ES3059435T3 - Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains - Google Patents

Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains

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ES3059435T3
ES3059435T3 ES15179669T ES15179669T ES3059435T3 ES 3059435 T3 ES3059435 T3 ES 3059435T3 ES 15179669 T ES15179669 T ES 15179669T ES 15179669 T ES15179669 T ES 15179669T ES 3059435 T3 ES3059435 T3 ES 3059435T3
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Marie-Paule Lucienne Armanda Bouche
Carlo Boutton
Marie-Ange Buyse
Veerle Snoeck
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Abstract

Esta invención proporciona, y en ciertos aspectos específicos pero no limitativos se relaciona con: ensayos que pueden usarse para predecir si un ISV dado estará sujeto a interferencia de proteínas como se describe en el presente documento y/o dará lugar a una señal (inespecífica) en dicho ensayo (como por ejemplo en un inmunoensayo de ADA). Dichos ensayos predictivos podrían usarse, por ejemplo, para probar si un ISV dado podría tener una tendencia a dar lugar a dicha interferencia de proteínas y/o a dicha señal; para seleccionar ISV que no sean o sean menos propensos a dicha interferencia de proteínas o a dar dicha señal; como un ensayo o prueba que puede usarse para probar si ciertas modificaciones a un ISV reducirán (total o parcialmente) su tendencia a dar lugar a dicha interferencia o a dicha señal; y/o como un ensayo o prueba que puede usarse para guiar la modificación o mejora de un ISV para reducir su tendencia a dar lugar a dicha interferencia o señal de proteínas; - métodos para modificar y/o mejorar los ISV para eliminar o reducir su tendencia a dar lugar a dicha interferencia de proteínas o a dicha señal; - modificaciones que se pueden introducir en un ISV que eliminan o reducen su tendencia a generar dicha interferencia proteica o dicha señal; ISV que han sido seleccionados específicamente (por ejemplo, utilizando el/los ensayo(s) descrito(s) en el presente documento) para no tener o tener una tendencia baja/reducida a generar dicha interferencia proteica o dicha señal; ISV modificados y/o mejorados que no tienen o tienen una tendencia baja/reducida a generar dicha interferencia proteica o dicha señal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Técnicas para predecir, detectar y reducir una interferencia específica de proteínas en ensayos que implican dominios variables únicos de inmunoglobulina
[0003] La presente invención se refiere al campo de los dominios variables únicos de inmunoglobulina. La invención se define en las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización o aspecto no comprendido en las reivindicaciones se incluye a efectos de referencia.
[0004] Un dominio variable único de inmunoglobulina o "ISV" (por las siglas del inglésimmunoglobulin single variable) se define generalmente en el presente documento como una secuencia de aminoácidos que:
[0005] • comprende un plegamiento de inmunoglobulina o que, en condiciones adecuadas (tales como condiciones fisiológicas), es capaz de formar un plegamiento de inmunoglobulina(es decir,mediante plegamiento),es decir,para formar un dominio variable de inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, un dominio VH, VL o VHH);
[0006] y que
[0007] • forma (o que, en dichas condiciones adecuadas es capaz de formar) un dominio variable de inmunoglobulina que comprende un sitio funcional de unión al antígeno (en el sentido de que no requiere una interacción con otro dominio variable de inmunoglobulina (tal como una interacción VH-VL) para formar un sitio funcional de unión al antígeno).
[0008] Algunos ejemplos de dominios variables únicos de inmunoglobulina que se conocen actualmente en la técnica son los VHH y/u (otros) nanocuerpos, los dAb y los anticuerpos de dominio (único). De estos, a la fecha de presentación de la presente solicitud, varios nanocuerpos se encuentran en ensayos clínicos de fase I y fase II. Esto hace que sea importante disponer de ensayos fiables para analizar muestras biológicas de personas tratadas con los ISV (tales como sujetos de ensayos clínicos y, una vez que dichos ISV lleguen al mercado, pacientes tratados con dichos ISV).
[0009] Esto no solo es importante con fines regulatorios, sino también para el tratamiento de pacientes con fármacos biológicos, ya que los médicos que prescriben el tratamiento también desearían disponer de ensayos fiables para monitorizar diversos aspectos del mismo.
[0010] Por ejemplo, en el desarrollo clínico de moléculas de fármacos biológicos, es importante evaluar su potencial inmunogénico, y en particular el grado en que pueden inducir los denominados "anticuerpos contra fármacos" o "ADA" (anti-drug antibodies). Esto se determina utilizando los denominados "(inmuno)ensayos de anticuerpo contra fármaco" o "ADA" (véase, por ejemplo, la revisión de Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; así como Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth.289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; y Loyet et al., J. Immunol. Meth.345 (2009), 17-28. Tales ensayos de ADA y los métodos para realizarlos, son conocimientos estándar en el campo de la farmacología y se utilizan de forma habitual durante el desarrollo clínico de biomedicamentos (además de ser requeridos por diversas agencias reguladoras en todo el mundo).
[0011] Por ejemplo, como se describe en las páginas 3 y 4 del artículo de Mire-Sluis y como, por ejemplo, también se ilustra esquemáticamente en las figuras del artículo de Peng, se conocen diversos formatos de ensayo ADA diferentes, tales como el "formato ELISA tipo puente", "formato ELISA directo", "formato indirecto", ensayo de radioinmunoprecipitación (RIP), "resonancia de plasmón superficial" y "formato de electroquimioluminiscencia tipo puente". Otros formatos para realizar inmunoensayos de ADA serán evidentes para el experto.
[0012] El experto también estará familiarizado con diversas plataformas tecnológicas diferentes disponibles en el comercio, que se ha demostrado que son adecuadas para establecer y realizar ensayos de ADA. Estas incluyen, pero sin limitación, la plataforma MSD (Mesoscale), Gyrolab (Gyros) y la plataforma octet (Fortebio).
[0013] Algunos ejemplos no limitativos de formatos de ensayo de ADA también se muestran esquemáticamente en las Figuras 1A a 1C.
[0014] En general, cabe señalar que en dichos ensayos de ADA para detectar o medir los ADA frente un ISV, el ISV se utiliza como el "agente analítico" (es decir, como el compuesto utilizado para detectar si hay algún ADA en la muestra que se analiza), y los ADA son el "antígeno" (es decir, el compuesto que se va a detectar en la muestra que se analiza). Por tanto, en estos ensayos, el ISV se unirá habitualmente/con frecuencia al portador (tal como la placa ELISA), mientras que los ADA (si los hay) estarán presentes en la muestra que se somete al ensayo.
[0015] Para comprender mejor la invención descrita en el presente documento, cabe señalar que - por el contrario - en los métodos que se usan en el presente documento para predecir si un ISV dará lugar a una interferencia de proteínas, el ISV se usará habitualmente como el "antígeno" (es decir, como el compuesto que se va a detectar), y un anticuerpo (que es como se describe adicionalmente en el presente documento) se usa como el "agente analítico" (es decir,como un medio para detectar si un ISV dado se une o no, y, por lo tanto, si presenta o no un riesgo alto o aumentado de causar interferencia de proteínas, respectivamente). Por tanto, en este método según la invención, tal como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo utilizado como agente analítico (al que también se hace referencia en el presente documento como "anticuerpo analítico") normalmente estará unido al portador (es decir, a la placa ELISA) y el ISV estará (presente) en la muestra que se va a analizar. Sin embargo, en general debe observarse que la invención, tal como se define en las reivindicaciones, no se limita a ensayos en los que el "anticuerpo analítico" está unido al portador. Por ejemplo, de manera alternativa en la realización de un ensayo según la invención, tal como se define en las reivindicaciones (como se muestra, por ejemplo, en la Figura 1 y se describe en los
[0016] Ejemplos), el anticuerpo analítico se utiliza en su lugar como agente de puente y, por lo tanto, estará en solución en lugar de estar unido a la placa (aunque esté unido indirectamente a la placa a través del ISV que está recubierto sobre la misma). Sin embargo, también en el ensayo de tipo puente específico descrito en los Ejemplos (que es un ensayo competitivo), el anticuerpo analítico se sigue utilizando como agente analítico (es decir, para determinar si el ISV de interés se une o no, respectivamente; y por tanto tiene un riesgo elevado o aumentado de generar o no interferencia de proteínas, respectivamente). También se contempla que, basándose en la divulgación adicional del presente documento, el experto será capaz de diseñar otros formatos de ensayo en los que el anticuerpo analítico pueda utilizarse como agente analítico para determinar si un ISV dado puede unirse o no, respectivamente; y por tanto tiene un riesgo elevado o aumentado de generar o no interferencia de proteínas).
[0018] Como resultado de investigaciones sobre Fv monocatenarios o "scFv" (single chain Fv) (que son construcciones que contienen dominios variables únicos de inmunoglobulina que, al igual que los ISV, no están asociados a dominios constantes), se ha descrito en la técnica que el extremo carboxílico de un dominio variable de inmunoglobulina forma un parche hidrófobo que, en un anticuerpo, queda enterrado en la interfaz entre el dominio variable y el dominio constante, pero que cuando el dominio variable no está asociado a un dominio constante, que expuesto al disolvente (Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). También se ha descrito que el extremo carboxílico expuesto puede formar epítopos de linfocitos B que pueden dar lugar a, y/o interaccionar con, anticuerpos contra fármaco (emergentes y/o preexistentes) (documento WO 11/07586), cuya presencia puede determinarse entonces utilizando los ensayos de ADA mencionados anteriormente. Por esta razón, se ha propuesto realizar mutaciones en algunos de los restos de aminoácidos que forman parte del extremo carboxílico de los dominios variables para reducir dicha hidrofobia y/o eliminar dichos epítopos. Por ejemplo, Nieba et al., sugieren mutar las posiciones 11, 14, 41, 84, 87 y/o 89 de una región VH (numeración según Kabat), mientras que en el documento WO 11/07586 se sugiere mutar las posiciones 99, 98 y/o 148 (numeración AHO) de un dominio VL o las posiciones 12, 103, 101, 99, 97 y/o 144 de un dominio VH (de nuevo numeración AHo - estas posiciones corresponden a las posiciones 11, 83, 84, 85, 89 y 103 según Kabat).
[0020] Sin embargo, ninguna de estas referencias reconoce que determinadas proteínas presentes en la sangre o el suero de un sujeto, pueden interferir con los ensayos de ADA que implican los ISV, y debido a esto, estas referencias no están dirigidas a (ni ofrecen una solución para) solucionar el problema de cómo evitar la interferencia específica de proteínas en dichos ensayos de ADA, de manera que el ensayo de ADA se utilice para determinar la presencia/grado real de anticuerpos contra fármacos (emergentes o preexistentes) en la muestra a analizar. S Poelmans et al., The AAPS Journal, vol.12, nº. S1 (2010) se refieren a la monitorización de la inmunogenicidad durante el desarrollo preclínico de nanocuerpos. En el documento WO 2013/024059 A2 se hace referencia a proteínas y péptidos modificados.
[0022] En cambio, la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, proporciona métodos y ensayos que permiten fácilmente al experto predecir si un dominio variable único de inmunoglobulina tendrá o no una tendencia a sufrir interferencia de proteínas específica en un ensayo de ADA. Los métodos y ensayos descritos en el presente documento también permiten al experto, cuando se descubre que un dominio variable puede tener una tendencia o un riesgo de experimentar dicha interferencia de proteínas en un ensayo de ADA, analizar fácilmente modificaciones (propuestas) en un dominio variable con el fin de predecir si cualquiera de dichas modificaciones (propuestas) reducirá o esencialmente evitará por completo dicha interferencia de proteínas.
[0024] La presente memoria descriptiva también describe diversas modificaciones que pueden realizarse en dominios variables con el fin de reducir o esencialmente evitar dicha interferencia de proteínas. De acuerdo con un aspecto no limitativo, esta modificación implica añadir un número limitado (como se describe adicionalmente en el presente documento) de restos de aminoácidos (como también se describe en el presente documento) al extremo carboxiterminal (C-terminal) del dominio variable. Sorprendentemente, se ha descubierto que, para diversos dominios variables diferentes o construcciones basadas en los mismos, incluso añadir un único resto de aminoácido al extremo carboxílico (tal como un único resto de alanina) puede eliminar sustancialmente o incluso esencialmente por completo, el problema de la interferencia de proteínas en ensayos de ADA, aunque añadir un aminoácido de este tipo por sí solo no es suficiente para "cubrir" o "enterrar" el parche hidrófobo que, según Nieba et al., está presente en el extremo carboxílico de un ISV. De manera similar, pero sin que se pretenda limitar de modo alguno la invención tal como se define en las reivindicaciones ni a ningún mecanismo o explicación, también se asume que la adición de uno solo de dichos aminoácidos no sería suficiente para "cubrir" u "ocultar" ningún epítopo de linfocitos B que, de acuerdo con el documento WO 11/07586, pueda estar presente en el extremo carboxílico de un dominio variable. Asimismo, cabe señalar que, aunque conforme a este aspecto específico de la presente memoria descriptiva, la adición de un número limitado o incluso de un único aminoácido en el extremo carboxílico del dominio variable (es decir, sin realizar sustituciones dentro de la propia región carboxiterminal, como proponen Nieba et al. y en el documento WO 11/07586) puede -y en muchos casos lo hará- reducir de forma significativa o incluso eliminar esencialmente el problema de la interferencia específica de proteínas, también está dentro del alcance de este aspecto de la memoria descriptiva que dichas adiciones al extremo carboxiterminal se combinen con mutaciones en la región carboxiterminal. A este respecto, sin embargo, también debe observarse que la invención tal como se define en las reivindicaciones no está particularmente limitada en cuanto a la razón detrás de la realización de tales mutaciones. Por ejemplo, se sabe bien como realizar mutaciones en restos de aminoácidos en el carboxiterminal (incluidas aquellas posiciones a las que se hace referencia explícita en Nieba et al. y en el documento WO 11/07586) con el fin de humanizar un dominio variable (que incluye, sin limitación, un dominio V<HH>) o con el fin de "camelizar" un dominio V<H>(véase, por ejemplo, el documento WO 08/020079 y algunas de las otras solicitudes de Ablynx N.V. citadas en el presente documento).
[0026] Se contempla que los métodos, ensayos y modificaciones que se enseñan en el presente documento puedan aplicarse a cualquier dominio variable que no esté relacionado o asociado de otro modo con un dominio constante (o con otro grupo o porción peptídica que funcione para "proteger", cubrir o "enterrar" la región carboxiterminal del dominio variable) y, de manera más general, con cualquier dominio variable que tenga una región carboxiterminal expuesta al disolvente. Sin embargo, de acuerdo con un aspecto preferido, aunque no limitativo de la invención tal como se define en las reivindicaciones, los métodos, ensayos y modificaciones descritos en el presente documento pueden aplicarse en particular a dominios variables de cadena pesada (dominios V<H>), y de acuerdo con un aspecto específico de la invención definido en las reivindicaciones, a dominios V<HH>.
[0028] También se contempla que los métodos, ensayos y modificaciones descritos en el presente documento puedan aplicarse adecuadamente a construcciones proteicas que contienen uno o más dominios variables y, en particular, a aquellas construcciones en las que un dominio variable constituye la parte carboxiterminal de la construcción o, en el caso de los métodos y ensayos descritos en el presente documento, en las que la región carboxiterminal de un dominio variable esté expuesta al disolvente por cualquier otro motivo. De nuevo, de acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitativo de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, los métodos, ensayos y modificaciones descritos en el presente documento se aplican a construcciones en las que un dominio V<H>(y en particular un dominio V<HH>) forma la parte carboxiterminal de la construcción o, en el caso de los métodos y ensayos de la invención tal como se definen en las reivindicaciones, está expuesto de otro modo al disolvente.
[0030] Algunos ejemplos no limitativos de tales construcciones son construcciones multivalentes, multiespecíficas (tales como biespecíficas) o multiparatópicas (tales como biparatópicas) que contienen dos o más ISV unidos directamente o a través de uno o más enlazadores adecuados (de nuevo, de acuerdo con un aspecto específico, con un dominio V<H>o V<HH>) que forman la parte carboxiterminal de dicha construcción. Por ejemplo, y sin limitación, dicha construcción puede estar completamente compuesta por dominios V<H>, y en particular por nanocuerpos (es decir, dominios V<HH>, dominios V<HH>humanizados o dominios V<H>camelizados), unidos de nuevo directamente o a través de uno o más enlazadores adecuados. Como ejemplos no limitativos de tales construcciones y una enseñanza general sobre cómo pueden prepararse tales construcciones (en particular basándose en nanocuerpos) se hace referencia, por ejemplo, a Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001), así como al artículo de revisión de Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).
[0032] Sin embargo, también se contempla, por ejemplo, que la invención tal como se define en las reivindicaciones pueda aplicarse a otras construcciones que tengan un dominio variable expuesto al disolvente y, en particular, que tengan un dominio variable en su extremo carboxílico, tal como, por ejemplo, Fv monocatenarios, y en particular scFv que tengan su dominio variable de cadena pesada en el extremo carboxílico.
[0034] En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones, los términos como "ISV", "agente analítico" e "interferencia de proteínas" tienen el significado que se define adicionalmente en el presente documento.
[0036] En particular, un ISV como se describe en el presente documento puede ser en particular un Nanocuerpo o un (otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0038] Además, cualquier proteína o polipéptido que comprende un ISV (tal como un fármaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos un) ISV en su extremo carboxiterminal. De nuevo, dicho ISV puede ser, en particular, un Nanocuerpo o un (otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0040] La invención tal como se define en las reivindicaciones pretende, en particular, y es adecuada, aplicarse a ISV que comprenden, se basan en y/o se han obtenido de dominios variables de cadena pesada, tales como dominios VH (incluidos dominios VH humanos) y Nanocuerpos tales como dominios VHH (incluidos dominios VHH humanizados y optimizados con respeto a la secuencia) o dominios VH camelizados. Estos pueden ser sintéticos (por ejemplo, obtenidos a partir de una biblioteca sintética y/o basados en una región marco conservada fija), semisintéticos (por ejemplo, humanizados, camelizados u optimizados con respecto a la secuencia, u obtenidos mediante maduración de afinidad o injerto de CDR, partiendo de un dominio VH o VHH natural) o dominios VH o VHH de origen totalmente natural. Por lo tanto, la invención se describirá adicionalmente en el presente documento haciendo referencia a los ISV que son se basan en y/o se han obtenido de dominios VH o VHH.
[0042] Al establecer la presente invención, se ha descubierto que en algunos ensayos (tales como, por ejemplo, en inmunoensayos de ADA) utilizados para analizar muestras biológicas (tales como muestras de sangre, incluyendo sangre entera, suero y plasma, líquido ocular, líquido broncoalveolar/LBAL, líquido cefalorraquídeo u otras muestras de líquidos biológicos) puede producirse interferencia de proteínas, y que dicha interferencia de proteínas puede generar una señal específica en algunos de estos ensayos y/o en algunas de estas muestras. También se ha descubierto que dicha interferencia de proteínas puede producirse no solo en muestras que se obtuvieron de sujetos que han sido tratados con ISV (y en particular con nanocuerpos; o con proteínas, polipéptidos u otros fármacos biológicos que comprenden al menos uno de dichos ISV o Nanocuerpo) y/o a los que se han administrado los mismos (tales como pacientes o sujetos de ensayos clínicos), sino también en muestras de sujetos que nunca han recibido un ISV (lo que indica que tal interferencia es probable que se deba a una interacción entre proteínas específica con proteínas preexistentes más que a la aparición de ADA).
[0044] Aunque se ha descubierto que dicha interferencia de proteínas y/o una señal de este tipo en dichos ensayos no está asociada a ningún cambio o reducción de las propiedades farmacológicas (tales como propiedades farmacocinéticas/FC o farmacodinámicas/FD) de los ISV, sería deseable disponer de técnicas para predecir, detectar, reducir y/o, si es posible, evitar tal interferencia de proteínas específica. Este es el objetivo general de la presente invención. La invención se define en las reivindicaciones.
