número la publicación de solicitud de patente US número US 2007/0277263. En otros aspectos, los segmentos enlazadores peptídicos de la región bisagra de las inmunoglobulinas de cadena pesada IgG, IgA, IgM, IgD o IgE proporcionan una relación angular entre los polipéptidos unidos. Especialmente útiles son aquellas regiones bisagra en las que las cisteínas se sustituyen por serinas. Los enlazadores de la presente descripción incluyen secuencias derivadas de la región bisagra de IgG gamma 2b murina, en la que las cisteínas se han cambiado a serinas. Las proteínas de fusión no están limitadas por la forma, el tamaño o el número de secuencias enlazadoras empleadas, y el único requisito del enlazador es que funcionalmente no interfiera negativamente con el plegamiento y la función de las moléculas individuales de la fusión.
En otro aspecto, se describen polipéptidos IPD079 quiméricos que se crean uniendo dos o más porciones de genes IPD079, que originalmente codificaban proteínas IPD079 separadas para crear un gen quimérico. La traducción del gen quimérico da como resultado un único polipéptido quimérico IPD079 con regiones, motivos o dominios derivados de cada uno de los polipéptidos originales. En ciertos aspectos, la proteína quimérica comprende porciones, motivos o dominios de polipéptidos IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 en cualquier combinación.
Se reconoce que las secuencias de ADN pueden alterarse mediante diversos métodos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por la proteína plaguicida de tipo salvaje (o nativa). En algunos aspectos, un polipéptido IPD079 puede alterarse de diversas maneras, incluyendo sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos, incluyendo hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o más sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos, o combinaciones de los mismos, en comparación con cualquiera de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140.
Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IPD079 pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN. Esto también puede lograrse mediante una de varias formas de mutagénesis y/o evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Tales variantes poseerán la actividad plaguicida deseada. Sin embargo, se entiende que la capacidad de un polipéptido IPD079 para conferir actividad plaguicida puede mejorarse mediante el uso de dichas técnicas sobre las composiciones de esta descripción.
Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones conservativas de aminoácidos en uno o más restos de aminoácidos no esenciales. Un resto de aminoácido “no esencial” es un resto que se puede alterar de la secuencia de tipo salvaje de un polipéptido IPD079 sin alterar la actividad biológica. Una “sustitución conservativa de aminoácidos” es aquella en la que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen: aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina); cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico); restos polares cargados negativamente y sus amidas (por ejemplo, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, glutamina; cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína); restos pequeños alifáticos, no polares o ligeramente polares (por ejemplo, alanina, serina, treonina, prolina, glicina); cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); restos alifáticos no polares grandes (por ejemplo, metionina, leucina , isoleucina, valina, cisteína); cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina); cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina); cadenas laterales aromáticas grandes (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano).
Las sustituciones de aminoácidos se pueden realizar en regiones no conservadas que retienen la función. En general, tales sustituciones no se harían para restos de aminoácidos conservados o para restos de aminoácidos que residen dentro de un motivo conservado, en el que tales restos son esenciales para la actividad de la proteína. Los ejemplos de restos que se conservan y que pueden ser esenciales para la actividad de la proteína incluyen, por ejemplo, restos que son idénticos entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias descritas aquí (por ejemplo, restos que son idénticos en una alineación de proteínas homologas). Los ejemplos de restos que se conservan pero que pueden permitir sustituciones conservativas de aminoácidos y que todavía conservan la actividad incluyen, por ejemplo, restos que tienen solo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en una alineación de toxinas similares o relacionadas con las secuencias descritas aquí (por ejemplo, restos que tienen solo sustituciones conservativas entre todas las proteínas contenidas en las proteínas homólogas de alineación). Sin embargo, un experto en la técnica comprendería que las variantes funcionales pueden tener alteraciones menores conservadas o no conservadas en los restos conservados. En el modelo de Dayhoff, et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) se puede encontrar una guía en cuanto a las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica de la proteína de interés.
Al realizar tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte y Doolittle, (1982) J Mol Biol. 157(1 ):105-32). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y similares.
Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o puntuación similar y aún así dar como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir, aún obtener una proteína biológica funcionalmente equivalente. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobia y características de carga (Kyte y Doolittle, ibídem). Estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (­ 0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5). Al realizar tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de 2, se prefieren particularmente aquellos que están dentro de 1, y se prefieren incluso más particularmente aquellos dentro de 0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar de forma eficaz sobre la base de la hidrofilia. La patente US número 4.554.101 señala que la mayor hidrofilia promedio local de una proteína, determinada por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.
Como se detalla en patente US número 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0.+0,1); glutamato (+3,0.+0,1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5.+0,1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (­ 1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Alternativamente, se pueden realizar alteraciones en la secuencia de proteínas de muchas proteínas en el extremo amino o carboxi sin afectar sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, supresiones o alteraciones introducidas por métodos moleculares modernos, tales como PCR, incluyendo amplificaciones de PCR que alteran o amplían la secuencia codificante de proteínas en virtud de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias codificantes de proteínas completas, tales como las que se usan comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión a menudo se usan para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés, (2) introducir un dominio de unión, una actividad enzimática o un epítopo para facilitar la purificación de proteínas, la detección de proteínas u otros usos experimentales conocidos en la técnica, (3) la secreción diana o traducción de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplásmico de bacterias gramnegativas, mitocondrias o cloroplastos de plantas o el retículo endoplásmico de células eucariotas, el último de los cuales a menudo da como resultado la glicosilación de la proteína.
Las variantes de secuencias nucleotídicas y de aminoácidos de la descripción también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como el barajado de ADN. Con dicho procedimiento, por ejemplo, se pueden usar una o más regiones codificantes diferentes del polipéptido IPD079 de la descripción para crear un nuevo polipéptido IPD079 que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, usando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés se pueden barajar entre un gen plaguicida y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para dicho barajado de ADN se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer, (1994) Nature 370:389-391; Crameri, et al., (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore, et al., (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri, et al., (1998) Nature 391:288-291; y patentes US números 5.605.793 y 5.837.458.
El intercambio o barajado de dominios es otro mecanismo para generar polipéptidos IPD079 alterados. Los dominios pueden intercambiarse entre los polipéptidos IPD079 de la descripción dando como resultado toxinas híbridas o quiméricas con actividad insecticida o espectro diana mejorados. Los métodos para generar proteínas recombinantes y evaluar su actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Naimov, et al., (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd, et al., (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge, et al., (1991) J. Biol. Chem.
266:17954-17958; Schnepf, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang, et al., 91999) Appl. Environ. Microbiol.
65:2918-2925).
La alineación de los homólogos de IPD079 (Figuras 1 y 2) permite la identificación de restos que están muy conservados entre los homólogos de esta familia.
Composiciones
También se abarcan las composiciones que comprenden una perforina de origen vegetal de la descripción, incluyendo, pero sin limitarse a, un polipéptido IPD079 de la descripción. En algunos aspectos, la composición comprende un polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140. En algunos aspectos, la composición comprende una proteína de fusión IPD079.
Anticuerpos
También se abarcan los anticuerpos contra una perforina de origen vegetal de la descripción, incluyendo, pero sin limitarse a, un polipéptido IPD079 descrito aquí o variantes o fragmentos del mismo. Los anticuerpos de la descripción incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, así como fragmentos de los mismos que conservan su capacidad para unirse al polipéptido IPD079 que se encuentra en el intestino de los insectos. Se afirma que un anticuerpo, anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo es capaz de unirse a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir así la molécula al anticuerpo, anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. El término “anticuerpo” (Ab) o “anticuerpo monoclonal” (Mab) incluye moléculas intactas, así como fragmentos o regiones de unión o dominios de las mismas (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab)2) que son capaces de unirse a hapteno. Dichos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica, tal como papaína o pepsina. Alternativamente, los fragmentos de unión a hapteno se pueden producir mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante o mediante química sintética. Los métodos para la preparación de los anticuerpos de la presente descripción son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, véase, Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane (eds.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988), así como las referencias citadas en el mismo. Los trabajos de referencia estándar que establecen los principios generales de la inmunología incluyen: Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y. (1982); Dennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980) y Campbell, “Monoclonal Antibody Technology”, en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burdon, et al., (eds.), Elsevier, Amsterdam (1984). Véanse también, las patentes US números 4.196.265; 4.609.893; 4.713.325; 4.714.681; 4.716.111; 4.716.117 y 4.720.459. Los anticuerpos polipeptídicos IPD079 o sus porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495. También se pueden emplear otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, tales como la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal para preparar hibridomas es un sistema murino. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. También se conocen parejas de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión. El anticuerpo y los anticuerpos monoclonales de la descripción se pueden preparar utilizando un polipéptido IPD079 como antígeno.
Se describe aquí un kit para detectar la presencia de un polipéptido IPD079 o detectar la presencia de una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido IPD079 en una muestra. En un aspecto, el kit proporciona reactivos basados en anticuerpos para detectar la presencia de un polipéptido IPD079 en una muestra de tejido. En otro aspecto, el kit proporciona sondas de ácido nucleico marcadas, útiles para detectar la presencia de uno o más polinucleótidos que codifican el polipéptido IPD079. El kit se proporciona junto con los reactivos y controles adecuados para llevar a cabo un método de detección, así como las instrucciones de uso del kit.
Identificación y aislamiento de receptores
También se incluyen los receptores del polipéptido IPD079 descrito aquí o de variantes o fragmentos del mismo. Los métodos para identificar receptores son bien conocidos en la técnica (véase, Hofmann, et al., (1988) Eur. J. Biochem.
173:85-91; Gill, et al., (1995) J. Biol. Chem. 27277-27282) se pueden emplear para identificar y aislar el receptor que reconoce el polipéptido IPD079 usando las vesículas de membrana con borde en cepillo de insectos susceptibles. Además del método de marcaje radiactivo enumerado en la bibliografía citada, el polipéptido IPD079 se puede marcar con colorante fluorescente y otros marcadores comunes tal como estreptavidina. Se pueden preparar vesículas de membrana con borde en cepillo (BBMV) de insectos susceptibles, tales como la lanzadera de la soja y las chinches hediondas, según los protocolos enumerados en las referencias, y se pueden separar en gel de SDS-PAGE y secar en una membrana adecuada. El polipéptido IPD079 marcado se puede incubar con membrana transferida de BBMv , y el polipéptido IPD079 marcado se puede identificar con los informadores marcados. La identificación de las bandas de proteínas que interactúan con el polipéptido IPD079 se puede detectar mediante la secuenciación en fase gaseosa de aminoácidos N-terminales o el método de identificación de proteínas basado en espectrometría de masas (Patterson, (1998) 10.22, 1-24, Current Protocol in Molecular Biology, publicado por John Wiley & Son Inc..). Una vez que se identifica la proteína, el gen correspondiente se puede clonar a partir de la biblioteca de ADN genómico o ADNc de los insectos susceptibles, y la afinidad de unión se puede medir directamente con el polipéptido IPD079. La función del receptor para la actividad insecticida del polipéptido IPD079 se puede verificar mediante el método de eliminación del gen de tipo ARNi (Rajagopal, et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:46849-46851).
Constructos de nucleótidos, casetes de expresión y vectores
El uso aquí de la expresión “constructos de nucleótidos” no pretende limitar la descripción a constructos de nucleótidos que comprenden ADN. Los expertos en la técnica reconocerán que las constructos de nucleótidos, particularmente polinucleótidos y oligonucleótidos compuestos de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, también pueden emplearse en los métodos descritos aquí. Los constructos de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias nucleotídicas descritos aquí abarcan además todas las formas complementarias de dichos constructos, moléculas y secuencias. Además, las constructos de nucleótidos, las moléculas de nucleótidos y las secuencias de nucleótidos descritas aquí abarcan todas las constructos, moléculas y secuencias nucleotídicas que se pueden emplear en los métodos descritos aquí para transformar plantas, incluyendo, pero sin limitarse a, los comprendidos por desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de origen natural como análogos sintéticos. Las constructos de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias nucleotídicas descritas aquí también abarcan todas las formas de constructos de nucleótidos que incluyen, pero no se limitan a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras de tallo y bucle, y similares.
Otro aspecto se refiere a un organismo transformado tal como un organismo seleccionado de células de plantas e insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoos, nematodos y algas. El organismo transformado comprende una molécula de ADN descrita aquí, un casete de expresión que comprende la molécula de ADN, o un vector que comprende el casete de expresión, que puede incorporarse de forma estable en el genoma del organismo transformado.
Las secuencias descritas aquí se proporcionan en constructos de ADN para la expresión en el organismo de interés. El constructo incluirá secuencias reguladoras en 5’ y 3’ enlazadas operativamente a una secuencia descrita aquí. La expresión “enlazado operativamente”, como se usa aquí, se refiere a un enlace funcional entre una secuencia promotora y una segunda secuencia, en el que la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. En general, enlazado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico que se unen son contiguas y, cuando es necesario, unen dos regiones codificantes de proteínas en el mismo marco de lectura. El constructo puede contener adicionalmente al menos un gen adicional para ser cotransformado en el organismo. Alternativamente, los genes adicionales se pueden proporcionar en múltiples constructos de ADN.
Tal constructo de ADN se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de la secuencia del gen del polipéptido IPD079 para que esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El constructo de ADN puede contener adicionalmente genes marcadores seleccionables.
El constructo de ADN generalmente incluirá en la dirección de transcripción de 5’ a 3’: una región de iniciación transcripcional y traduccional (es decir, un promotor), una secuencia de ADN descrita aquí, y una región de terminación transcripcional y traduccional (es decir, región de terminación) funcional en el organismo que actúa como hospedante. La región de iniciación de la transcripción (es decir, el promotor) puede ser nativa, análoga, extraña o heteróloga al organismo hospedante y/o a la secuencia descrita aquí. Además, el promotor puede ser la secuencia natural, o alternativamente una secuencia sintética. El término “extraño”, como se usa aquí, indica que el promotor no se encuentra en el organismo nativo en el que se introduce el promotor. Cuando el promotor es “extraño” o “heterólogo” a la secuencia descrita aquí, se pretende que el promotor no sea el promotor nativo o natural para la secuencia enlazada operativamente descrita aquí. Como se usa aquí, un gen quimérico comprende una secuencia codificante enlazada operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga a la secuencia codificante. Cuando el promotor es una secuencia nativa o natural, la expresión de la secuencia enlazada operativamente se altera con respecto a la expresión de tipo salvaje, lo que da como resultado una alteración en el fenotipo.
En algunos aspectos, el constructo de ADN también puede incluir una secuencia potenciadora de la transcripción. Como se usa aquí, el término “potenciador” se refiere a una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor, y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para mejorar el nivel o la especificidad tisular de un promotor. En la técnica se conocen varios potenciadores, que incluyen, por ejemplo, intrones con propiedades potenciadoras de la expresión génica en plantas (publicación de solicitud de patente US número 2009/0144863, el intrón de ubiquitina (es decir, el intrón 1 de ubiquitina de maíz (véase, por ejemplo, secuencia NCBI S94464)), el potenciador omega o el potenciador principal omega (Gallie, et al., (1989) Molecular Biology of RNA ed. Cech (Liss, New York) 237­ 256, y Gallie, et al., (1987) Gene 60:217-25), el potenciador CaMV 35S (véase, por ejemplo, Benfey, et al., (1990) Em BO J. 9:1685-96), y también se pueden usar los potenciadores de la patente US número 7.803.992. La lista anterior de potenciadores de la transcripción no pretende ser limitativa. Puede usarse cualquier potenciador transcripcional apropiado.
La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación de la transcripción, puede ser nativa con la secuencia de ADN enlazada operativamente de interés, puede ser nativa con la planta hospedante, o puede derivar de otra fuente (es decir, extraña o heteróloga al promotor, la secuencia de interés, la planta hospedante, o cualquier combinación de los mismos).
Las regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Véanse también, Guerineau, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot, (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon, et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261 -1272; Munroe, et al., (1990) Gene 91:151 -158; Ballas, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891 -7903, y Joshi, et al., (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.
Cuando sea apropiado, un ácido nucleico puede optimizarse para aumentar la expresión en el organismo hospedante. Por lo tanto, cuando el organismo hospedante es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos se pueden sintetizar usando codones preferidos de plantas para mejorar la expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri, (1990) Plant Physiol.
92:1 -11 para una discusión sobre el uso de codones preferidos del hospedante. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico descritas aquí pueden expresarse tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden modificarse para tener en cuenta las preferencias específicas de codones y las preferencias de contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que estas preferencias difieren (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Por lo tanto, el codón preferido del maíz para un aminoácido particular puede derivar de secuencias genéticas conocidas del maíz. El uso de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz se enumera en la Tabla 4 de Murray, et al., más arriba. Hay métodos disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por ejemplo, las patentes US números 5.380.831 y 5.436.391, y Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, y Liu H et al. Mol Bio Rep 37: 677-684, 2010. Una tabla de uso de codones de Zea maize también se puede encontrar en kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, a la que se puede acceder usando el prefijo www.
Una tabla de uso de codones de Glycine max se puede encontrar en kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, a la que se puede acceder usando el prefijo www.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido IPD079 tiene codones optimizados para maíz.
Se sabe que modificaciones de secuencia adicionales potencian la expresión génica en un hospedante celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de ayuste de exón-intrón, repeticiones de tipo transposón, y otras secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de GC de la secuencia puede ajustarse a los niveles promedio para un hospedante celular dado, calculado mediante referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedante. La expresión “célula hospedante”, como se usa aquí, se refiere a una célula que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células hospedantes pueden ser células procarióticas, tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, anfibio o mamífero, o células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Un ejemplo de una célula hospedante monocotiledónea es una célula hospedante de maíz. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de ARNm secundarias en horquilla predichas.
Los casetes de expresión pueden contener adicionalmente secuencias líder en 5’. Tales secuencias líder pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la técnica, e incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo líder de EMCV (región no codificante 5’ de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potyvirus, por ejemplo líder de TEV (virus del grabado del tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder de MDMv (virus del mosaico del enano del maíz), proteína de unión a la cadena pesada (BiP) de inmunoglobulina humana (Macejak, et al., (1991) Nature 353:90-94); líder no traducido del ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625);
líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256), y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Véase también, Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Dichos constructos también pueden contener una “secuencia señal” o “secuencia líder” para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del péptido a ciertas estructuras intracelulares, tales como el cloroplasto (u otro plástido), el retículo endoplasmático o el aparato de Golgi.
“Secuencia señal”, como se usa aquí, se refiere a una secuencia que se sabe o se sospecha que da como resultado el transporte cotraduccional o postraduccional de péptidos a través de la membrana celular. En los eucariotas, esto normalmente implica la secreción en el aparato de Golgi, con algo de glicosilación resultante. Las toxinas insecticidas de las bacterias a menudo se sintetizan como protoxinas, que se activan proteolíticamente en el intestino de la plaga diana (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). En algunos aspectos, la secuencia señal se ubica en la secuencia nativa, o puede derivar de una secuencia descrita aquí. “Secuencia líder”, como se usa aquí, se refiere a cualquier secuencia que, cuando se traduce, da como resultado una secuencia de aminoácidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptídica a un orgánulo subcelular. Por lo tanto, esto incluye secuencias líder dirigidas al transporte y/o glicosilación por paso al retículo endoplásmico, paso a vacuolas, plástidos que incluyen cloroplastos, mitocondrias, y similares. Las proteínas codificadas nuclearmente dirigidas al compartimento del lumen del tilacoide del cloroplasto tienen un péptido de tránsito bipartito característico, compuesto por un péptido señal dirigido al estroma y un péptido señal dirigido al lumen. La información de direccionamiento del estroma está en la porción amino-proximal del péptido de tránsito. El péptido señal de direccionamiento al lumen está en la porción proximal al carboxilo del péptido de tránsito, y contiene toda la información para el direccionamiento al lumen. Investigaciones recientes en proteómica del cloroplasto de plantas superiores han logrado la identificación de numerosas proteínas del lumen codificadas nuclearmente (Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12: 319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350-356, 2001), cuyo péptido señal dirigido al lumen puede usarse potencialmente de acuerdo con la presente descripción. Unas 80 proteínas de Arabidopsis, así como proteínas homólogas de espinacas y guisantes de jardín, se dan a conocer por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. En particular, la Tabla 2 de esta publicación describe 85 proteínas del lumen del cloroplasto, identificadas por su número de acceso (véase también la publicación de solicitud de patente US 2009/09044298). Además, la versión preliminar recientemente publicada del genoma del arroz (Goff et al, Science 296:92-100, 2002) es una fuente adecuada para el péptido señal dirigido al lumen que puede usarse de acuerdo con la presente descripción.
Los péptidos de tránsito de cloroplastos (CTP) adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica, y también incluyen CTP quiméricos que comprenden, pero no se limitan a, un dominio N-terminal, un dominio central, o un dominio C-terminal de un CTP de 1-desoxi-D xulosa-5-fosfato sintasa de Oriza sativa, superóxido dismutasa de Oryza sativa, almidón sintasa soluble de Oryza sativa, enzima del ácido málico dependiente de NADP de Oryza sativa, fosfo-2-deshidro-3-desoxiheptonato aldolasa 2 de Oryza sativa, L-ascorbato peroxidasa 5 de Oryza sativa, fosfoglucano agua diquinasa de Oryza sativa, ssRUBISCO de Zea Mays, beta-glucosidasa de Zea Mays, malato deshidrogenasa de Zea mays, tiorredoxina tipo M de Zea Mays, publicación de solicitud de patente US 2012/0304336).
El gen del polipéptido IPD079 que se dirige al cloroplasto puede optimizarse para la expresión en el cloroplasto para tener en cuenta las diferencias en el uso de codones entre el núcleo de la planta y este orgánulo. De esta manera, los ácidos nucleicos de interés se pueden sintetizar usando codones preferidos de cloroplastos. Véase, por ejemplo, patente US número 5.380.831.
Al preparar el casete de expresión, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según corresponda, en el marco de lectura adecuado. Con este fin, pueden emplearse adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN, o pueden estar involucradas otras manipulaciones para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este fin, pueden estar implicadas mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, hibridación, resustituciones, por ejemplo transiciones y transversiones.
Se pueden usar varios promotores. Los promotores se pueden seleccionar en función del resultado deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferidos de tejido, inducibles, u otros, para la expresión en el organismo hospedante. Los promotores constitutivos adecuados para uso en una célula hospedante vegetal incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7, y otros promotores constitutivos descritos en el documento WO 1999/43838 y la patente US número 6.072.050; el promotor central de CaMV 35S (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al., (1989) Plant Mol. Biol.
12:619-632 y Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); UEMp (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor de ElA (patente US número 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los discutidos en las patentes US números 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 y 6.177.611.
Según el resultado deseado, puede ser beneficioso expresar el gen a partir de un promotor inducible. De particular interés para regular la expresión de las secuencias nucleotídicas descritas aquí en plantas son los promotores inducibles por heridas. Dichos promotores inducibles por heridas pueden responder al daño causado por la alimentación de insectos, e incluyen el gen inhibidor de la proteinasa de la patata (pin II) (Ryan, (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 y wun2, patente US número 5.428.148; win1 y win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeieret al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141-150), y similares.
Además, en los métodos y constructos de nucleótidos descritos aquí pueden emplearse promotores inducibles por patógenos. Dichos promotores inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con la patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Véanse, por ejemplo, Redolfi, et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes, et al., (1992) Plant Cell 4: 645-656, y Van Loon, (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Véase también, el documento WO 1999/43819.
Son de interés los promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de infección por patógenos. Véanse, por ejemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet.
2:93-98, y Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Véanse también, Chen, et al., (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner, et al., (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz, et al., (1989) Plant Cell 1:961 -968; patente US número 5.750.386 (inducible por nematodos) y las referencias citadas allí. De particular interés es el promotor inducible del gen PRms del maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (véase, por ejemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).
Los promotores regulados químicamente pueden usarse para modular la expresión de un gen en una planta mediante la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo de la diana, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, en el que la aplicación de la sustancia química induce la expresión génica, o un promotor reprimible por sustancias químicas, en el que la aplicación de la sustancia química reprime la expresión génica. Los promotores inducibles por sustancias químicas son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 de maíz, que se activa con protectores de herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST de maíz, que se activa con compuestos electrófilos hidrófobos que se utilizan como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-1a del tabaco, que es activado por el ácido salicílico. Otros promotores regulados por sustancias químicas de interés incluyen promotores sensibles a esteroides (véanse, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoides en Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425, y McNellis, et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257), y promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles por tetraciclina (véanse, por ejemplo, Gatz, et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las patentes u S números 5.814.618 y 5.789.156).
Los promotores preferidos de tejidos se pueden utilizar para dirigirse contra la expresión mejorada del polipéptido IPD079 dentro de un tejido vegetal particular. Los promotores preferidos de tejidos incluyen los discutidos en Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata, et al., (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen, et al., (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell, et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart, et al., (1996) Plant Physiol.
112(3):1331 -1341; Van Camp, et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini, et al., (1996) Plant Physiol.
112(2):513-524; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam, (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181 -196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590, y Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-505. Dichos promotores pueden modificarse, si es necesario, para una expresión débil.
Los promotores preferidos de las hojas son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Yamamoto, et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon, et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto, et al., (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor, et al., (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138 and Matsuoka, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.
Los promotores preferidos de la raíz o específicos de la raíz son conocidos y pueden seleccionarse de los muchos disponibles en la bibliografía, o pueden aislarse de novo a partir de diversas especies compatibles. Véanse, por ejemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de glutamina sintetasa específico de raíz de soja); Keller y Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051 -1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de haba francesa); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de la raíz del gen de la manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens), y Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1 ):11 -22 (clon de ADNc de longitud completa que codifica la glutamina sintetasa (GS) citosólica, que se expresa en raíces y nódulos de raíces de soja). Véase también, Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, en el que se describen dos promotores específicos de raíces aislados de genes de hemoglobina de la no leguminosa fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa no fijadora de nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen informador de p-glucuronidasa y se introdujeron tanto en la no leguminosa Nicotiana tabacum y la legumbre loto corniculatus, y en ambos casos se conservó la actividad del promotor específica de la raíz. Leach y Aoyagi, (1991) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raíces rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (véase, Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Llegaron a la conclusión de que los determinantes de ADN preferidos de tejidos y potenciadores están disociados en esos promotores. Teeri, et al., (1989) usaron la fusión de genes a lacZ para mostrar que el gen T-DNA de Agrobacterium que codifica la octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz, y que el gen TR2’ es específico de la raíz en la planta intacta y se estimula al herir el tejido de la hoja, una combinación de características especialmente deseable para uso con un gen insecticida o larvicida (véase, EMBO J.
8(2):343-350). El gen TR1’ fusionado con nptll (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíces adicionales incluyen el promotor del gen VfENOD-GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) y el promotor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4) :681 -691. Véase también, las patentes US números 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 y 5.023.179. Las secuencias reguladoras preferidas de la raíz de Arabidopsis thaliana se describen en el documento US20130117883.
