ES2969739T3 - Utilización de un tripéptido cíclico para mejorar el metabolismo energético celular - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de un péptido cíclico que comprende el tripéptido que reproduce un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito, para mejorar el metabolismo energético celular. Más particularmente, la invención se refiere al uso de un péptido cíclico que comprende el tripéptido FEEc para estimular el metabolismo energético de gametos o células embrionarias en el contexto de protocolos de procreación médicamente asistida (MAP), en particular promoviendo la maduración in vitro del ovocito, la tasa de fertilización y la tasa de natalidad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de un tripéptido cíclico para mejorar el metabolismo energético celular

La presente invención se refiere al campo de la procreación médicamente asistida (AMP) y, más generalmente, a todas las aplicaciones médicas, veterinarias o de otro tipo en las que se desea estimular la actividad mitocondrial o, más generalmente, energética, de las células, en particular durante los protocolos que comprenden una etapa de cultivo celular o mantenimiento de las célulasex vivo.

Más del 15% de las parejas han recurrido a la procreación médicamente asistida durante su vida genital. Cuando el esperma está alterado, es frecuente recurrir a las técnicas de microinyección para obtener la fecundación. Esta técnica es muy invasiva para el ovocito. Por otro lado, durante la fecundaciónin vitro(FIV) con esperma normal, se detectan regularmente del 3 al 5% de fracasos inexplicados en la fecundación.

En una solicitud de patente anterior (WO 2005/051799 A2), el equipo de inventores describió un tripéptido cíclico (Phe, Ac Glu, Ac Glu) de fórmula C-S-F-E-E-C (SEQ ID No: 1) con un enlace de ciclación entre las dos cisteínas terminales (FEEc), así como su acción aumentando las capacidades de fecundación de los gametos humanos. Existen equivalentes de la molécula en las diferentes especies animales que tienen las mismas propiedades y también se describen en este documento.

Continuando con su investigación, los inventores han puesto de manifiesto que la molécula de FEEc tiene un impacto en los espermatozoides (ejemplo 1 más adelante). En particular, mejora los parámetros del movimiento espermático tales como los analizados por CASA(Computer Aided Sperm Analysis).Así, por ejemplo, la velocidad lineal y la amplitud del recorrido lateral de la cabeza aumentan un 7 y un 8% respectivamente (P<0,05 y P<0,002) (Ejemplo 1). El resultado es un aumento de casi un 30% en el porcentaje de espermatozoides hiperactivados (P<0,009). Estos son los espermatozoides hiperactivados que son los espermatozoides fecundantes. Para que el espermatozoide aumente su velocidad de progresión, es lógico pensar que aumenta su consumo de ATP o al menos que mejora su metabolismo energético, ya que su movimiento se crea por los enlaces de los brazos de dineína a los túbulos vecinos del axonema. Las dineínas son ATPasas. Al estudiar el metabolismo mitocondrial de los espermatozoides expuestos al FEEc, los inventores plantearon la hipótesis de que induce un aumento en el potencial de la membrana mitocondrial, indicativo de un aumento en la síntesis de ATP por las mitocondrias o de un menor consumo. Por lo tanto, el FEEc mejora el metabolismo energético mitocondrial o, más generalmente, el metabolismo energético celular de los espermatozoides, ya sea mejorando la producción de ATP o racionalizando su utilización por parte de la célula.

Por lo tanto, la presente descripción se refiere, de manera general, a la utilización de un péptido cíclico que comprende el tripéptido que reproduce un sitio de unión de la Fertilina beta a la integrina del ovocito o de un tripéptido de fórmula EEP (SEQ ID No: 2), para su utilización como medicamento para mejorar la actividad mitocondrial o, más generalmente, para mejorar el metabolismo energético celular. Las aplicaciones de dicho péptido se ilustran aquí en dos tipos de células diferentes, que son el espermatozoide y el ovocito, y en el desarrollo de un organismo multicelular que es un embrión. Los resultados presentados en la parte experimental apoyan el hecho de que este péptido puede utilizarse en otras aplicaciones en las que se desea una mejora del metabolismo energético celular. En particular, este péptido puede ser útil para mejorar el rendimiento de los cultivos celulares, en particular los linfocitos. En un modo particular de implementación, el péptido se vectoriza, es decir, se administra en asociación con un agente, una molécula, una composición o cualquier otro tipo de vector que facilite su entrada en las células. De manera más general, la vectorización sirve para modular y controlar la distribución de un principio activo a una diana asociándolo con un vector.

En lo anterior, el "péptido cíclico que comprende el tripéptido que reproduce un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito" corresponde al péptido descrito en la solicitud de patente WO 2005/051799 A2 mencionada anteriormente. Como se ha mencionado en esta solicitud anterior, en particular en la Tabla 1, el tripéptido varía según la especie. Se puede ciclar por cualquier medio conocido por el experto en la técnica, en particular por medio de dos residuos de cisteína localizados a cada lado del tripéptido. De manera general, todas las presentaciones descritas en la solicitud WO 2005/051799 A2 se considera que responden a la definición de "péptido cíclico que comprende el tripéptido que forma un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito". Para facilitar la lectura del presente texto, este péptido cíclico, así como el medicamento que lo contiene como principio activo, se designarán aquí con la fórmula "FEEc". El experto en la técnica comprenderá perfectamente que esta notación abarca igualmente las formas que se pueden utilizar en especies distintas del hombre, tales como, por ejemplo, el tripéptido cíclico TDE que se debe utilizar en el ganado bovino.

A partir de la lectura de la siguiente descripción detallada, así como de los ejemplos, se comprenderá que la utilización del péptido cíclico anterior no se limita a las aplicaciones en la procreación médicamente asistida, sino que abre perspectivas reales en muchos otros campos. Por lo tanto, la descripción se refiere más generalmente a la utilización del FEEc en aplicaciones médicas o no médicas en las que se desea una estimulación del metabolismo energético celular.

Acción sobre los espermatozoides en la inseminación intrauterina

Al mejorar los parámetros del movimiento espermático, el FEEc es igualmente susceptible de mejorar las tasas de embarazo en la inseminación intrauterina (IIU). Según un primer aspecto particular, el FEEc se utiliza para aumentar la velocidad de progresión de los espermatozoides en un protocolo de procreación médicamente asistida (PMA). Siempre en el marco de una AMP, el FEEc se puede utilizar para mejorar los parámetros del movimiento de los espermatozoides y aumentar la tasa de espermatozoides hiperactivados. Además, la utilización del FEEc es particularmente interesante en un protocolo de inseminación intrauterina (IIU), tanto en los seres humanos como en mamíferos no humanos. Durante la implementación de este aspecto, los espermatozoides se incuban preferiblemente durante un minuto a 3 horas en presencia de 10 a 100 pM de péptido y luego se lavan antes de la inseminación intrauterina.