[0046] En particular, la invención proporciona, y en determinados aspectos específicos pero no limitativos es útil en:
[0047] • ensayos que pueden usarse para predecir si un ISV dado estará sujeto a dicha interferencia de proteínas y/o dará lugar a dicha señal (específica) en un ensayo de este tipo (tal como, por ejemplo, en un inmunoensayo de ADA). Dichos ensayos predictivos podrían usarse, por ejemplo, para evaluar si un ISV dado podría tener una tendencia a generar dicha interferencia de proteínas y/o una señal de este tipo; para seleccionar ISV que no sean, o sean menos propensos, a dicha interferencia de proteínas o a generar dicha señal; como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para evaluar si determinada(s) modificación(e) de un ISV reducirán (total o parcialmente) su tendencia a generar dicha interferencia o señal; y/o como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para guiar la modificación o mejora de un ISV con el fin de reducir su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas o señal;
[0048] • métodos para modificar y/o mejorar los ISV para eliminar o reducir su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas o una señal de este tipo;
[0049] • modificaciones que puedan introducirse en un ISV que eliminen o reduzcan su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas o una señal de este tipo;
[0050] • ISV que se han seleccionado específicamente (por ejemplo, utilizando el o los ensayos descritos en el presente documento) para que no tengan, o tengan una tendencia baja/reducida a generar dicha interferencia de proteínas o una señal de este tipo;
[0051] • ISV modificados y/o mejorados para que no tengan, o tengan una tendencia baja/reducida a generar dicha interferencia de proteínas o una señal de este tipo.
[0053] Por ejemplo, en un primer aspecto no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un método que puede utilizarse para predecir si un ISV o un Nanocuerpo dado (o un fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) generará (o tiene un alto o mayor riesgo de generar) interferencia de proteínas en un inmunoensayo (es decir, después de que se haya administrado a un sujeto, se haya obtenido una muestra de un líquido biológico de dicho sujeto y dicha muestra se someta a un inmunoensayo como se describe más adelante), comprendiendo dicho método realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
[0054] (i) poner en contacto dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado, generado y/o aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo (el"anticuerpo analítico"); y
[0055] (ii) determinar si dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo) se une a dicho anticuerpo en dicho inmunoensayo.
[0057] En este método, cuando el ISV, el Nanocuerpo, el fármaco basado en ISV o el fármaco basado en Nanocuerpo, se une a dicho anticuerpo analítico, se puede esperar que dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, genere (o tenga un riesgo elevado o aumentado de generar) dicha interferencia de proteínas (como se define adicionalmente en el presente documento). Basándose en esto, por ejemplo, dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, puede modificarse o mejorarse para reducir o eliminar su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas (que puede determinarse de nuevo usando el ensayo anterior), y algunas estrategias que pueden usarse para modificar dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo se describirán en el presente documento (y, por ejemplo, incluyen unir un pequeño número de restos de aminoácidos al extremo carboxiterminal y/o introducir una o más sustituciones de aminoácidos específicas).
[0058] Por tanto, en general, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, pone a disposición del experto ensayos y métodos/técnicas que pueden usarse para predecir la tendencia de un ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, a generar interferencia de proteínas y/o como una herramienta para mejorar los ISV con el fin de reducir o evitar su tendencia a generar interferencia de proteínas. Al hacerlo, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, también proporciona al experto medios para seleccionar ISV, Nanocuerpos, fármacos basados en ISV o fármacos basados en Nanocuerpos, en función de su capacidad baja o reducida (o la ausencia de cualquier capacidad) a generar interferencia de proteínas. Por tanto, la invención tal como se define en las reivindicaciones proporciona al experto un ensayo y una herramienta importantes que se pueden utilizar en la optimización y desarrollo de ISV, Nanocuerpos, fármacos basados en ISV o fármacos basados en Nanocuerpos.
[0060] Asimismo, como se describe más adelante en el presente documento, la memoria enseña al experto en la materia diversas formas en las que un ISV, un Nanocuerpo, un fármaco basado en ISV o un fármaco basado en Nanocuerpo puede modificarse o mejorarse con el fin de reducir o evitar su tendencia a generar interferencia de proteínas. Por tanto, la memoria también pone a disposición, de manera general, ISV, Nanocuerpos, fármacos basados en ISV o fármacos basados en Nanocuerpos modificados y/o mejorados, con una tendencia reducida, baja o nula a generar interferencia de proteínas.
[0062] Como se describe más adelante en el presente documento, la invención tal como se define en las reivindicaciones puede utilizarse, en particular, para predecir si un ISV o Nanocuerpo dado (o un fármaco basado en ISV o Nanocuerpo) dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe más adelante) en un inmunoensayo y, más concretamente, en un ensayo de ADA. Dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o cuantificar ADA frente ISV en general, y puede ser, en particular, un ensayo de ADA para detectar o cuantificar ADA frente al ISV utilizado en las etapas (i) y (ii) mencionadas anteriormente.
[0064] De nuevo, como se menciona en el presente documento, un ISV descrito en el presente documento puede ser en particular un Nanocuerpo o un(otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0066] Además, cualquier proteína o polipéptido que comprende un ISV (tal como un fármaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos un) ISV en su extremo carboxiterminal. De nuevo, dicho ISV puede ser, en particular, un Nanocuerpo o un (otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0068] La muestra que se analiza en dicho inmunoensayo o ensayo de ADA también se denomina en el presente documento"muestra de prueba"o "muestra de ensayo". Para evitar confusiones, expresiones tales como "muestra de prueba" o "muestra de ensayo", no deben confundirse con la muestra biológica que se utiliza en la presente como material de partida para obtener el "anticuerpo analítico" (policlonal o monoclonal) utilizado en la invención tal como se define en las reivindicaciones.
[0070] En un aspecto particular preferido, pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o Nanocuerpo), dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de dicho ISV. De nuevo, dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA frente a ISV en general, y puede ser, en particular, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA frente al ISV utilizado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
[0072] En un aspecto aún más particular pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede usarse para predecir si un ISV o Nanocuerpo dado (o fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo) dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) destinado a determinar o medir si la muestra contiene algún ADA frente al ISV. Nuevamente, por ejemplo, dicho inmunoensayo puede ser uno de los tipos conocidos de ensayo ADA (para lo cual se hace referencia, por ejemplo, al estado de la técnica sobre ensayos ADA citado en el presente documento) que se realiza para determinar o medir si existen ADA frente a dicho ISV en la "muestra de ensayo", siendo dicha muestra de ensayo una muestra de líquido biológico (según se describe en el presente documento) obtenida de un sujeto al que se le ha administrado dicho ISV (como se describe más adelante).
[0074] Como se describe adicionalmente en el presente documento, en todos estos aspectos (y en los aspectos adicionales útiles en o con la invención tal como se define en las reivindicaciones), la invención tal y como se define en las reivindicaciones también puede utilizarse para seleccionar ISV que no sean, o sean menos propensos, a generar dicha interferencia de proteínas en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA; como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para evaluar si determinada(s) modificación(es) en un ISV reducirán (total o parcialmente) su tendencia a generar dicha interferencia en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA; y/o como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para guiar la modificación o mejora de un ISV con el fin de reducir su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA.
[0075] Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención según se define en las reivindicaciones se desprenderán de la descripción adicional contenida en el presente documento.
[0077] En la presente memoria descriptiva, siempre que se utilice el término "ISV", debe entenderse que:
[0078] • dicho ISV es preferentemente un Nanocuerpo, en el que el término Nanocuerpo se define, en general, según se indica en el documento WO 08/020079 o WO 09/138519 y, por tanto, en un aspecto específico, indica en general un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado (tal como un VH humano camelizado) o generalmente un VHH con secuencia optimizada (por ejemplo, optimizada con respecto a su estabilidad química y/o solubilidad, máximo solapamiento con regiones marco humanas conocidas y máxima expresión). Cabe destacar que los términos Nanocuerpo o Nanocuerpos son marcas registradas de Ablynx N.V. y, por tanto, también pueden denominarse Nanobody<®>y/o Nanobodies<®>);
[0079] • el término "ISV" en su sentido más amplio también incluye "biofármacos basados en ISV" y, cuando el ISV es un Nanocuerpo, "biofármacos basados en Nanocuerpo". En el presente documento, un "biofármaco basado en ISV" se define como una proteína, polipéptido u otro fármaco biológico que comprende o consiste esencialmente en al menos un (tal como uno, dos o tres) ISV. De manera similar, un "biofármaco basado en Nanocuerpo" se define como una proteína, polipéptido u otro fármaco biológico que comprende o consiste esencialmente en al menos un (tal como uno, dos o tres) Nanocuerpo. Al igual que con el término "ISV", siempre que se utilice la expresión "biofármaco basado en ISV", debe entenderse que dicho biofármaco basado en ISV es preferentemente un biofármaco basado en Nanocuerpo. Dentro del contexto de la presente invención, tanto un "biofármaco basado en ISV" como un "biofármaco basado en Nanocuerpo" pueden ser, por ejemplo, una construcción de ISV o una construcción de Nanocuerpo monovalente, bivalente (o multivalente), biespecífica (o multiespecífica) y biparatópica (o "multiparatópica), respectivamente. Asimismo, cualquier biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo, además de uno o más (tal como uno, dos o tres) ISV o Nanocuerpos, puede comprender opcionalmente una o más (tal como, una o dos) porciones terapéuticas adicionales distintas y/o una o más (tal como una o dos) porciones distintas que influyan en las propiedades farmacocinéticas o farmacodinámicas del biofármaco basado en ISV o en Nanocuerpo (tales como su semivida). Ejemplos adecuados de dichas porciones terapéuticas adicionales u otras porciones serán evidentes para el experto en la materia, y, por ejemplo, generalmente pueden incluir cualquier proteína, polipéptido u otro dominio de unión o unidad de unión, terapéuticamente activo, así como, por ejemplo, modificaciones tales como las descritas en las páginas 149 a 152 del documento WO 09/138159 Un biofármaco basado en ISVD o basado en Nanocuerpo es preferentemente un agente terapéutico o destinado para su uso como un agente terapéutico (que incluye profilaxis y diagnóstico) y para este fin contiene preferentemente al menos un ISVD frente a una diana terapéuticamente relevante (tal como, por ejemplo, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, Il-23 u otras interleucinas, etc.). Como algunos ejemplos específicos pero no limitativos de dichos biofármacos basados en ISVD o en Nanocuerpos, se hace referencia, por ejemplo, a las diversas solicitudes presentadas por Ablynx N.V. (tales como, por ejemplo y sin limitación, los documentos WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 y WO 2009/068627), así como por ejemplo (y sin limitación) a solicitudes tales como WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 y WO 07/085814. Además, en la presente memoria descriptiva, a menos que se mencione explícitamente lo contrario en el presente documento, todos los términos mencionados tienen el significado proporcionado en el documento WO 09/138519 (o en la técnica anterior citada en el documento WO 09/138519) o WO 08/020079 (o en la técnica anterior citada en el documento WO 08/020079). Además, cuando un método o técnica no se describe específicamente en el presente documento, puede realizarse como se describe en el documento WO 09/138519 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 09/138519) o el documento WO 08/020079 (o en el estado de la técnica citado en el documento WO 08/020079).
[0081] En particular, los siguientes términos o expresiones tienen el mismo significado que se da, y/o cuando sea aplicable pueden determinarse de la manera descrita, en las páginas 62-75 del documento WO 09/138519:"agonista", "antagonista", "agonista inverso", "resto de aminoácido no cargado no polar", "resto de aminoácido no cargado polar", "resto de aminoácido cargado polar", "identidad de secuencia", "exactamente igual"y"diferencia de aminoácido"(cuando se refiere a una comparación de secuencias de dos secuencias de aminoácidos), "(en) esencialmente aislado (forma) "dominio", "dominio de unión", "determinante antigénico", "epítopo", "contra"o"dirigido contra"(unantígeno),"especificidad" y"semivida".Además, los términos o expresiones"modulación"y"modular", "sitio de interacción", "específico para", "bloqueo cruzado", "bloqueado de manera cruzada"y"bloqueo cruzado" y "esencialmente independiente del pH", son como se definen (y/o pueden determinarse como se describe) en las páginas 74-79 del documento WO 10/130832 del solicitante. Además, cuando se hace referencia a una construcción, a un compuesto, a una proteína o a un polipéptido de la invención, como se define en las reivindicaciones, los términos como"monovalente", "bivalente"(o"multivalente"), "biespecífico"(o"multiespecífico")y"biparatópico"(o"multiparatópico"), pueden tener el significado que se da en los documentos WO 09/138,519, WO 10/130832 o WO 08/020079.
[0083] El término "semivida", como se utiliza en el presente documento en relación a un ISVD, Nanocuerpo, biofármaco basado en ISV, biofármaco basado en Nanocuerpo o cualquier otra secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido, puede definirse generalmente como se describe en el párrafo o) en la página 57 del documento WO 08/020079, y como se menciona en la misma se refiere al tiempo necesario para reducir un 50 % la concentración en suero de la secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptidoin vivo. por ejemplo, debido a la degradación de la secuencia o del compuesto y/o al aclaramiento o secuestro de la secuencia o del compuesto por mecanismos naturales. La semividain vivode una secuencia de aminoácidos, compuesto o polipéptido de la invención, como se define en las reivindicaciones, puede determinarse de cualquier manera de por sí conocida, tal como mediante análisis farmacocinético. Las técnicas adecuadas serán evidentes para el experto en la materia y pueden ser, por ejemplo, en general, como se describen en el párrafo o) de la página 57 del documento WO 08/020079. Como se menciona también en el párrafo o) de la página 57 del documento WO 08/020079, la semivida puede expresarse usando parámetros tales como t1/2-alfa, t1/2-beta y el área bajo la curva (ABC). A este respecto, cabe señalar que el término "semivida", como se utiliza en el presente documento, se refiere en particular a la t1/2-beta o semivida terminal (en la que se pueden dejar fuera de consideración la t1/2-alfa y/o el ABC, o ambas cosas). Se hace referencia, por ejemplo, a la parte experimental, más adelante, así como a los manuales convenciones, tales como Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2ª edición rev. (1982). De manera similar, las expresiones "aumento de la semivida" o "semivida aumentada" tal como se definen también en el párrafo o) de la página 57 del documento WO 08/020079, se refieren en particular a un aumento en la t1/2-beta, ya sea con o sin un aumento de la t1/2-alfa y/o del AUC o ambas cosas.
[0085] Cuando un término o expresión no se define específicamente en el presente documento, tiene su significado habitual en la técnica, que será evidente para el experto. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales convencionales, tales como Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2ª Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, Nueva York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2.ª edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6.ª Ed.), Mosby/Elsevier, Edimburgo (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10.ª Ed. Blackwell Publishing, GB (2001); y Janeway et al., "Immunobiology" (6.ª ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), así como a los antecedentes de la técnica generales citados en el presente documento.
[0087] Además, en el presente documento, los restos de aminoácidos de un Nanocuerpo se numeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH proporcionada por Kabat et al. ("Sequence of Proteins of Immunological Interest", Servicios de Salud Pública de Estados Unidos, NIH Bethesda, MD, publicación Nº 91), tal como se aplica a los dominios VHH de camélidos en el artículo de Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods, 23 de junio del 2000; 240 (1-2): 185-195; o a la que se hace referencia en el presente documento. Según esta numeración, la FR1 de un Nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 1-30, la CDR1 de un nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 31-35, la FR2 de un Nanocuerpo comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, la CDR2 de un Nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 50-65, la FR3 de un Nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 66-94, la CDR3 de un Nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 95-102 y la FR4 de un Nanocuerpo comprende los restos de aminoácidos en las posiciones 103-113. [A este respecto, cabe señalar que, como es bien sabido en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH, el número total de restos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de restos de aminoácidos indicados por la numeración de Kabat (es decir, una o más posiciones según la numeración de Kabat pueden no estar ocupadas en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más restos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración según Kabat puede corresponder o no a la numeración real de los restos de aminoácidos en la secuencia real. En general, sin embargo, puede decirse que, según la numeración de Kabat e independientemente del número de restos de aminoácidos en las CDR, la posición 1 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR1 y viceversa, la posición 36 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR2 y viceversa, la posición 66 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR3 y viceversa y la posición 103 según la numeración de Kabat corresponde al inicio de FR4 y viceversa].
[0089] Métodos alternativos para numerar los restos de aminoácidos de dominios VH, métodos que también pueden aplicarse de manera análoga a dominios VHH de camélidos y a Nanocuerpos, son el método descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), la denominada "definición de AbM" y la denominada "definición de contacto". Sin embargo, en la presente descripción, aspectos y figuras, se seguirá la numeración según Kabat, tal como se aplica a los dominios VHH por Riechmann y Muyldermans, salvo que se indique lo contrario.
[0091] También debe observarse que las figuras, cualquier listado de secuencias y la parte experimental/ejemplos se proporcionan solo para ilustrar adicionalmente la invención y no deben interpretarse ni entenderse como limitativos del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones adjuntas de ninguna manera, a menos que se indique explícitamente lo contrario en el presente documento.
[0093] Cabe señalar además que la presente invención no se limita específicamente a ninguna causa, explicación, hipótesis o mecanismo de/para la interferencia de proteínas (y/o las señales que se generan en los inmunoensayos) que se observa en la presente invención y que pueden reducirse de acuerdo con ella. Sin embargo, se supone que la sangre o el suero (u otros líquidos biológicos, como los mencionados en el presente documento) de ciertos individuos o grupos de individuos, puede contener determinadas proteínas (preexistentes) que, en algunas circunstancias, pueden unirse (específicamente) a los ISV, dando lugar a una señal interferente en algunos ensayos utilizados para analizar muestras de sangre o suero obtenidas de dichos individuos. Esto se basa, entre otras cosas, en la observación hecha al establecer la presente invención, de que la interferencia de proteínas específica que se aborda en la presente invención, no solo se produce cuando se analizan muestras que se han obtenido de sujetos a los que se ha administrado previamente un ISV, sino también cuando se analiza una muestra que se ha obtenido de sujetos que no han recibido previamente un ISV.
[0095] En particular, basándose en las observaciones realizadas al establecer la presente invención, y aunque la invención no se limita a ello, se cree que dichas proteínas (preexistentes) pueden, en particular, (ser capaces de) unirse al extremo carboxiterminal de tales ISV (que, en un anticuerpo monoclonal convencional de 4 cadenas de tamaño completo, así como en los anticuerpos "solo de cadena pesada" presentes enCamelidae,están unidos al resto del anticuerpo - es decir, a la región CH1 en los anticuerpos monoclonales convencionales y a la región bisagra en los de cadena pesada deCamelidae, respectivamente - y, por tanto, en dichos anticuerpos de tamaño completo, pueden estar protegidos frente a dicha interferencia de proteínas).
[0097] Esto se confirma con los hallazgos realizados por los presentes inventores al establecer la presente invención (cuyos hallazgos se describen detalladamente en el presente documento), según los cuales ciertas modificaciones (simples) de los ISV en su extremo carboxiterminal pueden reducir sustancialmente o impedir esencialmente dicha interferencia de proteínas. Por consiguiente, los métodos para modificar los ISV de esta manera, así como los ISV que se han modificado de esta manera, forman aspectos adicionales de la invención, como también se describe en el presente documento.
[0099] La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse en particular para reducir o evitar la interferencia de proteínas y/o señales debido a la unión específica en inmunoensayos que se realizan en muestras biológicas (tales como muestras de sangre o suero) obtenidas de un sujeto al que se ha administrado un fármaco (biofármaco) (de nuevo, tales muestras también se denominan en el presente documento "muestra de prueba" o "muestra de ensayo"). Algunos ejemplos de esto son los inmunoensayos que se utilizan para caracterizar la disposición del fármaco y de la formación de anticuerpos tras la administración de un fármaco biológico a un sujeto, tales como los mencionados en la"Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacocintics of Therapeutic Proteins" (documento CHMP/EWP/89249/2004 con fecha 27 de enero de 2007) publicado por el Comité de Medicamentos de Uso Humano (CHMP) de la Agencia Europea del Medicamento (EMEA). Como se indica en las páginas 4 y 5 de este documento:
[0100] "Se han identificado varias posibles debilidades que pueden dar lugar a una caracterización errónea de la disposición del fármaco y de la formación de anticuerpos. Deberían considerarse los siguientesaspectos [...]:Inmunoensayo
[0101] Ensayo farmacológico:
[0102] [...]
[0103] iii) Inferencia por sustancias endógenas.
[0104] (iv) interferencia por componentes plasmáticos o anticuerpos contra fármaco que se unen al analito e inhiben la unión complementaria al anticuerpo de captura."
[0106] La invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse en particular para predecir, reducir o evitar este tipo de interferencia en inmunoensayos que se utilizan en el análisis de muestras de prueba/muestras de ensayo de líquidos biológicos tomados de sujetos a los que se han administrado los ISV (y en particular Nanocuerpos; o un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo, como también se define en el presente documento).