Los promotores “preferidos de semillas” incluyen tanto promotores “específicos de semillas” (aquellos promotores activos durante el desarrollo de semillas, tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semillas) como promotores “germinadores de semillas” (aquellos promotores activos durante la germinación de semillas). Véase, Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108. Dichos promotores preferidos de semillas incluyen, pero no se limitan a, Cim1 (mensaje inducido por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz); y milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa) (véase, patente US número 6.225.529). Gamma-zeína y Glb-1 son promotores específicos del endospermo. Para las dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, el inhibidor de tripsina 3 de Kunitz (KTi3) (Jofuku y Goldberg, (1989) Plant Cell 1: 1079-1093), p-faseolina de judía, napina, p-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferita, y similares. Para las monocotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, cerosa, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Véase también, el documento WO 2000/12733, en el que se describen los promotores preferidos de semillas de los genes endl y end2. En dicotiledóneas, los promotores específicos de semillas incluyen, pero no se limitan a, promotores de la cubierta de la semilla de Arabidopsis, pBAN; y los promotores tempranos de semillas de Arabidopsis, p26, p63 y p63tr (patentes US números 7.294.760 y 7.847.153). Un promotor que tiene expresión “preferida” en un tejido particular se expresa en ese tejido en mayor grado que en al menos otro tejido vegetal. Algunos promotores preferidos de tejido muestran expresión casi exclusivamente en el tejido particular.
Cuando se desee un nivel de expresión bajo, se utilizarán promotores débiles. En general, la expresión “promotor débil”, como se usa aquí, se refiere a un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante en un nivel bajo. Por expresión de nivel bajo se entiende niveles de entre alrededor de 1/1000 transcritos a alrededor de 1/100.000 transcritos a alrededor de 1/500.000 transcritos. Alternativamente, se reconoce que la expresión “promotores débiles” también abarca promotores que impulsan la expresión en solo unas pocas células y no en otras, para dar un nivel de expresión total bajo. Cuando un promotor dirige la expresión a niveles inaceptablemente altos, pueden eliminarse o modificarse partes de la secuencia del promotor para disminuir los niveles de expresión.
Dichos promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo, el promotor central del promotor Rsyn7 (documento WO 1999/43838 y patente US número 6.072.050), el promotor central 35S CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, los descritos en las patentes US números 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 y 6.177.611.
La lista anterior de promotores no pretende ser limitativa. Puede usarse cualquier promotor apropiado.
Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable, para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ejemplos adicionales de genes marcadores seleccionables adecuados incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella, et al., (1983) EMBO J. 2:987-992); metotrexato (Herrera Estrella, et al., (1983) Nature 303:209-213 y Meijer, et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:807-820); estreptomicina (Jones, et al., (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard, et al., (1996) Transgenic Res. 5:131-137); bleomicina (Hille et al., (1990) Plant Mol. Biol. 7:171-176); sulfonamida (Guerineau, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:127-136); bromoxinilo (Stalker, et al., (1988) Science 242:419-423); glifosato (Shaw, et al., (1986) Science 233: 478-481, y las solicitudes de patente US series números 10/004.357 y 10/427.692); fosfinotricina (DeBlock, et al., (1987) EMBO J.6:2513-2518). Véase en general, Yarranton, (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao, et al., (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff, (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley, et al., (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu, et al., (1987) Cell 48:555-566; Brown, et al., (1987) Cell 49:603-612; Figge, et al., (1988) Cell 52:713-722; Deuschle, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400-5404; Fuerst, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle, et al., (1990) Science 248:480-483; Gossen, (1993) Tesis doctoral, Universidad de Heidelberg; Reines, et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow, et al., (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski, et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman, (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb, et al., (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt, et al., (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin, (1993) Tesis doctoral, Universidad de Heidelberg; Gossen, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva, et al., (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka, et al., (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin), y Gill, et al., (1988) Nature 334:721-724.
La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitativa. Puede usarse cualquier gen marcador seleccionable.
Transformación de plantas
Los métodos descritos aquí implican la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. “Introducir”, como se usa aquí, significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia obtenga acceso al interior de una célula de la planta. Los métodos descritos aquí no dependen de un método particular para introducir un polinucleótido o polipéptido en una planta, solo que el polinucleótido o los polipéptidos obtienen acceso al interior de al menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos o polipéptidos en plantas son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transitoria, y métodos mediados por virus.
“Transformación estable”, como se usa aquí, significa que el constructo de nucleótidos introducido en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredado por la progenie de la misma. “Transformación transitoria”, como se usa aquí, significa que se introduce un polinucleótido en la planta y no se integra en el genoma de la planta, o se introduce un polipéptido en una planta. “Planta”, como se usa aquí, se refiere a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, células vegetales, propágulos, embriones y progenie de los mismos. Las células vegetales pueden ser diferenciadas o no diferenciadas (por ejemplo, callos, células de cultivo en suspensión, protoplastos, células de hojas, células de raíz, células de floema y polen).
Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de nucleótidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, seleccionado como diana de la transformación. Los métodos adecuados para introducir secuencias nucleotídicas en células vegetales y la posterior inserción en el genoma de la planta incluyen la microinyección (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606), transformación mediada por Agrobacterium (patentes US números 5.563.055 y 5.981.840), transferencia directa de genes (Paszkowski, et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración de partículas balísticas (véanse, por ejemplo, las patentes US números 4.945.050; 5.879.918; 5.886.244 y 5.932.782; Tomes, et al., (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips, (Springer-Verlag, Berlín), y McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926), y transformación Lecl (documento w O 00/28058). Para la transformación de patata, véanse, Tu, et al., (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838, y Chong, et al., (2000) Transgenic Research 9:71-78. Se pueden encontrar procedimientos adicionales de transformación en Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe, et al., (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen, (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh, et al., (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes Us números 5.240.855; 5.322.783 y 5.324.646; Klein, et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren, et al., (1984) Nature (Londres) 311:763-764; patente US número 5.736.369 (cereales); Bytebier, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet, et al., (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman, et al., (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por triquitos); D’Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255, y Christou y Ford, (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz vía Agrobacterium tumefaciens).
En aspectos específicos, las secuencias descritas aquí se pueden proporcionar a una planta usando una variedad de métodos de transformación transitoria. Tales métodos de transformación transitoria incluyen, pero no se limitan a, la introducción del polinucleótido IPD079 o variantes y fragmentos del mismo directamente en la planta, o la introducción del transcrito del polipéptido IPD079 en la planta. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véanse, por ejemplo, Crossway, et al., (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura, et al., (1986) Plant Sci.
44:53-58; Hepler, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:2176-2180 y Hush, et al., (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784. Alternativamente, el polinucleótido IPD079 se puede transformar transitoriamente en la planta usando técnicas conocidas en la técnica. Dichas técnicas incluyen el sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido de una manera que impide la posterior liberación del ADN. Por lo tanto, la transcripción del ADN unido a partículas puede ocurrir, pero la frecuencia con la que se libera para integrarse en el genoma se reduce considerablemente. Dichos métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilimina (PEI; Sigma #P3143).
En la técnica se conocen métodos para la inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En un aspecto, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 y WO 1999/25853. Brevemente, el polinucleótido descrito aquí puede estar contenido en un casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos. El casete de transferencia se introduce en una planta que tiene incorporado de manera estable en su genoma un sitio diana que está flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los sitios del casete de transferencia. Se proporciona una recombinasa adecuada, y el casete de transferencia se integra en el sitio diana. El polinucleótido de interés se integra así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta.
Los vectores de transformación de plantas pueden estar compuestos por uno o más vectores de ADN necesarios para lograr la transformación de plantas. Por ejemplo, es una práctica común en la técnica utilizar vectores de transformación de plantas que se componen de más de un segmento de ADN contiguo. Estos vectores a menudo se denominan en la técnica “vectores binarios”. Los vectores binarios, así como los vectores con plásmidos auxiliares, se usan con mayor frecuencia para la transformación mediada por Agrobacterium, en la que el tamaño y la complejidad de los segmentos de ADN necesarios para lograr una transformación eficiente son bastante grandes y es ventajoso separar las funciones en moléculas de ADN separadas. Los vectores binarios normalmente contienen un vector de plásmido que contiene las secuencias que actúan en cis requeridas para la transferencia de ADN-T (tal como el borde izquierdo y el borde derecho), un marcador seleccionable que está diseñado para ser capaz de expresarse en una célula vegetal, y un “gen de interés” (un gen diseñado para ser capaz de expresión en una célula vegetal para la que se desea la generación de plantas transgénicas). También están presentes en este vector de plásmido las secuencias requeridas para la replicación bacteriana. Las secuencias que actúan en cis están dispuestas de manera que permitan una transferencia eficaz a las células vegetales y la expresión en las mismas. Por ejemplo, el gen marcador seleccionable y el gen plaguicida están ubicados entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo, un segundo vector de plásmido contiene los factores que actúan en trans que median la transferencia de ADN-T de Agrobacterium a las células vegetales. Este plásmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infección de células vegetales por Agrobacterium, y la transferencia de ADN por escisión en las secuencias fronterizas y la transferencia de ADN mediada por vir, como se entiende en la técnica (Hellens y Mullineaux, (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). Se pueden usar varios tipos de cepas de Agrobacterium (por ejemplo, LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformación de plantas. El segundo plásmido vector no es necesario para transformar las plantas por otros métodos tales como microproyección, microinyección, electroporación, polietilenglicol, etc.
En general, los métodos de transformación de plantas implican la transferencia de ADN heterólogo a células vegetales diana (por ejemplo, embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspensión, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicación de un nivel umbral máximo de selección adecuada (según el gen marcador seleccionable) para recuperar las células vegetales transformadas de un grupo de masa celular no transformada. Después de la integración del ADN extraño heterólogo en las células vegetales, se aplica un nivel umbral máximo de selección apropiada en el medio para matar las células no transformadas, para separar y proliferar las células supuestamente transformadas que sobreviven de este tratamiento de selección al transferirlas regularmente a un medio nuevo. Por pasada continua y exposición con la selección apropiada, se identifican y proliferan las células que se transforman con el vector plasmídico. Entonces pueden usarse métodos moleculares y bioquímicos para confirmar la presencia del gen heterólogo integrado de interés en el genoma de la planta transgénica.
Los explantes normalmente se transfieren a un suministro reciente del mismo medio, y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las células transformadas se diferencian en brotes después de colocarlas en un medio de regeneración suplementado con un nivel umbral máximo de agente de selección. Entonces, los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar brotes o plántulas enraizados. La plántula transgénica crece entonces hasta convertirse en una planta madura y produce semillas fértiles (por ejemplo, Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6: 271­ 282; Ishida, et al., (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Los explantes normalmente se transfieren a un suministro reciente del mismo medio, y se cultivan de forma rutinaria. Una descripción general de las técnicas y métodos para generar plantas transgénicas se encuentra en Ayres y Park, (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 y Bommineni y Jauhar, (1997) Maydica 42:107-120. Dado que el material transformado contiene muchas células; tanto las células transformadas como las no transformadas están presentes en cualquier pieza de callo o tejido diana sometido o grupo de células. La capacidad de matar células no transformadas y permitir que las células transformadas proliferen da como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo, la capacidad de eliminar células no transformadas es una limitación para la recuperación rápida de células vegetales transformadas y la generación exitosa de plantas transgénicas.
Las células que se han transformado se pueden cultivar en plantas de acuerdo con formas convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick, et al., (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. A continuación, estas plantas pueden cultivarse y polinizarse con la misma cepa transformada o con cepas diferentes, y se identifica el híbrido resultante que tiene una expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para garantizar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga y se herede de manera estable y luego se cosechen las semillas para garantizar que se haya logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.
Las secuencias nucleotídicas descritas aquí pueden proporcionarse a la planta poniendo en contacto la planta con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, dichos métodos implican la incorporación del constructo de nucleótidos de interés dentro de una molécula de ADN o ARN viral. Se reconoce que las proteínas recombinantes descritas aquí pueden sintetizarse inicialmente como parte de una poliproteína viral, que luego puede procesarse mediante proteólisis in vivo o in vitro para producir el polipéptido IPD079 deseado. También se reconoce que dicha poliproteína viral, que comprende al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de un IPD079 descrito aquí, puede tener la actividad plaguicida deseada. Dichas poliproteínas virales y las secuencias nucleotídicas que las codifican se describen aquí. Se conocen en la técnica métodos para proporcionar a las plantas constructos de nucleótidos y producir las proteínas codificadas en las plantas, que implican moléculas de ADN o ARN virales. Véanse, por ejemplo, las patentes US números 5.889.191; 5.889.190; 5.866.785; 5.589.367 y 5.316.931.
Los métodos para la transformación de cloroplastos son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Svab, et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab y Maliga, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab y Maliga, (1993) EMBO J. 12:601-606. El método se basa en el suministro con pistola de partículas de ADN que contiene un marcador seleccionable y el direccionamiento del ADN al genoma del plástido a través de la recombinación homóloga. Además, la transformación de plástidos se puede lograr mediante la transactivación de un transgén silencioso transmitido por plástidos mediante la expresión preferida de tejido de una ARN polimerasa codificada nuclearmente y dirigida por plástidos. Tal sistema se ha dado a conocer en McBride, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.
Los aspectos se refieren además al material de propagación de plantas de una planta transformada descrita aquí, que incluye, pero no se limita a, semillas, tubérculos, cormos, bulbos, hojas y esquejes de raíces y brotes.
Los aspectos pueden usarse para la transformación de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no se limitan a, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), proso mijo (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (¡pomoea batatus), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), piña (Ananas comosus), cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), marañón (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas ornamentales, y coníferas.
Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis, tales como pepino (C. sativus), melón (C. cantalupensis), y melón almizclero (C. melo). Los ornamentales incluyen azalea (Rododendron spp.), hortensias (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), clavel (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima), y crisantemo. Las coníferas que pueden emplearse en la práctica de los aspectos incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino loblolly (Pinus taeda), pino ellioti (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino torcido (Pino contorta), y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); cicuta occidental (Tsuga canadensis); pícea de Sitka (Picea glauca); secuoya (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos, tal como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros, tal como cedro rojo occidental (Thua picata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). Las plantas descritas aquí incluyen plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, brasicáceas, soja, algodón, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), tales como plantas de maíz y soja.
Los pastos de césped incluyen, pero no se limitan a: poa anual (Poa anual); ballica anual (Lolium multiflorum); pasto azul de Canadá (Poa compresa); cañuela común (Festuca rubra); pasto colonial (Agrostis tenuis); pasto rastrero (Agrostis palustris); pasto de trigo crestado (Agropyron desertorum); hierba de trigo de calle (Agropyron cristatum); festuca dura (Festuca longifolia); hierba azul de kentucky (Poa pratensis); pasto ovillo (Dactylis glomerata); ballica perenne (Lolium perenne); festuca roja (Festuca rubra); pasto quila (Agrostis alba); gamilla (Poa trivialis); barcea (Festuca ovina); bromo inerme (Bromus inermis); festuca alta (Festuca arundinacea); fleo (Phleum pratense); agróstide canina (Agrostis canina); hierba alcalina llorona (Puccinellia distancia); hierba de trigo occidental (Agropyron smithii); pasto bermuda (Cynodon spp.); hierba de San Agustín (Stenotaphrum secundatum); hierba zoysia (Zoysia spp.); pasto bahía (Paspalum notatum); hierba de alfombra (Axonopus affinis); hierba ciempiés (Eremochloa ophiuroides); hierba kikuyo (Pennisetum clandesinum); paspalum de la orilla del mar (Paspalum vaginatum); grama azul (Bouteloua gracilis); hierba de búfalo (Buchloe dactyloids); grama colgante corto (Bouteloua curtipendula).
Las plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas oleaginosas, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de cereales, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, brasicáceas, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, olivo, etc. Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarrobo, fenogreco, soja, habas de jardín, caupí, judía mungo, judía lima, haba, lentejas, garbanzos, etc.
Evaluación de la transformación de plantas
Después de la introducción de ADN extraño heterólogo en células vegetales, la transformación o integración del gen heterólogo en el genoma de la planta se confirma mediante diversos métodos, tal como el análisis de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos asociados con el gen integrado.
El análisis de PCR es un método rápido para examinar células, tejidos o brotes transformados en busca de la presencia del gen incorporado en la etapa anterior antes del trasplante al suelo (Sambrook y Russell, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,Nueva York). La PCR se lleva a cabo usando cebadores de oligonucleótidos específicos para el gen de interés, o antecedentes del vector Agrobacterium, etc.
La transformación de las plantas puede confirmarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN genómico (Sambrook y Russell, (2001), más arriba). En general, el ADN total se extrae del transformante, se digiere con las enzimas de restricción apropiadas, se fracciona en un gel de agarosa, y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa o nailon. A continuación, la membrana o “transferencia” se sonda, por ejemplo, con un fragmento de ADN diana 32P radiomarcado para confirmar la integración del gen introducido en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas estándar (Sambrook y Russell, (2001), más arriba).
En el análisis de transferencia Northern, el ARN se aísla de tejidos específicos del transformante, se fracciona en un gel de agarosa con formaldehído, y se transfiere a un filtro de nailon de acuerdo con los procedimientos estándar que se usan de forma habitual en la técnica (Sambrook y Russell, (2001). supra). La expresión del ARN codificado por el gen plaguicida se analiza luego mediante la hibridación del filtro con una sonda radiactiva derivada de un gen plaguicida, mediante métodos conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, (2001)), más arriba).
La transferencia Western, los ensayos bioquímicos, y similares, se pueden llevar a cabo en las plantas transgénicas para confirmar la presencia de proteína codificada por el gen plaguicida por procedimientos estándar (Sambrook y Russell, 2001, más arriba) usando anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en el polipéptido IPD079.
Apilamiento de rasgos en planta transgénica
Las plantas transgénicas pueden comprender una pila de uno o más polinucleótidos insecticidas descritos aquí con uno o más polinucleótidos adicionales que dan como resultado la producción o supresión de múltiples secuencias polipeptídicas. Las plantas transgénicas que comprenden pilas de secuencias polinucleotídicas pueden obtenerse mediante uno o ambos métodos de cultivo tradicionales, o mediante métodos de ingeniería genética. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, la reproducción de líneas individuales, cada una de las cuales comprende un polinucleótido de interés, la transformación de una planta transgénica que comprende un gen descrito aquí con un gen posterior, y la cotransformación de genes en una única célula vegetal. Tal como se usa aquí, el término “apilado” incluye tener los múltiples rasgos presentes en la misma planta (es decir, ambos rasgos se incorporan al genoma nuclear, un rasgo se incorpora al genoma nuclear y un rasgo se incorpora al genoma de un plástido, o ambos rasgos se incorporan al genoma de un plástido). En un ejemplo no limitativo, los “rasgos apilados” comprenden una pila molecular en la que las secuencias son físicamente adyacentes entre sí. Un rasgo, como se usa aquí, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o grupos de secuencias. La cotransformación de genes se puede llevar a cabo usando vectores de transformación únicos que comprenden múltiples genes, o genes transportados por separado en múltiples vectores. Si las secuencias se apilan transformando genéticamente las plantas, las secuencias polinucleotídicas de interés pueden combinarse en cualquier momento y en cualquier orden. Los rasgos se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés proporcionados por cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si se van a introducir dos secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidas en el mismo casete de transformación (cis). La expresión de las secuencias puede estar dirigida por el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un casete de transformación que suprima la expresión del polinucleótido de interés. Esto puede combinarse con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de rasgos en la planta. Se reconoce además que las secuencias polinucleotídicas se pueden apilar en una ubicación genómica deseada usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 1999/25821, WO 1999/25854, WO 1999/25840, WO 1999/25855 y WO 1999/25853.
En algunos aspectos, los polinucleótidos que codifican el polipéptido IPD079 descrito aquí, solos o apilados con uno o más rasgos adicionales de resistencia a insectos, pueden apilarse con uno o más rasgos de entrada adicionales (por ejemplo, resistencia a herbicidas, resistencia a hongos, resistencia a virus, tolerancia al estrés, resistencia a enfermedades, esterilidad masculina, fuerza del tallo, y similares) o características de producción (por ejemplo, mayor rendimiento, almidones modificados, perfil de aceite mejorado, aminoácidos equilibrados, alto contenido de lisina o metionina, mayor digestibilidad, calidad de fibra mejorada, resistencia a la sequía, y similares). Por lo tanto, los polinucleótidos descritos aquí se pueden usar para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar de forma flexible y rentable cualquier número de plagas agronómicas.
Los transgenes útiles para el apilamiento incluyen, pero no se limitan a:
1. Transgenes que confieren resistencia a insectos o enfermedades, y que codifican:
1. (A) Genes de resistencia a enfermedades de las plantas. Las defensas de las plantas a menudo se activan mediante una interacción específica entre el producto de un gen de resistencia a enfermedades (R) en la planta y el producto de un gen de avirulencia (Avr) correspondiente en el patógeno. Una variedad de planta se puede transformar con un gen de resistencia clonado para diseñar plantas que sean resistentes a cepas patógenas específicas. Véanse, por ejemplo, Jones, et al., (1994) Science 266:789 (clonación del gen de tomate Cf-9 para la resistencia a Cladosporium fulvum); Martin, et al., (1993) Science 262:1432 (el gen Pto del tomate para la resistencia a Pseudomonas syringae pv. codifica una proteína cinasa); Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089 (gen RSP2 de Arabidopsis de resistencia a Pseudomonas syringae), McDowell y Woffenden, (2003) Trends Biotechnol. 21(4):178-83, y Toyoda, et al., (2002) Transgenic Res. 11 (6):567-82. Una planta resistente a una enfermedad es aquella que es más resistente a un patógeno en comparación con la planta de tipo salvaje.
2. (B) Genes que codifican una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma, o un polipéptido sintético modelado sobre la misma. Véase, por ejemplo, Geiser, et al., (1986) Gene 48:109, que describen la clonación y la secuencia nucleotídica de un gen de la endotoxina delta de Bt. Además, las moléculas de ADN que codifican los genes de la endotoxina delta se pueden comprar en la American Type Culture Collection (Rockville, Md.), por ejemplo, bajo los números de acceso de ATCC® 40098, 67136, 31995 y 31998. Otros ejemplos no limitativos de transgenes de Bacillus thuringiensis modificados genéticamente se dan en las siguientes patentes y solicitudes de patentes: patentes US números 5.188.960; 5.689.052; 5.880.275; 5.986.177; 6.023.013, 6.060.594, 6.063.597, 6.077.824, 6.620.988,
6.642.030, 6.713.259, 6.893.826, 7.105.332; 7.179.965, 7.208.474; 7.227.056, 7.288.643, 7.323.556, 7.329.736,
7.449.552, 7.468.278, 7.510.878, 7.521.235, 7.544.862, 7.605.304, 7.696.412, 7.629.504, 7.705.216, 7.772.465,
7.790.846, 7.858.849 y WO 1991/14778; WO 1999/31248; WO 2001/12731; WO 1999/24581 y WO 1997/40162.
También se pueden apilar genes que codifican proteínas plaguicidas, incluyendo, pero no se limitan a: proteínas insecticidas de Pseudomonas sp. tal como PSEEN3174 (Monalysin; (2011) PLoS Pathogens 7:1-13); de Pseudomonas protegens cepa CHAO y Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Environmental Microbiology 10:2368-2386; n° de acceso GenBank EU400157); de Pseudomonas Taiwanensis (Liu, et al., (2010) J. Agric. Food Chem., 58:12343-12349) y de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50, y Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 89:159-168); proteínas insecticidas de Photorhabdus sp. Y Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxicology Journal, 3:101-118, y Morgan, et al., (2001) Applied and Envir. Micro. 67:2062-2069); patente US número 6.048.838, patente US número 6.379.946; un polipéptido PIP-1 de la publicación de patente US20140007292; un polipéptido AfIP-1A y/o AfIP-1 B de la publicación de patente US20140033361; un polipéptido PHI-4 de la publicación de patente US20140274885 y US20160040184; un polipéptido PIP-47 de la publicación pCt número WO2015/023846, un polipéptido PIP-72 de la publicación PCT número WO2015/038734; un polipéptido PtIP-50 y un polipéptido PtIP-65 de la publicación PCT número WO2015/120270; un polipéptido PtIP-83 de la publicación PCT número WO2015/120276; un polipéptido PtIP-96 de PCT Serie Número PCT/US15/55502; un polipéptido IPD073 de PCT Serie Número PCT/US16/32273, un polipéptido IPD082 de US Serie Número 62/269482, y 5-endotoxinas, inluyendo, pero no limitadas а, las clases Cry1, Cry2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry10, Cry11, Cry12, Cry13, Cry14, Cry15, Cry16, Cry17, Cry18, Cry19, Cry20, Cry21, Cry22, Cry23, Cry24, Cry25, Cry26, Cry27, Cry 28, Cry 29, Cry 30, Cry31, Cry32, Cry33, Cry34, Cry35,Cry36, Cry37, Cry38, Cry39, Cry40, Cry41, Cry42, Cry43, Cry44, Cry45, Cry 46, Cry47, Cry49, Cry50, Cry51, Cry52, Cry53, Cry 54, Cry55, Cry56, Cry57, Cry58, Cry59, Cry60, Cry61, Cry62, Cry63, Cry64, Cry65, Cry66, Cry67, Cry68, Cry69, Cry70, Cry71, Cry72, Cry73, y Cry 74 de genes de 5-endotoxina y los genes citolíticos cyt1 y cyt2 de B. thuringiensis. Los miembros de estas clases de proteínas insecticidas de B. thuringiensis son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, Crickmore, et al., “Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (2011), en lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/, a la que se puede acceder en Internet utilizando el prefijo “www”).