Acción sobre la maduración del ovocito in vitro

La molécula es igualmente eficaz en los ovocitos. La maduraciónin vitrode los ovocitos humanos bloqueados en la vesícula germinal pasa del 37,71 al 59,30% (P<5,7 10'5) en presencia de FEEc (ejemplo 2). En pacientes de 37 años o más, esta tasa pasa del 36,96% al 68,29% (P<0,003), lo que muestra que la molécula es particularmente eficaz en este tramo de edad. Los ovocitos de las mujeres de 37 a 40 años son aneuploides en al menos el 50% y, de manera más general, en aproximadamente el 80% de los casos, debido a una disminución de su actividad mitocondrial. Por lo tanto, la molécula es susceptible de mejorar la ploidía de los ovocitos y, por lo tanto, la de los embriones, cuyo potencial de desarrollo y capacidad de implantación dependen igualmente de la actividad mitocondrial del ovocito que ha sido fecundado. El aumento significativo de las tasas de embarazo en mujeres menores de 37 años, en el marco del estudio clínico "Fertiline" que se describe a continuación, muestra que este efecto beneficioso tiene lugar en cualquier ovocito y, en particular, durante su fecundación y desarrollo embrionario precoz. La hipótesis basada en estos resultados es que la fertilina es capaz de mejorar la ploidía ovocitaria.

Por lo tanto, la suplementación de los medios de cultivo y los medios de fecundaciónin vitroy los medios de incubación de embriones con la molécula permite mejorar la maduración ovocitaria y embrionaria (especialmente en mujeres menores de 30 años y de 37 años o más) y la tasa de fecundación en la FIV clásica, así como en la FIV con ICSI (inyección intracitoplásmica de espermatozoides).

Por lo tanto, la suplementación de los medios de cultivo durante la fecundaciónin vitro,con o sin micromanipulación, con la molécula de FEEc permite mejorar la tasa de embarazo y de niños nacidos, en particular en mujeres menores de 37 años en las condiciones experimentales implementadas.

Acción en los protocolos de maduración in vitro del ovocito (MIV)

También es probable que la molécula de FEEc sea eficaz en los protocolos de maduraciónin vitrode los ovocitos para la preservación de la fertilidad (MIV).

En un protocolo de fecundaciónin vitro,la maduración del ovocito generalmente se completa durante la recolección de los ovocitos. Sin embargo, a veces los ovocitos aún son inmaduros. Además, algunas mujeres presentan anomalías en la función ovárica o un estado clínico que dificulta la estimulación. Luego, las punciones se realizan deliberadamente en una etapa inmadura para una maduraciónin vitro.El péptido podría ayudar eficazmente a esta maduración (maduraciónin vitropara la preservación de la fertilidad).

El ovocito totalmente inmaduro presenta un núcleo grande llamado vesícula germinal (VG). El ovocito maduro se caracteriza por la presencia del 1er glóbulo polar (GP) en el espacio perivitelino (entre la superficie del ovocito y la zona pelúcida). Solo se pueden fecundar los ovocitos maduros.

Los inventores han puesto de manifiesto que el FEEc permite mejorar la maduración de los ovocitosin vitro.Esto se explica por el efecto del tripéptido sobre la actividad mitocondrial o sobre el metabolismo energético del ovocito. En efecto, la actividad mitocondrial o, más generalmente, el metabolismo energético disminuye con la edad, y la maduración del ovocito implica varias etapas que consumen mucha energía:

- Rotura de vesícula germinal

- Condensación de los cromosomas

- Formación de la placa metafásica

- Formación del huso

- Síntesis de proteínas de punto de control

- Telofase

- Expulsión del GP.

Sin embargo, estos trastornos de la maduración ovocitaria, que se agravan con la edad, se corrigen mediante la microinyección de mitocondrias que provienen de células jóvenes (ovocitos de donantes jóvenes o células madre ovogonias). Esto refuerza la probabilidad de que el FEEc corrija efectivamente el defecto celular relacionado con la insuficiencia mitocondrial o, más generalmente, energética.

Según otro de sus aspectos, la presente invención se refiere, por lo tanto, a la utilización del FEEc para mejorar la maduraciónin vitrode un ovocito. La mejora en la calidad de la meiosis probablemente esté en el origen de la disminución de la tasa de abortos espontáneos observada también en mujeres más jóvenes, por lo que este aspecto de la invención también es interesante para mejorar la maduraciónin vitrode los ovocitos de mujeres menores de 37 años, o incluso menores de 30 años. Al implementar este aspecto de la invención, el ovocito se incuba durante un período comprendido entre 1 hora y 4 días, en particular hasta 3 días o 24 horas, y en presencia de 10 a 100 pM de péptido.

Acción sobre la activación del ovocito fecundado

Los inventores también han puesto de manifiesto un aumento en la descondensación de la cabeza de los espermatozoides después de la fecundación. Esto se traduce en una mejora en la activación del ovocito durante la fecundación. Además, esto está relacionado con la actividad mitocondrial del ovocito.

Acción sobre la blastoformación

Los inventores también han puesto de manifiesto (en ratones) que el FEEc permite una mejora en la blastoformación. Esto también se puede atribuir al efecto del tripéptido sobre la actividad mitocondrial o, más generalmente, sobre el metabolismo de la célula. En efecto, se sabe que no hay replicación del ADN mitocondrial durante la embriogénesis preimplantacional. Durante la primera semana de desarrollo, el cigoto (o huevo) se divide por mitosis sucesivas, comenzando con 2 y luego con 4 células, pasando por el estadio de mórula hasta llegar al estadio de blastocisto, utilizando preferentemente las mitocondrias inicialmente presentes en el ovocito. Por lo tanto, un déficit mitocondrial (en número o rendimiento) puede ser el origen de una inestabilidad cromosómica de los blastómeros durante la meiosis y las mitosis, y dar lugar una detención de la evolución del cigoto, del embrión o incluso del embarazo. Esta es una causa frecuente de aborto espontáneo después de la fecundación natural o después de la transferencia de embriones durante una FIV.

Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a la utilización del FEEc para mejorar la ploidía de los blastómeros durante la primera semana del desarrollo del cigoto. Por lo tanto, la descripción se refiere a la utilización de FEEc para disminuir el número de abortos espontáneos. La descripción también se refiere a la utilización de FEEc para disminuir el riesgo de aneuploidía, en particular de trisomía. Al implementar este aspecto, el embrión se incuba durante un período comprendido entre 24 horas y 6 o 7 días en presencia de 10 a 100 pM de péptido.

Las utilizaciones descritas anteriormente son particularmente útiles en un protocolo de fecundaciónin vitro(FIV). En los seres humanos, permiten a las mujeres de todas las edades tener hijos mediante AMP con sus propios ovocitos sin recurrir a inyecciones de mitocondrias descritas en la bibliografía (efecto principal que se ha documentado más hasta ahora).

