ES2940905T3 - Procedimiento para la separación y el aislamiento selectivo fraccionado en tamaño de mezclas de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
- lavado y elución de los ácidos nucleicos aislados después de los pasos a) y c) según métodos conocidos, con el resultado de que los ácidos nucleicos aislados después del paso a) no solo tienen un mayor número de pares de bases que los ácidos nucleicos aislados en el paso c), sino que también se aíslan fracciones de ácido nucleico específicas individuales con un número determinado de pares de bases, tanto después del paso a) como también después del paso c), cuyas fracciones no se aíslan en el otro paso respectivo. Las proporciones de las fracciones de ácido nucleico pueden controlarse mediante la modificación de los valores de pH. se aíslan fracciones de ácido nucleico específicas con un número específico de pares de bases, tanto después del paso a) como también después del paso c), cuyas fracciones no se aíslan en el otro paso respectivo. Las proporciones de las fracciones de ácido nucleico pueden controlarse mediante la modificación de los valores de pH. se aíslan fracciones de ácido nucleico específicas con un número específico de pares de bases, tanto después del paso a) como también después del paso c), cuyas fracciones no se aíslan en el otro paso respectivo. Las proporciones de las fracciones de ácido nucleico pueden controlarse mediante la modificación de los valores de pH. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
^ Procedimiento para la separación y el aislamiento selectivo fraccionado en tamaño de mezclas de ácidos nucleicos
La invención se refiere a un procedimiento novedoso para la separación y el aislamiento fraccionado en tamaño de ácidos nucleicos.
La invención se dirige en particular a aquellas aplicaciones en las que se desea que solo se deban aislar ácidos 0 nucleicos de un espectro de tamaño seleccionado, para que se puedan llevar a cabo de manera más eficiente aplicaciones descendentes específicas. Pero, la invención también es adecuada cuando los usuarios desean analizar diferentes fracciones de ácido nucleico de una muestra.
Para la purificación y recuperación de ácidos nucleicos, en particular de ADN o de fragmentos de ADN, existe hoy en 5 día una pluralidad de kits disponibles comercialmente.
Todos estos procedimientos se basan en un método desarrollado por Vogelstein y Gillespie (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76, 615 - 619) y descrito por primera vez para la purificación preparativa y analítica de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa. El método combina la disolución de la agarosa que contiene la banda de ADN a aislar 0 en una solución saturada de una sal caotrópica (NaJ) con una unión del ADN a partículas de vidrio. El ADN fijado a las partículas de vidrio se lava a continuación con una solución de lavado (20 mM Tris HCl [pH 7,2]; 200 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50% v/v etanol) y finalmente se separa de las partículas de soporte.
El principio físico-químico de esta forma de la unión específica de ácidos nucleicos a materiales de soporte minerales 5 debe consistir a este respecto en la perturbación de estructuras superiores del medio acuoso, a través de las cuales los ácidos nucleicos se adsorben en la superficie de materiales minerales, en particular de partículas de vidrio o de sílice. A este respecto, la perturbación de las estructuras superiores del medio acuoso se produce siempre con la presencia de iones caotrópicos y es casi cuantitativa a altas concentraciones de estos. Desde 1998 se conoce adicionalmente que es posible una unión de ácidos nucleicos a soportes minerales también completamente sin 0 tampones que contienen sales caotrópicas. Así, en el documento de solicitud de patente WO2007/036564 A2 se da a conocer que también los llamados tampones que contienen sales anticaotrópicas permiten una adsorción específica de ácidos nucleicos a soportes minerales, donde el proceso de aislamiento de los ácidos nucleicos se implementa en analogía con el procedimiento conocido sobre la base de una química caotrópica. Esta química de unión también se optimizó y refinó a continuación (WO2007/060248 A1).
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En el documento WO 01/62976 A1 se da a conocer un procedimiento que describe la purificación de ácidos nucleicos a partir de diferentes fórmulas de reacción con adición de diferentes alcoholes, su posterior precipitación en fases sólidas especiales (membranas con características físicas específicas), etapas de lavado con tampones alcohólicos y la elución final de los ácidos nucleicos por medio de agua.
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Asimismo, los documentos de patente US 5405951 A y EP 0512767 B1 describen el aislamiento de ácidos nucleicos mediante incubación de la muestra que contiene ácido nucleico con un alcohol y la posterior incubación de la muestra con un material mineral. La elución de los ácidos nucleicos se realiza a través de la adición de agua calentada a 60 °C.
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En el documento de patente DE 10253351 B4 se da a conocer que la purificación y recuperación de ácidos nucleicos se realiza porque se ajusta la solución que contiene ácido nucleico con aditivos, de modo que contiene cationes monovalentes y multivalentes así como un alcohol, luego se pone en contacto con la fase sólida, lava a continuación eventualmente el soporte dado el caso y separa el ácido nucleico de la fase sólida. Como componentes de sal 0 monovalentes se utilizan cloruro de amonio, cloruro de sodio y/ o cloruro de potasio y como componente de sal multivalente se utilizan cloruro de magnesio, cloruro de calcio, cloruro de zinc y/ o cloruro de manganeso.