[0108] La invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse en particular para predecir, reducir o evitar este tipo de interferencia de proteínas (específica) en inmunoensayos que se utilizan para la caracterización de la distribución del fármaco y/o para determinar la formación de cualquier anticuerpo contra fármaco (ADA). A este respecto, cabe señalar que, en general, en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, cuando se utiliza una expresión como "predecir, reducir o evitar la interferencia de proteínas", esto no solo incluye predecir, reducir o evitar de por sí dicha interferencia de proteínas, sino también generalmente predecir, reducir o evitar la aparición de señales específicas en inmunoensayos (tales como aquellos en los que pueden producirse señales (específicas) asociadas a la interferencia de proteínas, por ejemplo, en ensayos de ADA), y, en particular, predecir, reducir o evitar, en tales inmunoensayos, la aparición de señales específicas que, cuando se observan en dicho ensayo, suelen atribuirse a, asociarse con y/o interpretarse como un indicio de interferencia (específica) de proteínas. A este respecto, debe tenerse en cuenta en general que, tal como se menciona en el presente documento, la presente invención no se limita específicamente a ninguna causa, explicación, hipótesis o mecanismo.
[0110] En un aspecto específico, pero no limitativo, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir, evitar o reducir dicha interferencia de proteínas en ensayos de "anticuerpo contra fármaco" o "ADA" que se realizan en muestras(es decir,"muestras de ensayo") de líquidos biológicos tomados de sujetos a los que se han administrado ISV (y en particular nanocuerpos; o un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpos, tal como se define adicionalmente en el presente documento).
[0112] En otro aspecto específico, pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir, evitar o reducir dicha interferencia de proteínas (y/o las señales específicas normalmente asociadas a las mismas) en ensayos de "anticuerpo contra fármaco" o "ADA" que se usan para detectar, medir y/o caracterizar la presencia de (cualquier) anticuerpo contra fármaco frente a uno o más ISV (y en particular frente a nanocuerpos; o un biofármaco basado en ISV, tal como se define adicionalmente en el presente documento). En particular, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir, evitar o reducir dicha interferencia de proteínas en tales ensayos de "anticuerpo contra fármaco" o "ADA" que se realizan en muestras(es decir,"muestras de ensayo") de líquidos biológicos, y más en particular en muestras de líquidos biológicos que se hayan obtenido de un sujeto al que se le haya administrado uno o más de tales ISV o nanocuerpos (o un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo, tal como se define adicionalmente en el presente documento). Por ejemplo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir, evitar o reducir dicha interferencia de proteínas en tales ensayos de "anticuerpo contra fármaco" o "ADA" que se usan para detectar, medir y/o caracterizar la presencia de (cualquier) anticuerpo contra fármaco frente al ISV o Nanocuerpo (o un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo, tal como se define adicionalmente en el presente documento) que se haya administrado al sujeto del que se ha obtenido la muestra (ya sea en el contexto de un ensayo clínico y/o en el contexto de una terapia).
[0114] Por tanto, en un aspecto específico, pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir, evitar o reducir dicha interferencia de proteínas (y/o señales específicas normalmente asociadas a la misma) en muestras biológicas (es decir,"muestras de ensayo") obtenidas de un sujeto al que se han administrado uno o más de dichos ISV o nanocuerpos (o un biofármaco basado en ISV o en Nanocuerpos, tal como se define adicionalmente en el presente documento), donde dichas muestras son adecuadas para, y/o destinadas a, su uso en un ensayo inmunológico, tal como un ensayo de ADA. Como se ha mencionado, dicha muestra biológica puede ser sangre (incluyendo sangre entera, suero o plasma), líquido ocular, líquido broncoalveolar/LBAL, líquido cefalorraquídeo o cualquier otro líquido biológico o muestra que sea adecuado para su uso en un inmunoensayo, y en particular un ensayo de ADA.
[0116] En un aspecto específico, pero no limitativo, dicha muestra de ensayo se puede haber obtenido de un sujeto que ha sido sometido a múltiples administraciones (por ejemplo, al menos de 1 a 3 administraciones distintas durante un periodo de al menos 10 días, tal como al menos un mes o más) y/o a tratamiento crónico (es decir, tratamiento durante al menos 10 días tal como al menos un mes) con un ISV, un Nanocuerpo, un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo (como también se define en el presente documento). Dicho ISV, Nanocuerpo, biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo, puede haberse administrado, por ejemplo, a dicho sujeto, en el contexto de una terapia o en el contexto de un ensayo clínico.
[0118] En un aspecto específico, pero no limitativo, dicha muestra de ensayo puede haberse obtenido de un sujeto al que se le haya administrado un ISV, un Nanocuerpo, un biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo que tenga (y/o se le haya proporcionado) una semivida aumentada (como se define en el presente documento y en comparación con un ISV monovalente), por ejemplo, una semivida de al menos 1 día, preferentemente de al menos 3 días, más preferentemente de al menos 7 días, tal como de al menos 10 días, en el sujeto al que se ha administrado o se haya administrado el mismo.
[0120] Por ejemplo y sin limitación, dicho ISV, Nanocuerpo, biofármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo puede haber recibido una semivida aumentada mediante funcionalización y/o incluyendo en la construcción una porción o unidad de unión que aumente la semivida de la construcción. Los ejemplos de dicha funcionalización, porciones o unidades de unión serán evidentes para el experto y pueden ser, por ejemplo, los descritos en el presente documento, y por ejemplo pueden incluir pegilación, fusión a seroalbúmina o fusión a un péptido o unidad de unión que pueda unirse a una proteína sérica tal como la seroalbúmina. Dicho péptido o dominio de unión a seroalbúmina puede ser cualquier péptido o dominio de unión a seroalbúmina adecuado capaz de aumentar la semivida de la construcción (en comparación con la misma construcción sin el péptido o dominio de unión a seroalbúmina), y pueden ser, en particular, péptidos de unión a seroalbúmina tal como se describen en el documento WO 2008/068280 del solicitante (y en particular en el documento WO 2009/127691 y en la solicitud estadounidense no prepublicada 61/301,819, ambas del solicitante), o un ISV de unión a seroalbúmina (tal como un nanocuerpo de unión a seroalbúmina; por ejemplo, Alb-1 o una versión humanizada de Alb-1, tal como Alb-8, a la cual se hace referencia, por ejemplo, en el documento WO 06/122787).
[0122] Por tanto, en un aspecto específico pero no limitativo, una muestra biológica de este tipo puede haberse obtenido de un sujeto al que se le haya administrado un ISV, un Nanocuerpo, un biofármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, que comprenda un péptido o dominio de unión a seroalbúmina (humana).
[0124] Como ya se ha mencionado anteriormente, en un aspecto no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, se refiere, en general, a un método que puede utilizarse para predecir si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o Nanocuerpo) generará (o tiene una tendencia alta o aumentada a generar) interferencia de proteínas (como se describe más adelante) en un inmunoensayo (es decir, después de que dicho ISV se haya administrado a un sujeto, se haya obtenido una muestra de un líquido biológico de dicho sujeto y dicho líquido biológico se someta a un inmunoensayo como se describe más adelante), comprendiendo dicho método realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
[0125] (i) poner en contacto dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado, generado y/o aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo (el "anticuerpo analítico"); y
[0126] (ii) determinar si dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo) se une a dicho anticuerpo en dicho inmunoensayo.
[0128] De nuevo, como se menciona en el presente documento, un ISV descrito en el presente documento puede ser en particular un Nanocuerpo o un(otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0130] Además, cualquier proteína o polipéptido que comprende un ISV (tal como un fármaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos un) ISV en su extremo carboxiterminal. De nuevo, dicho ISV puede ser, en particular, un Nanocuerpo o un (otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0132] En un aspecto alternativo, que también se describe adicionalmente en el presente documento, en lugar del anticuerpo mencionado anteriormente obtenido de un sujeto humano, puede utilizarse el anticuerpo monoclonal al que se hace referencia en el presente documento como "21-4-3" (o "21-4" para resumir, véanse las SEQ ID NO 35 y 36 para las secuencias de VH y VL). El anticuerpo 21-4 se generó mediante tecnología de hibridoma partiendo de un ratón inmunizado con la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 descrita en el documento WO 2006/122825, tal como se describe adicionalmente en el Ejemplo 7, y una estirpe celular de hibridoma (denominada "ABH0015") que expresa el anticuerpo 21-4, se ha depositado el 4 de junio de 2012 en la BCCM (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms), Gante, Bélgica, con el número de registro LMBP-9680-CB. Se ha demostrado que el anticuerpo monoclonal 21-4 reconoce el extremo carboxiterminal de la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 del documento WO 2006/122825, donde el extremo carboxiterminal consiste en un Nanocuerpo (V<HH>humanizado) creado contra el factor de Von Willebrand (vWF,Von Willebrand Factor). El anticuerpo 21-4 se generó originalmente como reactivo analítico para su uso en la detección de nanocuerpos de proteína (en particular, la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 del documento WO 2006/122825) en muestras (de suero); sorprendentemente, ahora se ha descubierto que el anticuerpo 21-4 también puede utilizarse para predecir si un ISV tiene tendencia a experimentar interferencia de proteínas específica (más que algunos otros anticuerpos monoclonales comparables (de ratón) generados contra la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 del documento WO 2006/122825 o contra otros nanocuerpos).
[0134] En particular, se ha descubierto que, si la medición de la unión del anticuerpo 21-4 a un ISV (o a una proteína o polipéptido que contenga un ISV en su extremo carboxiterminal, o a una proteína o polipéptido similar como se menciona en el presente documento) da un valor de UR (unidades de respuesta) inferior a 500 (después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular de la proteína, de acuerdo con la fórmula [UR medido]/[PM de la proteína] x 10<6>) al determinarse según el protocolo expuesto en el Ejemplo 9, dicho ISV o proteína probablemente no tendrá tendencia a experimentar interferencia de proteínas (dentro del nivel de confianza proporcionado por el conjunto de datos expuestos en los ejemplos que se indican más adelante). Para los fines de la fórmula anterior, el PM puede calcularse como la suma de todos los PM de todos los restos de aminoácidos presentes en el ISV.
[0136] Por consiguiente, cualquier ISV, proteína o polipéptido descrito en el presente documento, tiene preferentemente dicho valor de UR para la unión al anticuerpo 21-4 inferior a 500 (determinado según el protocolo expuesto en el Ejemplo 9, y después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular del ISV o de la proteína que se utilice, de acuerdo con la fórmula indicada anteriormente).
[0138] Por tanto, este aspecto de la invención tal como se define en las reivindicaciones, generalmente se refiere a un método que puede utilizarse para predecir si un ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) determinado, generará (o tiene una tendencia alta o aumentada a generar) interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (es decir, después de que dicho ISV se haya administrado a un sujeto, se haya obtenido una muestra de un fluido biológico de dicho sujeto, y dicho fluido biológico se somete a un inmunoensayo como se describe adicionalmente en el presente documento), comprendiendo dicho método realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
[0139] (i) poner en contacto dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) con el anticuerpo monoclonal 21-4 (es decir, utilizado como el "anticuerpo analítico"); y
[0140] (ii) determinar si dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) se une al anticuerpo monoclonal 21-4 en dicho inmunoensayo.
[0141] Dicho método puede realizarse en particular utilizando Biacore o una técnica similar, y más en particular utilizando el protocolo expuesto en el Ejemplo 9. Como se menciona en el presente documento, cuando la unión del ISV o del fármaco basado en ISV en este protocolo muestra un valor de UR inferior a 500 (después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular de la proteína, de acuerdo con la fórmula [UR medido]/[PM de la proteína] x 10<6>), dicho ISV o proteína basada en ISV probablemente no se unirá a ningún factor o factores de interferencia presentes en la sangre o suero de un ser humano y/o probablemente no tendrá una tendencia a experimentar interferencia de proteínas específica en un ensayo de ADA (es decir, dentro de los grados de confianza expuestos en la parte experimental a continuación).
[0142] De nuevo, como se menciona en el presente documento, un ISV descrito en el presente documento puede ser en particular un Nanocuerpo o un(otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0143] Además, cualquier proteína o polipéptido que comprende un ISV (tal como un fármaco basado en ISV) tiene preferentemente dicho (o al menos un) ISV en su extremo carboxiterminal. De nuevo, dicho ISV puede ser, en particular, un Nanocuerpo o un (otro) ISV (es decir, distinto de un Nanocuerpo) que es un dominio VH o que comprende un dominio VH; y es preferentemente un Nanocuerpo.
[0144] Como también se menciona en el presente documento, el método anterior que utiliza el anticuerpo 21-4 también puede utilizarse para determinar si un ISV o una proteína o polipéptido que comprende un ISV se une a (o tiene tendencia a unirse a) uno o más factores de interferencia presentes en la sangre o el suero de un ser humano. Además, como se menciona en el presente documento, se contempla que dicho método que utiliza el anticuerpo 21-4, también pueda utilizarse para predecir si cualquier proteína o polipéptido (tal como un fragmento de anticuerpo o scFv) que tenga un dominio VH en su extremo carboxiterminal, se unirá a (o tiene una tendencia a unirse a) uno o más factores de interferencia presentes en la sangre o el suero de un ser humano y/o tiene una tendencia a experimentar interferencia de proteínas en un ensayo de ADA.
[0145] Además del anticuerpo 21-4, se contempla que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (tal como un fragmento Fab adecuado) que contenga los dominios variables de cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo 21-4 (véanse las SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente) o incluso solo las secuencias CDR del anticuerpo 21-4 (adecuadamente injertadas en otras regiones marco conservadas de VH y VK adecuadas) también pueda utilizarse en los métodos descritos en el presente documento.
[0146] Como se describe adicionalmente en el presente documento, la invención definida en las reivindicaciones puede usarse en particular para predecir si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo), dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo que es un ensayo de ADA. Dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o cuantificar ADA frente ISV en general, y puede ser, en particular, un ensayo de ADA para detectar o cuantificar ADA frente al ISV utilizado en las etapas (i) y (ii) mencionadas anteriormente.
[0147] En un aspecto particular preferido, pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o Nanocuerpo), dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de dicho ISV. De nuevo, dicho ensayo de ADA puede ser, por ejemplo, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA frente a ISV en general, y puede ser, en particular, un ensayo de ADA para detectar o medir ADA frente al ISV utilizado en las etapas (i) y (ii) anteriores.
[0148] En un aspecto aún más particular, pero no limitativo, la invención tal como se define en las reivindicaciones, puede utilizarse para predecir si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo), dará lugar a interferencia de proteínas (como se describe adicionalmente en el presente documento) en un inmunoensayo (y en particular, en un ensayo de ADA) que implica el uso de dicho ISV. Por ejemplo, dicho inmunoensayo puede ser un ensayo de ADA (es decir, que implique el ISV) que se realice para determinar o medir si en la muestra que se analiza hay algún ADA contra dicho ISV, en donde dicha muestra es una muestra de líquido biológico (como se describe en el presente documento) que se obtiene de un sujeto al que se ha administrado dicho ISV (como también se describe en el presente documento). Por ejemplo, como se menciona adicionalmente en el presente documento, dicha muestra(es decir,la "muestra de ensayo") puede ser una muestra de sangre (incluyendo sangre entera, suero o plasma), líquido ocular, líquido broncoalveolar/LBAL, líquido cefalorraquídeo o cualquier otro líquido biológico adecuado, y puede ser en particular una muestra biológica que es adecuada para y/o destinada a su uso en un ensayo inmunológico, tal como un ensayo de ADA.
[0149] Como se describe adicionalmente en el presente documento, en todos estos aspectos (y en los aspectos adicionales útiles en o con la invención tal como se define en las reivindicaciones), la invención tal y como se define en las reivindicaciones también puede utilizarse para seleccionar ISV que no sean, o sean menos propensos, a generar dicha interferencia de proteínas en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA; como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para evaluar si determinada(s) modificación(es) en un ISV reducirán (total o parcialmente) su tendencia a generar dicha interferencia en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA; y/o como un ensayo o prueba que pueda utilizarse para guiar la modificación o mejora de un ISV con el fin de reducir su tendencia a generar dicha interferencia de proteínas en dichos inmunoensayos o ensayos de ADA.
[0151] Como se ha mencionado, la etapa (i) del método de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, comprende poner en contacto dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo) con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo (como se describe adicionalmente en el presente documento). En dicha etapa (i) del método descrito en el presente documento,"dicho ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo)" se utiliza como antígeno en el inmunoensayo (es decir, como la sustancia a detectar). Además, en dicha etapa (i), el "anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo"se utiliza como reactivo analítico (es decir, de la misma manera en que se utilizan otros anticuerpos en inmunoensayos para detectar la presencia de un antígeno al que están dirigidos).
[0153] Como ya se ha mencionado, y con el fin de comprender mejor la invención descrita en el presente documento, cabe señalar que, en la etapa (i), el ISV se usará habitualmente como el "antígeno" (es decir, como el compuesto a detectar), y el "anticuerpo analítico" se usará como agente analítico (es decir,como un medio para detectar si un ISV determinado se une o no, respectivamente; y, por tanto, si tiene un riesgo elevado o aumentado de generar o no interferencia de proteínas, respectivamente). Por ejemplo, cuando la etapa (i) se realiza en un formato ELISA, el "anticuerpo/agente analítico" normalmente se unirá al portador (es decir,a la placa de ELISA) y el ISV estará en (presente en) la muestra a ensayar.
[0155] En cambio, cabe señalar que en los ensayos de ADA para detectar o medir los ADA frente a un ISV, el ISV se utiliza como el "agente analítico" (es decir,como el compuesto utilizado para detectar si hay algún ADA presente), y los ADA son el "antígeno" (es decir,el compuesto a detectar). Por tanto, en estos ensayos, el ISV se unirá habitualmente/con frecuencia al portador (tal como la placa ELISA), mientras que los ADA (si los hay) estarán presentes en la muestra que se somete al ensayo.
[0157] Sin embargo, como ya se ha mencionado, en general debe observarse que la invención tal como se define en las reivindicaciones, no se limita a ensayos en los que el "anticuerpo analítico" está unido al portador. Por ejemplo, en una manera alternativa de realizar un ensayo de acuerdo con la invención tal como se define en las reivindicaciones (como se muestra en el Ejemplo
[0158] 5), el anticuerpo analítico se utiliza en cambio como agente puente y, por lo tanto, estará en solución en lugar de estar unido a la placa (aunque está unido indirectamente a la placa a través del ISV que está recubierto sobre la misma). Sin embargo, también en el ensayo (de tipo puente) específico descrito en el Ejemplo 5 (que es un ensayo competitivo), el anticuerpo analítico se sigue utilizando como agente analítico (es decir, para determinar si el ISV de interés se une o no, respectivamente; y por tanto tiene un riesgo elevado o aumentado de generar o no interferencia de proteínas, respectivamente). También se contempla que, basándose en la divulgación adicional del presente documento, el experto será capaz de diseñar otros formatos de ensayo en los que el anticuerpo analítico pueda utilizarse como agente analítico para determinar si un ISV dado puede unirse o no, respectivamente; y por tanto tiene un riesgo elevado o aumentado de generar o no interferencia de proteínas).
[0160] El "anticuerpo analítico" usado en la etapa (i) puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal.
[0162] Cuando el anticuerpo analítico es un anticuerpo policlonal, éste puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal (preparación) que se ha obtenido/purificado/aislado de una muestra biológica obtenida de un sujeto humano (tal como sangre, plasma, linfocitos B u otra muestra biológica o líquido biológico adecuado a partir del cual se pueden aislar adecuadamente anticuerpos policlonales). Esta puede ser, por ejemplo, una muestra biológica adecuada que se ha obtenido de un sujeto humano al que se ha administrado al menos un ISV (tal como el ISV utilizado en la etapa (i), pero esto no es necesario o esencial), pero también puede ser (y preferentemente es) una muestra biológica adecuada de un sujeto humano que nunca ha recibido o se ha tratado con un ISV. Lo más importante es que el anticuerpo policlonal se haya obtenido de dicha muestra biológica mediante un método que implique al menos una etapa de afinidad utilizando una matriz o columna de afinidad que lleve un ISV, como la porción de afinidad (y una o más etapas adicionales para obtener, purificar/aislar anticuerpos policlonales de por sí conocidos. Por ejemplo, el anticuerpo policlonal puede haberse obtenido a partir de una muestra biológica de este tipo mediante cromatografía de afinidad utilizando una columna de afinidad que lleva un ISV, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 2. Esto puede realizarse, por ejemplo, utilizando técnicas bien conocidas de cromatografía de inmunoafinidad para aislar anticuerpos de una muestra biológica, usando una matriz de afinidad que lleva un ISV como antígeno. Dichas técnicas son generalmente conocidas en la materia y los ejemplos adecuados de las mismas serán evidentes para el experto basándose en la presente divulgación.
[0164] Dicho anticuerpo policlonal (preparación) puede ser en particular una IgG (o fracción de IgG).
