ES3037112T3

ES3037112T3 - Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy

Info

Publication number: ES3037112T3
Application number: ES18728389T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin
Original assignee: Biontech SE
Current assignee: Biontech SE
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2025-09-29
Anticipated expiration: 2038-06-01
Also published as: JP7396903B2; IL271031A; JP2026041868A; IL271031B1; CN110741260B; US20250283888A1; FI3635408T3; HUE072622T2; RU2019139982A; US12270813B2; AU2018279117B2; TW201920959A; TWI865429B; SI3635408T1; SG10201912475XA; LT3635408T; DK3635408T3; TW202426040A; EP3635408B1; HRP20250791T8

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para predecir si péptidos o polipéptidos que comprenden modificaciones de aminoácidos específicas de una enfermedad, en particular neoantígenos asociados a tumores, contienen epítopos, en particular neoepítopos asociados a tumores, útiles para inmunoterapia, como la vacunación. Los métodos de la invención pueden utilizarse, en particular, para el suministro de vacunas específicas para el tumor de un paciente y, por lo tanto, en el contexto de vacunas personalizadas contra el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para predecir la utilidad de las modificaciones de aminoácidos específicos de la enfermedad para la inmunoterapia

Campo técnico

La presente invención se refiere a métodos para predecir si los péptidos o polipéptidos que comprenden modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, en particular neoantígenos asociados a tumores, comprenden epítopos, en particular neoepítopos asociados a tumores, que son útiles para la inmunoterapia, tal como para la vacunación. Los métodos de la invención se pueden utilizar, en particular, para el suministro de vacunas que sean específicas para el tumor de un paciente y, por lo tanto, en el contexto de vacunas personalizadas contra el cáncer.

Antecedentes

La evolución del sistema inmune dio lugar a los vertebrados en una red altamente efectiva basada en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa. A diferencia del antiguo sistema inmune innato evolutivo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con los patógenos, la inmunidad adaptativa se basa en receptores de antígenos altamente específicos en las células B (linfocitos B) y las células T (linfocitos T) y en la selección clonal. Mientras que las células B generan respuestas inmunes humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunes celulares que conducen a la destrucción de las células reconocidas.

Las células T desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células en humanos y animales. El reconocimiento y la unión de un antígeno particular está mediado por los receptores de células T expresados en la superficie de las células T El receptor de células T (TCR) de una célula T es capaz de interactuar con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células diana. La unión específica del TCR desencadena una cascada de señales dentro de la célula T que conduce a la proliferación y diferenciación en una célula T efectora madura. Para poder dirigirse a una gran variedad de antígenos, los receptores de las células T necesitan tener una gran diversidad.

La inmunoterapia específica de antígeno tiene como objetivo mejorar o inducir respuestas inmunes específicas en los pacientes para controlar enfermedades infecciosas o malignas. La identificación de un número creciente de antígenos asociados a patógenos y tumores condujo a una amplia colección de objetivos adecuados para la inmunoterapia. Las células que presentan péptidos inmunogénicos (epítopos) derivados de estos antígenos pueden ser atacadas específicamente mediante estrategias de inmunización activa o pasiva. La inmunización activa tiende a inducir y expandir células T específicas del antígeno en el paciente, que son capaces de reconocer y matar específicamente las células enfermas. Por el contrario, la inmunización pasiva se basa en la transferencia adoptiva de células T, que se expandieron y modificaron genéticamente opcionalmentein vitro(terapia de células T adoptivas; ACT).

Las vacunas tumorales tienen como objetivo inducir respuestas inmunes específicas de tumores endógenos mediante inmunización activa. Se pueden utilizar diferentes formatos de antígenos para la vacunación contra tumores, incluidas células enfermas completas, proteínas, péptidos o vectores inmunizantes como ARN, ADN o vectores virales que se pueden aplicar directamentein vivooin vitromediante pulsaciones de células dendríticas (DC) después de la transferencia al paciente.

Las mutaciones somáticas en el cáncer son objetivos ideales para los enfoques de vacunas terapéuticas (Castle, J.C. et al. Cancer Res. 72, 1081-1091 (2012); Schumacher, T.N. & Schreiber, R.D. Science 348, 69-74 (2015); Türeci, O. et al. Clin. Cancer Res. 22, 1885-1896 (2016)). Pueden procesarse en péptidos, presentarse en la superficie de las células tumorales y ser reconocidos por las células T como neoepítopos. Los neoepítopos están exentos de la tolerancia inmunitaria central y ausentes en el tejido sano, lo que combina una inmunogenicidad potencialmente fuerte con una menor probabilidad de autoinmunidad. Datos emergentes indican que los resultados clínicos favorables de las inmunoterapias clínicas, como el bloqueo de puntos de control (Rizvi, N. A. et al. Science348,124-128 (2015); Snyder, A. et al. N. Engl. J. Med. 371,2189-2199 (2014); Van Allen, E. M. et al. Science 350, 207-211 (2015); Le, D. T. et al. N. Engl. J. Med. 372, 2509-2520 (2015); Mcgranahan, N. et al. Science 351, 1463-1469 (2016)) y terapía de células T adoptivas (Tran, E. et al. Science 344, 641-645 (2014); Robbins, P. F. et al. Nat. Med. 19, 747-752 (2013); Tran, E. et al. N. Engl. J. Med. 375, 2255-2262 (2016)) están asociados con el reconocimiento inmunológico del neoepítopo. Demostramos en modelos de tumores de ratón que una fracción sustancial del mutanoma (es decir, la totalidad de las mutaciones somáticas identificadas mediante secuenciación de próxima generación) es inmunogénica y que estos neoepítopos son reconocidos preferentemente por células T CD4+. Las vacunas compuestas de neoepítopos predichasin silicoa partir de datos del mutanoma mostraron una fuerte actividad antitumoral e indujeron el rechazo completo de tumores de ratón establecidos y de crecimiento agresivo (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)). De la misma manera, los neoepítopos de clase I del MHC identificados en modelos tumorales de ratón mediante análisis del exorna y del transcriptoma, ya sea solos o combinados con espectrometría de masas, parecen ser objetivos de vacunas adecuados y antígenos de rechazo tumoral (Yadav, M. et al. Nature 515, 572-576 (2014); Gubin, M.M. et al. Nature 515, 577-581 (2014)). En conjunto, estos estudios han generado entusiasmo por las vacunas de neoepítopos (Carreno, B. M. et al. Science 348, 803-808 (2015); Bobisse, S., Foukas, P G., Coukos, G. & Harari, A. Ann. Transl. Med. 4, 262 (2016); Katsnelson, A. Nat. Med. 22, 122-124 (2016); Delamarre, L., Mellman, I. & Yadav, M. Science 348, 760-1 (2015)).

En el cáncer humano, la gran mayoría de las mutaciones del cáncer son exclusivas de cada paciente y, por lo tanto, se requieren estrategias de tratamiento personalizadas. Para cada paciente, es necesario determinar el perfil personal de mutación del cáncer mediante una secuenciación profunda para determinar la composición de la vacuna adaptada individualmente que se fabricará de acuerdo con demanda.

En el presente documento informamos sobre la primera aplicación en humanos de esta inmunoterapia personalizada en pacientes con melanoma en estadio III y IV. Establecimos un proceso que cumple con las pautas de desarrollo clínico, que incluye la secuenciación de próxima generación para la identificación integral de mutaciones individuales a partir de biopsias tumorales de rutina, la predicción computacional de neoepítopos de HLA clase I y clase II potencialmente relevantes, así como el diseño y la fabricación de una vacuna de ARN poli-neoepítopo única para cada paciente. Los pacientes elegibles comenzaron con una vacuna de antígeno tumoral compartida compuesta de NY-ESO-1 y ARN de tirosinasa hasta la liberación de su vacuna de ARN personalizada. En total, 13 pacientes completaron el tratamiento, que demostró ser factible, seguro y bien tolerado. La tasa de inmunogenicidad fue sorprendentemente alta. El 60 % de los neoepítopos fueron reconocidos específicamente por las células T inducidas por la vacuna. Cada paciente respondió a al menos tres de sus diez neoantígenos individuales y se movilizó un repertorio de t Cr amplio y diversificado. Las frecuencias de células T específicas de neoepítopos en la sangre entre dos y cuatro semanas después del inicio de la vacunación variaron desde números bajos que requerían detectar expansiónin vitro,hasta un alto porcentaje de un solo dígito. En los dos pacientes con metástasis de melanoma resecadas después de la vacunación se observaron infiltrados activos con células T reactivas al neoepítopo inducidas por la vacuna y muerte específica del neoepítopo de células tumorales autólogas.

La evaluación clínica de los eventos metastásicos recurrentes acumulativos en todos los pacientes reveló una disminución altamente significativa tras la vacunación con ARN del neoepítopo en comparación con el historial de enfermedad previo de los pacientes, lo que dio lugar a un resultado clínico altamente favorable con una supervivencia libre de progresión sostenida. Un paciente con metástasis múltiples tratado sólo durante un corto período de tiempo con la vacuna del neoepítopo debido a la rápida progresión del tumor respondió casi instantáneamente al bloqueo posterior de<p>D-1 y experimentó una respuesta completa. En dos pacientes se documentó la regresión objetiva del tumor relacionada con el tratamiento directo con vacuna de neoepítopo. Uno de estos pacientes tuvo una respuesta completa de metástasis progresiva y un control sostenido de la enfermedad durante 26 meses. Un segundo paciente experimentó una respuesta tumoral objetiva, pero a pesar de la presencia de células T reactivas al neoantígeno poliespecíficas y totalmente funcionales, tuvo una recaída tardía.

La definición de epítopos adecuados para la inmunoterapia sigue siendo un desafío. De este modo, existe la necesidad de un modelo para predecir si un epítopo, en particular un neoepítopo, será útil en la inmunoterapia.

La subtipificación de las respuestas específicas del neoepítopo no solo confirmó nuestro hallazgo previo de la alta frecuencia de reconocimiento mediado por células T CD4+ de neoepítopos inmunogénicos (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)), pero también mostró respuestas de células T CD8+ contra una cuarta parte de los neoepítopos utilizados para las vacunas. El predominio de respuestas de CD4+ contra las mutaciones pueden explicarse por la alta promiscuidad de la molécula HLA de clase II con respecto a la composición y longitud del ligando peptídico, mientras que la molécula HLA de clase I altamente específica se une a un conjunto limitado de péptidos de una distribución de longitud estrecha (Arnold, PY et al. J. Immunol. 169, 739 49 (2002)). Aproximadamente dos tercios de las respuestas CTL observadas se dirigieron contra mutaciones que fueron reconocidas concomitantemente por células T CD4+ que reaccionan contra una posición diferente del neoepítopo respectivo. Como el 50 % de todos los neoepítopos incluidos en la vacuna exhibieron una respuesta de las células T CD4+, el vínculo observado probablemente no sea una pura coincidencia de respuestas inmunes del neoepítopo CD4+ y CD8. Se sabe que los epítopos CTL que están unidos covalentemente a los epítopos auxiliares son más inmunogénicos (Shirai, M. et al. J. Immunol. 152, 549-556 (1994)). Las mutaciones que albergan neoepítopos de HLA de clase I y de clase II proporcionan condiciones mecanísticamente favorables para el cebado de CTL, ya que las células T CD4+ reconocen su ligando en las DC que presentan de forma cruzada el neoepítopo de células T CD8+ y proporciona ayuda a las células T afines mediante la activación de DC mediada por CD40L (Schoenberger, S.P, Toes, R.E., van der Voort, E.I., Offringa, R. & Melief, C.J. Nature 393, 480-3 (1998)). En una nota relacionada, también encontramos que una y la misma mutación puede dar lugar a neoepítopos presentados en diferentes elementos de restricción de clase I de HLA y reconocidos por células T CD8+ independientes (Fig. 3b). Asimismo, descubrimos que un mismo complejo epítopo/elemento de restricción es reconocido por células T específicas del neoepítopo con diferentes clonotipos de TCR. Estos hallazgos ilustran que un repertorio inesperadamente amplio de células T específicas de mutación puede ser reclutado por la vacunación con neoepítopos y que cada mutación individual aprovecha una diversidad de especificidades de las células T

En resumen, los hallazgos presentados en este trabajo demuestran que la definición de vacunas de neoepítopos personalizadas adecuadas, en particular vacunas de neoepítopos de ARN personalizadas, pueden desplegar un amplio repertorio de células T específicas de neoantígeno en pacientes con cáncer, lo que permite una direccionamiento eficaz de su mutanoma.

Resumen de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de la invención se refiere a un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, en donde la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se identifica mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad mediante la secuenciación de ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o de una o más células enfermas, comprendiendo el método determinar uno 0 más de los siguientes:

(i) determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC, en donde la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC con células T restringidas a diferentes clases del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia,

(ii) determinar si un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T, en donde la reactividad de un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC con células T que tienen diferentes receptores de células T indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia,

y/o

(iii) determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, en donde la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia;

en donde, preferiblemente, (a) las moléculas del MHC de diferentes clases son moléculas del MHC de clase I y moléculas del MHC de clase II y/o las células T restringidas a diferentes clases del MHC son células T CD4+ y CD8+, y/o (b) las diferentes moléculas del MHC de la misma clase son diferentes moléculas del MHC de clase 1 y/o las diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC son diferentes células T CD8+.

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de una enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, en donde las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se identifican mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad mediante la secuenciación de ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o de una o más células enfermas, comprendiendo el método las etapas de:

(i) identificar péptidos y/o polipéptidos expresados en células enfermas, comprendiendo cada péptido y/o polipéptido al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, y

(ii) determinar uno o más de los siguientes:

(1) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprende la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC, en donde la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC con células T restringidas a diferentes clases del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia,

(2) determinar si un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T, en donde la reactividad de un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC con células T que tienen diferentes receptores de células T indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia,

y/o

(3) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprende la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, en donde la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para inmunoterapia,

y

(iii) repetir la etapa (ii) para al menos una modificación de aminoácidos adicional identificada en (i);

en donde, preferiblemente, (a) las moléculas del MHC de diferentes clases son moléculas del MHC de clase I y moléculas del MHC de clase II y/o las células T restringidas a diferentes clases del MHC son células T CD4+ y CD8+, y/o (b) las diferentes moléculas del MHC de la misma clase son diferentes moléculas del MHC de clase I y/o las diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC son diferentes células T CD8+.

En una realización del método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii) están presentes en el mismo y/o en diferentes péptidos o polipéptidos. En algunas realizaciones, el método comprende comparar las puntuaciones obtenidas para las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii).

En una realización de todos los aspectos de la invención, los diferentes receptores de células T son de diferentes clonotipos. En una realización de todos los aspectos de la invención, la(s) modificación(es) de aminoácidos específica(s) de la enfermedad se debe(n) a (a) mutación(es) somática(s) específica(s) de la enfermedad. En una realización de todos los aspectos de la invención, la enfermedad es cáncer y la inmunoterapia es inmunoterapia contra el cáncer.

En una realización de todos los aspectos de la invención, la inmunoterapia comprende la administración de uno o más de los siguientes:

(i) un péptido o polipéptido expresado en células enfermas, comprendiendo el péptido o polipéptido al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad,

(ii) un péptido o polipéptido que comprende un fragmento del péptido o polipéptido de acuerdo con (i), comprendiendo el fragmento al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, y

(iii) un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido de acuerdo con (i) o (ii).

Otro aspecto de la invención se refiere a un método para proporcionar una vacuna que comprende las etapas de:

(i) identificar una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se prevé que sean útiles para la inmunoterapia mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

(ii) proporcionar una vacuna que comprenda uno o más de los siguientes:

(1) un péptido o polipéptido expresado en células enfermas, comprendiendo el péptido o polipéptido al menos una de las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se prevé que sean útiles para la inmunoterapia,

(2) un péptido o polipéptido que comprende un fragmento del péptido o polipéptido de acuerdo con (1), comprendiendo el fragmento al menos una de las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se prevé que sean útiles para la inmunoterapia, y

(3) un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido de acuerdo con (1) o (2).

En una realización de todos los aspectos de la invención, el fragmento es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial o puede procesarse para proporcionar un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial.

Resumen de la enseñanza

La presente divulgación proporciona enseñanzas que, en algunos aspectos, van más allá de la invención como tal, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. Las enseñanzas se proporcionan para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. La información técnica adicional que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no es parte de la invención. En particular, los términos "realización" y "aspecto" no deben interpretarse como necesariamente referidos a una realización de la invención, a menos que la "realización" o el "aspecto" en cuestión estén dentro del alcance de las reivindicaciones.

Las referencias a métodos de tratamiento en el resumen de la enseñanza y la descripción detallada deben interpretarse como referencias a compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente enseñanza para su uso en los métodos de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Un aspecto de la enseñanza se relaciona con un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC, preferiblemente moléculas del MHC de diferentes clases, son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC.

En una realización, las moléculas del MHC de diferentes clases son moléculas del MHC de clase I y moléculas del MHC de clase II y/o las células T restringidas a diferentes clases del MHC son células T CD4+ y CD8+. En una realización, la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC con células T restringidas a diferentes clases del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia.

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar si un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T

En una realización, los diferentes receptores de células T son de diferentes clonotipos. En una realización, la reactividad de un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC con células T que tienen diferentes receptores de células T indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia.

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC.

En una realización, las diferentes moléculas del MHC de la misma clase son diferentes moléculas del MHC de clase I y/o las diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC son diferentes células T CD8+. En una realización, la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia.

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, comprendiendo el método determinar uno o más de los siguientes:

(i) determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC, preferiblemente moléculas del MHC de diferentes clases, son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC,

(ii) determinar si un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC, es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T, y/o

(iii) determinar si los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC.

En una realización, las moléculas del MHC de diferentes clases son moléculas del MHC de clase I y moléculas del MHC de clase II y/o las células T restringidas a diferentes clases del MHC son células T CD4+ y CD8+. En una realización, la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC con células T restringidas a diferentes clases del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia. En una realización, los diferentes receptores de células T son de diferentes clonotipos. En una realización, la reactividad de un fragmento del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC con células T que tienen diferentes receptores de células T indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia. En una realización, las diferentes moléculas del MHC de la misma clase son diferentes moléculas del MHC de clase I y/o las diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC son diferentes células T CD8+. En una realización, la presentación de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o la reactividad de los mismos o diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC indica que la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad es útil para la inmunoterapia.

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, comprendiendo el método las etapas de:

(ii) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprenden la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC, preferiblemente moléculas del MHC de diferentes clases, son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC, y

(iii) repetir la etapa (ii) para al menos una modificación de aminoácidos adicional identificada en (i).

(ii) determinar si un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad, cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC, es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T, y

(ii) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprenden la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, y

(ii) determinar uno o más de los siguientes:

(1) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprenden la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC, preferiblemente moléculas del MHC de diferentes clases, son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC,

(2) determinar si un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad, cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC, es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T, y/o

(3) determinar si los mismos o diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprenden la misma modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, y

En una realización del método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii) están presentes en el mismo y/o en diferentes péptidos o polipéptidos. En una realización, el método de enseñanza comprende comparar las puntuaciones obtenidas para las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii).

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la(s) modificación(es) de aminoácidos específicas de la enfermedad se deben a (a) mutación(es) somáticas específicas de la enfermedad. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la enfermedad es el cáncer y la inmunoterapia es inmunoterapia contra el cáncer. En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la inmunoterapia comprende la administración de uno o más de los siguientes:

(iii) un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido de acuerdo con (i) o (ii). En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el método de la enseñanza es útil para proporcionar una vacuna.

Otro aspecto de la enseñanza se refiere a un método para proporcionar una vacuna que comprende las etapas:

(i) identificar una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se prevé que sean útiles para la inmunoterapia mediante cualquiera de los métodos de la enseñanza,

(ii) proporcionar una vacuna que comprenda uno o más de los siguientes:

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, el fragmento es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial o puede procesarse para proporcionar un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial (por ejemplo, la predicción de unión al MHC indica que el fragmento se unirá al MHC).

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con una vacuna producida de acuerdo con el método de la enseñanza. Una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y puede comprender opcionalmente uno o más adyuvantes, estabilizadores, etc. La vacuna puede tener la forma de una vacuna terapéutica o profiláctica.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, la indicación de una utilidad de una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad para inmunoterapia indica que el péptido o polipéptido expresado en una célula enferma que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad o un péptido o polipéptido que comprende un fragmento del mismo, tal como un epítopo o secuencia de vacuna que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad tras la administración (opcionalmente en el formato del ácido nucleico codificante) inducirá una respuesta inmunitaria.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, las modificaciones de aminoácidos en péptidos o polipéptidos se identifican mediante la identificación de mutaciones no sinónimas en una o más regiones codificantes. En una realización, las modificaciones de aminoácidos se identifican secuenciando parcial o completamente el genoma o transcriptoma de una o más células, tales como una o más células cancerosas y opcionalmente una o más células no cancerosas, e identificando mutaciones en una o más regiones codificantes. En una realización, dichas mutaciones son mutaciones somáticas. En una realización, dichas mutaciones son mutaciones cancerosas.