Disminución de los riesgos de abortos espontáneos

El FEEc también se puede utilizar para disminuir los riesgos de aborto espontáneo, como se mencionó anteriormente y se ilustra en la parte experimental a continuación.

Disminución de los riesgos de trisomía

El FEEc también se puede utilizar para disminuir los riesgos de trisomía o, más generalmente, de aneuploidía, durante una FIV en todas las mujeres, especialmente en mujeres de 35, 36, 37, 38, 39 o 40 años o más.

Mejora de la cinética del desarrollo del embrión in vitro

La presente descripción también se refiere a la utilización del FEEc para mejorar el desarrollo embrionario previo a la implantaciónin vitro.En un aspecto particular, el desarrollo previo a la implantación se obtiene en condiciones de cultivo prolongado. La mejora de la cinética del desarrollo del embrión permite mejorar la tasa de natalidad.

Acción en la reproducción natural

Aunque los inventores han demostrado los efectos del FEEc sobre el ovocito y el cigoto en el contexto de la FIV, es evidente que estos efectos también podrían obtenerse durante las fecundaciones naturales, por ejemplo, administrando FEEc por vía vaginal, en el momento de la ovulación, acoplándose el tripéptido a medios capaces de vectorizarlo al ovocito.

Acción durante la crioconservación de gametos y embriones

También se ha mostrado que la tasa de supervivencia de los ovocitos crioconservados depende, entre otras cosas, de su actividad mitocondrial. Es probable que ocurra lo mismo con los embriones. Por lo tanto, el péptido FEEc es susceptible de mejorar las tasas de supervivencia y/o la calidad de los gametos y embriones crioconservados durante su descongelación.

Acción sobre otros tipos celulares

El tripéptido cíclico se preparó para que se uniera a la integrina a6p1 en el ovocito. Es capaz de unirse a la membrana citoplasmática de otros tipos celulares diferentes porque esta integrina es muy ubicua. Por lo tanto, esta molécula es probablemente capaz de aumentar la actividad energética de numerosos tipos celulares. Por lo tanto, es susceptible de múltiples utilizaciones fuera de la FIV.

Dado que el modo de acción de la molécula probablemente esté mediado por la integrina a6p1, es probable que el FEEc tenga efectos en muchos otros tipos celulares. Esta molécula podría utilizarse para mejorar el rendimiento de cualquier cultivo celular.

Como se mencionó anteriormente, el FEEc posiblemente actúa a través de la integrina a6p1 u otro receptor, presente en numerosos tipos celulares. Por lo tanto, se puede utilizar para mejorar la actividad mitocondrial o el metabolismo energético de cualquier célula que porte esta integrina o este otro receptor. Una aplicación inmediata de esta propiedad es la mejora del rendimiento de cualquier cultivo celular. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a un procedimiento para mejorar la actividad mitocondrial o, más generalmente, energética de las célulasin vitro,que comprende una etapa de poner las células en cuestión en presencia del FEEc. Este procedimiento puede implementarse ventajosamente en células primarias cultivadasex vivocon miras de administrarlas a un paciente en el marco de una terapia celular. Como ejemplos no limitativos de cultivos celulares susceptibles de beneficiarse de este procedimiento, se pueden citar los cultivos de piel para injertos de piel, los cultivos de linfocitos para inmunoterapias celulares, etc.

La descripción se refiere a la utilización de un péptido FEEc con el objetivo de favorecer el cultivoex vivode todos los tipos celulares que expresan un receptor de FEEc, en aplicaciones médicas (como la terapia celular) o no médicas (como el mantenimiento de células en cultivo con fines experimentales o para la producción de proteínas).

Acción en el mundo de los animales mamíferos

La molécula presenta una especificidad de especie. Sus isoformas están disponibles para una utilización en todos los animales domésticos, o no, incluidos los animales de granja cuyas especies se reproducen con dificultad (caballos de carreras, vacas Holstein).

Acción sobre las patologías mitocondriales y contra el envejecimiento

Las propiedades del FEEc como molécula que estimula la actividad mitocondrial o, más generalmente, el metabolismo energético, también pueden utilizarsein vivoen cualquier tipo de patología ligada a un defecto de la actividad mitocondrial. A este respecto, se pueden citar, de forma general, las patologías del envejecimiento. La relación entre una disfunción de las mitocondrias y las enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, ha sido establecida por varios equipos. Además, el FEEc podría utilizarse como medicamento para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson. También se ha mostrado una relación entre la longitud de los telómeros de los cromosomas y la actividad mitocondrial de la célula. Ahora bien, el acortamiento de los telómeros está ligado a los procesos de envejecimiento. Por lo tanto, es posible que al estimular la actividad mitocondrial o energética de la célula estemos en condiciones de retrasar los efectos del envejecimiento.

Las enfermedades mitocondriales presentan un cuadro variado, pero que se asocian con frecuencia con manifestaciones oculares como la retinitis pigmentaria o la oftalmoplejía. En estos últimos casos, una administración tópica del FEEc en el ojo, por ejemplo, en un colirio, podría mejorar los síntomas ligados a la insuficiencia mitocondrial o energética. Otro objeto de la descripción es, por lo tanto, un colirio que comprende un péptido cíclico que comprende el tripéptido capaz de formar un sitio de unión entre la fertilina beta y la integrina del ovocito. Dicho colirio puede comprender, además del FEEc, otro agente tal como un agente espesante, un agente antiséptico, un antibiótico o cualquier otro compuesto que pueda utilizarse para este tipo de producto. Los medios descritos en la solicitud WO 2005/051799 A2 están, por supuesto, excluidos de la definición del término "colirio" en el sentido de la presente descripción.

Acción en cosmética

La presente descripción también se refiere a la utilización del FEEc en una composición cosmética o terapéutica destinada a una aplicación tópica. Como ejemplos, se puede citar la utilización del FEEc para estimular los fibroblastos para la producción de colágeno, o para estimular los folículos pilosos para favorecer el crecimiento del cabello, por ejemplo, para prevenir o ralentizar la alopecia. Por lo tanto, la presente descripción también se refiere a una composición cosmética o dermatológica que comprende el FEEc como principio activo. Por "composición cosmética o dermatológica", se entiende aquí una composición que, además del FEEc, comprende ingredientes utilizados habitualmente en el campo de la cosmetología. La composición cosmética o dermatológica puede presentarse en cualquier forma conocida por el experto en la técnica. Se puede tratar, por ejemplo, de una emulsión de aceite en agua, agua en aceite, agua en silicona, una emulsión múltiple, una microemulsión, una nanoemulsión, una emulsión sólida, un gel acuoso o hidroalcohólico, una crema, una leche, una loción, una pomada, un aceite, un bálsamo, un ungüento, una máscara, un polvo, un soporte empapado, por ejemplo, un parche transdérmico, una loción acuosa o hidroalcohólica y/o una cera, un producto de maquillaje, por ejemplo, una base de maquillaje, un champú, un acondicionador, un máscara, un suero para aplicación tópica, una loción capilar. Los medios descritos en la solicitud WO 2005/051799 A2 están, por supuesto, excluidos de la definición de composiciones cosméticas o dermatológicas en el sentido de la presente descripción.

