RS67664B1 - Tehnike za predviđanje, detekciju i redukciju interferencije specifičnih proteina u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina - Google Patents

Tehnike za predviđanje, detekciju i redukciju interferencije specifičnih proteina u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina

Info

Publication number
RS67664B1
RS67664B1 RS20260072A RSP20260072A RS67664B1 RS 67664 B1 RS67664 B1 RS 67664B1 RS 20260072 A RS20260072 A RS 20260072A RS P20260072 A RSP20260072 A RS P20260072A RS 67664 B1 RS67664 B1 RS 67664B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
isv
protein
nanobody
antibody
amino acid
Prior art date
Application number
RS20260072A
Other languages
English (en)
Inventor
Judith Baumeister
Marie-Paule Lucienne Armanda Bouche
Carlo Boutton
Marie-Ange Buyse
Veerle Snoeck
Stephanie Staelens
Original Assignee
Ablynx Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47423024&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS67664(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/EP2011/067132 external-priority patent/WO2012042026A1/en
Priority claimed from PCT/EP2012/061304 external-priority patent/WO2012175400A1/en
Application filed by Ablynx Nv filed Critical Ablynx Nv
Priority claimed from EP15179669.5A external-priority patent/EP2974737B1/en
Publication of RS67664B1 publication Critical patent/RS67664B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

[0001] Opis
[0003] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina. Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima. Bilo koja otelotvorenja ili aspekti koji nisu obuhvaćeni patentnim zahtevima uključeni su u svrhu reference.
[0005] Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ili „ISV“ se ovde generalno definiše kao aminokiselinska sekvenca koja:
[0006] − sadrži imunoglobulinsko nabiranje ili je, pod odgovarajućim uslovima (kao što su fiziološki uslovi), sposobna da formira imunoglobulinsko nabiranje (tj. savijanje), tj. tako da formira varijabilni domen imunoglobulina (kao što je, na primer, VH, VL ili VHH domen);
[0007] i koja
[0008] − formira (ili je pod takvim odgovarajućim uslovima sposobna da formira) varijabilni domen imunoglobulina koji sadrži funkcionalno mesto za vezivanje antigena (u smislu da mu nije potrebna interakcija sa drugim varijabilnim domenom imunoglobulina (kao što je VH-VL interakcija) da bi formirao funkcionalno mesto za vezivanje antigena).
[0010] Neki primeri pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina koji su trenutno poznati u struci su VHH i/ili (druga) nanotela, dAb i (pojedinačna) domenska antitela. Od ovih, na dan podnošenja predmetne prijave, različita nanotela su u fazi I i fazi II kliničkih ispitivanja. Zbog toga je važno imati dostupne pouzdane testove za analizu bioloških uzoraka od ljudi koji se leče ISV (kao što su ispitanici u kliničkim ispitivanjima i, nakon što takvi ISV stignu na tržište, pacijenti koji se leče takvim ISV).
[0012] Ovo nije važno samo u regulatorne svrhe, već i za lečenje pacijenata biološkim lekovima, jer bi kliničari koji propisuju lečenje takođe želeli da imaju dostupne pouzdane testove za praćenje različitih aspekata lečenja.
[0013] Na primer, u kliničkom razvoju molekula bioloških lekova, važno je proceniti njihov imunogeni potencijal, a posebno stepen u kojem mogu da izazovu takozvana „anti-lek antitela“ ili „ADA“. Ovo se određuje korišćenjem takozvanih „testova na anti-lek antitela“ ili „ADA (imuno)testova“ (videti, na primer, pregled Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; kao i Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth.289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; i Loyet et al., J. Immunol. Meth.345 (2009), 17-28. Takvi ADA testovi i metode za njihovo izvođenje predstavljaju standardno znanje u oblasti farmakologije i rutinski se koriste tokom kliničkog razvoja bioloških lekova (kao što ih zahtevaju i različite regulatorne agencije širom sveta).
[0015] Na primer, kao što je opisano na stranama 3 i 4 članka autora Mire-Sluis i kao što je na primer takođe shematski prikazano na slikama u članku autora Peng, poznat je broj različitih formata ADA testova, kao što su „ELISA format premošćavanja”, „direktni ELISA format”, „indirektni format”, test radio-imunoprecipitacije (RIP), „površinska plazmonska rezonanca” i „elektrohemiluminiscencija format premošćavanja”. Drugi formati za izvođenje ADA imunotestova biće jasni stručnjaku.
[0017] Stručnjak će takođe biti upoznat sa brojnim različitim komercijalno dostupnim tehnološkim platformama za koje se pokazalo da su pogodne za postavljanje i izvođenje ADA testova. One uključuju, ali se ne ograničavaju na, platformu MSD (Mesoscale), Gyrolab (Gyros) i octet platformu (Fortebio).
[0019] Neki neograničavajući primeri formata ADA testova takođe su shematski prikazani na slikama 1A do 1C.
[0021] Generalno, treba napomenuti da se u takvim ADA testovima za detekciju ili merenje ADA protiv ISV, ISV koristi kao „analitički agens” (tj. kao jedinjenje koje se koristi za detekciju da li su bilo koja ADA prisutna u uzorku koji se testira), а ADA su „antigen” (tj. jedinjenje koje treba detektovati u uzorku koji se testira). Dakle, u ovim testovima, ISV će obično/često biti vezan za nosač (kao što je ELISA ploča), dok će ADA (ako ih ima) biti prisutna u uzorku koji se podvrgava testu.
[0022] Radi boljeg razumevanja pronalaska koji je ovde opisan, već sada treba napomenuti da se - nasuprot tome - u metodama koje se ovde koriste za predviđanje da li će ISV izazvati proteinsku interferenciju, ISV će se obično koristiti kao „antigen” (tj. kao jedinjenje koje treba detektovati), a antitelo (koje je dalje ovde opisano) koristi se kao „analitički agens” (tj. kao sredstvo za detekciju da li se dati ISV vezuje ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne, respektivno). Dakle, u ovoj metodi prema predmetnom pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima, antitelo koje se koristi kao analitički agens (koje se ovde naziva i „analitičko antitelo”) obično će biti vezano za nosač (tj. za ELISA ploču) i ISV će biti (prisutan u) uzorku koji se testira. Međutim, generalno treba napomenuti da predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima nije ograničen na testove u kojima je „analitičko antitelo” vezano za nosač. Na primer, u alternativnom načinu izvođenja testa prema predmetnom pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima (kao što je prikazano na primer na slici 1 i opisano u
[0023] Primerima), analitičko antitelo se umesto toga koristi kao agens za premošćavanje i stoga će biti u rastvoru, a ne vezano za ploču (iako je indirektno vezano za ploču preko ISV koji je nanet na ploču). Međutim, i u specifičnom testu premošćavanja opisanom u primerima (koji je kompetitivni test), analitičko antitelo se i dalje koristi kao analitički agens (tj. da bi se utvrdilo da li se ISV od interesa vezuje ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne, respektivno). Takođe se predviđa da će, na osnovu daljeg ovdašnjeg obelodanjivanja, stručnjak moći da osmisli druge formate testova u kojima se analitičko antitelo može koristiti kao analitički agens kako bi se utvrdilo da li se dati ISV može vezati ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne).
[0025] [0011] Kao rezultat istraživanja pojedinačnih lanaca Fv ili „ScFv” (što su konstrukti koji sadrže pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina koji, slično kao ISV, nisu asocirani sa konstantnim domenima), u struci je opisano da C-terminalni kraj varijabilnog domena imunoglobulina formira hidrofobno polje koje je u antitelu skriveno u dodirnoj površini između varijabilnog domena i konstantnog domena, ali koje postaje izloženo rastvaraču kada varijabilni domen nije asociran sa konstantnim domenom (Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). Takođe je opisano da izloženi C-terminalni kraj može formirati B-ćelijske epitope koji mogu izazvati i/ili stupiti u interakciju sa (nastajućim i/ili već postojećim) anti-lek antitelima (WO 11/07586), čije se prisustvo tada može utvrditi korišćenjem gore navedenih ADA testova. Iz tog razloga, predloženo je da se izvrše mutacije na nekim od aminokiselinskih ostataka koji čine deo C-terminalnog kraja varijabilnih domena kako bi se redukovala navedena hidrofobnost i/ili uklonili navedeni epitopi. Na primer, Nieba et al. sugerišu mutaciju pozicija 11, 14, 41, 84, 87 i/ili 89 VH regiona (numerisanje prema Kabatu), dok se u WO 11/07586 sugeriše mutacija pozicija 99, 101 i/ili 148 (AHo numerisanje) VL domena ili pozicija 12, 97, 98, 99, 103 i/ili 144 VH domena (ponovo AHo numerisanje - ove pozicije odgovaraju pozicijama 11, 83, 84, 85, 89 i 103 prema Kabatu).
[0027] Međutim, nijedna od ovih referenci ne prepoznaje da određeni proteini prisutni u krvi ili serumu ispitanika mogu interferirati sa ADA testovima koji uključuju ISV, i zbog toga ove reference nisu usmerene na (niti nude rešenje za) problem kako izbeći aspecifičnu proteinsku interferenciju u takvim ADA testovima kako bi se omogućilo da se ADA test koristi za utvrđivanje stvarnog prisustva/obima (nastajućih ili već postojećih) anti-lek antitela u uzorku koji se testira.
[0028] S Poelmans et al., The AAPS Journal, vol. 12, no. S1 (2010) odnosi se na praćenje imunogenosti tokom pretkliničkog razvoja nanotela. WO 2013/024059 A2 odnosi se na modifikovane proteine i peptide.
[0030] Nasuprot tome, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima obezbeđuje metode i testove koji stručnjaku lako omogućavaju da predvidi da li će pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina imati ili neće imati tendenciju da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji u ADA testu. Metode i testovi koji su ovde opisani takođe omogućavaju stručnjaku da, kada se utvrdi da varijabilni domen može imati tendenciju ili rizik da podlegne takvoj proteinskoj interferenciji u ADA testu, lako testira (predložene) modifikacije varijabilnog domena kako bi predvideo da li će bilo koja takva (predložena) modifikacija redukovati ili u suštini potpuno izbeći takvu proteinsku interferenciju.