En una realización de todos los aspectos de la enseñanza, en particular con el fin de proporcionar una vacuna personalizada para un paciente tal como un paciente con cáncer, la(s) modificación(es) están presentes en dicho paciente y los métodos de la enseñanza se realizan para dicho paciente.

Otro aspecto de la enseñanza se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un paciente, que comprende administrar al paciente una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza.

Otro aspecto de la enseñanza se refiere a un método de tratamiento de un paciente que comprende las etapas de:

a) proporcionar una vacuna utilizando los métodos de acuerdo con la enseñanza; y

(b) administrar la vacuna al paciente.

Otro aspecto de la enseñanza se relaciona con un método de tratamiento de un paciente que comprende administrar una vacuna como se describe en el presente documento al paciente.

En una realización, el paciente es un paciente con cáncer y la vacuna es una vacuna contra el cáncer, tal como una vacuna cuya administración proporciona neoepítopos específicos del cáncer.

En otros aspectos, la enseñanza proporciona una vacuna como se describe en este documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en este documento, en particular para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.

Los tratamientos del cáncer descritos en este documento pueden combinarse con resección quirúrgica y/o radiación y/o quimioterapia tradicional.

Otras características y ventajas de la presente enseñanza se desprenderán de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Descripción detallada

Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no está limitada a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la materia.

A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los diversos ejemplos y realizaciones preferidas descritos no deben interpretarse como que limitan la presente enseñanza únicamente a las realizaciones descritas explícitamente. Esta descripción debe entenderse como que respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos utilizados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (cf., por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderán que implican la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidas, pero no la exclusión de cualquier otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas, aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el objeto consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo de miembros, números enteros o etapas establecidos. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse de manera que cubran tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto los contradiga claramente. La mención de intervalos de valores que se incluye en el presente documento tiene como único fin servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en este documento.

Todos los métodos descritos en este documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en este documento tiene como único fin ilustrar mejor la enseñanza y no supone una limitación en el alcance de la enseñanza que de otro modo se reivindica. Ningún expresión de la memoria descriptiva debe interpretarse como indicativo de algún elemento no reivindicado que sea esencial para la práctica de la enseñanza.

La presente enseñanza prevé la inmunoterapia de enfermedades, en particular de enfermedades cancerosas, utilizando una proteína o un fragmento de proteína presente en las células enfermas como etiqueta y como diana para las células enfermas. En particular, las células enfermas pueden ser atacadas apuntando a un fragmento de una proteína presentada en la superficie de las células enfermas en el contexto del MHC. Específicamente, la presente enseñanza tiene como objetivo definir modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad en péptidos o polipéptidos expresados en células enfermas, modificaciones que se encuentran dentro de fragmentos de los péptidos o polipéptidos adecuados para la inmunoterapia. Dichos fragmentos que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad son o comprenden neoepítopos adecuados para inmunoterapia, en particular para provocar una respuesta inmunitaria celular eficiente contra células enfermas que expresan péptidos o polipéptidos que comprenden las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad y fragmentos de los péptidos o polipéptidos. Una vez que se ha identificado un fragmento adecuado que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad, dicho fragmento (opcionalmente como parte de un polipéptido más grande) o un ácido nucleico que codifica el fragmento (opcionalmente como parte de un polipéptido más grande) se puede utilizar como una vacuna para mejorar o inducir una respuesta inmune contra células que expresan el péptido o polipéptido modificado del que se deriva el fragmento, en particular induciendo y/o activando células efectoras apropiadas, tales como células T que reconocen células que expresan el péptido o polipéptido modificado cuando se presentan en el contexto del MHC.

De acuerdo con la enseñanza, un péptido o polipéptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad y que se expresa en células enfermas también se denomina "neoantígeno" en el presente documento. Además, de acuerdo con la enseñanza, un fragmento de un neoantígeno que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, es reconocido por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocido por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC, y que preferiblemente se ha determinado mediante los métodos de la enseñanza que es útil para la inmunoterapia (opcionalmente como parte de un polipéptido más grande, por ejemplo, como parte del neoantígeno o un péptido o polipéptido artificial, por ejemplo, como parte de un polipéptido multiepitópico que comprende, por ejemplo, 2 o más de los neoepítopos que se han determinado mediante los métodos de la enseñanza que son útiles para la inmunoterapia) también se denomina "neoepítopo" en el presente documento.

De acuerdo con la enseñanza, una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad se debe preferiblemente a mutación(es) somáticas específicas de la enfermedad. En una realización particularmente preferida, una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad es una modificación de aminoácidos específica de un cáncer y una mutación somática específica de una enfermedad es una mutación somática específica de un cáncer. De este modo, de acuerdo con la enseñanza, una vacuna preferentemente presenta modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad/mutaciones somáticas específicas de la enfermedad de un paciente y preferentemente tras su administración proporciona uno o más neoepítopos basados en mutaciones. De este modo, la vacuna puede comprender un péptido o polipéptido que comprende uno o más neoepítopos basados en mutaciones, o un ácido nucleico que codifica dicho péptido o polipéptido.

En una realización, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se identifican mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad, por ejemplo, mediante la secuenciación de ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o de una o más células enfermas.

De acuerdo con la presente enseñanza, el término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.

De acuerdo con la enseñanza, el término "modificación de aminoácidos específica de la enfermedad" se refiere a una modificación de aminoácidos que está presente en la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido de una célula enferma pero ausente en la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido de una célula normal correspondiente, es decir, no enferma.

De acuerdo con la enseñanza, el término "modificación de aminoácidos específica de un tumor" o "modificación de aminoácidos específica de un cáncer" se refiere a una modificación de aminoácidos que está presente en la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido de una célula tumoral o cancerosa pero ausente en la secuencia de aminoácidos de un péptido o polipéptido de una célula normal correspondiente, es decir, no tumoral o no cancerosa.

De acuerdo con la enseñanza, el término "modificación" con respecto a péptidos, polipéptidos o proteínas se relaciona con un cambio de secuencia en un péptido, polipéptido o proteína en comparación con una secuencia parental tal como la secuencia de un péptido, polipéptido o proteína de tipo silvestre. El término incluye variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y variantes de sustitución de aminoácidos, preferiblemente variantes de sustitución de aminoácidos. Todos estos cambios de secuencia de acuerdo con la enseñanza pueden potencialmente crear nuevos epítopos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones en el terminal amino y/o carboxilo de uno o más aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes por eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, como, por ejemplo, mediante la eliminación de 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan porque se elimina al menos un residuo de la secuencia y se inserta otro en su lugar.

De acuerdo con la enseñanza, una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad o un fragmento de péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad tal como un epítopo o una secuencia de vacuna puede derivarse de un péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad.

El término "derivado" significa de acuerdo con la enseñanza que una entidad particular, tal como una secuencia de aminoácidos particular, está presente en el objeto del cual se deriva. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente de regiones de secuencias particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

De acuerdo con la enseñanza, los péptidos o polipéptidos descritos en este documento comprenden preferiblemente una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad. En una realización, estas una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se ubican dentro de epítopos o epítopos potenciales del péptido o polipéptido. De este modo, los péptidos o polipéptidos preferidos descritos en este documento son neoantígenos que comprenden preferiblemente uno o más neoepítopos. De manera similar, un fragmento de péptido o polipéptido preferido descrito en este documento es un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, en donde una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se encuentran dentro del fragmento. De este modo, un fragmento de péptido o polipéptido preferido descrito en este documento es un neoepítopo.

De acuerdo con la enseñanza, el término "mutación específica de la enfermedad" se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de una célula enferma pero ausente en el ácido nucleico de una célula normal correspondiente, es decir, no enferma.

De acuerdo con la enseñanza, el término "mutación específica de tumor" o "mutación específica de cáncer" se refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de una célula tumoral o cancerosa pero ausente en el ácido nucleico de una célula normal correspondiente, es decir, no tumoral o no cancerosa. Los términos "mutación específica del tumor" y "mutación tumoral" y los términos "mutación específica del cáncer" y "mutación del cáncer" se utilizan indistintamente en el presente documento.

El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmunológico. El término "respuesta inmune" incluye la respuesta inmune innata y la respuesta inmune adaptativa. Preferiblemente, la respuesta inmune está relacionada con una activación de células inmunes y, más preferiblemente, está relacionada con una respuesta inmune celular.

Se prefiere que la respuesta inmune inducida por las composiciones descritas en este documento comprenda las etapas de activación de células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas y/o macrófagos, presentación de un antígeno o fragmento del mismo por dichas células presentadoras de antígeno y activación de células T citotóxicas debido a esta presentación.

"Inducir una respuesta inmune" puede significar que no hubo respuesta inmune antes de la inducción, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmune antes de la inducción y después de la inducción dicha respuesta inmune se mejora. De este modo, "inducir una respuesta inmune" también incluye "mejorar una respuesta inmune". Preferiblemente, después de inducir una respuesta inmune en un sujeto, dicho sujeto está protegido de desarrollar una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o la condición de la enfermedad se mejora al inducir una respuesta inmune. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmune contra un antígeno expresado en un tumor en un paciente que padece una enfermedad cancerosa o en un sujeto que corre el riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Inducir una respuesta inmune en este caso puede significar que la condición de la enfermedad del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.

Los términos "respuesta inmune celular" y "respuesta celular" o términos similares se refieren a una respuesta inmune dirigida a las células caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I o clase II que involucra células T o linfocitos T que actúan como "auxiliares" o "asesinos". Las células T colaboradoras (también llamadas células T CD4+) desempeñan un papel central al regular la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan células enfermas, como las cancerosas, previniendo la producción de más células enfermas. En realizaciones preferidas, la presente enseñanza implica la estimulación de una respuesta de CTL antienfermedad contra células enfermas que expresan uno o más antígenos asociados a la enfermedad y preferiblemente presentan dichos antígenos asociados a la enfermedad con MHC de clase I, particularmente una respuesta de CTL antitumoral contra células tumorales que expresan uno o más antígenos expresados por tumores y preferiblemente presentan dichos antígenos expresados por tumores con MHC de clase I.

De acuerdo con la enseñanza, el término "antígeno" o "inmunógeno" cubre cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o polipéptido, que sea un objetivo de una respuesta inmune y/o que provocará una respuesta inmune. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). En una realización, el término "antígeno" comprende una molécula que comprende al menos un epítopo, tal como un epítopo de célula T. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que es preferiblemente específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno. En el contexto de las realizaciones de la presente enseñanza, un antígeno es presentado preferiblemente por una célula, preferiblemente por una célula presentadora de antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, lo que da como resultado una reacción inmune contra el antígeno o las células que expresan el antígeno.

El término "antígeno asociado a la enfermedad" se utiliza en su sentido más amplio para referirse a cualquier antígeno asociado con una enfermedad. En una realización, un antígeno asociado a una enfermedad es una molécula que contiene uno o más epítopos que estimularán el sistema inmunológico de un huésped para producir una respuesta inmune celular contra las células enfermas. De este modo, el antígeno asociado a la enfermedad puede utilizarse con fines terapéuticos. Los antígenos asociados a enfermedades pueden estar asociados con el cáncer, típicamente tumores.

De acuerdo con la enseñanza, el término "neoantígeno" se refiere a un péptido o polipéptido que incluye una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con el péptido o polipéptido original. Por ejemplo, el neoantígeno puede ser un neoantígeno asociado a un tumor, donde el término "neoantígeno asociado a un tumor" incluye un péptido o polipéptido que incluye modificaciones de aminoácidos debido a mutaciones específicas del tumor.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de un antígeno que es reconocido por el sistema inmune, por ejemplo, que es reconocido por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC. Un epítopo de un péptido o polipéptido comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicho péptido o polipéptido y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. En una realización, un epítopo puede unirse a moléculas del MHC, tales como moléculas del MHC en la superficie de una célula, y opcionalmente puede ser reconocido por un receptor de células T, tal como un receptor de células T en la superficie de una célula T De este modo, en una realización, un epítopo es un "péptido de unión al MHC" y, más preferiblemente, un "epítopo de células T".

El término "complejo mayor de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluyen moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II y se relacionan con un complejo de genes que está presente en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígeno o células enfermas en reacciones inmunes, en donde las proteínas o moléculas del MHC se unen a los péptidos y los presentan para su reconocimiento por los receptores de células T Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos no propios (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T

La región del MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena a y p2-microglobulina (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmune, específicamente en las células presentadoras de antígeno, las proteínas del MHC de clase II contienen cadenas a y p y presentan fragmentos de antígenos a las células T colaboradoras. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunes, como los componentes del complemento y algunos que codifican citocinas.

El MHC es a la vez poligénico (hay varios genes del MHC de clase I y MHC de clase II) y polimórfico (hay múltiples alelos de cada gen).

Tal como se utiliza en este documento, el término "haplotipo" se refiere a los alelos del MHC que se encuentran en un cromosoma y las proteínas codificadas por ellos. El haplotipo también puede referirse al alelo presente en cualquier locus dentro del MHC. Cada clase del MHC está representada por varios loci: por ejemplo, HLA-A (antígeno leucocitario humano A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P y HLA-V para la clase I y HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-d Ma , HLA-DMB, HLA-Do A, y HLA-DOB para la clase II. Los términos "alelo del HLA" y "alelo del MHC" se utilizan indistintamente en este documento.

Los MHC exhiben un polimorfismo extremo: dentro de la población humana hay, en cada locus genético, un gran número de haplotipos que comprenden alelos distintos. Diferentes alelos polimórficos del MHC, tanto de clase I como de clase II, tienen diferentes especificidades peptídicas: cada alelo codifica proteínas que se unen a péptidos que exhiben patrones de secuencia particulares.

En una realización preferida de todos los aspectos de la enseñanza, una molécula del MHC es una molécula de HLA.

Tal como se utiliza en este documento, se dice que un péptido o epítopo "se presenta en el contexto de una molécula del MHC" si el péptido o epítopo se une a la molécula del MHC. Dicha unión puede detectarse utilizando cualquier ensayo conocido en la técnica. El término "péptido de unión al MHC" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC de clase I y/o de MHC de clase II. En el caso de los complejos del MHC/péptido de clase I, los péptidos de unión suelen tener una longitud de 8-10 aminoácidos, aunque pueden ser eficaces péptidos más largos o más cortos. En el caso de los complejos MHC/péptido de clase II, los péptidos de unión suelen tener una longitud de 10-25 aminoácidos, y en particular de 13-18 aminoácidos, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser eficaces. En una realización preferida de todos los aspectos de la enseñanza, una molécula del m Hc es una molécula del HLA.

Si un péptido o epítopo es parte de una entidad más grande que comprende secuencias adicionales, por ejemplo, de una secuencia de vacuna o polipéptido, y se va a presentar después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido o epítopo producido por el procesamiento tiene una longitud que es adecuada para unirse a una molécula del MHC. Preferiblemente, la secuencia del péptido o epítopo que se va a presentar después del procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno o polipéptido utilizado para la vacunación, es decir, su secuencia corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento del antígeno o polipéptido.

De este modo, un péptido de unión al MHC en una realización comprende una secuencia que corresponde sustancialmente y es preferiblemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno.

Tal como se utiliza en este documento, el término "neoepítopo" incluye un epítopo que no está presente en una referencia, como una célula normal no enferma (por ejemplo, no cancerosa) o una célula de la línea germinal, pero que se encuentra en células enfermas (por ejemplo, células cancerosas). Esto incluye, en particular, situaciones en las que en una célula normal no enferma o de la línea germinal se encuentra un epítopo correspondiente, sin embargo, debido a una o más mutaciones en una célula enferma la secuencia del epítopo se modifica de modo de dar lugar al neoepítopo.

Tal como se utiliza en este documento, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T Normalmente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Un epítopo de célula T de acuerdo con la enseñanza se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizada por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno tales como células enfermas, en particular células cancerosas. Preferiblemente, un epítopo de célula T es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico sensible al antígeno (CTL).

En una realización, una vacuna de acuerdo con la presente enseñanza proporciona uno o más neoepítopos adecuados para la vacunación de un organismo objetivo. Un experto en la materia sabrá que uno de los principios de la inmunobiología y de la vacunación se basa en el hecho de que una reacción inmunoprotectora frente a una enfermedad se produce inmunizando un organismo con una vacuna, que es inmunológicamente relevante con respecto a la enfermedad a tratar. De acuerdo con la presente enseñanza, un antígeno es preferiblemente un autoantígeno.

El término "inmunogenicidad" se relaciona con la efectividad relativa para inducir una respuesta inmune que se asocia preferiblemente con tratamientos terapéuticos, como los tratamientos contra el cáncer. Tal como se utiliza en este documento, el término "inmunogénico" se relaciona con la propiedad de tener inmunogenicidad. Por ejemplo, el término "modificación inmunogénica" cuando se utiliza en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína se relaciona con la efectividad de dicho péptido, polipéptido o proteína para inducir una respuesta inmune que es causada por y/o dirigida contra dicha modificación. Preferiblemente, el péptido, polipéptido o proteína no modificado no induce una respuesta inmune, induce una respuesta inmune diferente o induce un nivel diferente, preferiblemente un nivel inferior, de respuesta inmune.

De acuerdo con la enseñanza, el término "inmunogenicidad" o "inmunogénico" se refiere preferentemente a la eficacia relativa para inducir una respuesta inmune biológicamente relevante, en particular una respuesta inmune que sea útil para la vacunación. Por lo tanto, en una realización preferida, una modificación de aminoácidos o un péptido modificado es inmunogénico si induce una respuesta inmune contra la modificación objetivo en un sujeto, respuesta inmune que puede ser beneficiosa para fines terapéuticos o profilácticos.

Como se utiliza en este documento, el término "evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad para inmunoterapia" o "predecir si una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad es útil para inmunoterapia" se refiere a una predicción de si la modificación de aminoácidos específica de una enfermedad, en particular el antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad o un fragmento del antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, tal como un fragmento del antígeno que comprende uno o más epítopos que comprenden la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, en particular uno o más epítopos de células T, será útil para inducir una respuesta inmunitaria o dirigir una respuesta inmunitaria. El término "modificación de aminoácidos específica de la enfermedad que se prevé que sea útil para inmunoterapia" o términos similares se refieren al hecho de que se ha previsto que una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, en particular el antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad o un fragmento del antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, tal como un fragmento del antígeno que comprende uno o más epítopos que comprenden la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, en particular uno o más epítopos de células T, sea útil para inducir una respuesta inmunitaria o dirigir una respuesta inmunitaria. Si se predice que una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad será útil para inmunoterapia, por ejemplo, el antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad o un fragmento del antígeno que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad tal como un fragmento del antígeno que comprende uno o más epítopos que comprenden la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, en particular uno o más epítopos de células T, se puede utilizar para la vacunación o el diseño de una vacuna como se describe en este documento.

De acuerdo con la enseñanza, un epítopo tal como un epítopo de célula T puede estar presente en una vacuna como parte de una entidad más grande tal como una secuencia de vacuna y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo. El péptido o epítopo presentado se produce después de un procesamiento adecuado. Además, los epítopos pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para la unión al MHC o para el reconocimiento del TCR. Estos epítopos modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes. Preferiblemente, un epítopo cuando es presentado por MHC y reconocido por un receptor de células T es capaz de inducir, en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de la célula T que porta el receptor de células T que reconoce específicamente el complejo péptido/MHC. Preferiblemente, un epítopo comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por MHC de clase I y/o de clase II.

"Procesamiento de antígeno" o "procesamiento" se refiere a la degradación de un péptido, polipéptido o proteína en productos del procesamiento, que son fragmentos de dicho péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la degradación de un polipéptido en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, a través de la unión) con moléculas del MHC para su presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígeno, a células T específicas.

Las "células presentadoras de antígeno" (APC) son células que presentan fragmentos peptídicos de antígenos proteicos en asociación con moléculas del MHC en su superficie celular. Algunas APC pueden activar células T específicas de antígeno.

Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficientes al internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptores, y luego presentan un fragmento del antígeno, unido a una molécula del MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo antígenomolécula del MHC de clase II en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional que conduce a la activación de la célula T La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígeno profesionales.