[0166] Por ejemplo, puede ser un anticuerpo policlonal que se haya obtenido a través de un método que implique cromatografía de (inmuno)afinidad, realizada en una muestra de líquido biológico obtenida de un sujeto humano, usando, como antígeno unido a la matriz de afinidad, un ISV (y en particular un Nanocuerpo, tal como un VHH, un VHH humanizado y/o con secuencia optimizada o un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) que no contenga una etiqueta carboxiterminal (es decir,cuyo extremo carboxílico finalice con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33)). En particular, el ISV utilizado como antígeno unido a la matriz de afinidad puede ser un VHH humanizado o con secuencia optimizada (o, alternativamente, un VH humano camelizado correspondiente) cuyo extremo carboxílico finalice con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33). En un aspecto específico, pero no limitativo, el ISV utilizado como antígeno unido a la matriz de afinidad, puede ser un VHH humanizado o con secuencia optimizada que, como resultado de dicha humanización u optimización de secuencia, comprende un resto de prolina (P) en la posición 14 donde el VHH "intacto" correspondiente comprende una alanina (A) en la posición 14 (en otras palabras, el ISV utilizado como antígeno es una versión humanizada de un VHH que comprende de manera natural una alanina en la posición 14, cuyo resto de alanina, como resultado de la humanización y/u optimización de la secuencia, se ha reemplazado por un resto de prolina (P)). El ISV utilizado como antígeno también puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos diferentes como resultado de dicha humanización u optimización de secuencia, por ejemplo, como se describe de manera general en el documento WO 08/020079 o WO 09/138519.
[0168] Algunos ejemplos específicos de ISV que pueden utilizarse como antígeno para generar/aislar el "anticuerpo analítico" usado en la invención tal como se define en las reivindicaciones, se proporcionan en las SEQ ID NO: 1 y 2.
[0170] De nuevo, el método utilizado para obtener el anticuerpo policlonal puede comprender, además de las etapas de (inmuno)afinidad, una o más etapas adicionales para aislar/purificar un anticuerpo policlonal de la muestra biológica (realizadas antes o después de las etapas de afinidad). De nuevo, dichas etapas y técnicas para llevarlas a cabo serán evidentes para el experto en la materia.
[0172] Por tanto, en un aspecto, la invención tal como se define en las reivindicaciones, comprende un método como se describe adicionalmente en el presente documento, que comprende las etapas (i) y (ii) descritas en el presente documento, en las que el "anticuerpo analítico" (es decir, el anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo), se ha obtenido de una muestra biológica obtenida de un sujeto humano (en donde dicha muestra biológica es una muestra que es adecuada para su uso en un método para generar/aislar un anticuerpo de dicha muestra) usando un método que comprende al menos una etapa de afinidad (tal como una etapa de cromatografía de afinidad, tal como cromatografía de inmunoafinidad) en la que como antígeno se usa un ISV (y preferentemente un Nanocuerpo) y preferentemente como antígeno se usa un ISV que comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) como la secuencia carboxiterminal, y más preferentemente se utiliza como antígeno un Nanobody humanizado y/o con secuencia optimizada que comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) como la secuencia carboxiterminal, y aún más preferentemente se utiliza como antígeno un nanocuerpo humanizado y/o con secuencia optimizada que comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) como secuencia carboxiterminal y que tiene un resto de prolina en la posición 14, tal como un nanocuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) como secuencia carboxiterminal y que tiene un resto de prolina en la posición 14, introducido en el nanocuerpo como resultado de dicha humanización y/u optimización de secuencia (por ejemplo, para reemplazar un resto de alanina que se produce de forma natural en dicha posición en el VHH que se ha humanizado y/o con secuencia optimizada).
[0173] Los ISV anteriores también pueden utilizarse en métodos para aislar anticuerpos monoclonales (de nuevo partiendo de una muestra biológica adecuada obtenida de un ser humano) que son adecuados para su uso en la invención tal como se define en las reivindicaciones como el "anticuerpo analítico".
[0175] Por ejemplo, dicho anticuerpo monoclonal puede obtenerse a partir de sangre, células B u otra muestra o material adecuado para aislar anticuerpos, y puede seleccionarse en función de su capacidad para reconocer y/o unirse a (el extremo carboxiterminal de) un ISV o Nanocuerpo (en el que, de nuevo, el ISV o ISV utilizados como antígeno durante la exploración y/o selección son preferentemente los descritos en los párrafos anteriores, incluidas las preferencias indicadas para dicho ISV/antígeno). Dicha exploración y selección puede realizarse de cualquier manera adecuada, por ejemplo, utilizando técnicas de selección y/o expansión de linfocitos B esencialmente iguales o convenientemente similares a las técnicas de selección de linfocitos B descritas en los documentos EP 0 488470, WO 92/02551, EP 1633787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 o WO 04/106377 o técnicas similares a la técnica de Nanoclon descrita en el documento WO 06/079372 (pero utilizando linfocitos B humanos en lugar de linfocitos B de camélidos).
[0177] Una vez que se han identificado/aislado uno o más linfocitos B que expresan un anticuerpo adecuado, dicho anticuerpo puede aislarse, expresarse y/o producirse de cualquier manera adecuada. Por ejemplo, dichos linfocitos B pueden inmortalizarse como hibridomas que producen el anticuerpo/anticuerpos deseados (utilizando técnicas de por sí bien conocidas para generar hibridomas partiendo de linfocitos B seleccionados), y dicho anticuerpo o anticuerpos pueden aislarse después del sobrenadante del cultivo de dicho hibridoma o hibridomas, utilizando de nuevo técnicas adecuadas bien establecidas en la materia descritas en diversos manuales y guías, y también descritas y/o mencionadas en las publicaciones de patentes mencionadas en el párrafo anterior.
[0178] Como alternativa, dicho o dichos linfocitos B pueden expandirse utilizando técnicas de expansión de linfocitos B de por sí conocidas y el anticuerpo/anticuerpos pueden aislarse de (el sobrenadante de cultivo de) dichos linfocitos B expandidos. Una vez más, esto puede realizarse utilizando técnicas adecuadas bien establecidas en la materia y descritas en diversos manuales y guías, y también descritas y/o mencionadas en las publicaciones de patentes mencionadas en los párrafos anteriores.
[0180] En otra alternativa más, el ADN que codifica el anticuerpo/anticuerpos de interés se puede obtener (p. ej., mediante amplificación) a partir de dicho linfocito B u otras células adecuadas, ya sea directamente (por ejemplo, utilizando técnicas de clonación por PCR de células individuales adecuadas) o después de la expansión adecuada de los linfocitos B deseados. Dicho ADN puede expresarse entonces de manera adecuada en una célula hospedadora u organismo hospedador adecuado para proporcionar el anticuerpo/anticuerpos deseados. Una vez más, esto puede realizarse utilizando técnicas adecuadas bien establecidas en la materia y descritas en diversos manuales y guías, y también descritas y/o mencionadas en las publicaciones de patentes mencionadas en los párrafos anteriores.
[0181] También es posible generar anticuerpos monoclonales que sean adecuados para su uso como "anticuerpo analítico" mediante un método que implique clonación por repertorio (partiendo de una muestra adecuada obtenida de un sujeto humano) y explorar el repertorio clonado en busca de anticuerpos que se unan al ISV usado como antígeno (en el que, de nuevo, el ISV o los ISV utilizados como antígeno durante la exploración y/o selección son preferentemente como se describe en los párrafos anteriores, incluyendo las preferencias indicadas para dicho ISV/antígeno). Los métodos para la clonación de repertorios y las diversas técnicas para mostrar repertorios clonados para su selección y exploración (como la presentación de fagos, la presentación de ribosomas y la presentación de levaduras) serán evidentes para los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0589877, EP 0774511, WO 90/14430 y EP 0368684), así como en diversos manuales sobre el tema.
[0183] Generalmente, la muestra biológica que se utiliza como punto de partida para obtener el anticuerpo analítico (policlonal o monoclonal) puede ser cualquier muestra adecuada (es decir, adecuada como material de partida para obtener un anticuerpo policlonal o monoclonal, respectivamente) obtenida de cualquier sujeto humano adecuado. En un aspecto específico pero no limitativo, una muestra de este tipo se puede haber obtenido, por ejemplo, de una mujer y, en particular, de una mujer posmenopáusica. Por tanto, en un aspecto específico pero no limitativo, el anticuerpo analítico utilizado en las etapas (i) y (ii) anteriores se ha obtenido partiendo de una muestra biológica que se ha obtenido/procede de una mujer posmenopáusica (o que procede de un anticuerpo que se ha obtenido/procede de una mujer posmenopáusica).
[0185] Además, la muestra biológica que se utiliza como punto de partida para obtener el anticuerpo analítico (policlonal o monoclonal) puede obtenerse de un sujeto al que se ha administrado previamente un ISV (por ejemplo, como parte de un ensayo clínico o terapéuticamente), pero preferentemente se obtiene de un sujeto al que no se ha administrado previamente ningún ISV.
[0187] Sin embargo, cabe señalar que la invención tal como se define en las reivindicaciones no se limita específicamente a la fuente del anticuerpo/anticuerpos analíticos utilizados, y se ha demostrado que, en algunos casos, es posible, utilizando las técnicas descritas en el presente documento, obtener (generar, aislar) otros anticuerpos analíticos adecuados a partir de otras fuentes, incluyendo sangre o plasma humano disponible comercialmente (e incluso sangre, plasma o linfocitos B de otras especies de mamíferos o primates, como el babuino o el macaco cangrejero (Macaca fascicularis(nombre actual de la antigua especieMacacus cynomolgus), cuyo nombre común en español es macaco cangrejero)).
[0189] Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo analítico (policlonal o monoclonal) utilizado en las etapas (i) y (ii) debe ser capaz de reconocer o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo, y lo más preferentemente se selecciona y/o aísla basándose en esta capacidad de unirse al extremo carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo.
[0191] Como puede observarse en la Figura 2, cuando el ISV se basa en, o procede de, un dominio VH o VHH, el extremo carboxiterminal de un ISV comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y, por consiguiente, el anticuerpo analítico debería ser capaz de reconocer cualquier ISV que tenga la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) en su extremo carboxiterminal. Como puede observarse además en la Figura 2, (al menos algunos de los restos de aminoácidos en) la secuencia VTVSS (SEQ ID NO:33) forma parte de un supuesto epítopo en el ISV que también incluye, entre otros restos, el resto de aminoácido en la posición 14 (y los restos de aminoácidos adyacentes o cercanos en la secuencia, como las posiciones 11, 13 y 15) y que también puede comprender el resto de aminoácido en la posición 83 (y los restos de aminoácidos adyacentes o cercanos, como las posiciones 82, 82a, 82b y 84) y/o el resto de aminoácido en la posición 108 (y los restos de aminoácidos adyacentes o cercanos, como las posiciones 107. La posición 109 corresponde a la primera V de la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33), y se ha demostrado que, por ejemplo, la posición 110 también puede tener influencia sobre la interferencia de proteínas. En el presente documento, a esto se denomina en conjunto, la "región carboxiterminal", entendiéndose que esta región carboxiterminal comprende al menos la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33) y el resto de aminoácido en la posición 14, y también puede comprender los restos de aminoácidos en las posiciones 83 y 108, y posiblemente también los de las posiciones 13, 15, 82b, 83, 84 y 107.
[0193] Como ya se ha mencionado, y de nuevo sin limitarse a ninguna hipótesis o explicación, en un anticuerpo monoclonal de 4 cadenas de tamaño completo, o en un anticuerpo solo de cadena pesada de tamaño completo tal como los presentes enCamelidae,el extremo carboxiterminal de un dominio VH o VHH está unido al resto del anticuerpo - es decir, a la región CH1 en anticuerpos monoclonales convencionales o a la región bisagra en anticuerpos de cadena pesada deCamelidae, respectivamente - y, por tanto, en dichos anticuerpos de tamaño completo pueden estar protegidos frente a dicha interferencia de proteínas) y/o cubiertos por la interacción VH/VL (en los anticuerpos convencionales de 4 cadenas), de modo que esta "región carboxiterminal" normalmente no está expuesta al disolvente y/o no es accesible como sitio de interacción para proteínas presentes en la sangre, el suero o el organismo de una persona a la que se administra dicho ISV. Sin embargo, si se usa un ISV o Nanocuerpo de por sí (es decir, sin estar ligado a ninguna otra parte de un anticuerpo), o si se usa un fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo que lleva un ISV o Nanocuerpo en su extremo carboxiterminal, este epítopo carboxiterminal está disponible para la interacción (específica) con otras proteínas, y de nuevo, sin limitarse a ninguna hipótesis o explicación, se supone que esta región carboxiterminal puede ser ahora accesible para experimentar una interacción de proteínas (específica) con una o más proteínas preexistentes en la "muestra de ensayo" (por ejemplo, una o más IgG) que se analiza y que esto puede provocar interferencia de proteínas y/o señales específicas en los inmunoensayos (y en particular en los ensayos de ADA).
[0195] Como se ha mencionado, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para predecir, reducir o evitar dicha interacción de proteínas, y también pueden usarse como herramienta para guiar la modificación del ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, para proporcionar al mismo una tendencia (parcialmente, o preferentemente, esencialmente por completo) reducida, a generar dicha interferencia de proteínas.
[0197] Como se desprende claramente del párrafo anterior, y nuevamente sin quedar limitado a ninguna hipótesis o explicación, se espera en particular (y forma parte de la enseñanza de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones) que determinadas modificaciones de la "región carboxiterminal" alteren (y preferentemente reduzcan) la tendencia de un ISV a experimentar dicha interacción de proteínas específica, lo cual es también lo que se observa experimentalmente (véanse, por ejemplo, los resultados experimentales presentados en los Ejemplos 1C y 3 a continuación).
[0199] Basándose en esto, y de nuevo sin quedar limitado a ninguna hipótesis o explicación, la presente memoria descriptiva también enseña determinadas modificaciones que pueden introducirse con este fin en la región carboxiterminal de un ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo (cuya (posible) eficacia puede evaluarse utilizando los métodos descritos en el presente documento). Además, basándose en las enseñanzas del presente documento, se contempla que el experto pueda elegir, diseñar o proponer otras modificaciones (candidatas) a la región carboxiterminal que podrían introducirse para este fin (y cuya (posible) eficacia puede evaluarse de nuevo utilizando los métodos descritos en el presente documento).
[0201] Volviendo al anticuerpo analítico usado en la invención tal como se define en las reivindicaciones, este es preferentemente un anticuerpo (policlonal o monoclonal) que reconoce la región carboxiterminal (como se ha definido anteriormente) de un ISV, y en particular, pero sin limitación, la región carboxiterminal de un Nanocuerpo.
[0202] Por ejemplo, en un aspecto específico pero no limitativo, el "anticuerpo analítico" puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconoce (y/o es capaz de unirse a, y en particular de unirse específicamente a) la región carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo, cuyo extremo carboxiterminal de la secuencia termina en VTVSS (SEQ ID NO:33), pero no reconoce (y/o no es capaz de unirse específicamente a) la región carboxiterminal de un ISV o Nanocuerpo (que puede ser un ISV diferente pero es preferentemente el mismo ISV) cuando hay uno o más restos de aminoácidos adicionales (tales como de 1 a 5 restos de aminoácidos, o alternativamente una secuencia peptídica pequeña o incluso otro polipéptido o proteína) unidos a VTVSS carboxiterminal (SEQ ID NO:33).
[0204] En otro aspecto más específico, aunque todavía no limitativo, el "anticuerpo analítico" puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconozca (y/o sea capaz de unirse, y en particular de unirse específicamente) a la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo cuyo extremo carboxiterminal de la secuencia termina en VTVSS (SEQ ID NO:33) y en el que la posición 14 corresponde a un aminoácido no natural en la posición 14 y/o que ha sido modificado con respecto al aminoácido natural en la posición 14 (por ejemplo, como resultado de humanización, camelización y/u optimización de secuencia), pero que no reconoce (y/o no es capaz de unirse específicamente a) la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo (que puede ser un ISV diferente, pero preferentemente el mismo ISV) en el que uno o más restos adicionales de aminoácidos (tales como 1 a 5 restos de aminoácidos, o alternativamente una pequeña secuencia peptídica o incluso otro polipéptido o proteína) estén unidos a la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33); y/o en el que la posición 14 sea un aminoácido natural en la posición 14 (por ejemplo, alanina o, cuando el ISV contiene de manera natural una prolina en la posición 14).
[0205] Por ejemplo, el "anticuerpo analítico" también puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconozca (y/o sea capaz de unirse, y en particular de unirse específicamente a) la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo cuyo extremo carboxiterminal de la secuencia termina en VTVSS (SEQ ID NO:33) y en el que la posición 14 es prolina (y en particular cuando la posición 14 ha sido modificada a prolina, por ejemplo como resultado de humanización, camelización y/u optimización de secuencia), pero que no reconozca la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo (que puede ser un ISV diferente, pero preferentemente el mismo ISV) en el que uno o más restos adicionales de aminoácidos (tales como 1 a 5 restos de aminoácidos, o alternativamente una pequeña secuencia peptídica o incluso otro polipéptido o proteína) estén unidos a la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33); y/o en el que la posición 14 sea alanina.
[0207] El "anticuerpo analítico" también puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconozca (y/o sea capaz de unirse, y en particular de unirse específicamente a) a la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo cuyo extremo carboxiterminal de la secuencia termina en VTVSS (SEQ ID NO:33) y en el que la posición 14 es prolina (en particular cuando hay un resto de prolina de origen natural en dicha posición en dicho ISV), pero que no reconozca la región carboxiterminal de un ISV o nanocuerpo (que puede ser un ISV diferente, pero preferentemente el mismo ISV) en el que uno o más restos adicionales de aminoácidos (tales como 1 a 5 restos de aminoácidos, o alternativamente una pequeña secuencia peptídica o incluso otro polipéptido o proteína) estén unidos a la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33), manteniéndose la posición 14 como una prolina (de origen natural o no modificada).
[0209] El "anticuerpo analítico" también puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o monoclonal que reconozca (la región carboxiterminal de) la secuencia del ISV denominada "Nb 3.4" en el presente documento (SEQ ID NO: 5) pero que no reconozca (la región carboxiterminal de) la secuencia del ISV denominada "Nb 3.1" en el presente documento (SEQ ID NO: 3) y/o (y preferentemente y) no reconozca la secuencia del ISV denominada "Nb 3.2" en el presente documento (SEQ ID NO: 4).
[0211] Para el propósito anterior, si un "anticuerpo analítico" reconoce (o no) un ISV o Nanocuerpo (y/o es o no capaz de unirse (específicamente) a un ISV o Nanocuerpo) puede determinarse usando cualquier ensayo de unión adecuado (tal como Biacore), pero también se puede determinar utilizando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3 o un ensayo de ADA tal como el ensayo de puente/competencia de ADA descrito en el Ejemplo 5 (véase también la Figura 1A a 1C y en particular la Figura 1B).
[0213] Los formatos/técnicas adecuados para realizar un ensayo de este tipo serán evidentes para el experto basándose en la divulgación del presente documento y, por ejemplo, incluyen (sin limitación):
[0214] • Un ensayo colorimétrico tal como ELISA con anticuerpo analítico recubierto directa o indirectamente a la placa y detección del ISV unido con anticuerpo monoclonal o policlonal contra ISV. Otras tecnologías alternativas útiles para esta configuración incluyen, pero sin limitación, electroquimioluminiscencia (la plataforma MSD), fluorescencia (DELFIA, GYROS) y otros métodos que se basan en la detección secundaria del ISV unido.
[0215] • Una resonancia de plasmón superficial (tal como BIACORE) u otro método biodetector en tiempo real (es decir, que no sea el uso de SPR) con anticuerpo analítico inmovilizado directa o indirectamente y monitorizar la unión de ISV inyectado/administrado posteriormente. Estos métodos no requieren una detección adicional del ISV unido. Un método representativo para realizar este tipo de ensayo es el ensayo que se describe en el Ejemplo 3.
[0216] • Analizar el comportamiento competitivo del ISV en un ensayo de tipo puente (ensayo de ADA) utilizando el anticuerpo analítico en lugar de un líquido biológico que contenga ADA. Para el ensayo de puente pueden utilizarse diferentes tecnologías tales como ELISA, la plataforma MSD. Los métodos representativos para realizar este tipo de ensayo se muestran esquemáticamente en las figuras 1A a 1C y un ejemplo específico de este tipo de ensayo también se describe en el Ejemplo 5.
[0217] • Cualquier método cromatográfico en el que el anticuerpo analítico esté inmovilizado en la matriz cromatográfica y se permita la captura/aislamiento específico del ISV a partir de una solución.