[0032] [0014] Predmetna specifikacija takođe opisuje broj modifikacija koje se mogu izvršiti na varijabilnim domenima kako bi se redukovala ili u suštini izbegla takva proteinska interferencija. Prema jednom neograničavajućem aspektu, ova modifikacija uključuje dodavanje ograničenog broja (kako je dalje ovde opisano) aminokiselinskih ostataka (kako je dalje ovde opisano) na C-terminalni kraj varijabilnog domena. Iznenađujuće, utvrđeno je da, za broj različitih varijabilnih domena ili konstrukata zasnovanih na njima, čak i dodavanje jednog aminokiselinskog ostatka na C-terminalni kraj (kao što je jedan ostatak alanina) može značajno ili čak u suštini potpuno ukloniti problem proteinske interferencije u ADA testovima, iako dodavanje jednog takvog aminokiselinskog ostatka samo po sebi nije dovoljno da „pokrije” ili „sakrije” hidrofobno polje koje je prema Nieba et al. prisutno na C-terminalnom kraju ISV. Slično tome, ali bez želje da se predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima ograniči na bilo koji način ili na bilo koji mehanizam ili objašnjenje, takođe se pretpostavlja da dodavanje jednog takvog aminokiselinskog ostatka ne bi bilo dovoljno da „pokrije” ili „sakrije” bilo koje B-ćelijske epitope koji prema WO 11/07586 mogu biti prisutni na C-terminalnom kraju varijabilnog domena. Takođe treba napomenuti da, iako prema ovom specifičnom aspektu predmetne specifikacije, dodavanje ograničenog broja ili čak jedne aminokiseline na C-terminalni kraj varijabilnog domena (tj. bez vršenja bilo kakvih supstitucija unutar samog C-terminalnog regiona, kao što su predložili Nieba et al i WO 11/07586) može - i u mnogim slučajevima hoće - značajno redukovati ili čak u suštini ukloniti problem aspecifične proteinske interferencije, takođe je u okviru ovog aspekta specifikacije da se takva dodavanja na C-terminalni kraj kombinuju sa mutacijama u C-terminalnom regionu. U tom pogledu, međutim, takođe treba napomenuti da predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima nije posebno ograničen u pogledu logike iza vršenja takvih mutacija. Na primer, dobro je poznato vršiti mutacije aminokiselinskih ostataka unutar C-terminalnog kraja (uključujući i one pozicije na koje se eksplicitno pozivaju Nieba et al. i u WO 11/07586) u svrhu humanizacije varijabilnog domena (uključujući, bez ograničenja, V<HH>domen) ili u svrhu „kamelizacije” V<H>domena (upućuje se, na primer, na WO 08/020079 i neke od drugih prijava kompanije Ablynx N.V. koje su ovde navedene).
[0034] Predviđa se da se metode, testovi i modifikacije koji su ovde podučeni mogu primeniti na bilo koji varijabilni domen koji nije povezan ili na drugi način asociran sa konstantnim domenom (ili sa drugom grupom ili peptidnim delom molekula koji funkcioniše tako da „štiti”, pokriva ili „skriva” C-terminalni region varijabilnog domena) i generalnije na bilo koji varijabilni domen koji ima C-terminalne regione koji su izloženi rastvaraču. Međutim, prema jednom preferiranom, ali neograničavajućem aspektu predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, metode, testovi i modifikacije koji su ovde opisani mogu se posebno primeniti na varijabilne domene teških lanaca (V<H>domene), a prema jednom specifičnom aspektu predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, na V<HH>domene.
[0036] [0016] Takođe se predviđa da se metode, testovi i modifikacije koji su ovde opisani mogu pogodno primeniti na proteinske konstrukte koji sadrže jedan ili više varijabilnih domena, a posebno na takve konstrukte u kojima varijabilni domen formira C-terminalni deo konstrukta ili, u slučaju ovde opisanih metoda i testova, u kojima je C-terminalni region varijabilnog domena na drugi način izložen rastvaraču. Ponovo, prema jednom preferiranom, ali neograničavajućem aspektu predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, metode, testovi i modifikacije koji su ovde opisani primenjuju se na konstrukte u kojima V<H>domen (a posebno V<HH>domen) formira C-terminalni deo konstrukta ili je, u slučaju metoda i testova predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, na drugi način izložen rastvaraču.
[0038] Neki neograničavajući primeri takvih konstrukata su multivalentni, multispecifični (kao što su bispecifični) ili multiparatopni (kao što su biparatopni) konstrukti koji sadrže dva ili više ISV povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera (pri čemu ponovo, prema jednom specifičnom aspektu, V<H>ili V<HH>domen formira C-terminalni deo takvog konstrukta). Na primer, i bez ograničenja, takav konstrukt može biti u potpunosti sastavljen od V<H>domena, a posebno od nanotela (tj. V<HH>domena, humanizovanih V<HH>domena ili kamelizovanih V<H>domena), ponovo povezanih direktno ili preko jednog ili više pogodnih linkera. Za neke neograničavajuće primere takvih konstrukata i opšta uputstva o tome kako se takvi konstrukti mogu napraviti (posebno na bazi nanotela), upućuje se na primer na Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001) kao i na pregledni članak čiji je autor Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001).
[0040] Međutim, takođe se na primer predviđa da se predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može primeniti na druge konstrukte koji imaju varijabilni domen izložen rastvaraču i posebno imaju varijabilni domen na svom C-terminalnom kraju, kao što su na primer Fv pojedinačni lanci, a posebno ScFv koji imaju svoj varijabilni domen teškog lanca na C-terminalnom kraju.
[0042] U predmetnoj specifikaciji i patentnim zahtevima, termini poput „ISV”, „analitički agens” i „proteinska interferencija” imaju značenje kako je dalje ovde definisano.
[0044] Posebno, ISV kako je ovde opisan može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0046] [0021] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što je lek zasnovan na ISV) prvenstveno ima navedeno (ili barem jedno) takvo ISV na svom C-terminalnom kraju. Ponovo, navedeno ISV može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0048] Predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima posebno je namenjen i pogodan da se primeni na ISV koji sadrže, zasnivaju se na i/ili su izvedeni iz varijabilnih domena teških lanaca, kao što su VH domeni (uključujući humane VH domene) i nanotela kao što su VHH domeni (uključujući humanizovane i sekvencijalno optimizovane VHH domene) ili kamelizovani VH domeni. Oni mogu biti sintetički (na primer, dobijeni polazeći od sintetičke biblioteke i/ili zasnovani na fiksnim okvirnim regionima), polusintetički (na primer, humanizovani, kamelizovani ili sekvencijalno optimizovani, ili dobijeni afinitetnim sazrevanjem ili CDR kalemljenjem, polazeći od prirodnog VH ili VHH domena) ili potpuno prirodni VH ili VHH domeni. Predmetni pronalazak će stoga dalje biti ovde opisan sa referencom na ISV koji jesu, koji se zasnivaju na i/ili koji su izvedeni iz VH ili VHH domena.
[0050] Prilikom uspostavljanja predmetnog pronalaska, utvrđeno je da u nekim testovima (kao što su, na primer, ADA imunotestovi) koji se koriste za analizu bioloških uzoraka (kao što su uzorci krvi uključujući punu krv, serum i plazmu, očna tečnost, bronhoalveolarna tečnost/BALF, cerebrospinalna tečnost ili drugi uzorci bioloških tečnosti) može doći do proteinske interferencije, i da takva proteinska interferencija može izazvati aspecifičan signal u nekim od tih testova i/ili u nekim od tih uzoraka. Takođe je utvrđeno da se takva proteinska interferencija može javiti ne samo u uzorcima koji su dobijeni od ispitanika koji su lečeni sa ISV (a posebno sa nanotelima; ili sa proteinima, polipeptidima ili drugim biološkim lekovima koji sadrže najmanje jedno takvo ISV ili nanotelo) i/ili kojima su isti primenjeni (kao što su pacijenti ili ispitanici u kliničkim ispitivanjima), već i u uzorcima ispitanika koji nikada nisu primili ISV (što ukazuje na to da je takva interferencija verovatno posledica aspecifične protein-protein interakcije sa već postojećim proteinima, pre nego bilo kojih nastajućih ADA).
[0052] Iako je utvrđeno da takva proteinska interferencija i/ili takav signal u takvim testovima nije povezan sa bilo kakvom promenom ili redukcijom farmakoloških svojstava (kao što su farmakokinetička/PK ili farmakodinamička/PD svojstva) ISV, bilo bi poželjno imati dostupne tehnike za predviđanje, detekciju, redukciju i/ili, ako je moguće, izbegavanje takve aspecifične proteinske interferencije. Ovo je opšti cilj predmetnog pronalaska. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0053] Posebno, pronalazak obezbeđuje, i u određenim specifičnim, ali neograničavajućim aspektima je koristan u:
[0054] − testovima koji se mogu koristiti za predviđanje da li će dati ISV biti podložan takvoj proteinskoj interferenciji i/ili izazvati takav (aspecifičan) signal u takvom testu (kao što je na primer u ADA imunotestu). Takvi prediktivni testovi bi se mogli, na primer, koristiti za testiranje da li bi dati ISV mogao imati tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju i/ili takav signal; za selekciju ISV koji nisu ili su manje skloni takvoj proteinskoj interferenciji ili davanju takvog signala; kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za proveru da li će određena modifikacija (ili modifikacije) na ISV (potpuno ili delimično) redukovati njegovu tendenciju da izazove takvu interferenciju ili takav signal; i/ili kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za usmeravanje modifikacije ili poboljšanja ISV kako bi se redukovala njegova tendencija da izazove takvu proteinsku interferenciju ili signal;
[0055] − metodama za modifikovanje i/ili poboljšanje ISV kako bi se uklonila ili redukovala njihova tendencija da izazovu takvu proteinsku interferenciju ili takav signal;
[0056] − modifikacijama koje se mogu uvesti u ISV koje uklanjaju ili redukuju njegovu tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju ili takav signal;
[0057] − ISV koji su specifično selektovani (na primer, korišćenjem testa opisanog ovde) tako da nemaju ili imaju nisku/redukovanu tendenciju da izazovu takvu proteinsku interferenciju ili takav signal;
[0058] − modifikovanim i/ili poboljšanim ISV koji nemaju ili imaju nisku/redukovanu tendenciju da izazovu takvu proteinsku interferenciju ili takav signal.
[0060] Na primer, u prvom neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na metodu koja se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati (ili ima visok ili povećan rizik od izazivanja) proteinsku interferenciju u imunotestu (tj., nakon što je primenjen ispitaniku, uzorak biološke tečnosti dobijen od navedenog ispitanika, i navedeni uzorak podvrgnut imunotestu kako je dalje ovde opisano), pri čemu navedena metoda obuhvata izvođenje imunotesta koji obuhvata najmanje sledeće korake:
[0061] (i) kontaktiranje navedenog ISV ili nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili nanotelu) sa antitelom koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano, generisano i/ili izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela („analitičko antitelo”); i
[0062] (ii) određivanje da li je navedeni ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) vezan navedenim antitelom u navedenom imunotestu.
[0064] U ovoj metodi, kada se ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelu veže za navedeno analitičko antitelo, može se očekivati da će navedeni ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelu izazvati (ili ima visok ili povećan rizik od izazivanja) takvu proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde definisano). Na osnovu toga, na primer, navedeni ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelu može se modifikovati ili poboljšati kako bi se redukovala ili uklonila njegova tendencija da izazove takvu proteinsku interferenciju (što se opet može utvrditi korišćenjem gore navedenog testa), a neke strategije koje se mogu koristiti za modifikovanje navedenog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelu biće ovde opisane (i na primer uključuju pričvršćivanje malog broja aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj i/ili uvođenje jedne ili više specifičnih supstitucija aminokiselina).