Los principales tipos de células presentadoras de antígeno profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos y son probablemente las células presentadoras de antígeno más importantes, los macrófagos, las células B y ciertas células epiteliales activadas. Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las vías de presentación de antígenos de clase II y I del MHC. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de la inmunidad antitumoral. Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", lo que puede utilizarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe interpretarse como que excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como células presentadoras de antígeno con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de las células T, como MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB). La maduración de las células dendríticas se refiere al estado de activación de las células dendríticas en el cual dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por parte de células dendríticas inmaduras da como resultado tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L y sustancias liberadas por células que experimentan muerte celular estresante. Las células dendríticas pueden obtenerse mediante el cultivo de células de la médula óseain vitrocon citocinas, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

Las células presentadoras de antígeno no profesionales no expresan de forma constitutiva las proteínas del MHC de clase II necesarias para la interacción con las células T no modificadas; estas se expresan únicamente tras la estimulación de las células presentadoras de antígeno no profesionales por ciertas citocinas como el IFNy.

Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula presentadora de un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma, por ejemplo, una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta un antígeno o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, mediante procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, en particular moléculas del MHC de clase I. De manera similar, el término "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denota una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula puede efectuarse transfectando la célula con un ácido nucleico como el ARN que codifica el antígeno.

Por "fragmento de un antígeno que es presentado" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede ser presentado por el MHC de clase I o de clase II, preferiblemente el MHC de clase I, por ejemplo, cuando se añade directamente a células presentadoras de antígeno. En una realización, el fragmento es un fragmento que es presentado naturalmente por células que expresan un antígeno.

"Célula diana" significa una célula que es el objetivo de una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria celular. Las células diana incluyen células que presentan un antígeno, es decir, un fragmento de péptido derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula cancerosa. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula que expresa un antígeno como se describe en este documento y que preferiblemente presenta dicho antígeno con MHC de clase I.

El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína, el término "porción" de la misma puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferiblemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, preferiblemente al menos 40 %, preferiblemente al menos 50 %, más preferiblemente al menos 60 %, más preferiblemente al menos 70 %, incluso más preferiblemente al menos 80 %, y lo más preferiblemente al menos 90 % de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua está compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, siendo cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede estar compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferiblemente no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte preferiblemente comprende al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 20 aminoácidos continuos, preferiblemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.

Los términos "parte" y "fragmento" se utilizan indistintamente en este documento y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura comprende preferiblemente una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es preferiblemente inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína del que se deriva. En el contexto de la presente enseñanza, una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos preferiblemente comprende, preferiblemente consiste en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 94 %, al menos 96 %, al menos 98 %, al menos 99 % de toda la estructura o secuencia de aminoácidos.

El término "célula efectora", "célula efectora inmunitaria" o "célula inmunorreactiva" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un fragmento peptídico del mismo (por ejemplo, un epítopo de célula T) y mediar una respuesta inmune. Por ejemplo, dichas células secretan citocinas y/o quimiocinas, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas y, opcionalmente, eliminan células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas incluyen células T (células T citotóxicas, células T colaboradoras, células T infiltrantes de tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, en el contexto de la presente enseñanza, las células inmunorreactivas son células T, preferiblemente células T CD4+ y/o CD8+.

Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un fragmento peptídico del mismo con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas del MHC, como en la superficie de células presentadoras de antígeno o células enfermas, como las células cancerosas. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un fragmento peptídico del mismo sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+) que portan receptores que reconocen un antígeno o un fragmento peptídico del mismo en el contexto de moléculas del MHC de clase II, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, a través de apoptosis o lisis celular mediada por perforina. De acuerdo con la enseñanza, la respuesta de los CTL puede incluir un flujo sostenido de calcio, división celular, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, sobrerregulación de marcadores de activación como CD44 y CD69 y muerte citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de los CTL también se puede determinar utilizando un reportero artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de los CTL. Los CTL que reconocen un antígeno o un fragmento de antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan en este documento "CTL sensibles al antígeno". Si la célula es una célula B, dicha respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

Los términos "célula T" y "linfocito T" se utilizan indistintamente en este documento e incluyen células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T colaboradoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T colaboradoras se activan cuando las moléculas del MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC). Una vez activados, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos uniéndose al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real se compone de dos cadenas de péptidos separadas, que se producen a partir de los genes independientes del receptor de células T alfa y beta (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a y p-TCR. Las células T<y>8 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T<y>8, el TCR está formado por una cadena<y>y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2 % del total de células T) que las células T ap.

La primera señal de activación de las células T se proporciona mediante la unión del receptor de células T a un péptido corto presentado por el MHC en otra célula. Esto garantiza que sólo se active una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula asociada suele ser una célula presentadora de antígeno, como una célula presentadora de antígeno profesional, normalmente una célula dendrítica en el caso de respuestas sin modificar, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APC importantes.

De acuerdo con la presente enseñanza, una molécula es capaz de unirse a un objetivo si tiene una afinidad significativa por dicho objetivo predeterminado y se une a dicho objetivo predeterminado en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide mediante la constante de disociación de equilibrio (K<d>). Una molécula no es (sustancialmente) capaz de unirse a un objetivo si no tiene una afinidad significativa por dicho objetivo y no se une significativamente a dicho objetivo en ensayos estándar.

Se pueden generar linfocitos T citotóxicosin vivomediante la incorporación de un antígeno o un fragmento peptídico del mismo en células presentadoras de antígenoin vivo.El antígeno o un fragmento peptídico del mismo puede representarse como proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno puede procesarse para producir un compañero peptídico para la molécula del MHC, mientras que un fragmento del mismo puede presentarse sin la necesidad de procesamiento adicional. Esto último es especialmente cierto cuando estos pueden unirse a las moléculas del MHC. En general, es posible la administración a un paciente mediante inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también puede realizarse por vía intranodal en un ganglio linfático (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303). Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos autólogos que luego se propagan.

La activación específica de las células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas maneras. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen la detección de la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas como IFNy) o la actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica. En particular, la tinción de citocinas intracelulares o ELISPOT se puede utilizar para la detección de citocinas producidas por células T CD4+ y CD8+, por ejemplo, utilizando métodos como los descritos en este documento.

Generalmente, en un ensayo ELISPOT, las superficies de una membrana se recubren con un anticuerpo de captura que se une a un epítopo específico de la citocina que se está analizando. A medida que las células se activan, liberan la citocina, que es capturada directamente en la superficie de la membrana por el anticuerpo inmovilizado. La citocina queda así “capturada” en la zona que rodea directamente a la célula secretora. Las etapas de detección posteriores visualizan la citocina inmovilizada como una "inmunomancha", que es esencialmente la huella secretora de la célula activada. La técnica de ensayo ELISPOT permite así estimar el número y/o frecuencia de células T que están produciendo una citocina determinada (por ejemplo, IFNy) en respuesta a un estímulo antigénico específico. Los recuentos de manchas pueden expresarse como valores medianos obtenidos a partir de réplicas y pueden compararse con controles negativos (por ejemplo, células no estimuladas). Una respuesta puede definirse como positiva si se observa un número mínimo de manchas por una cierta cantidad de células y/o el número de manchas excede un cierto nivel en comparación con el control negativo. Por ejemplo, una respuesta puede definirse como positiva si hay un mínimo de cinco manchas por 1 x 103 células, 1 x 104 células, o 1 x 105 células y/o si el recuento de manchas es más de 2x, 3x, 4x, 5x tan alto, o incluso más alto, que el control negativo respectivo.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente, tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente, exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico, tal como la inducción de una respuesta inmune humoral y/o celular, la fuerza y/o duración de la reacción inmune inducida, o la especificidad de la reacción inmune inducida. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se utiliza preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicas de un péptido o polipéptido utilizado para la inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmune de un sujeto, induce una reacción inmune que tiene una especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunitario que resulte, por ejemplo, en la muerte de células tumorales, o en la inhibición del crecimiento tumoral y/o inhibición del desarrollo tumoral, incluida la inhibición de la diseminación y metástasis tumoral. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente enseñanza son funciones efectoras mediadas por células T Tales funciones comprenden, en el caso de una célula T colaboradora (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de las moléculas del MHC de clase II por los receptores de células T, la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de los CTL el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, vía apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, y muerte citolítica específica de células diana que expresan antígenos.

En general, de acuerdo con la enseñanza, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad y los fragmentos de péptidos o polipéptidos expresados en células enfermas, cuyos fragmentos comprenden una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad, se evalúan con respecto a su utilidad en inmunoterapia. Se pueden usar uno o más fragmentos con utilidad prevista para inmunoterapia para proporcionar una vacuna que comprende, por ejemplo, el péptido o polipéptido del que se derivan uno o más fragmentos o uno o más fragmentos peptídicos del péptido o polipéptido, en particular uno o más péptidos de unión al MHC (potenciales) del péptido o polipéptido. La vacuna también puede comprender ácido nucleico tal como ARN que codifica el péptido o polipéptido del cual se derivan uno o más fragmentos o uno o más fragmentos peptídicos del péptido o polipéptido, en particular uno o más péptidos de unión al MHC (potenciales) del péptido o polipéptido.

De acuerdo con la enseñanza, el término "puntuación" se relaciona con un resultado, usualmente expresado numéricamente, de una prueba o ensayo que incluye, por ejemplo, ensayos para medir la presentación de fragmentos de polipéptidos en moléculas del MHC o ensayos para medir la reactividad de las células T a fragmentos de polipéptidos en moléculas del MHC. Términos como "una mejor puntuación" o "mejor puntuación" se refieren a un mejor resultado o al mejor resultado de una prueba o un ensayo.

Los niveles de presentación de polipéptidos y reactividad de células T se pueden determinar utilizando cualquier método conocido en la técnica. La presentación de péptidos se puede determinar, por ejemplo, utilizando métodos de predicción bien conocidos, así como métodos experimentales. Por ejemplo, se han desarrollado varios ensayos bioquímicos para determinar la afinidad del péptido del MHC. Un método clásico es un ensayo de competencia en el que un péptido de referencia, generalmente marcado radiactivamente, se une al MHC. Los ensayos de reactividad de células T también se pueden utilizar para determinar la unión del péptido del MHC. La reactividad de las células T se puede evaluar como se describió en este documento, por ejemplo, mediante ensayos inmunológicos, incluidos ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISpOT) o ensayos de secreción de citocinas (CSA).

De acuerdo con la enseñanza, las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad pueden calificarse de acuerdo con la capacidad prevista de los epítopos peptídicos o polipeptídicos que comprenden al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad para (1) presentarse en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o reaccionar con células T restringidas a diferentes clases del MHC, (2) reaccionar con células T que tienen diferentes receptores de células T cuando se presentan en el contexto de la misma molécula del MHC, y/o (3) presentarse en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o reaccionar con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase. En general, cuantos más parámetros (1) a (3) cumpla una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad o un epítopo de péptido o polipéptido que comprende al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, mejor se puntúa la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad.

Términos tal como "predecir", "que predice" o "predicción" se relacionan con la determinación de una probabilidad, por ejemplo, de que una modificación de un aminoácido específico de una enfermedad dentro de un polipéptido expresado en una célula enferma sea útil para la inmunoterapia. Una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un polipéptido expresado en una célula enferma se identifica como útil para la inmunoterapia si los mismos o diferentes fragmentos del polipéptido (estos fragmentos comprenden la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad) se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases, si los mismos o diferentes fragmentos del polipéptido son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC, o ambos. De manera alternativa o adicional, una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad dentro de un polipéptido expresado en una célula enferma se identifica como útil para inmunoterapia si un fragmento del polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T De manera alternativa o adicional, una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un polipéptido expresado en una célula enferma se identifica como útil para la inmunoterapia si los mismos o diferentes fragmentos del polipéptido (estos fragmentos comprenden la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad) se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase, si los mismos o diferentes fragmentos del polipéptido cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, o ambos.

La presentación de un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad en el contexto de moléculas del MHC se puede determinar, por ejemplo, utilizando cualquier herramienta de predicción de unión de péptido:MHC y/o determinando la unión del fragmento a moléculas del MHC experimentalmente.

La reactividad de un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad con las células T cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC se puede determinar experimentalmente, por ejemplo.

En una realización, generalmente se realiza una evaluación frente a moléculas del MHC y/o células T que se encuentran en un paciente que tiene una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad. Por consiguiente, la presente enseñanza también puede incluir la determinación del repertorio de MHC y/o células T de un paciente.

El término "diferentes fragmentos del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad" en una realización se refiere a péptidos que comprenden o consisten en diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido modificado, comprendiendo dichos diferentes fragmentos la misma modificación(es) presentes en el péptido o polipéptido pero que difieren en la longitud y/o posición de la modificación(es). Si un péptido o polipéptido tiene una modificación en la posición x, dos o más fragmentos de dicho péptido o polipéptido, cada uno de los cuales comprende una ventana de secuencia diferente de dicho péptido o polipéptido que cubre dicha posición x, se consideran fragmentos diferentes del péptido o polipéptido que comprende la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad.

El término "diferentes modificaciones de aminoácidos" se refiere a diferentes modificaciones de aminoácidos ya sea de los mismos y/o de diferentes péptidos o polipéptidos.

Preferiblemente, de acuerdo con la presente enseñanza, un "fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad" tiene una longitud apropiada para la unión al MHC.

Las modificaciones de aminoácidos cuya utilidad para la inmunoterapia se debe evaluar de acuerdo con la presente enseñanza o que se deben seleccionar y/o clasificar por su utilidad en inmunoterapia de acuerdo con la enseñanza resultan preferiblemente de mutaciones en el ácido nucleico de una célula tal como una célula enferma, en particular una célula cancerosa o tumoral de un paciente. Estas mutaciones pueden identificarse mediante técnicas de secuenciación conocidas. En consecuencia, los métodos de enseñanza se pueden llevar a cabo para un paciente, tal como, un paciente con cáncer, para proporcionarle una vacuna específica, tal como una vacuna contra el cáncer.

En una realización, las mutaciones son mutaciones somáticas específicas del cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer que pueden determinarse identificando diferencias de secuencia entre el genoma, el exoma y/o el transcriptoma de una muestra de tumor y el genoma, el exoma y/o el transcriptoma de una muestra no tumorígena.

De acuerdo con la enseñanza, una muestra de tumor se refiere a cualquier muestra, como, por ejemplo, una muestra corporal derivada de un paciente, que contiene o se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido, como sangre, una muestra de tejido obtenida del tumor primario o de metástasis tumorales o cualquier otra muestra que contenga células tumorales o cancerosas. Preferiblemente, una muestra corporal es sangre y se determinan mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferencias de secuencia en una o más células tumorales circulantes (CTC) contenidas en la sangre. En otra realización, una muestra de tumor se relaciona con una o más células tumorales o cancerosas aisladas, tales como células tumorales circulantes (CTC) o una muestra que contiene una o más células tumorales o cancerosas aisladas, tales como células tumorales circulantes (CTC).

Una muestra no tumorígena se refiere a cualquier muestra, tal como una muestra corporal derivada de un paciente u otro individuo que preferiblemente sea de la misma especie que el paciente, preferiblemente un individuo sano que no contenga o no se espere que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido, tal como sangre o una muestra de un tejido no tumoral.

La enseñanza puede implicar la determinación de la firma de mutación del cáncer de un paciente. El término "firma de mutación del cáncer" puede referirse a todas las mutaciones del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede referirse solo a una parte de las mutaciones del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente. Por consiguiente, la presente enseñanza puede implicar la identificación de todas las mutaciones específicas del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede implicar la identificación de sólo una parte de las mutaciones específicas del cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente. Generalmente, los métodos de enseñanza prevén la identificación de un número de mutaciones que proporcione un número suficiente de modificaciones o péptidos o polipéptidos modificados para ser incluidos en los métodos de enseñanza.

Preferiblemente, las mutaciones identificadas de acuerdo con la presente enseñanza son mutaciones no sinónimas, preferiblemente mutaciones no sinónimas de péptidos o polipéptidos expresados en una célula tumoral o cancerosa.

En una realización, las mutaciones somáticas específicas del cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el genoma, preferiblemente en todo el genoma, de una muestra de tumor. De este modo, la enseñanza puede comprender la identificación de la firma de mutación cancerosa del genoma, preferiblemente el genoma completo de una o más células cancerosas. En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación del cáncer de todo el genoma.

En una realización, se determinan mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferencias de secuencia en el exoma, preferiblemente el exoma completo, de una muestra de tumor. Por lo tanto, la enseñanza puede comprender la identificación de la firma de mutación de cáncer del exoma, preferiblemente el exoma completo de una o más células cancerosas. En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación del cáncer en todo el exoma.

En una realización, se determinan mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferencias de secuencia en el transcriptoma, preferiblemente en todo el transcriptoma, de una muestra de tumor. Por lo tanto, la enseñanza puede comprender la identificación de la firma de mutación cancerosa del transcriptoma, preferiblemente el transcriptoma completo de una o más células cancerosas. En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación del cáncer en todo el transcriptoma.

En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende la secuenciación de una sola célula de una o más, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más células cancerosas. Por lo tanto, la enseñanza puede comprender la identificación de una firma de mutación de cáncer de dicha una o más células cancerosas. En una realización, las células cancerosas son células tumorales circulantes. Las células cancerosas, como las células tumorales circulantes, pueden aislarse antes de la secuenciación de células individuales.

En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer o identificar diferencias de secuencia implica el uso de secuenciación de próxima generación (NGS).

En una realización, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende la secuenciación del ADN y/o ARN genómico de la muestra de tumor.

Para revelar mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferencias de secuencia, la información de secuencia obtenida de la muestra del tumor se compara preferiblemente con una referencia, tal como la información de secuencia obtenida de la secuenciación de ácidos nucleicos tales como ADN o ARN de células normales no cancerosas, como células de la línea germinal, que pueden obtenerse del paciente o de un individuo diferente.

En una realización, el ADN germinal genómico normal se obtiene de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

El término "genoma" se refiere a la cantidad total de información genética en los cromosomas de un organismo o una célula.

El término "exorna" se refiere a la parte del genoma de un organismo formada por exones, que son porciones codificantes de genes expresados. El exoma proporciona el modelo genético utilizado en la síntesis de proteínas y otros productos genéticos funcionales. Es la parte funcionalmente más relevante del genoma y, por lo tanto, es la que tiene mayor probabilidad de contribuir al fenotipo de un organismo. Se estima que el exoma del genoma humano comprende el 1.5 % del genoma total (Ng, PC et al., PLoS Gen., 4(8): 1-15,2008).

El término "transcriptoma" se relaciona con el conjunto de todas las moléculas de ARN, incluido el ARNm, el ARNr, el ARNt y otros ARN no codificantes producidos en una célula o una población de células. En el contexto de la presente enseñanza, el transcriptoma significa el conjunto de todas las moléculas de ARN producidas en una célula, una población de células, preferiblemente una población de células cancerosas, o todas las células de un individuo dado en un momento determinado.

Un "ácido nucleico" es, de acuerdo con la enseñanza, preferiblemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferiblemente ARN, lo más preferiblemente ARN transcritoin vitro(ARN IVT) o ARN sintético. Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la enseñanza el ADN genómico, el ADNc, el ARNm, las moléculas producidas de forma recombinante y las sintetizadas químicamente. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y lineal o circularmente cerrada covalentemente. Un ácido nucleico puede, de acuerdo con la enseñanza, aislarse. El término "ácido nucleico aislado" significa, de acuerdo con la enseñanza, que el ácido nucleico (i) fue amplificadoin vitro,por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y separación por electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico se puede emplear para la introducción en, es decir, la transfección de, células, en particular, en forma de ARN que se puede preparar mediante transcripciónin vitroa partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN se puede modificar antes de su aplicación mediante secuencias estabilizadoras, protección y poliadenilación.

El término "material genético" se refiere a un ácido nucleico aislado, ya sea ADN o ARN, una sección de una doble hélice, una sección de un cromosoma o el genoma completo de un organismo o célula, en particular su exoma o transcriptoma.

El término "mutación" se refiere a un cambio o diferencia en la secuencia de ácido nucleico (sustitución, adición o eliminación de nucleótidos) en comparación con una referencia. Una "mutación somática" puede ocurrir en cualquiera de las células del cuerpo excepto en las células germinales (espermatozoide y óvulo) y, por lo tanto, no se transmite a los hijos. Estas alteraciones pueden (pero no siempre) causar cáncer u otras enfermedades. Preferiblemente una mutación es una mutación no sinónima. El término "mutación no sinónima" se refiere a una mutación, preferiblemente una sustitución de nucleótidos, que da como resultado un cambio de aminoácido, tal como una sustitución de aminoácido en el producto de la traducción.

De acuerdo con la enseñanza, el término "mutación" incluye mutaciones puntuales, indeles, fusiones, cromotripsis y ediciones de ARN.

De acuerdo con la enseñanza, el término "Indel" describe una clase especial de mutación, definida como una mutación que resulta en una inserción y eliminación colocalizada y una ganancia o pérdida neta de nucleótidos. En las regiones codificantes del genoma, a menos que la longitud de un indel sea múltiplo de 3, se produce una mutación por desplazamiento del marco de lectura. Los indeles pueden contrastarse con una mutación puntual; donde un indel inserta y elimina nucleótidos de una secuencia, una mutación puntual es una forma de sustitución que reemplaza uno de los nucleótidos.

