ES3040144T3

ES3040144T3 - Antigen-binding proteins that antagonize leptin receptor

Info

Publication number: ES3040144T3
Application number: ES17801273T
Authority: ES
Inventors: Jesper Gromada; Panayiotis Stevis; Judith ALTAREJOS
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2025-10-28
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: RS67214B1; IL266426B; FI3538554T3; HUE073276T2; IL266426A; AU2025201454A1; EP3538554B1; JP7611292B2; MA45801B1; KR102563568B1; MX2019005397A; US20200123264A1; JP2023093753A; CN110167965A; AU2017359439B2; JP2022031969A; US20230235068A1; IL272358B; PH12019500988A1; SI3538554T1

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen al receptor de leptina (LEPR), así como métodos para su uso. Según ciertas realizaciones, la invención incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen al LEPR y antagonizan su señalización. En ciertas realizaciones, la invención incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen al LEPR en presencia o ausencia de leptina. En otras realizaciones, la invención incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que presentan agonismo parcial de la señalización del LEPR. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son útiles para el tratamiento de diversas afecciones, que incluyen, entre otras, caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunes como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, presión arterial elevada, trastornos neurodegenerativos, depresión, cáncer como carcinoma hepatocelular, melanoma, cáncer de mama y otras enfermedades y trastornos asociados o causados por la señalización elevada de leptina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a antígeno que antagonizan el receptor de leptina

Antecedentes de la invención

La leptina es una hormona polipeptídica que se expresa predominantemente en el tejido adiposo y está implicada en la regulación del metabolismo, el balance energético y la ingesta de alimentos. La actividad de la leptina está mediada por la interacción con, y la señalización a través de, el receptor de leptina. El receptor de leptina, (también conocido como "LEPR", "WSX", "receptor de OB", "OB-R", y "CD295") es un receptor transmembrana de un solo cruce de la familia de receptores de citocinas de clase I con un dominio extracelular grande (818 aminoácidos). La expresión elevada de leptina, el receptor de leptina Ob-R o ambos pueden contribuir a múltiples trastornos incluyendo, pero no limitado a, anorexia u otros trastornos alimentarios psiquiátricos, caquexia por enfermedad renal crónica, otras caquexias tales como caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar, caquexia por radiación y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunitarios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, depresión, esteatosis hepática no alcohólica, trastornos neurodegenerativos, depresión, cáncer tales como carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de mama.

Los enfoques terapéuticos propuestos para abordar la alta señalización de leptina incluyen el uso de antagonistas de péptidos del receptor de leptina y mutantes antagonistas tales como variantes solubles del receptor de leptina, antagonistas competitivos de LEPR tales como el anticuerpo 9F8 (Fazeliet al.(2006) J Immunological Methods 312, 190-200) o nanocuerpos dirigidos al receptor de leptina (McMurphyet al.,PLOS One (2014) 9(2):e89895), dominios de fibronectina III, sustancias orexigénicas (por ejemplo, grelina y NPY), bloqueo de los mediadores posteriores de la leptina (por ejemplo, receptor de melanocortina 4) y/o cambios en el estilo de vida. Dichos enfoques, sin embargo, generalmente han mostrado una eficacia limitada. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de enfoques alternativos para tratar la resistencia a la leptina y otras afecciones asociadas a niveles elevados de leptina sérica y/o señalización LEPR excesiva.

Breve sumario de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones que se unen al receptor de leptina humano (LEPR). Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos antagonistas; es decir, la unión de los anticuerpos anti-LEPR de la invención a LEPR da como resultado el bloqueo o la regulación negativa de la señalización del receptor de leptina en las células. En diversas realizaciones, los anticuerpos antagonistas de la presente invención exhiben una actividad agonista parcial débil. Los anticuerpos de la presente invención son útiles, por ejemplo, para regular negativamente la actividad biológica de la leptina en un sujeto. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención son, por lo tanto, útiles en el tratamiento terapéutico de enfermedades y trastornos asociados a señalización de leptina elevada.

Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddyet al.,2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

En particular, la invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de leptina (LEPR) humano, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO: 58; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende las CDR de una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:10, en donde las CDR se identifican por la definición de Kabat, la definición de Chothia o la definición de AbM.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 42/10 y 58/10.

La presente invención también proporciona anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden unas secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16 y 60, 62, 64, 12, 14, 16.

Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones ilustrativas que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un término medio entre los enfoques de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikaniet al.,J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); y Martinet al.,Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto más, la invención proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso como un medicamento. La invención también proporciona la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a o provocada por la señalización de leptina, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad o afección asociada a o provocada por la señalización de leptina se selecciona del grupo que consiste en anorexia u otros trastornos alimentarios psiquiátricos, caquexia por enfermedad renal crónica, otras caquexias tales como caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar, caquexia por radiación y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunitarios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, depresión, esteatosis hepática no alcohólica, trastornos neurodegenerativos, depresión y cáncer tales como carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de mama. La invención proporciona además la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección asociada a o provocada por una mutación de LEPR activadora, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde la mutación de LEPR es LEPR Q223R y la enfermedad o condición asociada a o provocada por una mutación de LEPR activadora es caquexia.

Breve descripción de las figuras

LaFigura 1muestra el cambio porcentual en la ingesta de alimentos de ratones tratados con 30 mg/kg de anticuerpos anti-LEPR H4H17322P2, H4H18457P2, o H4H18464, o con un anticuerpo de control de isotipo. LaFigura 2muestra el cambio porcentual promedio en el peso corporal de ratones tratados con 30 mg/kg de anticuerpos anti-LEPR H4H17322P2, H4H18457P2, o H4H18464, o con un anticuerpo de control de isotipo. LaFigura 3muestra la masa grasa promedio de ratones tratados con 30 mg/kg de anticuerpos anti-LEPR H4H17322P2, H4H18457P2, o H4H18464, o con un anticuerpo de control de isotipo.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a métodos ni a condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.

Salvo que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque cualquier método y material similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o el ensayo de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

Definiciones

La expresión "receptor de leptina", "LEPR" y similares, como se usan en el presente documento, se refieren al receptor de leptina humano, que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en SEQ ID NO: 89 (véase también UniProtKB/Swiss-Prot N.° de referencia P48357). Los nombres alternativos para el LEPR usados en la bibliografía científica incluyen "receptor de OB", "OB-R", y "CD295". El LEPR también se denomina "WSX" (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 7.524.937). La expresión "LEPR" incluye moléculas de LEPR tanto monoméricas como multiméricas (por ejemplo, diméricas). Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR humano monomérico" significa una proteína LEPR o una porción de la misma que no contiene ni posee dominios multimerizantes y que existe en condiciones normales como una sola molécula de LEPR sin una conexión física directa con otra molécula de LEPR. Una molécula de LEPR monomérica ilustrativas es la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.mmh" que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:90 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en el presente documento). Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR humano dimérico" significa una construcción que comprende dos moléculas de LEPR conectadas entre sí a través de un enlazador, un enlace covalente, un enlace no covalente, o a través de un dominio multimerizante tal como un dominio Fc de anticuerpo. Una molécula de LEPR dimérica ilustrativa es la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.mFc" que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:91 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 en el presente documento), o la molécula denominada en el presente documento "hLEPR.hFc" que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:92. Como se usa en el presente documento, las expresiones tales como "anticuerpo anti-LEPR", "anticuerpo que se une específicamente al LEPR", "proteína de unión específica al LEPR" y similares, a menos que se indique específicamente lo contrario, se refieren a moléculas que se unen al LEPR humano de longitud completa, al LEPR humano monomérico, al LEPR humano dimérico, u otras construcciones que comprenden o consisten en el dominio extracelular del LEPR.

Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectiva a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana. Por lo tanto, la expresión "LEPR" significa "LEPR" humano a menos que se especifique que procede de una especie no humana, por ejemplo, "LEPR de ratón", "LEPR de macaco", etc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "LEPR expresado en superficie celular" significa una o más proteínas LEPR, o el dominio extracelular de las mismas, que se expresa/expresan en la superficie de una célulain vitrooin vivo,de tal manera que al menos una porción de una proteína LEP<r>se expone al lado extracelular de la membrana celular y es accesible a una porción de unión a antígeno de un anticuerpo. Un "LEPR expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína LEPR expresada en la superficie de una célula que normalmente (por ejemplo, en el estado nativo o de tipo silvestre) expresa la proteína LEPR. Como alternativa, "LEPR expresado en la superficie celular" puede comprender o consistir en una proteína LEPR expresada en la superficie de una célula que normalmente no expresa el LEPR humano en su superficie pero que se ha modificado por ingeniería genética de forma artificial para expresar al LEPR en su superficie.

Como se usa en el presente documento, las expresiones tales como "anticuerpo anti-LEPR", o "anticuerpo que se une al receptor de leptina humano", incluyen tanto anticuerpos monovalentes con una única especificidad, como anticuerpos biespecíficos que comprenden un primer brazo que se une a LEPR y un segundo brazo que se une a un segundo antígeno (diana), en donde el brazo anti-LEPR comprende cualquiera de las secuencias de HCVR/LCVR o de CDR como se expone en la Tabla 1 en el presente documento.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interactúa con un antígeno particular (por ejemplo, LEPR). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o V<h>) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, C<h>1, C<h>2 y C<h>3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o V<l>) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (C<l>1). Las regiones V<h>y V<l>pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR, por sus siglas en inglés). Cada V<h>y V<l>está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,<c>D<r>3, FR4. En distintas realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-LEPR (o parte de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de línea germinal humana, o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia de aminoácidos consenso puede definirse basándose en un análisis en paralelo de dos o más CDR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Las expresiones "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo pueden derivar, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas usando cualquier técnica convencional adecuada tales como digestión proteolítica o técnicas recombinantes de ingeniería genética que implican la manipulación y la expresión de ADN que codifica los dominios variables y, opcionalmente, los constantes, de un anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o puede adquirirse fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos) o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o mediante técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o eliminar aminoácidos, etc.