Los ejemplos de 5-endotoxinas también incluyen, pero no se limitan a, proteínas Cry1A de patentes US números 5.880.275 y 7.858.849; una toxina DIG-3 o DIG-11 (eliminación N-terminal de variantes a-hélice 1 y/o a-hélice 2 de proteínas cry, tales como Cry1A, Cry3A) de las patentes US números 8.304.604, 8.304.605, 8.476.226, y 9.006.520;
Cry1B de la publicación de solicitud de patente US número 2006/0112447; Cry1C de la patente US número 6.033.874;
Cry1F de las patentes US números 5.188.960 y 6.218.188; quimeras Cry1A/F de las patentes US números 7.070.982; б. 962.705 y 6.713.063); una proteína Cry2, tal como la proteína Cry2Ab de la patente US número 7.064.249); una proteína Cry3A que incluye, pero no se limita a, una proteína insecticida híbrida diseñada (eHIP), creada mediante la fusión de combinaciones únicas de regiones variables y bloques conservados de al menos dos proteínas Cry diferentes (publicación de solicitud de patente US número 2010/0017914); una proteína Cry4; una proteína Cry5; una proteína Cry6; proteínas Cry8 de las patentes US números 7.329.736, 7.449.552, 7.803.943, 7.476.781, 7.105.332, 7.378.499 y 7.462.760; una proteína Cry9, tal como miembros de las familias Cry9A, Cry9B, Cry9C, Cry9D, Cry9E y Cry9F; una proteína Cry15 de Naimov, et al., (2008) Applied and Environmental Microbiology, 74:7145-7151; una Cry22, una proteína Cry34Ab1 de las patentes US números 6.127.180, 6.624.145 y 6.340.593; una proteína CryET33 y cryET34 de las patentes US números 6.248.535, 6.326.351, 6.399.330, 6.949.626, 7.385.107 y 7.504.229; homólogos CryET33 y CryET34 de la patente US número 8.796.026, publicación de patente US número 2012/0278954, y publicación PCT número WO 2012/139004; una proteína Cry35Ab1 de las patentes US números 6.083.499, 6.548.291 y 6.340.593; una proteína Cry46, una proteína Cry 51, una toxina binaria Cry; una TIC901 o toxina relacionada; TIC807 de la patente US número 8.609.936; ET29, ET37, TIC809, TIC810, TIC812, TIC127, TIC128 del documento WO 2007/027776; AXMI-027, AXMI-036, y AXMI-038 de la patente US número 8.236.757; AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040, AXMI-049 de la patente US número 7.923.602; AXMI-018, AXMI-020 y AXMI-021 del documento WO 2006/083891; AXMI-010 del documento WO 2005/038032; AXMI-003 del documento WO 2005/021585; AXMI-008 de la patente US número 7.351.881; AXMI-006 de la publicación de solicitud de patente US número 2004/0216186; AXMI-007 de la publicación de solicitud de patente US número 2004/0210965; AXMI-009 de la publicación de solicitud de patente US número 2004/0210964; AXMI-014 de la publicación de solicitud de patente US número 2004/0197917; AXMI-004 de la patente US número 7.355.099; AXMI-028 y AXMI-029 del documento WO 2006/119457, patentes US números 7.622.572, 7.803925, 7.803.391,7.811.598, 8.314.292; AXMI-007, AXMI-008, AXMI-0080, AXMI-009, AXMI-014 y AXMI-004 del documento WO 2004/074462; AXMI-150 de la patente US número 8.084.416;
AXMI-205 de la publicación de solicitud de patente US número 2011/0023184; AXMI-011, AXMI-012, AXMI-013, AXMI-015, AXMI-019, AXMI-044, AXMI-037, AXMI-043, AXMI-033, AXMI-034, AXMI-022, AXMI-023, AXMI-041, AXMI-063 y Ax M i-064 de la patente US número 8.829.279 o publicación de patente US número US20140344999; AXMI-R1 y proteínas relacionadas de la patente US número 8.299.217; AXMI221Z, AXMI222z, AXMI223z, AXM1224z y AXMl225z de la patente US número 8.686.124; AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230 y AXMI231 de la patente US número 8.759.619; AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 y AxMl-184 de la patente u S número 8.334.431; AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AxMl-035 y a Xm I-045 de la publicación de solicitud de patente US número 2013/0117884; AXMI-066 y AXMI-076 de la publicación de solicitud de patente US número 2009/0144852;
XMI148, XMI166,
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XMI177, AXMI178, AXMI179, AXMI180, AXMI181, AXMI182, AXMI185, AXMI186, AXMI187, AXMI188, AXMI189 de la patente US número 8.318.900 o publicación de patente US número 2013/0055469; AXMI079, AXMI080, AXMI081, AXMI082, AXMI091, AXMI092, AXMI096, AXMI097, AXMI098, AXMI099, AXMI100, AXMI101, AXMI102, AXMI103, AXMI104, AXMI107, AXMI108, AXM1109, AXMI110, AXMI111, AXMI112, AXMI114, AXMI116, AXMI117, AXMI118, AXMI119, AXMI120, AXMI121, AXMI122, AXMI123, AXMI124, AXMI1257, AXMI1268, AXMI127, AXMI129, AXMI164, AXMI151, AXMI161, AXMI183, AXMI132, AXMI138, AXMI137 de la patente US número 8.461.421 y publicación de patente US número 2013/0305412, proteínas cry, tales como Cry1 A y Cry3A, que tienen sitios proteolíticos modificados de la patente US número 8.319.019; una proteína de toxina Cry1Ac, Cry2Aa y Cry1Ca de Bacillus thuringiensis cepa VBTS 2528 de la patente US número 8.551.757. La actividad insecticida de las proteínas Cry es bien conocida por los expertos en la técnica (para revisión, véase, van Frannkenhuyzen, (2009) J. Invert. Path. 101:1-16). El uso de proteínas Cry como rasgos de plantas transgénicas es bien conocido por los expertos en la técnica, y las plantas transgénicas Cry, incluyendo, pero sin limitarse limitan a, plantas que expresan Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1 F, Cry1 Fa2, Cry1 F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3BM, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c y CBI-Bt, han recibido aprobación regulatoria (véanse, Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9: 283-300 y el CERA. (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C., en ceragmc.org/index.php?action=gm_crop_database, a la que se puede acceder en la red mundial usando el prefijo “www"). Más de una proteína plaguicida bien conocida por un experto en la técnica también se puede expresar en plantas, tales como Vip3Ab y Cry1Fa (documento US2012/0317682); Cry1BE y Cry1F (documento US2012/0311746); Cry1CA y Cry1AB (documento US2012/0311745); Cry1F y CryCa (documento US2012/0317681); Cry1DA y Cry1BE (documento US2012/0331590); Cry1 DA y Cry1Fa (documento US2012/0331589); Cry1AB y Cry1 BE (documento US2012/0324606); Cry1 Fa y Cry2Aa y Cry11 y Cry1 E (documento US2012/0324605); Cry34Ab/35Ab y Cry6Aa (documento US20130167269); Cry34Ab/VCry35Ab y Cry3Aa (documento US20130167268); y Cry3A y Cry1Ab o Vip3Aa (documento US20130116170). Las proteínas plaguicidas también incluyen lipasas insecticidas que incluyen acil hidrolasas lipídicas de la patente US número 7.491.869, y colesterol oxidasas tales como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Comun 15: 1406-1413). Las proteínas plaguicidas también incluyen toxinas VIP (proteínas insecticidas vegetales) de las patentes US números 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686, y 8.237.020, y similares. Otras proteínas VIP son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html, a la que se puede acceder en la red mundial utilizando el prefijo “www"). Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas complejas de toxinas (TC), que se pueden obtener de organismos tales como Xenorhabdus, Photorhabdus y Paenibacillus (véanse, las patentes US números 7.491.698 y 8.084.418). Algunas proteínas TC tienen actividad insecticida “independiente”, y otras proteínas TC aumentan la actividad de las toxinas independientes producidas por el mismo organismo dado. La toxicidad de una proteína TC “autónoma” (de Fotorhabdus, Xenorhabdus o Paenibacillus, por ejemplo) puede mejorarse mediante uno o más “potenciadores” de proteína TC derivados de un organismo fuente de un género diferente. Hay tres tipos principales de proteínas TC. Como se menciona aquí, las proteínas de Clase A (“Proteína A”) son toxinas autónomas. Las proteínas de Clase B (“Proteína B”) y las proteínas de Clase C (“Proteína C”) aumentan la toxicidad de las proteínas de Clase A. Ejemplos de proteínas de Clase A son TcbA, TcdA, XptA1 y XptA2. Ejemplos de proteínas de Clase B son TcaC, TcdB, XptB1Xb y XptC1Wi. Ejemplos de proteínas de Clase C son TccC, XptC1Xb y XptB1Wi. Las proteínas plaguicidas también incluyen proteínas de veneno de araña, serpiente y escorpión. Los ejemplos de péptidos de veneno de araña incluyen, pero no se limitan a, péptidos de licotoxina-1 y mutantes de los mismos (patente US número 8.334.366).
(C) Un polinucleótido que codifica una hormona o feromona específica de insecto, tal como un ecdiesteroide y hormona juvenil, una variante de la misma, un mimético basado en la misma o un antagonista o agonista de la misma. Véase, por ejemplo, la descripción de Hammock, et al., (1990) Nature 344:458, de la expresión de baculovirus de la esterasa de hormona juvenil clonada, un inactivador de la hormona juvenil.
(D) Un polinucleótido que codifica un péptido específico de insectos que, al expresarse, altera la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las descripciones de, Regan, (1994) J. Biol. Chem. 269:9 (la clonación de la expresión produce la codificación del ADN para el receptor de la hormona diurética de insectos); Pratt, et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (se identifica una alostatina en Diploptera puntata); Chattopadhyay, et al., (2004) Critical Reviews in Microbiology 30(1):33-54; Zjawiony, (2004) J Nat Prod 67(2):300-310; Carlini y Grossi-de-Sa, (2002) Toxicon 40(11):1515-1539; Ussuf, et al., (2001) Curr Sci. 80(7):847-853 y Vasconcelos y Oliveira, (2004) Toxicon 44(4):385-403. Véase también la patente US número 5.266.317 de Tomalski, et al., que describen genes que codifican toxinas específicas de insectos.
(E) Un polinucleótido que codifica una enzima responsable de una hiperacumulación de un monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado fenilpropanoide u otra molécula no proteica con actividad insecticida.
(F) Un polinucleótido que codifica una enzima implicada en la modificación, incluida la modificación postraduccional, de una molécula biológicamente activa; por ejemplo una enzima glicolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una cinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, ya sean naturales o sintéticos. Véase, solicitud PCT WO 1993/02197 a nombre de Scott, et al., que describe la secuencia nucleotídica de un gen de callasa. Las moléculas de ADN que contienen secuencias codificantes de quitinasa se pueden obtener, por ejemplo, de la ATCC® bajo los números de acceso 39637 y 67152. Véanse también, Kramer, et al., (1993) Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691, que enseñan la secuencia nucleotídica de un ADNc que codifica la quitinasa del anquilostoma del tabaco, y Kawalleck, et al., (1993) Plant Molec. Biol.21:673, que proporcionan la secuencia nucleotídica del gen de la poliubiquitina ubi4-2 del perejil, y las patentes US números 6.563.020; 7.145.060 y 7.087.810.
(G) Un polinucleótido que codifica una molécula que estimula la transducción de señales. Por ejemplo, véase la descripción de Botella, et al., (1994) Plant Molec. Biol. 24:757, de secuencias nucleotídicas para clones de ADNc de calmodulina de judía mungo, y Griess, et al., (1994) Plant Physiol. 104:1467, que proporcionan la secuencia nucleotídica de un clon de ADNc de calmodulina de maíz.
(H) Un polinucleótido que codifica un péptido de momento hidrofóbico. Véanse la solicitud PCT WO 1995/16776 y la patente US número 5.580.852, que describen derivados peptídicos de la taquiplesina que inhiben los patógenos fúngicos de las plantas), y la solicitud PCT WO 1995/18855 y la patente US número 5.607.914 (que enseñan péptidos antimicrobianos sintéticos que confieren resistencia a enfermedades).
(I) Un polinucleótido que codifica una permeasa de membrana, un formador de canales o un bloqueador de canales. Por ejemplo, véase la descripción de Jaynes, et al., (1993) Plant Sci. 89:43, de expresión heteróloga de un análogo de péptido lítico de cecropina-beta para hacer que las plantas de tabaco transgénicas sean resistentes a Pseudomonas solanacearum.
(J) Un gen que codifica una proteína viral invasiva o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de la cubierta viral en células vegetales transformadas imparte resistencia a la infección viral y/o al desarrollo de enfermedades efectuado por el virus del que deriva el gen de la proteína de la cubierta, así como por virus relacionados. Véase, Beachy, et al., (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. Se ha conferido resistencia mediada por la proteína de la cubierta a las plantas transformadas contra el virus del mosaico de la alfalfa, el virus del mosaico del pepino, el virus del rayado del tabaco, el virus X de la patata, el virus Y de la patata, el virus del grabado del tabaco, el virus del cascabel del tabaco, y el virus del mosaico del tabaco. Id.
(K) Un gen que codifica un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada del mismo. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido contra una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada y exterminaría al insecto. Véase, Taylor, et al., Abstract #497, SEVENTH INT'L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS (Edimburgo, Escocia, 1994) (inactivación enzimática en tabaco transgénico mediante la producción de fragmentos de anticuerpos monocatenarios).
(L) Un gen que codifica un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki, et al., (1993) Nature 366:469, que muestran que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están protegidas del ataque de virus.
(M) Un polinucleótido que codifica una proteína que detiene el desarrollo producida en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por lo tanto, las endo alfa-1,4-D-poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes vegetales al solubilizar la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared celular vegetal. Véase, Lamb, et al., (1992) Bio/Technology 10:1436. La clonación y caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de endopoligalacturonasa la judía es descrita por Toubart, et al., (1992) Plant J. 2:367.
(N) Un polinucleótido que codifica una proteína que detiene el desarrollo producida en la naturaleza por una planta. Por ejemplo, Logemann, et al., (1992) Bio/Technology 10:305, han demostrado que las plantas transgénicas que expresan el gen que inactiva los ribosomas de la cebada tienen una mayor resistencia a las enfermedades fúngicas.
(O) Genes implicados en la Respuesta de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) y/o los genes relacionados con la patogenia. Briggs, (1995) Current Biology 5(2), Pieterse y Van Loon, (2004) Curr. Opin. Plant Bio. 7(4):456-64, y Somssich, (2003) Cell 113(7):815-6.
(P) Genes antifúngicos (Cornelissen y Melchers, (1993) PI. Physiol. 101:709-712, y Parijs, et al., (1991) Planta 183:258-264, y Bushnell, et al., (1998) Can. J. of Plant Path. 20(2):137-149. Véanse también las solicitudes de patente US series números 09/950.933; 11/619.645; 11/657.710; 11/748.994; 11/774.121, y las patentes US números 6.891.085 y 7.306.946. Cinasas tipo receptor LysM para la percepción de fragmentos de quitina como primer etapa en la respuesta de defensa de las plantas contra patógenos fúngicos (documento US 2012/0110696).
(Q) Genes de desintoxicación, tales como fumonisina, beauvericina, moniliformina y zearalenona y sus derivados estructuralmente relacionados. Por ejemplo, véanse las patentes US números 5.716.820; 5.792.931; 5.798.255; 5.846.812; 6.083.736; 6.538.177; 6.388.171 y 6.812.380.
(R) Un polinucleótido que codifica inhibidores de cistatina y cisteína proteinasa. Véase la patente US número 7.205.453.
(S) Genes de defensina. Véanse el documento WO 2003/000863 y las patentes US números 6.911.577; 6.855.865; 6.777.592 y 7.238.781.
(T) Genes que confieren resistencia a los nematodos. Véanse, por ejemplo, solicitud PCT WO 1996/30517; solicitud PCT WO 1993/19181, WO 2003/033651, y Urwin, et al., (1998) Planta 204:472-479, Williamson, (1999) Curr Opin Plant Bio.
2(4):327-31; patentes US números 6.284.948 y 7.301.069, y genes miR164 (documento WO 2012/058266).
(U) Genes que confieren resistencia a Pudrición de la Raíz de Phytophthora, tales como Rps 1, Rps 1-a, Rps 1-b, Rps 1-c, Rps 1-d, Rps 1-e, Rps 1-k, Rps 2 , Rps 3-a, Rps 3-b, Rps 3-c, Rps 4, Rps 5, Rps 6, Rps 7 y otros genes Rps. Véanse, por ejemplo, Shoemaker, et al., Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean, Plant Genome IV Conference, San Diego, California (1995)).
(V) Genes que confieren resistencia a la Pudrición Parda del Tallo, tal como se describe en la patente US número 5.689.035.
(W) Genes que confieren resistencia a Colletotrichum, tal como se describe en la publicación de solicitud de patente US 2009/0035765. Esto incluye el locus Rcg que puede utilizarse como una conversión de locus único.
2. Transgenes que confieren resistencia a un herbicida, por ejemplo:
1. (A) Un polinucleótido que codifica la resistencia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o el meristema, tal como una imidazolinona o una sulfonilurea. Ejemplos de genes en esta categoría codifican la enzima ALS y AHAS mutante como se describe, por ejemplo, por Lee, et al., (1988) EMBO J. 7:1241, y Miki, et al., (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449, respectivamente. Ver también, las patentes US números 5.605.011; 5.013.659; 5.141.870; 5.767.361; 5.731.180; 5.304.732; 4.761.373; 5.331.107; 5.928.937 y 5.378.824; la solicitud de patente US serie número 11/683.737, y la publicación internacional WO 1996/33270.
2. (B) Un polinucleótido que codifica una proteína para la resistencia al glifosato (resistencia impartida por genes mutantes de 5-enolpiruvl-3-fosquimato sintasa (EPSP) y aroA, respectivamente) y otros fosfono compuestos tal como el glufosinato (genes de fosfinotricin acetil transferasa (PAT) y de fosfinotricina acetil transferasa (bar) de Streptomyces hygroscopicus), y ácidos piridinoxi o fenoxipropiónico y ciclohexonas (genes que codifican inhibidores de ACCasa). Véase, por ejemplo, la patente US número 4.940.835 de Sha, et al., que describe la secuencia nucleotídica de una forma de EPSPS que puede conferir resistencia al glifosato. La patente US número 5.627.061, de Barry, et al., también describe genes que codifican enzimas EPSPS. Véanse también las patentes US números 6.566.587; 6.338.961; 6.248.876; 6.040.497; 5.804.425; 5.633.435; 5.145.783; 4.971.908; 5.312.910; 5.188.642; 5.094.945. 4.940.835; 5.866.775; 6.225.114; 6.130.366; 5.310.667; 4.535.060; 4.769.061; 5.633.448; 5.510.471; Re. 36.449; RE 37.287 E y 5.491.288, y las publicaciones internacionales EP 1173580; WO 2001/66704; EP 1173581 y EP 1173582. La resistencia al glifosato también se imparte a las plantas que expresan un gen que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa como se describe con más detalle en las patentes US números 5.776.760 y 5.463.175. Además, la resistencia al glifosato se puede impartir a las plantas mediante la sobreexpresión de genes que codifican la glifosato N-acetiltransferasa. Véanse, por ejemplo, las patentes US números 7.462.481; 7.405.074, y el número de publicación de solicitud de patente US 2008/0234130. Una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante se puede obtener bajo ATCC® número de acceso 39256, y la secuencia nucleotídica del gen mutante se describe en la patente US número 4.769.061 de Comai. La solciitud EP número 0333033 de Kumada, et al., y la patente US número 4.975.374 de Goodman, et al., describen secuencias nucleotídicas de genes de glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia nucleotídica de un gen de fosfinotricetil-transferasa se proporciona en las solicitudes EP números 0242 246 y 0242 236 de Leemans, et al.,; De Greef, et al., (1989) Bio/Technology 7:61, describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican la actividad de fosfinotricina acetil transferasa. Véanse también las patentes US números 5.969.213; 5.489.520; 5.550.318; 5.874.265; 5.919.675; 5.561.236; 5.648.477; 5.646.024; 6.177.616. y 5.879.903. Ejemplos de genes que confieren resistencia a los ácidos fenoxipropiónicos y ciclohexonas, tales como setoxidim y haloxifop, son los genes Acc1-S1, Acc1-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
3. (C) Un polinucleótido que codifica una proteína para la resistencia al herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de la nitrilasa). Przibilla, et al., (1991) Plant Cell 3:169, describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes psbA mutantes. Las secuencias nucleotídicas para genes de nitrilasa se describen en la patente US número 4.810.648 de Stalker, y las moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles bajo ATCC® números de acceso 53435, 67441 y 67442. La clonación y expresión de ADN que codifica una glutationa S-transferasa se describe por Hayes, et al., (1992) Biochem. J. 285:173.
4. (D) Un polinucleótido que codifica una proteína para la resistencia a la acetohidroxiácido sintasa, que se ha descubierto que hace que las plantas que expresan esta enzima sean resistentes a múltiples tipos de herbicidas, se ha introducido en una variedad de plantas (véase, por ejemplo, Hattori et al., (1995) Mol Gen Genet. 246:419). Otros genes que confieren resistencia a los herbicidas incluyen: un gen que codifica una proteína quimérica del citocromo P4507A1 de rata y la NADPH-citocromo P450 oxidorreductasa de levadura (Shiota, et al., (1994) Plant Physiol 106:17), genes de glutationa reductasa y superóxido dismutasa (Aono, et al., (1995) Plant Cell Physiol 36:1687), y genes para diversas fosfotransferasas (Datta, et al., (1992) Plant Mol Biol 20:619).
5. (E) Un polinucleótido que codifica la resistencia a un herbicida dirigido contra la protoporfirinógeno oxidasa (protox) que es necesaria para la producción de clorofila. La enzima protox sirve como diana para una variedad de compuestos herbicidas. Estos herbicidas también inhiben el crecimiento de todas las diferentes especies de plantas presentes, provocando su destrucción total. El desarrollo de plantas que contienen actividad protox alterada y que son resistentes a estos herbicidas se describe en las patentes US números 6.288.306, 6.282.837, y 5.767.373, y la publicación internacional WO 2001/12825.
6. (F) El gen aad-1 (originalmente de Sphingobium herbicidavorans) codifica la proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1). El rasgo confiere tolerancia a los herbicidas ácido 2,4-diclorofenoxiacético y ariloxifenoxipropionato (comúnmente denominados herbicidas “fop”, tal como quizalofop). El gen aad-1, en sí mismo, para la tolerancia a los herbicidas en las plantas se describió por primera vez en el documento WO 2005/107437 (véase también, documento US 2009/0093366). El gen aad-12, derivado de Delftia acidvorans, que codifica la proteína ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-12) que confiere tolerancia a los herbicidas del ácido 2,4-diclorofenoxiacético y piridiloxiacetato mediante la desactivación de varios herbicidas con un resto ariloxialcanoato, incluyendo la fenoxi auxina (por ejemplo, 2,4-D, MCPA), así como como piridiloxi auxinas (por ejemplo, fluroxipir, triclopir).
7. (G) Un polinucleótido que codifica una dicamba monooxigenasa resistente a herbicidas descrita en la publicación de solicitud de patente US 2003/0135879 por impartir tolerancia a la dicamba;
8. (H) Una molécula polinucleotídica que codifica bromoxinil nitrilasa (Bxn) descrita en la patente US número 4.810.648 para impartir tolerancia al bromoxinil;
9. (I) Una molécula polinucleotídica que codifica fitoeno (crtl) descrita en Misawa, et al., (1993) Plant J. 4: 833-840 y en Misawa, et al., (1994) Plant J. 6: 481 -489 para la tolerancia al norflurazon.
3. Transgenes que confieren o contribuyen a una característica de grano alterado
Tal como:
1. (A) Ácidos grasos alterados, por ejemplo por
(1) Dismuyendo estearoil-ACP para aumentar el contenido de ácido esteárico de la planta. Véase, Knultzon, et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 y documento WO 1999/64579 (Genes para alterar los perfiles de lípidos en maíz).
(2) Elevando el ácido oleico a través de la modificación del gen FAD-2 y/o disminuyendo el ácido linolénico a través de la modificación del gen FAD-3 (véanse, patentes US números 6.063.947; 6.323.392; 6.372.965 y documento WO 1993/11245).
(3) Alterando el contenido de ácido linolénico o linoleico conjugado, tal como en el documento WO 2001/12800.
(4) Alterando LEC1, AGP, Dek1, Superal1, mi1 ps, diversos genes Ipa, tal como Ipa1, Ipa3, hpt o hggt. Por ejemplo, véanse, documentos WO 2002/42424, WO 1998/22604, WO 2003/011015, WO 2002/057439, WO 2003/011015, patentes US números 6.423.886, 6.197.561,6.825.397 y los números de publicación de solicitud de patente US 2003/0079247, US 2003/0204870, y Rivera-Madrid, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:5620-5624.
(5) Genes que codifican delta-8 desaturasa para producir ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (patentes US números 8.058.571 y 8.338.152), delta-9 desaturasa para reducir las grasas saturadas (patente US número 8.063.269), A6-desaturasa de Primula para mejorar los perfiles de ácidos grasos omega-3.
(6) Ácidos nucleicos y proteínas aislados asociados con la regulación del metabolismo de lípidos y azúcares, en particular, proteína del metabolismo de lípidos (LMP) usada en métodos para producir plantas transgénicas y modular los niveles de compuestos de almacenamiento de semillas, incluyendo lípidos, ácidos grasos, almidones o proteínas de almacenamiento de semillas, y uso en métodos para modular el tamaño de las semillas, el número de semillas, el peso de las semillas, la longitud de las raíces y el tamaño de las hojas de las plantas (documento EP 2404499).
(7) Alterando la expresión de una proteína de expresión de alto nivel de azúcar inducible 2 (HSI2) en la planta para aumentar o disminuir la expresión de HSI2 en la planta. El aumento de la expresión de HSI2 aumenta el contenido de aceite, mientras que la disminución de la expresión de HSI2 disminuye la sensibilidad al ácido abscísico y/o aumenta la resistencia a la sequía (publicación de solicitud de patente US número 2012/0066794).
(8) Expresión de citocromo b5 (Cb5) solo o con FAD2 para modular el contenido de aceite en semillas de plantas, particularmente para aumentar los niveles de ácidos grasos omega-3 y mejorar la relación de ácidos grasos omega-6 a omega-3 (publicación de solicitud de patente US número 2011/0191904).
(9) Moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de tipo wrinkled1 para modular el metabolismo del azúcar (patente US número 8.217.223).
2. (B) Contenido de fósforo alterado, por ejemplo mediante
(1) La introducción de un gen codificador de fitasa mejoraría la descomposición del fitato, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase, Van Hartingsveldt, et al., (1993) Gene 127:87, para una descripción de la secuencia nucleotídica de un gen de fitasa de Aspergillus niger.
(2) Modulando un gen que reduce el contenido de fitato. En el maíz, esto podría lograrse, por ejemplo, clonando y reintroduciendo luego ADN asociado con uno o más de los alelos, tales como los alelos LPA, identificados en mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico, tal como en el documento WO 2005/113778, y/o alterando la actividad de la inositol quinasa tal como en el documento WO 2002/059324, la publicación de solicitud de patente US número 2003/0009011, el documento WO 2003/027243, la publicación de solicitud de patente US número 2003/0079247, el documento WO 1999/05298, la patente US número 6.197.561, la patente US número 6.291.224, la patente US número 6.391.348, el documento WO 2002/059324, la publicación de solicitud de patente Us número 2003/0079247, los documentos WO 1998/45448, WO 1999/55882, WO 2001/04147.
3. (C) Hidratos de carbono alterados, afectados, por ejemplo, al alterar un gen para una enzima que afecta el patrón de ramificación del almidón, o un gen que altera la tiorredoxina tal como NTR y/o TRX (véase, patente US número 6.531.648) y/o una genosupresión o muíante de gamma zeína tal como cs27 o TUSC27 o en27 (véase, patente US número 6.858.778 y publicación de solicitud de patente US número 2005/0160488, publicación de solicitud de patente US número 2005/0204418). Véase, Shiroza, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:810 (secuencia nucleotídica de gen mutante de la fructosiltransferasa de Streptococcus), Steinmetz et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 200:220 (secuencia nucleotídica del gen de la levansacarasa de Bacillus subtilis), Pen, et al., (1992) Bio/Technology 10:292 (producción de plantas transgénicas que expresan alfa-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot, et al., (1993) Plant Molec. Biol. 21:515 (secuencias nucleotídicas de genes de invertasa de tomate), Sogaard, et al., (1993) J. Biol. Chim. 268:22480 (mutagénesis dirigida al sitio del gen de la alfa-amilasa de cebada), y Fisher, et al., (1993) Plant Physiol. 102:1045 (enzima de ramificación del almidón del endospermo de maíz II), documento WO 1999/10498 (digestibilidad mejorada y/o extracción de almidón mediante la modificación de UDP-D-xilosa 4-epimerasa, Fragile 1 y 2, Ref1, HCHL, C4H), patente US número 6.232.529 (método para producir semillas con alto contenido de aceite mediante la modificación de los niveles de almidón (AGP)). Los genes de modificación de ácidos grasos mencionados aquí también se pueden usar para afectar el contenido y/o la composición del almidón a través de la interrelación de las rutas del almidón y el aceite.
4. (D) Contenido o composición antioxidante alterada, tal como alteración de tocoferol o tocotrienoles. Por ejemplo, véase, patente US número 6.787.683, publicación de solicitud de patente US número 2004/0034886, y documento WO 2000/68393, que implica la manipulación de los niveles de antioxidantes, y documento WO 2003/082899 a través de la alteración de una homogentisato geranil geranil transferasa (hggt).