Se da a conocer que precisamente la combinación de una sal monovalente y una sal multivalente conduce a que los ácidos nucleicos adsorban en fases sólidas, donde las fuerzas iónicas necesarias para ello solo deben ser muy 5 pequeñas. Esto tiene la ventaja de que, dado el caso, ya no se necesitan las etapas de lavado necesarias hasta ahora y, por lo tanto, los procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos se pueden acortar y simplificar significativamente.
En el documento de solicitud de patente WO2007/065934 A1 se da a conocer un procedimiento que igualmente 0 permite una purificación de fragmentos de ADN de cadena larga y corta, donde mediante el uso de sales del ácido cítrico se utilizan tampones que solo contienen pequeñas fuerzas iónicas, de modo que igualmente ya no son necesarias las etapas de lavado.
Todos estos diferentes procedimientos tienen algo en común. Siempre permiten el aislamiento de un ácido nucleico total contenido en una muestra. Esto significa que si en una muestra se encuentra una mezcla de ácidos nucleicos de cadena larga y corta, entonces siempre se purifica esta mezcla de ácidos nucleicos. No se realiza ninguna separación o extracción diferencial de fragmentos de ácido nucleico de cadena larga y corta o una purificación dirigida de ácidos nucleicos que se encuentran en un espectro de tamaño deseado.
Las cuestiones diagnósticas modernas definen hoy la necesidad de enriquecer o empobrecer selectivamente determinadas fracciones de ácido nucleico a partir de una muestra que contiene ácidos nucleicos o de tener presentes estas fracciones de forma diferenciada. Como fracción de ácido nucleico en el sentido de la presente invención se entiende una fracción de tamaño del ácido nucleico, es decir, ácidos nucleicos de cadena corta, de cadena más larga o de cadena larga.
El enriquecimiento de ácidos nucleicos de cadena corta y, por lo tanto, un empobrecimiento de ácidos nucleicos de cadena más larga y de cadena larga a partir de una muestra desempeña un papel esencial en el diagnóstico prenatal moderno. En este caso se trata de una separación deseada, fraccionada en tamaño del ADN materno libremente circulante del ADN fetal libremente circulante en la sangre de las mujeres embarazadas. El uso de ADN fetal libremente circulante para un diagnóstico prenatal (por ejemplo, detección de trisomías) tiene la ventaja de que no sería necesario un examen invasivo (amniocentesis o biopsia de vellosidades coriónicas), lo que siempre significa un riesgo para el feto en crecimiento. Pero, el experto en la materia también sabe que la proporción de ADN libremente circulante de origen fetal en la sangre de la madre es generalmente mucho menor que la proporción de ADN libremente circulante de la madre. Debido al gran exceso de ADN materno, el estudio de las secuencias de destino del feto es claramente más difícil, esto en particular en la secuenciación del ADN.
Además, la proporción de ADN libremente circulante siempre es muy pequeña, lo que dificulta adicionalmente un diagnóstico, ya que no siempre se puede proporcionar una cantidad suficiente de ADN. Aquí sería deseable poder utilizar más volumen de muestra para una extracción. Además del diagnóstico prenatal, el aislamiento del ácido nucleico libremente circulante de los fluidos corporales desempeña un papel cada vez más importante. Esto se refiere al diagnóstico molecular de tumores, el estudio de las reacciones de rechazo de trasplantes y mucho más. También en estos campos de investigación es cada vez más interesante poder llevar a cabo una extracción selectiva, fraccionado en tamaño de ácidos nucleicos a partir de una muestra. A su vez, también es importante que se puedan aislar cantidades suficientes de ácidos nucleicos y, por este motivo, procesar volúmenes de muestra más grandes de forma sencilla y rápida. También es importante investigar en general cómo se representa la distribución de tamaño de los ácidos nucleicos en una muestra, ya que se pueden extraer conclusiones sobre el origen del ADN libremente circulante.
En el documento WO2009/146776 A2 se da a conocer un procedimiento que describe el aislamiento/ purificación de ácidos nucleicos de cadena corta a partir de un material de partida que contiene ácido nucleico.