Algunos ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos con dominio eliminado, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también están abarcados dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.

Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros V<h>-V<h>, V<h>-V<l>o V<l>-V<l>. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio V<h>o V<l>monomérico.

En determinados aspectos, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Las configuraciones no limitantes ilustrativas de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Por otra parte, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente divulgación puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante enlace o enlaces disulfuro).

Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno diferente o a un epítopo distinto en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ilustrativos divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.

En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-LEPR de la invención son anticuerpos humanos. La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitioin vitroo por mutación somáticain vivo),por ejemplo, en las CDR y, en particular, en la CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco conservadas humanas.

Los anticuerpos de la invención pueden, en algunas realizaciones, ser anticuerpos humanos recombinantes. La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula hospedadora (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un recombinante, biblioteca de anticuerpo humano combinatorio (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, de un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Tayloret al.(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesisin vitro(o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, a mutagénesis somáticain vivo)y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanosin vivo.

La presente invención abarca anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, la región CH2 o CH3, lo cual puede ser deseable, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde el anticuerpo existe de forma natural o se produce de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpoin situdentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido a al menos una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con determinadas realizaciones, un anticuerpo aislado puede carecer sustancialmente de otro material celular y/o agentes químicos.

La presente divulgación incluye variantes de los anticuerpos anti-LEPR divulgados en este documento que comprenden una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que proceden los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles de, por ejemplo, bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que proceden de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en donde uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que procede el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en conjunto en el presente documento "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprendan una o más mutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios V<h>y/o V<l>se retromutan a los restos encontrados en la secuencia de la estirpe germinal original de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos se retromutan a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los 8 primeros aminoácidos de FR1 o dentro de los 8 últimos aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más del resto o restos marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la estirpe germinal dentro de las regiones marco conservadas y/o las CDR, por ejemplo, en donde determinados restos individuales mutan al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular, mientras que otros restos determinados, que difieren de los de la secuencia de la línea germinal original, se mantienen o se mutan al resto correspondiente de una secuencia de línea germinal distinta. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden probarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, afinidad de unión aumentada, propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están abarcados en la presente divulgación.

La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-LEPR que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservativas de aminoácidos respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR expuestas en la Tabla 1 en el presente documento. En determinados aspectos, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-LEPR que comprenden secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR variantes en relación con las secuencias establecidas en la Tabla 1 en el presente documento (por ejemplo, que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas), en donde tales anticuerpos variantes presentan, no obstante, una o más funciones y/o propiedades de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos divulgados en el presente documento.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como un parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, distintos anticuerpos pueden unirse a distintas áreas de un antígeno y pueden tener distintos efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce mediante aminoácidos yuxtapuestos espacialmente de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En una determinada circunstancia, un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.

La presente divulgación incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares o sustancialmente idénticas a una o más secuencias de aminoácidos del dominio variable o de CDR que se encuentran en cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR ilustrativos divulgados en el presente documento.

Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos el 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos el 98 % o el 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos que no son idénticas difieren en sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un resto de aminoácido está sustituido con otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservativa de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanintirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparaginaglutamina. Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnetet al.(1992) Science 256: 1443-1445. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.

La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide normalmente con un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diferentes sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit, que pueden usarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de distintas especies de organismos o entre una proteína de tipo natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse con FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) citado anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschulet al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 y Altschulet al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402.

Anticuerpos anti-LEPR que comprenden variantes de Fc

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que potencian o disminuyen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden una mutación en la región C<h>2 o C<h>3 del dominio Fc, en donde la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en donde el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administra a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/<r>/<s>/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o Y); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y una en 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 259l (por ejemplo, V259l) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428<l>(por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que comprenden un dominio Fc que comprende una o más parejas o grupos de mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores y otras mutaciones dentro de los dominios variables de los anticuerpos divulgados en el presente documento, se contemplan.

Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden comprender un dominio Fc modificado que tenga una función efectora reducida. Como se usa en el presente documento, un "dominio Fc modificado que tiene una función efectora reducida" significa cualquier porción Fc de una inmunoglobulina que se ha modificado, mutado, truncado, etc., con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre de origen natural de tal manera que una molécula que comprende el Fc modificado exhibe una reducción en la gravedad o extensión de al menos un efecto seleccionado del grupo que consiste en destrucción celular (por ejemplo, ADCC y/o CDC), activación del complemento, fagocitosis y opsonización, con respecto a una molécula comparable que comprende la versión de origen natural de tipo silvestre de la porción Fc. En determinadas realizaciones, un "dominio Fc modificado que tiene una función efectora reducida" es un dominio Fc con unión reducida o atenuada a un receptor de Fc (por ejemplo, FcyR).

En determinadas realizaciones de la presente invención, el dominio Fc modificado es una variante del Fc de IgG1 o una variante del Fc de IgG4 que comprende una sustitución en la región bisagra. Por ejemplo, una Fc modificada para su uso en el contexto de la presente invención puede comprender una variante del Fc de IgG1 en donde al menos un aminoácido de la región bisagra del Fc de IgG1 se sustituye por el aminoácido correspondiente de la región bisagra del Fc de IgG2. Como alternativa, una Fc modificada para su uso en el contexto de la presente invención puede comprender una variante del Fc de IgG4 en donde al menos un aminoácido de la región bisagra del Fc de IgG4 se sustituye por el aminoácido correspondiente de la región bisagra del Fc de IgG2. Las regiones Fc modificadas ilustrativas no limitantes que pueden usarse en el contexto de la presente invención se exponen en la Publicación de Solicitud de Patente de E<e>. UU. N.° 2014/0243504, así como cualquier variante funcionalmente equivalente de las regiones Fc modificadas allí establecidas.

Otros dominios Fc modificados y modificaciones de Fc que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen cualquiera de las modificaciones expuestas en el documento US 2014/0171623; el documento US 8.697.396; el documento US 2014/0134162; el documento WO 2014/043361. Los métodos para construir anticuerpos u otras proteínas de fusión de unión a antígeno que comprenden un dominio Fc modificado como se describe en el presente documento son conocidos en la técnica.

Características biológicas de los anticuerpos

La presente invención proporciona anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos como se define en las reivindicaciones, que se unen al LEPR humano y antagonizan la señalización por el LEPR. Dichos anticuerpos pueden denominarse en el presente documento "anticuerpos antagonistas". En el contexto de la presente invención, un "antagonista de la señalización de LEPR" significa un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a LEPR e inhibe un efecto intracelular que normalmente resulta de la interacción de la leptina con LEPR en las células que expresan LEPR. En diversas realizaciones, los anticuerpos antagonistas de la invención inhiben la función de los agonistas de LEPR y/o la función de los agonistas parciales de LEPR. En determinadas realizaciones, "antagonizar la señalización de LEPR" significa inhibición de la activación transcripcional estimulada por leptina de STAT3, que puede detectarse usando cualquier método que pueda medir o identificar, directa o indirectamente, la actividad de STAT3, por ejemplo, usando una versión marcada de STAT3 expresada en una línea celular indicadora. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos antagonistas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que regulan negativamente la señalización de LEPR en un ensayo indicador basado en células como se describe en el Ejemplo 6, o un ensayo sustancialmente similar. La presente invención también incluye anticuerpos antagonistas y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que demuestran una inhibición completa de la señalización LEPR inducida por leptina con valores de CI50 que varían de 723 pM a 1,8 nM en el ensayo del Ejemplo 6, o un ensayo sustancialmente similar. Los ensayos de unión basados en células que detectan la unión de anticuerpos a células que expresan LEPR tales como el ensayo descrito en el Ejemplo 5 en el presente documento, demostraron la unión a células HEK293/hLEPR-GPI con proporciones de unión de 824 a 3187 veces sin leptina y de 398 a 3106 veces en presencia de leptina 1 pM. Se descubrió que los anticuerpos de la invención se unen a LEPR incluso en presencia de un exceso de leptina a 1 pM, lo que indica que los anticuerpos LEPR de la invención se unen a sitios en hLEPR que no se superponen con los sitios de unión de leptina. La invención también incluye anticuerpos anti-LEPR que antagonizan la señalización de leptina pero también promueven la señalización parcial de LEPR en ausencia de leptina; dichos anticuerpos también se denominan en este documento "agonistas parciales" o "anticuerpos que exhiben agonismo de la señalización de LEPR".