[0066] Stoga, generalno, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima stavlja na raspolaganje stručnjaku testove i metode/tehnike koje se mogu koristiti za predviđanje tendencije ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelu da izazovu proteinsku interferenciju i/ili kao alat za poboljšanje ISV kako bi se redukovala ili izbegla njihova tendencija da izazovu proteinsku interferenciju. Čineći to, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima takođe obezbeđuje stručnjaku sredstva za selekciju ISV, nanotela, lekova zasnovanih na ISV ili lekova zasnovanih na nanotelu na osnovu njihove niske ili redukovane sposobnosti (ili odsustva bilo kakve sposobnosti) da izazovu proteinsku interferenciju. Dakle, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima obezbeđuje stručnjaku važan test i alat koji se može koristiti u optimizaciji i razvoju ISV, nanotela, lekova zasnovanih na ISV ili lekova zasnovanih na nanotelu.
[0068] [0029] Takođe, kao što je dalje ovde opisano, specifikacija podučava stručnjaka brojnim načinima na koje se ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelu može modifikovati ili poboljšati kako bi se redukovala ili izbegla njihova tendencija da izazovu proteinsku interferenciju. Stoga, specifikacija takođe generalno stavlja na raspolaganje modifikovane i/ili poboljšane ISV, nanotela, lekove zasnovane na ISV ili lekove zasnovane na nanotelu sa redukovanom, niskom ili bez ikakve tendencije da izazovu proteinsku interferenciju.
[0070] Kao što je dalje ovde opisano, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se posebno koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu, a preciznije u ADA testu. Navedeni ADA test može, na primer, biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može posebno biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV korišćenog u gore navedenim koracima (i) i (ii).
[0072] Ponovo, kao što je ovde pomenuto, ISV kako je ovde opisan može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0074] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što je lek zasnovan na ISV) prvenstveno ima navedeno (ili barem jedno) takvo ISV na svom C-terminalnom kraju. Ponovo, navedeno ISV može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0076] Uzorak koji se testira u navedenom imunotestu ili ADA testu ovde se takođe naziva „test uzorak” ili „uzorak testa”. Radi izbegavanja zabune, takav „test uzorak” ili „uzorak testa” ne treba mešati sa biološkim uzorkom koji se ovde koristi kao polazni materijal za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) „analitičkog antitela” koje se koristi u predmetnom pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima.
[0078] U jednom posebno preferiranom, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (a posebno u ADA testu) koji uključuje upotrebu takvog ISV. Ponovo, navedeni ADA test može, na primer, biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može posebno biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV korišćenog u gore navedenim koracima (i) i (ii).
[0079] U još specifičnijem, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (a posebno u ADA testu) koji je namenjen određivanju ili merenju da li uzorak sadrži bilo koja ADA protiv ISV. Ponovo, na primer, takav imunotest može biti jedan od poznatih tipova ADA testa (za koji se referenca, na primer, upućuje na ranije navedeno stanje tehnike o ADA testovima) koji se izvodi da bi se utvrdilo ili izmerilo da li su bilo koja ADA protiv navedenog ISV prisutna u „test uzorku”, pri čemu je navedeni test uzorak uzorak biološke tečnosti (kako je ovde opisano) koji je dobijen od ispitanika kojem je navedeni ISV bio primenjen (kako je dalje ovde opisano).
[0081] Kao što je dalje ovde opisano, u svim ovim aspektima (i daljim aspektima korisnim u ili sa predmetnim pronalaskom kako je definisan u patentnim zahtevima), predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima takođe se može koristiti za selekciju ISV koji nisu ili su manje skloni takvoj proteinskoj interferenciji u takvim imunotestovima ili ADA testovima; kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za proveru da li će određena modifikacija (ili modifikacije) na ISV (potpuno ili delimično) redukovati njegovu tendenciju da izazove takvu interferenciju u takvim imunotestovima ili ADA testovima; i/ili kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za usmeravanje modifikacije ili poboljšanja ISV kako bi se redukovala njegova tendencija da izazove takvu proteinsku interferenciju u takvim imunotestovima ili ADA testovima.
[0083] Drugi aspekti, otelotvorenja, prednosti i primene predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima postaće jasni iz daljeg ovdašnjeg opisa.
[0085] U predmetnoj specifikaciji, kad god se koristi termin „ISV”, treba razumeti sledeće: − takvo ISV je prvenstveno nanotelo, pri čemu je termin „nanotelo” generalno definisan kao u WO 08/020079 ili WO 09/138519, i stoga u specifičnom aspektu generalno označava VHH, humanizovano VHH ili kamelizovano VH (kao što je kamelizovano humano VH) ili generalno sekvencijalno optimizovano VHH (kao što je npr. optimizovano za hemijsku stabilnost i/ili rastvorljivost, maksimalno preklapanje sa poznatim humanim okvirnim regionima i maksimalnu ekspresiju). Napominje se da su termini nanotelo ili nanotela registrovani zaštitni znakovi kompanije Ablynx N.V. i stoga se na njih može upućivati i kao na Nanobody<®>i/ili Nanobodies<®>);
[0086] termin „ISV” u svom najširem smislu takođe uključuje „biološke lekove zasnovane na ISV” i, kada je ISV nanotelo, „biološke lekove zasnovane na nanotelima”. „Biološki lek zasnovan na ISV” je ovde definisan kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koji sadrži ili se u suštini sastoji od najmanje jednog (kao što su jedan, dva ili tri) ISV. Slično tome, „biološki lek zasnovan na nanotelima” je definisan kao protein, polipeptid ili drugi biološki lek koji sadrži ili se u suštini sastoji od najmanje jednog (kao što su jedan, dva ili tri) nanotela. Kao i kod termina „ISV”, kad god se koristi termin „biološki lek zasnovan na ISV”, treba razumeti da je takav biološki lek zasnovan na ISV prvenstveno biološki lek zasnovan na nanotelima. U kontekstu predmetnog pronalaska, i „biološki lek zasnovan na ISV” i „biološki lek zasnovan na nanotelima” mogu, na primer, biti monovalentni, bivalentni (ili multivalentni), bispecifični (ili multispecifični) i biparatopni (ili multiparatopni) ISV konstrukt, odnosno konstrukt nanotela. Takođe, bilo koji biološki lek zasnovan na ISV ili nanotelima može, na primer, pored jednog ili više (kao što su jedan, dva ili tri) ISV ili nanotela, opciono dalje sadržati jedan ili više (kao što su jedan ili dva) druga dalja terapeutska dela molekula i/ili jedan ili više (kao što su jedan ili dva) druga dela molekula koji utiču na farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva biološkog leka zasnovanog na ISV ili nanotelima (kao što je njegovo poluvreme eliminacije). Pogodni primeri takvih daljih terapeutskih ili drugih delova molekula biće jasni stručnjaku, i na primer generalno mogu uključivati bilo koji terapeutski aktivan protein, polipeptid ili drugi vezivni domen ili vezivnu jedinicu, kao i na primer modifikacije poput onih opisanih na stranama 149 do 152 WO 09/138159. Biološki lek zasnovan na ISV ili nanotelima je prvenstveno terapeutik ili je namenjen za upotrebu kao terapeutik (što uključuje profilaksu i dijagnozu) i u tu svrhu prvenstveno sadrži najmanje jedno ISV protiv terapeutski relevantne mete (kao što su na primer RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukini, itd.). Za neke specifične, ali neograničavajuće primere takvih bioloških lekova zasnovanih na ISV ili nanotelima, upućuje se na primer na različite prijave kompanije Ablynx N.V. (kao što su na primer i bez ograničenja WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao i na primer (i bez ograničenja) na prijave kao što su WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 i WO 07/085814. Takođe, u predmetnoj specifikaciji, osim ako ovde nije izričito navedeno drugačije, svi termini pomenuti ovde imaju značenje navedeno u WO 09/138519 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 08/020079). Takođe, tamo gde metoda ili tehnika nije specifično opisana ovde, ona se može izvesti kako je opisano u WO 09/138519 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 09/138519) ili WO 08/020079 (ili u stanju tehnike citiranom u WO 08/020079).
[0088] Posebno, sledeći termini imaju isto značenje kao što je navedeno na, i/ili gde je primenljivo mogu se odrediti na način opisan na stranama 62-75 WO 09/138519: „agonist”, „antagonist”, „inverzni agonist”, „nepolarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak”, „polarni nenaelektrisani aminokiselinski ostatak”, „polarni, naelektrisani aminokiselinski ostatak”, „identitet sekvence”, „potpuno isti” i „razlika u aminokiselinama” (kada se odnosi na poređenje sekvenci dve aminokiselinske sekvence), „(u) suštinski izolovanom (obliku)”, „domen”, „vezivni domen”, „antigena determinanta”, „epitop”, „protiv” ili „usmeren protiv” (antigena), „specifičnost” i „poluvreme eliminacije”. Pored toga, termini „moduliranje” i „modulisati”, „mesto interakcije”, „specifičan za”, „unakrsno blokirati”, „unakrsno blokiran” i „unakrsno blokiranje” i „suštinski nezavisno od pH” su onako kako su definisani na (i/ili se mogu odrediti kako je opisano na) stranama 74-79 WO 10/130832 podnosioca prijave. akođe, kada se odnosi na konstrukt, jedinjenje, protein ili polipeptid pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, termini poput „monovalentni”, „bivalentni” (ili „multivalentni”), „bispecifični” (ili „multispecifični”) i „biparatopni” (ili „multiparatopni”) mogu imati značenje navedeno u WO 09/138.519, WO 10/130832 ili WO 08/020079.
[0090] [0040] Termin „poluvreme eliminacije” kako se ovde koristi u vezi sa ISV, nanotelom, biološkim lekom zasnovanim na ISV, biološkim lekom zasnovanim na nanotelima ili bilo kojom drugom aminokiselinskom sekvencom, jedinjenjem ili polipeptidom, može se generalno definisati kako je opisano u stavu o) na strani 57 WO 08/020079 i, kako je tamo pomenuto, odnosi se na vreme potrebno da se koncentracija aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida u serumu redukuje za 50%, in vivo, na primer usled degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. In vivo poluvreme eliminacije aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima može se odrediti na bilo koji način poznat po sebi, kao što je farmakokinetička analiza. Pogodne tehnike biće jasne stručnjaku i mogu, na primer, generalno biti onakve kakve su opisane u stavu o) na strani 57 WO 08/020079. Kao što je takođe pomenuto u stavu o) na strani 57 WO 08/020079, poluvreme eliminacije se može izraziti korišćenjem parametara kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U tom pogledu treba napomenuti da se termin „poluvreme eliminacije” kako se ovde koristi posebno odnosi na t1/2-beta ili terminalno poluvreme eliminacije (pri čemu se t1/2-alfa i/ili AUC ili oba mogu izostaviti iz razmatranja). Upućuje se, na primer, na Eksperimentalni deo u nastavku, kao i na standardne priručnike, kao što su Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists i Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se upućuje na "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, izdavača Marcel Dekker, 2. rev. izdanje (1982). Slično tome, termini „povećanje poluvremena eliminacije” ili „povećano poluvreme eliminacije” su takođe onako kako su definisani u stavu o) na strani 57 WO 08/020079 i posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, bilo sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.