A este respecto, se utilizan dos variantes. La purificación de ácidos nucleicos en particular de cadena corta se realiza porque el material de partida se pone en contacto con un compuesto caotrópico, con isopropanol, así como con un material de soporte que se une al ácido nucleico. A este respecto, el alcohol debe estar presente en una concentración de > 5% (v/v) y menor o igual de < 40% (v/v). De este modo, los ácidos nucleicos de cadena corta se deben unir de manera más eficiente al material de soporte. Los ácidos nucleicos unidos pueden permanecer en el material de soporte, pero también se pueden eluir. Según los datos del documento, los ácidos nucleicos de cadena corta se deben purificar de forma especialmente eficiente en estas condiciones de unión (combinación de compuesto caotrópico con isopropanol) e incluso ser posible un enriquecimiento de ácidos nucleicos de cadena corta frente a ácidos nucleicos de cadena más larga. Pero, el procedimiento no describe una separación real de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena más larga. Todas las fracciones se purifican. Para llevar a cabo una separación de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena larga, se describe un segundo procedimiento en este documento. En este procedimiento, el material de partida se pone en contacto con un compuesto caotrópico, con un alcohol ramificado y/o no ramificado, así como con un material de soporte que se une a ácidos nucleicos, donde el alcohol está presente en una concentración de < 30% (v/v). Luego, el paso o sobrenadante de la primera etapa se pone en contacto con un compuesto caotrópico, con un alcohol ramificado y/ o no ramificado, así como con un material de soporte de unión a ácido nucleico, donde el alcohol que se une a ácidos nucleicos en una concentración de > 5% (v/v). Se expone que en las condiciones de la combinación de un material de soporte que se une a ácidos nucleicos con un compuesto caotrópico y un alcohol con una concentración de aprox. el 25% conduce a que los ácidos nucleicos de cadena larga y más larga se unen preferiblemente, mientras que los ácidos nucleicos de cadena corta solo se unen muy mal y, por lo tanto, se encuentran en el paso / sobrenadante, a partir del que se pueden aislar según el procedimiento descrito. También esta segunda vía de procedimiento describe solo una separación de ácidos nucleicos de cadena más larga. No hay evidencia de que se pueda llevar a cabo un aislamiento fraccionado de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena larga / más larga. Además, el procedimiento no permite ningún aislamiento del ácido nucleico total y una
posterior separación de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena larga / más larga. Para el enriquecimiento de ácidos nucleicos de cadena corta es decisiva la combinación de un compuesto caotrópico con preferentemente isopropanol.
En el documento de patente DE102006045391 B4 se describe igualmente un procedimiento que es adecuado para la separación de ácidos nucleicos de cadena larga y corta de una mezcla que contiene estos ácidos nucleicos. A este respecto, la separación no se realiza mediante un cambio de las condiciones de unión, sino a través de un paso sucesivo de la muestra puesta en contacto con un compuesto caotrópico a través de dos fases de dióxido de silicio, que presentan dos tamaños de poro diferentes. Después de pasar dos veces por la muestra a través de la fase de dióxido de silicio 1 y después de pasar dos veces por la muestra a través de la fase de dióxido de silicio 2, los fragmentos de ácido nucleico están separados en la forma en que se unen a la primera fase fragmentos de ácido nucleico, que son al menos 20.000 pares de bases, y se unen a la segunda fase fragmentos de ácido nucleico de un máximo de 10.000 pares de bases. Por lo tanto, este procedimiento no es adecuado para la separación de ácidos nucleicos de cadena corta y larga, como es precisamente el objetivo de la presente invención.
El documento WO 2004/042058 A2 pertenece igualmente al estado de la técnica. Allí se da a conocer que el valor de pH de los tampones de unión utilizados posee una influencia esencial tanto en el rendimiento de los ácidos nucleicos a obtener como también en una selectividad frente a las longitudes de fragmento de, por ejemplo, productos de PCR a purificar. A este respecto, no es necesario combinar entre sí sales monovalentes y multivalentes en una solución. Preferiblemente se usan sales de Mg o Ca divalentes y especialmente preferentes. En el caso de tampones de unión sin alcohol, pero con cationes divalentes - se produce una recuperación de fragmentos de ADN en cantidades cuantitativas y a través del espectro de tamaño de 100 pb a 10.000 pb preferiblemente a un valor de pH de >8,5. La presente invención se basó en el objetivo de eliminar las desventajas de las soluciones descritas en el estado de la técnica.
El objeto se soluciona según las características de las reivindicaciones.
Según la invención, se proporcionó un procedimiento que permite purificar o aislar selectivamente diferentes fracciones de tamaño del ADN a partir de una muestra que contiene una mezcla de ácidos nucleicos de cadena corta y más larga / de cadena larga (en particular ADN) y, por lo tanto, tener estas fracciones disponibles para otras aplicaciones. Además, se proporcionó un procedimiento que permite separar selectivamente ácidos nucleicos de cadena corta de ácidos nucleicos de cadena larga a partir de una muestra que contiene una mezcla de ácidos nucleicos de cadena corta y más larga / larga (ADN), donde el espectro de tamaño de la fracción respectiva es ajustable (por ejemplo, separación de ADN que es de menos de 500 pares de bases de ADN que es de más de 500 pares de bases). La fracción no deseada en cada caso se puede desechar entonces, mientras que se sigue trabajando con la fracción deseada.
Además, se proporcionó un procedimiento que permite concentrar a partir de una muestra de gran volumen (por ejemplo, plasma, suero, orina u otros líquidos corporales sin células) ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena larga / más larga y, a continuación, como se describe en el punto 1 o el punto 2, llevar a cabo una separación selectiva fraccionada en tamaño de los ácidos nucleicos.
La presente invención se basó en una observación de que el aislamiento de fragmentos de ADN de cadena corta (fragmentos de ADN menores de 500 pb) a partir de una fórmula de reacción de PCR es siempre más problemático si el tampón de amplificación utilizado presenta un alto valor de pH y si se utiliza una solución de un tampón caotrópico para la purificación.
La causa parece ser que un valor de pH más alto influye significativamente en la unión, en particular de ácidos nucleicos de cadena corta a materiales de soporte minerales. Si esta fuera la causa, entonces existiría la posibilidad de poder ajustar mediante el cambio del valor de pH condiciones de unión que pudieran permitir una unión selectiva de ácidos nucleicos de cadena corta o de cadena más larga / de cadena larga.