Las fusiones pueden generar genes híbridos formados a partir de dos genes previamente separados. Puede ocurrir como resultado de una translocación, eliminación intersticial o inversión cromosómica. A menudo, los genes de fusión son oncogenes. Los genes de fusión oncogénicos pueden dar lugar a un producto génico con una función nueva o diferente de la de los dos compañeros de fusión. Como alternativa, un protooncogén se fusiona a un promotor fuerte y, por lo tanto, la función oncogénica se establece para funcionar mediante una sobrerregulación causada por el promotor fuerte del compañero de fusión más adelante. Las transcripciones de fusión oncogénicas también pueden ser causadas por eventos de empalme trans o lectura continua.

De acuerdo con la enseñanza, el término "cromotripsis" se refiere a un fenómeno genético por el cual regiones específicas del genoma se destruyen y luego se unen mediante un único evento devastador.

De acuerdo con la enseñanza, el término "edición de ARN" o "que edita ARN" se refiere a procesos moleculares en los que el contenido de información de una molécula de<a>R<n>se altera a través de un cambio químico en la composición de bases. La edición de ARN incluye modificaciones de nucleósidos, como desaminaciones de citidina (C) a uridina (U) y de adenosina (A) a inosina (I), así como adiciones e inserciones de nucleótidos sin plantilla. La edición de ARN en los ARNm altera efectivamente la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada de modo que difiere de la predicha por la secuencia de ADN genómico.

El término "firma de mutación del cáncer" se refiere a un conjunto de mutaciones que están presentes en las células cancerosas en comparación con las células de referencia no cancerosas.

De acuerdo con la enseñanza, se puede utilizar una "referencia" para correlacionar y comparar los resultados de una muestra de tumor. Normalmente, la "referencia" puede obtenerse a partir de una o más muestras normales, en particular muestras que no están afectadas por una enfermedad cancerosa, obtenidas de un paciente o de uno o más individuos diferentes, preferiblemente individuos sanos, en particular individuos de la misma especie. Se puede determinar una "referencia" empíricamente probando un número suficientemente grande de muestras normales.

De acuerdo con la enseñanza, se puede utilizar cualquier método de secuenciación adecuado para determinar mutaciones, siendo preferidas las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS). Los métodos de secuenciación de tercera generación podrían sustituir a la tecnología NGS en el futuro para acelerar la etapa de secuenciación del método. Para fines de aclaración: los términos "secuenciación de próxima generación" o "NGS" en el contexto de la presente enseñanza significan todas las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que, en contraste con la metodología de secuenciación "convencional" conocida como química de Sanger, leen plantillas de ácidos nucleicos aleatoriamente en paralelo a lo largo de todo el genoma rompiendo todo el genoma en pequeños pedazos. Estas tecnologías de NGS (también conocidas como tecnologías de secuenciación masiva paralela) pueden proporcionar información de la secuencia de ácidos nucleicos de un genoma completo, exoma, transcriptoma (todas las secuencias transcritas de un genoma) o metiloma (todas las secuencias metiladas de un genoma) en períodos de tiempo muy cortos, por ejemplo, dentro de 1-2 semanas, preferiblemente dentro de 1-7 días o, lo más preferiblemente, dentro de menos de 24 horas y permiten, en principio, enfoques de secuenciación de células individuales. Se pueden utilizar en el contexto de la presente enseñanza varias plataformas de NGS que están disponibles comercialmente o que se mencionan en la literatura, por ejemplo, las que se describen en detalle en Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; o en Voelkerding et al. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Ejemplos no limitativos de dichas tecnologías/plataformas de NGS son:

1) La tecnología de secuenciación por síntesis conocida como pirosecuenciación implementada, por ejemplo, en el Genoma Sequencer™ GS-FLX 454 de la empresa asociada a Roche 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), descrita por primera vez en Ronaghi et al. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Esta tecnología utiliza una PCR en emulsión en la que las perlas de unión de ADN monocatenario se encapsulan mediante agitación vigorosa tipo vórtice en micelas acuosas que contienen reactivos de PCR rodeados de aceite para la amplificación por PCR en emulsión. Durante el proceso de pirosecuenciación, la luz emitida por las moléculas de fosfato durante la incorporación de nucleótidos se registra a medida que la polimerasa sintetiza la cadena de ADN.

2) Los enfoques de secuenciación por síntesis desarrollados por Solexa (ahora parte de Illumina Inc., San Diego, California), que se basan en terminadores de colorante reversibles e implementados, por ejemplo, en el Genoma Analyzer™ de Illumina /Solexa y en el Genoma Analyzer™ HiSeq 2000 de Illumina. En esta tecnología, los cuatro nucleótidos se agregan simultáneamente a fragmentos de grupos cebados con oligonucleótidos en canales de celdas de flujo junto con la ADN polimerasa. La amplificación de puente extiende las cadenas del grupo con los cuatro nucleótidos marcados con fluorescencia para la secuenciación.

3) Enfoques de secuenciación por ligadura, por ejemplo, implementados en la plataforma SOLid™ de Applied Biosystems (ahora Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). En esta tecnología, un conjunto de todos los oligonucleótidos posibles de una longitud fija se etiqueta de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se hibridan y se ligan; la ligadura preferencial por parte de la ADN ligasa para las secuencias coincidentes da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica mediante PCR en emulsión. Las perlas resultantes, cada una de las cuales contiene sólo copias de la misma molécula de ADN, se depositan en un portaobjetos de vidrio. Como segundo ejemplo, también emplea la plataforma The Polonator™ G.007 de Dover Systems (Salem, New Hampshire) un enfoque de secuenciación por ligadura mediante una PCR en emulsión basada en perlas dispuestas aleatoriamente para amplificar fragmentos de ADN para la secuenciación paralela.

4) Tecnologías de secuenciación de moléculas individuales, como las implementadas en el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences (Menlo Park, California) o en la plataforma HeliScope™ de Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). La característica distintiva de esta tecnología es su capacidad de secuenciar moléculas individuales de ADN o ARN sin amplificación, definida como secuenciación de ADN de molécula única en tiempo real (SMRT). Por ejemplo, HeliScope utiliza un sistema de detección de fluorescencia altamente sensible para detectar directamente cada nucleótido a medida que se sintetiza. Visigen Biotechnology (Houston, Texas) ha desarrollado un enfoque similar basado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Otras técnicas de moléculas individuales basadas en fluorescencia son de U.S. Genomics (GeneEngine™) y Genovoxx (AnyGene™).

5) Nanotecnologías para secuenciación de moléculas individuales en las que se utilizan varias nanoestructuras que se disponen, por ejemplo, en un chip para monitorizar el movimiento de una molécula de polimerasa en una sola cadena durante la replicación. Ejemplos no limitativos de enfoques basados en nanotecnologías son la plataforma GridON™ de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, RU), las plataformas de secuenciación de nanoporos asistida por hibridación (HANS)™ desarrolladas por Nabsys (Providence, Rhode Island), y la plataforma patentada de secuenciación de ADN basada en ligasa con tecnología de nanobolas de ADN (DNB) llamada ligadura combinatoria de sonda-anclaje (cPAL™).

6) Tecnologías basadas en microscopía electrónica para la secuenciación de moléculas individuales, por ejemplo, las desarrolladas por LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) y Halcyon Molecular (Redwood City, California)

7) Secuenciación de semiconductores iónicos que se basa en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN. Por ejemplo, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) utiliza un arreglo de alta densidad de pozos micromaquinados para realizar este proceso bioquímico de forma masiva y paralela. Cada pocillo contiene una plantilla de ADN diferente. Debajo de los pozos hay una capa sensible a los iones y debajo de ésta un sensor de iones patentado.

Preferiblemente, las preparaciones de ADN y ARN sirven como material de partida para NGS. Estos ácidos nucleicos pueden obtenerse fácilmente a partir de muestras tales como material biológico, por ejemplo, de tejidos tumorales frescos, congelados rápidamente o fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE), o de células recién aisladas o de CTC que están presentes en la sangre periférica de los pacientes. El ADN o ARN genómico normal no mutado se puede extraer del tejido somático normal, sin embargo, en el contexto de la presente enseñanza se prefieren las células de la línea germinal. Se puede extraer ADN o ARN de la línea germinal de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en pacientes con neoplasias malignas no hematológicas. Aunque los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE o de células individuales recién aisladas están muy fragmentados, son adecuados para aplicaciones de NGS.

En la literatura se describen varios métodos de NGS específicos para la secuenciación del exoma (para una revisión, consulte, por ejemplo, Teer y Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2),R145-51),todo lo cual puede utilizarse junto con la presente enseñanza. Muchos de estos métodos (descritos, por ejemplo, como captura del genoma, partición del genoma, enriquecimiento del genoma, etc.) utilizan técnicas de hibridación e incluyen enfoques de hibridación basados en matrices (por ejemplo, Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) y a base de líquidos (por ejemplo, Choi et al., 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101). También están disponibles kits comerciales para la preparación de muestras de ADN y la posterior captura del exoma: por ejemplo, Illumina Inc. (San Diego, California) ofrece el Kit de preparación de muestras de ADN TruSeq™y el kit de enriquecimiento del exoma TruSeq™.

Para reducir la cantidad de hallazgos falsos positivos en la detección de mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferencias de secuencia al comparar, por ejemplo, la secuencia de una muestra de tumor con la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de línea germinal, se prefiere determinar la secuencia en réplicas de uno o ambos de estos tipos de muestras. Por lo tanto, se prefiere que la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de línea germinal, se determine dos, tres o más veces. Alternativa o adicionalmente, la secuencia de una muestra de tumor se determina dos veces, tres veces o más. También puede ser posible determinar la secuencia de una muestra de referencia tal como la secuencia de una muestra de línea germinal y/o la secuencia de una muestra de tumor más de una vez determinando al menos una vez la secuencia en ADN genómico y determinando al menos una vez la secuencia en ARN de dicha muestra de referencia y/o de dicha muestra de tumor. Por ejemplo, al determinar las variaciones entre réplicas de una muestra de referencia, como una muestra de línea germinal, se puede estimar la tasa esperada de mutaciones somáticas falsas positivas (FDR) como una cantidad estadística. Las repeticiones técnicas de una muestra deberían generar resultados idénticos y cualquier mutación detectada en esta "la comparación "igual frente a igual" es un falso positivo. En particular, para determinar la tasa de falsos descubrimientos para la detección de mutaciones somáticas en una muestra de tumor en relación con una muestra de referencia, se puede utilizar una repetición técnica de la muestra de referencia como referencia para estimar el número de falsos positivos. Además, varias métricas relacionadas con la calidad (por ejemplo, la cobertura o la calidad de SNP) se pueden combinar en una única puntuación de calidad utilizando un enfoque de aprendizaje automático. Para una variación somática dada se pueden contar todas las demás variaciones con un puntaje de calidad superior, lo que permite una clasificación de todas las variaciones en un conjunto de datos.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente de residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de forma recombinante tal como ARN modificado que se diferencia del ARN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tal como nucleótidos no naturales o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. A estos ARN alterados se les puede llamar análogos o análogos del ARN natural.

De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y se relaciona preferentemente con "ARNm". El término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se relaciona con una "transcripción" que se genera utilizando una plantilla de ADN y codifica un péptido o polipéptido. Normalmente, un ARNm comprende un 5'-UTR, una región codificante de proteína, un 3'-UTR y, opcionalmente, una cola de poli(A). El ARNm solo posee una vida media limitada en las células ein vitro.En el contexto de la presente enseñanza, el ARNm puede generarse mediante transcripciónin vitroa partir de una plantilla de ADN. La metodología de transcripciónin vitroes conocida por el experto en la materia. Por ejemplo, hay una variedad de kits de transcripciónin vitrodisponibles comercialmente.

De acuerdo con la enseñanza, la estabilidad y la eficiencia de la traducción del ARN pueden modificarse según sea necesario. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y su traducción aumentarse mediante una o más modificaciones que tengan efectos estabilizadores y/o aumenten la eficiencia de la traducción del ARN. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en el documento WO 2007/036366 A2. Para aumentar la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, de manera que aumente el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, de este modo, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN utilizado en la presente enseñanza incluye cualquier modificación de un ARN que no esté presente de forma natural en dicho ARN.

En una realización de la enseñanza, el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza no tiene 5'-trifosfatos sin protección. La eliminación de estos 5'-trifosfatos sin protección se puede lograr mediante el tratamiento del ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la enseñanza puede tener ribonucleótidos modificados con el fin de aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza, la pseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.

En una realización, el término "modificación" se relaciona con proporcionar un ARN con un protector 5' o un análogo protector de 5'. El término "protector de 5'" se refiere a una estructura de protección que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato 5' a 5' inusual. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "protector convencional de 5'" se refiere a un protector de 5' de ARN natural, preferiblemente al protector de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "protector de 5'" incluye un análogo protector de 5' que se asemeja a la estructura protectora del ARN y está modificada para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si se une a él, preferiblementein vivoy/o en una célula.

Proporcionar un ARN con un protector de 5' o un análogo de protector de 5' se puede lograr mediante transcripciónin vitrode una plantilla de ADN en presencia de dicho protector de 5' o análogo protector de 5', en donde dicho protector de 5' se incorpora cotranscripcionalmente en la cadena de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, mediante transcripciónin vitro,y el protector de 5' se puede unir al ARN postranscripcionalmente utilizando enzimas protectoras, por ejemplo, enzimas protectoras del virus vaccinia.

El ARN puede contener modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado en la presente enseñanza puede ser una extensión o truncamiento de la cola de poli(A) de origen natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tal como alfa2-globina, alfa1-globina, beta-globina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia de poli-A desenmascarada se traduce de manera más eficiente que el ARN que tiene una secuencia de poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se relaciona con una secuencia de residuos de adenilo (A) que típicamente se ubica en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia de poli-A desenmascarada" significa que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia de poli-A y no es seguida por otros nucleótidos además de A ubicado en el extremo 3', es decir secuencia abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia de poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción del ARN óptimas.

De este modo, con el fin de aumentar la estabilidad y/o expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, que preferiblemente tenga una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia de poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o expresión del ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza, se puede desenmascarar la secuencia de poli-A.

El término "estabilidad" del ARN se relaciona con la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del<a>R<n>puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tiene una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si de acuerdo con la presente enseñanza se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN de manera que interfiera con la función de los elementos como se describió anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN.

El término "expresión" se utiliza de acuerdo con la enseñanza en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos, polipéptidos o proteínas, por ejemplo, mediante transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos, polipéptidos o proteínas. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se relaciona con un proceso mediante el cual el código genético de una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en péptido, polipéptido o proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripciónin vitro",donde el término " transcripciónin vitro"se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, es sintetizadoin vitroen un sistema libre de células, preferiblemente utilizando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, se aplican vectores de clonación para la generación de transcripciones. Estos vectores de clonación se denominan generalmente vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente enseñanza, se engloban bajo el término "vector". De acuerdo con la presente enseñanza, el<a>R<n>utilizado en la presente enseñanza es preferiblemente ARN transcritoin vitro(IVT-ARN) y puede obtenerse mediante transcripciónin vitrode una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, la transcripciónin vitrode acuerdo con la enseñanza está controlada por un promotor T7 o SP6. Una plantilla de ADN para la transcripciónin vitropuede obtenerse mediante la clonación de un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para transcripciónin vitro.El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa del ARN.

El término "traducción" de acuerdo con la enseñanza se relaciona con el proceso en los ribosomas de una célula por el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para formar un péptido, polipéptido o proteína.

Las secuencias de control de expresión o secuencias reguladoras, que de acuerdo con la enseñanza pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas entre sí "funcionalmente" si están unidas covalentemente, de modo que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en un péptido, polipéptido o proteína funcional, con enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia codificante, sin causar un cambio del marco de lectura en la secuencia codificante o la incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en el péptido, polipéptido o proteína deseado.

El término "secuencia de control de expresión" o "secuencia reguladora" comprende, de acuerdo con la enseñanza, promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control, que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. En ciertas realizaciones de la enseñanza, las secuencias reguladoras pueden controlarse. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar dependiendo de la especie o dependiendo del tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, que están involucradas en el inicio de la transcripción o traducción, tales como caja TATA, secuencia protectora, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen funcionalmente unido. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras más adelante.

Preferiblemente, de acuerdo con la enseñanza, el ARN que se va a expresar en una célula se introduce en dicha célula. En una realización de los métodos de acuerdo con la enseñanza, el ARN que se va a introducir en una célula se obtiene mediante transcripciónin vitrode una plantilla de ADN apropiada.

De acuerdo con la enseñanza, términos como "ARN capaz de expresar" y "ARN que codifica" se usan indistintamente en este documento y con respecto a un péptido o polipéptido en particular significan que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido. Preferiblemente, el ARN de acuerdo con la enseñanza es capaz de interactuar con la maquinaria de traducción celular para proporcionar el péptido o polipéptido que es capaz de expresar.

Términos como "transferir", "introducir" o "transfectar" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARN, en una célula. De acuerdo con la presente enseñanza, la célula puede formar parte de un órgano, de un tejido y/o de un organismo. De acuerdo con la presente enseñanza, la administración de un ácido nucleico se logra ya sea como ácido nucleico desnudo o en combinación con un reactivo de administración. Preferiblemente, la administración de ácidos nucleicos se realiza en forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferiblemente, el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizadoras como los inhibidores de la RNasa. La presente enseñanza también prevé la introducción repetida de ácidos nucleicos en las células para permitir una expresión sostenida durante períodos de tiempo prolongados.

Las células pueden transfectarse con cualquier transportador con el que se pueda asociar el ARN, por ejemplo, formando complejos con el ARN o formando vesículas en las que el ARN está encerrado o encapsulado, lo que da como resultado una mayor estabilidad del ARN en comparación con el ARN desnudo. Los portadores útiles de acuerdo con la enseñanza incluyen, por ejemplo, portadores que contienen lípidos tales como lípidos catiónicos, liposomas, en particular liposomas catiónicos, y micelas, y nanopartículas. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Se podrá utilizar cualquier lípido catiónico de acuerdo con las enseñanzas.

Preferiblemente, la introducción de ARN que codifica un péptido o polipéptido en una célula, en particular en una célula presentein vivo,da como resultado la expresión de dicho péptido o polipéptido en la célula. En realizaciones particulares, se prefiere el direccionamiento de los ácidos nucleicos a células particulares. En tales realizaciones, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma), exhibe una molécula de direccionamiento. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específico para una proteína de membrana de superficie en la célula objetivo o un ligando para un receptor en la célula objetivo puede incorporarse al portador de ácido nucleico o puede unirse al mismo. En caso de que el ácido nucleico se administre mediante liposomas, se pueden incorporar a la formulación del liposoma proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie asociada con la endocitosis para permitir el direccionamiento y/o captación. Estas proteínas incluyen proteínas de la cápside o fragmentos de ellas que son específicas para un tipo de célula particular, anticuerpos contra proteínas que se internalizan, proteínas que se dirigen a una ubicación intracelular, etc.

El término "célula" o "célula huésped" se refiere preferiblemente a una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales, como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta es preferiblemente una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente dicho término se refiere de acuerdo con la enseñanza a cualquier célula que puede ser transformada o transfectada con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye, de acuerdo con la enseñanza, células procariotas (por ejemplo,E. coli)o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insecto). El ácido nucleico exógeno puede encontrarse dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o en el ADN mitocondrial. Se prefieren especialmente las células de mamíferos, como las de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de una gran cantidad de tipos de tejidos e incluir células primarias y líneas celulares. Ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En otras realizaciones, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago.

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferiblemente el péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico.

El término "expansión clonal" se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente enseñanza, el término se utiliza preferiblemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y el linfocito específico que reconoce dicho antígeno se amplifica. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

Términos como "reducir" o "inhibir" se relacionan con la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, más preferiblemente del 50 % o más, y lo más preferiblemente del 75 % o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluyen una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos como "aumentar", "mejorar", "promover" o "prolongar" se refieren preferiblemente a un aumento, mejora, promoción o prolongación de aproximadamente al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 100 %, preferiblemente al menos un 200 % y en particular al menos un 300 %. Estos términos también pueden referirse a un aumento, mejora, promoción o prolongación desde cero o un nivel no medible o no detectable a un nivel superior a cero o un nivel que sea medible o detectable.