5. (E) Aminoácidos de semillas esenciales alterados. Por ejemplo, véase, patente US número 6.127.600 (método para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en las semillas), patente US número 6.080.913 (métodos binarios para aumentar la acumulación de aminoácidos esenciales en las semillas), patente US número 5.990.389 (alto contenido de lisina), documento WO 1999/40209 (alteración de la composición de aminoácidos en las semillas), documento WO 1999/29882 (métodos para alterar el contenido de aminoácidos de las proteínas), patente US número 5.850.016 (alteración de la composición de aminoácidos en las semillas), documento WO 1998/20133 (proteínas con niveles mejorados de aminoácidos esenciales), patente US número 5.885.802 (alto contenido de metionina), patente US número 5.885.801 (alto contenido de treonina), patente US número 6.664.445 (enzimas biosintéticas de aminoácidos vegetales), patente US número 6.459,019 (aumento de lisina y treonina), patente US número 6.441.274 (subunidad beta de triptófano sintasa vegetal), patente US número 6.346.403 (enzimas metabólicas de metionina), patente US número 5.939.599 (alto contenido de azufre), patente US número 5.912.414 (alto contenido de metionina), documento WO 1998/56935 (enzimas biosintéticas de aminoácidos vegetales), documento WO 1998/45458 (proteína de semilla modificada con mayor porcentaje de aminoácidos esenciales), documento WO 1998/42831 (aumento de lisina), patente US número 5.633.436 (aumentando el contenido de aminoácidos azufrados), patente US número 5.559.223 (proteínas de almacenamiento sintéticas con estructura definida que contienen niveles programables de aminoácidos esenciales para mejorar el valor nutricional de las plantas), documento WO 1996/01905 (aumento de treonina), documento WO 1995/15392 (aumento de lisina), publicación de solicitud de patente US número 2003/0163838, publicación de solicitud de patente US número 2003/0150014, publicación de solicitud de patente US número 2004/0068767, patente US número 6.803.498, documento WO 2001/79516.
4. Genes que controlan la esterilidad masculina:
Hay varios métodos disponibles para conferir esterilidad genética masculina, tales como múltiples genes mutantes en ubicaciones separadas dentro del genoma que confieren esterilidad masculina, como se describe en patentes US números 4.654.465 y 4.727.219 de Brar, et al., y translocaciones cromosómicas como se describe por Patterson en las patentes US números 3.861.709 y 3.710.511. Además de estos métodos, Albertsen, et al., patente US número 5.432.068, describen un sistema de esterilidad masculina nuclear que incluye: identificar un gen que es fundamental para la fertilidad masculina; silenciar este gen nativo que es fundamental para la fertilidad masculina; eliminar el promotor nativo del gen esencial de fertilidad masculina y reemplazarlo por un promotor inducible; insertar nuevamente en la planta este gen modificado genéticamente; y creando así una planta que es estéril masculina porque el promotor inducible no está “encendido”, dando como resultado que el gen de la fertilidad masculina no se transcriba. La fertilidad se restaura induciendo o “encendiendo” el promotor, que a su vez permite transcribir el gen que confiere la fertilidad masculina.
1. (A) Introducción de un gen de desacetilasa bajo el control de un promotor específico del tapetum y con la aplicación de la sustancia química N-Ac-PPT (documento Wo 2001/29237).
2. (B) Introducción de diversos promotores específicos del estambre (documento WO 1992/13956, documento WO 1992/13957).
3. (C) Introducción de la barnasa y el gen barstar (Paul, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 19:611 -622).
Para ejemplos adicionales de genes y sistemas de esterilidad nuclear masculina y femenina, véanse también las patentes US números 5.859.341; 6.297.426; 5.478.369; 5.824.524; 5.850.014 y 6.265.640.
5. Genes que crean un sitio para la integración del ADN específico del sitio.
Esto incluye la introducción de sitios FRT, que pueden usarse en el sistema FLP/FRT, y/o sitios Lox, que pueden usarse en el sistema Cre/Loxp. Por ejemplo, véanse, Lyznik, et al., (2003) Plant Cell Rep 21:925-932 y el documento WO 1999/25821. Otros sistemas que pueden usarse incluyen la Gin recombinasa del fago Mu (Maeser, et al., (1991) Vicki Chandler, The Maize Handbook cap. 118 (Springer-Verlag 1994), la Pin recombinasa de E. coli (Enomoto, et al., 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSRi (Araki, et al., 1992).
6. Genes que afectan la resistencia al estrés abiótico
Incluyendo, pero no se limita a, floración, desarrollo de mazorcas y semillas, mejora de la eficiencia de utilización de nitrógeno, respuesta alterada de nitrógeno, resistencia o tolerancia a la sequía, resistencia o tolerancia al frío, y resistencia o tolerancia a la sal, y mayor rendimiento bajo estrés.
1. (A) Por ejemplo, véanse: documento WO 2000/73475, en el que la eficiencia del uso del agua se altera a través de la alteración del malato; patentes US números 5.892.009, 5.965.705, 5.929.305, 5.891.859, 6.417.428, 6.664.446, 6.706.866, 6.717.034, 6.801.104, documentos WO 2000/060089, WO 2001/026459, WO 2001/035725, WO
2001/034726, WO 2001/035727, WO 2001/036444, WO 2001/036597, WO 2001/036598, WO 2002/015675, WO
2002/017430, WO 2002/077185, WO 2002/079403, WO 2003/013227, WO 2003/013228, WO 2003/014327, WO
2004/031349, WO 2004/076638, WO 199809521.
2. (B) El documento WO 199938977, que describe genes, incluyendo genes CBF, y factores de transcripción eficaces para mitigar los efectos negativos de la congelación, la alta salinidad y la sequía en las plantas, así como para conferir otros efectos positivos en el fenotipo de la planta.
3. (C) La publicación de solicitud de patente US número 2004/0148654 y el documento WO 2001/36596, en los que el ácido abscísico se altera en las plantas dando como resultado un mejor fenotipo de la planta, tal como un mayor rendimiento y/o una mayor tolerancia al estrés abiótico.
4. (D) Los documentos WO 2000/006341, WO 2004/090143, patentes US números 7.531.723 y 6.992.237, en los que la expresión de citoquinina se modifica dando como resultado plantas con mayor tolerancia al estrés, tal como tolerancia a la sequía y/o mayor rendimiento. Véanse también, documentos WO 2002/02776, WO 2003/052063, JP 2002/281975, patente US número 6.084.153, documento WO 2001/64898, patente US número 6.177.275 y patente US número 6.107.547 (mejora de la utilización de nitrógeno y alteración de la sensibilidad al nitrógeno).
5. (E) Para la alteración del etileno, véase, publicación de solicitud de patente US número 2004/0128719, publicación de solicitud de patente US número 2003/0166197 y documento WO 2000/32761.
6. (F) Para factores de transcripción de plantas o reguladores transcripcionales del estrés abiótico, véanse, por ejemplo, publicación de solicitud de patente US número 2004/0098764 o publicación de solicitud de patente US número 2004/0078852.
7. (G) Genes que aumentan la expresión de pirofosfatasa vacuolar, tal como AVP1 (patente US número 8.058.515) para un mayor rendimiento; ácido nucleico que codifica polipéptidos HSFA4 o HSFA5 (Factor de Choque Térmico de la clase A4 o A5), un polipéptido de proteína transportadora de oligopéptidos (similar a OPT4); un polipéptido similar a plastochron2 (similar a PLA2) o un polipéptido similar a homeobox 1 relacionado con Wuschel (similar a WOX1) (publicación de solicitud de patente US número US 2011/0283420).
8. (H) Disminución de polinucleótidos que codifican proteínas poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) para modular la muerte celular programada (patente US número 8.058.510) para aumentar el vigor.
9. (I) Polinucleótido que codifica polipéptidos DTP21 para conferir resistencia a la sequía (publicación de solicitud de patente US número Us 2011/0277181).
10. (J) Secuencias nucleotídicas que codifican proteínas ACC Sintasa 3 (ACS3) para modular el desarrollo, modular la respuesta al estrés y modular la tolerancia al estrés (publicación de solicitud de patente US número US 2010/0287669).
11. (K) Polinucleótidos que codifican proteínas que confieren un fenotipo de tolerancia a la sequía (DTP) para conferir resistencia a la sequía (documento WO 2012/058528).
12. (L) Genes de tocoferol ciclasa (TC) para conferir tolerancia a la sequía y la sal (publicación de solicitud de patente US número 2012/0272352).
13. (M) Proteínas de la familia amino terminal CAAX para la tolerancia al estrés (patente US número 8.338.661).
14. (N) Las mutaciones en el gen que codifica SAL1 han aumentado la tolerancia al estrés, incluyendo una mayor resistencia a la sequía (publicación de solicitud de patente US número 2010/0257633).
15. (O) Expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: polipéptido GRF, polipéptido similar a RAA1, polipéptido SYR, polipéptido ARKL y polipéptido YTP, que aumentan los rasgos relacionados con el rendimiento (publicación de solicitud de patente US número 2011/0061133).
16. (P) Modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de trehalosa fosfato fosfatasa (TPP) de clase III para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en las plantas, particularmente aumentando el rendimiento de la semilla (publicación de solicitud de patente US número 2010/0024067).
Otros genes y factores de transcripción que afectan el crecimiento de las plantas y los ragos agronómicos, tales como el rendimiento, la floración, el crecimiento de las plantas y/o la estructura de las plantas, pueden introducirse o introgresarse en las plantas; véanse, por ejemplo, documentos WO 1997/49811 (LHY), WO 1998/56918 (ESD4), WO 1997/10339, y patente US número 6.573.430 (Tf L), patente US número 6.713.663 (PIE), documentos WO 1996/14414 (CON), WO 1996/38560, WO 2001/21822 (VRN1), WO 2000/44918 (VRN2), WO 1999/49064 (GI), WO 2000/46358 (FR1), WO 1997/29123, patente US número 6.794.560, patente US número 6.307.126 (GAI), documentos WO 1999/09174 (D8 y Rht) y WO 2004/076638 y WO 2004/031349 (factores de transcripción).
7. Genes que confieren mayor rendimiento
1. (A) Una planta de cultivo transgénica transformada por un ácido nucleico codificante de polipéptido similar a 1-aminociclopropano-1-carboxilato desaminasa (ACCDP), en la que la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la planta de cultivo da como resultado un mayor crecimiento de la raíz de la planta, y/o mayor rendimiento, y/o mayor tolerancia al estrés ambiental en comparación con una variedad de tipo silvestre de la planta (patente US número 8.097.769).
2. (B) Se ha demostrado que la sobreexpresión del gen de la proteína de dedos de zinc del maíz (Zm-ZFP1) usando un promotor preferido de semillas mejora el crecimiento de las plantas, aumenta el número de granos y el peso total de los granos por planta (publicación de solicitud de patente US número 2012/0079623).
3. (C) Se ha demostrado que la sobreexpresión constitutiva de la proteína del dominio de los límites de los órganos laterales (LOB) del maíz (Zm-LOBDP1) aumenta el número de granos y el peso total de los granos por planta (publicación de solicitud de patente US número 2012/0079622).
4. (D) Mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a VIM1 (variante en la metilación 1) o un polipéptido similar a VTC2 (GDP-L-galactosa fosforilasa) o un polipéptido DUF1685 o un polipéptido similar a ARF6 (factor de respuesta a auxina) (documento WO 2012/038893).
5. (E) Modular la expresión en una planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido similar a Ste20 o un homólogo del mismo proporciona plantas que tienen un mayor rendimiento con respecto a las plantas de control (documento EP 2431472).
6. (F) Genes que codifican polipéptidos de nucleósido difosfatasa cinasa (NDK) y homólogos de los mismos para modificar la arquitectura de la raíz de la planta (publicación de solicitud de patente US número 2009/0064373).
8. Genes que confieren digestibilidad a las plantas.
1. (A) Alterar el nivel de xilano presente en la pared celular de una planta mediante la modulación de la expresión de xilano sintasa (patente US número 8.173.866).
En algunos aspectos, el rasgo apilado puede ser un rasgo o evento que ha recibido aprobación regulatoria, incluyendo, pero sin limitarse a, los eventos con aprobación regulatoria que son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en el Centro para la Evaluación de Riesgos Ambientales (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, a la que se puede acceder usando el prefijo www) y en el Servicio Internacional para la Adquisición de Aplicaciones Agrobiotecnológicas (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, a la que se puede acceder usando el www prefijo).
Silenciamiento de genes
En algunos aspectos, el rasgo apilado puede estar en forma de silenciamiento de uno o más polinucleótidos de interés que dan como resultado la supresión de uno o más polipéptidos de la plaga diana. En algunos aspectos, el silenciamiento se logra mediante el uso de un constructo de ADN de supresión.
En algunos aspectos, uno o más polinucleótidos que codifican los polipéptidos del polipéptido IPD079, o fragmentos o variantes del mismo, pueden apilarse con uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen actividad insecticida o rasgos agronómicos como se expone anteriormente, y opcionalmente pueden incluir además uno o más polinucleótidos que proporcionan silenciamiento génico de uno o más polinucleótidos diana como se describe más adelante.
“Constructo de ADN de supresión” es un constructo de ADN recombinante que, cuando se transforma o se integra de manera estable en el genoma de la planta, da como resultado el “silenciamiento” de un gen diana en la planta. El gen diana puede ser endógeno o transgénico para la planta. “Silenciar”, como se usa aquí con respecto al gen diana, se refiere generalmente a la supresión de los niveles de ARNm o proteína/enzima expresados por el gen diana, y/o el nivel de actividad enzimática o funcionalidad de la proteína. El término “supresión” incluye disminuir, reducir, declinar, disminuir, inhibir, eliminar y prevenir. El “silenciamiento” o “silenciamiento de genes” no especifica el mecanismo, y es inclusivo, y no está limitado a, antisentido, cosupresión, supresión viral, supresión de horquilla, supresión de tallo-bucle, enfoques basados en ARNi y enfoques basados en ARN pequeño.
Un constructo de ADN de supresión puede comprender una región derivada de un gen diana de interés, y puede comprender toda o parte de la secuencia de ácido nucleico de la hebra sentido (o hebra antisentido) del gen diana de interés. Dependiendo del enfoque a utilizar, la región puede ser 100% idéntica o menos de 100% idéntica (por ejemplo, al menos 50% o cualquier número entero entre 51% y 100% idéntica) a toda o parte de la hebra sentido (o hebra antisentido) del gen de interés.
Los constructos de ADN de supresión son bien conocidos en la técnica, se construyen fácilmente una vez que se selecciona el gen diana de interés, e incluyen, sin limitación, constructos de cosupresión, constructos antisentido, constructos de supresión viral, constructos de supresión de horquilla, constructos de supresión de tallo-bucle, constructos productores de ARN bicatenario, y, más generalmente, constructos de ARNi (interferencia de ARN) y constructos de ARN pequeño tales como constructos de ARNip (ARN de interferencia corto) y constructos de miARN (microARN).
“Inhibición antisentido” se refiere a la producción de transcritos de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana.
“ARN antisentido” se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario diana o ARNm y que bloquea la expresión de un fragmento de ácido nucleico aislado diana (patente US número 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito del gen específico, es decir, en la secuencia no codificante 5’, la secuencia no codificante 3’, los intrones o la secuencia codificante.
Cosupresión se refiere a la producción de transcritos de ARN sentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana. El ARN “sentido” se refiere a la transcripción de ARN que incluye el ARNm y puede traducirse en proteína dentro de una célula o in vitro. Las constructos de cosupresión en plantas se han diseñado previamente centrándose en la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico que tiene homología con un ARNm nativo, en la orientación sentido, lo que da como resultado la reducción de todo el ARN que tiene homología con la secuencia sobreexpresada (véanse, Vaucheret, et al., (1998) Plant J. 16:651-659, y Gura, (2000) Nature 404: 804-808).
Otra variación describe el uso de secuencias virales de plantas para dirigir la supresión de secuencias codificantes de ARNm proximales (publicación PCT WO 1998/36083).
Un trabajo reciente ha descrito el uso de estructuras de “horquilla” que incorporan la totalidad o una parte de una secuencia codificante de ARNm en una orientación complementaria que da como resultado una estructura potencial de “bucle-bucle” para el ARN expresado (publicación PCT WO 1999/53050). En este caso, el tallo está formado por polinucleótidos correspondientes al gen de interés insertados en orientación sentido o antisentido con respecto al promotor, y el bucle está formado por algunos polinucleótidos del gen de interés, que no tienen complemento en el constructo. Esto aumenta la frecuencia de cosupresión o silenciamiento en las plantas transgénicas recuperadas. Para una revisión de la supresión de horquilla, véase, Wesley, et al., (2003) Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273-286.
Un constructo en la que el tallo está formado por al menos 30 nucleótidos de un gen a suprimir y el bucle está formado por una secuencia aleatoria de nucleótidos también se ha usado eficazmente para la supresión (publicación PCT WO 1999/61632).
También se ha descrito el uso de secuencias poli-T y poli-A para generar el tallo en la estructura de tallo-bucle (publicación PCT WO 2002/00894).
Aún otra variación incluye el uso de repeticiones sintéticas para promover la formación de un tallo en la estructura de tallobucle. Se ha demostrado que los organismos transgénicos preparados con tales fragmentos de ADN recombinante tienen niveles reducidos de la proteína codificada por el fragmento de nucleótido que forma el bucle, como se describe en publicación PCT WO 2002/00904.
La interferencia de ARN se refiere al proceso de silenciamiento génico postranscripcional, específico de secuencia, en animales, mediado por los ARN de interferencia cortos (ARNip) (Fire, et al., (1998) Nature 391:806). El proceso correspondiente en las plantas se conoce comúnmente como silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) o silenciamiento de ARN, y también se conoce como silenciamiento en hongos. Se cree que el proceso de silenciamiento génico postranscripcional es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente que se usa para prevenir la expresión de genes extraños, y es comúnmente compartido por diversas floras y filos (Fire, et al., (1999) Trends Genet.
15:358). Tal protección contra la expresión de genes extraños puede haber evolucionado en respuesta a la producción de ARN bicatenario (ARNbc) derivados de una infección viral o de la integración aleatoria de elementos transposones en el genoma del hospedante a través de una respuesta celular que destruye específicamente el ARN monocatenario homólogo de ARN genómico viral. La presencia de ARNbc en las células desencadena la respuesta de ARNi a través de un mecanismo que aún no se ha caracterizado por completo.
La presencia de ARNbc largos en las células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III denominada dicer. Dicer participa en el procesamiento del ARNbc en fragmentos cortos de ARNbc conocidos como RNA de interferencia cortos (ARNip) (Berstein, et al., (2001) Nature 409:363). Los ARN de interferencia cortos derivados de la actividad de Dicer suelen tener alrededor de 21 y 23 nucleótidos de longitud, y comprenden dúplex de alrededor de 19 pares de bases (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Dicer también ha estado implicado en la escisión de ARN temporales pequeños (ARNtp) de 21 y 22 nucleótidos del ARN precursor de estructura conservada que están implicados en el control de la traducción (Hutvagner, et al., (2001) Science 293:834). La respuesta de ARNi también presenta un complejo de endonucleasa, comúnmente denominado complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que media la escisión del ARN monocatenario que tiene complementariedad de secuencia con la cadena antisentido del dúplex de ARNip. La escisión del ARN diana tiene lugar en la mitad de la región complementaria a la hebra antisentido del dúplex de ARNip (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Además, la interferencia de ARN también puede imlicaar el silenciamiento de genes mediado por ARN pequeño (por ejemplo, miARN), presumiblemente a través de mecanismos celulares que regulan la estructura de la cromatina y, por lo tanto, previenen la transcripción de secuencias de genes diana (véase, por ejemplo, Allshire, (2002) Science 297:1818-1819; Volpe, et al., (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein, (2002) Science 297:2215-2218, y Hall, et al., (2002) Science 297:2232-2237). Como tales, las moléculas de miARN de la descripción pueden usarse para mediar en el silenciamiento génico a través de la interacción con transcritos de ARN, o, alternativamente, mediante la interacción con secuencias génicas particulares, en el que dicha interacción da como resultado el silenciamiento génico a nivel transcripcional o postranscripcional.
Se describen aquí métodos y composiciones que permiten un aumento en el ARNi producido a partir del elemento silenciador. En tales aspectos, los métodos y las composiciones emplean un primer polinucleótido que comprende un elemento silenciador para una secuencia de plaga diana ligada operativamente a un promotor activo en la célula vegetal; y un segundo polinucleótido que comprende un elemento potenciador supresor que comprende la secuencia de la plaga diana o una variante activa o un fragmento de la misma enlazado operativamente a un promotor activo en la célula vegetal. La expresión combinada del elemento silenciador con el elemento potenciador supresor conduce a una mayor amplificación del ARN inhibidor producido a partir del elemento silenciador, en comparación con lo que se puede lograr con la expresión del elemento silenciador solo. Además de la mayor amplificación de las propias especies específicas de ARNi, los métodos y las composiciones permiten además la producción de una población diversa de especies de ARNi que pueden mejorar la eficacia de interrumpir la expresión del gen diana. Como tal, cuando el elemento potenciador supresor se expresa en una célula vegetal en combinación con el elemento silenciador, los métodos y la composición pueden permitir la producción sistémica de ARNi en toda la planta; la producción de mayores cantidades de ARNi que las que se observarían solo con el constructo del elemento silenciador solo; y, la carga mejorada de ARNi en el floema de la planta, proporcionando así un mejor control de los insectos que se alimentan del floema mediante un enfoque de ARNi. Por tanto, los diversos métodos y composiciones proporcionan métodos mejorados para el suministro de ARN inhibidor al organismo diana. Véase, por ejemplo, publicación de solicitud de patente US 2009/0188008.
Como se usa aquí, un “elemento potenciador supresor” comprende un polinucleótido que comprende la secuencia diana a suprimir o un fragmento activo o una variante de la misma. Se reconoce que el elemento supresor potenciador no necesita ser idéntico a la secuencia diana, sino que el elemento supresor potenciador puede comprender una variante de la secuencia diana, siempre que el elemento supresor potenciador tenga suficiente identidad de secuencia con la secuencia diana para permitir para un mayor nivel del ARNi producido por el elemento silenciador con respecto al que se puede lograr con solo la expresión del elemento silenciador. De manera similar, el elemento potenciador supresor puede comprender un fragmento de la secuencia diana, en el que el fragmento tiene una longitud suficiente para permitir un mayor nivel de ARNi producido por el elemento silenciador con respecto al que se puede lograr con solo la expresión del elemento silenciador.
Se reconoce que pueden emplearse múltiples elementos potenciadores supresores de la misma secuencia diana o de diferentes secuencias diana o de diferentes regiones de la misma secuencia diana. Por ejemplo, los elementos potenciadores supresores empleados pueden comprender fragmentos de la secuencia diana derivados de diferentes regiones de la secuencia diana (es decir, de la 3’UTR, la secuencia codificante, el intrón, y/o la 5’UTR). Además, el elemento potenciador supresor puede estar contenido en un casete de expresión, como se describe aquí en otra parte, y en aspectos específicos, el elemento potenciador supresor está en el mismo vector o constructo de ADN o en uno diferente que el elemento silenciador. El elemento potenciador supresor se puede unir operativamente a un promotor como se describe aquí. Se reconoce que el elemento potenciador supresor se puede expresar de forma constitutiva, o, alternativamente, se puede producir de una manera específica de la etapa empleando los diversos promotores inducibles o preferidos por tejido o regulados por el desarrollo que se analizan en otra parte del presente documento.
En aspectos específicos, empleando tanto un elemento silenciador como el elemento potenciador supresor, la producción sistémica de ARNi se produce en toda la planta. En otros aspectos, la planta o las partes de la planta de la descripción tienen una carga mejorada de ARNi en el floema de la planta que la que se observaría con la expresión del constructo del elemento silenciador solo, y por lo tanto proporcionan un mejor control de los insectos que se alimentan del floema mediante un enfoque de ARNi. En aspectos específicos, las plantas, partes de plantas y células de plantas de la descripción pueden caracterizarse además por permitir la producción de una diversidad de especies de ARNi que pueden mejorar la eficacia de interrumpir la expresión del gen diana.
En aspectos específicos, la expresión combinada del elemento silenciador y el elemento potenciador supresor aumenta la concentración del ARN inhibidor en la célula vegetal, planta, parte de la planta, tejido vegetal o floema por encima del nivel que se alcanza cuando el elemento silenciador se expresa solo.
Como se usa aquí, un “nivel aumentado de ARN inhibidor” comprende cualquier aumento estadísticamente significativo en el nivel de ARNi producido en una planta que tiene la expresión combinada en comparación con una planta de control apropiada. Por ejemplo, un aumento en el nivel de ARNi en la planta, parte de la planta o célula vegetal puede comprender al menos un aumento de alrededor de 1%, alrededor de 1%-5%, alrededor de 5%-10%, alrededor de 10%-20%, alrededor de 20%-30%, alrededor de 30%-40%, alrededor de 40%-50%, alrededor de 50%-60%, alrededor de 60-70%, alrededor de 70%-80%, alrededor de 80%-90%, alrededor de 90%-100% o mayor en el nivel de ARNi en la planta, parte de la planta, célula vegetal o floema, en comparación con un control apropiado. En otros aspectos, el aumento en el nivel de ARNi en la planta, parte de la planta, célula vegetal o floema puede comprender un aumento de al menos alrededor de 1 vez, alrededor de 1 vez-5 veces, alrededor de 5 veces-10 veces, alrededor de 10 veces-20 veces, alrededor de 20 veces-30 veces, alrededor de 30 veces-40 veces, alrededor de 40 veces-50 veces, alrededor de 50 veces-60 veces, alrededor de 60 veces-70 veces, alrededor de 70 veces-80 veces, alrededor de 80 a 90 veces, alrededor de 90 veces-100 veces o mayor en el nivel de ARNi en la planta, parte de la planta, célula vegetal o floema, en comparación con un control apropiado. Se pueden encontrar ejemplos de expresión combinada del elemento silenciador con el elemento potenciador supresor para el control de chinches y chinches lygus en la publicación de solicitud de patente US 2011/0301223 y la publicación de solicitud de patente US 2009/0192117.