La composición cosmética o dermatológica puede ser, por ejemplo, una composición para el cuidado de la cara, el cuerpo, el cabello, por ejemplo, composiciones para la cara y/o el cuerpo y/o el cabello.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin embargo, sin limitar su alcance.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Variación del potencial de la membrana mitocondrial en presencia del FEEc (a la derecha) frente al péptido de control "de secuencia aleatoria" (a la izquierda). Obsérvese el aumento del potencial de membrana en los espermatozoides expuestos en la mayoría de los pacientes.

Figura 2: Recuento después de la excitación UV de espermatozoides humanos fusionados con ovocitos humanos depelucidados, incubados en ausencia (A) o en presencia de FEEc a 100 pM (B). Obsérvese el aumento del número de espermatozoides fusionados y la descondensación más rápida de sus cabezas.

Figura 3: Proporción de ovocitos maduros en el D1 de maduración in vitro (MIV). Representación esquemática de las proporciones de ovocitos humanos en metafase II (MII) a partir del estadio VG después de MIV en el medio de control o suplementado con FEEc a 100 pM.*p=0,02. **p=0,003. D 1 = 24 h de MIV.

Figura 4: Proporción de ovocitos atréticos en el D1 de maduración in vitro (MIV). Representación esquemática de las proporciones de ovocitos humanos atréticos. Resultados observados el D1 a partir del estadio VG después de la maduración in vitro (MIV) en el medio de control o suplementado con FEEc a 100 pM. D1 = 24 h de MIV.

Figura 5: Marcaje del huso meiótico obtenido en un ovocito humano en MII después de la MIV en el medio estándar (24 h). Marcaje del huso con un anticuerpo anti-a-tubulina y de los cromosomas con DAPI. Imagen obtenida con un microscopio confocal. A; ovocito entero. B; agrandamiento de la placa metafásica.

Figura 6: Comparación de la tasa de fecundación el D1 entre ratones jóvenes y viejos, en presencia o ausencia de fertilina, que corresponde al péptido QDEc.

Jóvenes: ratones B6CBAF1 de 7 semanas de edad; Viejos: ratones B6CBAF1 de 7 meses

Figura 7: Comparación de los porcentajes medios de embriones escindidos en D2 y D4 entre ratones jóvenes y viejos, en presencia o ausencia del péptido QDEc.

Jóvenes: ratones B6CBAF1 de 7 semanas (n = 108 ovocitos, 56 controles, 52 QDEc); Viejos: ratones B6CBAF1 de 7 meses (n = 128 ovocitos, 65 controles, 63 QDEc), *; p = 0,02. **p=0,008. ***p=0,01.

Figura 8: Comparación de los porcentajes medios de atresia (ATR) en D2 entre ratones jóvenes y viejos, en presencia o ausencia del péptido QDEc.

Jóvenes: ratones B6CBAF1 de 7 semanas (n = 108 ovocitos, 56 controles, 52 QDEc); Viejos: ratones B6CBAF1 de 7 meses (n = 128 ovocitos, 65 controles, 63 QDEc).

Figura 9: Representación esquemática de la metodología del estudio clínico realizado en el ejemplo 5.

Figura 10: Resultados preliminares de los criterios de juicio primarios y secundarios en el marco del estudio clínico. Tasa de embarazo por transferencia de embriones frescos o congelados (grupo de control, n = 17 transferencias/grupo FEEc, n = 13 transferencias). Porcentaje de "embrión superior' (grupo de control, n = 75 embriones escindidos/grupo FEEc, n = 72). Tasa de fecundación (grupo de control, n = 259 Mil/grupo FEEc, n = 246 MII)

Figura 11: Tasas de embarazo obtenidas en el marco del estudio clínico.

Figura 12: Mejora de la tasa de maduración de los ovocitos bloqueados en VG después de la incubación en presencia del FEEc. Este estudio se realizó considerando un ovocito por mujer e incubándolo en presencia del FEEc o el péptido de control.

Figura 13: Efectos del FEEc sobre la maduración de los ovocitos humanos bloqueados en VG por tramo de edad.

Figura 14: Estimulación del desarrollo embrionario previo a la implantación en ratones jóvenes por el QDEc. (*P<0,00532; **P< 0,00374; ***P< 0,00913; ****P<0,068; ( ) número de embriones)

Materiales y métodos

Los ejemplos experimentales que se presentan a continuación se obtuvieron utilizando los siguientes materiales y métodos:

Observación de los parámetros del movimiento espermático

Los espermas estudiados se dividieron cada uno en 2 alícuotas, una de las cuales se incubó con FEEc y la otra con un péptido "de secuencia aleatoria" que contenía los mismos aminoácidos, pero en un orden aleatorio. Los inventores incubaron espermatozoides humanos durante 3 h a 37 °C en presencia de 100 pM del péptido FEEc o del péptido con secuencia aleatoria y luego observaron los parámetros del movimiento espermático según un análisis automatizado(Computed Assisted Sperm Analysis,CASA).

Los parámetros espermáticos ensayados son los siguientes: VAP móvil, VSL, VCL y ALH. Corresponden respectivamente a la velocidad según la trayectoria media, la velocidad en línea recta(Straight Line Velocity),la velocidad curvilínea y el desplazamiento lateral de la cabeza. El estudio mostró un aumento significativo del porcentaje de espermatozoides hiperactivados (según los criterios de Mortimer et al.). Es probable que esto explique el aumento en las tasas de fecundación observado en presencia del péptido.

Medición del potencial de la membrana mitocondrial

Los inventores incubaron espermatozoides humanos durante 3 h a 37 °C en presencia del péptido FEEc o del péptido "con secuencia aleatoria", que comprende los mismos aminoácidos en orden aleatorio y, por lo tanto, constituye el grupo de control. Después del lavado, los espermatozoides se marcan mediante un colorante lipófilo fluorescente, DIOC6.

El potencial de la membrana mitocondrial (gradiente de protones a nivel de la membrana interna de la mitocondria) se midió luego mediante citometría de flujo. Se encuentra aumentado en los espermatozoides después de la exposición al FEEc.