[0219] Una vez que se ha obtenido un anticuerpo analítico adecuado utilizando uno de los métodos descritos en el presente documento o en uno de los ejemplos (o un método esencialmente equivalente al mismo), dicho anticuerpo analítico puede utilizarse para determinar si un determinado ISV o Nanocuerpo (o fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo) dará lugar a (o tiene una tendencia elevada o aumentada de generar) interferencia de proteínas (como se define en el presente documento), es decir, realizando las etapas (i) y (ii) descritas anteriormente. Como ya se ha descrito en el presente documento, esto generalmente implica poner en contacto dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, con el anticuerpo analítico y determinar si dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, es reconocido por (y/o se une a, y en particular se une específicamente a) dicho anticuerpo analítico (y en particular si la región carboxiterminal de dicho ISV o Nanocuerpo o de cualquier ISV o Nanocuerpo que forme el extremo carboxiterminal de dicho fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, es reconocida por dicho anticuerpo analítico).
[0220] Esto puede realizarse generalmente utilizando cualquier técnica adecuada para determinar si un antígeno (en el caso, el ISV, el Nanocuerpo, el fármaco basado en ISV o el fármaco basado en Nanocuerpo) está unido a un anticuerpo, y las técnicas de (inmuno)ensayo adecuadas serán evidentes para el experto. Algunos ejemplos no limitativos son técnicas de ELISA adecuadas (incluyendo, por ejemplo, ELISA de tipo sándwich); en las que, dependiendo del formato ELISA utilizado (como será evidente para el experto), el anticuerpo analítico o el ISV puede recubrir la placa y el anticuerpo analítico o el ISV pueden marcarse de manera detectable. Otras técnicas pueden implicar, por ejemplo, el uso de un instrumento Biacore (en el que, de nuevo, el anticuerpo analítico o el ISV puede recubrir el chip, véase, por ejemplo, el Ejemplo 3). Otra alternativa puede ser un ensayo de tipo puente competitivo (como el que se ilustra en el Ejemplo 5), en el que se evalúa la capacidad del ISV para competir con otro ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, que se sabe que se une al anticuerpo analítico (o viceversa). Estas y otras técnicas adecuadas para determinar si un determinado ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, es reconocido por el anticuerpo analítico, o se une (específicamente) al mismo, serán evidentes para el experto en la materia a partir de la divulgación contenida en el presente documento.
[0222] También será evidente, basándose en la divulgación del presente documento, que la presente invención tal como se define en las reivindicaciones (y en particular el anticuerpo analítico utilizado en la presente invención tal como se define en las reivindicaciones) pueda utilizarse para determinar si un ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo dado contiene o no un sitio de interacción (tal como un sitio de interacción presente en o dentro de la región carboxiterminal, y/o de la cual forma parte la región carboxiterminal) que es capaz de experimentar una interacción de proteína (específica) con una o más proteínas u otros componentes que pueden estar presentes en una muestra biológica(es decir,una "muestra de ensayo") obtenida de un sujeto que se va a someter a un inmunoensayo tal como un ensayo de ADA (en particular, un ensayo de ADA para determinar la presencia de cualquier ADA frente al ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo). Por tanto, cuando un ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo es reconocido por el anticuerpo analítico utilizado en la invención, tal como se define en las reivindicaciones, es muy probable que dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo contenga un sitio de interacción accesible o expuesto, y, por lo tanto, tendrá tendencia generar dicha interferencia de proteínas (según se define en el presente documento) cuando se utilice en un inmunoensayo o ensayo de ADA para analizar la muestra de prueba. Como será evidente para el experto, esto es algo que se debería evitar preferentemente, ya sea seleccionando/utilizando otro ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, si es posible, o modificando el ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o basado en Nanocuerpo de modo que su tendencia a dicha interferencia de proteínas se reduzca sustancialmente o se elimine esencialmente (de nuevo, esto puede analizarse utilizando el método y el anticuerpo analítico divulgado en el presente documento).
[0224] Como también será evidente para el experto basándose en la divulgación del presente documento, dicha modificación puede comprender, por ejemplo, hacer una o más modificaciones (tales como inserciones, adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos) en el sitio de interacción en el ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo, de modo que su capacidad para experimentar una interacción de proteína (específica) con una o más proteínas u otros componentes que pueden estar presentes en una muestra de ensayo se reducirá o eliminará. De nuevo, esto puede realizarse mediante ensayo y error limitados introduciendo una o más modificaciones y después verificando si esta capacidad se ha reducido o no, de nuevo utilizando el método y el anticuerpo analítico divulgado en el presente documento. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de dichas modificaciones, y posteriormente compararse la capacidad del ISV modificado para unirse al anticuerpo analítico con la del ISV original/no modificado. Como alternativa, utilizando un formato de tipo puente competitivo (como el que se ilustra, por ejemplo, en el Ejemplo 5), o utilizando Biacore (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3), se puede determinar la capacidad del ISV modificado para competir (aún) con el ISV original para unirse al anticuerpo analítico.
[0226] De nuevo, y aunque la invención tal como se define en las reivindicaciones no se limita a ninguna hipótesis o explicación, basándose en la evidencia experimental que se expone en los ejemplos a continuación, los inventores han descubierto que este sitio de interacción está probablemente ubicado en/cerca de la región carboxiterminal (tal como se define en el presente documento) o que dicho sitio de interacción forma parte de la región carboxiterminal (o que la región carboxiterminal forma parte de este sitio de interacción). Esto se basa, por ejemplo, al menos en parte, en la observación de que, si un ISV tiene tendencia a generar dicha interferencia de proteínas y tiene VTVSS (SEQ ID NO:33) como los restos de aminoácidos en su extremo carboxiterminal, la unión de un número limitado de restos de aminoácidos (tal como de 1 a 10, por ejemplo de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5), o como alternativa, de una etiqueta u otro péptido, proteína u otra porción a dicho extremo carboxiterminal, normalmente reducirá sustancialmente o eliminará esencialmente dicha tendencia. En algunos casos, se ha descubierto que incluso la adición de 1, 2 o 3 restos de aminoácidos el extremo carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33) (que puede ser cualquier aminoácido o combinación de aminoácidos adecuados, los cuales pueden elegirse cada uno independientemente de cualquier aminoácido de origen natural tales como los enumerados en la Tabla A-2 en la página 64 del documento WO 09/138519, por ejemplo y sin limitación, alanina, glicina, valina, leucina o isoleucina) ya puede reducir sustancialmente o eliminar esencialmente dicha tendencia. Esto también se basa en parte en la observación de que, en algunos casos, cuando un VHH contiene de forma natural un resto de alanina en la posición 14 (que, como se ha mencionado, forma parte de la región carboxiterminal; véase la Figura 2), el VHH de origen natural a menudo no tiene (o tiene una baja) tendencia a generar dicha interferencia de proteínas, mientras que un VHH correspondiente en el que dicha alanina en la posición 14 se ha reemplazado por un resto de prolina (por ejemplo, para fines de humanización u optimización de secuencia) puede dar como resultado, una tendencia aumentada a generar dicha interferencia de proteínas (es decir, en comparación con el VHH que tiene alanina en la posición 14).
[0228] En un aspecto, la invención tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un VHH, a un Nanocuerpo (como se define en el presente documento, y en particular a un VHH humanizado o un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) u otro ISV (o fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo con un VHH, Nanocuerpo u otro ISV en su extremo carboxiterminal) que se ha modificado (por ejemplo, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos), y, en particular, modificado en las regiones carboxiterminales (por ejemplo mediante una o más sustituciones o adiciones de aminoácidos en la región carboxiterminal), de manera que: (i) tenga una tendencia sustancialmente reducida (como mínimo una tendencia reducida estadísticamente significativa) a generar interferencia de proteínas (como se define en el presente documento); y/o (ii) tenga, en el método de la invención tal como se define en las reivindicaciones (por ejemplo, en el ensayo específico descrito en los Ejemplos 3 o 5), una capacidad sustancialmente reducida de unirse a un anticuerpo analítico descrito en el presente documento (tal como, el anticuerpo policlonal descrito en el Ejemplo 2 y utilizado en los Ejemplos 3 y 5), en ambos casos preferentemente en comparación con el mismo VHH, nanocuerpo o ISV sin las modificaciones.
[0230] Por tanto, en un aspecto, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un VHH, a un Nanocuerpo (como se define en el presente documento, y en particular a un VHH humanizado o a un VH camelizado, tal como un VH humano camelizado) o a otro ISV (o fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo con un VHH, Nanocuerpo u otro ISV en su extremo carboxiterminal) que es un dominio VHH o VH (es decir, un ISV que es un dominio VH o derivado de un dominio VH) y/o que se ha basado en o se ha derivado de (la secuencia de aminoácidos de) un dominio VHH o VH, cuyo VHH, Nanocuerpo o ISV comprende la secuencia de aminoácidos VTVSS(X)<n>(SEQ ID NO:34) en su extremo carboxiterminal, donde n es de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 (y preferentemente 1 o 2, tal como 1), y en donde cada X es un resto de aminoácido (preferentemente de origen natural) que se elige independientemente (y preferentemente se elige independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I); sin embargo, como puede observarse a partir de los datos presentados a continuación, también pueden utilizarse otros restos de aminoácidos (preferentemente de origen natural) o combinaciones de los restos de aminoácidos preferidos mencionados anteriormente con otros restos de aminoácidos (tales como serina, prolina, treonina y/o lisina). preferentemente, dicho VHH, Nanocuerpo o ISV con la secuencia de aminoácidos VTVSS<n>(X) (SEQ ID NO:34) en su extremo carboxiterminal es tal que (i) tiene una tendencia sustancialmente reducida (tal como al menos una tendencia reducida estadísticamente relevante) a generar interferencia de proteínas (como se define en el presente documento); y/o tal que (ii) tiene, en el método de la invención tal como se define en las reivindicaciones (tal como en el ensayo específico descrito en el Ejemplo 3 o 5), capacidad sustancialmente reducida para unirse a un anticuerpo analítico como se describe en el presente documento (tal como el anticuerpo policlonal descrito en el Ejemplo 2), en ambos casos preferentemente en comparación con el mismo VHH, Nanocuerpo o ISV pero con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) en su extremo carboxiterminal. Se hace referencia, por ejemplo, al ensayo y a los datos mostrados en el Ejemplo 3.
[0232] Los VHH, nanocuerpos u (otros) ISV mencionados anteriormente son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la unión al anticuerpo 21-4 inferior a 500 (determinado de acuerdo con el protocolo expuesto en el Ejemplo 9, y después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular). También debe señalarse que, cada vez que se haga referencia en la descripción o en las reivindicaciones, a cualquier secuencia VTVSS(X)ₙ carboxiterminal (incluyendo cualquiera de los aspectos (a) a (p) anteriores), según un aspecto específico, ninguno de los aminoácidos X es un resto de cisteína.
[0234] Por ejemplo, en algunos aspectos preferidos, el extremo carboxiterminal del ISV o de la construcción que contiene el ISV (cuando este extremo carboxiterminal es un ISV derivado de VH, un VHH o un Nanocuerpo) puede ser:
[0235] (a) VTVSS(X)<n>, donde n = 1 y X = Ala;
[0236] (b) VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y cada X = Ala;
[0237] (c) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y cada X = Ala;
[0238] (d) VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y al menos un X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0239] (e) VTVSS(X)ₙ, donde n = 3 y al menos un X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0240] (f) VTVSS(X)ₙ, donde n = 3 y al menos dos X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0241] (g) VTVSS(X)<n>, donde n = 1 y X = Gly;
[0242] (h) VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y cada X = Gly;
[0243] (i) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y cada X = Gly;
[0244] (j) VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y al menos una X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0245] (k) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos una X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0246] (l) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos dos X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0247] (m)VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y cada X = Ala o Gly;
[0248] (n) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y cada X = Ala o Gly;
[0249] (o) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos una X = Ala o Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile); o
[0250] (p) VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos dos X = Ala o Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile);
[0251] prefiriéndose particularmente los aspectos (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) y (n), prefiriéndose los aspectos donde n =1 o 2 y prefiriéndose más particularmente los aspectos en los que n = 1.
[0253] También cabe señalar que, cada vez que se haga referencia en la descripción o en las reivindicaciones del presente documento a cualquier secuencia VTVSS(X)<n>carboxiterminal (incluyendo cualquiera de los aspectos (a) a (p) anteriores, según un aspecto específico, ninguno de los aminoácidos X es un resto de cisteína.
[0255] Por tanto, en un aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose Nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS<n>(X), donde n = 1 y X = Ala (o una proteína o un polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0257] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose Nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y cada X = Ala (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0259] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS<n>(X), donde n = 2 y al menos una X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0261] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS<n>(X), donde n = 3 y al menos una X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0263] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS<n>(X), donde n = 3 y al menos dos X = Ala (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0265] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose Nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y cada X = Ala (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0266] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 1 y X = Gly (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente tal Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0267] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otra) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y cada X = Gly (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0268] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otra) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y cada X = Gly (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0269] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 2 y al menos una X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0270] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos una X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0271] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos dos X = Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X entre cualquier aminoácido de origen natural, pero preferentemente seleccionándose independientemente entre Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0272] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, en donde n = 2 y cada X = Ala o Gly (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0273] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, en donde n = 3 y cada X = Ala o Gly (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0274] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o uno(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS<n>(X), en donde n = 3 y al menos una X = Ala o Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X de cualquier aminoácido de origen natural pero preferentemente seleccionándose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0275] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, donde n = 3 y al menos dos X = Ala o Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X de cualquier aminoácido de origen natural pero preferentemente seleccionándose independientemente de Val, Leu y/o Ile) (o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0277] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, en donde n = 1, 2 o 3 en donde cada X = Ala o Gly.
[0279] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, en donde:
[0280] • n = 1, 2 o 3 en donde cada X = Ala o Gly; o
[0281] • n = 2 o 3 en donde todas las X, excepto una, = Ala o Gly seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X de cualquier aminoácido de origen natural pero preferentemente seleccionándose independientemente de Val, Leu y/o Ile)
[0282] o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal).
[0284] En otro aspecto preferido, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV), que es un Nanocuerpo o un(otro) ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH (prefiriéndose nanocuerpos) que tiene un extremo carboxiterminal de la secuencia VTVSS(X)<n>, en donde:
[0285] • n = 1, 2 o 3 en donde cada X = Ala o Gly; o
[0286] • n = 2 o 3 en donde al menos una X = Ala o Gly (seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X de cualquier aminoácido de origen natural pero preferentemente seleccionándose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
[0287] • n = 2 o 3 en donde todas las X, excepto una, = Ala o Gly seleccionándose independientemente el/los resto(s) de aminoácidos restante(s) X de cualquier aminoácido de origen natural pero preferentemente seleccionándose independientemente de Val, Leu y/o Ile);
[0288] o una proteína o polipéptido que contiene dicho ISV (y preferentemente dicho Nanocuerpo) en su extremo carboxiterminal.
[0290] En los aspectos anteriores, con dicho (otro) "ISV que comprende una secuencia VH o procede de una secuencia VH" se entiende cualquier ISV que comprende una secuencia VH o que procede de una secuencia VH y que no es un Nanocuerpo (es decir, no es un VHH, VHH humanizado o VH camelizado). Por ejemplo, dicho (otro) ISV puede ser, por ejemplo, un anticuerpo de dominio (único) basado en VH, un dAb<™>basado en VH o un microcuerpo basado en VH (véase el documento WO 00/29004).
[0292] De nuevo, cabe señalar que, cada vez que uno de los ISV mencionados en el presente documento tenga una secuencia carboxiterminal VTVSS(X)ₙ (incluyendo, sin limitación, los ISV mencionados en los aspectos anteriores), según un aspecto específico, ninguno de los aminoácidos X en la secuencia VTVSS(X)ₙ es un resto de cisteína.
[0293] Como se describe adicionalmente en el presente documento, cualquiera de dichas proteínas o polipéptidos puede ser, por ejemplo, una construcción que contenga dos o más ISV (tal como dos o más nanocuerpos), opcionalmente unidos mediante uno o más enlazadores adecuados. Por tanto, por ejemplo, dicha construcción puede ser una construcción bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente (tal como una construcción de Nanocuerpo bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente) y puede ser, por ejemplo, una construcción bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente (tal como una construcción de Nanocuerpo bivalente, trivalente, tetravalente o pentavalente) que sea bispecífica, trispecífica o biparatópica (incluyendo, por ejemplo, construcciones monoespecíficas, biespecíficas o biparatópicas que también puedan unirse a la seroalbúmina (proteína preferida) o a otra proteína sérica para ampliar la semivida.
[0295] De nuevo, los nanocuerpos, ISV y proteínas/polipéptidos de acuerdo con cada uno de los aspectos descritos anteriormente, son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la unión al anticuerpo 21-4 inferior a 500 (determinado de acuerdo con el protocolo expuesto en el Ejemplo 9, y después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular del ISV o de la proteína utilizado de acuerdo con la fórmula expuesta anteriormente).
[0297] Como se menciona en el presente documento, también se contempla que la invención, tal como se define en las reivindicaciones, también se pueda aplicar a otras proteínas o polipéptidos (y en particular a fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab u otras proteínas o polipéptidos basados en fragmentos de anticuerpo, tales como scFv) que tienen un dominio VH en su extremo carboxiterminal. Por tanto, en otro aspecto, la invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere a una proteína o polipéptido de este tipo (tal como un scFv) que tiene un dominio VH en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS<n>(X) (SEQ ID NO:34) en su extremo carboxiterminal, en donde n es de 1 a 10, preferentemente de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5, y en donde cada X es un resto de aminoácido (preferentemente de origen natural) que se selecciona independientemente (y preferentemente se selecciona independientemente del grupo que consiste en alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) o isoleucina (I). De nuevo, de acuerdo con algunos aspectos específicos, dicho extremo carboxiterminal puede ser de acuerdo con cualquiera de (a) a (p) anteriores, y preferentemente de acuerdo con uno de (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) o (n), siendo n 1, 2 o 3 y preferentemente 1 o 2.
[0299] De nuevo, dichas proteínas o polipéptidos son preferentemente tales que tienen un valor de UR para la unión al anticuerpo 21-4 inferior a 500 (determinado de acuerdo con el protocolo expuesto en el Ejemplo 9, y después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular del ISV o de la proteína utilizado de acuerdo con la fórmula expuesta anteriormente). Además, de nuevo, de acuerdo con un aspecto específico de este aspecto, ninguno de los aminoácidos X en la secuencia carboxiterminal
[0300] VTVSS(X)<n>es un resto de cisteína.
[0302] La invención, como se define en las reivindicaciones, se refiere además a una composición farmacéutica que comprende un ISV (y preferentemente un ISV terapéutico) o una proteína o polipéptido que comprende al menos un ISV (y preferentemente al menos un ISV terapéutico), en donde dicho ISV, proteína o polipéptido es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, proteína o polipéptido de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular, de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en las páginas anteriores; y más en particular un ISV, proteína o polipéptido que tiene un extremo/secuencia carboxiterminal que es de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento), y al menos un portador, diluyente o excipiente adecuado (es decir, adecuado para uso farmacéutico), y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales. Dichas composiciones, portadores, diluyentes o excipientes pueden ser, por ejemplo, como se describe en el documento WO 08/020079 para composiciones farmacéuticas que comprenden un Nanocuerpo o una proteína o polipéptido que comprende al menos un Nanocuerpo (y como ya se ha mencionado, de acuerdo con la presente invención tal como se define en las reivindicaciones, el ISV también es preferentemente un Nanocuerpo).
[0304] La invención, como se define en las reivindicaciones, se refiere además a un ISV o a una proteína o polipéptido que comprende al menos un ISV para su uso en la terapia de una enfermedad en un ser humano (por ejemplo, un paciente que necesita dicha terapia), en donde dicho ISV, proteína o polipéptido es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, proteína o polipéptido de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular, de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en las páginas anteriores; y más en particular un ISV, proteína o polipéptido que tiene un extremo/secuencia carboxiterminal que es de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento).
[0306] La invención, como se define en las reivindicaciones, se refiere además al uso de un ISV o de una proteína o polipéptido que comprende al menos un ISV, en la preparación de una composición farmacéutica, en donde dicho ISV, proteína o polipéptido es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, proteína o polipéptido de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular, de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en las páginas anteriores; y más en particular un ISV, proteína o polipéptido que tiene un extremo/secuencia carboxiterminal que es de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento).