La presente enseñanza proporciona métodos para identificar modificaciones de aminoácidos que se prevé que sean útiles en inmunoterapia. Las modificaciones de aminoácidos están presentes en péptidos o polipéptidos expresados en las células enfermas de un paciente. El término "péptido o polipéptido expresado en células enfermas de un paciente" no significa necesariamente que la expresión del péptido o polipéptido haya sido probada experimentalmente. Más bien, significa que un marco de lectura abierto que codifica el péptido o polipéptido está presente dentro de las células enfermas de un paciente y, por lo tanto, existe el potencial de que el péptido o polipéptido se exprese en las células enfermas de un paciente.

Las modificaciones de aminoácidos que se prevé que sean útiles en inmunoterapia podrían utilizarse para diseñar una vacuna. Específicamente, la vacuna puede comprender un péptido o polipéptido expresado por una célula enferma y que comprende modificaciones de aminoácidos que se prevé que sean útiles en inmunoterapia mediante el método de la presente enseñanza, o un ácido nucleico tal como ARN que codifica dicho péptido o polipéptido. Alternativa o adicionalmente, la vacuna puede comprender un péptido o polipéptido de vacuna que comprende un fragmento de dicho péptido o polipéptido expresado por una célula enferma, comprendiendo dicho fragmento una modificación de aminoácidos que se predice que es útil en inmunoterapia mediante el método de la presente enseñanza, o un ácido nucleico tal como ARN que codifica dicho péptido o polipéptido de vacuna.

Si los métodos de la enseñanza indican que un fragmento de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad (1) se presenta en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presenta en el contexto de moléculas del MHC es reactivo con células T restringidas a diferentes clases del<m>H<c>, (2) cuando se presenta en el contexto de la misma molécula del MHC es reactivo con células T que tienen diferentes receptores de células T y/o (3) se presenta en el contexto de diferentes moléculas del m Hc de la misma clase y/o cuando se presenta en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase es reactivo con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, el péptido o polipéptido de la vacuna comprende preferiblemente al menos la secuencia del péptido o polipéptido que cubre dicho fragmento o una secuencia más larga, es decir, una secuencia de vacuna.

Si los métodos de la enseñanza indican que diferentes fragmentos de un péptido o polipéptido que comprende una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad (1) se presentan en el contexto de moléculas del MHC de diferentes clases y/o cuando se presentan en el contexto de moléculas del MHC son reactivos con células T restringidas a diferentes clases del MHC, y/o (2) se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase y/o cuando se presentan en el contexto de diferentes moléculas del MHC de la misma clase son reactivos con diferentes células T restringidas a la misma clase del MHC, el péptido o polipéptido de la vacuna comprende preferiblemente al menos la secuencia del péptido o polipéptido que cubre dichos fragmentos o una secuencia más larga, es decir, una secuencia de vacuna.

De acuerdo con la enseñanza, el término "vacuna" se refiere a una preparación farmacéutica (composición farmacéutica) o producto que al administrarse induce una respuesta inmune, en particular una respuesta inmune celular, que reconoce y ataca a un patógeno o una célula enferma tal como una célula cancerosa. Una vacuna puede utilizarse para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. El término "vacuna personalizada contra el cáncer" o "vacuna individualizada contra el cáncer" se refiere a un paciente con cáncer en particular y significa que una vacuna contra el cáncer está adaptada a las necesidades o circunstancias especiales de un paciente con cáncer individual.

En una realización, una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos o uno o más péptidos modificados que se prevé que sean útiles en inmunoterapia mediante los métodos de la enseñanza o un ácido nucleico, preferiblemente ARN, que codifica dicho péptido o polipéptido.

Las vacunas contra el cáncer proporcionadas de acuerdo con la enseñanza cuando se administran a un paciente preferiblemente proporcionan uno o más epítopos de células T adecuados para estimular, cebar y/o expandir células T específicas para células enfermas del paciente, tales como el tumor del paciente. Las células T se dirigen preferiblemente contra células que expresan antígenos de los cuales se derivan los epítopos de células T Las vacunas descritas en este documento son preferiblemente capaces de inducir o promover una respuesta celular, preferiblemente actividad de células T citotóxicas, contra una enfermedad cancerosa caracterizada por la presentación de uno o más neoantígenos asociados a tumores con MHC de clase I. Una vacuna dirigida a mutaciones específicas del cáncer será específica para el tumor del paciente.

Una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza se refiere a una vacuna que cuando se administra a un paciente proporciona preferiblemente uno o más epítopos de células T, tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más y preferiblemente hasta 60, hasta 55, hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 epítopos de células T, que incorporan modificaciones de aminoácidos o péptidos modificados que se prevé que sean inmunogénicos mediante los métodos de la enseñanza. Estos epítopos de células T también se denominan "neoepítopos" en este documento. La presentación de estos epítopos por las células de un paciente, en particular las células presentadoras de antígeno, preferentemente da como resultado que las células T se dirijan a los epítopos cuando se unen al MHC y, por lo tanto, el tumor del paciente, preferentemente el tumor primario, así como las metástasis tumorales, expresen antígenos de los cuales se derivan los epítopos de las células T y presenten los mismos epítopos en la superficie de las células tumorales.

Los métodos de enseñanza pueden comprender la etapa adicional de determinar la utilidad de las modificaciones de aminoácidos identificadas o de los péptidos modificados para la vacunación contra el cáncer. Por lo tanto, las etapas siguientes pueden implicar uno o más de los siguientes: (i) evaluar si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por el MHC conocidos o previstos, (ii) probarin vitroy/oin siliciosi las modificaciones se encuentran en epítopos presentados por el MHC, por ejemplo, probar si las modificaciones son parte de secuencias de péptidos que se procesan y/o se presentan como epítopos presentados por el MHC, y (iii) probarin vitrosi los epítopos modificados previstos, en particular cuando están presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, cuando están flanqueados por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en el péptido o polipéptido de origen natural, y cuando se expresan en células presentadoras de antígeno, son capaces de estimular células T tales como células T del paciente que tienen la especificidad deseada. Cada una de dichas secuencias flanqueantes puede comprender 3 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo en el extremo terminal N y/o en el extremo terminal C.

Los péptidos modificados determinados de acuerdo con la enseñanza pueden clasificarse por su utilidad como epítopos para la vacunación contra el cáncer. De este modo, en un aspecto, la enseñanza comprende un proceso analítico manual o informático en el que los péptidos modificados identificados se analizan y seleccionan por su capacidad para ser utilizados en la respectiva vacuna que se va a proporcionar. En una realización preferida, dicho proceso analítico es un proceso basado en algoritmos computacionales. Preferiblemente, dicho proceso analítico comprende determinar y/o clasificar epítopos de acuerdo con una predicción de su capacidad de ser inmunogénicos.

Los neoepítopos identificados de acuerdo con la enseñanza y proporcionados por una vacuna de la enseñanza están presentes preferiblemente en forma de un polipéptido que comprende dichos neoepítopos tal como un polipéptido poliepitópico o un ácido nucleico, en particular ARN, que codifica dicho polipéptido. Además, los neoepítopos pueden estar presentes en el polipéptido en forma de una secuencia de vacuna, es decir, presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, flanqueados por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en el péptido o polipéptido de origen natural. Cada una de dichas secuencias flanqueantes puede comprender 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo en el terminal N y/o en el terminal C. De este modo, una secuencia de vacuna puede comprender 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. En una realización, los neoepítopos y/o secuencias de vacunas se alinean en el polipéptido de un extremo al otro.

En una realización, los neoepítopos y/o secuencias de vacunas están espaciados por enlazadores, en particular enlazadores neutrales. El término "enlazador" de acuerdo con la enseñanza se refiere a un péptido añadido entre dos dominios peptídicos tales como epítopos o secuencias de vacunas para conectar dichos dominios peptídicos. No existe ninguna limitación particular con respecto a la secuencia enlazadora. Sin embargo, se prefiere que la secuencia enlazadora reduzca el impedimento estérico entre los dos dominios peptídicos, esté bien traducida y respalde o permita el procesamiento de los epítopos. Además, el enlazador no debe tener elementos de secuencia inmunogénica o debe tener muy pocos. Es preferible que los enlazadores no creen neoepítopos no endógenos como los generados a partir de la sutura de unión entre neoepítopos adyacentes, que podrían generar reacciones inmunes no deseadas. De este modo, la vacuna poliepitópica debe contener preferiblemente secuencias enlazadoras que sean capaces de reducir el número de epítopos de unión al MHC no deseados. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006; y Zhang et al. (J. Biol. Chem. 279(10), 8635-41,2004; han demostrado que las secuencias ricas en glicina perjudican el procesamiento proteasomal y, por lo tanto, el uso de secuencias enlazadoras ricas en glicina actúa para minimizar la cantidad de péptidos que contienen enlaces que pueden ser procesados por el proteasoma. Además, se observó que la glicina inhibe una unión fuerte en las posiciones del surco de unión del MHC (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993;.

Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26,2005)habían descubierto que los aminoácidos glicina y serina incluidos en una secuencia de aminoácidos dan como resultado una proteína más flexible que es traducida y procesada más eficientemente por el proteasoma, lo que permite un mejor acceso a los neoepítopos codificados. Cada enlazador puede comprender 3 o más, 6 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferiblemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. Preferiblemente, el enlazador está enriquecido en aminoácidos glicina y/o serina. Preferiblemente, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de los aminoácidos del enlazador son glicina y/o serina. En una realización preferida, un enlazador está compuesto sustancialmente por los aminoácidos glicina y serina. En una realización, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e en donde a, b, c, d y e son independientemente un número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 y en donde a b c d e son diferentes de 0 y preferiblemente son 2 o más, 3 o más, 4 o más o 5 o más. En una realización, el enlazador comprende una secuencia como se describe en este documento, incluidas las secuencias enlazadoras descritas en los ejemplos, tales como la secuencia GGSGGGGSG.

En una realización particularmente preferida, un polipéptido que incorpora uno o más neoepítopos, tal como un polipéptido poliepitópico de acuerdo con la presente enseñanza, se administra a un paciente en forma de un ácido nucleico, preferiblemente ARN tal como ARNin vitrotranscrito o sintético, que puede expresarse en células de un paciente, tal como células presentadoras de antígeno, para producir el polipéptido. La presente enseñanza también prevé la administración de uno o más polipéptidos multiepitópicos que para el propósito de la presente enseñanza están comprendidos por el término "polipéptido poliepitópico", preferiblemente en forma de un ácido nucleico, preferiblemente ARN tal como ARN transcrito o sintéticoin vitro,que puede expresarse en células de un paciente, tal como células presentadoras de antígeno, para producir uno o más polipéptidos. En el caso de una administración de más de un polipéptido multiepitópico, los neoepítopos proporcionados por los diferentes polipéptidos multiepitópicos pueden ser diferentes o superponerse parcialmente. Una vez presente en las células de un paciente, como las células presentadoras de antígeno, el polipéptido, de acuerdo con la enseñanza, se procesa para producir los neoepítopos identificados de acuerdo con la enseñanza. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza proporciona preferiblemente epítopos presentados por el MHC de clase I que son capaces de provocar una respuesta de células T CD8+ contra células que expresan antígenos de los cuales se derivan los epítopos presentados por el MHC. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza también puede proporcionar epítopos presentados por el MHC de clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T CD4+ contra células que expresan antígenos de los cuales se derivan los epítopos presentados por el MHC. Además, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza puede proporcionar uno o más neoepítopos (incluidos los neoepítopos conocidos y los neoepítopos identificados de acuerdo con la enseñanza), así como uno o más epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncer pero que son expresados por células cancerosas y preferiblemente inducen una respuesta inmune contra las células cancerosas, preferiblemente una respuesta inmune específica del cáncer.

La vacuna proporcionada de acuerdo con la enseñanza puede ser una vacuna recombinante.

El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, una "entidad recombinante" tal como un polipéptido recombinante en el contexto de la presente enseñanza no ocurre de manera natural, y preferiblemente es el resultado de una combinación de entidades tales como secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que no están combinadas en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido recombinante en el contexto de la presente enseñanza puede contener varias secuencias de aminoácidos tales como neoepítopos o secuencias de vacunas derivadas de diferentes proteínas o diferentes porciones de la misma proteína fusionadas entre sí, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos o enlazadores apropiados.

El término "de origen natural" tal como se utiliza en el presente documento se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Los agentes y composiciones descritos en este documento se pueden usar para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno y presentan un fragmento del mismo. Las enfermedades especialmente preferidas son las enfermedades cancerosas. Los agentes y composiciones descritos en este documento también pueden usarse para la inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en este documento.

El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad a menudo se interpreta como una condición médica asociada con síntomas y signos específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, tal como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, tal como las enfermedades autoinmunes. En el ámbito humano, el término "enfermedad" suele usarse de forma más amplia para referirse a cualquier condición que cause dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o muerte al individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de la estructura y la función, mientras que en otros contextos y para otros fines estas pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades suelen afectar a los individuos no sólo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva sobre la vida y la personalidad de uno.

El término "normal" se refiere al estado saludable o las condiciones en un sujeto o tejido sano, es decir, condiciones no patológicas, donde "saludable" significa preferiblemente no canceroso.

El término "enfermedad asociada a un antígeno" o "enfermedad que involucra un antígeno" se refiere a cualquier enfermedad que implique un antígeno, por ejemplo, una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno o células que expresan un antígeno. La enfermedad que involucra un antígeno puede ser una enfermedad cancerosa o simplemente cáncer. Como se mencionó anteriormente, el antígeno puede ser un antígeno asociado a una enfermedad, tal como un antígeno asociado a un tumor.

"Enfermedad que involucra células que expresan un antígeno" significa, de acuerdo con la enseñanza, que se detecta la expresión del antígeno en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en las células de un tejido u órgano enfermo puede aumentar en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos un 10 %, en particular de al menos un 20 %, de al menos un 50 %, de al menos un 100 %, de al menos un 200 %, de al menos un 500 %, de al menos un 1000 %, de al menos un 10000 % o incluso más. En una realización, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano está reprimida. De acuerdo con la enseñanza, las enfermedades que involucran o están asociadas con células que expresan un antígeno incluyen las enfermedades cancerosas.

Los términos "enfermedad cancerosa" o "cáncer" se refieren o describen la condición fisiológica de un individuo que generalmente se caracteriza por un crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Más particularmente, los ejemplos de dichos cánceres incluyen cáncer de huesos, cáncer de sangre, cáncer de pulmón, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, carcinoma de los órganos sexuales y reproductivos, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejido blando, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), cáncer neuroectodérmico, tumores del eje espinal, glioma, meningioma y adenoma pituitario. El término "cáncer" de acuerdo con la enseñanza también comprende las metástasis del cáncer.

De acuerdo con la enseñanza, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, células tumorígenas o células tumorales) que forman preferiblemente una hinchazón o lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida e incontrolada y continúa creciendo después de que cesan los estímulos que iniciaron el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una falta parcial o total de organización estructural y de coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa de tejido distinta, que puede ser benigna, premaligna o maligna.

Para los fines de la presente enseñanza, los términos "cáncer" y "enfermedad cancerosa" se utilizan indistintamente con los términos "tumor" y "enfermedad tumoral".

Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales endoteliales para ingresar a la cavidad corporal y los vasos y luego, después de ser transportadas por la sangre, la infiltración de los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o tumor metastásico, en el sitio objetivo depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo ocurre incluso después de la extirpación del tumor primario porque pueden permanecer células o componentes tumorales y desarrollar potencial metastásico. En una realización, el término "metástasis" de acuerdo con la enseñanza se relaciona con "metástasis distante" que se relaciona con una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.

Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que, si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario está formado por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado se denomina entonces cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

El término "células tumorales circulantes" o "CTC" se refiere a las células que se han desprendido de un tumor primario o de metástasis tumorales y circulan en el torrente sanguíneo. Las CTC pueden constituir semillas para el crecimiento posterior de tumores adicionales (metástasis) en diferentes tejidos. Las células tumorales circulantes se encuentran en frecuencias del orden de 1-10 CTC por mL de sangre completa en pacientes con enfermedad metastásica. Se han desarrollado métodos de investigación para aislar CTC. Se han descrito varios métodos de investigación en la técnica para aislar CTC, por ejemplo, técnicas que utilizan el hecho de que las células epiteliales comúnmente expresan la proteína de adhesión celular EpCAM, que está ausente en las células sanguíneas normales. La captura basada en perlas inmunomagnéticas implica el tratamiento de muestras de sangre con un anticuerpo contra EpCAM que se ha conjugado con partículas magnéticas, seguido de la separación de las células marcadas en un campo magnético. Luego, las células aisladas se tiñen con anticuerpos contra otro marcador epitelial, la citoqueratina, así como con un marcador leucocitario común CD45, para distinguir las CTC raras de los glóbulos blancos contaminantes. Este enfoque robusto y semiautomatizado identifica CTC con un rendimiento promedio de aproximadamente 1 CTC/mL y una pureza del 0.1 % (Allard et al, 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904,). Un segundo método para aislar CTC utiliza un dispositivo de captura de CTC basado en microfluidos que implica hacer fluir sangre completa a través de una cámara embebida con 80,000 micropostes que se han vuelto funcionales al recubrirlos con un anticuerpo contra EpCAM. Luego, las CTC se tiñen con anticuerpos secundarios contra la citoqueratina o marcadores específicos de tejido, como el PSA en el cáncer de próstata o el HER2 en el cáncer de mama, y se visualizan mediante el escaneo automatizado de micropostes en múltiples planos a lo largo de coordenadas tridimensionales. Los chips de CTC pueden identificar células tumorales circulantes positivas para citoqueratina en pacientes con un rendimiento medio de 50 células/mL y una pureza que varía entre 1 - 80 % (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235 -1239). Otra posibilidad para aislar CTC es utilizar la prueba de células tumorales circulantes (CTC) CellSearch™ de Veridex, LLC (Raritan, NJ) que captura, identifica y cuenta las CTC en un tubo de sangre. El sistema CellSearch™ es una metodología aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos para la enumeración de CTC en sangre completa que se basa en una combinación de etiquetado inmunomagnético y microscopía digital automatizada. Existen otros métodos para aislar CTC descritos en la bibliografía, todos los cuales pueden utilizarse junto con la presente enseñanza.

Una recaída o recurrencia ocurre cuando una persona se ve afectada nuevamente por una condición que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha padecido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y nuevamente desarrolla dicha enfermedad, dicha enfermedad recién desarrollada puede considerarse como una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la enseñanza, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. De este modo, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento con éxito una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor aparece en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como en el sitio del tumor original. Preferiblemente, el tumor original para el cual el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

El término "inmunoterapia" se relaciona con el tratamiento de una enfermedad o condición induciendo, mejorando o suprimiendo una respuesta inmune. Las inmunoterapias diseñadas para provocar o amplificar una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de activación, mientras que las inmunoterapias que reducen o suprimen una respuesta inmunitaria se clasifican como inmunoterapias de supresión. El término "inmunoterapia" incluye la inmunización con antígenos o vacunación con antígenos, o la inmunización con tumores o vacunación con tumores. El término "inmunoterapia" también se relaciona con la manipulación de las respuestas inmunes de tal manera que las respuestas inmunes inapropiadas se modulen en otras más apropiadas en el contexto de enfermedades autoinmunes como la artritis reumática, las alergias, la diabetes o la esclerosis múltiple.

Los términos "inmunización" o "vacunación" describen el proceso de administrar un antígeno a un individuo con el propósito de inducir una respuesta inmune, por ejemplo, por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "tratamiento terapéutico" o simplemente "tratamiento" se refiere a cualquier tratamiento que mejore el estado de salud y/o prolongue (aumente) la vida de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retardar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que en la actualidad tiene o que anteriormente ha tenido una enfermedad.

El término "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refiere a cualquier tratamiento que tenga como objetivo evitar que una enfermedad se presente en un individuo. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se utilizan en el presente documento indistintamente.

Los términos "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención y/o tratamiento de la aparición y/o propagación de una enfermedad, por ejemplo, un tumor, en un individuo. Por ejemplo, una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, mediante la administración de una composición descrita en este documento, puede proteger al individuo receptor del desarrollo de un tumor. Por ejemplo, una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, mediante la administración de una composición descrita en este documento, puede detener el desarrollo de una enfermedad, por ejemplo, conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de un tumor. Esto incluye la desaceleración del progreso/crecimiento del tumor, en particular una interrupción de la progresión del tumor, que conduce preferiblemente a la eliminación del tumor. La administración terapéutica de una inmunoterapia puede proteger al individuo, por ejemplo, de la diseminación o metástasis de tumores existentes.

El término "individuo" o "sujeto" se refiere a los vertebrados, particularmente a los mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente enseñanza son los humanos, los primates no humanos, los mamíferos domesticados como perros, gatos, ovejas, ganado, cabras, cerdos, caballos, etc., los animales de laboratorio como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como los animales en cautiverio como los animales de los zoológicos. El término "sujeto" también se refiere a vertebrados no mamíferos como aves (en particular aves domesticadas como pollos, patos, gansos, pavos) y a peces (en particular peces de piscifactoría, como el salmón o el bagre). El término "animal" tal como se utiliza en este documento también incluye a los seres humanos. Preferiblemente, el término "paciente" se refiere a un individuo enfermo.