A diferencia del procedimiento, que se describió en el documento WO 2004/042058 A2, no son necesarios cationes divalentes o multivalentes ni una combinación de cationes monovalentes y divalentes para el aislamiento de los ácidos nucleicos de diferente longitud.
Con el procedimiento según la invención se puede conseguir exactamente esto de forma muy eficiente. Además, las condiciones de unión se pueden ajustar de forma tan flexible que se puede efectuar de facto cualquier fraccionamiento de tamaño de ácidos nucleicos. Por lo tanto, el procedimiento según la invención permite purificar o aislar selectivamente diferentes fracciones de tamaño del ADN de una muestra que contiene una mezcla de ácidos nucleicos
de cadena corta y más larga / de cadena larga (ADN) o también eliminar selectivamente determinadas fracciones de tamaño. El desarrollo del procedimiento se basa en que una mezcla de ácidos nucleicos de cadena corta y más larga / de cadena larga se pone en contacto con una solución que contiene una sal caotrópica. Para conseguir una unión selectiva de ácidos nucleicos de cadena corta o de cadena más larga / de cadena larga, el valor de pH de esta mezcla se ajusta de forma variable. Se muestra que a un valor de pH de 6 o 7 se unen tanto ácidos nucleicos de cadena corta como también de cadena más larga / de cadena larga de forma muy eficiente a un material de soporte mineral (por ejemplo material de filtro de fibra de vidrio). Después de la unión de los ácidos nucleicos a un material mineral (por ejemplo, columna de centrifugación con material de fibras de vidrio), el material de soporte se lava con tampón de lavado y, finalmente, después de la adición de agua u otro tampón de baja sal, la fracción de ácido nucleico unida se eluye del soporte. Sorprendentemente se muestra que un aumento del valor de pH de la mezcla de la muestra y de la solución acuosa de una sal caotrópica modifica el espectro de tamaño de los ácidos nucleicos que se unen al soporte. Un aumento sucesivo del valor de pH provoca que primero los ácidos nucleicos de cadena corta ya no se unan y a continuación tampoco se unan los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga y solo queden ácidos nucleicos de cadena larga en el soporte. A este respecto, este fraccionamiento se puede ajustar de forma flexible. Finalmente, en el material de soporte no se unen ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga o incluso solo de cadena larga y ácidos nucleicos de cadena corta o de cadena corta / de cadena más larga. Los ácidos nucleicos unidos se pueden purificar y aislar entonces. Pero, son de mucho mayor interés precisamente las aplicaciones que tienen como objetivo empobrecer ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga a partir de una mezcla que contiene ácidos nucleicos de cadena corta así como de cadena más larga / de cadena larga y aislar los ácidos nucleicos de cadena corta. Precisamente este objetivo se puede lograr de forma sencilla y eficiente con el procedimiento según la invención. Después del ajuste del valor de pH en la mezcla de muestra y solución caotrópica, los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga se unen a un primer material de soporte. La fracción no unida de ácidos nucleicos se encuentra entonces en cada caso en el filtrado.
El aislamiento de los ácidos nucleicos de cadena corta que se encuentran en el filtrado se realiza por medio del procedimiento según la invención de la siguiente manera. El filtrado se mezcla ahora con una solución acuosa cuyo pH es menor que el pH presente en la solución que se utilizó para la primera reacción de unión. Esto se puede realizar mediante la adición de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, de la clase de los alquilglicósidos o etoxilatos de octilfenol, o con un alcohol o una mezcla de tensioactivo no iónico y alcohol, o con una mezcla de un compuesto caotrópico y un tensioactivo no iónico, etc. A este respecto, solo es importante que las condiciones de unión resultantes se modifiquen de modo que la fracción de ácido nucleico contenida en el filtrado se una de forma eficiente a un segundo material de soporte.
A continuación, la mezcla se pone en contacto con un segundo soporte que se une a ácidos nucleicos (por ejemplo, una columna de centrifugación con material de fibras de vidrio), luego se lava y finalmente el ácido nucleico se eluye del soporte mediante la adición de agua o un tampón de baja sal.
Se muestra que las condiciones de unión se modifican de modo que ahora los ácidos nucleicos de cadena corta contenidos en el filtrado o, dado el caso, los ácidos nucleicos de cadena corta / de cadena más larga se unen de forma eficiente al material de soporte - la fracción de ácido nucleico, que no se ha unido al primer material de soporte. Por lo tanto, la presente invención se basa en una interacción variable del cambio flexible de las condiciones de unión, que están presentes para la adsorción de ácidos nucleicos en un primer material de soporte y las condiciones de unión, que están presentes para la adsorción de ácidos nucleicos en el segundo material de soporte. Las condiciones de unión para el primer material de soporte se configuran de modo que, según el deseo, los ácidos nucleicos de cadena corta o de cadena más larga o de cadena larga se unen al primer material de soporte. Las fracciones no unidas de los ácidos nucleicos se encuentran entonces en el filtrado después de la realización de la etapa de extracción. Las condiciones de unión se ajustan ahora mediante la adición de soluciones, de modo que estos ácidos nucleicos se unen ahora al segundo material de soporte.