Algunos aspectos se refieren a la reducción de la expresión de genes diana en especies de plagas de insectos por moléculas de ácido ribonucleico (ARN) interferentes. La publicación PCT WO 2007/074405 describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluyendo el escarabajo de la patata de Colorado. La publicación PCT WO 2005/110068 describe métodos para inhibir la expresión de genes diana en plagas de invertebrados, incluyendo en particular el gusano de la raíz del maíz occidental, como un medio para controlar la infestación de insectos. Además, la publicación PCT WO 2009/091864 describe composiciones y métodos para la supresión de genes diana de especies de plagas de insectos que incluyen plagas del género Lygus. Moléculas de ácido nucleico que incluyen ARNi contra la subunidad de ATPasa H vacuolar, útiles para controlar una población de plagas de coleópteros y la infestación como se describe en la publicación de solicitud de patente US 2012/0198586. La publicación PCT Wo 2012/055982 describe ácido ribonucleico (ARN o ARN bicatenario) que inhibe o reduce la expresión de un gen diana que codifica: una proteína ribosómica de insecto, tal como la proteína ribosómica L19, la proteína ribosómica L40 o la proteína ribosómica S27A; una subunidad del proteasoma de insecto, tal como la proteína Rpn6, la Pros 25, la proteína Rpn2, la proteína subunidad beta 1 del proteasoma, o la proteína Pros beta 2; un p-coatómero de insecto de la vesícula COPI, el g-coatómero de la vesícula COPI, la proteína p’-coatómero o el Z-coatómero de la vesícula COPI; una proteína tetraspanina 2 A de insecto, que es una proteína de dominio transmembrana putativa; una proteína de insecto perteneciente a la familia de las actinas, tal como la Actina 5C; una proteína ubiquitina-5E de insecto; una proteína Sec23 de insecto, que es un activador de GTPasa implicado en el transporte intracelular de proteínas; una proteína crinkled de insecto, que es una miosina no convencional que está implicada en la actividad motora; una proteína crooked neck de insecto que está implicada en la regulación del ayuste de ARNm alternativo nuclear; una proteína de subunidad G de ATPasa H+ vacuolar de insecto y una Tbp-1 de insecto, tal como proteína de unión a Tat. Las publicaciones de solicitudes de patente US 2012/029750, US 20120297501, y 2012/0322660 describen ácidos ribonucleicos interferentes (ARN o ARN bicatenario) que funcionan tras la absorción por una especie de plaga de insectos para reducir la expresión de un gen diana en dicha plaga de insectos, en el que el ARN comprende al menos un elemento silenciador, en el que el elemento silenciador es una región de ARN bicatenario que comprende hebras complementarias hibridadas, una hebra de las cuales comprende o consiste en una secuencia nucleotídica que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia nucleotídica diana dentro del gen diana. La publicación de solicitud de patente 2012/0164205 describe dianas potenciales para ácidos ribonucleicos bicatenarios interferentes para inhibir plagas de invertebrados, que incluyen: una secuencia homóloga de Chd3, una secuencia homóloga de beta-tubulina, una secuencia homóloga de V-ATPasa de 40 kDa, una secuencia homóloga de EF1a, una secuencia homóloga de la subunidad p28 del proteosoma 26S, una secuencia homóloga de epóxido hidrolasa de hormona juvenil, una secuencia homóloga de la proteína del canal de cloruro dependiente de hinchazón, una secuencia homóloga de la proteína glucosa-6-fosfato 1-deshidrogenasa, una secuencia homóloga de la proteína Act42A, una secuencia homóloga del factor 1 de ribosilación ADP, una secuencia homóloga de la proteína del factor de transcripción IIB, una secuencia homóloga de quitinasa, una secuencia homóloga de la enzima conjugadora de ubiquitina, una secuencia homóloga de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una secuencia homóloga de ubiquitina B, una secuencia homóloga de hormona juvenil esterasa, y una secuencia homóloga de alfa tubulina.
Uso en control plaguicida
En la técnica se conocen métodos generales para emplear cepas que comprenden una secuencia de ácido nucleico descrita aquí, o una variante de la misma, en el control plaguicida o en la ingeniería de otros organismos tales como agentes plaguicidas. Véase, por ejemplo, la patente US número 5.039.523 y el documento EP 0480762A2.
Se pueden seleccionar hospedantes de microorganismos que se sabe que ocupan la “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan para que puedan competir con éxito en el entorno particular con los microorganismos de tipo salvaje, proporcionan un mantenimiento y una expresión estables del gen que expresa el polipéptido IPD079, y, deseablemente, proporcionan una protección mejorada del plaguicida frente a la degradación ambiental y la inactivación.
Alternativamente, los polipéptidos IPD079 se producen introduciendo un gen heterólogo en un hospedante celular. La expresión del gen heterólogo da como resultado, directa o indirectamente, la producción intracelular y el mantenimiento del plaguicida. Estas células se tratan entonces en condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando la célula se aplica al entorno de la o las plagas diana. El producto resultante conserva la toxicidad de la toxina. Estos polipéptidos IPD079 encapsulados de forma natural pueden formularse entonces según técnicas convencionales para su aplicación al entorno que alberga una plaga diana, por ejemplo suelo, agua y follaje de las plantas. Véase, por ejemplo, el documento EPA 0192319 y las referencias citadas allí.
Composiciones plaguicidas
En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal se puede aplicar en forma de composiciones, y se puede aplicar al área de cultivo o a la planta a tratar, simultáneamente o en sucesión, con otros compuestos. Estos compuestos pueden ser fertilizantes, herbicidas, crioprotectores, tensioactivos, detergentes, jabones plaguicidas, aceites latentes, polímeros y/o formulaciones portadoras biodegradables o de liberación prolongada que permiten la dosificación a largo plazo de un área diana después de una sola aplicación de la formulación. También pueden ser herbicidas selectivos, insecticidas químicos, virucidas, microbicidas, amebicidas, plaguicidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, molusquicidas, o mezclas de varios de estos preparados, si se desea, junto con otros vehículos agrícolamente aceptables, tensioactivos o adyuvantes que favorecen la aplicación, empleados habitualmente en la técnica de la formulación. Los vehículos y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y corresponden a las sustancias normalmente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo sustancias minerales naturales o regeneradas, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes de pegajosidad, aglutinantes o fertilizantes. Asimismo, las formulaciones pueden prepararse en “cebos” comestibles, o moldearse en “trampas” para plagas, para permitir que una plaga diana de la formulación plaguicida se alimente o ingiera.
Los métodos para aplicar un ingrediente activo o una composición agroquímica que contiene al menos una de las perforinas de origen vegetal de la descripción, que incluyen, pero no se limita a, el polipéptido IPD079 producido por las cepas bacterianas, incluyen la aplicación a hojas, el recubrimiento de semillas, y la aplicación al suelo. El número de aplicaciones y la tasa de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.
La composición se puede formular como polvo, polvo fino, pelete, gránulos, aerosol, emulsión, coloide, disolución, o similar, y se puede preparar por medios convencionales como desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células que comprenden el polipéptido. En todas las composiciones que contienen al menos un polipéptido plaguicida de este tipo, el polipéptido puede estar presente en una concentración de alrededor de 1 % a alrededor de 99% en peso. “Alrededor de” con respecto al % en peso significa ± 0,5%.
Las plagas de lepidópteros, dípteros, heterópteros, nematodos, hemípteros o coleópteros pueden eliminarse o reducirse en número en un área dada mediante los métodos de la descripción, o pueden aplicarse profilácticamente a un área ambiental para evitar la infestación por una plaga susceptible. Preferiblemente, la plaga ingiere o entra en contacto con una cantidad del polipéptido eficaz como plaguicida. “Cantidad eficaz como plaguicida”, como se usa aquí, se refiere a una cantidad del plaguicida que es capaz de provocar la muerte de al menos una plaga o de reducir notablemente el crecimiento, la alimentación o el desarrollo fisiológico normal de la plaga. Esta cantidad variará dependiendo de factores tales como, por ejemplo, las plagas diana específicas que se van a controlar, el entorno específico, la ubicación, la planta, el cultivo o el sitio agrícola que se va a tratar, las condiciones ambientales y el método, la tasa, la concentración, la estabilidad, y cantidad de aplicación de la composición polipeptídica eficaz como plaguicida. Las formulaciones también pueden variar con respecto a las condiciones climáticas, las consideraciones ambientales, y/o la frecuencia de aplicación y/o la gravedad de la infestación de plagas.
Las composiciones plaguicidas descritas pueden prepararse formulando la célula bacteriana, la suspensión de cristales y/o esporas o el componente de proteína aislada con el vehículo agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones pueden formularse antes de la administración en un medio apropiado, tal como liofilizado, secado por congelación, desecado o en un vehículo acuoso, medio o diluyente adecuado, tal como disolución salina u otro amortiguador. Las composiciones formuladas pueden estar en forma de polvo o material granular o una suspensión en aceite (vegetal o mineral) o agua o emulsiones de aceite/agua, o como polvo humectable, o en combinación con cualquier otro material portador adecuado para aplicación agrícola. Los vehículos agrícolas adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y son bien conocidos en la técnica. La expresión “vehículo agrícolamente aceptable” cubre todos los adyuvantes, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc. que se usan normalmente en la tecnología de formulación de plaguicidas; son bien conocidos por los expertos en formulación de plaguicidas. Las formulaciones pueden mezclarse con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos, y prepararse por diversos medios, por ejemplo mezclando, amasando y/o moliendo homogéneamente la composición plaguicida con adyuvantes adecuados usando técnicas de formulación convencionales. Las formulaciones adecuadas y los métodos de aplicación se describen en la patente US número 6.468.523. Las semillas o plantas también pueden tratarse con una o más composiciones químicas, incluyendo uno o más herbicidas, insecticidas o fungicidas. Las composiciones químicas ejemplares incluyen: herbicidas para frutas/verduras: atrazina, bromacilo, diurón, glifosato, linurón, metribuzina, simazina, trifluralina, fluazifop, glufosinato, halo sulfurón Gowan, paraquat, propizamida, setoxidim, butafenacilo, halosulfurón, indaziflam; insecticidas para frutas/verduras: aldicarb, Bacillus thuriengiensis, carbarilo, carbofurano, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, diazinón, malatión, abamectina, ciflutrina/beta-ciflutrina, esfenvalerato, lambda-cihalotrina, acequinocilo, bifenazato, metoxifenozida, novalurón, cromafenozida, tiacloprid, dinotefurano, fluacripirim, tolfenpirad, clotianidina, espirodiclofeno, gamma-cihalotrina, espiromesifeno, espinosad, rinaxipir, ciazipir, espinotaram, triflumurón, espirotetramat, imidacloprida, flubendiamida, tiodicarb, metaflumizona, sulfoxaflor, ciflumetofeno, cianopirafeno, imidacloprida, clotianidina, tiamethoxam, espinotoram, tiodicarb, flonicamida, metiocarb, emamectina-benzoato, indoxacarb, fortiazato, fenamifós, cadusafós, piriproxifeno, óxido de fenbutatina, hextiazox, metomilo, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona; fungicidas para frutas/verduras: carbendazim, clorotalonilo, ebdc, azufre, tiofanato-metilo, azoxistrobina, cimoxanilo, fluazinam, fosetilo, iprodiona, kresoxim-metilo, metalaxil/mefenoxam, trifloxistrobina, etaboxam, iprovalicarb, trifloxistrobina, fenhexamida, oxpoconazol fumarato, ciazofamida, fenamidona, zoxamida, picoxistrobina, piraclostrobina, ciflufenamida, boscalida; herbicidas para cereales: isoproturón, bromoxinilo, loxinilo, fenoxis, clorsulfurón, clodinafop, diclofop, diflufenican, fenoxaprop, florasulam, fluoroxipir, metsulfurón, triasulfurón, flucarbazona, lodosulfurón, propoxicarbazona, picolinafeno, mesosulfurón, beflubutamida, pinoxadeno, amidosulfurón, tifensulfurón metilo, tribensulfurón, flufopirsulfurón, pirasulfotol, piroxsulam, flufenacet, tralkoxidim, piroxasulfon; fungicidas para cereales: carbendazim, clorotalonilo, azoxistrobina, ciproconazol, ciprodinilo, fenpropimorf, epoxiconazol, kresoxim-metilo, quinoxifeno, tebuconazol, trifloxistrobina, simeconazol, picoxistrobina, piraclostrobina, dimoxistrobina, protioconazol, fluoxastrobina; insecticidas para cereales: dimetoato, lambda-cihaltrina, deltametrina, alfa-cipermetrina, p-ciflutrina, bifentrina, imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, tiacloprida, acetamiprida, dinetofurano, clorfirifós, metamidofós, oxidemeton-metilo, pirimicarb, metiocarb; herbicidas para maíz: atrazina, alaclor, bromoxinilo, acetoclor, dicamba, clopiralida, (S-)dimetenamida, glufosinato, glifosato, isoxaflutol, (S-)metolaclor, mesotriona, nicosulfurón, primisulfurón, rimsulfurón, sulcotriona, foramsulfurón, topramezona, tembotriona, saflufenacilo, tiencarbazona, flufenacet, piroxasulfona; insecticidas para maíz: carbofurano, clorpirifós, bifentrina, fipronilo, imidacloprida, lambda-cihalotrina, teflutrina, terbufós, tiametoxam, clotianidina, espiromesifeno, flubendiamida, triflumurón, rinaxipir, deltametrina, tiodicarb, p-ciflutrina, cipermetrina, bifentrina, lufenurón, triflumoron, teflutrina, tebupirinfós, etiprol, ciazipir, tiacloprida, acetamiprida, dinetofurano, avermectina, metiocarb, espirodiclofeno, espirotetramat; fungicidas para maíz: fenitropan, tiram, protioconazol, tebuconazol, trifloxistrobina; herbicidas para arroz: butaclor, propanilo, azimsulfurón, bensulfurón, cihalofop, daimurón, fentrazamida, imazosulfurón, mefenacet, oxaziclomefona, pirazosulfurón, piributicarb, quincloraco, tiobencarb, indanofano, flufenacet, fentrazamida, halosulfurón, oxaziclomefona, benzobiciclon, piriftalida, penoxsulam, bispiribac, oxadiargilo, etoxisulfurón, pretilaclor, mesotriona, tefuriltriona, oxadiazona, fenoxaprop, pirimisulfán; insecticidas para arroz: diazinon, fenitrotión, fenobucarb, monocrotofós, benfuracarb, buprofezin, dinotefurano, fipronilo, imidacloprida, isoprocarb, tiacloprida, cromafenozida, tiacloprida, dinotefurano, clotianidina, etiprol, flubendiamida, rinaxipir, deltametrina, acetamiprida, tiamethoxam, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamect-benzoato, cipermetrina, clorpirifós, cartap, metamidofós, etofenprox, triazofós, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, carbofurano, benfuracarb; fungicidas para arroz: tiofanato-metilo, azoxistrobina, carpropamida, edifenfós, ferimzona, iprobenfós, isoprotiolano, pencicurón, probenazol, piroquilona, triciclazol, trifloxistrobina, diclocimet, fenoxanilo, simeconazol, tiadinilo; herbicidas para algodón: diurón, fluometurón, MSMA, oxifluorfeno, prometrina, trifluralina, carfentrazona, cletodim, fluazifop-butilo, glifosato, norflurazona, pendimetalina, piritiobac-sodio, trifloxisulfurón, tepraloxidim, glufosinato, flumioxazina, tidiazurón; insecticidas para algodón: acefato, aldicarb, clorpirifós, cipermetrina, deltametrina, malatión, monocrotofós, abamectina, acetamiprida, benzoato de emamectina, imidacloprida, indoxacarb, lambda-cihalotrina, espinosad, tiodicarb, gamma-cihalotrina, espiromesifeno, piridalilo, flonicamida, flubendiamida, triflumurón, rinaxipir, betaciflutrina, espirotetramat, clotianidina, tiametoxam, tiacloprida, dinetofurano, flubendiamida, ciazipir, espinosad, espinotoram, gamma cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furano-2(5H)-ona, tiodicarb, avermectina, flonicamida, piridalilo, espiromesifeno, sulfoxaflor, profenofós, triazofós, endosulfán; fungicidas para algodón: etridiazol, metalaxilo, quintoceno; herbicidas para soja: alaclor, bentazona, trifluralina, clorimurón-etilo, cloransulam-metilo, fenoxaprop, fomesafeno, fluazifop, glifosato, imazamox, imazaquina, imazetapir, (S-)metolaclor, metribuzina, pendimetalina, tepraloxidim, glufosinato; insecticidas para soja: lambda-cihalotrina, metomilo, parationa, tiocarb, imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, tiacloprida, acetamiprida, dinetofurano, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, espinosad, espinotoram, emamectina-benzoato, fipronilo, etiprol, deltametrina, p-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, espirotetramat, espinodiclofeno, triflumurón, flonicamida, tiodicarb, beta-ciflutrina; fungicidas de soja: azoxistrobina, ciproconazol, epoxiconazol, flutriafol, piraclostrobina, tebuconazol, trifloxistrobina, protioconazol, tetraconazol; herbicidas para remolacha azucarera: cloridazón, desmedifam, etofumesato, fenmedifam, trialato, clopiralida, fluazifop, lenacilo, metamitrón, quinmerac, cicloxidim, triflusulfurón, tepraloxidim, quizalofop; insecticidas para remolacha azucarera: imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, tiacloprida, acetamiprida, dinetofurano, deltametrina, p-ciflutrina, gamma/lambda cihalotrina, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona, teflutrina, rinaxipir, ciaxipir, fipronilo, carbofurano; herbicidas para cánola: clopiralida, diclofop, fluazifop, glufosinato, glifosato, metazaclor, trifluralina etametsulfurón, quinmerac, quizalofop, cletodim, tepraloxidim; fungicidas para cánola: azoxistrobina, carbendazim, fludioxonilo, iprodiona, procloraz, vinclozolina; insecticidas para cánola: organofosforados de carbofurano, piretroides, tiacloprida, deltametrina, imidacloprida, clotianidina, tiametoxam, acetamiprida, dinetofurano, p-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, tau-fluvaleriato, etiprol, espinosad, espinotoram, flubendiamida, rinaxipir, ciazipir, 4-[[(6-clorpiridin-3-il)metil](2,2-difluoretil)amino]furan-2(5H)-ona.
En algunos aspectos, el herbicida es atrazina, bromacilo, diurón, clorsulfurón, metsulfurón, tifensulfurón metilo, tribenurón, acetoclor, dicamba, isoxaflutol, nicosulfurón, rimsulfurón, piritiobac-sodio, flumioxazina, clorimurón-etilo, metribuzina, quizalofop, S-metolaclor, hexazina, o combinaciones de los mismos.
En algunos aspectos, el insecticida es esfenvalerato, clorantraniliprol, metomilo, indoxacarb, oxamilo, o combinaciones de los mismos.
Actividad plaguicida e insecticida
“Plaga” incluye, pero no se limita a, insectos, hongos, bacterias, nematodos, ácaros, garrapatas y similares. Las plagas de insectos incluyen insectos seleccionados de los órdenes Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, particularmente Lepidoptera y Coleoptera.
Los expertos en la técnica reconocerán que no todos los compuestos son igualmente eficaces contra todas las plagas. Los compuestos descritos aquí muestran actividad contra plagas de insectos, que pueden incluir plagas agronómicas, forestales, de invernadero, ornamentales de vivero, de alimentos y fibras, de salud pública y animal, de estructuras domésticas y comerciales, de hogar y productos almacenados, económicamente importantes.
Las larvas del orden Lepidoptera incluyen, pero no se limitan a, gusanos soldados, gusanos cortadores, áncoras y heliotinas de la familia Noctuidae. Spodoptera frugiperda JE Smith (gusano cogollero); S. exigua Hübner (gusano soldado de la remolacha); S. litura Fabricius (gusano cortador del tabaco, oruga del racimo); Mamestra configurata Walker (gusano soldado bertha); M. brasicáceas Linnaeus (polilla de la col); Agrotis ipsilon Hufnagel (gusano cortador negro); A. ortogonia Morrison (gusano cortador occidental); A. subterranea Fabricius (gusano cortador granulado); Alabama argillacea Hübner (gusano de la hoja de algodón); Tricoplusia ni Hübner (engarzador de repollo); Pseudoplusia includens Walker (oruga de soja); Anticarsia gemmatalis Hübner (oruga de la judía terciopelo); Hypena scabra Fabricius (gusano del trébol verde); Heliothis virescens Fabricius (gusano de las yemas del tabaco); Pseudaletia unipuncta Haworth (gusano soldado); Athetis mindara Barnes y Mcdunnough (gusano cortador de piel áspera); Euxoa mesoria Harris (gusano cortador de lados oscuros); Earias insulana Boisduval (gusano cogollero espinoso); E. vitella Fabricius (gusano manchado); Helicoverpa armígera Hübner (gusano cogollero americano); H. zea Boddie (gusano cogollero o gusano cogollero del algodón); Melanchra picta Harris (oruga cebra); Egira (Xylomyges) curialis Grote (gusano cortador de cítricos); barrenadores, polillas, gusanos tejedores, gusanos cónicos, y larvas mordedoras del parénquima de la familia Pyralidae Ostrinia nubilalis Hübner (barrenador europeo del maíz); Amyelois transitella Walker (gusano de naranja naval); Anagasta kuehniella Zeller (polilla mediterránea de la harina); Cadra cautella Walker (polilla de la almendra); Chilo supresoris Walker (barrenador del tallo del arroz); C. partellus (barrenador del sorgo); Corcyra cephalonica Stainton (polilla del arroz); Crambus caliginosellus Clemens (gusano tejedor de la raíz del maíz); C. teterrellus Zincken (gusano tejedor de la poa); Cnaphalocrocis medinalis Guenée (rollo de hojas de arroz); Desmia funeralis Hübner (doblador de hojas de uva); Diaphania hyalinata Linnaeus (gusano del melón); D. nitidalis Stoll (gusano del pepinillo); Diatraea grandiosella Dyar (barrenador del maíz del sudoeste), D. saccharalis Fabricius (barrenador de la caña de azúcar); Eoreuma loftini Dyar (barrenador mexicano del arroz); Ephestia elutella Hübner (polilla del tabaco (cacao)); Gallería mellonella Linnaeus (polilla de cera mayor); Herpetogramma licarsisalis Walker (gusano tejedor de césped); Homoeosoma electrellum Hulst (polilla del girasol); Elasmopalpus lignosellus Zeller (barrenador menor del tallo de maíz); Achroia grisella Fabricius (polilla de cera menor); Loxostege sticticalis Linnaeus (gusano de la remolacha); Orthaga thyrisalis Walker (polilla de telaraña del árbol del té); Maruca testulalis Geyer (barrenador de la vaina de la judía); Plodia interpunctella Hübner (polilla india de la harina); Scirpophaga incertulas Walker (barrenador amarillo del tallo); Udea rubigalis Guenée (gusano de la hoja del apio); y enrolladores de hojas, gusanos de las yemas, gusanos de las semillas y gusanos de los frutos de la familia Tortricidae Acleris gloverana Walsingham (gusano occidental de cabeza negra); A. variana Fernald (gusano de los cogollos de cabeza negra oriental); Archips argyrospila andador (enrollador de hojas de árboles frutales); A. rosana Linnaeus (enrollador de hojas europeo); y otras especies de Archips, Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm (polilla tortrix de la fruta de verano); Cochylis hospes Walsingham (polilla del girasol rayada); Cydia latiferreana Walsingham (gusano avellana); C. pomonella Linnaeus (polilla codificadora); Platynota flavedana Clemens (enrollador de hojas abigarrado); P. stultana Walsingham (enrollador de hojas omnívoro); Lobesia botrana Denis y Schiffermüller (polilla europea de la vid); Spilonota ocellana Denis y Schiffermüller (polilla de las yemas con manchas oculares); Endopiza viteana Clemens (polilla de la uva); Eupoecilia ambiguella Hübner (polilla de la vid); Bonagota salubricola Meyrick (enrollador de hojas del manzano brasileño); Grapholita molesta Busck (polilla oriental de la fruta); Suleima helianthana Riley (polilla del capullo del girasol); Argyrotaenia spp.; Choristoneura spp.
Otras plagas agronómicas seleccionadas en el orden Lepidoptera incluyen, pero no se limitan a, Tambiénphila pometaria Harris (gusano de otoño); Anarsia lineatella Zeller (barrenador de ramitas de melocotón); Anisota senatoria JE Smith (gusano de roble rayado de naranja); Antheraea pernyi Guérin-Méneville (polilla china del roble Tussah); Bombyx mori Linnaeus (gusano de seda); Bucculatrix thurberiella Busck (perforador de hojas de algodón); Colias eurytheme Boisduval (oruga de la alfalfa); Datana integerrima Grote y Robinson (oruga de nuez); Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov (polilla de seda siberiana), Ennomos subsignaria Hübner (gusano del olmo); Erannis tiliaria Harris (gusano medidor del tilo); Euproctis chrysorrhoea Linnaeus (polilla de cola parda); Harrisina americana Guérin-Méneville (esqueletizador de hoja de parra); Hemileuca oliviae Cockrell (oruga de intervalo); Hyphantria cunea Drury (gusano web de otoño); Keiferia lycopersicella Walsingham (oxiuro del tomate); Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst (gusano medidor de cicuta oriental); L. fiscellaria lugubrosa Hulst (gusano medidor de cicuta occidental); Leucoma salicis Linnaeus (polilla satinada); Lymantria dispar Linnaeus (polilla gitana); Manduca quinquemaculata Haworth (polilla halcón de cinco puntos, gusano cornudo del tomate); M sexta Haworth (gusano cornudo del tomate, gusano cornudo del tabaco); Operophtera brumata Linnaeus (polilla de invierno); Paleacrita vernata Peck (gusano de primavera); Papilio cresphontes Cramer (perro naranja cola de golondrina gigante); Phryganidia californita Packard (gusano del roble de California); Phyllocnistis citrella Stainton (minador de hojas de cítricos); Phyllonorycter blancardella Fabricius (minador de hojas tentiforme manchado); Pieris brassicae Linnaeus (mariposa blanca grande); P. rapae Linnaeus (pequeña mariposa blanca); P. napi Linnaeus (mariposa blanca con vetas verdes); Platyptilia carduidactyla Riley (polilla de la pluma de la alcachofa); Plutella xylostella Linnaeus (polilla de espalda de diamante); Pectinophora gossypiella Saunders (gusano cogollero rosado); Pontia protodice Boisduval y Leconte (gusano de la col del sur); Sabulodes aegrotata Guenée (gusano medidor omnívoro); Schizura concinna JE Smith (oruga jorobada roja); Sitotroga cerealella Olivier (polilla del grano Angoumois); Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller (oruga procesionaria del pino); Tineola bisselliella Hummel (polilla de la ropa tejida); Tuta absoluta Meyrick (minador de hojas del tomate); Yponomeuta padella Linnaeus (polilla del armiño); Heliothis subflexa Guenée; Malacosoma spp. y Orgyia spp.
Son de interés las larvas y los adultos del orden Coleoptera, incluyendo los gorgojos de las familias Anthribidae, Bruchidae y Curculionidae (incluyendo, pero no se limita a: Anthonomus grandis Boheman (gorgojo del algodonero); Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel (gorgojo del agua del arroz); Sitophilus granarius Linnaeus (gorgojo del granero); S. oryzae Linnaeus (gorgojo del arroz); Hypera punctata Fabricius (gorgojo de la hoja del trébol); Cilindrocopturus adspersus LeConte (gorgojo del tallo del girasol); Smicronyx fulvus LeConte (gorgojo rojo de la semilla de girasol); S. sordidus LeConte (gorgojo gris de la semilla de girasol); Sphenophorus maidis Chittenden (picudo del maíz)); escarabajos pulgas, escarabajos del pepino, gusanos de la raíz, escarabajos de las hojas, escarabajos de la patata y minadores de hojas de la familia Chrysomelidae (incluyendo, pero no se limita a: Leptinotarsa decemlineata Say (escarabajo de patata de Colorado); Diabrotica virgifera virgifera LeConte (gusano de la raíz del maíz occidental); D. barberi Smith y Lawrence (gusano de la raíz del maíz del norte); D. undecimpunctata howardi Barber (gusano de la raíz del maíz del sur); Chaetocnema pulicaria Melsheimer (escarabajo pulga del maíz); Phyllotreta cruciferae Goeze (escarabajo pulga de crucífera); Phyllotreta striolata (escarabajo pulga rayado); Colaspis brunnea Fabricio (colaspis de la uva); Oulema melanopus Linnaeus (escarabajo de la hoja de cereales); Zygogramma exclamationis Fabricius (escarabajo del girasol)); escarabajos de la familia Coccinellidae (incluyendo, pero no limitado a: Epilachna varivestis Mulsant (escarabajo mexicano de la judía)); cháfers y otros escarabajos de la familia Scarabaeidae (incluyendo, pero no limitado a: Popillia japonica Newman (escarabajo japonés); Cyclocephala borealis Arrow (cháfer enmascarado del norte, larva blanca); C. immaculata Olivier (cháfer enmascarado del sur, larva blanca); Rhizotrogus majalis Razoumowsky (cháfer europeo); Phyllophaga crinita Burmeister (gusano blanco); Ligyrus gibbosus De Geer (escarabajo de la zanahoria)); escarabajos de alfombra de la familia Dermestidae; gusanos de alambre de la familia Elateridae, Eleodes spp., Melanotus spp.; Conoderus spp.; Limonius spp.; Agriotes spp.; Ctenicera spp.; Aeolus spp.; escarabajos descortezadores de la familia Scolytidae y escarabajos de la familia Tenebrionidae.