En determinadas realizaciones ilustrativas de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR dimérico humano (hLEPR.hFc, SEQ ID NO:92) en presencia o ausencia de leptina, sin que ninguno de los anticuerpos de la invención haya demostrado un bloqueo superior al 40 % de la interacción LEPR:leptina, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 4 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPR humano monomérico con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico (por ejemplo, hLEPR.mmh, SEQ ID NO:90) con una K<d>de menos de aproximadamente 10 nM, medido por resonancia plasmónica de superficie a 25 °C, o de menos de aproximadamente 25 nM, medido por resonancia plasmónica de superficie a 37 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico a 25 °C con una K<d>de menos de aproximadamente 12 nM, menos de aproximadamente 11 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 9 nM, menos de aproximadamente 8 nM, menos de aproximadamente 7 nM, menos de aproximadamente 6 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 4 nM, menos de aproximadamente 3 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM, menos de aproximadamente 700 pM, menos de aproximadamente 600 pM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM o menos de aproximadamente 100 pM medido por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEpR humano monomérico (por ejemplo, hLEPR.mmh, SEQ ID NO:90) con una semivida disociativa (t1^ ) de más de aproximadamente 5 minutos, medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C, o de más de aproximadamente 1 minuto, medida por resonancia de plasmón superficial a 37 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano monomérico a 25 °C con una t1^ de más de aproximadamente 5 minutos, más de aproximadamente 10 minutos, más de aproximadamente 20 minutos, más de aproximadamente 40 minutos, más de aproximadamente 50 minutos o más, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEP<r>humano dimérico (por ejemplo, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:91) con alta afinidad. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico (por ejemplo, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:91) con una K<d>de menos de aproximadamente 4 nM medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico a 25 °C con una K<d>de menos de aproximadamente 15 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 9,0 nM, menos de aproximadamente 8,0 nM, menos de aproximadamente 7,0 nM, menos de aproximadamente 6,0 nM, menos de aproximadamente 5,0 nM, menos de aproximadamente 4,0 nM, menos de aproximadamente 3,0 nM, menos de aproximadamente 2,0 nM, menos de aproximadamente 1,0 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM, menos de aproximadamente 700 pM, menos de aproximadamente 600 pM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM o menos de aproximadamente 100 pM, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPR humano dimérico (por ejemplo, hLEPR.mFc, SEQ ID NO:91) con una semivida disociativa (t1^ ) de más de aproximadamente 10 minutos medida por resonancia de plasmón superficial a 25 °C o 37 °C, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar. De acuerdo con determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano dimérico a 25 °C con una t1^ de más de aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, más de aproximadamente 30 minutos, más de aproximadamente 40 minutos, más de 50 minutos, más de aproximadamente 60 minutos, más de aproximadamente 70 minutos, más de 80 minutos, más de 90 minutos, más de aproximadamente 100 minutos o más, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, mediante un formato de ensayo como el definido en el Ejemplo 3 en el presente documento o un ensayo sustancialmente similar.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEP<r>formando complejo con la leptina humana ("LEPR formando complejo con la leptina humana" también puede representarse mediante la expresión "leptina:LEPR"). Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son capaces de unirse a un complejo preformado que comprende hLEPR y leptina humana. Es decir, de acuerdo con determinadas realizaciones, la interacción entre los anticuerpos anti-LEPR y el LEPR no se inhibe por la presencia de leptina formando complejo con el LEPR; asimismo, la interacción entre la leptina y el LEPR, de acuerdo con este aspecto de la invención, no se inhibe por la presencia de un anticuerpo anti-LEPR. Un formato de ensayo ilustrativo para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une al LEPR formando complejo con la leptina humana se expone en el Ejemplo 4 en el presente documento.

La presente invención también incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen al LEPr expresado en la superficie celular en presencia y/o ausencia de leptina humana. LEPR expresado en la superficie celular significa LEPR o una porción del mismo (por ejemplo, una porción extracelular de LEPR) expresada en la superficie de una célula, ya sea de forma natural o en una línea celular modificada por ingeniería genética, de tal manera que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo sea capaz de unirse a la molécula de LEPR. En determinadas realizaciones, el LEPR expresado en la superficie celular incluye complejos recombinantes que comprenden un dominio extracelular del LEPR conectado a una célula a través de una etiqueta o anclaje (por ejemplo, un anclaje de GPI como se ilustra en el Ejemplo 6 en el presente documento). De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en ausencia de leptina y también son capaces de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en presencia de leptina (es decir, en circunstancias en donde la leptina es capaz de unirse al LEPR expresado en la superficie celular). Es decir, de acuerdo con determinadas realizaciones, la interacción entre los anticuerpos anti-LEPR y el LEPR expresado en la superficie celular no se inhibe por la presencia de leptina formando complejo con el LEPR expresado en la superficie celular. Los anticuerpos de acuerdo con este aspecto de la invención son capaces de formar un complejo de tres miembros en la superficie de una célula, que comprende el anticuerpo, el LEPR expresado en la superficie celular y la leptina. Un formato de ensayo ilustrativo para determinar si un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es capaz de unirse al LEPR expresado en la superficie celular en presencia y ausencia de la leptina humana se expone en el Ejemplo 5 en el presente documento.

Los anticuerpos de la presente invención pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mismas. El listado anterior de características biológicas de los anticuerpos de la invención no pretende ser exhaustivo. Otras características biológicas de los anticuerpos de la presente invención serán evidentes para un experto en la materia a partir de una revisión de la presente divulgación, incluyendo los Ejemplos de trabajo en el presente documento.

Mapeado de epítopos y tecnologías relacionadas

El epítopo al que se unen los anticuerpos de la presente divulgación puede consistir en una única secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos de una proteína LEPR. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos del LEPR. En algunos casos, el epítopo está ubicado en o cerca del dominio de unión a leptina del LEPR. En otros casos, el epítopo está ubicado en una región distinta del dominio de unión a leptina del LEPR, por ejemplo, en una ubicación en la superficie del LEPR en la que un anticuerpo, cuando se une a tal epítopo, no interfiere con la unión de leptina al LEPR.

Pueden usarse diversas técnicas conocidas por los expertos en la materia para identificar los aminoácidos dentro de un epítopo reconocido por un anticuerpo particular. Las técnicas ilustrativas incluyen, por ejemplo, análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis por transferencia de péptidos y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógeno-deuterio en todos los restos, excepto en los restos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasas y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265<a>. El análisis por cristalografía de rayos X de un anticuerpo formando complejo con su antígeno también puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo.

La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-LEPR que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 en el presente documento). Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-LEPR que compiten por unirse a LEPR con cualquiera de los anticuerpos ilustrativos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos que comprenden cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se establece en la Tabla 1 en el presente documento).

Puede determinarse si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-LEPR de referencia mediante el uso de métodos de rutina conocidos en la materia e ilustrados en el presente documento. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LEPR de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína LEPR. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de prueba para unirse a la molécula de LEPR. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse al LEPR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-LEPR de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo distinto que el anticuerpo anti-LEPR de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no puede unirse a la molécula de LEPR después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-LEPR de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-LEPR de referencia de la invención. A continuación, puede llevarse a cabo experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la falta de unión del anticuerpo de prueba observada se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la falta de unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con un aspecto de la divulgación, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso 99 % medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, por ejemplo, Junghanset al.(1990) Cancer Res.

50:1495-1502). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.

Para determinar si un anticuerpo compite por la unión (o compite de forma cruzada por la unión) con un anticuerpo anti-LEPR de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína LEPR en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula de LEPR. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de prueba se una a una molécula de LEPR en condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula LEPR. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la molécula de LEPR, entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a LEPR. Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.

Preparación de anticuerpos humanos

Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden ser anticuerpos completamente humanos. Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos, son conocidos en la materia. Cualquiera de tales métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para fabricar anticuerpos humanos que se unan específicamente al LEPR humano.

El uso de la tecnología VELOCIMMUNE™, por ejemplo, o cualquier otro método conocido similar para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad para LEPR que tengan una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, actividad bloqueante de ligandos, selectividad, epítopo, etc. Si es necesario, las regiones constantes de ratón se sustituyen por una región constante humana deseada, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas, para generar un anticuerpo anti-LEPR completamente humano. Si bien la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. En determinados casos, los anticuerpos anti-LEPR completamente humanos se aíslan directamente de linfocitos B positivos para el antígeno.

Bioequivalentes

Los anticuerpos anti-LEPR y los fragmentos de anticuerpos de la presente invención abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos pero que conservan la capacidad de unirse al LEPR humano. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero presentan una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-LEPR de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-LEPR o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-LEPR o fragmento de anticuerpo de la invención. Anteriormente se han analizado ejemplos de tales secuencias de ADN y de aminoácidos variantes.

Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, ya sea en una única dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y, sin embargo, pueden considerarse bioequivalentes porque tales diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el etiquetado, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente irrelevantes para el fármaco estudiado en concreto.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente significativas en su seguridad, pureza y potencia.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.

En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la condición o condiciones de uso, en la medida en que se conozcan dichos mecanismos.

La bioequivalencia puede demostrarse por métodosin vivoein vitro.Las mediciones de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayoin vivoen seres humanos u otros mamíferos, en donde se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) una pruebain vitroque se ha correlacionado con, y es razonablemente predictiva, de datos de biodisponibilidadin vivoen seres humanos; (c) una pruebain vivoen seres humanos u otros mamíferos en donde se mide el efecto farmacológico agudo adecuado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.

Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-LEPR de la invención pueden construirse, por ejemplo, haciendo diversas sustituciones de restos o secuencias o la eliminación de secuencias o restos terminales o internos no necesarios para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-LEPR que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o retiran la glucosilación.

Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie

La presente divulgación proporciona anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano pero no al LEPR de otras especies. La presente invención también proporciona anticuerpos anti-LEPR que se unen al LEPR humano y al LEPR de una o más especies no humanas. Los anticuerpos anti-LEPR de la divulgación pueden unirse al LEPR humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de LEPR de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, macaco cangrejero, tití, macaco de la India o chimpancé. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención se unen específicamente al LEPR humano y al LEPR de macaco cangrejero (por ejemplo,Macaca fascicularis).Otros anticuerpos anti-LEPR de la invención pueden unirse al LEPR humano, pero no se unen, o solo se unen débilmente, al LEPR de macaco cangrejero.