Sorprendentemente, también se muestra que el fraccionamiento de tamaño no es un enriquecimiento / empobrecimiento porcentual de determinados tamaños de fragmento en un 20%, 50% o 60%, como se describe esto en el documento EP2128169A1 citado, sino que esta separación también se puede lograr casi cuantitativamente (al 99%).
Por medio del procedimiento según la invención se pueden aislar por separado de forma selectiva y flexible dos fracciones de ácido nucleico y están presentes en paralelo. Si no se desean tener ambas fracciones, sino solo una fracción, entonces se puede desechar el material de soporte respectivo y se trabaja solo con el material de soporte en el que se encuentra la fracción de ácido nucleico deseada. Por lo tanto, se puede ajustar y realizar el enriquecimiento / empobrecimiento deseado de una fracción de tamaño de ácido nucleico seleccionada de forma sencilla y eficiente.
Pero, la presente invención del fraccionamiento de tamaño selectivo de mezclas de ácidos nucleicos también permite procesar directamente una muestra biológica que contiene diferentes fracciones de ácidos nucleicos. En particular, los
fluidos corporales libres de células (suero, plasma, orina, etc.) son muestras iniciales importantes, ya que se desea aislar de forma eficiente el llamado ADN libre de células circulantes. Como ya se ha mencionado, aquí es importante, por ejemplo, empobrecer ácidos nucleicos de cadena larga de la muestra y purificar de forma eficiente ácidos nucleicos de cadena corta (por ejemplo, lograr una separación del ADN materno y fetal para un diagnóstico prenatal). El procedimiento según la invención también permite el procesamiento directo de tales muestras. Para ello, la muestra se mezcla con un tampón de lisis / unión, que consiste en la combinación según la invención de una solución caotrópica con un valor de pH ajustado de forma específica y flexible. También en este caso, a través de las modificaciones del valor de pH (cuanto mayor sea el valor de pH a una concentración de sal constante, tanto menos eficientemente se unen los ácidos nucleicos de cadena corta o luego siguiendo de cadena más larga y de cadena larga) se puede ajustar de modo tan flexible que se puede definir un fraccionamiento de tamaño deseado. Después de una lisis breve de la muestra inicial, la muestra se pone en contacto con un soporte que se conecta a ácidos nucleicos (por ejemplo, columna de centrifugación con material de fibras de vidrio). A este respecto, los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga se unen a este soporte, los de cadena corta se encuentran en el filtrado. La columna de centrifugación se puede desechar ahora o se lava según el desarrollo de procedimiento ya descrito y los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga unidos se eluden del soporte y luego están disponibles para otras aplicaciones. El filtrado se trata entonces con otra solución de modo que el valor de pH resultante ahora era menor que el valor de pH del filtrado antes de la adición de esta solución. Esto se puede realizar, como ya se ha expuesto, mediante la adición de un tampón Tris o mediante la adición de una solución salina o un detergente o un alcohol o también a partir de mezclas de estos componentes. Esta solución posibilita a continuación la unión de los ácidos nucleicos contenidos en el filtrado al segundo material de soporte.
Después de los pasos de lavado, los ácidos nucleicos de cadena corta se eluyen y se pueden analizar. Por medio del procedimiento según la invención es posible, por lo tanto, empobrecer de forma eficiente los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga de la muestra y aislar de forma eficiente los ácidos nucleicos de cadena corta. El procedimiento según la invención se demuestra especialmente significativo por el hecho de que también es posible procesar muestras biológicas de gran volumen de modo que es posible un fraccionamiento de tamaño de ácidos nucleicos. En este caso, una vez más, el estudio de los fluidos corporales libres de células es de creciente interés. Como ya se ha descrito, los ácidos nucleicos circulantes son muy interesantes para una pluralidad de problemas de diagnóstico. Sin embargo, la cantidad de este ADN circulante sin células es muy pequeña, de modo que la posibilidad del procesamiento de grandes volúmenes de muestra es muy deseable, ya que con esto se puede lograr un aumento significativo en los rendimientos de ADN. El documento de solicitud de patente (WO2009/055596) describe un procedimiento eficiente y muy sencillo para el enriquecimiento de ADN libre de células a partir de muestras de gran volumen. Para este enriquecimiento y posterior purificación del ADN libre de células, también hay un kit disponible comercialmente (PME free-circulating DNA Extraction Kit; Analytik Jena AG). Sin embargo, este procedimiento solo permite la purificación del ADN total circulante sin células. No permite una separación de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena larga. Aquí la presente invención ofrece una solución. Así, es posible combinar la etapa de enriquecimiento para ADN libre de células con un fraccionamiento de tamaño posterior de ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena más larga / de cadena larga. Por primera vez existe la posibilidad de procesar grandes volúmenes de muestras y también de permitir un fraccionamiento de tamaño. Para la realización posterior del procedimiento según la invención se realiza a este respecto en una primera etapa el enriquecimiento del ADN total sin células de una muestra. Para ello se añade a la muestra una solución acuosa de alginato y una solución acuosa que contienen sales de cationes divalentes o polivalentes (por ejemplo cloruro de calcio o cloruro de aluminio). Después de una breve centrifugación se retira el sobrenadante de gran volumen y se continúa trabajando con el pellet resultante. En este pellet se encuentra el ADN total libre de células.