Son de interés adultos e inmaduros del orden Diptera, incluyendo los minadores Agromyza parvicornis Loew (minador de hojas de la mancha de maíz); mosquitos (incluyendo, pero no limitado a: Contarinia sorghicola Coquillett (mosquito del sorgo); Mayetiola destructor Say (mosca de arpillera); Sitodiplosis mosellana Géhin (mosquito del trigo); Neolasioptera murtfeldtiana Felt (mosquito de semilla de girasol)); moscas de la fruta (Tephritidae), Oscinella frit Linnaeus (moscas de la fruta); gusanos (incluyendo, pero no limitado a: Delia platura Meigen (gusano de semilla de maíz); D. coarctata Fallen (mosca del bulbo de trigo) y otros Delia spp., Meromyza americana Fitch (gusano del tallo del trigo); Musca domestica Linnaeus (moscas domésticas); Fannia canicularis Linnaeus, F. femoralis Stein (moscas domésticas menores); Stomoxys calcitrans Linnaeus (moscas de los establos)); moscas de cara, moscas de cuerno, moscas de soplar, Crysomya spp.; Phormia spp. y otras plagas de moscas muscoides, tábanos Tabano spp.; moscas bot Gasterophilus spp.; Oestrus spp.; larvas de ganado Hypoderma spp.; moscas de ciervo Chrysops spp.; Melophagus ovinus Linnaeus (ovejas keds) y otros Brachycera, mosquitos Aedes spp.; Anofeles spp.; Culex spp.; moscas negras Prosimulium spp.; Simulium spp.; mosquitos mordedores, jejenes, esciúridos, y otros Nematocera.
Se incluyen como insectos de interés adultos y ninfas de los órdenes Hemiptera y Homoptera tales como, pero no se limita a, adélgidos de la familia Adelgidae, chinches de las plantas de la familia Miridae, cigarras de la familia Cicadidae, chicharritas, Empoasca spp.; de la familia Cicadellidae, saltahojas de las familias Cixiidae, Flatidae, Fulgoroidea, Issidae y Delphacidae, saltahojas de la familia Membracidae, psílidos de la familia Psyllidae, moscas blancas de la familia Aleyrodidae, pulgones de la familia Aphididae, filoxera de la familia Phylloxeridae, cochinillas harinosas de la familia Pseudococcidae, escamas de las familias Asterolecanidae, Coccidae, Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae Ortheziidae, Phoenicococcidae y Margarodidae, chinches de encaje de la familia Tingidae, chinches hediondas de la familia Pentatomidae, chinches, Blissus spp.; y otras chinches de las semillas de la familia Lygaeidae, chinches salivadoras de la familia Cercopidae, chinches de la calabaza de la familia Coreidae, y chinches rojas y manchadoras de algodón de la familia Pyrrhocoridae.
Los miembros agronómicamente importantes del orden Homoptera incluyen además, pero no se limitan a: Acyrthisiphon pisum Harris (pulgón del guisante); Aphis craccivora Koch (pulgón del caupí); A. fabae Scopoli (pulgón de la judía negra); A. gossypiiGlover (pulgón del algodón, pulgón del melón); A. maidiradicis Forbes (pulgón de la raíz del maíz); A. pomi De Geer (pulgón del manzano); A. spiraecola Patch (pulgón espirea); Aulacorthum solani Kaltenbach (pulgón dedalera); Chaetosiphon fragaefolii Cockerell (pulgón de la fresa); Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko (pulgón ruso del trigo); Dysaphis plantaginea Paaserini (pulgón rosado de la manzana); Eriosoma lanigerum Hausmann (pulgón lanudo del manzano); Brevicoryne brassicae Linnaeus (pulgón de la col); Hyalopterus pruni Geoffroy (pulgón harinoso del ciruelo); Lipaphis erysimi Kaltenbach (pulgón del nabo); Metopolophium dirrhodum Walker (pulgón de los cereales); Macrosiphum euphorbiae Thomas (pulgón de la patata); Myzus persicae Sulzer (pulgón del melocotón-patata, pulgón verde del melocotón); Nasonovia ribisnigri Mosley (pulgón de la lechuga); Pemphigus spp. (pulgones de las raíces y de las agallas); Rhopalosiphum maidis Fitch (pulgón de la hoja de maíz); R. padi Linnaeus (pulgón de la cereza y la avena); Schizaphis graminum Rondani (pulgón de los cereales); Sipha flava Forbes (pulgón amarillo de la caña de azúcar); Sitobion avenae Fabricius (pulgón inglés del grano); Therioaphis maculata Buckton (pulgón manchado de la alfalfa); Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (pulgón negro de los cítricos) y T. citricida Kirkaldy (pulgón marrón de los cítricos); Adelges spp. (adélgidos); Phylloxera devastatrix Pergande (filoxera de nuez pecana); Bemisia tabaci Gennadius (mosca blanca del tabaco, mosca blanca de la batata); B. argentifolii Bellows y Perring (mosca blanca de hoja plateada); Dialeurodes citri Ashmead (mosca blanca de los cítricos); Trialeurodes abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) y T. vaporariorum Westwood (mosca blanca de invernadero); Empoasca fabae Harris (saltahojas de la patata); Laodelphax striatellus Fallen (saltamontes marrón más pequeño); Macrolestes quadrilineatus Forbes (saltahojas aster); Nephotettix cinticeps Uhler (saltahojas verde); N. nigropictus Stál (saltahojas del arroz); Nilaparvata lugens Stál (saltamontes marrón); Peregrinus maidis Ashmead (saltamontes de maíz); Sogatella furcifera Horvath (saltamontes de lomo blanco); Sogatodes orizicola Muir (delfácido del arroz); Typhlocyba pomaria McAtee (saltahojas blanca de la manzana); Erythroneoura spp. (saltahojas de la uva); Magicicada septendecim Linnaeus (cigarra periódica); Icerya purchasi Maskell (escama algodonosa); Quadraspidiotus perniciosus Comstock (escama de San José); Planococcus citri Risso (cochinilla de los cítricos); Pseudococcus spp. (otro complejo de cochinillas); Cacopsylla pyricola Foerster (psila de la pera); Trioza diospyriAshmead (psila del caqui).
Las especies de interés agronómicamente importantes del orden Hemiptera incluyen, pero no se limitan a: Acrosternum hilare Say (chinche hedionda verde); Anasa tristis De Geer (chinche de calabaza); Blissus leucopterus leucopterus Di (chinche chinche); Corythuca gossypii Fabricius (chinche de encaje de algodón); Cyrtopeltis modesta Distant (insecto del tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schaffer (teñidor del algodón); Euschistus servus Say (chinche hedionda marrón); MI. variolarius Palisot de Beauvois (chinche hedionda de una mancha); Graptostethus spp. (complejo de chinches de las semillas); Leptoglossus corculus Say (chinche de semilla de pino de patas de hoja); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (chinche de planta empañada); L. Hesperus Knight (chinche occidental de plantas deslustradas); L. pratensis Linnaeus (chinche común de los prados); L. rugulipennis Poppius (chinche europea de las plantas empañadas); Lygocorispabulinus Linnaeus (cápside verde común); Nezara viridula Linnaeus (chinche hedionda verde del sur); Oebalus pugnax Fabricius (chinche hedionda del arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (chinche grande del algodoncillo); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (saltahojas de algodón).
Además, los aspectos pueden ser eficaces contra Hemiptera tales, Calocoris norvegicus Gmelin (chinche de la fresa); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (cápside de manzana); Cyrtopeltis modestus Distant (insecto del tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca chupadora); Spanagonicus albofasciatus Reuter (pulga saltamontes de marca blanca); Diaphnocoris chlorionis Say (insecto de la planta de algarrobo de miel); Labopidicola allii Knight (chinche de la planta de cebolla); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga saltamontes de algodón); Adelphocoris rapidus Say (insecto de la planta rápida); Poecilocapsus lineatus Fabricius (chinche de planta de cuatro líneas); Nysius ericae Schilling (falsa chinche); Nysius raphanus Howard (falsa chinche); Nezara viridula Linnaeus (chinche hedionda verde del sur); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. y Cimicidae spp.
También se incluyen adultos y larvas del orden Acari (ácaros) tales como Aceria tosichella Keifer (ácaro del rizo del trigo); Petrobia latens Müller (ácaro marrón del trigo); ácaros araña y ácaros rojos de la familia Tetranychidae, Panonychus ulmi Koch (ácaro rojo europeo); Tetranychus urticae Koch (araña roja de dos manchas); (T. mcdanieli McGregor (ácaro de McDaniel); T. cinnabarinus Boisduval (araña roja carmín); T. turkestani Ugarov y Nikolski (araña roja de la fresa); ácaros planos de la familia Tenuipalpidae, Brevipalpus lewisi McGregor (ácaro plano de los cítricos); ácaros de la roya y de los brotes de la familia Eriophyidae, y otros ácaros que se alimentan de las hojas, y ácaros importantes para la salud humana y animal, es decir, ácaros del polvo de la familia Epidermoptidae, ácaros del folículo de la familia Demodicidae, ácaros de los cereales de la familia Glycyphagidae, garrapatas del orden Ixodidae. Ixodes escapularis Say (garrapata de venado); I. holoyiclus Neumann (garrapata de la parálisis australiana); Dermacentor variabilis Say (garrapata del perro americano); Amblyomma americanum Linnaeus (garrapata estrella solitaria), y ácaros de la sarna y del picor de las familias Psoroptidae, Pyemotidae y Sarcoptidae.
Son de interés las plagas de insectos del orden Thysanura, tales como Lepisma saccharina Linnaeus (pez plateado); Thermobia domestica Packard (insecto de fuego).
Las plagas de artrópodos adicionales cubiertas incluyen: arañas en el orden Araneae tales como Loxosceles reclusa Gertsch y Mulaik (araña reclusa parda) y la Latrodectus mactans Fabricius (araña viuda negra), y ciempiés del orden Scutigeromorpha tal como Scutigera coleoptrata Linnaeus (ciempiés doméstico).
Las plagas de insectos de interés incluyen la superfamilia de chinches hediondas y otros insectos relacionados, incluyendo, pero sin limitarse a, especies pertenecientes a la familia Pentatomidae (Nezara viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acrosternum hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus, y Bagrada hilaris (chinche bagrada)), la familia Plataspidae (Megacopta cribraria - chicnhe kudzu) y la familia Cydnidae (Scaptocoris castanea - chinche hedionda de la raíz), y especies de Lepidoptera que incluyen, pero no se limitan a: polilla de espalda de diamante, por ejemplo Helicoverpa zea Boddie; gusano falso medidor, por ejemplo Pseudoplusia includens Walker, y oruga de judía terciopelo, por ejemplo Anticarsia gemmatalis Hubner.
Los métodos para medir la actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Czapla y Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293, y patente US número 5.743.477. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir y/o provocar la muerte de las plagas.
Los nematodos incluyen nematodos parásitos tales como nematodos del nudo de la raíz, quistes y lesiones, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos del quiste, incluyendo, pero no se limita a, Heterodera glicinas (nematodo del quiste de la soja); Heterodera schachtii (nematodo del quiste de la remolacha); Heterodera avenae (nematodo del quiste de los cereales) y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nematodos del quiste de la patata). Los nematodos de las lesiones incluyen Pratylenchus spp.
Tratamiento de semillas
Para proteger y mejorar la producción de rendimiento y las tecnologías de rasgos, las opciones de tratamiento de semillas pueden proporcionar flexibilidad adicional en el plan de cultivo y un control rentable contra insectos, malezas y enfermedades. El material de la semilla se puede tratar, normalmente en la superficie, con una composición que comprende combinaciones de herbicidas químicos o biológicos, protectores de herbicidas, insecticidas, fungicidas, inhibidores y potenciadores de la germinación, nutrientes, reguladores y activadores del crecimiento de las plantas, bactericidas, nematocidas, avicidas y/o molusquicidas. Estos compuestos se formulan normalmente junto con otros vehículos, tensioactivos o adyuvantes que promueven la aplicación empleados habitualmente en la técnica de la formulación. Los recubrimientos se pueden aplicar impregnando el material de propagación con una formulación líquida, o revistiendo con una combinación de formulación húmeda o seca. Los ejemplos de los diversos tipos de compuestos que pueden usarse como tratamientos de semillas se proporcionan en The Pesticide Manual: A World Compendium, C.D.S. Tomlin Ed., publicado por el British Crop Production Council.
Algunos tratamientos de semillas que se pueden usar en semillas de cultivos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ácido abscísico, acibenzolar-S-metilo, avermectina, amitrol, azaconazol, azospirillum, azadiractina, azoxistrobina, Bacillus spp. (incluyendo una o más especies de cereus, firmus, megaterium, pumilis, sphaericus, subtilis y/o thuringiensis), Bradyrhizobium spp. (incluyendo una o más de betae, canariense, elkanii, iriomotense, japonicum, liaonigense, pachyrhizi y/o yuanmingense), captan, carboxina, quitosano, clotianidina, cobre, ciazipir, difenoconazol, etidiazol, fipronilo, fludioxonilo, fluoxastrobina, fluquinconazol, flurazol, fluxofenim, proteína harpina, imazalilo, imidacloprida, ipconazol, isoflavonoides, lipo-quitooligosacárido, mancozeb, manganeso, maneb, mefenoxam, metalaxilo, metconazol, miclobutanilo, PCNB, penflufeno, penicilio, pentiopirad, permetrina, picoxistrobina, protioconazol, piraclostrobina, rinaxipir, S-metolaclor, saponina, sedaxano, TCMTB, tebuconazol, tiabendazol, tiametoxam, tiocarb, tiram, tolclofós-metilo, triadimenol, tricoderma, trifloxistrobina, triticonazol, y/o zinc. El recubrimiento de semilas PCNB se refiere al número de registro de la EPA 00293500419, que contiene quintozen y terrazol. TCMTB se refiere a 2-(tiocianometiltio)benzotiazol.
Las variedades de semillas y las semillas con rasgos transgénicos específicos pueden analizarse para determinar qué opciones de tratamiento de semillas y tasas de aplicación pueden complementar dichas variedades y rasgos transgénicos para mejorar el rendimiento. Por ejemplo, una variedad con buen potencial de rendimiento pero susceptibilidad al carbón de penacho de maíz puede beneficiarse del uso de un tratamiento de semillas que proporcione protección contra el carbón de penacho de maíz, una variedad con buen potencial de rendimiento pero susceptibilidad al nematodo del quiste puede beneficiarse del uso de un tratamiento de semillas que proporcione protección contra el nematodo del quiste, etc. Del mismo modo, una variedad que incluya un rasgo transgénico que confiera resistencia a insectos puede beneficiarse del segundo modo de acción conferido por el tratamiento de semillas, una variedad que incluya un rasgo transgénico que confiera resistencia a herbicidas puede beneficiarse de un tratamiento de semillas con un protector que mejore la resistencia de las plantas a ese herbicida, etc. Además, el buen establecimiento de raíces y la emergencia temprana que resulta del uso adecuado de un tratamiento de semillas puede dar como resultado un uso más eficiente del nitrógeno, una mejor capacidad para resistir la sequía, y un aumento general en el potencial de rendimiento de una variedad o variedades que contienen un cierto rasgo cuando se combina con un tratamiento de semillas.
Métodos para exterminar una plaga de insectos y controlar una población de insectos
En algunos aspectos, se describen métodos para exterminar una plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de al menos una perforina de origen vegetal recombinante que incluye, pero no se limita a, un polipéptido IPD079. En algunos aspectos, se describen métodos para exterminar una plaga de insectos, que comprenden poner en contacto la plaga de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de una proteína plaguicida recombinante de SEQ ID NO: 2, SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o una variante de la misma.
En algunos aspectos, se describen métodos para controlar una población de plagas de insectos, que comprenden poner en contacto la población de plagas de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido IPD079 recombinante. En algunos aspectos, se describen métodos para controlar una población de plagas de insectos, que comprenden poner en contacto la población de plagas de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido IPD079 recombinante de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o una variante del mismo. Como se usa aquí, “controlar una población de plagas” o “controlar una plaga” se refiere a cualquier efecto sobre una plaga que dé como resultado la limitación del daño que causa la plaga. El control de una plaga incluye, pero no se limita a, exterminar la plaga, inhibir el desarrollo de la plaga, alterar la fertilidad o el crecimiento de la plaga de tal manera que la plaga provoque menos daño a la planta, disminuir el número de descendientes producidos, producir plagas menos aptas, produciendo plagas más susceptibles al ataque de depredadores o disuadiendo a las plagas de comerse la planta.
En algunos aspectos, se describen métodos para controlar una población de plagas de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprende poner en contacto la población de plagas de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido IPD079 recombinante. En algunos aspectos, se describen métodos para controlar una población de plagas de insectos resistente a una proteína plaguicida, que comprenden poner en contacto la población de plagas de insectos con una cantidad eficaz como insecticida de un polipéptido IPD079 recombinante SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID n O: 140 o una variante del mismo.
En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante heterólogo que codifica un polipéptido IPD079. En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma un polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o variantes del mismo.
En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante que codifica una perforina heteróloga derivada de una planta. En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido IPD094.
En algunos aspectos se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido IPD094Aa de SEQ ID NO: 144 o un homólogo o variante del mismo. En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante que codifica una perforina heteróloga derivada de una planta. En algunos aspectos, se describen métodos para proteger una planta de una plaga de insectos, que comprenden expresar en la planta o célula de la misma al menos un polinucleótido recombinante que codifica una perforina heteróloga derivada de una planta de cualquiera de SEQ ID NO: 158-1248 o un homólogo o variante del mismo.
Estrategias de manejo de resistencia de insectos (IRM)
La expresión de endotoxinas 5 de B. thuringiensis en plantas de maíz transgénicas ha demostrado ser un medio eficaz para controlar plagas de insectos de importancia agrícola (Perlak, et al., 1990; 1993). Sin embargo, han evolucionado insectos que son resistentes a las endotoxinas 5 de B. thuringiensis expresadas en plantas transgénicas. Esa resistencia, si se generalizara, limitaría claramente el valor comercial del germoplasma que contiene genes que codifican dichas endotoxinas 5 de B. thuringiensis.
Una forma de aumentar la eficacia de los insecticidas transgénicos contra las plagas diana, y al mismo tiempo reducir el desarrollo de plagas resistentes a los insecticidas, es proporcionar refugios no transgénicos (es decir, proteínas no insecticidas) (una sección de cultivos/maíz no insecticidas) para uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína insecticida activa contra las plagas diana. La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm, a la que se puede acceder usando el prefijo www) publica los requisitos para el uso con cultivos transgénicos que producen una sola proteína Bt activa contra las plagas diana. Además, la Asociación Nacional de Productores de Maíz, en su sitio web: (ncga.com/insect-resistancemanagement-fact-sheet-btcorn, al que se puede acceder usando el prefijo www) también proporciona una guía similar con respecto a los requisitos de refugio. Debido a las pérdidas por insectos dentro del área del refugio, los refugios más grandes pueden reducir el rendimiento general.
Otra forma de aumentar la efectividad de los insecticidas transgénicos contra las plagas diana, y al mismo tiempo reducir el desarrollo de plagas resistentes a los insecticidas, sería tener un repositorio de genes de insecticidas que sean eficaces contra grupos de plagas de insectos y que manifiesten sus efectos a través de diferentes modos de acción.
La expresión en una planta de dos o más composiciones insecticidas tóxicas para la misma especie de insecto, expresándose cada insecticida a niveles eficaces, sería otra forma de lograr el control del desarrollo de resistencia. Esto se basa en el principio de que la evolución de la resistencia contra dos modos de acción separados es mucho más improbable que contra uno solo. Roush, por ejemplo, describe estrategias de dos toxinas, también llamadas “piramidación” o “apilamiento”, para el manejo de cultivos transgénicos insecticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:1777-1786). El apilamiento o piramidación de dos proteínas diferentes, cada una eficaz contra las plagas diana y con poca o ninguna resistencia cruzada, puede permitir el uso de un refugio más pequeño. La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos de América requiere que se plante una cantidad significativamente menor (generalmente 5 %) de refugio estructurado de maíz no Bt que para productos de un solo rasgo (generalmente 20%). Hay diversas formas de proporcionar los efectos IRM de un refugio, incluyendo diversos patrones geométricos de plantación en los campos y mezclas de semillas en bolsas, como lo analiza más adelante Roush.
En algunos aspectos, la perforina de origen vegetal de la descripción, que incluye, pero no se limita a, un polipéptido IPD079, es útil como estrategia de manejo de la resistencia de insectos en combinación (es decir, piramidal) con otras proteínas plaguicidas, incluyendo, pero sin limitarse a, toxinas Bt, proteínas insecticidas de Xenorhabdus sp. o Photorhabdus sp., y similares.
Se describen aquí métodos para controlar infestación o infestaciones de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica que promueven el manejo de la resistencia a insectos, que comprenden expresar en la planta al menos dos proteínas insecticidas diferentes que tienen diferentes modos de acción.
En algunos aspectos de los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos, la al menos una de las proteínas insecticidas comprende un polipéptido IPD094 insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos de los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos, la al menos una de las proteínas insecticidas comprende una perforina derivada de plantas insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos de los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos, la al menos una de las proteínas insecticidas comprende un polipéptido IPD079 insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos de los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos, la al menos una de las proteínas insecticidas comprende un polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o variantes del mismo, insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos comprenden expresar en la planta transgénica un polipéptido IPD079 y una proteína Cry insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera que tienen diferentes modos de acción.
En algunos aspectos, los métodos para controlar la infestación de insectos lepidópteros y/o coleópteros en una planta transgénica y promover el manejo de la resistencia de los insectos comprenden en la planta transgénica un polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o variantes del mismo, y una proteína Cry insecticida para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que tiene diferentes modos de acción.
También se describen métodos para reducir la probabilidad de aparición de resistencia de insectos lepidópteros y/o coleópteros a plantas transgénicas que expresan en las plantas proteínas insecticidas para controlar las especies de insectos, que comprenden la expresión de un polipéptido IPD079 insecticida para las especies de insectos, en combinación con una segunda proteína insecticida para especies de insectos, que tienen diferentes modos de acción.
También se describen medios para la gestión eficaz de la resistencia a insectos lepidópteros y/o coleópteros de plantas transgénicas, que comprenden coexpresar a altos niveles en las plantas dos o más proteínas insecticidas tóxicas para insectos lepidópteros y/o coleópteros, pero mostrando cada una de ellas un modo diferente de efectuar su actividad destructora, en los que las dos o más proteínas insecticidas comprenden un polipéptido IPD079 y una proteína Cry. También se describen medios para la gestión eficaz de la resistencia a insectos lepidópteros y/o coleópteros de plantas transgénicas, que comprenden coexpresar a altos niveles en las plantas dos o más proteínas insecticidas tóxicas para insectos lepidópteros y/o coleópteros, pero mostrando cada una de ellas un modo diferente de efectuar su actividad destructora, en los que las dos o más proteínas insecticidas comprenden un polipéptido IPD079 de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o variantes del mismo, y una proteína Cry.
Además, se describen métodos para obtener la aprobación reglamentaria para plantar o comercializar plantas que expresan proteínas insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que comprenden la etapa de hacer referencia, enviar o confiar en los datos de unión de ensayos de insectos que muestran que el polipéptido IPD079 no compite con los sitios de unión de las proteínas Cry en tales insectos. Además, se describen métodos para obtener la aprobación reglamentaria para plantar o comercializar plantas que expresan proteínas insecticidas para insectos del orden Lepidoptera y/o Coleoptera, que comprenden la etapa de hacer referencia, enviar o confiar en los datos de unión de ensayos de insectos que muestran que el polipéptido IPD079 de SEQ ID n O: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, o SEQ ID NO: 140 o variante del mismo no compite con los sitios de unión para las proteínas Cry en tales insectos.
Métodos para aumentar el rendimiento de las plantas
Se describen aquí métodos para aumentar el rendimiento de las plantas. Los métodos comprenden proporcionar una planta o célula vegetal que exprese un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica plaguicida descrita aquí, y hacer crecer la planta o una semilla de la misma en un campo infestado con una plaga contra la que el polipéptido tiene actividad plaguicida. En algunos aspectos, el polipéptido tiene actividad plaguicida contra una plaga de lepidópteros, coleópteros, dípteros, hemípteros o nematodos, y el campo está infestado con una plaga de lepidópteros, hemípteros, coleópteros, dípteros o nematodos.
Como se define aquí, el “rendimiento” de la planta se refiere a la calidad y/o cantidad de biomasa producida por la planta. “Biomasa”, como se usa aquí, se refiere a cualquier producto vegetal medido. Un aumento en la producción de biomasa es cualquier mejora en el rendimiento del producto vegetal medido. El aumento del rendimiento de las plantas tiene varias aplicaciones comerciales. Por ejemplo, el aumento de la biomasa foliar de las plantas puede aumentar el rendimiento de las hortalizas de hoja para el consumo humano o animal. Además, el aumento de la biomasa foliar se puede utilizar para aumentar la producción de productos farmacéuticos o industriales derivados de plantas. Un aumento en el rendimiento puede comprender cualquier aumento estadísticamente significativo, incluyendo, pero no se limita a, al menos un aumento del 1%, al menos un aumento del 3%, al menos un aumento del 5%, al menos un aumento del 10%, al menos un aumento del 20%, al menos un aumento del 30%, al menos 50%, al menos 70%, al menos 100% o mayor en el rendimiento en comparación con una planta que no expresa la secuencia plaguicida.
En métodos específicos, el rendimiento de la planta aumenta como resultado de la mejora de la resistencia a plagas de una planta que expresa un polipéptido IPD079 descrito aquí. La expresión del polipéptido IPD079 da como resultado una capacidad reducida de una plaga para infestar o alimentarse de la planta, mejorando así el rendimiento de la planta.
Métodos de procesamiento
Se describen además métodos de procesamiento de una planta, parte de una planta o semilla para obtener un producto alimentario o para piensos a partir de una planta, parte de una planta o semilla, que comprenden una perforina de origen vegetal o un polipéptido IPD079. Las plantas, partes de plantas o semillas descritas aquí pueden procesarse para producir aceite, productos proteicos y/o subproductos que son derivados obtenidos por procesamiento que tienen valor comercial. Los ejemplos no limitativos incluyen semillas transgénicas que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido IPD079 que puede procesarse para producir aceite de soja, productos de soja y/o subproductos de soja.
“Procesamiento” se refiere a cualquier método físico y químico usado para obtener cualquier producto de soja, e incluye, pero no se limita a, acondicionamiento térmico, descamación y molienda, extrusión, extracción con disolventes o remojo acuoso, y extracción de semillas completas o parciales.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.
EJEMPLOS EXPERIMENTALES
Ejemplo 1 - Identificación de la proteína insecticida IPD079Aa activa contra especies de D iabrotica de Huperzia phlegm aria
La proteína insecticida IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) se identificó mediante purificación de proteínas, espectrometría de masas (MS) y clonación por PCR a partir de Huperzia phlegmaria (L.) Rothm., (Id. # PS-8582) como sigue. Una muestra de Huperzia phlegmaria (L.) Rothm. (Id. # PS-8582) se recolectó, se ultracongeló en N2 líquido, y se almacenó a -80°C. Después del almacenamiento, se molió hasta obtener un polvo fino a temperaturas de N2 líquido con un molino de bolas Geno/Grinder® (SPEX Sample Prep LLC, Metuchen, NJ). Para la extracción de la proteína, se añadieron 20 ml de amortiguador Tris 50 mM, pH 8,0, KCI 150 mM, e Dt A 2,5 mM, polivinilpolipirrolidona (Pv Pp ) al 1,5%, y cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Alemania), por cada 5 gramos de peso fresco de tejido. El homogeneizado se centrifugó para eliminar los desechos celulares, se filtró a través de filtros de 0,22 pm, y se desalinizó usando 10 ml de columnas de desalinización por centrifugación Zeba™ (Thermo Scientific, IL.).