Los agentes descritos en este documento pueden administrarse en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una sal del mismo, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar, prevenir o reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar local o sistémicamente.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de tal manera que el agente se distribuye ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolla un efecto biológico. De acuerdo con la presente enseñanza, se prefiere que la administración sea por vía parenteral.

El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de tal manera que éste no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a ellas.

En una realización particularmente preferida, la composición de acuerdo con la presente enseñanza se administra al tejido muscular, tal como el músculo esquelético. Por lo tanto, la administración intramuscular, como, por ejemplo, la inyección intramuscular, es la vía de administración preferida.

La administración puede lograrse de diversas maneras. En una realización, la composición de acuerdo con la presente enseñanza se administra mediante inyección. En una realización preferida, la inyección se realiza mediante una aguja. Se puede utilizar como alternativa la inyección sin aguja.

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender al menos un adyuvante. El término "adyuvante" se refiere a compuestos que, cuando se administran en combinación con un antígeno o un péptido antigénico a un individuo, prolongan o mejoran o aceleran una respuesta inmunitaria. Se supone que los adyuvantes ejercen su actividad biológica mediante uno o más mecanismos, incluyendo un aumento de la superficie del antígeno, una prolongación de la retención del antígeno en el cuerpo, un retraso de la liberación del antígeno, el direccionamiento del antígeno a los macrófagos, el aumento de la captación del antígeno, la mejora del procesamiento del antígeno, la estimulación de la liberación de citocinas, la estimulación y activación de células inmunes tal como células B, macrófagos, células dendríticas, células T y la activación inespecífica de células inmunes. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos como emulsiones de aceite (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (como el alumbre), productos bacterianos (como la toxina de Bordetella pertussis) o complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes incluyen saponinas, adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, tocoferol o alumbre, pero no se limitan a ellos.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente enseñanza se aplica generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado sola o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad determinada, la reacción deseada se refiere preferentemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto incluye ralentizar la evolución de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir su progreso. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad también puede ser un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha condición. Una cantidad efectiva de las composiciones descritas en este documento dependerá de la condición a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las composiciones descritas en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En caso de que la reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden utilizar dosis más altas (o efectivamente dosis más altas logradas mediante una vía de administración diferente, más localizada).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, portadores y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes saborizantes o colorantes.

El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o adelgazante. Además, el término "diluyente" incluye uno o más de los siguientes medios de suspensión y/o mezcla: fluido, líquido o sólido.

El término "portador" se refiere a uno o más rellenos o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para su administración a un ser humano. El término "portador" se refiere a un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación de dicho componente. Preferiblemente, los componentes portadores son líquidos estériles tales como agua o aceites, incluidos aquellos que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, como aceite de maní, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. También se pueden utilizar soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerina como compuestos portadores acuosos.

Los portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de portadores adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticos pueden seleccionarse teniendo en cuenta la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender como, o además de, el/los vehículo(s), excipiente(s) o diluyente(s), cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento y/o agente(s) solubilizante(s) adecuado(s). Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. Se pueden proporcionar en la composición farmacéutica conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.

En una realización, la composición es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo, sales. En una realización, la composición está en forma de una composición liofilizada. Una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una composición acuosa respectiva.

Los agentes y composiciones proporcionados en este documento pueden usarse solos o en combinación con otros regímenes terapéuticos tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

La presente enseñanza se describe en detalle y se ilustra mediante figuras y ejemplos, que se utilizan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Gracias a la descripción y a los ejemplos, el profesional especializado tiene a su disposición otras formas de realización que también se incluyen en la enseñanza.

Figuras

Figura 1. Casos ejemplares de inducción de una espuesta de las células T CD4+ puro o CD4+/CD8+ dual contra un neoepítopo. a, Cultivos enriquecidos con células T CD4+ y CD8+ antes y después de la vacunación del paciente P19 estimulado con los ARN del pentátopo del paciente se compararon con DC autólogas cargadas con OLP que cubrían un neoepítopo mutado en la proteína ST5 (supresor de tumorigenicidad 5). b-c, cultivos enriquecidos con células T CD4+ y CD8+ antes y después de la vacunación del paciente P19 estimulados con el a Rn del pentátopo específico del paciente se compararon en ELIspot de IFNy contra las DC autólogas cargadas con OLP que cubrían un neoepítopo mutado en la proteína UTP6 (componente del procesoma de subunidad pequeña). c, se controló la calidad de cultivos de células T CD4+ y CD8+ después de la estimulación para verificar su pureza mediante citometría de flujo.

Figura 2. Especificidad de los TCR específicos de NARFL-E62K clonados a partir de células T CD8+ del paciente P01. Las células T CD8+ transfectadas con los TCR #1, #5, # 7 o # 9 dirigidos contra una mutación en la proteína NARFL (similar al factor de reconocimiento de prelamina A nuclear) se analizaron mediante ELISpot de IFNg para el reconocimiento de células K562 transfectadas con HLA-A*3101 y pulsadas con péptidos de 15 mer individuales que cubrían la secuencia mutada o la de tipo silvestre.

Figura 3. Control de la enfermedad en pacientes con melanoma con alto riesgo de recaída bajo la vacunación con ARN de neoepítopo. a, Los ARN que codifican las cadenas TCR-a/p de TCR#8 clonadas a partir de TIL individuales se transfectaron en células T CD8+ derivadas de donantes sanos y probadas en células K562 que expresan dos de las moléculas del HLA de clase I del paciente pulsadas con OLP RETSAT-P546S. b, Representación de la presentación del neoepítopo subyacente en dos alelos de HLA. La mutación está subrayada (ver también la Figura 4).

Figura 4. Inducción de las respuestas de células T CD8+ contra dos epítopos diferentes de células T restringidos a HLA generadas por la misma mutación. a, La prueba del ensayo ELISpot de IFNy de células T CD8+ después de la vacuna de P17 en DC autólogas cargadas con OLP P17-RETSAT-P546S individuales. b, Detección de células T CD8+ que reconocen HSCVMASLR, el epítopo mínimo restringido por HLA A *6801 mejor predicho dentro de P17-RETSAT-P546 (codificado por OLP 3 y 4) en TIL posteriores a la vacunación del paciente P17 mediante tinción de multímeros. c, Especificidad de dos RETSAT-P546S-TCR restringidos por HLA B*3701 obtenidos de TIL del paciente P17 que reconocen OLP 1 y 2.

Figura 5: Respuestas inmunes preexistentes mediadas por células T CD4+ y CD8+ contra neoepítopos

A, cultivos enriquecidos con células T CD4+ y CD8+ del paciente P01 estimulados con un grupo de OLP y comparados con ELIspot de IFNy contra DC autólogas cargadas con un grupo de OLP que cubren el objetivo 001_107. El objetivo 001_107 no fue vacunado. B, se controló la calidad de los cultivos de células T c D4+ y CD8+ (IVS) después de la estimulación para determinar su pureza mediante citometría de flujo. C, los cultivos enriquecidos con células T CD4+ y CD8+ del paciente P06 estimulados con un grupo de OLP y se compararon en ELIspot de IFNy contra DC autólogas cargadas con un grupo de OLP que cubren el objetivo 006_003. El objetivo 006_003 no fue vacunado. Los cultivos de células T. D, se controló la calidad de los cultivos de células T CD4+ y CD8+ después de la estimulación para determinar su pureza mediante citometría de flujo.

Ejemplos

Las técnicas y métodos utilizados en este documento se describen aquí o se llevan a cabo de una manera ya conocida y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Ejemplo 1:Materiales y métodos

Diseño del estudio

Los objetivos principales de este estudio multicéntrico de fase I (NCT02035956) fueron evaluar la seguridad de la vacuna y las respuestas inmunes específicas del antígeno inducidas por la vacuna.

El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las Guías de Buenas Prácticas Clínicas y con la aprobación del comité de revisión institucional o del comité de ética independiente de cada sitio participante y las autoridades reguladoras competentes. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.

Los pacientes elegibles tenían >18 años y tenían melanoma maligno en estadio IIIA-C o IV (clasificación de melanoma AJCC 2009) en remisión completa, remisión parcial o enfermedad estable en cualquier etapa del tratamiento. Los pacientes con metástasis eran elegibles si podían ser tratados con un compuesto activo hasta la disponibilidad de su vacuna individualizada. Los pacientes debían tener una función hematológica y de órganos terminales adecuada. Los criterios de exclusión clave fueron enfermedad autoinmune clínicamente relevante, VIH, VHB, VHC e infecciones agudas por VEB o VMC y metástasis cerebrales. El tratamiento regular consistió en ocho inyecciones en 43 días; la continuación del tratamiento quedó a criterio de los investigadores. Los pentátopos de ARN se diluyeron en solución de Ringer de 1.0 mg/mL (Rotexmedica o BAG Healthcare) y se inyectaron en ganglios linfáticos inguinales separados. A 10 pacientes se les administraron 500 |jg y a tres pacientes 1000 jg por tratamiento para explorar dos intervalos de dosis diferentes.

Evaluaciones clave del estudio

Se realizaron leucaféresis para pruebas de inmunogenicidad antes de la primera (visita 12, denominada 'previa a la vacunación') y después de la octava inyección de la vacuna (visita 20; denominada 'posterior a la vacunación'). Se realizaron imágenes de tórax, abdomen y cerebro mediante tomografías computarizadas y resonancias magnéticas al inicio (visita 1), antes de la vacunación (visita 12), el día 90 (visita 21) y al final del tratamiento continuo (visita 26) de acuerdo con las pautas de imágenes locales y RECIST versión 1.1 y las pautas de los criterios de respuesta inmunitaria relacionada (irRC) (Wolchok, J.D. et al. Clin. Cancer Res. 15, 7412-20 (2009)). La seguridad se caracterizó de acuerdo con CTCAE v4.03 desde el grado 1 hasta el grado 5.

Los datos que en el presente documento se presentan se basan en un análisis provisional exploratorio con fecha de corte de noviembre de 2016.

Material del paciente

Se adquirió tejido tumoral fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) o congelado fresco en resecciones diagnósticas de rutina y se evaluó el contenido tumoral en secciones teñidas con H&E.

Se utilizaron muestras frescas de tumores para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y líneas de células tumorales primarias.

Los TIL se cultivaron a partir de pequeños trozos de tejido tumoral fresco cultivado en medio X-Vivo 15 (Lonza) con 2 % de albúmina sérica humana (CSL-Behring) y 6000 U/mL de IL-2 (Proleukin S, Novartis) durante dos semanas como se publicó anteriormente (Dudley, M.E., Wunderlich, J.R., Shelton, T.E., Even, J. y Rosenberg, S.A.J. Inmunother. 26, 332-42). Posteriormente, los TIL se expandieron durante dos semanas utilizando PBMC alogénicas irradiadas como células alimentadoras en presencia de 30 ng/mL de IgG-2a anti-CD3 (clon OKT3, eBiosciences) y 300 U/mL de IL-2 (Proleukin S, Novartis).

Para la generación de líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes, se cultivaron fragmentos de tejido tumoral fresco en medio RPMI1640 (Life Technologies) suplementado con 15 % de FCS (Biochrome AG).

Las PBMC obtenidas para el monitoreo inmunológico o como material de partida para el proceso de fabricación se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) a partir de capas leucocíticas de donantes sanos o de muestras de sangre periférica de pacientes con melanoma. Las DC (DC) inmaduras se generaron como se describió anteriormente (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)).

Secuenciación de próxima generación

Se extrajo ADN de tres tejidos tumorales FFPE con rizos de diez pm por triplicado utilizando una versión modificada del kit de tejido FFPE con ADN QIAamp de Qiagen. La extracción de ARN de los rizos tumorales FFPE se realizó por duplicado utilizando el kit de FFPE con RNeasy de Qiagen. Para las extracciones de ADN y ARN de muestras o células tumorales frescas congeladas, se utilizaron el kit de tejido y sangre con DNeasy de Qiagen y el Mini Kit con RNeasy, respectivamente.

Los ácidos nucleicos extraídos se utilizaron para la generación de varias bibliotecas. Las bibliotecas de secuenciación de ARN se prepararon por duplicado a partir de ARN de tumores o líneas celulares de FFPE utilizando el kit de preparación de muestras de ARN TruSeq V2 de Illumina y 1 pg de ARN total como entrada. Se construyeron bibliotecas de captura de exoma de ADN por duplicado a partir de 1 a 3 pg de ADN tumoral de FFPE y ADN de PBMC correspondiente utilizando SureSelect X<t>V4 Human All Exon de Agilent.

Las bibliotecas de NGS para la secuenciación del genoma completo (WGS) de MZ-GaBa-018 y PBMC coincidentes se prepararon fragmentando 100 ng de ADN genómico en un volumen total de 15 pL utilizando microTUBE-15 (Covaris Ltd) hasta una longitud de fragmento promedio de aproximadamente 160 pb. La biblioteca fue preparada con un kit de preparación de biblioteca de ADN NEBNext® Ultra™de NEB para Illumina® utilizando 25 ng de ADNg fragmentado como entrada.

Para la secuenciación de próxima generación (NGS), las bibliotecas se diluyeron a 2 nM o diez nM y se agruparon a diez pM utilizando el kit de grupos TruSeq PE v3-cBot-HS de Illumina. Cada biblioteca de captura de exoma se secuenció por separado en un carril, mientras que las réplicas de la biblioteca de ARN se secuenciaron como 2-plexos en un carril. Todas las bibliotecas fueron secuenciadas en extremos emparejados de 50 nt en una plataforma Illumina HiSeq 2500 utilizando dos de los kit TruSeq SBS v3-HS de Illumina de 50 ciclos. La línea celular MZ-GaBa-018 y las bibliotecas de WGS de PBMC correspondientes se distribuyeron en 4 carriles cada una y se secuenciaron en extremos emparejados de 100 nt en la misma plataforma utilizando el kit TruSeq SBS v3-cBot-HS de Illumina de 200 ciclos.

Bioinformática y descubrimiento de mutaciones

Todas las etapas del análisis de datos relacionados con el mutanoma para un solo paciente fueron coordinadas mediante una canalización de software implementada en el lenguaje de programación Python. Para las bibliotecas de ADN, un mínimo de 150 x 106 lecturas de 50 nt de extremos emparejados y para las bibliotecas de ARN se requirió un mínimo de 75 x 106 lecturas de 50 nt de extremos emparejados.

Para la detección de mutaciones, las lecturas de ADN se alinearon con el genoma de referencia hg19 con bwa (Li, H. & Durbin, R. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)). Se analizaron exomas duplicados de muestras tumorales y normales coincidentes para detectar variantes de un solo nucleótido. Se identificaron y filtraron los loci con supuestos genotipos homocigotos en las muestras normales para conservar los llamados de alta confianza para las variantes de un solo nucleótido. Los sitios restantes fueron inspeccionados más a fondo para detectar un supuesto evento mutacional homocigoto o heterocigoto. Se filtraron los sitios sospechosos para eliminar posibles falsos positivos. Las réplicas se incorporaron probando tanto la suma de réplicas como las réplicas por separado. La lista final de variantes de un solo nucleótido estuvo compuesta por sitios homocigotos de alta confianza en las muestras normales y eventos mutacionales heterocigotos u homocigotos de alta confianza en las muestras tumorales. Las coordenadas genómicas de las variantes identificadas se compararon con las coordenadas de transcripción de los genes conocidos de la UCSC para asociar las variantes con genes, transcripciones, posibles cambios en la secuencia de aminoácidos y los valores de expresión derivados de la secuenciación de ARN.

Para la secuenciación de ARN, las lecturas de ARN se alinearon con el genoma de referencia hg19 y el transcriptoma usando bowtie (Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Genome Biol. 10, R25 (2009)), y la expresión genética se determinó por comparación con la transcripción de genes conocidos de la UCSC y las coordenadas de exones, seguido de la normalización a unidades RPKM (Mortazavi, A. et al. Nat. Methods 5, 1-8 (2008)).

Priorización y selección de neoepítopos

De las variantes de un solo nucleótido identificadas, se seleccionaron hasta 46 variantes predichas mediante un procedimiento evolutivo: a) Eliminación de variantes sin sentido y filtrado por expresión de exón y transcripción distinta de cero; seguido de la clasificación primero por expresión de exón y luego por puntuación de predicción de unión de HLA clase I utilizando un algoritmo de clasificación estable y seleccionando hasta 46 variantes (P01 - P04). b) Eliminación de variantes sin sentido y filtrado por expresión de exón y transcripción distinta de cero y frecuencia de variante distinta de cero en los datos de secuenciación de ARN; seguido de la clasificación primero por expresión de exón y luego por puntuación de predicción de unión de HLA clase I utilizando un algoritmo de clasificación estable y seleccionando hasta 23 secuencias de péptidos diana; seguido de la clasificación de las secuencias de péptidos diana restantes primero por puntuación de predicción de unión de HLA clase I y luego por expresión de exón utilizando un algoritmo de clasificación estable y seleccionando hasta 23 secuencias de péptidos diana adicionales; no se permitió que ambas etapas de selección dieran como resultado más de 46 variantes seleccionadas (P05-P07, P09-P12) y c) Eliminación de variantes sin sentido y filtrado por expresión de exón y transcripción distinta de cero y frecuencia de variante distinta de cero en los datos de secuenciación de a RN; seguido de la clasificación primero por expresión de exón y luego por puntuación de predicción de unión de HLA clase II utilizando un algoritmo de clasificación estable y seleccionando hasta 20 secuencias de péptidos diana con expresión génica > 10 RPKM; seguido de la clasificación de las secuencias de péptidos diana restantes primero por expresión y luego por puntuación de predicción de unión de HLA clase I utilizando un algoritmo de clasificación estable y seleccionando hasta 20 secuencias de péptidos diana adicionales; seguido de la clasificación de las secuencias de péptidos diana restantes primero por puntuación de predicción de unión de HLA clase I y luego por expresión de exón utilizando un algoritmo de clasificación estable y completando hasta 46 variantes seleccionadas (P17, P19). La selección final de hasta diez péptidos diana mutados por paciente requirió la decisión de un comité de selección de péptidos diana que evaluó los péptidos diana basándose en las predicciones de unión de MHC I y MHC II, la expresión genética y la frecuencia de alelos variantes.

La afinidad de unión de HLA se predijo a través del modo recomendado de IEDB de las herramientas de predicción de células T de IEDB (Kim, Y. et al. Nucleic Acids Res. 40, W525-30 (2012)) (versiones 2.5) utilizando todos los 8-11 mer que contienen variantes para estimaciones de unión de HLA-A/B o 15 mer para HLA-DRB/DQB. De todas las predicciones para una sola variante, la mejor puntuación de consenso estuvo asociada con las variantes respectivas.

Con base en estos datos, se seleccionó una lista corta de variantes de un solo nucleótido para confirmación mediante secuenciación de Sanger.

Secuenciación confirmatoria de Sanger

Para el diseño de cebadores, las secuencias genómicas que flanquean los sitios de mutación se extrajeron del genoma de referencia y se utilizaron como entrada para el software primer3 (Untergasser, A. et al. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012); Koressaar, T & Remm, M. Bioinformatics 23, 1289-91 (2007)). Los pares de cebadores de salida se alinearon con el genoma de referencia utilizando blast (Kent, W. J. Genome Res. 12, 656-64 (2002)). Se eliminaron los pares de cebadores con alineaciones con loci fuera del objetivo y se devolvió el par de cebadores óptimo restante para cada sitio de entrada.

La secuenciación de Sanger se realizó amplificando cada locus mutado seleccionado del tejido tumoral y ADN de PBMC mediante PCR (15 minutos a 95 °C para la activación inicial seguida de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C para la desnaturalización, 30 segundos a 60 °C para la hibridación, 30 segundos a 72 °C para la extensión y 6 minutos a 72 °C para la extensión final). Se controló la calidad de cada producto de p Cr utilizando un dispositivo QIAxcel (Qiagen) y se purificó mediante el tratamiento con ExoI/AP o el kit de purificación de PCR MinElute (Qiagen®). La secuenciación de Sanger fue realizada por Eurofins/MWG Ebersberg, Alemania.