Medición del índice de fecundación

Los ovocitos humanos depelucidados se incubaron con espermatozoides humanos en ausencia o en presencia de FEEc a 100 pM. Los espermatozoides fusionados se contaron después de la excitación UV. Se consideró que los espermatozoides estaban fusionados cuando el núcleo se marcó con HOECHST 33342. Además, las cabezas de los espermatozoides que han penetrado en el ovocito en presencia del péptido FEEc no solo son más numerosas, sino que también presentan un aspecto difuminado que indica la descondensación de su cabeza espermática. Esta descondensación es una de las primeras etapas de la activación ovocitaria tras la penetración del espermatozoide. Por lo tanto, podemos concluir que el FEEc no solo mejora la capacidad de fecundación del espermatozoide, sino que también activa el ovocito fecundado.

Recolección de ovocitos humanos para la maduración in vitro (MIV)

Los ovocitos humanos inmaduros donados para la investigación se recolectaron en el laboratorio de fecundación in vitro (FIV) del Centro de Procreación Médicamente Asistida (AMP) del hospital Cochin (París, Francia). Dos horas después de la punción ovocitaria, los ovocitos destinados a ser microinyectados se sometieron a decumulación con hialuronidasa (ORIGIO, Limonest, Francia). Tras la observación con un microscopio invertido (Hoffman), los ovocitos inmaduros en estadio de vesícula germinativa (VG) se retuvieron para el resto de los experimentos.

Maduración in vitro (MIV) de ovocitos humanos inmaduros

Los ovocitos humanos inmaduros en el estadio VG se aleatorizaron, ya sea en el medio de cultivo de control (Global, JCD, La Mulatiére, Francia) (n = 203) o en el mismo medio suplementado con 100 pM de FEEc (n = 193). Los ovocitos humanos inmaduros se clasificaron en dos grupos: los que pertenecían a mujeres menores de 37 años y los que pertenecían a mujeres de 37 años o más. El día de la punción folicular, los dos grupos de ovocitos en el estadio VG se incubaron en gotas de 20 pl recubiertas con aceite y se mantuvieron a 37 °C con un 5% de CO2 para observarlos bajo un microscopio invertido (Hoffman) en D1 (24 h de incubación) y D2 (48 h de incubación). Los ovocitos se clasificaron en metafase II (1er glóbulo polar en el espacio perivitelino), vesícula germinativa (VG), metafase I (ruptura de la vesícula germinativa sin expulsión del glóbulo polar) o atréticos.

Recolección de ovocitos murinos para la maduración in vitro (MIV)

Las hembras B6CBAF1 (de entre 5 y 8 semanas de edad) suministradas por el laboratorio Charles River (L' Arbresie, Francia) fueron estimuladas mediante la inyección de PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) a 10 UI (SIGMA-ALDRICH, Saint-Quentin Fallavier, Francia) sin provocar la ovulación. Los ovocitos inmaduros se recogieron de los ovarios 48 h después de esta última inyección, luego se despojaron de sus cúmulos usando hialuronidasa y se lavaron tres veces en medio de cultivo M2. Solo se retuvieron los ovocitos clasificados como VG para el resto de los experimentos.

Maduración in vitro (MIV) de ovocitos inmaduros de ratón

Los ovocitos de ratón se incubaron de forma aleatoria entre el medio estándar, por un lado, y el medio suplementado con QDEc 100 pM, por otro lado. Los frascos de cultivo se prepararon el día anterior y se incubaron a 37 °C con un 5% de CO2. Los ovocitos se observaron en D0 (8 h después del sacrificio) y D1 (24 h).

Inmunofluorescencia

Los ovocitos humanos derivados de MIV se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 2% durante 1 h a temperatura ambiente y después se lavaron en PBS que contenía BSA al 0,5%. La permeabilización se aseguró mediante la incubación de los ovocitos en una solución que contenía un 0,5% de BSA, un 0,1% de Triton X-100, un 0,05% de Tween-20 y un 5% de suero normal de cabra. A continuación, los ovocitos se lavaron en PBS-BSA al 0,5% antes de incubarlos durante la noche en una dilución 1/200 del anticuerpo anti-a-tubulina humana (SIGMA-ALDRICH) en PBS que contenía BSA al 0,5%. Los ovocitos se incubaron después durante 1 h en presencia del anticuerpo secundario de tipo IgG conjugado con Alexa Fluor (LIFE TECHNOLOGIES, Alfortville, Francia). Tras una etapa de lavado, los ovocitos se incubaron durante 10 min en DAPI (diluido a 1/1.000) antes de montarlos en un portaobjetos y observarlos mediante microscopía confocal en la oscuridad. Para el análisis del huso, los ovocitos con fibras de microtúbulos distintas y bien organizadas asociadas con una alineación cromosómica perfecta en la placa metafásica se identifican como normales.

Estimulación y apareamiento de ratones

Se aparearon hembras "jóvenes" B6CBAF1 de 7 semanas y "viejas" de 7 meses con machos C57N tras la superovulación, esta última consistió en inyectar PMSG a 10 UI (SIGMA-ALDRICH) y, a continuación, se desencadenó la ovulación por administración de hCG (gonadotropina coriónica humana) a 10 UI (SIGMA-ALDRICH), 46-48 h después.

El día después del apareamiento, se sacrificaron los ratones que presentaban un tapón vaginal. Los ovocitos se recolectaron en los oviductos 15-16 h después de la inyección de hCG y la tasa de fecundación se evaluó por la presencia del segundo glóbulo polar en el espacio perivitelino.

Incubación de ovocitos de ratón fecundados

Los ovocitos de ratón fecundados después del apareamiento y recolectados se aleatorizaron en 4 grupos (jóvenes "expuestos al péptido QDE cíclico (QDEc), controles jóvenes, viejos expuestos al QDEc y controles viejos) y se dispusieron en gotas de medio de cultivo (KSOM) de 20 pL para los controles y suplementadas con 100 pM de QDEc para los expuestos. La exposición duró de D1 a D4 después del apareamientoin vivo(D0). El QDEc es equivalente al FEEc humano. La incubación de los frascos de cultivo se realiza a 37 °C con un 5% de CO2 y se recubren con aceite mineral.

Los ovocitos se observaron todos los días con una lupa binocular para evaluar los signos del desarrollo embrionario. La cinética del desarrollo normal corresponde al menos, en D2, a un embrión de 2 células escindido y en D5 a un embrión en el estadio de mórula o blastocisto.

Estudio prospectivo aleatorizado en FIV humana

El 08/09/2014 se inició un ensayo clínico en el laboratorio de FIV del Centro de AMP de Cochin, en 66 parejas, con una edad promedio de 34,3 ± 4,2 años para las mujeres y de 37,0 ± 5,2 años para sus parejas. Se trata de un estudio prospectivo, aleatorizado monocéntrico sobre la fecundación in vitro (FIV) realizado en presencia o ausencia de FEEc. Los ovocitos, recuperados en sus cúmulos, se repartieron en dos grupos alternativamente en uno y luego en el otro según su orden de recuperación. Cuando se recuperaron todos los ovocitos, un técnico que no participó en la recolección de los cúmulos determinó aleatoriamente cuál de los dos grupos se inseminó en presencia de FEEc y cuál sirvió de control. Una parte de los ovocitos se incuba en el medio de cultivo estándar (Global, JCD), la otra parte en este mismo medio suplementado con FEEc 100 pM.