[0308] La invención, como se define en las reivindicaciones, se refiere además a un uso terapéutico, que comprende administrar a un sujeto humano (por ejemplo, a un paciente que necesite dicho tratamiento) un ISV o una proteína o polipéptido que comprende al menos un ISV en la preparación de una composición farmacéutica, en donde dicho ISV, proteína o polipéptido es como se describe adicionalmente en el presente documento (es decir, un ISV, proteína o polipéptido de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento, y en particular de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en las páginas anteriores; y más en particular un ISV, proteína o polipéptido que tiene un extremo/secuencia carboxiterminal que es de acuerdo con uno o más de los aspectos descritos en el presente documento); o una composición farmacéutica (como se ha descrito anteriormente) que comprende al menos uno de dicho ISV, proteína o polipéptido.
[0310] Con respecto a lo anterior, quedará claro que el uso terapéutico de los ISV, de las proteínas y de los polipéptidos descritos en el presente documento, son un aspecto muy importante de la invención, tal y como se define en las reivindicaciones, ya que dicho uso terapéutico (o el desarrollo clínico de dichos ISV, proteínas y polipéptidos para dicho uso terapéutico) puede implicar el uso de ensayos de ADA para determinar si dicho ISV, proteína o polipéptido es inmunogénico (es decir, puede generar los ADA cuando se administran a un sujeto humano). A este respecto, también quedará claro que las preocupaciones sobre la posible inmunogenicidad deberán abordarse en particular cuando se utilice un agente terapéutico durante periodos de tiempo más largos (semanas, meses o años) y/o tenga una semivida (preferentemente expresada como t1/2-beta) en un sujeto humano de al menos 3 días, tal como de al menos una semana, y hasta 10 días o más. Cualquier referencia a métodos de tratamiento se considera como una referencia a los compuestos y composiciones de la presente invención para su uso en un método de tratamiento practicado en el cuerpo humano/animal.
[0312] Por tanto, de acuerdo con un aspecto específico de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, un ISV, una proteína, un polipéptido o una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, está destinado a su uso en el tratamiento de una enfermedad crónica en un ser humano, y/o dicho ISV, proteína o polipéptido, tal como se describe en el presente documento, pretende estar presente en la circulación del sujeto (es decir, a niveles farmacológicamente activos) al que se administra (es decir, a una dosis terapéuticamente activa) durante al menos un periodo de una semana, preferentemente al menos dos semanas, tal como al menos un mes; y/o dicho ISV, proteína o polipéptido, como se describe en el presente documento, es tal que tiene una semivida (preferentemente expresada como t1/2-beta) en un sujeto humano de al menos 3 días, tal como de al menos una semana, y hasta 10 días o más; y/o dicho ISV, proteína, polipéptido o composición farmacéutica, como se describe en el presente documento, pretende administrarse a un ser humano en dos o más dosis administradas durante un periodo de al menos 3 días, tal como de al menos una semana, por ejemplo, de al menos dos semanas o de al menos un mes, o incluso durante períodos más prolongados (es decir, al menos 3 meses, al menos 6 meses o al menos un año), o incluso de forma crónica.
[0314] La invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere además a un método para reducir (sustancialmente) o eliminar esencialmente, la tendencia de un ISV, un Nanocuerpo o un fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, a generar interferencia de proteínas, comprendiendo dicho método al menos las etapas de:
[0315] • opcionalmente determinar la tendencia del ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, a generar interferencia de proteínas, usando un método que comprende al menos las etapas (i) y (ii) a las que se hace referencia en el presente documento;
[0316] • modificar dicho ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en dicho ISV o Nanocuerpo, o en el ISV o Nanocuerpo carboxiterminal (si lo hubiere) del fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo; y en particular introduciendo una o más sustituciones o adiciones de aminoácidos en la región carboxiterminal de dicho ISV o Nanocuerpo, o en la región carboxiterminal del ISV o Nanocuerpo carboxiterminal (si lo hubiere) del fármaco basado en ISV o en Nanocuerpo, por ejemplo, mediante la adición al extremo carboxiterminal de la secuencia de 1 a 10, tal como de 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 o 5 restos de aminoácidos, seleccionados cada uno independientemente entre cualquier aminoácido de origen natural (como los enumerados en la Tabla A-2 de la página 64 del documento WO 09/138519, por ejemplo y sin limitación, alanina, glicina, valina, leucina o isoleucina);
[0317] • determinar la tendencia del ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo así modificado a generar interferencia de proteínas, utilizando un método que comprende al menos las etapas (i) y (ii) a las que se hace referencia en el presente documento; opcionalmente de una manera que permita comparar la tendencia del ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo así modificado a generar interferencia de proteínas con la tendencia del ISV, Nanocuerpo, fármaco basado en ISV o fármaco basado en Nanocuerpo original a generar interferencia de proteínas (incluyendo, sin limitación, su comparación en un ensayo de competición para la unión al anticuerpo analítico tal como se describe en el presente documento). Como alternativa, puede utilizarse el método descrito en el presente documento que implica el uso del anticuerpo 21-4.
[0319] La invención se describirá ahora adicionalmente mediante los siguientes aspectos, ejemplos y figuras preferidos y no limitativos.
[0320] • Las figuras 1A a 1C muestran esquemáticamente algunos ejemplos no limitativos de formatos de ensayo de ADA. En el Ejemplo 4 se mencionan algunos protocolos representativos pero no limitativos para realizar estos ensayos.
[0321] • La figura 2 muestra esquemáticamente una estructura tridimensional representativa de un ISV, tal como un Nanocuerpo.
[0322] • La figura 3 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB (Nanocuerpos) 3.4 a 3.9 (SEQ ID NO: 5 a 10) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0323] • La figura 4 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB 3.4, 3.11, 3.12 y 3.13 (SEQ ID NO: 5, 12, 13 y 14) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0324] • La figura 5 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB 3.4, 3.14 y 3.15 (SEQ ID NO: 5, 15 y 16) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0325] • La figura 6 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB 3.1, 3.2 y 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0326] • La figura 7 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB 4.1 y 4.2 (SEQ ID NO: 17 y 18) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0327] • La figura 8 es una curva de unión (obtenida usando el ensayo BIACORE descrito en el Ejemplo 3) que muestra la unión de los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 (SEQ ID NO 19 a 22) al anticuerpo policlonal inmovilizado obtenido en el Ejemplo 2.
[0328] • La figura 9 proporciona una Tabla que muestra las secuencias utilizadas en el Ejemplo 8 (SEQ ID NO: 37 a 89) y presenta la secuencia de referencia correspondiente.
[0330] Las secuencias a las que se hace referencia en la presente descripción y en las reivindicaciones, se enumeran en la Tabla A a continuación (SEQ ID NO: 1 a 37) y en la figura 9 (SEQ ID NO: 38 a 89).
[0332] TABLA A
[0334]
[0335] TABLA A continuación
[0336]
[0337] TABLA A continuación
[0338]
[0339] TABLA A continuación
[0340]
[0341] TABLA A continuación
[0342]
[0343] TABLA A continuación
[0345]
[0347] Parte experimental:
[0348] Ejemplo 1: Generación de un anticuerpo analítico policlonal.
[0349] Un anticuerpo policlonal (fracción de IgG), que puede utilizarse como el "anticuerpo analítico", se generó de la siguiente manera:
[0350] A. Identificación de muestras de plasma adecuadas para aislar el anticuerpo policlonal
[0351] Se evaluaron veinte muestras de plasma de individuos sanos que nunca se trataron con un ISV, para determinar la presencia de anticuerpos frente a ISV que pueden usarse como anticuerpo analítico en la invención.
[0352] El ISV que se utilizó inicialmente en este Ejemplo fue el de la SEQ ID NO: 1. Posteriormente, para confirmar que la interacción no es específica de este ISV en particular, sino una interacción específica entre proteínas que puede ocurrir con varios ISV, se repitieron los ensayos que se indican a continuación con otros ISV (véase el párrafo C) más adelante). Como alternativa a la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, también puede utilizarse la SEQ ID NO: 2. El ensayo utilizado fue un ensayo de tipo puente basado en EQL (electroquimioluminiscencia) que empleaba ISV biotinilado (una variante biotinilada de SEQ ID NO:1) para capturar e ISV etiquetado con sulfonato (sulfo-tagged) para detectar anticuerpos contra fármaco. También se utilizó un formato similar para realizar ensayos de ADA. La biotinilación y el etiquetado con sulfonato del ISV se realizaron utilizando química de acoplamiento estándar en aminas primarias usando Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce) y éster NHS de etiqueta con sulfonato (MSD), respectivamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de plasma se diluyeron 1/5 en PBS/caseína al 0,1 % y se incubaron durante 30 minutos a 37°C, 600 RPM en placas de polipropileno de 96 pocillos. A continuación, las muestras (50 µl) se diluyeron 1/3 en una mezcla 1:1 (100 µl) de 2 µg/ml de ISV biotinilado y 2 µg/ml etiquetado con sulfonato (SEQ ID NO:1) y se incubaron durante 1 hora a TA, 600 RPM. Placas MSD MA<®>de 96 pocillos estándar de estreptavidina se bloquearon con 150 µl por pocillo de Superblock<®>T20 durante 1 hora a TA y posteriormente se lavaron 3 veces con PBS/Tween20 al 0,05 % (=tampón de lavado). La muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y etiquetado con sulfonato (SEQ ID NO: 1) (50,0 µl) se transfirió de la placa de polipropileno a la placa MSD y se incubó durante 1 hora a TA, 600 rpm. Las placas se lavaron tres veces antes de la adición de tampón de lectura 2 veces (MSD) (150 µl/pocillo) y la lectura de las unidades de electroquimioluminiscencia (UEQL) se realizó en un instrumento MSD (lector Sector Imager 2400). Las muestras se evaluaron como positivas o negativas utilizando el punto de corte de exploración determinado durante la validación del método. El punto de corte de exploración se calculó basándose en los valores de fondo de 118 muestras de plasma individuales de individuos sanos que nunca fueron tratados con un ISV, utilizando un análisis estadístico apropiado, conforme a las directrices para el desarrollo de ensayos de ADA (Shankar, 2008). Se utilizó una evaluación no paramétrica y el valor de corte se calculó basándose en el percentil 95, después de la exclusión de valores atípicos.
[0353] Seis muestras de plasma se puntuaron claramente como positivas: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 y IHuP#002-001-ABL-20 (Tabla I).
[0354] Estas muestras se analizaron adicionalmente en un ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco (ensayo de confirmación) para confirmar la especificidad del resultado positivo de la exploración (Tabla II). Por lo tanto, las muestras se diluyeron 1/5 en PBS/caseína al 0,1 % que contenía ISV 12,5 µg/ml (SEQ ID NO:1) y se incubaron durante 30 minutos a 37°C, 600 RPM en placas de polipropileno de 96 pocillos. A continuación, las muestras (50 µl) se diluyeron 1/3 en una mezcla 1:1 (100 µl) de 2 µg/ml de ISV biotinilado y 2 µg/ml etiquetado con sulfonato (SEQ ID NO:1) y se incubaron durante 1 hora a TA, 600 RPM. Posteriormente, la muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y etiquetado con sulfonato) (50,0 µl) se transfirió de la placa de polipropileno a la placa estándar de 96 pocillos de MSD MA<®>con estreptavidina bloqueada como se ha descrito anteriormente para el ensayo de exploración y se incubó durante 1 hora a TA, 600 rpm. Las placas se lavaron tres veces antes de la adición de 2 x tampón de lectura (MSD) (150 µl/pocillo) y realizar la lectura de las unidades de electroquimioluminiscencia (UEQL) en un instrumento MSD (lector Sector Imager 2400). Las muestras se confirmaron como verdaderos positivos utilizando el punto de corte de confirmación determinado durante la validación del método y se calculó sobre la respuesta de EQL de 118 muestras de plasma individuales de individuos sanos que nunca fueron tratados con ISV, a las que se añadieron 50 µg/ml de ISV (SEQ ID NO:1) utilizando un análisis estadístico apropiado, conforme a las directrices para el desarrollo de ensayos de ADA (Shankar, 2008). Se calculó una reducción mínima de la señal del 50 % basándose en el intervalo de confianza del 99 %.
[0356] Las muestras que fueron positivas en el ensayo de tipo puente basado en EQL y que se confirmaron como positivas en el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco, se seleccionaron como una fuente para generar el anticuerpo policlonal usando cromatografía de afinidad.
[0358] Tabla I: resultados de ex loración de 20 muestras de lasma en el ensa o ISV de ADA.
[0360]
[0361] Tabla II: Confirmación de las muestras de plasma evaluadas como positivas en el ensayo de confirmación. Para la evaluación de los resultados se utilizó un punto de corte de confirmación del 50 %. Una muestra no se confirmó como una muestra ositiva verdadera
[0363]
[0365] También se evaluaron otras tres muestras de suero de individuos que no se habían tratado con un ISV usando el ensayo de tipo puente basado en EQL descrito anteriormente y se confirmó utilizando el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco.
[0366] Se puntuaron claramente dos muestras de suero como positivas en el ensayo de tipo puente basado en EQL: IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311A20 (Tabla III). Las 2 muestras evaluadas como positivas también se analizaron en el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco para confirmar la especificidad del resultado positivo de la exploración.
[0367] Tabla III: Resultados de exploración y de confirmación de 3 muestras de suero y de la fracción purificada de I G corres ondiente
[0369]
[0371] B. Generación de la fracción de IgG policlonal purificada.
[0372] A partir de las muestras IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311A20 (véase anteriormente), se purificó una IgG policlonal utilizando columnas HP Spin Trap de proteína G (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, después de eliminar la solución de almacenamiento de la columna mediante centrifugación (30 s a 100 x g), la columna se equilibró añadiendo tampón de unión (fosfato de sodio 20 mM, pH 7,0). Después de la centrifugación, se añadió la solución que contenía el anticuerpo policlonal deseado (máx.1 mg en 600 µl) y la columna se incubó durante 4 min mientras se mezclaba suavemente. A continuación, la columna se centrifugó y se lavó 2 veces mediante la adición sucesiva de tampón de unión (600 µl) seguida de centrifugación. Después de la adición de 400 µl de tampón de elución (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,7) y la mezcla por inversión, el anticuerpo se eluyó por centrifugación en 30 µl de tampón de neutralización (Tris-HCl 1 M, pH 9,0).
[0373] Para confirmar que la fracción de IgG así obtenida estaba implicada en la unión específica al (o a los) ISV, el anticuerpo de IgG purificado se analizó en el ensayo de tipo puente basado en EQL descrito anteriormente y se confirmó utilizando el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco empleado en el apartado A) anterior. En ambas muestras (IHUS#B09032311A3 e IHUS#B09032311A20), se confirmó que el anticuerpo de IgG purificado estaba implicado en la unión específica que conducía a una señal positiva en los ensayos (Tabla III). Esto confirmó que la IgG policlonal purificada podría usarse como un "anticuerpo analítico", y se empleó tal cual en (los ensayos de) los Ejemplos 3 y 5.
[0374] C. Unión específica a otros ISV
[0375] Para determinar si la interferencia de proteínas observada es específica de un único ISV, y/o específica de una región, epítopo o determinante antigénico particular en los ISV, y/o de determinadas mutaciones realizadas en los ISV de tipo natural (wildtype) (tal como una o más mutaciones de humanización), el ensayo de tipo puente basado en EQL y el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco (ambos como se describe en el apartado A) anterior, utilizando la SEQ ID NO: 1 como ISV etiquetado con sulfonato) se repitieron utilizando las muestras de plasma IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 e IHUS#B09032311A1. Dado que estas muestras de plasma contienen el anticuerpo "analítico" policlonal aislado en el apartado B) anterior, esto también proporciona información sobre la especificidad, selectividad y reconocimiento de epítopos del anticuerpo analítico policlonal. Se evaluaron 8 ISV (SEQ ID NO 23 a 30, respectivamente - véase la Tabla A anterior), de los cuales uno era un VHH de tipo natural (SEQ ID NO: 23) y los otros 7 ISV eran versiones humanizadas de la secuencia de tipo natural con diferentes sustituciones de humanización. Dos ISV (SEQ ID NO: 29 y 30) también contenían restos de aminoácidos adicionales en el extremo carboxílico (1 y 3 restos de alanina adicionales, respectivamente).
[0376] Los datos se muestran en la Tabla IV. Sin limitarse a ninguna explicación ni hipótesis, puede observarse que los cambios en la región carboxiterminal (como se define en el presente documento) pueden influir, aparentemente, de manera significativa, en el grado en que las muestras de plasma utilizadas pueden generar interferencia de proteínas. Por ejemplo, puede observarse que la adición de uno o tres restos de aminoácidos en el extremo carboxílico puede reducir de manera significativa la tendencia a que se genere interferencia de proteínas (por ejemplo, solo una reducción del 18 y del 13 % en el ensayo de UEQL con la muestra IHUS#B09032311A3 para las SEQ ID NO: 29 y 30, en comparación con una reducción del 90 % para la SEQ ID NO: 28, la variante humanizada correspondiente sin ningún resto de aminoácido añadido al extremo carboxílico). De manera similar, la introducción de un resto de prolina en la posición 14 de la secuencia de tipo natural también puede influir, aparentemente, de manera significativa, en el grado en que las muestras de plasma utilizadas pueden generar interferencia de proteínas (por ejemplo, solo una reducción del 20 % en el ensayo de UEQL con la muestra IHUS#B09032311A3 para la secuencia de tipo natural de SEQ ID NO: 23, en comparación con una reducción del 91 % para la SEQ ID NO: 24, la secuencia de tipo natural con una sustitución A14P). K83R y Q108L, que también son sustituciones cercanas a la región carboxiterminal, también conducen a determinado aumento en la tendencia a generar interferencia de proteínas , pero no tanto como la sustitución A14P, y el efecto combinado total de las sustituciones A14P+K83R+Q108L puede anularse añadiendo uno o más restos de aminoácidos al extremo carboxílico (comparar de nuevo los datos de las SEQ ID NO: 29 y 30 con los datos de las otras variantes humanizadas).
[0377] Basándose en estos datos, también se concluyó que aparentemente, el anticuerpo analítico policlonal reconocía generalmente la región carboxiterminal (como se define en el presente documento) de los ISV. Como puede observarse en la figura 2, la posición 14 (y en menor medida, las posiciones 83 y 108) también forman parte de la región carboxiterminal de un ISV (cuando se tiene en cuenta la estructura ternaria tridimensional de un ISV).Tabla IV: Evaluación de diferentes variantes de Nanocuerpo como competidores en el ensayo ISV de ADA usando el anticuer o analítico.
[0379]
[0380] Tabla IV (continuación)
[0382]
[0385] Ejemplo 2: purificación por afinidad del anticuerpo analítico
[0387] Este ejemplo describe dos métodos que pueden utilizarse para aislar, de un líquido biológico de un sujeto humano, un anticuerpo analítico capaz de reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV. El anticuerpo se aísla de 4 muestras de suero diferentes, que se caracterizaron por inducir una señal positiva en un ensayo de ADA según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
[0389] Partiendo de muestras de suero, cada uno de estos protocolos proporciona una preparación purificada de factor(es) de interferencia que puede(n) utilizarse como anticuerpo analítico en los métodos descritos en el presente documento. Estos métodos también pueden utilizarse de manera más general para purificar el/los factor(es) de interferencia con otros fines (por ejemplo, los factor(es) de interferencia purificados utilizando los protocolos que se describen a continuación se emplearon también experimentalmente en el Ejemplo 8 para demostrar que la unión a un ISV o a una construcción de ISV por el anticuerpo monoclonal 21-4 es predictiva de la unión del mismo ISV o construcción de ISV por los factores de interferencia, y por tanto de la tendencia de dicho ISV o construcción de ISV a experimentar interferencia específica de proteínas en un ensayo de ADA).
[0390] Ejemplo 2A: purificación utilizando proteína A y cromatografía de afinidad
[0392] En una primera etapa, la fracción de anticuerpo de IgG se enriqueció a partir de las muestras de suero usando cromatografía de afinidad de proteína A. Las columnas habituales que se utilizaron para este enriquecimiento incluyeron HiTrap MabselectSure y MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). La purificación de los anticuerpos de IgG de las muestras de suero se realizó de una manera automatizada y similar en todos los experimentos. Las cromatografías se realizaron en los sistemas purificadores AKTA (GE Healthcare) y se registraron en tiempo real utilizando el programa informático de purificación de proteínas UNICORN (GE Healthcare). Resumiendo, la muestra de suero se diluyó 1:1 con D-PBS (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco) y se filtraron 0,22 µm antes de aplicarla en la columna a un caudal constante de 0,5 ml/min. La columna se lavó para eliminar los componentes de unión no específicos en 5 volúmenes de columna utilizando D-PBS a un caudal de 0,5 ml/min. La fracción de IgG se eluyó mediante elución ácida, utilizando tampón de glicina 100 mM pH 2,6 y un caudal de 0,5 ml/min. Después de la elución, las fracciones se neutralizaron utilizando tampón Tris 1,5 M pH 8,8. Para confirmar el aislamiento de anticuerpos de IgG en la elución, se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE,Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel Electrophoresis).