Fabricación de ARN transcritoin vitro

La fabricación se realizó de acuerdo con las pautas GMP (buenas prácticas de fabricación). Los fragmentos de ADN sintético que codifican cinco supuestos neoepítopos se clonaron en un vector de inicio que contenía los dominios de sec y MITD (Kreiter, S. et al. J. Immunol. 180, 309-318 (2008)) para un enrutamiento optimizado a las vías de HLA de clase I y II y a los elementos de la secuencia principal para mejorar la estabilidad del ARN y la eficiencia de la traducción (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)). El a Dn se linealizó, se cuantificó espectrofotométricamente y se sometió a transcripciónin vitrocon la ARN polimerasa T7 como se describió previamente (Grudzien-Nogalska, E. et al. Methods Mol. Biol. 969, 55-72 (2013)) en presencia de 7.5 mM de ATP, CTP, UTP, GTP y 3 mM de análogo del protector beta-S-ACA(D1) (Kuhn, AN et al. Gene Ther. 17, 961 971 (2010)) en un entorno de sala limpia. El ARN se purificó utilizando partículas magnéticas (Berensmeier, S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 495-504 (2006)) y la integridad se evaluó mediante electroforesis en gel y electroforesis capilar microfluídica (Experion, Biorad). Los análisis adicionales incluyeron la determinación de la concentración, apariencia, pH, osmolalidad, potencia, nivel de endotoxinas y esterilidad.

Estimulaciónin vitrode las PBMC

Las células T CD4+ y CD8+ se aislaron de PBMC criopreservadas utilizando microperlas (Miltenyi Biotec). Las células T, PBMC agotadas de CD4- o CD8-, se dejaron reposar durante la noche. Las PBMC agotadas de CD4-o CD8- se electroporaron con ARN que codificaba objetivos mutados específicos del paciente, eGFP, proteína de matriz de influenza 1 (M1) o secuencias p2/p16 de tétanos (control positivo), se dejaron reposar durante 3 h a 37 °C y se irradiaron a 15 Gy. Luego, las células T CD4+/CD8+ y las células presentadoras de antígeno electroporadas e irradiadas se combinaron en una proporción de efector a objetivo de 2:1. Después de un día, se añadió medio de cultivo fresco que contenía diez U/mL de IL-2 (Proleukin S, Novartis) y cinco ng/mL de IL-15 (Peprotech). La IL-2 se repuso siete días después de establecer los cultivos. Después de 11 días de estimulación, las células se analizaron mediante citometría de flujo y se utilizaron en ensayos ELISpot.

ELISpot

Las placas de filtro multipantalla (Merck Millipore), recubiertas previamente con anticuerpos específicos para IFN<y>(Mabtech), se lavaron con PBS y se bloquearon con X-Vivo 15 (Lonza) que contenía 2 % de albúmina sérica humana (CSL-Behring) durante 1-5 horas. Se estimularon 0.5 - 3 x 105 células efectoras/pocillo durante 16-20 h (40 h para TIL) con DC autólogas electroporadas con ARN o cargadas con péptidos, líneas de células de melanoma o células K562 transfectadas con HLA clase I o II. Para el análisis de respuestas de células Tex vivo:las PBMC criopreservadas se sometieron a ELISpot tras un periodo de reposo de 2-5 horas a 37 °C. Todas las pruebas se realizaron por duplicado o triplicado e incluyeron ensayos de controles positivos (Enterotoxina B deStaphylococcus[Sigma Aldrich]), así como células de un donante de referencia con reactividad conocida. Las manchas se visualizaron con un anticuerpo anti-IFNY conjugado con biotina (Mabtech) seguido de incubación con ExtrAvidin-Fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) y sustrato BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). Las placas se escanearon utilizando un analizador ELISpot ImmunoSpot R Serie S cinco Versa de CTL (S5Versa-02-9038) y se analizaron mediante el software ImmunoCapture V6.3. Los recuentos de manchas se resumieron como valores medianos para cada triplicado. Se compararon las respuestas de células T estimuladas por ARN mutado o péptidos con células diana electroporadas con ARN de control (luciferasa) o células diana descargadas, respectivamente. Una respuesta se definió como positiva con un mínimo de cinco manchas por 1 x 105 células en el entornoex vivoo 25 manchas por cinco x 104 células en el entorno posterior a IVS, así como un recuento de manchas que fue más del doble que el control respectivo.

Tinción de multímeros y análisis de datos

Se identificaron células T CD8+ específicas de la mutación utilizando dextrámeros (Immudex) que transportaban epítopos de 9 o diez aminoácidos de mutaciones inmunogénicas. Primero se tiñeron las células con multímeros, después de lo cual se realizó la tinción de los marcadores de superficie celular (CD28 CD28.8, CD197 150503, CD45RA HI100, CD3 UCHT1, CD163G8, CD14, MOP9, CD19 SJ25C1, CD27 L128, CD279 EH12, CD8 RPA-T8 todos BD y CD4 OKT4 BioLegend) y la tinción de vivos-muertos (DAPI BD). Luego, las células teñidas se adquirieron en un BD LSR Fortessa<s>O<r>P. Se identificaron eventos singlete, vivos positivos para multímeros dentro de los eventos positivos para CD3 (o CD8), negativos para CD4/CD14/CD16/CD19 o positivos para CD3 (o CD8)/negativos para CD4. La especificidad de los dextrámeros HLA-A*0201 para los neoepítopos específicos del paciente se demuestra por la falta de tinción de donantes de sangre HLA-A*0201+.

Tinción de citocinas intracelulares

Se agregaron DC autólogas electroporadas con ARN que codifica neoepítopos individuales en una proporción E:T de 10:1 y se cultivaron durante aproximadamente 16 horas a 37 °C en presencia de Brefeldina A y Monensina. Las células se tiñeron para determinar su viabilidad (colorante de viabilidad fijable eFluor506, eBioscience), seguido de una tinción para marcadores de superficie (CD8 SK1 BD, CD4 OKT4, BioLegend). Después de la permeabilización, se realizó la tinción de citocinas intracelulares (IL-2 MQ1-17H12, IFN<y>B27 todos BD y TNFa Mab11 BioLegend) y las muestras fueron adquiridas en un BD FACS Canto II (Becton Dickinson).

Clasificación de células individuales

La clasificación de células T específicas de antígenos individuales se realizó después de 11 días de expansión específica de antígenos de las PBMC, células T CD8+ o CD4+ o los TIL purificados. Antes de la clasificación, se reestimularon 2 x 106 células T expandidas con 2 x 105 DC autólogas transfectadas con ARN IVT que codifica el neoantígeno respectivo o un antígeno de control. Después de 16 a 20 h, se recolectaron las células y se trataron con anticuerpos conjugados con fluorocromo dirigidos contra CD14, CD19, CD3, CD8, CD4, CD137, CD134 (todos de BD Biosciences) así como IFN<y>utilizando el kit de ensayo de secreción de IFN<y>(Miltenyi Biotec). La clasificación de células T específicas de cada neoantígeno se realizó en un citómetro de flujo BD FACS Aria (BD Biosciences). Se recolectó una célula doblemente positiva (IFN<y>/CD8, CD137/CD8, IFN<y>/CD4 o CD134/CD4) por pocillo en una placa de fondo en V de 96 pocillos (Greiner Bio-One) que contenía células portadoras 3T3-L1, se centrifugó y se almacenó de -65 °C a -85 °C.

Clonación de TCR específicos de neoepítopos

La clonación de genes de TCR a partir de células T individuales se realizó como se describió previamente (Simon, P et al. Cancer Immunol Res. 2, 1230-44 (2014)). En resumen, el ARN total extraído con el kit Micro RNeasy (Qiagen) se utilizó para la síntesis de ADNc con cambio de plantilla con RevertAid H- transcriptasa inversa (Thermo Fisher) seguido de una amplificación previa utilizando ADN polimersa PfuUltra Hotstart (Agilent). Se utilizaron alícuotas de los ADNc resultantes para PCR multiplex específicas del gen Va/Vp. Los productos se analizaron en un sistema de electroforesis capilar (Qiagen). Las muestras con bandas de 430 a 470 pb se fraccionaron por tamaño en geles de agarosa y las bandas se cortaron y purificaron utilizando un kit de extracción de gel (Qiagen). Los fragmentos purificados se secuenciaron y las uniones V(D)J respectivas se analizaron utilizando la herramienta IMGT/V-Quest (Brochet, X., Lefranc, M.-P. & Giudicelli, V. Nucleic Acids Res. 36, W503-8 (2008)). Los ADN de las cadenas de TCR correspondientes, nuevas y reorganizadas productivamente, se digirieron con NotI y se clonaron en vectores pST1 que contenían las estructuras principales apropiadas para transcripciónin vitrode cadenas TCR-a/p completas (Simon, P et al. Cancer Immunol Res. 2, 1230-44 (2014)).

La secuenciación profunda de TCR-a/p se realizó con ARN total de las PBMC utilizando el kit TCR-Typer (BioNTech Diagnostics). Las bibliotecas de ADN resultantes se secuenciaron en un secuenciador Illumina MiSeq utilizando química de extremos emparejados de 2 x 300 pb. Los datos de secuenciación se analizaron con el software Typer Toolbox. El número total de lecturas de t Cr por muestra varió entre 1.1 x 106 hasta 1.5 x 106.

qRT-PCR

El ARN y el ADNc se generaron con el kit ExpressArt FFPE Clear RNAready (AmpTec) y el kit de reactivo RT PrimeScript™ con borrador de ADNg (Takara Bio Inc.), respectivamente. La qRT-PCR se realizó utilizando el sistema HD BioMark™ (Fluidigm®) o el sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7300 de 96 pocillos. Las muestras y los ensayos se prepararon y analizaron de acuerdo con el "Análisis rápido de expresión genética" a partir de ARN derivado de FFPE utilizando PCR en tiempo Quantitative SYBR® Green o Ensayos de expresión genética TaqMan® en el BioMark™ o en el "protocolo 28 de desarrollo avanzado Fluidigm® del sistema HD BioMark™". Se cargaron 96.96 IFC de matriz dinámica de expresión genética utilizando el controlador IFC HX.

Inmunohistoquímica

Después de la desparafinación de secciones de FFPE de 3 a 4 pm, los portaobjetos se sometieron a recuperación de antígeno hirviéndolos en ácido cítrico diez mM suplementado con 0.05 % de Tween-20 (pH 6.0) a 120 °C durante diez minutos, y posteriormente se enfriaron (con 0.3 % de H2O2; 15 min) y se bloquearon con diez % de suero de cabra en p Bs (30 min) a temperatura ambiente.

Los portaobjetos se incubaron durante la noche a una temperatura de 2 a ocho °C con 0.2 pg/mL de anti-CD3 humano (F7.2.38; Dako), 0.2 pg/mL de anti-CD8 humano (C8/144B; Dako), 1 pg/mL de anti-FoxP3 humano (236A/E7; Abcam), anti-PD-LI 1:200 (13684; Cell Signaling Technologies) o anti-Beta-2-microglobulina 1:2500 (D8P1H; Cell Signaling Technologies) en tampón de bloqueo. La unión de anticuerpos se visualizó con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante (BrightVision HRP, Immunologic) junto con una solución de sustrato-cromógeno rojo (VectorRed; Vector Labs). Las células tumorales se tiñeron con 1 |jg/mL de un anticuerpo específico de Melan-A(A103, Dako).

Posteriormente, las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer (Carl Roth GmbH) y se sometieron a evaluación mediante un análisis basado en computadora (Definiens Developer).

Para el análisis, se escanearon portaobjetos (Axio.Scan; Zeiss) y se cuantificaron manualmente las áreas de tumor, tejido normal y necróticas predefinidas mediante un software de análisis de imágenes computarizado (Developer, Definiens). Se determinó el número de TIL CD3, CD8 y FoxP3 en las áreas clasificadas como tejido tumoral.

Clonación de antígenos HLA

Los antígenos HLA fueron sintetizados por un proveedor de servicios (Eurofins Genomics) de acuerdo con los respectivos resultados de tipificación de HLA de alta resolución. Las secuencias HLA-DQA se amplificaron a partir de ADNc específico del donante con 2.5 U de polimerasa Pfu utilizando los cebadores DQA1_s (PHO-GCC ACC ATG ATC CTA AAC AAA GCT CTG MTG C) y DQA1_as (TAT GCG ATC GCT CAC AAK GGC CCY TGG TGT CTG). Los antígenos HLA se clonaron en vectores IVT digeridos adecuadamente (Simon, P et al. Cancer. Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)).

Transferencia de ARN a las células

Se añadió ARN a las células suspendidas en medio X-VIVO 15 (Lonza) en una cubeta de electroporación estéril preenfriada con un espacio de 4 mm (Bio-Rad). La electroporación se realizó con un sistema de electroporación de onda cuadrada<b>T<x>ECM 830 (células T: 500 V / 3 ms / 1 pulso; iDC: 300 V / 12 ms / 1 pulso; PBMC a granel: 400 V / 6 ms / 1 pulso; MZ-GaBa-018: 225 V / 3 ms / 2 pulsos; K562: 200 V / ocho ms / 3 pulsos).

Péptidos

Se utilizaron péptidos sintéticos de 15 mer con superposiciones de 11 aminoácidos que cubren las secuencias de neoantígeno de 27 mer (4 OLP por neoantígeno) o antígenos de control (VIH-gag, TPTE), denominados grupo de péptidos superpuestos (OLP), o epítopos de ocho a 11 mer. Todos los péptidos sintéticos se adquirieron de JPT Peptide Technologies GmbH y se disolvieron en AquaDest. (Aqua B. Braun, BRAUN Melsungen) con diez % de DMSO hasta una concentración final de 3 mM.

Análisis citométricos de flujo

La expresión en la superficie celular de los genes de TCR transfectados se analizó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpos anti-TCR conjugados con PE o FITC contra la familia de regiones variables apropiadas o la región constante de la cadena TCR-p (Beckman Coulter) y anticuerpos anti-CD8/-CD4+ marcados con FITC o APC.(BD Biosciences). Los antígenos HLA de las células presentadoras de antígeno utilizadas para evaluar la función de las células T transfectadas con TCR se detectaron mediante tinción con anticuerpos específicos de HLA clase II marcados con FITC (Beckman Coulter) y anticuerpos específicos de HLA clase I marcados con PE (BD Biosciences). El análisis citométrico de flujo se realizó en un citómetro de flujo analítico BD FACSCanto™ II (BD Biosciences). Los datos adquiridos fueron analizados utilizando la versión diez del software FlowJo (Tree Star).

Ensayo de citotoxicidad

Se realizó un ensayo de citotoxicidad basado en luciferasa como se describió previamente (Omokoko, TA et al. J. Immunol. Res. 2016, 9540975 (2016)). Se cocultivaron 1 x 104 células diana transfectadas con ARN de luciferasa solo o en combinación con ARN B2M con células T efectoras específicas de mutación (células T CD8+ transfectadas con TCR activadas por OKT3 o células T IVS CD4+/CD8+) durante 19 a 25 horas. Se añadió una mezcla de reacción que contenía D-Luciferina (BD Biosciences; concentración final 1.2 mg/mL). Una hora después, se midió la luminiscencia utilizando un lector Tecan Infinite M200 (Tecan). La muerte celular se calculó midiendo la reducción de la actividad total de la luciferasa. Las células viables se midieron mediante la oxidación de luciferina mediada por luciferasa. La muerte específica se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación:

(muestra — lisis completa)

Muerte especifica en % =100 —x100.(células viables máximas — lisis completa

Ensayo de apoptosis

Para el ensayo de apoptosis por activación de caspasa 3/7 (IncuCyte), se sembraron 1 x 104 células de melanoma y 20 x 104 células T efectoras por pocillo en placas Corning de 96 pocillos durante 24 horas. Se agregó el reactivo de caspasa 3/7 a una dilución de 1:1000 de una solución madre de cinco mM (Essen Bioscience), cada condición por triplicado. Se obtuvieron imágenes de las células con un aumento de 10 veces en un sistema de imágenes de contenido en vivo IncuCyte Zoom (Essen Bioscience) a 37 °C, cinco % de CO2. Se adquirieron imágenes cada hora durante 24 horas, cuatro imágenes por pocillo. Los datos se analizaron utilizando el software de análisis IncuCyte para detectar y cuantificar células verdes/imagen (apoptóticas). Los promedios de los recuentos de objetos verdes con SD en cada punto de tiempo se graficaron utilizando el software GraphPad Prism.

Ejemplo 2:Viabilidad clínica y seguridad favorable de la vacunación con ARN personalizada con neoepítopos

Anteriormente hemos descrito procedimientos relacionados con la personalización para el diseño y producción de vacunas de ARN que codifican múltiples mutaciones somáticas (en adelante, 'vacuna de ARN neoepítopo') a partir del mapeo exhaustivo de las mutaciones tumorales hasta la fabricación y liberación de la composición de la vacuna individual (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015); Vormehr, M. et al. J. Immunol. Res. 2015, 6 (2015); Kranz, L.M. et al. Nature 534, 396-401 (2016). Estos procedimientos se desarrollaron aún más hasta convertirse en un proceso estandarizado que cumple con las pautas regulatorias.

Las mutaciones no sinónimas expresadas en pacientes con melanoma en estadio III y IV se identificaron mediante secuenciación del exoma y del ARN de ácidos nucleicos de biopsias tumorales de rutina congeladas o fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) y de células sanguíneas como fuente de ADN de tejido sano. Se aplicaron dos principios independientes para clasificar las mutaciones. Se utilizó una predicción de unión de alta afinidad a las moléculas de HLA de clase II del paciente combinadas con altos niveles de expresión del ARN codificante de la mutación. El otro se basó en la unión prevista de HLA clase I. Las frecuencias de alelos mutados y los valores de transcripción relativos sirvieron como diferenciadores adicionales para priorizar las mutaciones con una afinidad de unión de HLA prevista comparable. Las mutaciones somáticas específicas del tumor priorizadas se confirmaron mediante secuenciación de Sanger.

Se seleccionaron diez mutaciones por paciente (para el paciente P09 solo cinco) y se diseñaron dos ARN sintéticos, cada uno de los cuales codifica cinco péptidos de 27 mer que representan una de las mutaciones (ARN pentátopos). Se produjo ARN de alta pureza de acuerdo con un proceso de grado de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) con una tasa de éxito del 100 %. El tiempo medio de fabricación de materias primas de la vacuna de ARN fue de 68 días (intervalo de 49 a 102 días). Debido a los requisitos reglamentarios para el primer uso en humanos y la etapa de investigación, cada vacuna personalizada fabricada se sometió a pruebas analíticas exhaustivas que extendieron el tiempo medio total a 103 días (intervalo de 89 a 160 días) desde la selección de mutaciones hasta la liberación de la vacuna.

A los pacientes con melanoma NY-ESO-1 y/o positivo para tirosinasa se les ofreció una vacuna de ARN que codifica estos dos autoantígenos compartidos asociados a tumores (TAA) como puente hasta la liberación de su vacuna de ARN neoepítopo. Se inyectaron percutáneamente ocho dosis de la vacuna de ARN individual en los ganglios linfáticos bajo control ecográfico. Posteriormente se extrajeron muestras de sangre después de la vacunación para realizar pruebas de inmunogenicidad. La vacunación con neoepítopo se continuó a criterio del investigador.

Se seleccionaron veinte pacientes para participar en el ensayo clínico, 16 de los cuales fueron considerados elegibles de acuerdo con los criterios de inclusión y exclusión y se inscribieron en el estudio. Dos pacientes retiraron su consentimiento y un paciente no pudo iniciar el tratamiento del estudio debido a metástasis cerebrales recién diagnosticadas y de rápida progresión. Por lo tanto, en total trece pacientes recibieron la vacuna de ARN neoepítopo, en nueve pacientes procedidos por la vacuna puente de ARN TAA.

Todos los pacientes completaron con éxito el tratamiento y recibieron hasta 20 dosis de la vacuna de ARN neoepítopo. El número de mutaciones detectadas por paciente (intervalo de 69 a 1440) estuvo dentro del intervalo esperado para el melanoma (Lawrence, M.S. et al. Nature 499, 214-8 (2013); Vormehr, M. et al. Curr. Opin. Immunol. 39, 14-22 (2016)). Diez pacientes tenían las mutaciones impulsoras de melanoma más comunes en los genes B<r>A<f>o H<r>AS/<n>R<a>S (Hodis, E. et al. Cell 150, 251-263 (2012)). Los perfiles de mutación estuvieron dominados por transiciones de citosina a timina (C>T) típicas del melanoma inducido por UV (Pleasance, E.D. et al. Nature 463, 191-196 (2009)).

En general, el tratamiento fue bien tolerado por todos los pacientes. De los 18 eventos adversos graves (SAE) informados, cuatro de los SAE en dos pacientes surgieron del tratamiento con vacuna neoepítopo, pero no estaban relacionados con el fármaco del estudio. Los eventos adversos (AE) resultantes del tratamiento con la vacuna neoepítopo fueron en su mayoría de grado 1 o 2. No hubo AE de grado 4 o 5. Los AE relacionados con fármacos no se agruparon en ninguna clase de sistema u órgano. Los datos sobre seguridad clínica y resultados se informarán en detalle en otra parte.