La metodología de este estudio, que se muestra esquemáticamente en la figura 9, se presenta a continuación. Los ovocitos humanos que provienen de mujeres de 18 a 43 años de edad se recuperaron mediante punción de los ovarios tras la estimulación hormonal por parte de los ginecólogos. Se repartieron aleatoriamente en 2 grupos: los ovocitos se incubaron en presencia de un medio de cultivo estándar suplementado con FEEc 100 pM o un medio de cultivo estándar (Global, JCD) y luego se colocaron en una incubadora a 37° en una atmósfera de 5% de CO2. Los espermatozoides del cónyuge se recuperaron en el laboratorio y los más móviles se seleccionaron según una preparación estándar de los centros de AMP. La FIV consiste en poner juntos espermatozoides y ovocitos en el medio de inseminación a razón de una concentración de 105 espermatozoides seleccionados/ml en gotas de 20 microlitros en aceite. La inseminación tiene lugar en una incubadora a 37 °C con un 5% de CO2 durante 18 horas. 18 h después de la inseminación (D1), se efectúa la decumulación de los ovocitos. Los ovocitos fecundados se lavan y se transfieren a otra gota de medio y se cultivan durante 24 h adicionales. Durante la transferencia en el útero, se lavan tres veces, luego se colocan en un medio de transferencia y se colocan en la cavidad uterina. Los embriones se transfieren según su calidad aparente sin preocuparse por el grupo de origen. Se transfieren uno o varios embriones en función de la edad, la indicación de la FIV, el rango del intento y la calidad de los embriones obtenidos, y con el acuerdo de las parejas. Ciertos embriones se pueden poner en cultivo prolongado durante 5 días (en el estadio de blastocisto), ya sea de inmediato o después de la transferencia de embriones en D2.

El principal criterio de evaluación es la tasa de embarazo clínico por transferencia de embriones frescos o congelados y la tasa de abortos espontáneos teniendo en cuenta los 3 grupos: transferencias homogéneas (control y tratadas) y mixtas (mezcla de las dos).

Los criterios secundarios son:

- Las tasas de fecundación, es decir, la relación entre el número de cigotos que tienen dos pronúcleos en el citoplasma, 18 horas después de la inseminación en relación con el número de ovocitos en la metafase 2 en la cohorte.

- El porcentaje de embriones de buena calidad, es decir, embriones cuya secuencia de escisión corresponde a la secuencia ideal, es decir: de 4 a 5 células en D2 y de 8 a 9 células en D3 y cuya fragmentación de blastómeros es de tipo A (cuando el volumen ocupado por los fragmentos es inferior al 10% del volumen embrionario) o B (cuando el volumen ocupado por los fragmentos está comprendido entre el 10% y el 30% del volumen total del embrión). Por lo tanto, estos embriones denominados «superiores» corresponden a la relación entre el número de embriones de cada tipo en relación con el número total de embriones para cada grupo.

Este protocolo recibió el dictamen favorable del Comité para la Protección de las Personas (CPP) Ouest VI el 13/12/2012. El estudio obtuvo la autorización de la Agencia de Biomedicina el 08/07/2013. La FIV se efectúa en estricto cumplimiento de las Buenas Prácticas Clínicas. Cada pareja que aceptó participar en el estudio firmó un consentimiento libre e informado.

Análisis estadístico

Las variables cuantitativas se estudiaron por sus efectivos, media y desviación estándar. Los datos se compararon entre el grupo expuesto y el no expuesto mediante una prueba apropiada (prueba de Student o prueba de Wilcoxon) para las variables cuantitativas. Las comparaciones de porcentajes se efectuaron mediante una prueba de Chi-2 (x2) o una prueba exacta de Fisher. Las diferencias entre los datos comparados se consideraron estadísticamente significativas cuando el valor p (nivel de significación) fue inferior a 0,05.

Ejemplo 1: Mejora de los parámetros del movimiento de los espermatozoides y del porcentaje de espermatozoides hiperactivados en el ser humano

Los experimentos preliminares han mostrado que en una prueba de supervivencia durante 18 horas de espermas incubados en presencia del péptido FEE, la supervivencia mejora significativamente en el grupo tratado con FEE a la concentración de 100 pM en comparación con el control.

Ejemplo 1a: Análisis automatizado de los parámetros del movimiento espermático después de la incubación en presencia de FEEc y de un péptido con secuencia aleatoria como control.

Los resultados presentados en la tabla 1 siguiente muestran un aumento de la VAP móvil (p = 0,008), de la VSL (p = 0,048), de la VCL (p<0,0001) y del ALH (p = 0,002), lo que resulta en un aumento del 29% de los espermatozoides hiperactivados (p = 0,009), con respecto al grupo de control. Esta mejora del porcentaje de espermatozoides hiperactivados explica la mejora de su capacidad fusiogénica y el aumento de las tasas de fecundación registradas en ratones en complejos de cumulo ovocitario intactos.

Tabla 1: Análisis automatizado de los parámetros del movimiento espermático comparado entre los grupos de control y después de la incubación en presencia de FEEc.

Ejemplo 1b: Medición del potencial de la membrana mitocondrial

El potencial de la membrana mitocondrial se muestra aumentado un 21% en presencia del péptido FEEc en relación con el péptido "de secuencia aleatoria" (p <0,001) (Figura 1).

Por lo tanto, el FEEc mejora los parámetros del movimiento espermático al aumentar el potencial de la membrana mitocondrial espermática.

Ejemplo 1c: Estudio del índice de fecundación

Los resultados presentados en la figura 2 muestran que, no solo se fusiona un mayor número de espermatozoides con los ovocitos depelucidados en presencia del péptido FEEc, sino que estos últimos también se descondensan a diferencia de los del grupo de control.

En los ovocitos de control, se cuenta una media de 19,0 ± 4,6 espermatozoides en el citoplasma, mientras que se notifica un aumento de 36,9 ± 11,7 espermatozoides fusionados por ovocito después de la incubación con FEEc a 100 pM (p<0,001). Este fenómeno sugiere una mejora en la capacidad de fecundación de los espermatozoides y una activación ovocitaria mediada por el péptido FEEc.

Los parámetros del movimiento de los espermas de 37 pacientes se analizaron en presencia o ausencia de FEEc (incubación de 3 horas). Hay un aumento significativo del porcentaje de espermatozoides hiperactivados según los criterios de Mortimer, lo que explica el aumento de su capacidad de fecundación (véase la Tabla 1 anterior).