El pellet se disuelve ahora con un tampón y a continuación se ajustan las condiciones que permiten una adsorción eficiente del ADN total sin células enriquecido a un primer material de soporte (por ejemplo, columna de centrifugación con material de fibras de vidrio). Después de las etapas de lavado, el ADN total libre de células se eluye a través de este primer material de soporte. En el eluido resultante se encuentran con ello ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena más larga / de cadena larga. De este eluido se recoge un pequeño volumen. El volumen restante se sigue mecanizando ahora según el procedimiento según la invención ya descrito. Para el eluido se añade una solución caotrópica, cuyo valor de pH se ajusta conforme la invención de modo que una fracción de ácido nucleico deseada (ácido nucleico de cadena más larga / de cadena larga) se une al segundo material de soporte (mediante el ajuste del valor de pH se determina qué longitudes de fragmento del ADN total se unen al material de soporte o qué fracción no se une y, por lo tanto, se encuentra entonces en el filtrado). A continuación, esta fórmula se pone en contacto con un soporte que se conecta a ácidos nucleicos (por ejemplo, una columna de centrifugación con un material de fibras de vidrio). Luego, el material de soporte se lava con tampones de lavado y, finalmente, después de la adición de agua u otro tampón de baja sal, la fracción de ácido nucleico unida se eluye del soporte. Este segundo eluido contiene ahora según la invención la fracción del ácido nucleico de cadena más larga / de cadena larga. El aislamiento de los ácidos nucleicos de cadena corta que se encuentran en el filtrado se realiza entonces a su vez mediante la adición de una solución que presenta un valor de pH más bajo que el valor de pH que existía para la unión previa al material de soporte. Ahora, según la invención, se garantiza que los ácidos nucleicos que se encuentran en el filtrado se puedan
unir de forma eficiente a un tercer material de soporte y aislarse.
A continuación, la mezcla se pone en contacto con un tercer soporte que se conecta a ácidos nucleicos (por ejemplo, una columna de centrifugación con material de fibras de vidrio), luego se lava y finalmente se eluye el ácido nucleico del soporte mediante la adición de agua o un tampón de baja sal. Por lo tanto, en este eluido se tiene la tercera fracción - los ácidos nucleicos de cadena corta. El procedimiento según la invención permite por primera vez que a partir de una muestra se proporcionen simultáneamente y en paralelo tres fracciones de ácidos nucleicos diferentes. Estas diferentes facciones se pueden investigar ahora.
La invención se explica a continuación mediante ejemplos de realización.
Pero, a este respecto, los ejemplos de realización no representan una limitación de la invención.
Explicación de las figuras
La figura 1 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica).
La figura 2 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica solución Tris pH 6.0).
La figura 3 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica solución Tris pH 7.0).
La figura 4 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica solución Tris pH 7.5).
La figura 5 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica solución Tris pH 8.0).
La figura 6 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra solución salina caotrópica solución Tris pH 9.0).
La figura 7 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (muestra con los tres fragmentos de ADN diferentes). La figura 8 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (eluido de la primera fracción con los fragmentos de ADN de cadena más larga).
La figura 9 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (eluido de la segunda fracción con el fragmento de ADN de cadena corta).
Ejemplo de realización 1
Aislamiento selectivo fraccionado en tamaño de ADN directamente de una muestra de plasma
El objetivo del ejemplo era mostrar que también a partir de una muestra biológica es posible directamente un aislamiento fraccionado en tamaño del ADN, es decir, que es posible separar de forma eficiente ácidos nucleicos de cadena corta de ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga y procesar ambas fracciones en paralelo o, si solo se desea una fracción, eliminar de forma eficiente la otra fracción de la muestra para que esta no tenga una influencia perturbadora sobre aplicaciones específicas.
Las muestras iniciales fueron respectivamente 200 pl de una muestra de plasma, que contiene fragmentos de ácido nucleico de cadena corta (51 pb, 77 pb, 103 pb, 149, pb, 199, pb, 298, pb) así como un fragmento de cadena más larga de 1118 pb. Se debe mostrar que la fracción de cadena corta se puede separar de la fracción de cadena más larga.
Las muestras se mezclaron con 300 pl de un compuesto caotrópico (isotiocianato de guanidina 4M, 5 mM Tris HCl, pH 7.5). A la muestra se añadió además un tensioactivo no iónico de la clase de los alquilglucósidos y 20 pl de proteinasa K (20 mg/ ml). La muestra se lisó durante 15 min a 70 °C. Para ajustar el valor de pH necesario para la separación selectiva prevista de los fragmentos de ácido nucleico se añadieron a la solución 4 pl de una solución de Tris-HCl pH 8. Luego, la fórmula se centrifugó sobre una primera columna de centrifugación (con material de fibras de vidrio). El filtrado se mezcló con 400 pl de una mezcla de un compuesto caotrópico y un tensioactivo no iónico de la clase de los glucósidos de alquilo (isotiocianato de guanidina 4M / tensioactivo no iónico al 30%) para preparar las condiciones de unión específicas para la adsorción de los fragmentos de ácido nucleico de cadena corta que se encuentran en el filtrado. Esta fórmula se transfirió a una segunda columna de centrifugación (con material de fibras de vidrio) y se centrifugó.