Anticuerpos multiespecíficos

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tuttet al.(1991) J. Immunol. 147:60-69; Kuferet al.(2004) Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención pueden unirse a o coexpresarse con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

La presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina se une al LEPR humano, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo antígeno. De acuerdo con la presente divulgación, el brazo de unión a LEPR puede comprender cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 1 en el presente documento.

Un formato de anticuerpo biespecífico ilustrativo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio C<h>3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio C<h>3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio C<h>3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio C<h>3 de Ig está unido a la proteína A y el segundo dominio C<h>3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R según la numeración EU). El segundo C<h>3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F según EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo C<h>3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (según IMGT; D356<e>, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (según IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.

Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-lg, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera común (por ejemplo, cadena ligera común con "botón en ojal", etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, Duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (dAf )-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Kleinet al.(2012) mAbs 4:6, 1-11, y referencias citadas allí, para una revisión de los formatos anteriores). Además, pueden construirse anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazaneet al.,J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).

Formulación terapéutica y administración

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-LEPR o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Una multitud de formulaciones adecuadas puede encontrarse en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powellet al."Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.

La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, las afecciones, la vía de administración y similares. La dosis preferida normalmente se calcula de acuerdo con el peso corporal o la superficie corporal. En un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y el control estricto para administrar anticuerpos anti-LEPR pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede monitorizarse el progreso del paciente mediante evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Por otra parte, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordentiet al.(1991) Pharmaceut. Res. 8:1351).

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wuet al.(1987) J. Biol. Chem.

262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, rectal y mucosa intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y sustituirse por un nuevo cartucho que contenga la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, se desecha todo el dispositivo.

Numerosos dispositivos inyectores de pluma y autoinyectores reusables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos inyectores de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el Autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), la PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), la EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.

En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, citado anteriormente; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.) (1974) CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede colocarse en proximidad a la diana de la composición, requiriendo de esta manera solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson (1984) en Medical Applications of Controlled Release, citado anteriormente, vol. 2, págs. 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990) Science 249:1527-1533.

Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse mediante métodos conocidos por el público en general. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o en un medio oleaginoso usado convencionalmente para inyecciones. Como el medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse junto con un agente de solubilización apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio oleaginoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de esta manera se carga preferentemente en una ampolla apropiada.

Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo anteriormente mencionado esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.

Usos terapéuticos de los anticuerpos

La presente divulgación incluye métodos que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una composición terapéutica que comprende un anticuerpo anti-LEPR antagonista (por ejemplo, un anticuerpo anti-LEPR que comprende cualquiera de las secuencias HCVR/LCVR o CDR como se establece en la Tabla 1 en el presente documento). La composición terapéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR divulgados en el presente documento, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otros, para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por niveles elevados de leptina (hiperleptinemia) y/o expresión elevada del receptor de leptina OB-R que dé como resultado un exceso de señalización LEPR. En diversas realizaciones, la enfermedad o trastorno se selecciona de, pero no limitado a, anorexia u otros trastornos alimentarios psiquiátricos, caquexia por enfermedad renal crónica, otras caquexias tales como caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar, caquexia por radiación y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunitarios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, depresión, trastornos neurodegenerativos, cáncer tales como carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de mama.

La presente invención también incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son útiles para antagonizar la señalización de LEPR en células, tejidos y órganos que expresan niveles normales o altos de leptina. Como se usa en el presente documento, un mutante del LEPR que presenta una señalización potenciada en presencia de leptina (en comparación con el LEPR de tipo silvestre) se denomina "mutante del LEPR con señalización potenciada". Una mutación LEPR con señalización potenciada ilustrativa es LEPR-Q223R (Chagnonet al.(2009) Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 85(1):29-34). Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos anti-LEPR y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que son útiles para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de enfermedades y trastornos provocados por o asociados a mutantes LEPR con señalización potenciada.

En el contexto de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, los anticuerpos anti-LEPR pueden administrarse como monoterapia (es decir, como único agente terapéutico) o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (de los cuales se describen ejemplos en otra parte en el presente documento).

Terapias y formulaciones de combinación

La presente invención incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LEPR de la invención en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, y dichas combinaciones para su uso en métodos de tratamiento, comprendiendo dichos métodos la administración de dichas combinaciones a sujetos que necesitan las mismas.

Los anticuerpos antagonistas anti-LEPR de la presente invención pueden coformularse y/o administrarse en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, tales como, por ejemplo, productos farmacéuticos prescritos para el tratamiento de la caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunitarios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, trastornos neurodegenerativos, depresión, cáncer tales como carcinoma hepatocelular, melanoma, cáncer de mama y otras enfermedades y trastornos asociados a o provocados por la disminución de la señalización de leptina. Los ejemplos de tales componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (por ejemplo, ACE, ACE-I, benazepril, captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, moexipril, perindopril, quinapril, ramapril, trandolapril), bloqueantes de los receptores de angiotensina (por ejemplo, ARB), relajantes del músculo liso (por ejemplo, hidralazina), nitratos de acción prolongada (por ejemplo, dinitrato de isosorbida con o sin, por ejemplo, ACE-I y ARB), diuréticos (por ejemplo, diuréticos de asa, diuréticos tipo tiazida y diuréticos ahorradores de potasio), tratamientos para la anemia por deficiencia de hierro (por ejemplo, hierro parenteral), broncodilatadores de acción prolongada o corta (por ejemplo, agonistas p2 tales como arformoterol, bufenina, clembuterol, dopexamina, epinefrina, fentoterol, formoterol, isoetarina, isoprenalina, isoprotenerol, levosalbutamol, orciprenalina, pirbuterol, procaterol, ritodrina, salbutamol, albuterol, terbutalina, tiotropio), anticolinérgicos (por ejemplo, hiosciamina, atropina, fenobarbital, escopolamina, diciclomina, fenobarbital, mepenzolato y combinaciones tales como atropina, hiosciamina, fenobarbital y escopolamina), corticosteroides (por ejemplo, hidrocortisona, hidrocortisona-17-valerato, hidrocortisona-17-butirato, prednisona, prednisolona, acetónido de triamcinolona, alcohol de triamcinolona, betametasona, dexametasona, fluocortolona, flunisolida, budesonida), antibióticos a largo plazo (por ejemplo, macrólidos tales como eritromicina, azitromicina y metilxantinas tales como teofilina), medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, aspirina, celecoxib, diclofenaco, diflunisal, etodolaco, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, naproxeno, oxaprozina, piroxicam, salsalato, sulindaco, tolmetina, etc.), ácidos 5-aminosalicílicos (5-ASA) (por ejemplo, mesalazina), inmunosupresores (por ejemplo, prednisona, inhibidores del TNF, azatioprina, metotrexato, 6 -mercaptopurina), terapias para la esclerosis múltiple recurrente-remitente (por ejemplo, interferón beta-1a, interferón beta-1b, acetato de glatirámero, mitoxantrona, natalizumab, fingolimod, teriflunomida, fumarato de dimetilo, alemtuzumab, daclizumab, anticuerpos monoclonales CD20 tales como rituximab, ocrelizumab y ofatumumab), agentes tópicos para el tratamiento de la psoriasis (por ejemplo, agentes tópicos tales como ácido paraaminobenzoico, aceite de coco, alquitrán de hulla, ditranol, corticosteroides tales como desoximetasona, fluocinonida, vitamina D3 y otros análogos de la vitamina D, psoraleno y agentes sistémicos tales como metotrexato, ciclosporina, hidroxicarbamida, fumaratos tales como dimetilfumarato y retinoides), antagonistas de TNF-a (por ejemplo, infliximab, adalimumab, golimumab y certolizumab pegol), tratamientos para la psoriasis que se dirigen a las células T (por ejemplo, efalizumab y alefacept), tratamientos para la hipertensión y las enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, aspirina, estatinas tales como atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina y combinaciones tales como simvastatina ezetimiba, lovastatina niacina y atorvastatina amlodipino), terapias para trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, dimebon y péptido rico en prolina (PRP)-1), antidepresivos (por ejemplo, sertralina, citalopram, fluoxetina, escitalopram, trazodona, venlafaxina, bupropión, duloxetina, paroxetina, amitriptilina, venlafacina, desvenlafaxina y nortriptilina) y terapias contra el cáncer (por ejemplo, sorafenib, JX-594, interleucina-2, ipilimumab (Yervoy), nivolumab (Opdivo), pembrolizumab (Keytruda), vemurafenib (Zelboraf), dabrafenib (Tafinlar), Trametinib (Mekinist), antraciclinas tales como doxorrubicina (Adriamycin®), epirrubicina (Ellence®), taxanos tales como paclitaxel (Taxol®) y docetaxel (Taxotere®), 5-fluorouracilo (5-FU), ciclofosfamida (Cytoxan®), carboplatino (Paraplatin®) o una combinación de los mismos).

Pautas de administración

De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, pueden administrarse múltiples dosis de un anticuerpo antagonista anti-LEPR (o una composición farmacéutica que comprenda una combinación de un anticuerpo antagonista anti-LEPR y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento) a un sujeto durante un transcurso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo anti-LEPR de la invención. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis del anticuerpo anti-LEPR se administra al sujeto en un punto de tiempo distinto, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente invención incluye métodos que comprenden administrar secuencialmente al paciente una dosis inicial única de un anticuerpo anti-LEPR, seguida de una o más dosis secundarias del anticuerpo anti-LEPR y, opcionalmente, seguidas de una o más dosis terciarias del anticuerpo anti-LEPR.

Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias" y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del anticuerpo anti-LEPR de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también denominada "dosis de referencia", "dosis de carga", "dosis de inicio" y similares); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de anticuerpo anti-LEPR, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de anticuerpo anti-LEPR contenida en la dosis inicial, secundaria y/o terciaria varían entre sí (por ejemplo, ajustadas hacia arriba o hacia abajo según corresponda) durante el transcurso del tratamiento. En determinadas realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").

Usos diagnósticos y analíticos de los anticuerpos

Los anticuerpos anti-LEPR de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir LEPR, o células que expresan LEPR, en una muestra, por ejemplo, con fines diagnósticos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-LEPR, o un fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) del LEPR. Los ensayos diagnósticos ilustrativos para el LEPR pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-LEPR de la invención, en donde el anticuerpo anti-LEPR está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, un anticuerpo anti-LEPR sin marcar puede usarse en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de manera detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tales como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos específicos ilustrativos que pueden usarse para detectar o medir al LEPR en una muestra incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).

Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de LEPR incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína LEPR o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, se medirán los niveles de LEPR en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente no afectado por una enfermedad o afección asociada a niveles o actividad de LEPR anómalos) para establecer inicialmente un nivel basal, o patrón, de LEPR. Este nivel de referencia de LEPR puede después compararse con los niveles de LEPR medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen un trastorno o afección relacionado con el LEPR.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar los métodos y composiciones de la invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1. Generación de proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente al receptor de leptina (LEPR)

Los anticuerpos anti-LEPR se obtuvieron inmunizando un ratón VELOCIMMUNE® (es decir, un ratón técnicamente diseñado que comprende ADN que codifica las regiones variables de la cadena ligera kappa y pesada de la inmunoglobulina humana) con un inmunógeno que comprende el dominio extracelular del LEPR. La respuesta inmunitaria de anticuerpos se controló mediante un inmunoensayo específico de LEPR. Usando las técnicas descritas anteriormente, se aislaron y se purificaron anticuerpos anti-LEPR completamente humanos.

Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-LEPR de ejemplo generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.

Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de la región variable de las cadenas pesada y ligera

La Tabla 1 expone los identificadores de secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y las CDR de los anticuerpos anti-LEPR seleccionados de la invención. Los identificadores de las secuencias de ácido nucleico correspondientes se exponen en la Tabla 2.

Tabla 1: Identificadores de la secuencia de aminoácidos

Tabla 2: Identificadores de secuencias de ácido nucleico

Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo de Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M", "H2M", etc.), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "17322", "18457", etc.), seguido de un sufijo "P" o "N". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H4H17322P2", "H4H18457P2", etc. Los prefijos Fc en las designaciones de anticuerpos usadas en el presente documento (H4H, H1M y H2M) indican el isotipo particular de la región Fc del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana, mientras que un anticuerpo "H1M" tiene una Fc de IgG1 de ratón, (todas las regiones variables son completamente humanas, como se indica con la primera "H" en la denominación del anticuerpo). Como apreciará un experto familiarizado con la materia, un anticuerpo que tiene un isotipo de Fc particular puede convertirse en un anticuerpo con un isotipo de Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con una Fc de IgG1 de ratón puede convertirse en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos mostrados en las Tablas 1 y 2, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.

Anticuerpo comparador.El anticuerpo comparador usado en los siguientes Ejemplos se refiere a Fab 9F8 descrito en Fazeliet al.(2006) J Immunol Methods 312:190-200 y Carpenteret al.(2012) Structure 20(3):487-497.

Ejemplo 3. Afinidades de unión y constantes cinéticas obtenidas por resonancia de plasmón superficial de los anticuerpos monoclonales anti-LEPR humanos.

Las constantes de disociación en equilibrio (valores de K<d>) para la unión de LEPR a anticuerpos monoclonales anti-LEPR purificados de la invención se determinaron usando un biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real usando un instrumento Biacore 4000. Todos los estudios de unión se realizaron en un tampón de ejecución que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, pH 7,4 (tampón de ejecución HBS-ET) a 25 °C y 37 °C. La superficie del sensor Biacore se derivatizó primero mediante acoplamiento de amina con un anticuerpo monoclonal anti-Fc humano de ratón (GE, n.° BR-1008-39) para la captura de anticuerpos monoclonales anti-LEPR. Los reactivos LEPR probados para la unión a los anticuerpos monoclonales anti-LEPR incluyeron el dominio extracelular LEPR humano recombinante expresado con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (hLEPR.MMH; SEQ ID NO:90), dominio extracelular de LEPR de macaco cangrejero recombinante expresado con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (mfLEPR.MMH; SEQ ID NO:93), dominio extracelular de LEPR de ratón recombinante expresado con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (mlEPR.MMH; SEQ ID NO:94), dominio extracelular de LEPR de rata recombinante expresado con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (rLEPR.MMH; SEQ ID NO:95) y dominio extracelular de LEPR humano recombinante expresado con una etiqueta Fc de IgG2a de ratón C-terminal (hLEPR.mFc; SEQ ID NO:91). Las construcciones LEPR que incluyen etiquetas MMH son construcciones LEPR monoméricas, y las construcciones LEPR que incluyen una etiqueta mFc son construcciones LEPR diméricas. Primero se prepararon diferentes concentraciones de reactivos LEPR en tampón de ejecución HBS-ET a concentraciones finales que variaban de 100 nM a 3,7 nM en diluciones seriadas 3 veces y luego se inyectaron sobre la superficie capturada del anticuerpo monoclonal anti-LEPR durante 4 minutos a un caudal de 30 pl/minuto. La disociación del reactivo de LEPR unido a anticuerpo monoclonal se monitorizó durante 10 minutos en tampón de ejecución HBS-ET. Se determinaron las constantes cinéticas de asociación (ka) y disociación (kd) ajustando los sensogramas de unión en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa usando el programa informático de ajuste a la curva Scrubber 2.0c. Las constantes de disociación en equilibrio (K<d>) de unión y las semividas disociativas (t1^ ) se calcularon a partir de las constantes cinéticas como:

K<d>('M)'= —k ay3t /'(min)'=6<ln>

0*^k d

Parámetros cinéticos de unión para la unión de hLEPR-MMH, mfLEPR-MMH, hLEPR.mFc, mlEPR-MMH o rLEPR-MMH a diferentes anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención a 25 °C y 37 °C se muestran en las Tablas 3 a 13.

Tabla 3: Parámetros cinéticos de unión^ de anticuer os anti-LEPR ue se unen a hLEPR-MMH a 25 °C.

Tabla 4: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR^ ue se unen a hLEPR-MMH a 37 °C.

Tabla 4: Parámetros cinéticos de unión^ de anticuer os anti-LEPR ue se unen a hLEPR-MMH a 37 °C.

continuación

Como se muestra en la Tabla 3, a 25 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a hLEPR-MMH con valores deKdque variaban de 5,11 nM a 194 nM. Como se muestra en la Tabla 4, a 37 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a hLEPR-MMH con valores de K<d>que variaban de 11,7 nM a 248 nM.

Tabla 5: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue se unen a mfLEPR-MMH a 25 °C.

Tabla 5: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os ant -LEPR ue se unen a mfLEPR-MMH a 25 °C.

Tabla 6: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os ant -LEPR ue se unen a mfLEPR-MMH a 37 °C.

continuación

Como se muestra en la Tabla 5, a 25 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a mfLEPR-MMH con valores de K<d>que varían de 4,16 nm a 179 nm. Como se muestra en la Tabla 6, a 37 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a mfLEPR-MMH con valores de K<d>que varían de 7,72 nm a 261 nm.

Tabla 7: Parámetros cinéticos de unión^ de anticuer os anti-LEPR ue se unen a hLEPR-mFc a 25 °C.

Tabla 8: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue se unen a hLEPR-mFc a 37 °C.

Como se muestra en la Tabla 7, a 25 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a hLEPR-mFc con valores de K<d>que varían de 443 pM a 11,9 nM. Como se muestra en la Tabla 8, a 37 °C, todos los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a hLEPR-mFc con valores de K<d>que varían de 527 pM a 15,1 nM.

Tabla9:Parámetros cinéticos de unión de anticuerpos monoclonales anti-LEPR que se unen a mlEPR-MMH a 25 °C.

Tabla 10: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue^ se unen a mlEPR-MMH a 37 °C.

Como se muestra en la Tabla 9, a 25 °C, dos de los 9 anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a mlEPR-MMH con valores deKdde 218 nM y 264 nM. Como se muestra en la Tabla 10, a 37 °C, dos de los 9 anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a mlEPR-MMH con valores de K<d>de 205 nM y 1,16 |<j>M.

Tabla 11: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue se unen a rLEPR-MMH a 25 °C.

Tabla 12: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue se unen a rLEPR-MMH a 37 °C.

Tabla 12: Parámetros cinéticos de unión de anticuer os anti-LEPR ue se unen a^ rLEPR-MMH a 37 °C.

Como se muestra en la Tabla 11, a 25 °C, cinco de los 9 anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a rLEPR-MMH con valores de K<d>que varían de 328 nM a 943 nM. Como se muestra en la Tabla 12, a 37 °C, cinco de los 9 anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención se unieron a rLEPR-MMH con valores de K<d>que varían de 168 nm a 771 nm.