[0092] Kada termin nije specifično definisan ovde, on ima svoje uobičajeno značenje u struci, koje će biti jasno stručnjaku. Upućuje se, na primer, na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. izd.), tomovi 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, urednici, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2. izdanje, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6. izd.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10. izd. Blackwell Publishing, UK (2001); i Janeway et al., "Immunobiology" (6. izd.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), kao i na opšte stanje tehnike koje je ovde citirano.
[0094] [0042] Takođe, ovde su aminokiselinski ostaci nanotela numerisani prema opštem numerisanju za VH domene koje su dali Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kako je primenjeno na VHH domene iz porodice Camelidae u članku čiji su autori Riechmann i Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili na koji se ovde upućuje. Prema ovom numerisanju, FR1 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30, CDR1 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35, FR2 nanotela obuhvata aminokiseline na pozicijama 36-49, CDR2 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65, FR3 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94, CDR3 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102, i FR4 nanotela obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113. [U tom pogledu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za VH domene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR može varirati i možda neće odgovarati ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenom Kabat numerisanjem (to jest, jedna ili više pozicija prema Kabat numerisanju možda neće biti zauzete u stvarnoj sekvenci, ili stvarna sekvenca može sadržati više aminokiselinskih ostataka od broja koji dozvoljava Kabat numerisanje). To znači da, generalno, numerisanje prema Kabatu može, ali ne mora odgovarati stvarnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u stvarnoj sekvenci. Generalno se, međutim, može reći da, prema numerisanju po Kabatu i bez obzira na broj aminokiselinskih ostataka u CDR, pozicija 1 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR1 i obrnuto, pozicija 36 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR2 i obrnuto, pozicija 66 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR3 i obrnuto, i pozicija 103 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR4 i obrnuto.].
[0096] Alternativne metode za numerisanje aminokiselinskih ostataka VH domena, koje se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene iz porodice Camelidae i na nanotela, jesu metoda koju su opisali Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), takozvana „AbM definicija” i takozvana „kontaktna definicija”. Međutim, u predmetnom opisu, aspektima i slikama, pratiće se numerisanje prema Kabatu kako su ga na VHH domene primenili Riechmann i Muyldermans, osim ako nije drugačije naznačeno.
[0098] Takođe treba napomenuti da su slike, bilo koji spisak sekvenci i eksperimentalni deo/primeri dati samo radi dalje ilustracije pronalaska i ne bi ih trebalo interpretirati niti tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska i/ili priloženih patentnih zahteva na bilo koji način, osim ako ovde nije izričito drugačije naznačeno.
[0100] [0045] Dalje treba napomenuti da predmetni pronalazak nije specifično ograničen na bilo koji uzrok, objašnjenje, hipotezu ili mehanizam proteinske interferencije (i/ili signala koji se javljaju u imunotestovima) koja se opaža i koja se može redukovati u skladu sa predmetnim pronalaskom. Međutim, pretpostavlja se da krv ili serum (ili druge biološke tečnosti, poput onih koje su ovde pomenute) određenih pojedinaca ili grupa pojedinaca mogu sadržati određene (prethodno postojeće) proteine koji pod određenim okolnostima mogu (aspecifično) da se vežu za ISV, što dovodi do interferirajućeg signala u određenim testovima koji se koriste za analizu uzoraka krvi ili seruma dobijenih od takvih pojedinaca. Ovo je, između ostalog, zasnovano na opažanju napravljenom prilikom uspostavljanja predmetnog pronalaska da se aspecifična proteinska interferencija, kojom se bavi predmetni pronalazak, ne javlja samo prilikom testiranja uzoraka koji su dobijeni od ispitanika kojima je prethodno bio primenjen ISV, već i prilikom testiranja uzoraka koji su dobijeni od ispitanika koji prethodno nisu primili ISV.
[0102] Posebno, na osnovu opažanja koja su napravljena prilikom uspostavljanja predmetnog pronalaska, i iako pronalazak nije time ograničen, smatra se da takvi (prethodno postojeći) proteini mogu posebno (biti u stanju da) se vežu za C-terminalni kraj takvih ISV (koji su, u konvencionalnim monoklonskim antitelima pune veličine sa 4 lanca, kao i u „samo sa teškim lancima” antitelima koja se nalaze kod porodice Camelidae, povezani sa ostatkom antitela - tj. sa CH1 regionom kod konvencionalnih monoklona, odnosno sa zglobnim regionom kod antitela teških lanaca porodice Camelidae - i stoga u takvim antitelima pune veličine mogu biti zaštićeni od takve proteinske interferencije).
[0104] Ovo je potvrđeno nalazima do kojih su došli predmetni pronalazači prilikom uspostavljanja predmetnog pronalaska (koji su nalazi dalje ovde opisani) da određene (jednostavne) modifikacije ISV na njihovom C-terminalnom kraju mogu značajno redukovati ili u suštini sprečiti takvu proteinsku interferenciju. Shodno tome, metode za modifikovanje ISV na ovaj način, kao i ISV koji su modifikovani na ovaj način, čine dalje aspekte pronalaska, kako je dalje ovde opisano.
[0106] Predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se posebno koristiti za redukovanje ili izbegavanje proteinske interferencije i/ili signala usled aspecifičnog vezivanja u imunotestovima koji se izvode na biološkim uzorcima (kao što su uzorci krvi ili seruma) dobijenim od ispitanika kojem je bio primenjen (biološki) lek (ponovo, takvi uzorci se ovde takođe nazivaju „test uzorak” ili „uzorak testa”). Neki primeri ovoga su imunotestovi koji se koriste za karakterizaciju dispozicije leka i formiranja antitela nakon primene biološkog leka ispitaniku, kao što su oni na koje se upućuje u „Smernici o kliničkom ispitivanju farmakokinetike terapeutskih proteina” (dokument CHMP/EWP/89249/2004 od 27. januara 2007. godine) koju je izdao Komitet za humane lekove (CHMP) Evropske agencije za lekove (EMEA). Kao što je navedeno na stranama 4 i 5 ovog dokumenta:
[0107] „Identifikovano je nekoliko mogućih slabosti koje mogu dovesti do pogrešne karakterizacije dispozicije leka i formiranja antitela. Treba razmotriti sledeća pitanja [...]:
[0108] Imunotest
[0109] Test leka:
[0110] [...]
[0111] (iii) Interferencija endogenih supstanci.
[0112] (iv) Interferencija komponenti plazme ili anti-lek antitela koja se vezuju za analit i inhibiraju komplementarno vezivanje za zahvatno antitelo.”
[0114] Predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se posebno koristiti za predviđanje, redukovanje ili izbegavanje ovog tipa interferencije u imunotestovima koji se koriste u analizi test uzoraka/uzoraka testa bioloških tečnosti uzetih od ispitanika kojima su ISV (a posebno nanotela; ili biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima, kako je dalje ovde definisano) bili primenjeni.
[0116] Predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se posebno koristiti za predviđanje, redukovanje ili izbegavanje ovog tipa (aspecifične) proteinske interferencije u imunotestovima koji se koriste za karakterizaciju dispozicije leka i/ili za određivanje formiranja bilo kojih ADA (anti-lek) antitela. U tom pogledu, treba napomenuti da generalno u ovoj specifikaciji i u priloženim patentnim zahtevima, kada se koristi formulacija poput „predviđanje, redukovanje ili izbegavanje proteinske interferencije”, to ne uključuje samo predviđanje, redukovanje ili izbegavanje takve proteinske interferencije po sebi, već i generalno predviđanje, redukovanje ili izbegavanje pojave aspecifičnih signala u imunotestovima (kao što su oni u kojima se mogu javiti (aspecifični) signali povezani sa proteinskom interferencijom, na primer u ADA testovima), a posebno predviđanje, redukovanje ili izbegavanje, u takvim imunotestovima, pojave aspecifičnih signala koji se, kada se primete u takvom testu, obično pripisuju, povezuju sa i/ili uzimaju kao znak (aspecifične) proteinske interferencije. U tom pogledu, generalno treba napomenuti da, kao što je ovde pomenuto, predmetni pronalazak nije specifično ograničen na bilo koji uzrok, objašnjenje, hipotezu ili mehanizam.
[0118] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje, izbegavanje ili redukovanje takve proteinske interferencije u testovima za „anti-lek antitela” ili „ADA” testovima koji se izvode na uzorcima (tj. „test uzorcima”) bioloških tečnosti uzetih od ispitanika kojima su ISV (a posebno nanotela; ili biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima, kako je dalje ovde definisano) bili primenjeni.
[0119] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje, izbegavanje ili redukovanje takve proteinske interferencije (i/ili aspecifičnih signala koji se obično povezuju sa istom) u testovima za „anti-lek antitela” ili „ADA” testovima koji se koriste za detekciju, merenje i/ili karakterizaciju prisustva (bilo kojih) anti-lek antitela protiv jednog ili više ISV (a posebno protiv nanotela; ili biološkog leka zasnovanog na ISV ili biološkog leka zasnovanog na nanotelima, kako je dalje ovde definisano). Posebno, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje, izbegavanje ili redukovanje takve proteinske interferencije u takvim testovima za „anti-lek antitela” ili „ADA” testovima koji se izvode na uzorcima (tj. „test uzorcima”) bioloških tečnosti, a preciznije na uzorcima bioloških tečnosti koji su dobijeni od ispitanika kojem su jedno ili više takvih ISV ili nanotela (ili biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima, kako je dalje ovde definisano) bili primenjeni. Na primer, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje, izbegavanje ili redukovanje takve proteinske interferencije u takvim testovima za „anti-lek antitela” ili „ADA” testovima koji se koriste za detekciju, merenje i/ili karakterizaciju prisustva (bilo kojih) anti-lek antitela protiv ISV ili nanotela (ili biološkog leka zasnovanog na ISV ili biološkog leka zasnovanog na nanotelima, kako je dalje ovde definisano) koje je bilo primenjeno ispitaniku od kojeg je uzorak dobijen (bilo u kontekstu kliničkog ispitivanja i/ili u kontekstu terapije).
[0121] Dakle, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje, izbegavanje ili redukovanje takve proteinske interferencije (i/ili aspecifičnih signala koji se obično povezuju sa istom) u biološkim uzorcima (tj. „test uzorcima”) dobijenim od ispitanika kojem su jedno ili više takvih ISV ili nanotela (ili biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima, kako je dalje ovde definisano) bili primenjeni, pri čemu su navedeni uzorci pogodni za i/ili namenjeni za upotrebu u imunološkom testu, kao što je ADA test. Kao što je pomenuto, takav biološki uzorak može biti krv (uključujući punu krv, serum ili plazmu), očna tečnost, bronhoalveolarna tečnost/BALF, cerebrospinalna tečnost ili bilo koja druga pogodna biološka tečnost ili uzorak koji je pogodan za upotrebu u imunotestu, a posebno u ADA testu.