Ambas columnas de centrifugación se lavaron entonces con tampones de lavado que contienen etanol y finalmente se eluyó el ácido nucleico unido con agua.
La detección de los fragmentos de ADN aislados se realizó a su vez por medio de un bioanalizador Agilent utilizando
el kit de ADN 7500. La evaluación muestra que es posible una separación fraccionada en tamaño del ADN directamente a partir de una muestra biológica. En este ejemplo, las condiciones de unión para la primera columna de centrifugación y para la segunda columna de centrifugación se ajustaron de modo que los fragmentos, los fragmentos de ácido nucleico de cadena corta, no se unieron a la primera columna y estos fragmentos de cadena más corta están entonces en el filtrado y se pueden aislar a través de la segunda columna de centrifugación. Por lo tanto, se pudo demostrar que los ácidos nucleicos de cadena más larga se pueden eliminar de forma eficiente de una muestra o, dependiendo del objetivo, ambas fracciones se procesan en paralelo y están disponibles. Los análisis del bioanalizador Agilent están representados en las figuras 10 y 11 siguientes.
La figura 10 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (eluido de la primera fracción con el fragmento de ADN de cadena más larga).
La figura 11 muestra un análisis del bioanalizador Agilent (eluido de la segunda fracción con los fragmentos de ADN de cadena corta).
Ejemplo de realización 2
Enriquecimiento de ADN libre de células a partir de la muestra de plasma humano y posterior separación selectiva de los ácidos nucleicos de cadena corta y de cadena más larga / de cadena larga, aislamiento diferenciado de las dos fracciones y medición del empobrecimiento de los ácidos nucleicos de cadena corta de los ácidos nucleicos de cadena más larga / de cadena larga por medio de PCR en tiempo real. Representación de la influencia de un aumento sucesivo del valor pH para la unión selectiva a la primera columna de filtro y al filtrado correspondiente.
El material de partida fue una muestra de plasma humano de 1 ml. El enriquecimiento de los fragmentos de ADN se realizó por medio de un kit disponible comercialmente (PME free-circulating DNA Extraction Kit; Analytik Jena AG) según las indicaciones del fabricante. Después de la etapa de enriquecimiento, el ácido nucleico total sin células se aisló según las instrucciones del fabricante.
El eluido con el ácido nucleico total aislado se empleó entonces para la separación selectiva de la fracción de ácido nucleico de cadena corta de la de cadena más larga / de cadena larga. Se probaron 4 fórmulas diferentes. Las condiciones de unión se eligieron de modo que a la primera columna de centrifugación se debían unir cada vez menos eficientemente también los ácidos nucleicos de cadena más larga a través de un aumento sucesivo del valor de pH, de modo que de este modo también se encuentran ácidos nucleicos de cadena más larga en el filtrado y, en última instancia, estos se debían unir a continuación a la segunda columna.
El eluido (40 pl) obtenido después del enriquecimiento y la extracción con el ácido nucleico total en ADN libre de células se mezcló con 400 pl de un compuesto caotrópico (isotiocianato de guanidina 4M; 5 mM Tris HCl, pH 7.5). Para influir en el valor de pH se efectuó la adición de 1 pl de 0.1N NaOH (muestra 1), 5 pl de 0.1N NaOH (muestra 2), 10 pl de 0.1N NaOH (muestra 3), 20 pl de 0.1N NaOH (muestra 4).
Luego, la fórmula se centrifugó sobre una primera columna de centrifugación (con material de fibras de vidrio). Se ha guardado la columna de centrifugación. Para aislar el ADN de cadena corta, el filtrado se mezcló con 400 pl de una mezcla de un compuesto caotrópico y un tensioactivo no iónico de la clase de los glucósidos de alquilo (isotiocianato de guanidina 4M / tensioactivo no iónico al 30%, 50 mM Tris HCl, 6.0) y esta fórmula se transfirió a una segunda columna de centrifugación (con material de fibras de vidrio) y se centrifugó. A continuación, las dos columnas de centrifugación se lavaron con un tampón de lavado alcohólico, se secaron mediante una etapa de centrifugación y el ácido nucleico unido se eluyó mediante la adición de agua.
Las fracciones de ácido nucleico eluidas se probaron entonces en una PCR en tiempo real.
Para ello, se realizó una PCR en tiempo real basada en SybrGreen para amplificar un fragmento de citocromo b de aprox. 1 kb. Ambas fracciones de eluido de las dos muestras se utilizaron para la PCR.