Ejemplo 4. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención no bloquean la unión de hLEPR-hFc a hLeptina

La capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-LEPR de la invención para bloquear la unión del LEPR humano dimérico a su ligando natural, Leptina humana, se midió usando un ELISA tipo sándwich de competición.

Para el ELISA, Leptina humana (hLeptina; R&D Systems, N.° 398-LP-01M) se recubrió a una concentración de 5 pg/ml en PBS en una placa de microtitulación de 96 pocillos durante la noche a 4 °C. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon posteriormente usando una solución al 0,5 % (p/v) de BSA en PBS. Una cantidad constante de 10 nM de la porción del dominio extracelular de la proteína LEPR que se expresó con una etiqueta Fc humana C-terminal (hLEPR.hFc; SEQ ID NO:92) se tituló con anticuerpos anti-LEPR, proteína hLeptina, o un anticuerpo de control de isotipo que variaba de 8,5 pM a 500 nM en dilución seriada. Estos complejos de anticuerpo-proteína o de proteínaproteína se incubaron a continuación durante 1,5 horas a temperatura ambiente (TA). Posteriormente los complejos se transfirieron a placas de microtitulación recubiertas con hLeptina y se incubaron durante 2 horas a TA, se lavaron los pocillos y se detectó hLEPR-hFc unida a la placa con un anticuerpo policlonal anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Inc, n.° 109-035-098). Las muestras se desarrollaron con una solución de TMB (BD Biosciences, n.° 555214; sustrato A y B mezclados en una relación 1:1 según las instrucciones del fabricante) para producir una reacción colorimétrica, y a continuación se neutralizó con ácido sulfúrico 1 M antes de medir la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Victor X5. El análisis de los datos se realizó usando un modelo de respuesta a la dosis sigmoidal dentro del programa informático Prism™ (GraphPad). El porcentaje de bloqueo a la concentración máxima del anticuerpo analizado se calculó como un indicador de la capacidad de los anticuerpos para bloquear la unión de 10 nM de hLEPR-hFc a la leptina humana en la placa. En el cálculo, la señal de unión de 10 nM de hLEPR-hFc sin la presencia del anticuerpo se consideró el 100 % de unión o del 0 % de bloqueo; y la señal de referencia del tampón solo sin la presencia de hLEPR-hFc se consideró el 0 % de unión o el 100 % de bloqueo. Los datos de bloqueo a una concentración de anticuerpo de 500 nM se resumen en la Tabla 13.

^ - -

Como se muestra en la Tabla 13, ninguno de los anticuerpos anti-LEPR de la invención mostró un bloqueo >40 % de la unión de hLEPR-hFc a la superficie recubierta de hLeptina. Sin embargo, el anticuerpo de comparación y la hLeptina, como el control positivo, fueron capaces de bloquear el 99 % de la unión de hLEPR-hFc a la superficie recubierta con hLeptina. El anticuerpo de control de isotipo no mostró un bloqueo medible a concentraciones de hasta 500 nM.

Ejemplo 5. Unión celular mediante análisis de FACS con células HEK293/Mycx2-hLEPR(ecto)-con anclaje de GPI.

El receptor de leptina, LEPR, es un receptor transmembrana de un solo paso de la familia de receptores de citocinas de clase I con un dominio extracelular grande de 818 aminoácidos de longitud (Tartaglia (1997) J. Biol. Chem 7:272(10):6093-6). El LEPR puede unirse a la Leptina, una proteína expresada predominantemente por el tejido adiposo que está implicada en la regulación de la ingesta de alimentos y el metabolismo (Friedman (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8). Existen diferentes isoformas de LEPR que producen formas solubles o unidas a la membrana del receptor y las formas unidas a la membrana difieren en la longitud de su dominio intracelular. La isoforma con el dominio intracelular más largo se expresa altamente en el hipotálamo, un sitio importante de acción de la leptina en relación con la obesidad (Friedman y Halaas (1998) Nature 395(6704):763-70). La LEPR se localiza predominantemente dentro de los cuerpos celulares y en menor medida en la superficie celular. LEPR se somete a una internalización inducida por ligando, lo que añade un nivel adicional de regulación a la señalización de leptina (Sweeney (2002) Cell Signal 14(8):655-63).

Para evaluar la unión celular mediante anticuerpos anti-LEPR de la invención, se generó una línea celular HEK293 para expresar de forma estable el dominio extracelular de LEPR humano (hLEPR; aminoácidos 22-839 del número de registro P48357, Isoforma B) con una etiqueta myc-myc N-terminal y una secuencia peptídica C-terminal de la carboxipeptidasa M humana que guía la adición de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (Marcicet al.(2000) J Biol Chem.

275(21):16110-8) de tal manera que la proteína pueda anclarse mediante GPl a la membrana. Dado que el hLEPR en la línea celular no posee un dominio intracelular, ni se internaliza tras unirse el ligando, aumentando enormemente la cantidad de LEPR disponible para la unión de anticuerpos y/o ligandos. La línea celular se seleccionó en DMEM que contenía 10 % FBS, NEAA, penicilina/estreptomicina y 500 pg/ml de G418, a continuación se clasificaron según la alta expresión del receptor usando un anticuerpo anti-Myc. La línea celular estable resultante, denominada HEK293/hLEPR-GPI, se mantuvo en DMEM que contenía F<b>S al 10 %, NEAA y penicilina/estreptomicina.

Para el análisis por FACS, las células parentales HEK293 y las células HEK293/hLEPR-GPI se disociaron y se sembraron en placas con fondo en V de 96 pocillos a 5 x 105 células/pocillo en PBS que contenía FBS al 2 % (tampón de FACS). Para probar si la unión de los anticuerpos anti-hLEPR a las células se ve afectada por la presencia de leptina, el tampón FACS con o sin leptina humana 1 pM (R&D Systems, N.° 398-LP) se incubó con las células durante 30 minutos a 4 °C, seguido de la adición de anticuerpos anti-LEpR o anticuerpos de control a 10 nM en tampón FACS. Las células se incubaron posteriormente durante 30 minutos a 4 °C, seguido de lavado y a continuación incubación con 16 pg/ml de anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor®-647 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., n.° 109-547-003) durante 30 minutos a 4 °C. Posteriormente las células se fijaron usando BD CytoFix™ (Becton Dickinson, n.° 554655), se filtraron y analizaron en un citómetro de flujo HyperCyt (Beckman Coulter). También se analizaron controles sin teñir y con anticuerpos secundarios solos para todas las líneas celulares. Los resultados se analizaron usando ForeCyt (IntelliCyt) y los programas informáticos FlowJo versión 10 para determinar las medias geométricos de fluorescencia para las células viables. A continuación, se normalizó la media geométrica de la fluorescencia para cada muestra con respecto a la media geométrica de las células no teñidas para obtener la unión relativa por condición, denominado "relaciones de unión", y estas relaciones de unión se registraron en la Tabla 14 para cada anticuerpo probado.

Como se muestra en la Tabla 14, los 9 anticuerpos anti-LEPR de la invención probados a 10 nM demostraron unión a células HEK293/hLEPR-GPI con proporciones de unión que van desde 824 veces a 3187 veces sin leptina y de 398 veces a 3590 veces en presencia de Leptina 1 pM. Basándose en la similitud de estas proporciones de unión, la capacidad de los anticuerpos anti-LEPR de la invención para unirse a LEPR expresado en células no parece verse afectada significativamente por la presencia de un exceso de Leptina a 1 pM, lo que sugiere que los sitios de unión de los anticuerpos anti-LEPR en LEP<r>no se superponen con los sitios de unión a Leptina en LEPR. Los anticuerpos anti-LEPR de la invención no mostraron ninguna unión significativa a las células parentales HEK293 con relaciones de unión con y sin Leptina 1 pM que variaban de 1 a 9 veces. La unión del comparador a las células que expresan LEPR anclado a GPI se redujo significativamente en presencia de Leptina. Las muestras de anticuerpo de control de isotipo y las de anticuerpo secundario solo tampoco mostraron una unión significativa a ninguna línea celular con o sin Leptina, con relaciones de unión que variaban de 1 a 6 veces.

Tabla 14: Unión de los anticuerpos anti-LEPR 10 nM a HEK293/hLEPR-GPI y a células parentales HEK293 /-l in h m n 1 M

Ejemplo 6: Los anticuerpos anti-LEPR de la invención demostraron una inhibición completa de la señalización de leptina en presencia de hLeptina

Se desarrolló un bioensayo para detectar la activación transcripcional de STAT3 a través de la activación por LEPR usando una línea celular indicadora que expresa de forma estable LEPR humano de longitud completa (hLEPR; aminoácidos 1 a 1165 del número de referencia NP_002294.2) junto con un indicador de luciferasa (STAT3-Luc; Qiagen, n.° CLS-6028L) en una línea celular IMR-32, una línea celular de neuroblastoma humano. La línea celular estable resultante, denominada IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR, se aisló y se mantuvo en medio MEM-Earl suplementado con FBS al 10 %, NEAA, puromicina 1 ug/ml, 100 ug/ml de Higromicina B y Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (Medio Completo).