[0123] [0054] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav test uzorak može biti dobijen od ispitanika koji je bio podvrgnut višestrukim primenama (na primer, najmanje 1 do 3 odvojene primene tokom perioda od najmanje 10 dana, kao što je najmanje jedan mesec ili duže) i/ili hroničnom lečenju (tj. lečenju tokom najmanje 10 dana, kao što je najmanje jedan mesec) sa ISV, nanotelom, biološkim lekom zasnovanim na ISV (kako je dalje ovde definisano) ili biološkim lekom zasnovanim na nanotelima (kako je dalje ovde definisano). Takav ISV, nanotelo, biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima može, na primer, biti primenjen navedenom ispitaniku u kontekstu terapije ili u kontekstu kliničkog ispitivanja.
[0125] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav test uzorak može biti dobijen od ispitanika kojem je primenjen ISV, nanotelo, biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima koji ima (i/ili mu je obezbeđeno) povećano poluvreme eliminacije (kako je ovde definisano, i u poređenju sa monovalentnim ISV), na primer poluvreme eliminacije od najmanje 1 dana, prvenstveno najmanje 3 dana, još poželjnije najmanje 7 dana, kao što je najmanje 10 dana kod ispitanika kojem se isti primenjuje/je bio primenjen.
[0127] Na primer i bez ograničenja, takvom ISV, nanotelu, biološkom leku zasnovanom na ISV ili biološkom leku zasnovanom na nanotelima može se obezbediti povećano poluvreme eliminacije funkcionalizacijom i/ili uključivanjem u konstrukt dela molekula ili vezivne jedinice koja povećava poluvreme eliminacije konstrukta. Primeri takve funkcionalizacije, delova molekula ili vezivnih jedinica biće jasni stručnjaku i mogu, na primer, biti onakvi kakvi su ovde opisani, i na primer mogu uključivati pegilaciju, fuziju sa serumskim albuminom ili fuziju sa peptidom ili vezivnom jedinicom koja može da se veže za serumski protein kao što je serumski albumin. Takav peptid koji vezuje serumski albumin ili vezivni domen može biti bilo koji pogodan peptid koji vezuje serumski albumin ili vezivni domen sposoban da poveća poluvreme eliminacije konstrukta (u poređenju sa istim konstruktom bez peptida koji vezuje serumski albumin ili vezivnog domena), i može posebno biti peptid koji vezuje serumski albumin kako je opisano u WO 2008/068280 podnosioca prijave (i posebno WO 2009/127691 i neobjavljenoj US prijavi 61/301,819, obe podnosioca prijave), ili ISV koji vezuje serumski albumin (kao što je nanotelo koje vezuje serumski albumin; na primer Alb-1 ili humanizovana verzija Alb-1 kao što je Alb-8, za šta se upućuje na primer na WO 06/122787).
[0129] Dakle, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav biološki uzorak može biti dobijen od ispitanika kojem je primenjen ISV, nanotelo, biološki lek zasnovan na ISV ili biološki lek zasnovan na nanotelima koji sadrži peptid koji vezuje (humani) serumski albumin ili vezivni domen.
[0130] Kao što je već gore pomenuto, u jednom neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima generalno se odnosi na metodu koja se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati (ili ima visoku ili povećanu tendenciju da izazove) proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (tj. nakon što je navedeni ISV primenjen ispitaniku, uzorak biološke tečnosti dobijen od navedenog ispitanika, i navedena biološka tečnost podvrgnuta imunotestu kako je dalje ovde opisano), pri čemu navedena metoda obuhvata izvođenje imunotesta koji obuhvata najmanje sledeće korake:
[0131] (i) kontaktiranje navedenog ISV ili nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili nanotelu) sa antitelom koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano, generisano i/ili izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela („analitičko antitelo”); i
[0132] (ii) određivanje da li je navedeni ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) vezan navedenim antitelom u navedenom imunotestu.
[0134] Ponovo, kao što je ovde pomenuto, ISV kako je ovde opisan može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0136] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što je lek zasnovan na ISV) prvenstveno ima navedeno (ili barem jedno) takvo ISV na svom C-terminalnom kraju. Ponovo, navedeno ISV može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0138] [0061] U alternativnom aspektu, koji je takođe dalje ovde opisan, umesto gorepomenutog antitela dobijenog od humanog ispitanika, može se koristiti monoklonsko antitelo koje se ovde naziva „21-4-3” (ili skraćeno „21-4”, videti SEQ ID NO: 35 i 36 za VH i VL sekvence). Antitelo 21-4 je generisano tehnologijom hibridoma polazeći od miša imunizovanog konstruktom nanotela SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825, kao što je dalje opisano u primeru 7, a ćelijska linija hibridoma (nazvana „ABH0015”) koja eksprimira 21-4 deponovana je 4. juna 2012. godine kod BCCM, Ghent, Belgium, pod pristupnim brojem LMBP-9680-CB. Pokazano je da monoklonsko antitelo 21-4 prepoznaje C-terminalni kraj konstrukta nanotela SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825, čiji se C-terminalni kraj sastoji od nanotela (humanizovanog V<HH>) usmerenog protiv Fon Vilebrandovog faktora (vWF). Antitelo 21-4 je prvobitno generisano kao analitički reagens za upotrebu u detekciji proteinskih nanotela (posebno konstrukta nanotela SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825) u uzorcima (seruma); iznenađujuće, sada je utvrđeno da se 21-4 takođe može koristiti kako bi se predvidelo da li ISV ima tendenciju da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji (više nego neki drugi, uporedivi (mišji) monokloni usmereni protiv konstrukta nanotela SEQ ID NO: 98 u WO 2006/122825 ili protiv drugih nanotela).
[0140] Posebno je utvrđeno da, ako merenje vezivanja 21-4 za ISV (ili za protein ili polipeptid koji sadrži ISV na svom C-terminalnom kraju, ili sličan protein ili polipeptid kao što je ovde pomenuto) daje RU vrednost manju od 500 (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu proteina, prema formuli [izmeren RU] / [MW proteina] x 10<6>) kada se odredi prema protokolu navedenom u primeru 9, navedeni ISV ili protein verovatno neće imati tendenciju da podleže proteinskoj interferenciji (u okviru pouzdanosti koju pružaju podaci navedeni u primerima u nastavku). Za potrebe gore navedene formule, MW se može izračunati kao zbir svih MW svih aminokiselinskih ostataka prisutnih u ISV.
[0142] Shodno tome, bilo koji ISV, protein ili polipeptid opisan ovde prvenstveno ima takvu RU vrednost za vezivanje antitelom 21-4 manju od 500 (određenu prema protokolu navedenom u primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu korišćenog ISV ili proteina prema gore navedenoj formuli).
[0144] Dakle, ovaj aspekt predmetnog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima generalno se odnosi na metodu koja se može koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati (ili ima visoku ili povećanu tendenciju da izazove) proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (tj. nakon što je navedeni ISV primenjen ispitaniku, uzorak biološke tečnosti dobijen od navedenog ispitanika, i navedena biološka tečnost podvrgnuta imunotestu kako je dalje ovde opisano), pri čemu navedena metoda obuhvata izvođenje imunotesta koji obuhvata najmanje sledeće korake:
[0145] (i) kontaktiranje navedenog ISV ili nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili nanotelu) sa monoklonskim antitelom 21-4 (tj. korišćenim kao „analitičko antitelo”); i
[0146] (ii) određivanje da li je navedeni ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) vezan monoklonskim antitelom 21-4 u navedenom imunotestu.
[0147] Navedena metoda se posebno može izvesti korišćenjem BiaCore ili slične tehnike, a preciznije korišćenjem protokola navedenog u primeru 9. Kao što je ovde pomenuto, kada vezivanje ISV ili leka zasnovanog na ISV u ovom protokolu pokazuje RU vrednost manju od 500 (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu proteina, prema formuli [izmeren RU] / [MW proteina] x 10<6>), navedeni ISV ili protein zasnovan na ISV verovatno neće biti vezan bilo kojim faktorom (ili faktorima) interferencije prisutnim u krvi ili serumu čoveka i/ili verovatno neće imati tendenciju da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji u ADA testu (tj. u okviru stepena pouzdanosti navedenih u eksperimentalnom delu u nastavku).
[0149] Ponovo, kao što je ovde pomenuto, ISV kako je ovde opisan može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0151] Takođe, bilo koji protein ili polipeptid koji sadrži ISV (kao što je lek zasnovan na ISV) prvenstveno ima navedeno (ili barem jedno) takvo ISV na svom C-terminalnom kraju. Ponovo, navedeno ISV može posebno biti ili nanotelo ili drugo ISV (tj. osim nanotela) koje je VH domen ili koje sadrži VH domen; a prvenstveno je nanotelo.
[0153] Kao što je takođe ovde pomenuto, gore navedena metoda koja koristi 21-4 može se takođe koristiti za određivanje da li se za ISV ili protein ili polipeptid koji sadrži ISV vezuju (ili imaju tendenciju da se za njih vežu) faktori interferencije koji su prisutni u krvi ili serumu čoveka.
[0155] Takođe, kao što je ovde pomenuto, predviđa se da se navedena metoda koja koristi 21-4 može takođe koristiti za predviđanje da li će se za bilo koji protein ili polipeptid (kao što je fragment antitela ili ScFv) koji ima VH domen na svom C-terminalnom kraju vezati (ili ima tendenciju da se za njega vežu) faktori interferencije koji su prisutni u krvi ili serumu čoveka i/ili ima tendenciju da podleže proteinskoj interferenciji u ADA testu.
[0157] Pored 21-4, predviđa se da se antitelo ili fragment antitela (kao što je pogodan Fab fragment) koji sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca antitela 21-4 (videti SEQ ID NO: 35 i 36, respektivno) ili čak samo CDR sekvence 21-4 (pogodno kalemljene u druge pogodne VH i VK okvire) takođe može koristiti u metodama koje su ovde opisane.
[0158] Kao što je dalje ovde opisano, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se posebno koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu koji je ADA test. Navedeni ADA test može, na primer, biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može posebno biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV korišćenog u gore navedenim koracima (i) i (ii).
[0160] U jednom posebno preferiranom, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (a posebno u ADA testu) koji uključuje upotrebu takvog ISV. Ponovo, navedeni ADA test može, na primer, biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV generalno, i može posebno biti ADA test za detekciju ili merenje ADA protiv ISV korišćenog u gore navedenim koracima (i) i (ii).
[0162] U još specifičnijem, ali neograničavajućem aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može se koristiti za predviđanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu) izazvati proteinsku interferenciju (kako je dalje ovde opisano) u imunotestu (a posebno u ADA testu) koji uključuje upotrebu takvog ISV. Na primer, takav imunotest može biti ADA test (tj. koji uključuje ISV) koji se izvodi da bi se utvrdilo ili izmerilo da li su bilo koja anti-lek antitela protiv navedenog ISV prisutna u uzorku koji se testira, pri čemu je navedeni uzorak uzorak biološke tečnosti (kako je ovde opisano) koji je dobijen od ispitanika kojem je navedeni ISV bio primenjen (kako je dalje ovde opisano). Na primer, kao što je dalje ovde pomenuto, navedeni uzorak (tj. „test uzorak”) može biti uzorak (uključujući punu krv, serum ili plazmu), očna tečnost, bronhoalveolarna tečnost/BALF, cerebrospinalna tečnost ili bilo koja druga pogodna biološka tečnost, i može posebno biti biološki uzorak koji je pogodan za i/ili namenjen za upotrebu u imunološkom testu, kao što je ADA test.