[0393] En una segunda etapa, las IgG interferentes se enriquecieron adicionalmente aplicando la fracción de IgG purificada con proteína A de los 4 sueros diferentes sobre columnas de afinidad acopladas a ISV. Más específicamente, las IgG interferentes se enriquecieron adicionalmente uniéndose a una columna que contenía un ISV con secuencia de SEQ ID NO: 1. Para ello, el ISV se unió covalentemente a Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) utilizando el método de acoplamiento con CNBr (bromuro de cianógeno) conforme al procedimiento del fabricante. La purificación por afinidad se realizó de manera automatizada y similar en todos los experimentos. Las cromatografías se realizaron en los sistemas purificadores AKTA y se registraron en el programa informático UNICORN. Resumiendo, la muestra de IgG enriquecida (hasta 10 ml de volumen de carga) se aplicó sobre la columna a un caudal constante de 0,5 ml/min. La columna se lavó para eliminar los componentes de unión no específicos en 5 volúmenes de columna utilizando D-PBS a un caudal de 0,5 ml/min. Los componentes de unión a ISV se eluyeron mediante elución ácida, utilizando tampón de glicina 100 mM pH 2,6 y un caudal de 0,5 ml/min. Después de la elución, las fracciones se neutralizaron utilizando tampón Tris 1,5 M pH 8,8. Las fracciones se analizaron utilizando SDS-PAGE que confirmó el aislamiento de anticuerpos de IgG en la elución (datos no mostrados).
[0394] Estas fracciones se agruparon y se utilizaron para análisis posteriores tales como los descritos en el Ejemplo 3.
[0395] Ejemplo 2B: purificación mediante cromatografía CaptureSelect™.
[0396] Como alternativa, el/los factor(es) de interferencia se recuperaron del plasma y se purificaron utilizando la resina de afinidad de unión a IgA disponible en el comercio CaptureSelect hIgA<™>(BAC BV), que se basa en dominios variables únicos de cadena pesada (VHH) derivados de camélidos. La 'fracción de IgA' recogida, que contenía IgA junto con IgG interferente, se cargó posteriormente en una columna de proteína A para eliminar la fracción de IgA. La columna de proteína A se procesó conforme a condiciones genéricas de purificación de IgG (tampón de ejecución: PBS; tampón de elución: glicina 100 mM pH = 2,7; neutralización posterior a la elución mediante Tris 1 M). El factor de interferencia se recuperó de la elución de Proteína A con un rendimiento >95 %.
[0397] En una variación de este método, se utilizó otra resina de afinidad CaptureSelect (resina antitripsina alfa-1 CaptureSelect, una resina de afinidad disponible en el comercio basada en VHH, que no se dirige a ninguna proteína relacionada con anticuerpos). Esta resina proporcionó una alta eficacia de unión al factor de interferencia y permitió una elución selectiva en 2 etapas: la antitripsina se eluyó a pH neutro utilizando MgCl₂ 2,0 M, seguida de la elución del factor de interferencia mediante una etapa ácida (glicina 0,1 M, pH 3,0, similar a las condiciones de elución de Proteína A/G; neutralización utilizando Tris 1,5 M). Esta purificación en una sola etapa produjo hasta 15 µg de IgG1 interferente por ml de plasma con alta interferencia, lo que corresponde aproximadamente al 0,3 % del total de IgG presente. Opcionalmente, la fracción de interferencia neutralizada puede desalinizarse y purificarse adicionalmente mediante una columna de exclusión por tamaño equilibrada en D-PBS.
[0398] Ejemplo 3: Influencia de diferentes sustituciones en el ISV sobre la tendencia del ISV a generar interferencia de proteínas
[0399] Como se ha mencionado en la descripción anterior, la presente invención pone a disposición determinados ensayos y técnicas que permiten evaluar si un ISV dado tiene o no tendencia a generar interferencia de proteínas. Estos incluyen el ensayo de tipo puente basado en EQL y el ensayo de configuración de desplazamiento de fármaco utilizados en el Ejemplo 1, así como el ensayo BIACORE descrito en este Ejemplo 3 y el ensayo de ADA de tipo puente/competencia descrito en los ejemplos adicionales que se detallan a continuación.
[0400] Como también se mencionó en la descripción anterior, estos ensayos también pueden utilizarse para determinar si cambios específicos (tales como deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos) pueden influir (y preferentemente reducir) la tendencia de un ISV dado a generar interferencia de proteínas. Algunos de estos cambios serán o resultarán evidentes para el experto basándose en la divulgación del presente documento y en los datos experimentales mostrados en el Ejemplo 1 y en este Ejemplo 3.
[0401] Como ya indican los datos generados en el Ejemplo 1, parece que determinadas mutaciones en, o cerca de, la región carboxiterminal (como se define en el presente documento) de un ISV, pueden influir (de manera significativa) en su tendencia a generar interferencia de proteínas. Por ejemplo, la adición de unos pocos restos de aminoácidos al extremo carboxílico (tal como 1 o 3 restos de alanina) parece reducir fuertemente la tendencia de un ISV a generar interferencia de proteínas, y parece incluso ser capaz de negar la presencia de otras sustituciones (por ejemplo, en o cerca de la región carboxiterminal) que parecen aumentar la tendencia a generar interferencia de proteínas (por ejemplo, una sustitución A14P).
[0402] En este Ejemplo 3, se investigó tanto el efecto de otras sustituciones como el efecto de añadir aminoácidos adicionales al extremo carboxílico comparando ISV relacionados con diferentes sustituciones, utilizando el anticuerpo policlonal analítico generado en el Ejemplo 2. El análisis se realizó midiendo la cinética de la interacción entre cada uno de los ISV investigados y el anticuerpo policlonal analítico mediante resonancia de plasmón superficial (SPR,surface Plasmon resonance) utilizando el biodetector Biacore<™>T100 de GE Healthcare. Los ISV evaluados en este ejemplo 3 fueron los de las SEQ ID NO 3 a 22 (véase la Tabla A anterior y la Tabla V más adelante).
[0403] En un experimento típico, se preparó una solución de anticuerpo policlonal a 10 µg/ml en NaOAc 10 mM pH 5,0. A continuación, este anticuerpo policlonal se inmovilizó en un chip detector CM5 usando acoplamiento de aminas mediante el método EDC/NHS (EDC=N-etil-N'-[3-dietilamino-propil]-carbodiimida; NHS=N-hidroxisuccinimida) conforme al procedimiento del fabricante. La cantidad inmovilizada proporcionó aproximadamente 2700 unidades de respuesta (UR). A continuación, se inyectó una concentración constante de 500 nM de ISV sobre la superficie durante 120 segundos a un caudal de 45 µl por minuto. Dado que no se pudo identificar un tampón de regeneración eficaz, el tiempo de disociación se prolongó hasta 2400 segundos. La señal obtenida al inyectar el ISV sobre una cubeta de flujo en blanco se restó de la señal obtenida al inyectar el ISV sobre la cubeta de flujo con el anticuerpo policlonal unido. La cubeta de flujo en blanco se activó/desactivó de manera similar a la cubeta de flujo para el anticuerpo policlonal, pero sin añadir proteína. Además, una inyección en blanco (HBS-EP tampón de ejecución (HBS= (solución salina tamponada con Hepes (Hepes Buffered Saline): GE Healthcare) se restó para corregir posibles desviaciones del valor inicial (baseline).
[0404] Para examinar el efecto de añadir restos de aminoácidos al extremo carboxílico, se investigó la influencia de añadir 1 o 2 alaninas y 1, 2 o 3 glicinas comparando la unión de ISV con las diferentes adiciones, utilizando un anticuerpo policlonal analítico generado como se describe en el Ejemplo 2. Los ISV generados y analizados con esta finalidad fueron los NB 3.4 a 3.9 (SEQ ID NO: 5 a 10).
[0405] Como ejemplos representativos del tipo de datos obtenidos, la figura 3 muestra la unión de los NB 3.4 a 3.9 al anticuerpo policlonal inmovilizado. La Tabla V resume los resultados obtenidos.
[0406] TABLA V
[0408]
[0410] Para examinar el efecto de (otras) sustituciones en la región carboxiterminal, se investigó la influencia de diferentes sustituciones comparando ISV relacionados que contenían estas sustituciones, utilizando el mismo anticuerpo policlonal analítico descrito anteriormente. El análisis se realizó como se ha descrito anteriormente.
[0411] Los ISV que se analizaron y que contenían dichas sustituciones fueron los NB 3.1, 3.2 y 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 y 5); los NB 3.10 a 3.15 (SEQ ID NO: 11 a 16), que se compararon con el NB 3.4; los NB 4.1 y 4.2 (SEQ ID NO:17 y 18) y los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 (SEQ ID NO: 19 a 22).
[0412] Como ejemplos representativos del tipo de datos obtenidos:
[0413] • La figura 4 muestra la unión de los NB 3.4, 3.11, 3.12 y 3.13 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
[0414] • La figura 5 muestra la unión de los NB 3.4, 3.14 y 3.15 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
[0415] • La figura 6 muestra la unión de los NB 3.1, 3.2 y 3.4 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
[0416] • La figura 7 muestra la unión de los NB 4.1 y 4.2 al anticuerpo policlonal inmovilizado;
[0417] • La figura 8 muestra la unión de los NB 6.1, 6.2, 6.4 y 6.5 al anticuerpo policlonal inmovilizado.
[0418] En las Tablas VI, VII y VIII se resumen los resultados obtenidos.
[0419] TABLA VI
[0421]
[0422]
[0424] TABLA VII
[0426]
[0428] TABLA VIII
[0430]
[0432] De nuevo, sin limitarse a ninguna hipótesis ni explicación específica, los datos mostrados anteriormente muestran que (diversas) sustituciones en la región carboxiterminal (como se define en el presente documento) de un ISV pueden alterar/mejorar su tendencia a generar interferencia de proteínas.
[0433] Ejemplo 4: protocolos representativos para realizar los ensayos de ADA de la Figura 1.
[0434] Este ejemplo proporciona algunas condiciones representativas pero no limitativas que podrían utilizarse para realizar los ensayos de ADA competitivos/de tipo puente mostrados esquemáticamente en la Figura 1:
[0435] • Ensayo de ADA de la Figura 1A en solución: Muestras en 100 % de matriz, 30', 37°C, tratamiento ácido utilizando ácido acético en una matriz 10, 5', TA, preincubación/neutralización del ácido de la muestra: ISV-Sulfo (:Tris) 1:1:1 (1: 0,9:0,9: 0,1), 1 h, TA; en la placa 1 h, TA; lavado 3x, tampón de lectura 4X • Ensayo de ADA de la Figura 1B en solución: Muestras en 20 % de matriz, 30', 37°C, preincubación de la muestra: ISV- -Sulfo 1:1:1, 1 h, TA, en la placa 1 h, TA, lavado 3x, tampón de lectura 2x
[0436] • Ensayo de ADA secuencial de la Figura 1C: Captura de ISV-Bio, 1 h, TA, lavado 3X, muestras en 20 % de matriz, 15', TA, en la placa: 2 h, TA, lavado 3X, reactivo de detección ALX-0141-Sulfo, 1 h, TA, lavado 3x, tampón de lectura 4X
[0437] Ejemplo 5: Predicción de la sensibilidad del ISV a la interferencia específica de proteínas utilizando el anticuerpo analítico.
[0438] Este ejemplo describe un ensayo de ADA de tipo puente/competición con el anticuerpo analítico que puede utilizarse para predecir la sensibilidad de un ISV frente a la interferencia específica de proteínas.
[0439] El ISV que se va a evaluar se diluye a una concentración de 10 µg/ml y se incuba con el anticuerpo analítico a 400 ng/ml, se purifica según el Ejemplo 2, y se incuba a 37°C a 600 rpm en placas de polipropileno de 96 pocillos. A continuación, la muestra (50 µl) se diluyó 1/3 en una mezcla 1:1 (100 µl) de 2 µg/ml de ISV biotinilado y 2 µg/ml etiquetado con sulfonato y se incubó durante 1 hora a TA, 600 RPM. Placas MSD MA<®>de 96 pocillos estándar de estreptavidina se bloquearon con 150 µl por pocillo de Superblock<®>T20 durante 1 hora a TA y posteriormente se lavaron 3 veces con PBS/Tween20 al 0,05 % (= tampón de lavado). La muestra/mezcla 1:1 (ISV biotinilado y etiquetado con sulfonato (50,0 µl) se transfirió de la placa de polipropileno a la placa MSD y se incubó durante 1 hora a TA, 600 rpm. Las placas se lavaron tres veces antes de la adición de tampón de lectura 2 veces (MSD) (150 µl/pocillo) y la lectura de las unidades de electroquimioluminiscencia (ECLU) se realizó en un instrumento MSD (lector Sector Imager 2400).
[0440] Usando este ensayo, se analizaron y compararon los ISV de las SEQ ID NO 23 a 30. Los datos se muestran en la Tabla IX. Estos datos no solo muestran que el ensayo descrito en este Ejemplo puede usarse para predecir la tendencia de un ISV a generar interferencia de proteínas, sino que los datos generados también confirman los hallazgos de los Ejemplos anteriores sobre el efecto de las sustituciones en la región carboxiterminal. Como puede observarse, la adición de 3 (y en menor medida 1) restos de alanina en el extremo carboxílico del ISV completamente humanizado anuló su capacidad para competir con la unión del anticuerpo analítico. La mutación de la posición 14 en la variante de ISV de tipo silvestre de Alanina a Prolina, aumentó claramente su capacidad como competidor en el ensayo, (=haciendo que la variante de ISV sea más propensa a interferencia específica de proteínas), mientras que las mutaciones en las posiciones 83 y 108 no influyeron claramente en la sensibilidad del ISV a interferencia específica de proteínas.
[0441] Tabla IX
[0443]
[0444] Ejemplo 6: Influencia de la adición de aminoácidos al extremo carboxílico de nanocuerpos contra OX40L sobre su fuerza de bloqueo de OX40L.
[0446] Este ejemplo demuestra que la extensión carboxiterminal no tiene influencia sobre la actividad ni la fuerza de bloqueo de los Nanocuerpos.
[0448] La fuerzain vitrodel Nanocuerpo contra OX40L trivalente biespecífico con secuencia optimizada Nb 3.16 (SEQ ID NO: 31) se comparó con la fuerza del Nanocuerpo correspondiente que contenía una Ala adicional en su extremo carboxílico, Nb 3.17 (SEQ ID NO: 32).
[0450] Se realizó un primer ensayo, el ensayo de activación de linfocitos T, como se indica a continuación. CMSP (células mononucleares de sangre periférica) se aislaron de capas leucoplaquetarias (Cruz Roja, Gante, Bélgica) de donantes sanos usando el reactivo Ficoll Paque Plus (GE Healthcare) y se lavaron usando medio completo RPMI 1640 (RPMI1640 GlutaMAX HEPES 25 mM suero bovino fetal al 10 % penicilina/estreptomicina al 1 %; Invitrogen). Las CMSP (1x10<5>células/pocillo) se estimularon con fitohemaglutinina (PHA-L; concentración final 0,6 µg/ml) antes de añadirlas a 1x10<4>células CHO que expresaban hOX40L (irradiadas con un centelleador gamma a 3000 RAD; UZ Gante, Bélgica) y a una serie de diluciones de los Nanocuerpos contra OX40L en medio completo RPMI 1640 y se incubaron durante 22 horas a 37°C en una incubadora con CO₂. La producción de IL2 por las CMSP se midió en un ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ensayo de inmunoadsorción enzimática). Los pocillos de una placa Maxisorp se recubrieron durante la noche a 4°C con anticuerpo monoclonal contra IL2 humano (BD Biosciences). Después de lavar y bloquear los pocillos recubiertos, se añadió una dilución ½ de sobrenadante celular. Como patrón, se incluyeron diluciones en serie ½ de IL2 humana recombinante (BD Biosciences) comenzando con 2000 pg/ml. La detección se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal contra IL2 humano biotinilado (BD Biosciences) y estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific) y sustrato TMB (SDT Reagents). La reacción se detuvo con HCl 1 N y la DO se leyó a 450 nm. Como era de esperar, la fuerza del Nanocuerpo trivalente biespecífico con secuencia optimizada, Nb 3.17 (CI<50>= 0,13 nM, IC del 95 % = 0,098-0,17 nM) fue comparable a la del Nb 3.16 (CI<50>= 0,10 nM, IC del 95 % = 0,071-0,15 nM).
[0452] En un segundo ensayo de competición basado en ELISA, se preincubó una serie de diluciones (de 1,5 µM a 0,083 pM) de los Nanocuerpos durante la noche a temperatura ambiente con 100 ng/ml de OX40/Fc humano (R&D Systems) y 10 ng/ml de OX40L (ligando OX40) humano biotinilado (R&D Systems; biotinilado internamente, como se describe en el Ejemplo 1) en PBS BSA al 0,1 % Tween-20 al 0,01 %. A continuación, las muestras se incubaron en placas Maxisorp recubiertas con 10 ug/ml de Nanocuerpo contra Fc humano (generado internamente) y se bloquearon con PBS BSA al 1 % Tween-20 al 0,1 %. Utilizando estreptavidina conjugada con HRP (Thermo Scientific) y sustrato TMB (SDT Reagents), se detectó OX40/Fc humano unido La reacción se detuvo con HCl 1 N y la DO se leyó a 450 nm. De acuerdo con el ensayo basado en células, la fuerza del Nanocuerpo trivalente biespecífico con secuencia optimizada, Nb 3.17 (CI<50>= 0,178 nM, IC del 95 % = 0,152-0,200 nM) fue comparable a la del Nb 3.16 (CI<50>= 0,179 nM, IC del 95 % = 0,149-0,215 nM).
[0453] Ejemplo 7: generación del anticuerpo monoclonal 21-4-3.
[0455] Dos grupos de diferentes cepas de ratones (BALB/c y NMRI - tres ratones cada uno) se inmunizaron por vía intraperitoneal con la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 descrita en el documento WO 2006/122825, en una emulsión de agua en aceite de idénticos volúmenes de antígeno y adyuvante completo o incompleto de Freund) durante un periodo de 39 días, administrando refuerzos hasta obtener títulos antiséricos adecuados.
[0456] Después de la asfixia de los ratones estimulados con CO<2>, los bazos se extirparon asépticamente y se preparó una suspensión de células individuales a partir de los bazos combinados. Los esplenocitos (células del bazo) y las células de mieloma se lavaron varias veces con DMEM y se fusionaron en presencia de 1 ml de PEG 3350 al 50 % (p/v) (relación de esplenocitos a SP2/03:1). Para la fusión se utilizó la estirpe celular de mieloma SP2/0-Ag14 de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ GmbH, Braunschweig). Esta estirpe celular es un híbrido entre esplenocitos de BALB/c y la estirpe celular de mieloma P3x63Ag8. Los hibridomas producidos de este modo se resuspendieron en CGM que contenía FCS al 20 % y aminopterina (medio HAT) y se sembraron (140 µl/pocillo) en ocho placas de cultivo tisular de fondo plano de 96 pocillos (Corning-Costar) que contenían 140 µl/pocillo de CGM (FCS al 20 %) con células de exudado peritoneal como células alimentadoras. Las placas se incubaron durante 10 días en un medio de crecimiento completo (CGM,complete growth medium) que contenía DMEM con los suplementos 2-mercaptoetanol, L-glutamina, glutamina estable, HT y aminoácidos no esenciales (en las concentraciones recomendadas por el proveedor) y FCS a diferentes concentraciones (10 %, 15 % o 20 %). Durante este periodo, las células se alimentaron dos veces con medio HAT. Los sobrenadantes de cultivo celular de las células de hibridoma generalmente contenían de 1 a 20 µg/ml de anticuerpo, que se sometieron a ensayo en un ELISA de unión para confirmar la unión a la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 descrita en el documento WO 2006/122825.
[0458] Las células de los pocillos positivos productores de IgG se transfirieron a pocillos de placas de 48 pocillos y se cultivaron durante 2-4 días (dependiendo de las características de crecimiento de las células). Para excluir los aglutinantes inespecíficos, se llevaron a cabo ensayos ELISA de unión en ALX081 e IgG de ser humano/macaco cangrejero. Las células de hibridoma que expresaban aglutinantes específicos para la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 descrita en el documento WO 2006/122825 se clonaron dos veces usando dilución limitada. Después de la fusión y la re-exploración, se identificaron 7 cultivos primarios que producían anticuerpos contra ALX-081. Todos estos cultivos primarios produjeron anticuerpos que no reaccionaban de forma cruzada con la IgG de ser humano ni de macaco cangrejero. Los cultivos primarios volvieron a clonarse (dos veces).