Ejemplo 2: Mejora de los porcentajes de maduración in vitro de ovocitos humanos inmaduros

Se puso de manifiesto un aumento significativo de la maduración ovocitaria con FEEc en el D1, para el conjunto de los ovocitos humanos ensayados. Los resultados obtenidos son los siguientes: el 42,3% (69/163) de los ovocitos en la metafase II (MII) bajo FEEc frente al 30,0% (52/173) en el grupo de control, p = 0,02 (Figura 3). Este aumento en la maduración es aún más pronunciado en los ovocitos de mujeres de 37 años o más desde D1. Los resultados obtenidos son los siguientes: el 47,9% (23/48) de los ovocitos en MII bajo FEEc frente al 20,4% (11/54) en el grupo de control (p = 0,003).

Aunque es baja en el caso de los ovocitos de mujeres cuya edad es inferior a 37 años, la mejora de la MIV ovocitaria en el ser humano es muy significativa para los ovocitos de mujeres más mayores, ya que se obtuvo la misma tasa de maduración que para los ovocitos de mujeres jóvenes (el 47,9% de los ovocitos en la metafase II en presencia de FEEc frente al 20,4% en el grupo de control, p = 0,003).

Los resultados obtenidos con los 336 ovocitos humanos en el estadio VG, incubados de forma aleatoria en presencia o ausencia del péptido FEEc, muestran que la presencia de FEEc mejora la tasa de maduración de los ovocitos humanos.

No se detectó ninguna diferencia significativa entre las tasas de atresia ovocitaria entre los 2 grupos (el 16,5% en presencia del péptido frente al 16,8% para el grupo de control) (Figura 4). En la muestra de mujeres de 37 años o más, se observa una tendencia no significativa a una disminución de la tasa de atresia en presencia del péptido FEEc (16,7%, 8/48) en relación con el medio de control (24,1%, 13/54) p>0,05.

El estudio continuó y se obtuvieron resultados complementarios. Estos resultados confirman los resultados descritos anteriormente y ponen de manifiesto otros efectos del péptido FEEc, tales como los descritos a continuación.

Se maduraron un total de 600 ovocitosin vitro.Para el análisis, solo se incluyó un ovocito por mujer en el estudio, con el fin de que todos los eventos fueran independientes. En presencia de Fertilina en el medio, la tasa de maduración pasó de un 38,3% a un 59,0% (P <1,6 10'4) (Figura 12). Cuando el análisis se realiza en función de la edad de la mujer de la que provienen los ovocitos en VG, vemos que la mejora en la maduración es relativamente modesta para las mujeres menores de 37 años (del 42,6% al 51,8%, P<0,2), pero que es mucho mayor en los ovocitos que provienen de mujeres de 37 años o más (del 35,1% al 65,9% P<3,91 10'5). Por lo tanto, la Fertilina está en condiciones de estimular la maduraciónin vitrodel ovocito decumulado y la expulsión del primer glóbulo polar. Aparentemente, lo hace mucho mejor, ya que el déficit energético del ovocito ligado a la edad es mayor. Este estudio también permitió poner de manifiesto un aumento en la tasa de maduración, más particularmente en los ovocitos en VG de mujeres mayores de 37 años y menores de 30 años (Figura 13).

Ejemplo 3: Organización del huso meiótico de los ovocitos humanos madurados in vitro

La figura 5 muestra la organización incompleta y aberrante de la alineación de los cromosomas en la placa metafásica con cromosomas no alineados. La imagen se obtiene a partir de un ovocito humano en MII después de 24 h de MIV en presencia del medio de control.

Ejemplo 4: Mejora de la tasa de fecundación y del desarrollo embrionario precoz en ratones

En D1, la tasa de fecundación permanece inalterada en ratones jóvenes, mientras que pasa del 39% al 51% en ratones viejos (p<0,03) (Figura 6).

En D2 entre los ratones jóvenes, el 50,0% (26/52) de los ovocitos se escinden en el grupo QDEc frente al 32,4% (18/56) en el grupo de control (P = 0,02) (Figura 7). Con respecto a los ratones viejos, hay significativamente más embriones escindidos en D2 en presencia de QDEc (58,7%, 37/63) en relación con el control (35,4%, 23/65), p = 0,008. En D4, la proporción de embriones escindidos de ratones jóvenes que alcanzaron el estadio de mórula o blastocisto es del 34,6% (7/16) para el grupo de control frente al 63,0% (17/26) para el medio suplementado con QDEc, p<0,03. Esta proporción alcanzó el 86,3% (63/73) para los ratones envejecidos en presencia del péptido frente al 28,3% (15/53) en el medio de control, p = 0,001.

De manera interesante, la blastoformación en ratones mejora en presencia del péptido QDEc.

Los porcentajes de embriones atréticos no son significativamente diferentes entre los 2 grupos entre los ratones jóvenes: el 17,3% (9/52) en presencia de QDEc y el 30,4% (17/56) en el control (p = 0,1). En relación con los ratones jóvenes, el porcentaje de atresia es mayor en el grupo de ratones viejos con tasas similares entre los grupos QDEc (38,1%, 24/63) y control (49,2%, 32/65) (p = 0,2) (Figura 8).

Con el fin de estudiar el desarrollo embrionario preimplantacional con mayor detalle, se implemento el siguiente protocolo: Los ratones se aparearon en D0. En D1, los ovocitos se recuperaron por dilaceración de las ampollas tubáricas. Luego, se distribuyeron en dos grupos de forma aleatoria y se pusieron en cultivo con o sin QDEc, antes de la fecundación.

Los resultados muestran un aumento de las mórulas en D3, de los blastocistos en D4 y, entre ellos, un aumento de los blastocistos expandidos cuando el ovocito se incubó en presencia de QDEc (el 31,1% frente al 45,9% de P <0,009) (Figura 14). Además, después de la transferencia de estos blastocistos a hembras pseudo gestantes, hay un aumento significativo en el número de progenies obtenidas por los embriones transferidos, especialmente en el caso de los embriones que provienen de ratones jóvenes (Tabla 2, a continuación).

Tabla 2: Tasa de natalidad tras la transferencia de los embriones de control y tratados con QDEc en ratones.

Ejemplo 5: Aumento de las tasas de embarazo clínico en fecundación in vitro

Los resultados que se presentan a continuación se obtuvieron en el marco del estudio «Fertiline».