[0164] [0074] Kao što je dalje ovde opisano, u svim ovim aspektima (i daljim aspektima korisnim u ili sa predmetnim pronalaskom kako je definisan u patentnim zahtevima), predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima takođe se može koristiti za selekciju ISV koji nisu ili su manje skloni takvoj proteinskoj interferenciji u takvim imunotestovima ili ADA testovima; kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za proveru da li će određena modifikacija (ili modifikacije) na ISV (potpuno ili delimično) redukovati njegovu tendenciju da izazove takvu interferenciju u takvim imunotestovima ili ADA testovima; i/ili kao test ili ispitivanje koje se može koristiti za usmeravanje modifikacije ili poboljšanja ISV kako bi se redukovala njegova tendencija da izazove takvu proteinsku interferenciju u takvim imunotestovima ili ADA testovima.
[0166] Kao što je pomenuto, korak (i) metode pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima obuhvata kontaktiranje navedenog ISV ili nanotela (ili leka zasnovanog na ISV ili nanotelu) sa antitelom koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano/izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela (kako je dalje ovde opisano). U navedenom koraku (i) ovde opisane metode, „navedeni ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelu)” koristi se kao antigen u imunotestu (tj. kao supstanca koju treba detektovati). Takođe, u navedenom koraku (i), „antitelo koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano/izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela” koristi se kao analitički reagens (tj. na isti način na koji se druga antitela koriste u imunotestovima za detekciju prisustva antigena protiv kojeg su usmerena).
[0168] Kao što je već pomenuto, a radi boljeg razumevanja pronalaska koji je ovde opisan, treba napomenuti da će se, u koraku (i), ISV obično koristiti kao „antigen” (tj. kao jedinjenje koje treba detektovati), a „analitičko antitelo” će se koristiti kao analitički agens (tj. kao sredstvo za detekciju da li se dati ISV vezuje ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne, respektivno). Na primer, kada se korak (i) izvodi u ELISA formatu, „antitelo/analitički agens” će obično biti vezano za nosač (tj. za ELISA ploču), a ISV će biti (prisutan u) uzorku koji se testira.
[0170] Nasuprot tome, treba napomenuti da se u ADA testovima za detekciju ili merenje antilek antitela protiv ISV, ISV koristi kao „analitički agens” (tj. kao jedinjenje koje se koristi za detekciju da li su bilo koja anti-lek antitela prisutna), a anti-lek antitela su „antigen” (tj. jedinjenje koje treba detektovati). Dakle, u ovim testovima, ISV će obično/često biti vezan za nosač (kao što je ELISA ploča), dok će ADA (ako ih ima) biti prisutna u uzorku koji se podvrgava testu.
[0171] Međutim, kao što je već pomenuto, generalno treba napomenuti da pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima nije ograničen na testove u kojima je „analitičko antitelo” vezano za nosač. Na primer, u alternativnom načinu izvođenja testa prema pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima (kao što je prikazano u primeru
[0172] 5), analitičko antitelo se umesto toga koristi kao agens za premošćavanje i stoga će biti u rastvoru, a ne vezano za ploču (iako je indirektno vezano za ploču preko ISV koji je nanet na ploču). Međutim, i u specifičnom testu (premošćavanja) opisanom u primeru 5 (koji je kompetitivni test), analitičko antitelo se i dalje koristi kao analitički agens (tj. da bi se utvrdilo da li se ISV od interesa vezuje ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne, respektivno). Takođe se predviđa da će, na osnovu daljeg ovdašnjeg obelodanjivanja, stručnjak moći da osmisli druge formate testova u kojima se analitičko antitelo može koristiti kao analitički agens kako bi se utvrdilo da li se dati ISV može vezati ili ne, respektivno; i samim tim da li ima visok ili povećan rizik od izazivanja proteinske interferencije ili ne).
[0174] „Analitičko antitelo” korišćeno u koraku (i) može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo.
[0176] [0080] Kada je analitičko antitelo poliklonsko antitelo, ono može, na primer, biti poliklonsko antitelo (preparat) koje je dobijeno/prečišćeno/izolovano iz biološkog uzorka dobijenog od humanog ispitanika (kao što su krv, plazma, B-ćelije ili drugi pogodan biološki uzorak ili tečnost iz kojih se poliklonska antitela mogu na pogodan način izolovati). To može, na primer, biti pogodan biološki uzorak koji je dobijen od humanog ispitanika kojem je bio primenjen najmanje jedan ISV (kao što je ISV korišćen u koraku (i), ali to nije neophodno niti suštinski važno), ali takođe može biti (i prvenstveno jeste) pogodan biološki uzorak od humanog ispitanika koji nikada nije primio ISV niti je njime bio lečen. WOno što je važnije jeste da je poliklonsko antitelo dobijeno iz navedenog biološkog uzorka metodom koja uključuje najmanje jedan korak afinitetne hromatografije korišćenjem afinitetne matrice ili kolone koja nosi ISV kao deo molekula sa afinitetom (i jedan ili više daljih koraka za dobijanje/prečišćavanje/izolovanje poliklonskih antitela koji su poznati po sebi). Na primer, poliklonsko antitelo je moglo biti dobijeno iz takvog biološkog uzorka putem afinitetne hromatografije korišćenjem afinitetne kolone koja nosi ISV, kao što je na primer opisano u primeru 2. Ovo se, na primer, može izvesti korišćenjem dobro poznatih tehnika imunoafinitetne hromatografije za izolovanje antitela iz biološkog uzorka, korišćenjem afinitetne matrice koja nosi ISV kao antigen. Takve tehnike su generalno poznate u struci i njihovi pogodni primeri biće jasni stručnjaku na osnovu ovdašnjeg obelodanjivanja.
[0178] Takvo poliklonsko antitelo (preparat) može posebno biti IgG (ili IgG frakcija).
[0180] Na primer, to može biti poliklonsko antitelo koje je dobijeno putem metode koja uključuje (imuno)afinitetnu hromatografiju, izvedenu na uzorku biološke tečnosti dobijene od humanog ispitanika, koristeći kao antigen vezan za afinitetnu matricu ISV (a posebno nanotelo, kao što je VHH, humanizovan i/ili sekvencijalno optimizovan VHH ili kamelizovan VH, kao što je kamelizovan humani VH) koji ne sadrži C-terminalni marker (tj. čiji se C-terminalni kraj završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 33)). Posebno, ISV korišćen kao antigen vezan za afinitetnu matricu može biti humanizovan ili sekvencijalno optimizovan VHH (ili alternativno odgovarajući kamelizovan humani VH) čiji se C-terminalni kraj završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 33). U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, ISV korišćen kao antigen vezan za afinitetnu matricu može biti humanizovan ili sekvencijalno optimizovan VHH koji, kao rezultat takve humanizacije ili sekvencijalne optimizacije, sadrži prolin (P) na poziciji 14, dok odgovarajući „naivni” VHH sadrži alanin (A) na poziciji 14 (drugim rečima, ISV korišćen kao antigen je humanizovana verzija VHH koja prirodno sadrži alanin na poziciji 14, pri čemu je taj ostatak alanina, kao rezultat humanizacije i/ili sekvencijalne optimizacije, zamenjen ostatkom prolina (P)). ISV korišćen kao antigen može takođe sadržati jednu ili više drugih aminokiselinskih supstitucija kao rezultat takve humanizacije ili sekvencijalne optimizacije, na primer onako kako je generalno opisano u WO 08/020079 ili WO 09/138519.
[0182] Neki specifični primeri ISV koji se mogu koristiti kao antigen za generisanje/izolovanje „analitičkog antitela” korišćenog u pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima dati su u SEQ ID NO: 1 i 2.
[0184] Ponovo, metoda koja se koristi za dobijanje poliklonskog antitela može, pored koraka (imuno)afinitetne hromatografije, obuhvatati i jedan ili više daljih koraka za izolovanje/prečišćavanje poliklonskog antitela iz biološkog uzorka (izvedenih bilo pre ili posle koraka afinitetne hromatografije). Ponovo, takvi koraci i tehnike za njihovo izvođenje biće jasni stručnjaku.
[0185] Dakle, u jednom aspektu, predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima obuhvata metodu, kako je dalje ovde opisano, koja obuhvata korake (i) i (ii) opisane ovde, u kojoj je „analitičko antitelo” (tj. antitelo koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano/izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela) dobijeno iz biološkog uzorka uzetog od humanog ispitanika (pri čemu je navedeni biološki uzorak uzorak koji je pogodan za upotrebu u metodi za generisanje/izolovanje antitela iz navedenog uzorka) korišćenjem metode koja obuhvata najmanje jedan korak afinitetne hromatografije (kao što je korak afinitetne hromatografije, na primer imunoafinitetne hromatografije) u kojoj se ISV (a prvenstveno nanotelo) koristi kao antigen, i prvenstveno se kao antigen koristi ISV koji kao C-terminalnu sekvencu sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33), a još poželjnije se kao antigen koristi humanizovano i/ili sekvencijalno optimizovano nanotelo koje kao C-terminalnu sekvencu sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33), i još poželjnije se kao antigen koristi humanizovano i/ili sekvencijalno optimizovano nanotelo koje kao C-terminalnu sekvencu sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) i koje sadrži ostatak prolina na poziciji 14, kao što je nanotelo koje kao C-terminalnu sekvencu sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) i koje sadrži ostatak prolina na poziciji 14 koji je uveden u nanotelo kao rezultat navedene humanizacije i/ili sekvencijalne optimizacije (na primer, da bi se zamenio ostatak alanina koji se prirodno javlja na navedenoj poziciji u VHH koji je humanizovan i/ili sekvencijalno optimizovan).
[0187] Gore navedeni ISV se takođe mogu koristiti u metodama za izolovanje monoklonskih antitela (ponovo polazeći od pogodnog biološkog uzorka dobijenog od čoveka) koja su pogodna za upotrebu u pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima kao „analitičko antitelo”.
[0189] [0087] Na primer, takvo monoklonsko antitelo može se dobiti polazeći od krvi, B-ćelija ili drugog pogodnog uzorka ili materijala za izolovanje antitela, i može biti selektovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za (C-terminalni kraj) ISV ili nanotela (pri čemu su, ponovo, ISV korišćeni kao antigen tokom skrininga i/ili selekcije prvenstveno onakvi kakvi su opisani u prethodnim stavovima, uključujući navedene preferencije za takav ISV/antigen). Takav skrining i selekcija mogu se izvesti na bilo koji pogodan način, na primer korišćenjem tehnika selekcije i/ili ekspanzije B-ćelija koje su u suštini iste ili pogodno slične tehnikama selekcije B-ćelija opisanim u EP 0488 470, WO 92/02551, EP 1633 787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 ili WO 04/106377 ili tehnikama sličnim Nanoclone tehnici opisanoj u WO 06/079372 (ali koristeći humane B-ćelije umesto B-ćelija kamelida).