Se llevaron a cabo bioensayos in vitro contra el gusano occidental de la raíz del maíz (WCRW) (Diabrotica virgifera virgifera) usando el extracto de proteína desalado superpuesto a una dieta para coleópteros basada en agar (Southland Products Inc., Lake Village, AR) en un formato de placa de 96 pocillos. Se utilizaron tres réplicas por muestra. Las muestras se dejaron secar encima de la dieta, y se colocaron de cinco a ocho insectos neonatos en cada pocillo de la placa tratada. Después de 48 horas de incubación a 27°C, las larvas se puntuaron en cuanto a mortalidad o gravedad del retraso en el crecimiento. Los puntuaciones se registraron numéricamente como muertas (3), gravemente atrofiadas (2) (poco o ningún crecimiento, pero vivo y equivalente a larvas de primer estadio), atrofiadas (1) (crecimiento hasta segundo estadio, pero no equivalente a los controles), o normales (0). El someter la muestra a tratamientos de proteinasa K y térmicos dio como resultado una pérdida de actividad, lo que indica que la muestra era de naturaleza proteica. Los resultados del bioensayo se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
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Ejemplo 2 - Purificación de los homólogos de IPD079Aa
El esquema de purificación de proteínas usado es el siguiente: se molieron 50 g de material vegetal PS-8582, se extrajo la fracción de proteína, y se desaló como se describe en el Ejemplo 1. El material desalado se aplicó a una columna SP GE HiTrap™ de 5 ml (GE, Piscataway, NJ), y se eluyó con un gradiente lineal de 30 volúmenes de columna, de NaCl desde 0 hasta 0,35 M en Mes 50 mM, pH 6,0, en fracciones de 1,5 ml. El flujo de SP se identificó como WCRW activo a través del bioensayo in vitro (como se describe anteriormente). La fracción de flujo continuo se concentró usando filtración de corte de peso molecular Amicon® (Millipore, Billerica, MA) para 3kD. El retenido concentrado ~3,2x se llevó hasta (NH4)2SO4 al 30%. La disolución de (NH4)2SO4 al 30% se centrifugó para eliminar cualquier precipitado, y se aplicó a una columna de butilo HIC GE HiTrap™ de 1 ml (GE, Piscataway, NJ), y se eluyó con un gradiente lineal de 50 volúmenes de columna de (NH4)2SO4 desde 1 hasta 0 M en MES 50 mM, pH 6,0, en fracciones de 1,0 ml. Las fracciones se desalinizaron con 0,5 ml de columnas de desalinización Zeba™ (Thermo Scientific, IL.), para eliminar el (NH4)2SO4. Las fracciones de WCRW activo se identificaron como activas mediante un bioensayo in vitro (como se describe anteriormente). La SDS-PAGE de las fracciones activas contenían una banda teñida Coomassie® a ~55 kD que se cortó y se sometió a digestión tríptica.
La secuenciación e identificación de proteínas se realizó mediante análisis de espectrometría de masas (MS) después de la digestión de proteínas con tripsina. Las proteínas para la identificación mediante MS se obtuvieron después de analizar la muestra en un gel LDS-PAGE teñido con Coomassie® Brilliant Blue G-250. Las dos bandas de interés se escindieron del gel, se destiñeron, se redujeron con ditiotreitol, y luego se alquilaron con yodoacetamida. Después de la digestión durante la noche con tripsina, las muestras se sometieron a análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). El análisis de cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para péptidos digeridos trípticamente se realizó mediante electropulverización en un espectrómetro de masas QToF Premiere™ (Waters®, Milford, MA) junto con un sistema nano-LC NanoAcquity™ (Waters®, Milford, MA) con un gradiente desde acetonitrilo al 2%, ácido fórmico al 0,1% hasta acetonitrilo al 60%, ácido fórmico al 0,1%. Los datos de LC-MS resultantes se analizaron usando Protein Lynx Global Server (Waters®, Milford, MA) para generar datos de secuencia DeNovo. Los resultados de la secuencia de espectrometría de masas indicaron que el polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) era similar a la perforina cuando se buscó en la base de datos de secuencias del transcriptoma de Huperzia phlegmaria (Id. # PS-8582) descrita en el Ejemplo 3.
Ejemplo 3- Secuenciación del transcriptoma de H uperzia phlegm aria
Un transcriptoma para Huperzia phlegmaria, (Id. # PS-8582) se preparó como sigue. El ARN total se aisló de tejidos congelados mediante el uso de un kit RNeasy® (Qiagen®) para el aislamiento de ARN total. Las bibliotecas de secuenciación del ARN total resultante se prepararon usando el kit mRNA-Seq TruSeq™ y protocolo de Illumina®, Inc. (San Diego, CA). Brevemente, los ARNm se aislaron a través de la unión a perlas de oligo(dT), se fragmentaron a un tamaño medio de 180 nt, se transcribieron inversamente en ADNc mediante cebado de hexámero aleatorio, se repararon los extremos, la encolaron A en 3’, y se ligaron con adaptadores TruSeq™ indexados Illumina® Los fragmentos de ADNc ligados se amplificaron por PCR usando cebadores Illumina® TruSeq™, y se comprobó la calidad y la cantidad de los productos de PCR purificados en el Agilent Bioanalyzer® Chip ADN 7500. Después de la evaluación de la calidad y la cantidad, se normalizaron 100 ng de la biblioteca de transcritos mediante tratamiento con Duplex Specific Nuclease (DSN) (Evrogen®, Moscú, Rusia). La normalización se logró mediante la adición de amortiguador Hepes 200 mM, seguida de desnaturalización por calor e hibridación durante cinco horas a 68°C. La biblioteca hibridada se trató con 2 pl de enzima DSN durante 25 minutos, se purificó mediante columnas Qiagen® MinElute® de acuerdo con los protocolos del fabricante, y se amplificó doce ciclos usando cebadores específicos del adaptador Illumina®. Los productos finales se purificaron con perlas Ampure® XP (Beckman Genomics, Danvers, MA), y se comprobó la calidad y la cantidad en el Agilent Bioanalyzer® Chip ADN 7500.
Las bibliotecas de transcritos normalizados se secuenciaron de acuerdo con los protocolos del fabricante en el Illumina® Genome Analyzer IIx. Cada biblioteca se hibridó con dos carriles de celdas de flujo, y se amplificó, bloqueó, linealizó e hibridó con cebadores utilizando el proceso de generación de grupos clonales de Illumina en cBot®. La secuenciación se completó en Genome Analyzer IIx, generando sesenta millones de lecturas de extremos emparejados de 75 pb por biblioteca normalizada.
Las secuencias peptídicas identificadas para IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) por secuenciación de LC-MS (descritas en el Ejemplo 3) se compararon con las secuencias de proteínas predichas por marcos de lectura abiertos (ORF) del transcriptoma interno para ensamblajes de PS-8582. Los péptidos dieron una coincidencia perfecta con un transcrito correspondiente a IPD079Aa (SEQ ID NO: 1). Las secuencias codificantes se usaron para diseñar los siguientes cebadores: GATTACCATATGGCCCAAATAGAGC (SEQ ID NO: 1249) y GCTAACTCGAGCTAGTCTAAATGACG (SEQ ID NO: 1250) para clonar la secuencia codificante de IPD079Aa. Este clon se produjo por reacción en cadena de la polimerasa utilizando el kit de PCR HF Advantage® (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043) y el ADNc preparado a partir del ARN total de Huperzia phlegmaria usando como plantilla el kit SuperScript® II (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA). La secuencia clonada se confirmó mediante secuenciación. Con base en la secuenciación del ADN y de las proteínas, la secuencia polinucleotídica de IPD079Aa se muestra como SEQ ID NO: 1, y la secuencia polipeptídica de IPD079Aa como SEQ ID NO: 2.
Ejemplo 4 - Identificación de la proteína insecticida IPD079Ea activa contra especies de Diabrotica de Ophioglossum pendulum
La proteína insecticida IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) se identificó mediante purificación de proteínas, espectrometría de masas (MS) y clonación por PCR a partir de Ophioglossum pendulum (L.), (Id. # PS-9145) como sigue. Una muestra de Ophioglossum pendulum (L.). (Id. # PS-9145) se recolectó, se ultracongeló en N2 líquido, y se almacenó a -80°C. Después del almacenamiento, se molió hasta obtener un polvo fino a temperaturas de N2 líquido con un molino de bolas Geno/Grinder® (SPEX Sample Prep LLC, Metuchen, NJ). A la proteína extraída, se añadieron 20 ml de amortiguador Tris 50 mM, pH 8,0, KCI 150 mM, EDTA 2,5 mM, polivinilpolipirrolidona (PVPP) al 1,5%, y cóctel de inhibidores de proteasa (Roche Diagnostics, Alemania) por cada 5 gramos de peso fresco de tejido. El homogeneizado se centrifugó para eliminar los desechos celulares, se filtró a través de filtros de 0,22 pm, y se desalinizó usando columnas de desalinización por centrifugación Zeba™ de 10 ml (Thermo Scientific, IL.).
Se llevaron a cabo bioensayos in vitro contra el gusano occidental de la raíz del maíz (WCRW) (Diabrotica virgifera virgifera) usando el extracto de proteína desalado superpuesto a una dieta para coleópteros basada en agar (Southland Products Inc., Lake Village, AR) en un formato de placa de 96 pocillos. Se usaron tres números de réplicas por muestra. Las muestras se dejaron secar encima de la dieta, y se colocaron de cinco a ocho insectos neonatos en cada pocillo de la placa tratada. Después de 72 horas de incubación a 27°C, las larvas se puntuaron en cuanto a mortalidad o gravedad del retraso en el crecimiento. Las puntuaciones se registraron numéricamente como muertas (3), severamente atrofiadas (2) (poco o ningún crecimiento, pero vivas y equivalente a larvas de primer estadio), atrofiadas (1) (crecimiento hasta segundo estadio, pero no equivalente a los controles), o normales (0). El someter la muestra a tratamientos de proteinasa K y térmicos dio como resultado una pérdida de actividad, lo que indica que la muestra era de naturaleza proteica. Los resultados del bioensayo se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
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Ejemplo 5 - Purificación de los homólogos de IPD079Ea
El esquema de purificación de proteínas se enumera a continuación, se molieron 10 g de material vegetal PS-9145, y la proteína se extrajo y desaló como se describe en el Ejemplo 1. El material desalado se aplicó a una columna GE HiTrap™ Q de 1 ml (GE, Piscataway, NJ). La proteína se eluyó de la columna con un gradiente lineal de 100 volúmenes de columna de NaCl desde 0 hasta 0,7 M en Tris 50 mM, pH 8,0, y se recogieron fracciones de 1,0 ml. Las fracciones eluidas que mostraron actividad de WCRW a través del bioensayo in vitro (como se describe anteriormente) se agruparon y concentraron 3 a 6 veces utilizando filtración de corte de peso molecular Amicon® 3 kD (Millipore, Billerica, MA). Las fracciones concentradas se separaron en SDS-PAGE, se tiñeron con Coomassie®, y la banda teñida de ~55 kD se cortó y se digirió con tripsina para el análisis de MS.
La secuenciación e identificación de proteínas se realizó mediante análisis de espectrometría de masas (MS) después de la digestión de proteínas con tripsina. Las proteínas para la identificación mediante MS se obtuvieron después de analizar la muestra en un gel de LDS-PAGE teñido con Coomassie® Brilliant Blue G-250. Las bandas de interés se escindieron del gel, se desteñeron, se redujeron con ditiotreitol, y luego se alquilaron con yodoacetamida. Después de la digestión durante la noche con tripsina, las muestras se sometieron a análisis por cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS). El análisis de LC-MS para péptidos digeridos trípsicamente se realizó usando electropulverización en un espectrómetro de masas QToF Premiere™ (Waters®, Milford, MA) junto con un sistema nano-LC NanoAcquity™ (Waters®, Milford, MA) con un gradiente desde acetonitrilo al 2%, ácido fórmico al 0,1% hasta acetonitrilo al 60%, ácido fórmico al 0,1%. Los datos de LC-MS resultantes se analizaron usando Protein Lynx Global Server (Waters®, Milford, MA) para generar datos de secuencia DeNovo.
Ejemplo 6 - Ensayos de coleópteros con polipéptidos IPD079 e IPD094 purificados expresados en E. co li El polinucleótido IPD079Aa (SEQ ID NO: 1) que codifica el polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) se subclonó en el vector pET14b (Novagen) usando los sitios de restricción Ndel/Xhol en marco con una etiqueta 6xHis N-terminal, seguido de un sitio de escisión de trombina. El gen (SEQ ID NO: 1) que codifica IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) también se amplificó con el cebador directo de SEQ ID NO: 154 y el cebador inverso de SEQ ID NO: 155 para la ligación en un vector pET28 con una etiqueta 6xHis N-terminal, seguido de la proteína de unión a maltosa de E. coli (Duplay et al. (1984) J. Biol. Chem.
259:10606-10613). El polinucleótido IPDo79Ea (SEQ ID NO: 55) que codifica el polipéptido IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) se amplificó a partir de ADNc preparado a partir del ARN total de Ophioglossum pendulum usando el cebador directo de SEQ ID NO: 1251 y el cebador inverso de SEQ ID NO: 1252. El producto de PCR resultante se subclonó usando el Gibson Assembly Cloning Kit (NEB) en un vector pET28 con una etiqueta 6xHis N-terminal, seguido de la proteína de unión a maltosa de E. coli. El polinucleótido IPD094Aa (SEQ ID NO: 143) que codifica el polipéptido IPD094Aa (SEQ ID NO: 144) se amplificó a partir de ADNc preparado a partir del ARN total de Selaginella victoriae usando el cebador directo SEQ ID NO: 1253 y el cebador inverso SEQ ID NO: 1254. El producto de PCR resultante se subclonó en un vector pET28 con una etiqueta 6xHis N-terminal, seguido de la proteína de unión a maltosa de E. coli. Las células E coli (Lucigen Corp. Middleton, WI 53562) químicamente competentes OverExpress™ C41(DE3) (Miroux B. et al. Journal of Molecular Biology 260:289-298, 1996) se transformaron con ADN de plásmido pET, que contenía el inserto del gen IPD079 respectivo para la expresión de proteína recombinante. Las células de E. coli transformadas se cultivaron durante la noche a 37°C con selección de kanamicina, y entonces se inocularon en un medio 2xYT reciente (1:25), y se cultivaron adicionalmente hasta una densidad óptica de alrededor de 0,8. La expresión de proteínas se indujo añadiendo IPTG 0,3 mM, y las células se cultivaron adicionalmente a 16°C durante 16 horas. Las proteínas expresadas en E. coli se purificaron mediante cromatografía de iones metálicos inmovilizados usando agarosa Ni-NTA (Qiagen®, Alemania) o resina de amilosa (NEB), según los protocolos del fabricante. Las fracciones purificadas se cargaron en columnas de desalinización PD-10 (GE Life Sciences, Pittsburg, USA) preequilibradas con amortiguador PBS 1 x. Se cargaron 3 ml de amortiguador de eluato en cada columna y se recogieron 2,5 ml de eluato de cada columna.
Se evaluó una serie de concentraciones de la muestra de proteína purificada frente a insectos Coleoptera, y se calcularon las concentraciones para la mortalidad del 50% (LC50) o la inhibición del 50% de los individuos (IC50). Para medir las actividades insecticidas de las proteínas IPD079 contra WCRW (Diabrotica virgifera), se llevaron a cabo bioensayos de incorporación de la dieta usando 20 pl de las muestras de proteína purificada mezcladas con 75 pl de dieta artificial para WCRW (basada en Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos, y después se secó al aire. Después de alimentarse con la dieta a la misma dosis durante un día, se colocó una larva en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El ensayo se llevó a cabo durante seis (1+5) días a 25°C sin luz, y entonces se puntuó la mortalidad y el retraso en el crecimiento. Para medir las actividades insecticidas de las proteínas IPD079 contra NCRW (Diabrotica barberi), se llevaron a cabo bioensayos de incorporación de dieta usando 10 pl de las muestras de proteína purificada mezcladas con 50 pl de dieta artificial para WCRW (basada en Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos, y después se secó al aire. Después de alimentarse con la dieta a la misma dosis durante un día, dos larvas recién nacidas se colocaron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El ensayo se realizó durante cuatro (1+3) días a 25°C sin luz, y entonces se puntuó la mortalidad y el retraso en el crecimiento. Los resultados de WCRW y NCRW para IPD079Aa (s Eq ID NO: 2), IPD079Ea (SEQ ID n O: 56) e IPD094Aa (SEQ ID NO: 144), expresados y purificados a partir de un sistema de expresión de E. coli que utiliza una etiqueta de fusión de polihistidina amino-terminal (NT His) o una fusión de proteína de unión a maltosa (MBP) se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
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El polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2), el polipéptido IPD079Ea (SEQ ID NO: 54) y el polipéptido IPD094Aa (SEQ ID NO: 144) también se evaluaron contra SCRW (Diabrotica undecimpunctata howardi). Los bioensayos se realizaron usando 10 pl de las muestras de proteína purificada mezcladas con 50 pl de dieta artificial para SCRW (basada en Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos (BD Falcon 353910). Un número variable de neonatos de Diabrotica undecimpunctata howardi (3 a 5) se colocaron en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. El ensayo se llevó a cabo durante cuatro días a 25°C sin luz, y entonces se puntuó la mortalidad y el retraso en el crecimiento. IPD094Aa (SEQ ID NO: 144) fue inactivo contra neonatos de Diabrotica undecimpunctata howardi en concentraciones de hasta 1250 ppm. IPD079Aa se analizó como un lisado transparente con una dosis máxima de IPD079Aa a 50 ppm. Los datos de los polipéptidos IPD079 se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4
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Ejemplo 7 Ensayos de lepidópteros con polipéptidos IPD079 purificados expresados en E. co li
Los ensayos de alimentación de lepidópteros se realizaron con una dieta artificial en una placa de 96 pocilios. La proteína purificada se incorporó a la dieta artificial específica para lepidópteros en una relación de 10 ul de proteína por 40 ul de mezcla de dieta. Se colocaron de dos a cinco larvas neonatas en cada pocillo para alimentar ad libitum durante 5 días. Los resultados se expresaron como positivos para las reacciones de las larvas, tales como el retraso en el crecimiento o la mortalidad. Los resultados se expresaron como negativos si las larvas eran similares al control negativo, que es una dieta de alimentación a la que solo se le aplicó el amortiguador anterior.
El polipéptido IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) se analizó en el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), gusano de maíz (Helicoverpa zea), gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), y gusano cogollero (Spodoptera frugiperda). No se observó actividad contra las especies de lepidópteros ensayadas para el polipéptido IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) a una concentración de hasta 2000 ppm. El lisado transparente del polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) se analizó contra los insectos anteriores y, además, sobre la oruga de la judía de terciopelo (Anticarsia gemmatalis) y el gusano medidor de soja (Pseudoplusia includens). No se observó actividad contra las especies de lepidópteros para ninguno de los homólogos de IPD079Aa a las concentraciones de proteína de hasta 50 ppm.
Ejemplo 8 - Identificación de homólogos de IPD079Aa
La secuencia de aminoácidos del polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) se buscó mediante BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, et al., (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; véase también ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, a la que se puede acceder mediante el prefijo www) frente a las bases de datos públicas e internas de DUPONT-PIONEER que incluían secuencias de proteínas vegetales. Las secuencias de aminoácidos se alinearon con proteínas en una base de datos de proteínas vegetales patentada de DUPONT-PIONEER. Se identificaron homólogos del polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) en Huperzia salvinioides (Id. # PS-9141) y Huperzia nummulariifolium (Id. # PS-9151), y se clonaron por transcripción inversa usando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript® (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa usando un kit de PCR HF Advantage® (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043) con cebadores de SEQ ID NO: 1255 y SEQ ID NO: 1256 para Huperzia salvinioides (Id. # PS-9141) y de Huperzia nummulariifolium (Id. # PS-9151) usando cebadores de SEQ ID NO: 1257 y SEQ ID NO: 1258. Los productos de PCR resultantes se clonaron directamente en el vector plasmídico pCR®-Blunt® II-TOPO® mediante clonación Zero Blunt® TOPO® (Life Technology). La secuenciación del ADN se realizó en clones aleatorios. Se identificaron dos homólogos del polipéptido IPD079 únicos, IPD079Ab (SEQ ID NO: 4) e IPD079Ac (SEQ ID NO: 6), de Huperzia salvinioides (Id. # PS-9141), y se identificaron 24 homólogos de IPD079Ad (SEQ ID n O: 8), IPD079Ae (SEQ ID NO: 10), IPD079Af (SEQ ID NO: 12), IPD079Ag (SEQ ID NO: 14), IPD079Ah (SEQ ID NO: 16), IPD079Ai (SEQ ID NO: 18), IPD079Aj (SEQ ID NO: 20), IPD079Ak (SEQ ID NO: 22), IPD079AI (SEQ ID NO: 26), IPD079Am (SEQ ID NO: 28), IPD079An (SEQ ID NO: 30), IPD079Ao (SEQ ID NO: 32), IPD079Ap (SEQ ID NO: 36), IPD079Aq (SEQ ID NO: 38), IPD079Ar (SEQ ID NO: 40), IPD079As (SEQ ID NO: 44), IPD079At (SEQ ID NO: 46), IPD079Au (SEQ ID NO: 48), IPD079Av (SEQ ID NO: 50), IPD079Aw (SEQ ID NO: 52), IPD079Ax (SEQ ID NO: 54), IPD079Ba (SEQ ID NO: 24), IPD079Bb (SEQ ID NO: 34), IPD079Bc (SEQ ID NO: 42) de Huperzia nummulariifolium (Id. # PS-9151). Los homólogos de IPD079Aa, el material de origen, el identificador de la secuencia codificante del polinucleótido, y el identificador de la secuencia del polipéptido IPD079 se muestran en la Tabla 5. La Tabla 8a-8c muestra una tabla de matriz de relaciones de identidad por pares para alineaciones globales (no se muestran las partes vacías de la tabla de matriz) basada en el algoritmo de Needleman-Wunsch, implementado en el programa Needle (conjunto de herramientas EMBOSS), de los homólogos de IPD079Aa de los Ejemplos 1,8 y 10.
Tabla 5
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Los polinucleótidos IPD079Aa (SEQ ID NO: 1), IPD079Ab (SEQ ID NO: 3), IPD079Ac (SEQ ID NO: 5), IPD079Ad (SEQ ID NO: 7), IPD079Ae (SEQ ID NO: 9), IPD079Af (SEQ ID NO: 11), e IPD079Ba (SEQ ID NO: 23) se clonaron en un vector pET14b (Novagen) con una etiqueta 6x His o un vector pCOLD™ 3 (Clontech, 1290 Terra Bella Ave., Mountain View, CA 94043) para expresión en E. coli. En las constructos ensayados, el polipéptido IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) era soluble y activo frente a WCRW; los polipéptidos IPD079Ab (SEQ ID NO: 4) e IPD079Ac (SEQ ID NO: 6) eran solubles pero no eran activos contra WCRW a las concentraciones ensayadas; los polipéptidos IPD079Ad (SEQ ID NO: 8), IPD079Ae (SEQ ID NO: 10), IPD079Af (SEQ ID NO: 12) e IPD079Ba (SEQ ID NO: 24) no eran solubles.
La búsqueda BLAST también identificó a partir de Selaginella victoriae el polipéptido de SEQ ID NO: 144, denominado aquí como IPD094Aa, que tiene una identidad de secuencia del 21% con IPD079Aa (SEQ ID NO: 2), pero se identificó en base a una homología similar a la perforina. El polipéptido IPD094Aa (SEQ ID NO: 144) está codificado por el polinucleótido de SEQ ID NO: 143.
Ejemplo 9 - Identificación de homólogos de IPD079Ea
Se identificaron homólogos de IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) en Ophioglossum pendulum (Id. # PS-9145) y Platycerium bifurcatum (Id. # PS-9135) y se clonaron por transcripción inversa según las instrucciones del fabricante (sistema de síntesis de primera cadena SuperScript®, Invitrogen), seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (kit de PCR HF Advantage® (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043) usando cebadores de SEQ ID NO: 1251 y SEQ ID NO: 1252 para Ophioglossum pendulum y Platycerium bifurcatum usando cebadores de SEQ ID: 156 y SEQ ID NO: 1252. Los productos de PCR resultantes se subclonaron usando el kit de clonación Gibson Assembly® (New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723) en un vector pET28a con una etiqueta N-terminal 6x His, seguido de la proteína de unión a maltosa de E. coli (Duplay et al. (1984) J. Biol. Chim. 259:10606-10613). Se identificaron seis homólogos únicos de IPD079Ea, IPD079Ec (SEQ ID NO: 60), IPD079Ed (SEQ ID NO: 62), IPD079Ee (SEQ ID NO: 64), IPD079Ef (SEQ ID NO: 66), IPD079Eg (SEQ ID NO: 68), IPD079Eh (SEQ ID NO: 70) a partir de Ophioglossum pendulum (Id. # PS-9145), y se identificó un homólogo IPD079Ea único, IPD079Eb (SEQ ID NO: 58), a partir de Platycerium bifurcatum (Id. #PS-9135).
Los homólogos de IPD079Ea, el material de origen, el identificador de la secuencia codificante del polinucleótido y el identificador de la secuencia del polipéptido IPD079 se muestran en la Tabla 6. La Tabla 9a-9c muestra una tabla de matriz de relaciones de identidad por pares para alineaciones globales (no se muestran las partes vacías de la tabla de matriz) basada en el algoritmo de Needleman-Wunsch, implementado en el programa Needle (conjunto de herramientas EMBOSS), de los homólogos de IPD079Ea de los Ejemplos 4, 9 y 10.
Tabla 6
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Células de E. coli electrocompetente OverExpress™ C41 (DE3) (Miroux B. et al. Journal of Molecular Biology 260:289-298, 1996) (Lucigen Corp. Middleton, WI 53562) se transformaron con cada vector pET, que contenía el inserto génico IPD079Eb (SEQ ID NO: 58), IPD079Ec (SEQ ID NO: 59), IPD079Ee (SEQ ID NO: 63) o IPD079Ef (SEQ ID NO: 65) para expresión de proteína recombinante. Las células de E. coli transformadas se cultivaron durante la noche a 37°C con selección de kanamicina en 3 mililitros de medio 2xYT. Se usó un mililitro de este cultivo para inocular 1 litro de medio 2xYT. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad óptica de alrededor de 0,8, se indujo la expresión de proteínas añadiendo IPTG 1 mM. Las células se cultivaron adicionalmente a 16°C durante 16 horas. Las células se recogieron por centrifugación, y se lisaron en 30 microlitros de Tris 20 mM pH 8 que contenía reactivo de extracción de proteínas bacterianas B-PER® II 1/4X (Life Technologies) suplementado con disolución de lisozima Ready-Lyse™ (Epicentre), endonucleasa OmniCleave™ (Epicentre, 5602 Research Park Blvd., Suite 200, Madison, WI 53719) y cóctel de inhibidor de proteasa Set V (EMD Millipore). El lisado se aclaró por centrifugación. El gen IPD079Ec (SEQ ID NO: 59) no se expresó a niveles suficientemente altos para la determinación de la actividad. Los polipéptidos IPD079Eb (SEQ ID NO: 58), IPD079Ee (SEQ ID NO: 64) e IPD079Ef (SEQ ID NO: 66) fueron activos en el bioensayo de WCRW.