[0459] El clon 21-4 (uno de los clones que producía de forma estable anticuerpos contra ALX-081 después de la segunda clonación) recibió la denominación "ABH0015" y se depositó en las Colecciones Coordinadas de Microorganismos de Bélgica (BCCM) en Gante, Bélgica, el 4 de junio de 2012 con el número de registro LMBP-9680-CB. El anticuerpo monoclonal de ratón producido por ABH0015 se denominó 21-4-3: la determinación de isotipo del anticuerpo 21-4-3 mostró una cadena pesada de IgG1 y una cadena ligera kappa, que se secuenciaron (véanse las SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente). Se demostró que el anticuerpo 21-4-3 se unía a la región carboxiterminal de la construcción de Nanocuerpo de SEQ ID NO:98 descrita en el documento WO 2006/122825 (datos no mostrados).
[0460] Ejemplo 8: la unión del anticuerpo 21-4 a un ISV predice la tendencia de un ISV a experimentar interferencia específica de proteínas
[0461] Este Ejemplo junto con el siguiente Ejemplo 9, demuestra que la unión del anticuerpo monoclonal 21-4 a un ISV puede usarse para predecir (dentro de los grados de certeza indicados en este Ejemplo) si un ISV dado tendrá una tendencia a experimentar interferencia específica de proteínas (p. ej., en un ensayo de ADA).
[0462] Este Ejemplo 8 muestra en particular que el anticuerpo 21-4 puede usarse para predecir si determinadas modificaciones propuestas a un ISV dado (tales como añadir uno o más restos de aminoácidos al extremo carboxílico de un ISV y/o sustituir uno o más aminoácidos dentro de la región carboxiterminal de un ISV) conducirán a una reducción de la tendencia de dicho ISV a experimentar interferencia específica de proteínas.
[0463] En resumen, un conjunto de 53 Nanocuerpos y construcciones de Nanocuerpos diferentes (véanse la Figura 9 y las SEQ ID NO: 38 a 89) se sometió a ensayo para determinar su unión al anticuerpo monoclonal 21-4-3. Los mismos Nanocuerpos y construcciones de Nanocuerpos también se sometieron a ensayo para determinar su unión con preparaciones purificadas de factor o factores de interferencia obtenidos de tres donantes humanos diferentes (denominados en el presente documento "Donante 8", "Donante 19" y "Donante 30"), para ver si había alguna correlación entre la unión al anticuerpo 21-4 y a los factores de interferencia purificados.
[0464] Se estableció que la unión de un ISV al anticuerpo 21-4 puede usarse de hecho para predecir la unión de los mismos ISV al factor o factores de interferencia (dentro del grado global de confianza proporcionado por los datos expuestos en el presente documento).
[0465] Para demostrar esto, tal como se detalla mediante los datos experimentales expuestos a continuación, la unión de los 53 Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos (tal como se enumeran en la Figura 9; véanse las SEQ ID NO: 38 a 89) al anticuerpo 21-4 se midió usando un Biacore T100 (de acuerdo con el protocolo expuesto a continuación) y se comparó con la unión de un Nanocuerpo o construcción de referencia (también enumerado en la Figura 9), medida usando el mismo instrumento Biacore y el mismo protocolo. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla X.
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470] Para cada uno de los 53 Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos evaluados, la referencia se eligió de modo que, en comparación con la referencia, los Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos analizados tuvieran uno o más restos de aminoácidos adicionales en el extremo carboxiterminal (que se añadieron con el fin de evaluar el efecto de dicha adición sobre la interferencia de proteínas, y en particular con el fin de reducir dicha interferencia) y/o una o más mutaciones dentro de la región carboxiterminal (por ejemplo, como resultado de la humanización en comparación con la referencia).
[0472] Los resultados se expresaron como una reducción porcentual en la unión (medida en unidades de respuesta, UR) para el Nanocuerpo dado frente a la unión de la referencia (también medida en unidades UR- por ejemplo, si el nivel de unión medido (UR) del Nanocuerpo de referencia era de 276 y el nivel de unión del Nanocuerpo dado (también en UR) era de 9, entonces la reducción en el nivel de unión era de [9 UR/276 UR] x 100 % = 3 %), lo que significa una reducción del 97 % en comparación con la referencia (100 %).
[0474] De manera similar, se midió la unión del factor o factores de interferencia purificado(s) de cada uno de los tres donantes a cada uno de los 53 nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos usando el mismo instrumento Biacore y se comparó con la unión del factor o factores de interferencia purificado(s) al mismo Nanocuerpo o construcción de referencia. Los resultados se expresaron de manera similar como una reducción porcentual en la unión del factor de interferencia al Nanocuerpo o a la construcción de Nanocuerpo dado frente a la referencia.
[0475] Se descubrió que, para prácticamente todos los Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos en los que se habían añadido uno o más restos de aminoácidos al extremo carboxiterminal en comparación con la referencia, la unión del factor o factores de interferencia se redujo de manera drástica. Esto confirma de nuevo que la adición de uno o más restos de aminoácidos al extremo carboxiterminal de un ISV (VTVSS) puede reducir la interferencia específica de proteínas en un ensayo de ADA. También se descubrió que en la mayoría de los casos, hacer únicamente sustituciones dentro de la región carboxiterminal (es decir, sin añadir uno o más restos de aminoácidos al extremo carboxiterminal) en comparación con la referencia, a menudo no tenía un impacto tan drástico en la unión del factor o factores de interferencia.
[0477] A continuación, los datos se analizaron más a fondo para determinar si una reducción en la unión al anticuerpo 21-4 en comparación con la referencia, estaba de alguna manera correlacionada con una reducción en la unión de cada una de las tres preparaciones diferentes de factor de interferencia purificado en comparación con la referencia. Se encontraron tales correlaciones.
[0479] Por ejemplo, se descubrió que de los 54 Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos analizados, 36 mostraron una reducción en la unión al anticuerpo 21-4 de más de un 70 % en comparación con su secuencia de referencia respectiva (teniendo la mayoría de estos 36 uno o más restos de aminoácidos adicionales en el extremo carboxílico, en algunos casos junto con sustituciones dentro de la región carboxiterminal). De estos 36, 32 también mostraron una reducción en la unión al factor o factores de interferencia en comparación con la referencia de más de un 50 % (y en un gran número de casos, en particular para los Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos con uno o más restos de aminoácidos añadidos al extremo carboxílico, la reducción fue mucho mayor de un 50 %, tal como más de un 70 % o incluso más de un 90 %, véanse los datos proporcionados en la Tabla X). Esto demuestra que, en 32 de los 36 casos (es decir, el 89 %), una reducción en la unión al anticuerpo 21-4 de más del 70 % (en comparación con la referencia = 100 %) predice una reducción en la unión a los factores de interferencia de más del 50 % (en comparación con la misma referencia). Para mayor claridad, en cada caso, la reducción se calculó como 100 % - [el porcentaje dado en las Tablas siguientes para el nivel de reducción alcanzado con el Nanocuerpo analizado].
[0481] De manera similar, se descubrió que de los 53 Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos analizados, 33 mostraron una reducción en la unión al anticuerpo 21-4 de más de un 90 % en comparación con su secuencia de referencia respectiva (de nuevo, teniendo la mayoría de estos 33 uno o más restos de aminoácidos adicionales en el extremo carboxílico, en algunos casos junto con sustituciones dentro de la región carboxiterminal). De estos 33, 32 también mostraron una reducción en la unión al factor o factores de interferencia en comparación con su secuencia de referencia respectiva de más del 50 %. Esto demuestra que, en 32 de los 33 casos (es decir, el 97 %), una reducción en la unión al anticuerpo 21-4 de más del 90 % (en comparación con la referencia) predice una reducción en la unión a los factores de interferencia de más del 50 % (en comparación con la misma referencia).
[0482] También debe observarse que dicha reducción en la unión del factor o factores de interferencia en más del 50 % (como lo evidencia una reducción de la unión al anticuerpo 21-4 de más del 70 %) significa que dicho factor o factores de interferencia prácticamente dejan de interferir en un ensayo de ADA para el ISV en cuestión: la confirmación experimental mediante un ensayo de ADA mostró que, cuando la unión del factor o factores de interferencia se reduce en más del 45 %, no se observa una influencia significativa de la presencia de dichos factores de interferencia sobre el ensayo de ADA. A este respecto, también quedará claro para el experto que esto será aún más evidente cuando la unión del factor o factores de interferencia se reduzca en un grado mucho mayor al 50 % (tal como en más del 70 % o incluso más del 90 %), como se observa en algunos casos (véanse nuevamente los datos mostrados en el presente documento).
[0483] De hecho, se ha descubierto que una reducción de más del 45 % en la unión al anticuerpo 21-4 es indicativa de una reducción en la unión de los factores de interferencia de más del 45 %, lo que, como se ha mencionado, significa que el factor o factores de interferencia ya no interfieren con el ensayo de ADA.
[0484] Además, los datos mostrados en el presente documento sobre la correlación entre la (reducción en la) unión al anticuerpo 21-4 y la (reducción en la) unión al factor de interferencia, también permitieron a los presentes inventores establecer un valor absoluto para la unión al anticuerpo 21-4 por debajo del cual se puede esperar (dentro del nivel de confianza proporcionado por el conjunto de datos expuesto en este Ejemplo 8) que un ISV o una construcción basada en ISV no será susceptible a la unión por el factor o factores de interferencia de una manera que pueda interferir con un ensayo de ADA. Tal como se expone en el siguiente Ejemplo 9, este valor es de 500 UR (determinado y calculado como se expone en el Ejemplo 9).
[0485] El anticuerpo monoclonal 21-4 se purificó del medio de cultivo del hibridoma obtenido en el Ejemplo 7 anterior, de la siguiente manera: Células de hibridoma que secretaban el anticuerpo monoclonal 21-4-3, se cultivaron en matraces giratorios en medio asérico (CD Hybridoma, Gibco, complementado con L-glutamina 8 mM (Invitrogen) y 1×colesterol (250× concentrado lipídico de colesterol, Gibco)) a un volumen de 100 ml o 500 ml. El sobrenadante clarificado se filtró y la IgG1 murina se capturó en una columna de Proteía A (HiTrap MabSelect Sure, 5 ml, GE Healthcare) a un caudal reducido de 2 ml/min. El anticuerpo unido se eluyó en tampón citrato 0,1 M pH 3,0, y las fracciones de elución (de 5 ml) se neutralizaron directamente con 1 ml de TRIS 1 M pH 9. La pureza del anticuerpo se verificó mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras.
[0486] Las preparaciones purificadas de factor o factores de interferencia de los Donantes 8 y 19 se obtuvieron a partir de muestras de suero de dichos donantes mediante purificación por afinidad, esencialmente como se describe en el Ejemplo 2A. El o los factores de interferencia del Donante 30 se obtuvieron de una muestra de suero del Donante 30, esencialmente como se describe en el Ejemplo 2B.
[0487] Para determinar la unión del anticuerpo 21-4 a cada uno de los Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos, se utilizó el protocolo descrito en el Ejemplo 9.
[0488] La unión de los factores de interferencia de los tres donantes a cada uno de los Nanocuerpos o construcciones de Nanocuerpos, se determinó utilizando un Biacore T100 esencialmente como se describe en el Ejemplo 3, utilizando el factor de interferencia de cada uno de los donantes 8, 19 y 30, inmovilizado directamente en un chip detector CM5.
[0489] Ejemplo 9: protocolo para predecir si un ISV tendrá una tendencia a experimentar interferencia específica de proteínas (usando el anticuerpo monoclonal 21-4).
[0490] Las mediciones de unión se realizaron con un Biacore T100 utilizando un chip detector CM5 T120416, con tampón de ejecución HBS-EP+ a 25°C. El anticuerpo 21-4 se capturó mediante IgG de conejo contra ratón inmovilizada, ya que se descubrió que la superficie del mAb (anticuerpo monocolonal) 21-4-3 inmovilizada directamente no podía regenerarse de manera eficaz. La IgG contra ratón utilizada era un anticuerpo policlonal de IgG de conejo contra ratón, que reaccionaba con todas las subclases de IgG, IgA e IgM (GE Healthcare; Cat n.º BR-1008-38; lote n.º 10056316). La inmovilización de la IgG contra ratón se llevó a cabo utilizando acoplamiento de aminas manual con una inyección de 7 minutos de EDC/NHS para la activación y una inyección de 7 minutos de etanolamina HCl 1 M pH 8,5, para la desactivación (Biacore, kit de acoplamiento de aminas). Las condiciones de unión se enumeran en la Tabla XI. Basándose en el nivel de inmovilización y en el PM (peso molecular) de las proteínas, la R<máx>teórica de la unión del mAb21-4-3 a la IgG contra ratón inmovilizada fue de ~13000 UR (cuando una molécula de mAb21-4-3 se une a una molécula de IgG contra ratón).
[0491] Tabla XI
[0493]
[0495] En la Tabla XII, se proporcionan las condiciones utilizadas para el experimento de unión (Biacore T100) con el anticuerpo 21-4 inmovilizado de esta manera. La superficie de IgG contra ratón pudo regenerarse con éxito después de la captura del mAb21-4-3 y la inyección de todas las muestras (con un aumento limitado del nivel inicial después de cada regeneración).
[0496] Tabla XII
[0498]
[0501]
[0504] El protocolo anterior se usó para generar el conjunto de datos de unión del anticuerpo 21-4 expuestos en la Tabla X. Cuando se consideraron los valores absolutos de UR (después de ajustar el valor de UR medido al peso molecular del ISV, de la proteína o polipéptido de acuerdo con la fórmula ([UR medido]/[PM de la proteína] x 10<6>), se descubrió que los Nanocuerpos y las construcciones de Nanocuerpos mencionados en la Tabla X que tenían un resto de alanina añadido y que mostraban una reducción >90 % en la unión tanto a 21-4 como a factores de interferencia, generalmente proporcionaban valores de UR de entre 30 UR y 400 UR (teniendo los Nanocuerpos o los polipéptidos de referencia correspondientes - tal como se enumeran en la Figura 9 - valores de UR superiores a 1000, normalmente superiores a 1500 y a menudo superiores a 2000).
[0506] Basándose en esto, se consideró que, en este ensayo, un valor de UR (ajustado) inferior a 500 sería claramente indicativo de un ISV (o de una proteína o polipéptido que comprenda al menos un ISV, como se describe en el presente documento) que (esencialmente) no estará unido por factores de interferencia de una manera que interfiera con un ensayo de ADA.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES
1. Método para predecir si un dominio variable único de inmunoglobulina (ISV) o una proteína o un polipéptido que comprende al menos un ISV, generará interferencia de proteínas en un inmunoensayo, tal como un ensayo de anticuerpos contra fármaco (ADA), comprendiendo dicho método realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
(i) poner en contacto dicho ISV o proteína/polipéptido con un anticuerpo que se ha obtenido de un sujeto humano y que se ha seleccionado/aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse al extremo carboxiterminal de un ISV que tiene la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) en su extremo carboxiterminal; y (ii) determinar si dicho ISV, proteína o polipéptido se une a dicho anticuerpo en dicho inmunoensayo en donde el hecho de que el ISV, proteína o polipéptido se una a dicho anticuerpo en la etapa (ii), significa que el ISV, proteína o polipéptido puede generar, o tiene un riesgo elevado o aumentado de generar, dicha interferencia de proteínas.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se ha seleccionado/aislado basándose en su capacidad para reconocer y/o unirse a un epítopo en dicho ISV, en donde el epítopo comprende la secuencia carboxiterminal VTVSS (SEQ ID NO:33), el resto de aminoácido en la posición 14 y opcionalmente comprende además los restos de aminoácidos en las posiciones 83 y 108 y los restos de aminoácidos en las posiciones 13, 15, 82b, 83, 84 y 107.
3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el ISV es un VHH, un VHH con secuencia optimizada, un VHH humanizado o VH camelizado.
4. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína o el polipéptido tiene dicho ISV en su extremo carboxiterminal.
5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el anticuerpo es un anticuerpo policlonal que se ha obtenido, partiendo de una muestra biológica de un sujeto humano que es adecuada como material de partida para obtener anticuerpos policlonales, mediante un método que comprende al menos una etapa de cromatografía de inmunoafinidad en la que se utiliza el ISV o la proteína o el polipéptido que comprende al menos un ISV como antígeno de afinidad, y opcionalmente una o más etapas adicionales para aislar y/o purificar un anticuerpo policlonal de dicha muestra
7. Método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el ISV o la proteína o el polipéptido que comprende al menos un ISV que se utiliza como antígeno de afinidad, es un ISV o una proteína o un polipéptido que comprende al menos un ISV que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33), o en el que la proteína o el polipéptido que comprende al menos un ISV que se utiliza como antígeno de afinidad, tiene en su extremo carboxiterminal un ISV que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33).
8. Método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que el ISV o la proteína o el polipéptido que comprende al menos un ISV que se utiliza como antígeno de afinidad, es un ISV o una proteína o un polipéptido que comprende al menos un ISV, que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y que tiene un resto de prolina en la posición 14; o en el que la proteína o el polipéptido que comprende al menos un ISV que se utiliza como el antígeno de afinidad, tiene en su extremo carboxiterminal un ISV que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y que tiene un resto de prolina en la posición 14.
9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el ISV que se utiliza como antígeno de afinidad, es un VHH con secuencia optimizada y/o humanizado, un VH camelizado, un VH con secuencia optimizada o un VH humano camelizado.
10. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que el ISV que se utiliza como antígeno de afinidad, es un VHH con secuencia optimizada y/o humanizado, o un VH con secuencia optimizada que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y que tiene un resto de prolina en la posición 14 que se ha introducido como parte de la humanización y/u optimización de secuencia del VHH de origen natural correspondiente.
11. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
12. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 u 11, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que se ha obtenido, partiendo de una muestra biológica de un sujeto humano que es adecuada como
material de partida para obtener anticuerpos monoclonales, mediante un método que comprende al menos una etapa de exploración o selección en la que se utiliza un ISV para explorar y seleccionar un anticuerpo monoclonal que se une a dicho ISV, y opcionalmente una o más etapas adicionales para aislar y/o purificar un anticuerpo monoclonal de dicha muestra.
13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el ISV que se utiliza en la etapa de exploración o selección, termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33).
14. Método de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en el que el ISV que se utiliza en la etapa de exploración o selección, termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y tiene un resto de prolina en la posición 14.
15. Método de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en el que el ISV que se utiliza en la etapa de exploración o selección es un VHH con secuencia optimizada y/o humanizado, un VH camelizado, un VH con secuencia optimizada o un VH humano camelizado.
16. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 15, en el que el ISV que se utiliza en la etapa de exploración o selección es un VHH con secuencia optimizada y/o humanizado, o un VH con secuencia optimizada que termina en su extremo carboxiterminal con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO:33) y que tiene un resto de prolina en la posición 14 que se ha introducido como parte de la humanización y/u optimización de secuencia del VHH de origen natural correspondiente.
17. Método para predecir si un ISV o una proteína o un polipéptido que comprende al menos un ISV, generará interferencia de proteínas en un inmunoensayo, comprendiendo dicho método realizar un inmunoensayo que comprende al menos las etapas de:
(i) poner en contacto dicho ISV o proteína o polipéptido que comprenda al menos un ISV, con el anticuerpo monoclonal 21-4 tal como se expresa en la estirpe celular de hibridoma LMBP-9680-Cb, es decir, utilizado como anticuerpo analítico; y
(ii) determinar si dicho ISV o proteína o polipéptido que comprende al menos un ISV se une a dicho anticuerpo monoclonal 21-4 en dicho inmunoensayo.
18. Método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el ISV es un VHH, un VHH con secuencia optimizada, un VHH humanizado o un VH camelizado o un ISV distinto de un VHH, un VHH humanizado o un VH camelizado.
19. Método de acuerdo con la reivindicación 17 o 18, en el que el ISV es un VHH, un VHH con secuencia optimizada, un VHH humanizado o VH camelizado.
20. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que la proteína o el polipéptido tiene dicho ISV en su extremo carboxiterminal.
21. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, que se realiza en un inmunoensayo seleccionado de un ELISA, un ELISA de tipo sándwich, una resonancia de plasmón superficial o un ensayo de tipo puente competitivo.
22. Método de acuerdo con la reivindicación 21, que se realiza en una resonancia de plasmón superficial, en la que el anticuerpo analítico se recubre sobre el chip.
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