[0191] Kada se identifikuju/izoluju jedna ili više B-ćelija koje eksprimiraju pogodno antitelo, navedeno antitelo se može izolovati, eksprimirati i/ili proizvesti na bilo koji pogodan način. Na primer, navedene B-ćelije se mogu imortalizovati kao hibridomi koji proizvode željeno antitelo/antitela (koristeći tehnike koje su po sebi dobro poznate za generisanje hibridoma polazeći od selektovanih B-ćelija), a navedeno antitelo/antitela se zatim mogu izolovati iz (supernatanta kulture) navedenih hibridoma, ponovo koristeći pogodne tehnike koje su dobro uspostavljene u struci i opisane u različitim priručnicima i manuelima, a takođe opisane i/ili pomenute u patentnim publikacijama navedenim u prethodnom stavu.
[0193] Alternativno, navedene B-ćelije se mogu ekspandirati korišćenjem tehnika ekspanzije B-ćelija koje su poznate po sebi, a antitelo/antitela se mogu izolovati iz (supernatanta kulture) navedenih ekspandiranih B-ćelija. Ponovo, ovo se može izvesti korišćenjem pogodnih tehnika dobro uspostavljenih u struci i opisanih u različitim priručnicima i manuelima, a takođe opisanih i/ili pomenutih u patentnim publikacijama navedenim u prethodnim stavovima.
[0195] U još jednoj alternativi, DNK koja kodira antitelo/antitela od interesa može se dobiti (npr. amplifikacijom) iz navedenih B-ćelija ili drugih pogodnih ćelija, bilo direktno (na primer korišćenjem pogodnih tehnika PCR kloniranja iz pojedinačnih ćelija) ili nakon pogodne ekspanzije željenih B-ćelija. Navedena DNK se zatim može na pogodan način eksprimirati u pogodnoj ćeliji domaćinu ili organizmu domaćinu kako bi se obezbedilo željeno antitelo/antitela. Ponovo, ovo se može izvesti korišćenjem pogodnih tehnika dobro uspostavljenih u struci i opisanih u različitim priručnicima i manuelima, a takođe opisanih i/ili pomenutih u patentnim publikacijama navedenim u prethodnim stavovima.
[0197] [0091] Takođe je moguće generisati monoklonska antitela pogodna za upotrebu kao „analitičko antitelo” metodom koja uključuje kloniranje repertoara (polazeći od pogodnog uzorka dobijenog od humanog ispitanika) i skrining kloniranog repertoara na antitela koja se vezuju za ISV korišćen kao antigen (pri čemu su, ponovo, ISV korišćeni kao antigen tokom skrininga i/ili selekcije prvenstveno onakvi kakvi su opisani u prethodnim stavovima, uključujući navedene preferencije za takav ISV/antigen). Metode za kloniranje repertoara i različite tehnike za prikazivanje kloniranih repertoara radi selekcije i skrininga (kao što su fagovni prikaz, ribozomni prikaz i prikaz na kvascima) biće jasne stručnjaku, i opisane su na primer u EP 0 589 877, EP 0774 511, WO 90/14430 i EP 0368 684, kao i u različitim priručnicima na tu temu.
[0199] Generalno, biološki uzorak koji se koristi kao polazna tačka za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) analitičkog antitela može biti bilo koji pogodan uzorak (tj. pogodan kao polazni materijal za dobijanje poliklonskog, odnosno monoklonskog antitela) dobijen od bilo kog pogodnog humanog ispitanika. U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, takav uzorak može na primer biti dobijen od žene, a posebno od žene u postmenopauzi. Dakle, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, analitičko antitelo korišćeno u koracima (i) i (ii) gore dobijeno je polazeći od biološkog uzorka koji je dobijen/izveden od žene u postmenopauzi (ili je izvedeno iz antitela koje je dobijeno/izvedeno od žene u postmenopauzi).
[0201] Takođe, biološki uzorak koji se koristi kao polazna tačka za dobijanje (poliklonskog ili monoklonskog) analitičkog antitela može biti dobijen od ispitanika kojem je prethodno bio primenjen ISV (na primer, kao deo kliničkog ispitivanja ili terapijski), ali se prvenstveno dobija od ispitanika kojem prethodno nije primenjen nijedan ISV.
[0203] Međutim, treba napomenuti da pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima nije posebno ograničen na izvor korišćenog analitičkog antitela/antitela, i pokazalo se mogućim u nekim slučajevima, korišćenjem ovde opisanih tehnika, dobiti (generisati, izolovati) druga pogodna analitička antitela iz drugih izvora, uključujući komercijalno dostupnu krv ili plazmu čoveka (pa čak i krv, plazmu ili B-ćelije drugih vrsta sisara ili primata, kao što su babun ili makaki majmun).
[0205] Kao što je gore pomenuto, (poliklonsko ili monoklonsko) analitičko antitelo korišćeno u koracima (i) i (ii) treba da bude takvo da je sposobno da prepozna ili se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela, i najpoželjnije je selektovano i/ili izolovano na osnovu ove sposobnosti da se veže za C-terminalni kraj ISV ili nanotela.
[0207] [0096] Kao što se može videti sa slike 2, kada je ISV zasnovan na ili izveden iz VH ili VHH domena, C-terminalni kraj ISV obuhvata aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33), i shodno tome, analitičko antitelo treba da bude sposobno da prepozna bilo koji ISV koji ima aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) na svom C-terminalnom kraju. Kao što se dalje može videti sa slike 2, (barem neki od aminokiselinskih ostataka u) sekvenci VTVSS (SEQ ID NO: 33) deo je pretpostavljenog epitopa na ISV koji takođe uključuje, između ostalih ostataka, aminokiselinski ostatak na poziciji 14 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu istog u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su pozicije 11, 13 i 15) i može takođe obuhvatati aminokiselinski ostatak na poziciji 83 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu istog u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su pozicije 82, 82a, 82b i 84) i/ili aminokiselinski ostatak na poziciji 108 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu istog u aminokiselinskoj sekvenci, kao što je pozicija 107. Pozicija 109 je prvo V u C-terminalnoj sekvenci VTVSS (SEQ ID NO: 33) i pokazano je da, na primer, pozicija 110 takođe može imati uticaj na proteinsku interferenciju). Ovo se ovde takođe kolektivno naziva „C-terminalni region”, pri čemu se podrazumeva da ovaj C-terminalni region obuhvata najmanje C-terminalnu sekvencu VTVSS (SEQ ID NO: 33) i aminokiselinski ostatak na poziciji 14, a može obuhvatati i aminokiselinske ostatke na pozicijama 83 i 108, a verovatno i aminokiselinske ostatke na pozicijama 13, 15, 82b, 83, 84 i 107.
[0209] Kao što je već pomenuto, i ponovo bez ograničavanja na bilo koju hipotezu ili objašnjenje, u monoklonskom antitelu pune dužine sa 4 lanca, ili u antitelu pune dužine samo sa teškim lancima kakva su prisutna kod Camelidae, C-terminalni kraj VH ili VHH domena je povezan sa ostatkom antitela - tj. sa CH1 regionom kod konvencionalnih monoklona, odnosno sa regionom šarke (hinge) kod antitela teških lanaca kamelida - i tako u takvim antitelima pune dužine može biti zaštićen od takve proteinske interferencije i/ili prekriven VH/VL interakcijom (kod konvencionalnih antitela sa 4 lanca), tako da ovaj „C-terminalni region” obično nije izložen rastvaraču i/ili dostupan kao mesto interakcije za proteine koji su prisutni u krvi, serumu ili telu osobe kojoj se takav ISV primenjuje. Međutim, ako se ISV ili nanotelo koristi po sebi (tj. bez povezivanja sa bilo kojim drugim delom antitela), ili ako se koristi lek zasnovan na ISV ili nanotelo koji nosi ISV ili nanotelo na svom C-terminalnom kraju, ovaj C-terminalni epitop je dostupan za (aspecifičnu) interakciju sa drugim proteinima. Ponovo bez ograničavanja na bilo koju hipotezu, pretpostavlja se da ovaj C-terminalni region sada može biti dostupan za (aspecifičnu) proteinsku interakciju sa jednim ili više proteina koji prethodno postoje u „test uzorku” (na primer, jedan ili više IgG) koji se testira, i da to može izazvati proteinsku interferenciju i/ili aspecifične signale u imunotestovima (a posebno u ADA testovima).
[0210] Kao što je pomenuto, ovde opisane metode mogu se koristiti za predviđanje, redukciju ili izbegavanje takve proteinske interakcije, a mogu se koristiti i kao alat za usmeravanje modifikacija na ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima, kako bi se obezbedila ista sa (delimično ili prvenstveno suštinski potpuno) redukovanom tendencijom da izazovu takvu proteinsku interferenciju.
[0212] Kao što će biti jasno iz prethodnog stava, i ponovo bez ograničavanja na bilo koju hipotezu, posebno se očekuje (i deo je učenja ovog pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima) da će (određene) modifikacije „C-terminalnog regiona” izmeniti (i prvenstveno redukovati) tendenciju ISV da podleže takvoj aspecifičnoj proteinskoj interakciji, a to je i ono što je eksperimentalno uočeno (videti na primer eksperimentalne rezultate predstavljene u primerima 1C i 3 u nastavku).
[0214] Na osnovu ovoga, i ponovo bez ograničavanja na bilo koju hipotezu ili objašnjenje, predmetna specifikacija takođe podučava o određenim modifikacijama koje se u tu svrhu mogu uvesti u C-terminalni region ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima (čija se potencijalna efikasnost može testirati korišćenjem ovde opisanih metoda). Takođe, na osnovu ovdašnjeg učenja, predviđa se da će stručnjak moći da izabere, dizajnira ili predloži druge (kandidatne) modifikacije C-terminalnog regiona koje bi se mogle uvesti u tu svrhu (i čija se potencijalna efikasnost ponovo može testirati korišćenjem ovde opisanih metoda).
[0216] Vraćajući se na analitičko antitelo koje se koristi u pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima, to je prvenstveno (poliklonsko ili monoklonsko) antitelo koje prepoznaje C-terminalni region (kako je gore definisano) ISV, a posebno, ali bez ograničenja, C-terminalni region nanotela.
[0218] [0102] Na primer, u jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, „analitičko antitelo” može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže za, a posebno da se specifično veže za) C-terminalni region ISV ili nanotela čiji se C-terminalni kraj sekvence završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33), ali ne prepoznaje (i/ili nije sposobno za specifično vezivanje za) C-terminalni region ISV ili nanotela (što može biti različit ISV, ali je prvenstveno isti ISV) kada postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala peptidna sekvenca ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID NO: 33).