El bioensayo resultante se usó para medir el efecto de los anticuerpos anti-LEPR de la invención sobre la señalización por el LEPR en presencia o ausencia de leptina. Para el bioensayo, se sembraron células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR en placas a una densidad de 20.000 células/100 ul/pocillo para un formato de 96 pocillos en el medio completo y a continuación el día siguiente el medio se reemplazó por el volumen apropiado de medio Opti-MEM suplementado con BSA al 1 % y FBS al 0,1 % (tampón de ensayo) durante 30 minutos. Para medir el efecto de los anticuerpos de la invención en ausencia de Leptina, los anticuerpos anti-LEPR o un anticuerpo de control de isotipo se diluyeron en serie semilog a concentraciones finales que varían de 100 nM a 300 fM en Tampón de ensayo y a continuación se añadieron a las células y posteriormente se incubaron durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. Para medir el efecto de los anticuerpos de la invención en presencia de Leptina, una concentración fija de Leptina humana (hLeptina; R&D Systems, N.° 398-LP) se añadió a 200 pM en tampón de ensayo a las células, seguido inmediatamente de la adición de anticuerpos anti-LEPR o anticuerpo de control de isotipo que se diluyeron en serie semilog hasta concentraciones finales que variaban de 100 nM a 300 fM. Las muestras se incubaron a continuación durante la noche a 37 °C en CO2 al 5 %. A continuación, se añadió el reactivo OneGlo (Promega, n.° E6051) a las muestras y se midió la actividad luciferasa en un lector de placas Envision Multilable (Perkin Elmer) en modo luminiscente. Se obtuvieron los valores de unidades de luz relativas (ULR) y los resultados se analizaron mediante regresión no lineal con el programa informático GraphPad Prism (GraphPad). El valor máximo de ULR obtenido a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina se definió como una activación del 100 % en el ensayo con IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR.

Como se muestra en la Tabla 15, en ausencia de hLeptina, los anticuerpos anti-LEPR probados demostraron una estimulación débil de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con una activación máxima del 4 % al 8 %, respectivamente, el de máxima activación obtenido a partir de la respuesta a la dosis de hLeptina. Un anticuerpo con estimulación débil tuvo un valor de CE50 de 1,27 nm, mientras que otro de los anticuerpos, H4H18440P2, no tenía un valor de CE50 medible. En presencia de 200 pM de hLeptina, tres de los anticuerpos anti-LEPR que se probaron demostraron inhibición completa de Leptina en las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR con valores de CI50 que variaban de 723 pM (anticuerpo H4H18457P2) a 1,83 nM (anticuerpo H4H17322P2) o 2,9 nM (anticuerpo H4H18464P2). Seis de los anticuerpos anti-LEPR analizados no demostraron ninguna inhibición medible en presencia de 200 pM de leptina humana. El anticuerpo de control de isotipo no mostró ninguna estimulación medible de las células IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR en ninguno de los ensayos.

T l 1 : A iv i n inhi i i n hLEPR r n i r n i-LEPR

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Ejemplo 7. Competición cruzada por Octet entre distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR.

La competición de unión entre un panel de diferentes anticuerpos monoclonales anti-LEPR se determinó usando un ensayo de interferometría de biocapa sin marcadores en tiempo real en la plataforma de biosensores Octet HTX (Pall ForteBio Corp.). Todo el experimento se realizó a 25 °C en un tampón que contenía HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo Tween-20 al 0,05 % v/v, BSA 1 mg/ml, pH 7,4 (HBS-EBT), agitando la placa a la velocidad de 1000 rpm.

Para evaluar si los dos anticuerpos eran capaces de competir entre sí por la unión a LEPR humano recombinante expresado con una etiqueta myc-myc-hexahistidina C-terminal (hLEPR.MMH; SEQ ID NO:90), se capturaron en primer lugar aproximadamente 0,25 nm de hLEPR-MMH en las puntas del biosensor Octet recubiertas con anticuerpo antipenta-His (Fortebio Inc, n.° 18-5122) sumergiendo las puntas del biosensor durante 5 minutos en pocillos que contenían hLEPR-MMH 20 pg/ml. Las puntas del biosensor con el antígeno capturado se saturaron a continuación con un primer anticuerpo monoclonal anti-LEPR (posteriormente denominado mAb-1) sumergiéndolo en pocillos que contenían una solución de mAb-1 50 pg/ml durante 210 segundos. Las puntas del biosensor se sumergieron posteriormente en pocillos que contenían una solución a 50 pg/ml de un segundo anticuerpo monoclonal anti-LEPR (posteriormente denominado mAb-2) durante 150 segundos. Las puntas del biosensor se lavaron en tampón HBS-EBT entre las etapas del experimento. La respuesta de unión en tiempo real se controló durante todo el transcurso del experimento y se registró la respuesta de unión al final de cada etapa. Se comparó la respuesta de unión del mAb-2 a hLEPR-MMH formando complejo previamente con el mAb-1 y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de distintos anticuerpos monoclonales anti-LEPR como se muestra en la Tabla 16.

Tabla 16. Com etición cruzada entre anticuer os monoclonales anti-LEPR

Como se muestra en la Tabla 16, los anticuerpos H4H18439P2 y H4H18440P2 compiten entre sí por unirse a sus respectivos epítopos. Los anticuerpos LEPR H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18437P2, H4H18466P2 y H4H18508P2 compiten entre sí para unirse a sus respectivos epítopos. Los anticuerpos H4H17322P2 y H4H18464P2 no compiten por la unión a los respectivos epítopos de H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18437P2y H4H18466P2.

Ejemplo 8: Prueba de eficacia in vivo de anticuerpos antagonistas de LEPR en ratones con LEPR humanizado.

Los efectos de tres anticuerpos anti-LEPR antagonistas específicos de la invención, H4H17322P2, H4H18457P2 y H4H18464P2, sobre la ingesta de alimento, el peso corporal y la adiposidad se determinaron en ratones LEPRHu/Hu modificados genéticamente y alojados individualmente que expresan un receptor de leptina que se compone de la secuencia de ectodominio LEPR humano en lugar de la secuencia de ectodominio LEPR murino.

La ingesta diaria inicial de alimentos se midió entre 5 días y 1 día antes del tratamiento (días -5 y -1). Cuatro días antes del tratamiento y 6 días después del tratamiento (días -4 y -6) la composición corporal, incluyendo la adiposidad, se cuantificó mediante pCT. El día 0, treinta y dos ratones LEPRHuHu macho de 12 a 13 semanas de edad fueron asignados aleatoriamente a cuatro grupos de 8 ratones según el peso corporal de 1 día de pretratamiento (día -1). El día 0, cada grupo recibió mediante inyección subcutánea una dosis única de anticuerpo de control de isotipo a 30 mg/kg, H4H17322P2 a 30 mg/kg, H4H18457P2 a 30 mg/kg o H4H18464P2 a 30 mg/kg. El anticuerpo de control de isotipo no se une a ninguna proteína de ratón conocida. Se midieron la ingesta de alimentos y el peso corporal de cada animal durante el estudio. La Figura 1 resume el cambio porcentual en la ingesta de alimentos con respecto a la ingesta diaria promedio de alimentos inicial para cada grupo de tratamiento en cada punto temporal. Se calculó el cambio porcentual del peso corporal desde el día 0 para cada animal en cada punto de tiempo. La Figura 2 resume el cambio porcentual promedio del peso corporal de los animales en cada grupo de tratamiento. La Figura 3 resume la masa grasa promedio para los animales en cada grupo de tratamiento con anticuerpo cuantificada por pTC 6 días antes y 6 días después del tratamiento con anticuerpos. Todos los valores se expresan como la media ± SEM.

Como se muestra en las Figuras 1 y 2, los ratones tratados con anticuerpos antagonistas anti-LEPR demostraron aumentos en el porcentaje de cambio en la ingesta de alimentos y en el porcentaje de cambio en el peso corporal. Estos aumentos no se observaron con el tratamiento con anticuerpos de control de isotipo. Como se muestra en la Figura 1, los ratones tratados con H4H17322P2 a 30 mg/kg exhibieron aumentos significativos en la ingesta de alimentos a partir de un día después del tratamiento (día 1) y en los puntos de tiempo posteriores en comparación con los ratones inyectados con el anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18457P2 a 30 mg/kg exhibieron un aumento significativo en la ingesta de alimentos a partir del día 2 y en los puntos de tiempo posteriores en comparación con los ratones inyectados con el anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18464P2 a 30 mg/kg exhibieron un aumento significativo en la ingesta de alimentos a partir del día 2 y en los puntos de tiempo posteriores, pero no el día 4 en comparación con los ratones inyectados con el anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la Figura 2, los ratones tratados con H4H17322P2 a 30 mg/kg exhibieron un aumento significativo en el cambio porcentual de peso corporal a partir de cuatro días después del tratamiento (día 4), y en los puntos de tiempo posteriores en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18457P2 a 30 mg/kg exhibieron un aumento significativo en el cambio porcentual de peso corporal a partir del día 3 y en los puntos de tiempo posteriores en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Los ratones tratados con H4H18464P2 a 30 mg/kg exhibieron un aumento significativo del cambio porcentual de peso corporal a partir del día 4 y en los puntos de tiempo posteriores en comparación con los ratones a los que se les inyectó anticuerpo de control de isotipo. Como se representa en la Figura 3, no hubo diferencias en la masa grasa entre los grupos antes del tratamiento (día -4). Los ratones tratados con anticuerpo H4H17322P2, H4H18457P2 y H4H18464P2 a 30 mg/kg demostraron un aumento significativo en la masa de grasa 6 días después del tratamiento (día 6) en comparación con el anticuerpo de control de isotipo. En conclusión, tratamiento con anticuerpo antagonista de LEPR, pero no con un anticuerpo de control de isotipo, aumentó la ingesta de alimentos, el peso corporal y la adiposidad en ratones.

Ejemplo 9: Determinación de epítopos de LEPR humano a los que se unen los anticuerpos anti-LEPR de la invención.