En un primer momento, se incluyeron 56 parejas. La edad promedio es de 33,9 /- 4,1 años entre las mujeres y 36,7 /-5,3 para las parejas. No se observó ninguna diferencia significativa, ni entre las tasas de fecundación ni entre el porcentaje de embriones de alta calidad entre los 2 grupos de FEEc frente al control. Se observa una tendencia no significativa de aumento de las tasas de embarazo por transferencia en presencia del péptido en relación con el control y el grupo mixto, del 46,1% (6/13) frente al 29,4% (5/17) y el 40% (2/5), respectivamente (Figura 10 y Tabla 2, a continuación). Se ha notificado un aborto espontáneo después de la transferencia de un embrión del grupo de control. Hasta la fecha, no se ha notificado ningún efecto no deseable.

Hasta la fecha, se han incluido en el estudio 66 parejas. Se han efectuado 54 transferencias, 26 con embriones de control, 22 con embriones del grupo FEE y 6 con embriones de los dos grupos (transferencias mixtas). La tasa acumulada de embarazo fue del 34,6%, 45,5% y 33,3%, respectivamente, en los 3 grupos. La tasa de abortos espontáneos fue del 33,3%, 10% y 0%, respectivamente. La tasa de embarazos clínicos es, por lo tanto, del 23%, el 41% y el 33,3%, respectivamente. Fundamentalmente, cuando la tasa de embarazo clínico está relacionada con la edad de las pacientes, se percibe que, en las pacientes jóvenes, la tasa de embarazo clínico progresivo (es decir, que llega a término) aumenta significativamente, del 20% al 57,1% (P<0,03).

Tabla 3: Tasa de embarazo por transferencia (para 66 pacientes)

Los resultados también muestran un aumento del 21% en los embarazos clínicos tras la transferencia de un embrión del grupo FEEc del 40,0% (8/20) frente al 33,3% (8/24) en el grupo de control (p>0,05). Las tasas de fecundación son del 66,2% entre los controles frente al 67,6% en el grupo expuesto al FEEc (p>0,05). La tasa de abortos espontáneos tempranos alcanzó el 37,5% (3/8) en el grupo de control frente al 11,1% (1/9) cuando el embrión estuvo expuesto al FEEc (p>0,05) (Figura 11).

Para las mujeres menores de 37 años, después de la exposición al FEEc, las tasas de fecundación son del 70,9% frente al 68,3% en el grupo de control. En el caso de que el ovocito haya estado expuesto al FEEc, las tasas de embarazo alcanzan el 57,1% frente al 20,0% en el grupo de control (Tabla 4, a continuación).

Tabla 4: Tasa de fecundación y tasa de embarazo según la edad de la pareja (>37 o < 37 años) * P<0,03)

De las 66 primeras parejas incluidas en el estudio hasta la fecha, se han efectuado 51 transferencias y las demás se han aplazado y los resultados muestran que de estas 51 transferencias:

- 21 se realizaron a partir de embriones del grupo de control;

- 18 a partir del grupo en presencia del FEEc;

- 12 con embriones de los dos grupos.

La tasa de embarazos es más elevada y los abortos espontáneos son menos numerosos para el grupo en presencia del FEEc en comparación con los demás grupos (el 33% de abortos espontáneos frente al 9% para los embriones en presencia de FEEc) (Tablas 5 y 6, a continuación).

Las tasas de embarazos para las mujeres jóvenes pasan del 20% al 57,1% (p<0,03), en presencia de FEEc en relación con el control.

Tabla 5: Tasa de embarazo por transferencia (para 66 pacientes)

Tabla 6: Tasa de embarazo por transferencia en función de la edad de las mujeres.

La continuación del estudio Fertiline ha permitido obtener resultados complementarios. Se incluyó un total de 66 parejas en el estudio. Los resultados se indican en la siguiente tabla.

Los datos globales de las tentativas se indican en la tabla 7. Las tasas de fecundación globales apenas se han modificado. Sin embargo, el porcentaje de las tentativas en las que hubo una fecundación baja (tasa de fecundación inferior al 20%) cayó del 37,9% al 27,3% en presencia de FEEc, lo que sugiere una mejor capacidad de fecundación de los gametos en presencia de Fertilina. Del mismo modo, la poliespermia es del mismo orden de magnitud en el grupo de Fertilina que en el grupo de control (el 4,0% frente al 5,2%), lo que muestra que el mecanismo normal del bloqueo de la poliespermia no se ha modificado.

Tabla 7: Resultados globales del estudio Fertiline en 66 pacientes

Los resultados de todas las parejas que se sometieron a una transferencia de embriones se indican en la tabla 8. Esta tabla excluye a las parejas que tuvieron un fallo de fecundación inexplicable en los dos grupos de ovocitos con o sin Fertilina (n = 6).

Tabla 8: Resultados obtenidos en las 66 parejas del estudio Fertiline

Como se muestra en la tabla 8, para las pacientes que se sometieron a una transferencia de embrión, la tasa de fecundación pasa del 69,5% al 78,6%, lo que representa una mejora del 13%, pero que no alcanza significación en la presente cohorte. El desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto no se modifica, ni la tasa de implantación de los embriones en el útero. Por otro lado, la tasa de abortos espontáneos disminuyó en casi un 50% en el grupo de Fertilina (el 15,4% frente al 30,5%).

Los resultados de las parejas que se han sometido a una transferencia de embriones y en los que la mujer tiene menos de 37 años se indican en la tabla 9.

Si consideramos solo las parejas en las que la mujer tiene menos de 37 años (n = 47) y que corresponden a más del 70% de los pacientes tratados, se percibe que la tasa de fecundación mejora significativamente del 70,9% al 83,3% (P<0,05). La tasa de abortos espontáneos pasa del 36,3%, para las pacientes que recibieron un embrión del grupo de Control, al 9,1%, es decir, cuatro veces menos, para las que recibieron un embrión del grupo de Fertilina. De hecho, la tasa de embarazos progresivos que dan a luz a un niño pasa del 28,6% en el grupo de embriones de Control al 41,6% en el de los embriones del grupo de Fertilina.

Tabla 9: Resultados obtenidos en las parejas en las que la mujer tienen menos de 37 años en el marco del estudio Fertiline.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Utilizaciónin vitrode un péptido cíclico que comprende el péptido cíclico de fórmula C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) con un enlace de ciclación entre las dos cisteínas terminales que reproducen un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito, para la maduraciónin vitrode ovocitos inmaduros.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que los ovocitos son ovocitos humanos.

3. Utilización según la reivindicación 1 o 2, en la que los ovocitos se incuban durante un período comprendido entre 1 minuto y 4 días, en particular hasta 24 horas, en presencia de 1 a 100 pM de péptido.

4. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 3, para mejorar la ploidía de los ovocitos.

5. Utilizaciónin vitrode un péptido cíclico que comprende el péptido cíclico de fórmula C-S-F-E-E-C (SEQ ID NO: 1) con un enlace de ciclación entre las dos cisteínas terminales que reproducen un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito, para la crioconservación de los gametos y de los embriones.