Ejemplo 3:Inducción de inmunidad de células T poliespecíficas mediante vacunación con ARN neoepítopo

Para medir la inmunogenicidad de cada uno de los 125 neoepítopos administrados individualmente en este estudio, analizamos las células T CD4+ y CD8+ altamente enriquecidas de muestras de sangre previas y posteriores a la vacunación. La inmunogenicidad se determinó mediante ELISpot de IFNy contra células dendríticas (DC) autólogas transfectadas con ARN que codifica una única secuencia de 27 aminoácidos (aa) que centra la mutación o DC cargadas con péptidos superpuestos (OLP) de 15 mer que cubren la secuencia respectiva. Ambas lecturas de inmunogenicidad generaron resultados altamente concordantes.

En general, el 60 % de los neoepítopos resultaron ser inmunogénicos. Cada paciente vacunado respondió al menos a tres de los neoepítopos individuales. Frente a un tercio de los neoepítopos inmunogénicos había células T preexistentes, que se expandieron aún más tras la vacunación. Las respuestas contra casi el 70 % de los neoepítopos no fueron detectables antes de la vacunación y fueron inducidas de nuevo.

La mayoría de los neoepítopos fueron reconocidos exclusivamente por células T CD4+ y una fracción más pequeña por CD8+. Aproximadamente una cuarta parte de los neoepítopos inmunogénicos fueron doblemente reactivos con células T tanto CD4+ como CD8+. La contaminación cruzada de células T CD4+ y CD8+ podrían excluirse experimentalmente (Fig. 1c). La caracterización detallada de las respuestas de los OLP de 15 mer mostró que las células T CD4+ y CD8+ reconocieron partes ligeramente diferentes del neoepítopo (Fig. 1a,b). Los neoepítopos inmunogénicos se distribuyeron uniformemente en las cinco posiciones del<a>R<n>pentátopo, lo que respalda la idoneidad del formato poli-neoepítopo.

Para evaluar si las células T inducidas por neoepítopos reconocen su contraparte no mutada, probamos DC pulsadas con ARN o con OLP que representan epítopos de tipo silvestre o mutados mediante ELISpot. En la gran mayoría de las respuestas inducidas por la vacuna de ARN neoepítopo, no se detectó reactividad contra el respectivo epítopo de tipo silvestre o fue de un nivel inferior. Aproximadamente una cuarta parte de las respuestas mostraron reactividad con el epítopo de tipo silvestre por encima del fondo de acuerdo con los análisis ELISpot. Es muy posible que la secuencia WT de 13 aa que se extiende por los extremos N y C de la mutación puntual pueda presentarse en moléculas de HLA de clase I y HLA de clase II, dando como resultado células T reactivas al epítopo de tipo silvestre. Sin embargo, se espera que una fuerte expansión de células T autorreactivas sea inhibida por mecanismos de tolerancia centrales. De este modo, caracterizamos con más detalle las respuestas de las células T contra los objetivos de la vacuna (P04-C7-E258K, P09-MAN1A2-E323D, P05-FAM135-A479S) que mostraron un reconocimiento significativo de las DC de ARN de tipo silvestre. La reactividad del epítopo de tipo silvestre P04-C7-E258K no se confirmó al probar DC cargadas con OLP Para P09-MAN1A2-E323D observamos el reconocimiento de epítopos tanto mutados como de tipo silvestre para los péptidos que abarcan los aa 9-23 de los 27mer, mientras que para los péptidos que abarcan los aa 5-19 solo se reconoció la versión mutada. Esto implica que las respuestas inmunes reactivas cruzadas pueden contener células T que reconozcan exclusivamente el epítopo mutado, lo que puede ejercer control sobre el tumor. En todos los casos encontramos que las DC autólogas, a pesar de expresar de forma endógena el respectivo gen de tipo silvestre, no fueron reconocidas por las respectivas células T, excluyendo un reconocimiento biológicamente significativo de los productos genéticos no mutados.

Ejemplo 4: Expansión rápida y eficiente de células T específicas de neoepítopos con fenotipos de memoria central y efectora mediante vacunación

Aproximadamente una quinta parte de los neoepítopos inmunogénicos en este estudio provocaron respuestas muy altas. Estas células T fueron detectables por análisisex vivode muestras de sangre sin estimulación previain vitro.En pacientes vacunados con neoepítopos y con TAA compartido, las respuestas de las células T contra los neoepítopos fueron más fuertes. Para estudiar el reconocimiento de células T a nivel molecular, clonamos receptores de células T (TCR) específicos de neoepítopos a partir de cultivos de células T posteriores a la vacunación de pacientes seleccionados. Se clasificaron células T CD4+ y CD8+ específicas de un único neoepítopo mediante citometría de flujo y se sometieron a secuenciación de TCR basada en RT-PCR (Simon, P et al. Cancer Immunol Res. 2, 1230-44 (2014)). Las cadenas alfa y beta del TCR clonadas se transcribieronin vitroen ARN y se cotransfectaron en células T para probar la especificidad del neoantígeno y la restricción de HLA.

En el paciente P01 identificamos cuatro TCR, todos compuestos por diferentes clonotipos de TCR alfa/beta (Tabla 1).

Tabla 1 Cadenas alfa/beta de TCR específicas de neoepítopos clonadas a partir de células T individuales de pacientes con melanoma P01 y P02

R e c o n o c im ie n t o P a c ie n te M u ta c ió n N o m b r e d e l T C RTRA TRBR e s t r ic c ió n P é p t id o

t ip o d e l H L A r e c o n o c id o d e l s i lv e s t r eTCRcds-NARFL-E62K#1 ¥22130 C VS-6D1J2-1 €2 A*3101 KSQREFVRR no

PPFIA4-T CH-cos' P02 - P P F1A4-S709N #2 V21J10C V7-6D1J2-7C2 B*390ó MRMNQGVCC. ■¡ • no . v . ;<S709N>TCRcd3-P02-PPFIA4-S709N#9 V2SJ29C V7-6D1J2-7C2 8*3906 MRMNQGVCC no

Los genes de TCR (V(D)J se indican en la nomenclatura IMGT. V: variable; D: diversidad; J: unión; C: constante. OLP, péptidos superpuestos; t.b.d., por realizar; NARFL, similar al factor de reconocimiento de prelamina A nuclear (NARFL), ARNm; HPN, Hepsina; PPFIA4, proteína tirosina fosfatasa, tipo de receptor, polipéptido f (PTPRF), proteína que interactúa (liprina), alfa 4.

Los cuatro TCR reconocieron el neoepítopo inmunodominante NARFL-E62K derivado del gen similar al factor de reconocimiento de prelamina nuclear A en HLA A*3101, pero no el epítopo no mutado (Fig. 2).

El paciente P02 tenía dos TCR restringidos por HLA B*3906 que reconocían PPFIA4-S709N, un neoepítopo derivado del gen liprina alfa 4 y dos TCR con reconocimiento restringido por HLA DRB1*0401 del neoepítopo Hepsina mutante HPN-G71R, que diferían con respecto a su reactividad cruzada de tipo silvestre.

Las secuencias de TCR-p de estos TCR se rastrearon en los datos de secuenciación profunda de TCR generados a partir de las células sanguíneas periféricas de los pacientes antes (visitas V1, V l2 ) y después de la vacunación (visita V20). Los respectivos clonotipos TCR beta no eran detectables antes de la vacunación, pero eran muy abundantes en las muestras de sangre posteriores a la vacunación.

Investigación de las respuestas de neoepítopos de varios pacientes mediante el análisis de multímerosex vivode MHC reveló una rápida expansión de células T CD8+ circulantes dentro de las 2 a 4 semanas posteriores al inicio de la vacunación con neoepítopos hasta porcentajes altos de un solo dígito. Las células T CD8+ específicas de neoepítopo contenían una subpoblación con fenotipo de memoria positivo para PD-1 débil. Algunas respuestas de neoepítopos estuvieron dominadas por la memoria central, otras por las células T de memoria efectora. Tras la estimulación con DC cargadas con neoepítopos, las células T CD8+ exhibieron un patrón típico de citocinas citotóxicas con expresión concomitante de IFNy y TNFa.

Ejemplo 5:Control de la enfermedad en pacientes con melanoma con alto riesgo de recaída mediante vacunación personalizada con ARN neoepítopo

La mayoría de los 13 pacientes del estudio tenían antecedentes recientes de enfermedad recurrente y todos presentaban un alto riesgo de recaída. La comparación de las recurrencias de melanoma documentadas en todos los pacientes antes y después de la vacunación con ARN neoepítopo reveló una reducción altamente significativa de los eventos metastásicos recurrentes acumulativos longitudinales (p < 0.0001), lo que se traduce en una supervivencia libre de progresión notablemente larga en esta población de pacientes de alto riesgo. Ocho de los pacientes no presentaban lesiones medibles al inicio de la vacunación con el neoepítopo. Los 8 pacientes desarrollaron fuertes respuestas inmunes contra los neoepítopos de la vacuna y permanecieron libres de recurrencia durante todo el período de seguimiento (intervalo de 12 a 23 meses) hasta el corte de los datos. La cinética y la potencia de las respuestas inmunes variaron; muchas evolucionaron dentro de las primeras 3 4 semanas posteriores a la vacunación. Los otros cinco pacientes experimentaron progresión tumoral después de la inclusión y recibieron el tratamiento estándar antes de la aplicación de la vacuna. Los cinco pacientes tenían una enfermedad medible en el momento en que su vacuna personalizada estuvo disponible. El curso de su enfermedad bajo la vacunación con neoepítopos evolucionó de la siguiente manera:

El paciente P02 tenía varias metástasis viscerales y ganglionares medibles en el momento de la inclusión y fue tratado con un inhibidor de BRAF, con lo cual la enfermedad progresó lentamente. El tratamiento con inhibidores de BRAF se continuó cuando se iniciaron las vacunaciones con neoepítopos. P02 monto respuestas de células T CD4+ contra seis de los diez neoepítopos de la vacuna y experimentó una respuesta mixta con reducción de las metástasis de los ganglios linfáticos, metástasis visceral estable, una lesión torácica progresiva y nuevas lesiones metastásicas medibles. Después de la radioterapia y la resección de las lesiones nuevas y progresivas, el paciente rechazó más tratamiento médico y falleció 12 meses después de la última visita.

La vacunación con neoepítopo del paciente P03 se pospuso debido a la recurrencia de la enfermedad con varias metástasis nuevas en los ganglios linfáticos hiliares y los riñones inmediatamente después de la inclusión. La radioterapia local y el tratamiento anti-CTLA-4 fracasaron. La metástasis renal continuó progresando rápidamente y fue resecada. Después de esto, se inició la vacunación con ARN neoepítopo y resultó en respuestas de células T contra tres neoepítopos, dos de los cuales fueron reconocidos por células T CD8+ y una por células T CD4+ y CD8+. Las metástasis de los ganglios linfáticos hiliares que progresaron antes de la vacunación se resolvieron por completo en los 12 meses siguientes, de acuerdo con lo determinado por generación de imágenes por resonancia magnética (MRI). El paciente completó el tratamiento con un total de 18 inyecciones de vacunas y permaneció libre de recaídas durante 26 meses sin ningún tratamiento adicional.

Al paciente P17 se le diagnosticó una metástasis en el ganglio linfático axilar después de su inclusión en el estudio, que permaneció estable y fue resecada después de cuatro inyecciones de vacuna de ARN neoepítopo y se utilizó para generar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y una línea celular de melanoma autóloga (MZ-I-017). El paciente continuó la vacunación durante otras 14 inyecciones. Notablemente, se detectaron células T reactivas contra los diez neoepítopos de la vacuna en las PBMC de P17. También se detectaron células T específicas de neoepítopos dentro de los linfocitos infiltrados en el tumor. La reactividad fue particularmente alta contra los epítopos mutados de la proteína de unión al guanilato (GBP1-P86F) y la retinol saturasa (RETSAT-P546S). Dentro del neoepítopo RETSAT-P546S, identificamos un epítopo mínimo restringido HLA-A*6801 (HSCVMASLR) y verificamos la presencia de células T CD8+ contra este epítopo en los TIL mediante tinción de multímeros de HLA.

Estimulamos los TIL con DC transfectadas con ARN de RETSAT-P546S autólogo y clonamos los TCR respectivos. Las células T transfectadas con el TCR#8 específico de RETSAT-P546S identificado mediante clonación de células individuales destruyeron eficazmente la línea celular de melanoma autóloga MZ-I-017, pero no las APC autólogas. Esto no sólo confirmó la expresión, el procesamiento y la presentación del neoepítopo por parte de las células tumorales sino también su reconocimiento efectivo en las células tumorales por parte de las células T citotóxicas inducidas por la vacuna. Sorprendentemente, una caracterización más detallada de TCR#8 reveló que HLA-B*3701 (en lugar de HLA-A*6801) restringía el reconocimiento de un neoepítopo, que difería del epítopo mínimo determinado originalmente (Fig. 3a,b, Fig. 4). Esto demuestra que en el mismo paciente una única mutación puede desencadenar simultáneamente respuestas de células T CD8+contra diferentes complejos péptido/HLA (Fig. 3b).

El paciente P07 presentó una serie de recurrencias y metástasis cutáneas y viscerales progresivas al inicio de la vacunación con ARN neoepítopo. P07 desarrolló una fuerte respuesta de células T contra seis neoantígenos, cinco de los cuales fueron mediblesex vivo.Como en las primeras imágenes se documentó una progresión continua de la enfermedad, se suspendió la vacunación con neoepítopo. P07 fue inscrito en un programa compasivo anti-PD-1 (pembrolizumab). El paciente experimentó una rápida regresión de todas las lesiones de melanoma, una reducción del tamaño del 80 % de las lesiones objetivo en dos meses y, finalmente, una respuesta completa con el bloqueo continuo de PD-1. Las células T inducidas por la vacuna persistieron bajo el tratamiento anti-PD-1 en altas frecuencias hasta 9 meses después del final de la vacunación.

Ejemplo 6:Respuestas inmunes preexistentes mediadas por células T CD4+ y CD8+ contra neoepítopos

Material para el paciente

Las PBMC obtenidas para pruebas de inmunogenicidad se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) de muestras de sangre periférica o leucaféresis de pacientes con melanoma. El material sobrante de NCT02035956 se utilizó para pruebas de inmunogenicidad a gran escala. El diseño del estudio se describe en la página 80.

Selección de neoepítopos

El proceso de secuenciación de próxima generación se describe en detalle en la página 81. Para pruebas de inmunogenicidad a gran escala, se seleccionaron hasta cien neoepítopos utilizando un enfoque imparcial para cubrir varias características, como predicciones de unión y niveles de expresión objetivo.

Estimulación de las células T CD4 y CD8in vitro

El día cero se aislaron monocitos de PBMC criopreservadas utilizando microperlas (Miltenyi Biotech) y se diferenciaron en células dendríticas rápidas (fDC) agregando un cóctel de citocinas que contenía IL-4/GM-CSF e IL-6/IL-1p/TNFa/PGE2. Dos días después, se aislaron células T CD4+ y CD8+ de PBMC criopreservadas utilizando microperlas (Miltenyi Biotech). Para la estimulaciónin vitro,se combinaron las células T CD4+ y el grupo de péptidos superpuestos (OLP) cargados con fDC en una relación efector a objetivo de 10:1, mientras que las células T CD8+ y las PBMC agotadas en CD4' cargadas con el grupo de OLP se combinaron en una relación de efector a objetivo de 1:10. Después de un día, se añadió medio fresco que contenía 10 U/mL de IL-2 (Proleukin S, Novartis) y 5 ng/mL de IL-15 (Peprotech). La IL-2 se repuso siete días después de establecer los cultivos. Después de 11 días de cultivoin vitro,las células se analizaron mediante citometría de flujo y se utilizaron como células efectoras en ensayos ELISpot de IFNy.

ELIspot de IFNy

Se utilizaron células dendríticas inmaduras (iDC) como objetivos para el ensayo ELIspot de IFNy. Los monocitos se aislaron de PBMC criopreservadas utilizando microperlas (Miltenyi Biotech) y se diferenciaron en células dendríticas inmaduras (iDC) en presencia de IL-4 y GM-CSF.

Placas de filtro multipantalla (Merck Millipore), previamente recubiertas con anticuerpos específicos para IFN<y>(Mabtech) se bloquearon con X-VIVO 15 (Lonza) que contenía 2 % de albúmina sérica humana (CSL Behring) durante 1-5 horas. Para células T CD4+ se reestimularon 0,5 x 105 células efectoras/pocillo con iDC autólogas cargadas con OLP en una relación efector a objetivo de 10:1 durante 18-20 horas. Para células T CD8+ se reestimularon 1 x 105 células efectoras/pocillo con iDC autólogas cargadas con OLP en una relación efector a objetivo de 10:1 durante 18-20 horas. Todas las pruebas se realizaron por triplicado e incluyeron controles positivos de ensayo (Enterotoxina B de Staphylococcus (Sigma Aldrich)). Las iDC y efectores cargadas con el grupo OLP de control se usaron únicamente como controles negativos. Las manchas se visualizaron con un anticuerpo anti-IFNY conjugado con biotina (Mabtech) seguido de incubación con fosfatasa alcalina extraavidina (Sigma-Aldrich) y sustrato BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). Las placas se escanearon utilizando un analizador ELISpot ImmunoSpot® S6Core de CTL y se analizaron con el software ImmunoCapture™ v6.6. Se compararon las respuestas de las células T estimuladas por péptidos mutados con los péptidos de control (grupo de péptidos irrelevantes). Una respuesta se definió como positiva cuando el recuento medio de manchas fue al menos dos veces mayor en comparación con los respectivos controles.

Péptidos

Para la estimulaciónin vitro,se utilizaron péptidos sintéticos de 15 mer (productos crudos) con una superposición de 11 aminoácidos que cubría las secuencias de neoantígeno de 27 mer (denominadas péptidos superpuestos (OLP)). Todos los péptidos sintéticos fueron adquiridos y agrupados previamente por JPT Peptide Technologies GmbH y disueltos en DMSO (AppliChem) hasta una concentración patrón de 5 mg/mL por OLP. Para la estimulaciónin vitrose utilizó una concentración final de 2.5 pg/mL por OLP, para la lectura de ELISpot 3.5 pg/mL. Se utilizaron grupos de diferentes neoantígenos (4 OLP por neoantígeno) para estimulaciónin vitro,así como para la lectura de ELISpot utilizando un enfoque matricial.

Análisis citométricos de flujo

La pureza de los cultivos de células T CD4 y CD8 se evaluó mediante citometría de flujo (CD25 PE, CD56 PE CY7, CD8 APC, eFluor780 FVD, CD3 BV421, CD4 FITC). El análisis citométrico de flujo se realizó en un BD FACSVerseTM (BD Biosciences). Los datos adquiridos fueron analizados utilizando la versión diez del software FlowJo (Tree Star).

Resultados

Hasta el momento se han analizado siete pacientes y en total se han detectado 26 reactividades mediadas por células T CD4+ y CD8+.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar la utilidad de una modificación de aminoácidos específica de una enfermedad dentro de un péptido o polipéptido expresado en una célula enferma para inmunoterapia, en donde la modificación de aminoácidos específica de la enfermedad se identifica mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad mediante la secuenciación de ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o de una o más células enfermas, comprendiendo el método la determinación de uno o más de los siguientes:

y/o

2. Un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos específicas de una enfermedad por su utilidad en inmunoterapia, en donde las modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad se identifican mediante la identificación de mutaciones somáticas específicas de la enfermedad mediante la secuenciación de ADN y/o ARN genómico de tejido enfermo o de una o más células enfermas, comprendiendo el método las etapas de:

(ii) determinar uno o más de los siguientes:

y/o

y

3. El método de la reivindicación 2, en el que las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii) están presentes en el mismo y/o en diferentes péptidos o polipéptidos.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, que comprende comparar las puntuaciones obtenidas para las diferentes modificaciones de aminoácidos probadas en la etapa (ii).

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los diferentes receptores de células T son de diferentes clonotipos.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la(s) modificación(es) de aminoácidos específicas de la enfermedad se debe(n) a (a) mutación(es) somáticas específicas de la enfermedad.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la enfermedad es cáncer y la inmunoterapia es inmunoterapia anticancerígena.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la inmunoterapia comprende la administración de uno o más de los siguientes:

(ii) un péptido o polipéptido que comprende un fragmento del péptido o polipéptido de acuerdo con (i), comprendiendo el fragmento al menos una modificación de aminoácidos específica de la enfermedad, y (iii) un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido de acuerdo con (i) o (ii).

9. Un método para proporcionar una vacuna que comprende las etapas de:

(i) identificar una o más modificaciones de aminoácidos específicas de la enfermedad que se prevé que sean útiles para la inmunoterapia mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

(ii) proporcionar una vacuna que comprenda uno o más de los siguientes:

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el fragmento es un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial o puede procesarse para proporcionar un péptido de unión al MHC o un péptido de unión al MHC potencial.