Los iniciadores PCR utilizados:
CyB S: CCA GCY CCA TCA AAC ATC TCA KCA TGA TG CyB AS: TTG GCT GAG TGG TCG GAA TAT TAT GCT KCG TTG YTT
Fórmula de reacción (amplificación/ hibridación)
Por muestra:
Iniciador sentido (50 pmol/pl) 0,1 pl
Iniciador antisentido (50 pmol/pl) 0,1 pl
SyGreen MasterMix (AJ) 7,5 pl
Grado PCR H2O ad. 15 pl
La PCR se llevó a cabo en un ciclador de PCR en tiempo real disponible en el mercado: Condiciones de amplificación Etapa 1: Desnaturalización 95°C 120"
Etapa 2 Amplificación 45 ciclos
95°C 4"
55°C 40"
A continuación se llevó a cabo un análisis de la curva de fusión para demostrar la especificidad de amplificación. Los resultados de PCR están representados gráficamente en la fig.12. Cuanto menores sean los valores de Ct, mayor será la proporción de la fracción de ácido nucleico respectiva en la muestra. Se puede ver claramente cuán eficientemente se pueden eliminar los ácidos nucleicos de cadena más larga de la fracción de cadena corta.
Así, la proporción de ácidos nucleicos de cadena más larga en la muestra 1 es solo del 1%, es decir, se tiene un empobrecimiento de más del 99%. También se puede ver claramente cómo las proporciones de los ácidos nucleicos de cadena más larga se desplazan a la fracción 2 cuando se aumenta sucesivamente el valor de pH para la unión a la primera columna.
La figura 12 muestra la representación de los valores de Ct.
Definiciones:
Sustancias o sales caotrópicas:
Sustancias que destruyen la estructura regular del agua líquida, basada en la formación de enlaces por puente de hidrógeno, impidiendo la formación de las estructuras de la jaula de H2O necesarias para la solvatación. Ejemplos de componentes caotrópicos son tiocianatos, yoduros o percloratos. Provocan la desnaturalización de proteínas, el aumento de la solubilidad de sustancias no polares en agua y la destrucción de la interacción hidrofóbica.
Alcoholes alifáticos
Los alcoholes alifáticos en el sentido de esta descripción de patente y reivindicaciones son todos los alcoholes que llevan su grupo OH en un átomo de C alifático, con la excepción de aminoalcoholes como TRIS.
Claims (9)
1. Procedimiento para el aislamiento fraccionado dependiente del tamaño de ácidos nucleicos a partir de una mezcla de ácidos nucleicos con un número diferente de pares de bases (pb), caracterizado por las siguientes etapas:
a) a un volumen de la mezcla de ácidos nucleicos - en ausencia de alcoholes alifáticos - se añade un primer tampón de unión que contenga al menos una sal caotrópica y al menos una sustancia que aumenta el valor de pH del tampón de unión;
b) unión a una fase sólida y separación de los ácidos nucleicos unidos por la etapa a)
c) el filtrado de la etapa a) se mezcla con un segundo tampón de unión que contiene un tensioactivo no iónico o con un alcohol
o una mezcla de tensioactivo no iónico y alcohol,
d) unión a una fase sólida y separación de los ácidos nucleicos unidos por la etapa c)
e) lavado y elución de los ácidos nucleicos aislados según las etapas a) y c) según procedimientos conocidos, resultando que los ácidos nucleicos que se han aislado después de la etapa a) no solo presentan un mayor número de pares de bases que los ácidos nucleicos aislados en la etapa c), sino que tanto después de la etapa a) como también después de la etapa c) se aíslan fracciones de ácido nucleico individuales, determinadas con un cierto número de pares de bases que no se aíslan en la otra etapa respectivamente.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo tampón de unión contiene al menos una sustancia caotrópica.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza isotiocianato de guanidina 4M como sal caotrópica y NaOH como sustancia que aumenta el valor de pH del tampón de unión.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque
como alcoholes se utilizan alcoholes alifáticos y como tensioactivo no iónico una sustancia de la clase de los alquilglucósidos o etoxilatos de octilfenol.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 , caracterizado porque el tamaño de los ácidos nucleicos (número de pares de bases), que se aíslan después de la etapa 1a), se controla mediante el aumento gradual del valor de pH del tampón de unión según la etapa 1a), donde con un valor de pH creciente se pueden separar menos ácidos nucleicos de cadena corta (número menor de pares de bases).
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizado porque el tamaño de los ácidos nucleicos (número de pares de bases) que se aíslan de la etapa 1c), se controla mediante la adición de un tensioactivo no iónico o un alcohol o una mezcla de tensioactivo no iónico y alcohol al primer tampón de unión según 1a), donde con una concentración creciente de las sustancias añadidas se pueden separar más ácidos nucleicos de cadena corta (menor número de pares de bases).
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque antes del fraccionamiento en una muestra de cualquier volumen se concentra en primer lugar el ácido nucleico total según un procedimiento conocido y a continuación se fraccionan los ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Uso del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el aislamiento de fracciones de ácido nucleico de una mezcla de ácidos nucleicos con un número diferente de pares de bases (pb), con el siguiente tamaño:
a) aprox. menor o igual a 110 pb o
b) aprox. menor o igual a 250 pb o
c) aprox. mayor o igual a 550 pb o
d) mayor o igual a 1.000 pb
9. Uso del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el fraccionamiento de tamaño arbitrario de ácidos nucleicos a partir de una mezcla de ácidos nucleicos (ADN) de cadena corta y cadena más larga / cadena larga.
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