Para determinar el epítopo del LEPR humano al que se unen los anticuerpos anti-LEPR de la invención, se usó un análisis basado en citometría de flujo Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) para caracterizar la interacción de los anticuerpos anti-LEPR con los dominios de la proteína LEPR humana recombinante. Para el ensayo, aproximadamente 3 millones de microesferas Microplex® carboxiladas (Luminex, n.° de cat. LC1000A), se lavaron, se mezclaron en vórtex y se sometieron a ultrasonidos en NaPO40,1 M, pH 6,2 (tampón de activación), a continuación se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las microesferas se resuspendieron en 120 pl de tampón de activación y los grupos carboxilato (-COOH) se activaron mediante la adición de 15 pl de 50 mg/ml de N-hidroxisuccinimida (NHS, Thermo Scientific, n.° de cat. 24500) seguido de la adición de 15 pl de 50 mg/ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC, ThermoScientific, N.° de Cat. 22980) a 25 °C. Después de 10 minutos, el pH de la reacción se redujo a 5,0 con la adición de 600 pl de MES 50 mM, pH 5 (tampón de acoplamiento), y las microesferas se mezclaron en vórtex y se centrifugaron para eliminar el sobrenadante. Las perlas activadas se mezclaron inmediatamente con 500 pl de anticuerpos monoclonales anti-myc 20 pg/ml con IgG de ratón o IgG humana, en tampón de acoplamiento, y se incubaron durante dos horas a 25 °C. La reacción de acoplamiento se inactivó mediante la adición de 50 pl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y las microesferas se mezclaron en vórtex rápidamente, se centrifugaron y se lavaron cuatro veces con 1 ml de DPBS, para eliminar las proteínas no acopladas y otros componentes de la reacción.

Las proteínas LEPR expresadas de forma transitoria, incluyeron el dominio extracelular del LEPR humano expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (LEPR humano-MMH, SEQ ID NO: 89), el CRH1 del LEPR humano (D1) expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1)-MMH, aminoácidos 1-208 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 209-236), el dominio CRH1 del LEPR humano (D1,D2) expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1,D2)-MMH, aminoácidos 1-318 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 319 346), el dominio lg-CRH1 del LEPR humano (D1,D2,D3) expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH1 del LEPR humano (D1,D2,D3)-Mm H, aminoácidos 1-278 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 279-306), el dominio CRH1-Ig del LEPR humano (D2,D3) expresado con una etiqueta mycmyc hexahistidina C-terminal (CRH1-Ig del LEPR humano (D2,D3)-MMH, aminoácidos 1-198 de la SEQ Id NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 199-226), el dominio Ig del LEPR humano (D3) expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (Ig del LEPR humano (D3)-MMH, aminoácidos 1-88 de SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 89-116), el dominio CRH2 del LEPR humano expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (CRH2 del LEPR humano-MMH, aminoácidos 1-207 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc-hexahistidina, aminoácidos 208-235), dominio FNIII del LEPR humano expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (FNIII del LEPR humano-MMH, aminoácidos 1-204 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc hexahistidina, aminoácidos 205-232), y dominio Ig-CRH2-FNIII del LEPR humano expresado con una etiqueta myc-myc hexahistidina C-terminal (Ig-CRH2-FNIII del LEPR-MMH, aminoácidos 1-510 de la SEQ ID NO: 89 con una etiqueta myc-myc-hexahistidina, aminoácidos 511-538), se suspendieron en medio CHO-S-SFM II sin suero (Thermo Fisher, n.° de cat. 31033020) y a continuación se clarificaron por centrifugación. Las alícuotas de microesferas con anticuerpos monoclonales anti-myc inmovilizados, preparados como se ha descrito anteriormente, se añadieron individualmente a 1 ml de cada uno de estos sobrenadantes de proteína. Las microesferas se mezclaron suavemente, se incubaron durante dos horas a 25 °C, se lavaron dos veces con 1 ml de DBPS, se centrifugaron para eliminar el sobrenadante y finalmente se resuspendieron en 1 ml de tampón DPBS. Cuarenta y ocho |jl de microesferas acopladas con IgG anti-myc procedentes de las reacciones individuales con LEPR humano de longitud completa y con cada una de las proteínas de dominios del LEPR humano se extrajeron y se mezclaron juntos en 3,6 ml de p Bs BSA 20 mg/ml azida sódica al 0,05 % (tampón de bloqueo).

A partir de este conjunto mixto, se sembraron en placas 75 j l de microesferas por pocillo en una placa de filtro de 96 pocillos (Millipore, n.° de Cat.: MSBVN1250) y se mezclaron con 25 j l de anticuerpos monoclonales individuales anti-LEPR humano (0,5 o 5 jg/ml), se incubó durante dos horas a 25 °C y a continuación se lavó dos veces con 200 j l de DPBS con Tween 20 al 0,05 % (tampón de lavado). Para detectar y cuantificar las cantidades de niveles de anticuerpo anti-LEPR unido a las microesferas individuales, ya sea 100 j l de 2,5 jg/m l de F(ab')2 de cabra conjugado con R-ficoeritrina anti-kappa humana (Southern Biotech, N.° de Cat 2063-09) en tampón de bloqueo o 100 j l de 1,25 jg/m l de R-ficoeritrina AffiniPure F(ab') en tampón de bloqueo o 100 j l de 1,25 jg/m l de fragmento F(ab')2 de R-ficoeritrina AffiniPure IgG de cabra anti-ratón, Fragmento específico F(ab')2 (Jackson Immunoresearch, N.° de Cat.: 115-116-072) en tampón de bloqueo, se añadió y se incubó durante 30 minutos a 25 °C. Después de 30 minutos, las muestras se lavaron dos veces con 200 j l de tampón de lavado y se resuspendieron en 150 j l de tampón de lavado. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de las microesferas se midió en un analizador Luminex.

Los resultados del análisis basado en Luminex se desglosan en la Tabla 17. Las intensidades de la señal de IFM por Luminex indican que los nueve anticuerpos anti-LEPR de la invención se unieron al dominio extracelular de LEPR humano completo. Los anticuerpos anti-LEPR H4H18439P2 y H4H18440P2, se unieron a epítopos dentro del dominio CRH1 D2 del LEPR humano. El anticuerpo anti-LEPR H4H17322P2 y COMP3551, se unieron a epítopos dentro del dominio CRH2 del LEPR humano. Los anticuerpos anti-LEPR, H4H18437P2, H4H18457P2, H4H18508P2, H4H18466P2 y H4H18462P2, se unieron a epítopos dentro del dominio FNIII del LEPR humano. El anticuerpo anti-LEPR, H4H18464P2 se unió a epítopos dentro del dominio Ig-D3 del LEPR humano.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de leptina (LEPR) humano, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una HCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:42 o SEQ ID NO: 58; y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende las CDR de una LCVR que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en donde las CDR se identifican por la definición de Kabat, la definición de Chothia o la definición de AbM.

2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende:

una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12;

una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14 y

una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16; y

una región variable de cadena pesada que comprende:

(i)

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4;

una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6; y

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8; o

(ii)

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 44;

una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 46; y

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48; o

(iii)

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 60;

una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 62; y

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 64.

3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende:

una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12;

una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 14; y

una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 16;

y una región variable de cadena pesada que comprende:

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4;

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8.

4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende:

una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12;

una región variable de cadena pesada que comprende:

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 44;

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48.

5. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende:

una región variable de cadena ligera que comprende:

una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12;

una región variable de cadena pesada que comprende:

una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 60;

una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 64.

6. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprenden un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVr seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2/10, 42/10 y 58/10.

7. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 6, que es un anticuerpo que comprende dos HCVR que están enlazadas a dominios constantes de cadena pesada humana y dos LCVR que están enlazadas a dominios constantes de cadena ligera humana.

8. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso como un medicamento.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 8, para su uso en un método para tratar una enfermedad asociada a o provocada por la señalización de leptina, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, en donde la enfermedad o afección asociada a o provocada por la señalización de leptina se selecciona del grupo que consiste en anorexia u otros trastornos alimentarios psiquiátricos, caquexia por enfermedad renal crónica, otras caquexias tales como caquexia por insuficiencia cardíaca congestiva, caquexia pulmonar, caquexia por radiación y caquexia por cáncer, trastornos autoinmunitarios tales como enfermedad inflamatoria intestinal, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, hipertensión, depresión, esteatosis hepática no alcohólica, trastornos neurodegenerativos, depresión y cáncer tales como carcinoma hepatocelular, melanoma y cáncer de mama.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un método para el tratamiento de una enfermedad o afección asociada a o provocada por una mutación del LEPR activadora, comprendiendo el método administrar la composición farmacéutica a un sujeto que lo necesite, opcionalmente en donde la mutación de LEPR es LEPR Q223R y la enfermedad o condición asociada a o provocada por una mutación de LEPR activadora es caquexia.

12. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende además administrar un segundo agente terapéutico al sujeto, opcionalmente en donde el segundo agente terapéutico se selecciona de un antidepresivo, un estimulante del apetito, un tratamiento para la anorexia y la caquexia, un inhibidor de COX-2, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un tratamiento para revertir la pérdida de masa muscular, función muscular y/o fuerza muscular con o sin caquexia, un tratamiento para la esteatosis hepática no alcohólica (EHNA), un tratamiento para la infección por VIH/SIDA, un bloqueante de la producción de TNF-alfa, un antioxidante, un antagonista del factor de necrosis tumoral (TNF)-a, un estimulador de linfocitos B, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un inhibidor de quinasa y un agente quimioterapéutico.