Ejemplo 10 - Identificación de homólogos de IPD079 por identidad de los extremos 5’ y 3’
Para identificar homólogos de IPD079 adicionales, se usaron alineaciones de genes homólogos de IPD079Aa e IPD079Ea identificados en los Ejemplos 1, 4, 8 y 9 para identificar secuencias conservadas cerca de los extremos 5’ y 3’ de las secuencias codificantes. Se diseñaron múltiples cebadores de PCR dentro de estas secuencias conservadas. La transcripción inversa se realizó usando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript® (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante, seguido de una reacción en cadena de la polimerasa usando ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion® (New England BioLabs) de Ophioglossumpendulum (Id. # PS-9145) usando los cebadores 79E_GS_F (SEQ ID NO: 1264), 79_GS_R (SEQ ID NO: 1265), 79E_F1 (SEQ ID NO: 1266), 79E_R1 (SEQ ID NO: 1267), y de Huperzia goebelii (Id.#PS-9149) y Huperzia carinata (Id. # PS-11847) con los F1 (SEQ ID NO: 1259), F2 (SEQ iD NO: 1260), F3 (SEQ ID NO: 1261), R1 (s Eq ID NO: 1262), R2 (SEQ ID NO: 1263). Los productos de PCR resultantes se clonaron directamente en el vector plasmídico pCR®-Blunt II-TOPO® mediante clonación Zero Blunt® TOPO® (Life Technology), y el ADN se secuenció. Se identificaron doce homólogos únicos de IPD079Aa, IPD079Ay (SEQ ID NO: 72), IPD079Az (SeQ ID NO: 74), IPD079Bd (SEQ ID NO: 76), IPD079Be (SEQ ID NO: 78), IPD079Bf (SEQ ID NO: 80), IPD079Bg (SEQ ID NO: 82), IPD079Bh (SEQ ID NO: 84), IPD079Bi (SEQ ID NO: 86), IPD079Bj (SEQ ID NO: 88), IPD079Bk (SEQ ID NO: 90), IPD079BI (SEQ ID NO: 92), IPD079Bm (SEQ ID NO: 94) a partir de Huperzia goebelii (Id. #PS-9149) y Huperzia carinata (Id. #PS-11847). Se identificaron veinticuatro homólogos únicos de IPD079Ea, IPD079Ei (SEQ iD NO: 96), IPD079Ej (SEQ ID NO: 98), IPD079Ek (SEQ ID NO: 100), IPD079EI (SEQ ID NO: 102), IPD079Em (SEQ ID NO: 104), IPD079En (SEQ ID NO: 106), IPD079Eo (SEQ ID NO: 108), IPD079Ep (SEQ ID NO: 110), IPD079Eq (SEQ ID NO: 112), IPD079Er (SEQ ID NO: 114), IPD079Es (SEQ ID NO: 116), IPD079Et(SEQ ID NO: 118), IPD079Eu (SEQ ID NO: 120), IPD079Ev (SEQ ID NO: 122), IPD079Ew (SEQ ID NO: 124), IPD079Ex (SEQ ID NO: 126), IPD079Ey (SEQ ID NO: 128), IPD079Ez (SEQ ID NO: 130), IPD079Eaa (SEQ ID NO: 132), IPD079Eab (SEQ ID NO: 134), IPD079Eac (SEQ ID NO: 136), IPD079Ead (SEQ ID NO: 138), IPD079Eae (SEQ ID NO: 140), IPD079Eaf (SEQ ID NO: 142) a partir de Ophioglossum pendulum. Los homólogos de IPD079, el material de origen, el identificador de la secuencia codificante de los polinucleótidos y el identificador de la secuencia de los polipéptidos de IPD079 se muestran en la Tabla 7.
Las secuencias codificantes de los homólogos de IPD079Ea se amplificaron con los cebadores 79AA_F-2 (SEQ ID NO: 1268), 79AA:5K_F-2 (SEQ ID NO: 1269), 79AA:2V:3N_F-2 (SEQ ID NO: 1270), 79AA_R (SEQ ID NO: 1271), 79EA_F-2 (SEQ ID NO: 1272), 79EA:4K:5T_F-2 (SEQ ID NO: 1273), 79EA_R (SEQ ID NO: 1274), y se subclonaron mediante Gibson Assembly® (New England BioLabs) en el vector pET28a con una etiqueta N-terminal 6x His, seguido de la proteína de unión a maltosa de E. coli (Duplay et al. (1984) J. Biol. Chim. 259:10606-10613), para la expresión en E. coli. Los homólogos de IPD079Aa y los homólogos de IPD079Ea que se muestran en la Tabla 7 se expresaron de forma soluble, y fueron activos contra w CrW en las concentraciones ensayadas, excepto IPD079Bf (SEQ iD NO: 80), IPD079Bk (SEQ ID NO: 90), IPD079Bl (SEQ ID NO: 92), IPD079Bm (SEQ ID NO: 92), e IPD079Ep (SEQ ID NO: 110).
Tabla 7
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Tabla 8a
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Tabla 8b
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Tabla 8c
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Tabla 9a
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Tabla 9b
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Tabla 9c
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Células de E. co lielectrocompetentes OverExpress™ C41 (DE3) (n° de cat. 60341, Lucigen Corp., 2905 Parmenter Street, Middleton, WI) se transformaron con cada vector pET, que contenía el inserto génico IPD079 respectivo para la expresión de proteínas recombinantes. Las células de E. coli transformadas se cultivaron durante la noche a 37°C con selección de kanamicina en 3 mililitros de medio 2xYT. Se usó un mililitro de este cultivo para inocular 1 litro de medio 2xYT. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad óptica de alrededor de 0,8, se indujo la expresión de proteínas añadiendo IPTG 1 mM. Las células se cultivaron adicionalmente a 16°C durante 16 horas. Las células se recogieron por centrifugación, y se lisaron en 30 microlitros de Tris 20 mM pH 8 que contenía reactivo de extracción de proteínas bacterianas B-PER® II 1/4X (Life Technologies) suplementado con disolución de lisozima Ready-Lyse™ (Epicentre), endonucleasa OmniCleave™ (Epicentre) y y cóctel de inhibidor de proteasa Set V (EMD Millipore). Los lisados se aclararon por centrifugación.
Los lisados clarificados se procesaron en un ensayo de dieta para evaluar el efecto de los polipéptidos IPD079 en las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW), (Diabrotica virgifera). Los bioensayos de WCRW se realizaron usando el procedimiento de bioensayo de incorporación en la dieta y/o superposición de dieta. Para los ensayos de superposición de dieta, 15 pl del lisado clarificado se aplicaron tópicamente sobre 65 pl de una dieta larvaria de WCRW artificial modificada (Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos (White Proxi-Plate, n° de catálogo de Perkin Elmer: 6006299), y después se secó al aire. Para los bioensayos incorporados en la dieta, se mezclaron 15 pl de lisado clarificado con 65 pl de dieta larvaria de WCRW artificial modificada (Bio-Serv F9800B) en cada una de las placas de bioensayo de 96 pocillos (White Proxi-Plate, n° de catálogo de Perkin Elmer: 6006299), y después se secó al aire durante un breve periodo. Tanto para el procedimiento de bioensayo de superposición como el de incorporado en la dieta, se colocó un número variable de neonatos de WCRW (Diabrotica virgifera) (de 3 a 10) en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Los ensayos se realizaron durante tres días a 27°C con luz continua, y entonces se puntuaron la mortalidad y el retraso en el crecimiento. Se realizaron de cuatro a ocho repeticiones para cada muestra de proteína, dependiendo de la disponibilidad del volumen de muestra. Cada una de las cuatro u ocho repeticiones se puntuó en una escala de 0 a 3 (0 sin efecto, 1 retraso leve en el crecimiento, 2 retraso severo en el crecimiento, 3 mortalidad) de modo que la puntuación máxima para cada muestra fue 12 (para el ensayo de cuatro repeticiones) y 24 (para ensayos de ocho repeticiones). Se usó la puntuación media o el valor de la puntuación acumulada para diferenciar la actividad. Si una muestra obtuvo un promedio de > 1, se consideró activa a la concentración de proteína analizada en el lisado aclarado.
Ejemplo 11 - Identificación de los HMM de perfiles de perforinas vegetales
IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) y los otros miembros de la familia de polipéptidos IPD079 ejemplificados muestran homología con proteínas del dominio de perforina/complejo de ataque de membrana (MACPF) que tiene el número de identificación de Pfam IPR020864 (Referencia a la base de datos de Pfam: en.wikipedia.org/ wiki/Pfam, a la que se puede acceder usando el prefijo www).
Las perforinas vegetales se identificaron consultando las secuencias de proteínas de los homólogos de IPD079 y Pfam ID# IPR020864 usando BLAST y HMMSearch dentro de una base de datos interna de ensamblajes de transcriptomas de especies vegetales diana. Se generaron traducciones de resultados de HMM del transcriptoma de perforina en los seis marcos, las traducciones fueron de metionina a codón de parada, con un tamaño de proteína de >= 50 aminoácidos. La HMMSearch se repitió en las traducciones resultantes para eliminar las traducciones de marco incorrectas. Los homólogos así identificados se alinearon usando el software MUSCLE (Edgar, Robert C. (2004), Nucleic Acids Research 19; 32(5):1792-7) usando el programa MEGA 6 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis -Tamura K., et al (2013) Mol. Biol. Evol. 30 (12): 2725-2729). El análisis filogenético se realizó con el programa MEGA 6, y el método de Máxima Probabilidad (Jones D.T., et al (1992). Comp Appl Biosci 8: 275-282; Tamura K., et al (2013) Mol. Biol. Evol. 30 (12): 2725-2729). Las ramas del árbol resultante se anotaron y agruparon en cinco clados principales, y se realizaron subalineaciones para cada grupo.
El módulo HMMbuild del paquete de programas HMMER® 3.0 (Finn, R., Nucleic Acid Research 39: Web Server issue W20-W37, 2011) se usó para crear un HMM del perfil para la familia de polipéptidos IPD079, basado en la alineación de secuencias múltiples (MSA), de los homólogos de IPD079 de la descripción, IPD094Aa (SEQ ID NO: 144) de la descripción, y la perforina bacteriana activa AXMI-205 (publicación de patente US 20110023184). Los representantes de cada rama principal se alinearon y usaron para construir el HMM. Los HMM de perfil son modelos estadísticos de múltiples alineaciones de secuencias, o incluso de secuencias únicas. Capturan información específica de la posición sobre cuán conservada está cada columna de la alineación y qué restos son probables. HMMMER® (análisis de biosecuencias usando modelos de Markov de perfil oculto) se usa para buscar homólogos de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias, y para realizar alineaciones de secuencias de proteínas. HMMMER® se puede usar para buscar bases de datos de secuencias con secuencias de consulta única, pero se vuelve particularmente eficaz cuando la consulta es una alineación de secuencias múltiples de una familia de secuencias. HMMMER® crea un perfil de la consulta que asigna un sistema de puntuación específico de la posición para sustituciones, inserciones y eliminaciones. Los perfiles HMMMER® son modelos probabilísticos llamados “modelos de Markov ocultos de perfil” (HMm de perfil) (Krogh et al., 1994, J. Mol. Biol., 235:1501-1531; Eddy, 1998, Curr. Opin. Struct. Biol., 6:361-365.; Durbin et al., Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids. Cambridge University Press, Cambridge UK. 1998, Eddy, Sean R., March 2010, HMMER User's Guide Version 3.0, Howard Hughes Medical Institute, Janelia Farm Research Campus, Ashburn VA, USA; publicación de patente US número US20100293118). En comparación con BLAST, FASTA y otras herramientas de alineación de secuencias y búsqueda en bases de datos basadas en una metodología de puntuación más antigua, HMMER® pretende ser significativamente más preciso y más capaz de detectar homólogos remotos, debido a la solidez de sus modelos de probabilidad subyacentes.
Todas las secuencias de proteínas que coincidían con el HMM de perfil de Pfam ID# IPR020864 con un valor E inferior a 0,01 y con una longitud superior a 250 aminoácidos se consideraron estadísticamente significativas y correspondientes a la familia de genes. Dado que todos los aciertos de proteínas estadísticamente significativos obtenidos son miembros de la familia de genes de perforinas vegetales, se sugiere que el HMM de perfil para perforinas bacterianas activas conocidas sea específico para priorizar la clasificación de las perforinas vegetales e identificar a otros miembros de la familia de perforinas vegetales. Se identificaron los miembros de la familia de las perforinas vegetales de SEQ ID NO: 158 - 1248.
Ejemplo 12 Ausencia de resistencia cruzada de IPD079Aa en la cepa de WCRW resistente a mCrv3A
La cepa de WCRW resistente a mCry3A (RR>92 veces) se desarrolló mediante selecciones de WCRW en plantas de maíz transgénico mCry3A con un nivel de expresión T0 de mCry3A a >10.000 ppm de proteínas totales en raíces seis selecciones en larvas F3, F6, F7, F8, F10 y F12. Se realizaron selecciones adicionales de WCRW en plantas de maíz transgénico mCry3A con un nivel de expresión T0 de mCry3A a >30.000 ppm de proteínas en las raíces antes de que las larvas se usaran para el ensayo de resistencia cruzada de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2). Se utilizaron bioensayos de incorporación en la dieta de WCRW para evaluar los efectos de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) en larvas de WCRW mediante el mismo método que se usó en el Ejemplo 5. La mortalidad de insectos y el retraso en el crecimiento severo se puntuaron y se usaron para calcular las concentraciones inhibidoras (IC50 y LC50) basado en el análisis de probitios. La relación de resistencia (RR) se calculó como sigue: RR = (LC/IC50 de Wc Rw resistente) / (LC/IC50 de WCRW susceptible). Como se muestra en la Tabla 10, los insectos WCRW resistentes a Cry3A eran sensibles a IPD079Aa (SEQ ID n O: 2).
Tabla 10
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Ejemplo 13 Modo de acción
Para comprender el mecanismo de toxicidad del polipéptido IPD079, se evaluó la unión específica de IPD079Aa purificado (SEQ ID NO: 2) e IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) con tejido del intestino medio de WCRW mediante ensayos de competición in vitro. Los intestinos medios se aislaron de larvas de WCRW de tercer estadio para preparar vesículas de membrana de borde en cepillo (BBMV) siguiendo un método modificado de Wolfersberger et al. (Comp Bioch Physiol 86A: 301-308 (1987))), usando la actividad de amino-peptidasa para rastrear el enriquecimiento. Las BBMV representan el componente de la membrana apical del revestimiento celular epitelial del tejido del intestino medio de los insectos, y por lo tanto sirven como un sistema modelo de cómo interactúan las proteínas insecticidas dentro del intestino después de la ingestión.
IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) e IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) recombinantes se expresaron y purificaron a partir de un sistema de expresión de E. coli que utiliza una etiqueta de fusión de polihistidina amino-terminal (6x His). La proteína purificada de longitud completa se marcó con Alexa-Fluor® 488 (Life Technologies), y el fluoróforo no incorporado se separó de la proteína marcada usando resina de intercambio de amortiguador (Life Technologies, A30006) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Antes de los experimentos de unión, las proteínas se cuantificaron mediante densitometría en gel, seguido de la tinción Simply Blue® (Thermo Scientific) de muestras resueltas con SDS-PAGE, que incluyó BSA como patrón.
El amortiguador de unión consistía en cloruro sódico 50 mM, cloruro potásico 2,7 mM, fosfato ácido de disodio 8,1 mM, y fosfato diácido de potasio 1,47 mM, pH 7,5. Para demostrar la unión específica y evaluar la afinidad, las BBMV (5 mg) se incubaron con 1 nM de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) o IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) marcados con Alexa en 100 ml de amortiguador de unión durante 1 hora a TA en ausencia y presencia de concentraciones crecientes de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) o IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) no marcados. Se usó centrifugación a 20.000 g para sedimentar las BBMV para separar la toxina no unida que quedaba en la disolución. A continuación, el pelete de BBMV se lavó dos veces con amortiguador de unión para eliminar la toxina restante no unida. El pelete final de BBMV (con toxina fluorescente unida) se solubilizó en amortiguador de muestra Laemmli reductor, se calentó hasta 100°C durante 5 minutos, y se sometió a SDS-PAGE usando geles de Bis-Tris poliacrilamida al 4-12% (Life Technologies). La cantidad de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) o IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) marcados con Alexa en el gel de cada muestra se midió mediante un sistema de formación de imágenes mediante fluorescencia digital (Image Quant LAS4000 GE Healthcare). Las imágenes digitalizadas se analizaron mediante un software de densitometría (Phoretix 1D, TotalLab, Ltd.)
La afinidad aparente de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) por las BBMV de WCRW se estimó en función de la concentración de proteína sin marcar que se necesitaba para reducir la unión de IPD079Aa marcado con Alexa (SEQ ID NO: 2) en un 50% (valor de EC50). Este valor fue aproximadamente 1 mM para la unión de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) con las BBMV de WCRW (Figura 3).
De manera similar, la afinidad aparente de IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) por las BBMV de WCRW se estimó en función de la concentración de proteína sin marcar que se necesitaba para reducir la unión de IPD079Ea marcado con Alexa (SEQ ID NO: 56) en un 50%. El valor de EC50 para la unión de IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) fue aproximadamente 1,1 pM (Figura 4).
Ejemplo 14 - Constructos de vectores de expresión para la expresión de polipéptidos IPD079 en plantas
Los vectores de expresión vegetales se construyeron para incluir un casete transgénico que contenía uno de dos diseños de genes diferentes que codifican IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) y uno de dos diseños de genes diferentes que codifican IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz en combinación con un elemento potenciador. Las constructos resultantes, PHP68039, PHP68040, PHP76130 y PHP76131, respectivamente, se usaron para generar eventos de maíz transgénico para probar la eficacia contra el gusano de la raíz del maíz proporcionado por la expresión de los polipéptidos IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) e IPD079Ea (SEQ ID NO: 56).
Ejemplo 15 - Transformación de maíz mediada por Agrobacterium, y regeneración de plantas transgénicas
Para la transformación de maíz mediada por Agrobacterium con secuencias nucleotídicas de IPD079, se usó el método de Zhao (patente US número 5.981,840 y publicación de patente PCT número WO 1998/32326). Brevemente, los embriones inmaduros se aislaron del maíz, y los embriones se pusieron en contacto con una suspensión de Agrobacterium en condiciones mediante las que las bacterias sean capaces de transferir los vectores PHP68039, PHP68040, PHP76130 y PHP76131 a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa, los embriones inmaduros se sumergieron en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de la inoculación. Los embriones se co-cultivaron durante un tiempo con la Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este período de co-cultivo, se contempla una etapa opcional de “reposo”. En esta etapa de reposo, los embriones se incubaron en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para la transformación vegetal (etapa 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con antibiótico, pero sin agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo de las células infectadas. A continuación, los embriones inoculados se cultivaron en un medio que contenía un agente selectivo, y se recuperó el callo transformado en crecimiento (etapa 4: etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivaron en medio sólido con un agente selectivo que dio como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. A continuación, el callo se regeneró en plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y los callos se cultivaron en un medio selectivo o se cultivaron en un medio sólido para regenerar las plantas.
Para la detección de las proteínas IPD079 en tejido foliar, se pulverizaron 4 muestras de hojas liofilizadas, y se resuspendieron en 100 pl de PBS que contenía Tween 20 al 0,1% (PBST), beta-mercaoptoetanol al 1% que contenía 1 tableta/7 ml de inhibidor de proteinasa Mini completo (Roche 1183615301). La suspensión se sonicó durante 2 min, y después se centrifugó a 4°C, 20.000 g durante 15 min. A un 1/3 de volumen de alícuota de sobrenadante de amortiguador de muestra LDS NuPAGE® 3X (Invitrogen™ (CA, USA), se añadió B-ME al 1% que contenía 1 tableta/7 ml de inhibidor de proteinasa Mini completo. La reacción se calentó a 80°C durante 10 min, y después se centrifugó. Se cargó una muestra de sobrenadante en geles de Bis-Tris Midi al 4-12% con amortiguador de ejecución MES según las instrucciones del fabricante (Invitrogen™), y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato iBlot® (Invitrogen™). La membrana de nitrocelulosa se incubó durante 2 horas en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 5% antes de la incubación durante la noche en anti-IPD079Aa de conejo purificado por afinidad en PBST durante la noche. La membrana se enjuagó tres veces con PBST, y entonces se incubó en PBST durante 15 min, y después dos veces durante 5 min antes de incubar durante 2 horas en PBST con anti-conejo-HRP de cabra durante 3 horas. Las proteínas detectadas se visualizaron usando reactivos de transferencia Western ECL (GE Healthcare, n° de cat. RPN2106) y película de MR Kodak® Biomax®. Para la detección de la proteína IPD079Aa en las raíces, éstas se liofilizaron, y 2 mg de polvo por muestra se resuspendieron en LDS, se añadió beta-mercaptoetanol al 1% que contenía 1 tableta/7 ml de inhibidor de proteinasa completo Mini. La reacción se calentó a 80°C durante 10 min, y luego se centrifugó a 4°C, 20.000 g durante 15 min. Se cargó una muestra de sobrenadante en geles de Bis-Tris Midi al 4-12% con amortiguador de ejecución MES según las instrucciones del fabricante (Invitrogen™), y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato iBlot® (Invitrogen™). La membrana de nitrocelulosa se incubó durante 2 horas en PBST que contenía leche desnatada en polvo al 5% antes de la incubación durante la noche en anticuerpo anti-IPD079 de conejo policlonal purificado por afinidad en PBST durante la noche. La membrana se enjuagó tres veces con PBST, y después se incubó en PBST durante 15 minutos y entonces dos veces durante 5 minutos antes de incubar durante 2 horas en PBST con anti-conejo-HRP de cabra durante 3 horas. Las proteínas insecticidas unidas a anticuerpos se detectaron usando reactivos de transferencia Western ECL™ (n° de cat. RPN2106 de GE Healthcare) y película de MR Kodak® Biomax®.
Las plantas de maíz transgénicas positivas para la expresión de las proteínas insecticidas se evalúan para determinar la actividad plaguicida usando bioensayos estándar conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, bioensayos de cortes de raíces y bioensayos de plantas enteras. Véanse, por ejemplo, publicación de solicitud de patente US número US 2003/0120054 y publicación internacional número WO 2003/018810.
Ejemplo 16 - Eficacia de efecto invernadero de los eventos del polipéptido IPD079
Los resultados de eficacia de invernadero T0 para los eventos generados a partir de los constructos PHP68039, PHP68040, PHP76130 y PHP76131 se muestran en la Figura 5. La eficacia para los eventos derivados de los 4 constructos se observó con respecto a los eventos del control negativo (Vacío), según se mide por la protección de la raíz frente al gusano de la raíz del maíz occidental. La protección de la raíz se midió de acuerdo con el número de nudos de las raíces dañadas (CRWNIS = puntuación de lesión del nudo del gusano de la raíz del maíz) usando el método desarrollado por Oleson, et al. (2005) [J. Econ Entomol. 98(1 ):1 -8]. La puntuación de lesión de la raíz se mide de “0” a “3”, en la que “0” indica que no hay lesión de raíz visible, “1” indica 1 nudo de daño radicular, “2” indica 2 nudos de daño radicular, y “3” indica un puntuación máxima de 3 nudos de daño radicular. Las puntuaciones intermedias (por ejemplo, 1,5) indican fracciones adicionales de ganglios dañados (por ejemplo, un ganglio y medio lesionado). La Figura 5 muestra que la mayoría de los eventos de PHP68039, PHP68040, PHP76130 y PHP76131) se comportaron mejor que el control negativo, y tienen puntuaciones de lesiones por gusanos de la raíz de < 1,0.
Ejemplo 17 - Polipéptidos IPD079 quiméricos
Para generar variantes activas de IPD079 con secuencias diversificadas, se generaron quimeras entre IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) e IPD079Ea (SEQ ID NO: 56) mediante ensamblaje de superposición de fragmentos de PCR múltiple (Gibson Assembly Cloning Kit, New England Biolabs Inc.). Se construyó un total de 3 quimeras: la Tabla 11 muestra los puntos de cruce, el % de identidad de secuencia con IPD079Aa (SEQ ID NO: 2) y los resultados de la actividad del gusano de la raíz del maíz occidental. Las quimeras designadas como 79Chimera1 (SEQ ID NO: 1277) comienzan con la secuencia IPD079Aa en su extremo N, mientras que las quimeras designadas como 79Chimera2 (SEQ ID NO: 1278) y 79Chimera3 (SEQ ID NO: 1275) comienzan con la secuencia IPD079Ea en sus extremos N. En la Figura 6 se muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de IPD079Aa (SEQ ID NO: 2), IPD079Ea (SEQ ID NO: 56), 79Chimera1 (SEQ ID NO: 1277), 79Chimera2 (SEQ ID NO: 1278) y 79Chimera3 (SEQ ID NO: 1276).
Tabla 11
Figure imgf000076_0001
La descripción anterior de diversos aspectos ilustrados de la descripción no pretende ser exhaustiva ni limitar el alcance a la forma precisa descrita. Aunque se describen aquí aspectos y ejemplos específicos con fines ilustrativos, son posibles diversas modificaciones equivalentes dentro del alcance de la descripción, como reconocerán los expertos en la técnica pertinente. Las enseñanzas descritas aquí se pueden aplicar a otros fines distintos de los ejemplos descritos anteriormente. Numerosas modificaciones y variaciones son posibles a la luz de las enseñanzas anteriores.
Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero se deben permitir algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio; la temperatura está en grados centígrados; y la presión es igual o cercana a la atmosférica.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido insecticida recombinante, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con la longitud total de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,
en el que la actividad insecticida es contra Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
2. El polipéptido insecticida recombinante de la reivindicación 1, en el que el polipéptido insecticida se fusiona con una secuencia señal o un péptido de tránsito de plástido.
3. Un polinucleótido recombinante que codifica el polipéptido insecticida de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
4. El polinucleótido recombinante de la reivindicación 3, en el que el polinucleótido es un polinucleótido no genómico, y preferiblemente el polinucleótido es un ADNc, en el que opcionalmente el polinucleótido es un polinucleótido sintético o tiene codones optimizados para la expresión en un cultivo agrícolamente importante.
5. Un constructo de ADN, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 3 enlazado operativamente a las secuencias reguladoras 5’ y 3’.
6. Una planta o célula vegetal transgénica que comprende el constructo de ADN de la reivindicación 5 como transgén.
7. Una composición que comprende el polipéptido insecticida recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
8. Una proteína de fusión que comprende el polipéptido insecticida recombinante de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la proteína de fusión tiene actividad insecticida contra Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
9. Un método para controlar una plaga de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte), que comprende poner en contacto la población de plaga de insectos con el polipéptido insecticida de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
10. Un método para inhibir el crecimiento o exterminar una plaga o población de plaga de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano norteño de la raíz del maíz), que comprende poner en contacto la plaga de insectos con una composición que comprende el polipéptido insecticida de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en el que la especie o población de plaga es resistente a al menos un polipéptido insecticida Cry.
12. Uso del polipéptido de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 para inhibir el crecimiento o exterminar una plaga o población de plaga de Diabrotica virgifera (gusano de la raíz del maíz occidental) y/o Diabrotica barberi (gusano de la raíz del maíz del norte).
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