[0220] U drugom, specifičnijem, ali i dalje neograničavajućem aspektu, „analitičko antitelo” može biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže za, a posebno da se specifično veže za) C-terminalni region ISV ili nanotela čiji se C-terminalni kraj sekvence završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i u kojem je na poziciji 14 aminokiselina koja se prirodno ne javlja na poziciji 14 i/ili je modifikovana u poređenju sa aminokiselinom koja se prirodno javlja na poziciji 14 (na primer kao rezultat humanizacije, kamelizacije i/ili sekvencijalne optimizacije), ali koje ne prepoznaje (i/ili nije sposobno za specifično vezivanje za) C-terminalni region ISV ili nanotela (što može biti različit ISV, ali je prvenstveno isti ISV) u kojem postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala peptidna sekvenca ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID NO: 33); i/ili u kojem je na poziciji 14 aminokiselina koja se prirodno javlja na poziciji 14 (na primer alanin ili, kada ISV prirodno sadrži prolin na poziciji 14, prolin).
[0222] Na primer, „analitičko antitelo” može biti i poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže za, a posebno da se specifično veže za) C-terminalni region ISV ili nanotela čiji se C-terminalni kraj sekvence završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i u kojem je na poziciji 14 prolin (i to posebno kada je pozicija 14 modifikovana u prolin, na primer kao rezultat humanizacije, kamelizacije i/ili sekvencijalne optimizacije), ali ne prepoznaje C-terminalni region ISV ili nanotela (što može biti različit ISV, ali je prvenstveno isti ISV) u kojem postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala peptidna sekvenca ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID NO: 33); i/ili u kojem je na poziciji 14 alanin.
[0224] [0105] „Analitičko antitelo” može takođe biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje (i/ili je sposobno da se veže za, a posebno da se specifično veže za) C-terminalni region ISV ili nanotela čiji se C-terminalni kraj sekvence završava sa VTVSS (SEQ ID NO: 33) i u kojem je na poziciji 14 prolin (posebno tamo gde se ostatak prolina prirodno javlja na navedenoj poziciji u navedenom ISV), ali ne prepoznaje C-terminalni region ISV ili nanotela (što može biti različit ISV, ali je prvenstveno isti ISV) u kojem postoji jedan ili više dodatnih aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 5 aminokiselinskih ostataka, ili alternativno mala peptidna sekvenca ili čak drugi polipeptid ili protein) povezanih sa C-terminalnim VTVSS (SEQ ID NO: 33) u kojem je pozicija 14 i dalje (prirodno javljajući se ili nemodifikovan) prolin.
[0226] „Analitičko antitelo” takođe može, na primer, biti poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje prepoznaje (C-terminalni region) sekvence ISV koji se ovde naziva „Nb 3.4” (SEQ ID NO: 5), ali ne prepoznaje (C-terminalni region) sekvence ISV koji se ovde naziva „Nb 3.1” (SEQ ID NO: 3) i/ili (i prvenstveno i) ne prepoznaje sekvencu ISV koji se ovde naziva „Nb 3.2” (SEQ ID NO: 4).
[0228] U gore navedenu svrhu, to da li „analitičko antitelo” prepoznaje (ili ne prepoznaje) ISV ili nanotelo (i/ili da li je sposobno ili nije sposobno za specifično vezivanje za ISV ili nanotelo) može se odrediti korišćenjem bilo kog pogodnog testa vezivanja (kao što je Biacore), ali se takođe može odrediti korišćenjem bilo BIACORE testa opisanog u primeru 3 ili ADA testa, kao što je ADA test premošćavanja/komperitivni test opisan u primeru 5 (videti takođe slike 1A do 1C, a posebno sliku 1B).
[0230] Pogodni formati/tehnike za izvođenje takvog testa biće jasni stručnjaku na osnovu ovdašnjeg obelodanjivanja i, na primer, uključuju (bez ograničenja):
[0231] − Kolorimetrijski test kao što je ELISA sa analitičkim antitelom nanetim direktno ili indirektno na ploču i detekcijom vezanog ISV pomoću monoklonskog ili poliklonskog anti-ISV antitela. Druge korisne alternativne tehnologije za ovu postavku uključuju, ali nisu ograničene na, elektrohemiluminiscenciju (MSD platforma), fluorescenciju (DELFIA, GYROS) i druge metode koje se oslanjaju na sekundarnu detekciju vezanog ISV.
[0232] − Površinska plazmonska rezonanca (kao što je BIACORE) ili druga metoda sa biosenzorom u realnom vremenu (tj. druga metoda osim SPR) sa direktno ili indirektno imobilizovanim analitičkim antitelom i praćenjem vezivanja naknadno injektovanog/primenjenog ISV. Ove metode ne zahtevaju dalju detekciju vezanog ISV. Reprezentativna metoda za izvođenje ovog tipa testa opisana je u primeru 3.
[0233] − Analiza kompetitivnog ponašanja ISV u testu premošćavanja (ADA test) korišćenjem analitičkog antitela umesto biološke tečnosti koja sadrži anti-lek antitela. Za test premošćavanja mogu se koristiti različite tehnologije kao što su ELISA ili MSD platforma.
[0234] Reprezentativne metode za izvođenje ovog tipa testa shematski su prikazane na slikama 1A do 1C, a jedan specifičan primer ove vrste testa takođe je opisan u primeru 5.
[0235] − Bilo koja hromatografska metoda u kojoj je analitičko antitelo imobilizovano na hromatografsku matricu i specifično hvatanje/izolovanje ISV iz rastvora.
[0237] Kada se dobije pogodno analitičko antitelo korišćenjem jedne od metoda opisanih ovde ili u jednom od primera (ili metode koja je suštinski ekvivalentna istoj), navedeno analitičko antitelo se može koristiti za određivanje da li će dati ISV ili nanotelo (ili lek zasnovan na ISV ili nanotelima) izazvati (ili ima visoku ili povećanu tendenciju da izazove) proteinsku interferenciju (kako je ovde definisano), tj. izvođenjem gore opisanih koraka (i) i (ii). Kao što je već ovde opisano, ovo generalno uključuje kontaktiranje navedenog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima sa analitičkim antitelom i određivanje da li je navedeni ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima prepoznat (i/ili vezan, a posebno specifično vezan) navedenim analitičkim antitelom (a posebno da li je C-terminalni region navedenog ISV ili nanotela, ili bilo kog ISV ili nanotela koje čini C-terminalni kraj navedenog leka zasnovanog na ISV ili nanotelima, prepoznat navedenim analitičkim antitelom).
[0239] Ovo se generalno može izvesti korišćenjem bilo koje pogodne tehnike za određivanje da li je antigen (u ovom slučaju ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima) vezan antitelom, a pogodne tehnike (imuno)testova biće jasne stručnjaku. Neki neograničavajući primeri su pogodne ELISA tehnike (uključujući, na primer, sendvič ELISA testove); u kojima, zavisno od korišćenog ELISA formata (što će biti jasno stručnjaku), ili analitičko antitelo ili ISV mogu biti naneti na ploču, a analitičko antitelo ili ISV mogu biti detektabilno obeleženi. Druge tehnike mogu, na primer, uključivati upotrebu BIAcore instrumenta (gde ponovo ili analitičko antitelo ili ISV mogu biti naneti na čip, videti na primer primer 3). Druga alternativa može biti kompetitivni test premošćavanja (kao što je, na primer, ilustrovano u primeru 5), u kojem se testira sposobnost ISV da se takmiči sa drugim ISV, nanotelom, lekom zasnovanim na ISV ili lekom zasnovanom na nanotelima za koji je poznato da ga analitičko antitelo vezuje (ili obrnuto). Ove i druge pogodne tehnike za određivanje da li je dati ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima (specifično) vezan ili prepoznat analitičkim antitelom biće jasne stručnjaku na osnovu ovdašnjeg obelodanjivanja.
[0240] Takođe će biti jasno, na osnovu ovdašnjeg obelodanjivanja, da se predmetni pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima (a posebno analitičko antitelo korišćeno u predmetnom pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima) može koristiti za određivanje da li dati ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima sadrži mesto interakcije (kao što je mesto interakcije prisutno na ili unutar C-terminalnog regiona, i/ili čiji C-terminalni region čini deo) koje je sposobno da podleže (aspecifičnoj) proteinskoj interakciji sa jednim ili više proteina ili drugim komponentama koje mogu biti prisutne u biološkom uzorku (tj. „test uzorku”) dobijenom od ispitanika koji treba da bude podvrgnut imunotestu kao što je ADA test (posebno, ADA test za određivanje prisustva bilo kojih anti-lek antitela protiv ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima). Dakle, kada je ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima prepoznat analitičkim antitelom koje se koristi u pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima, vrlo je verovatno da navedeni ISV, nanotelo, lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima sadrži takvo (dostupno ili izloženo) mesto interakcije, te će stoga imati tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju (kako je ovde definisano) kada se koristi u takvom imunotestu ili ADA testu za testiranje test uzorka. Kao što će biti jasno stručnjaku, to je nešto što bi prvenstveno trebalo izbegavati, bilo odabirom/upotrebom drugog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima ako je moguće, ili modifikovanjem ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima tako da se njegova tendencija ka takvoj proteinskoj interferenciji značajno redukuje ili suštinski ukloni (ponovo, ovo se može testirati korišćenjem metode i analitičkog antitela koji su ovde obelodanjeni).
[0242] [0112] Kao što će stručnjaku takođe biti jasno na osnovu ovdašnjeg obelodanjivanja, takva modifikacija može, na primer, obuhvatati uvođenje jedne ili više modifikacija (kao što su insercije, dodavanja, delecije ili supstitucije aminokiselina) na mestu interakcije na ISV, nanotelu, leku zasnovanom na ISV ili leku zasnovanom na nanotelima, tako da se njegova sposobnost da podleže (aspecifičnoj) proteinskoj interakciji sa jednim ili više proteina ili drugim komponentama koje mogu biti prisutne u test uzorku redukuje ili ukloni. Ponovo, ovo se može izvesti ograničenom metodom pokušaja i grešaka uvođenjem jedne ili više modifikacija, a zatim testiranjem da li je ta sposobnost redukovana ili ne, ponovo koristeći metodu i analitičko antitelo obelodanjene ovde. Na primer, jedna ili više takvih modifikacija mogu se uvesti, a zatim se sposobnost modifikovanog ISV da se veže za analitičko antitelo može uporediti sa onom kod originalnog/nemodifikovanog ISV. Alternativno, korišćenjem formata kompetitivnog premošćavanja (kao što je, na primer, ilustrovano u primeru 5), ili korišćenjem BIAcore (videti na primer primer 3), može se odrediti sposobnost modifikovanog ISV da se (i dalje) takmiči sa originalnim ISV za vezivanje za analitičko antitelo.
[0244] Ponovo, i iako pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima nije ograničen na bilo koju hipotezu ili objašnjenje, na osnovu eksperimentalnih dokaza koji su navedeni u primerima u nastavku, pronalazači su otkrili da se ovo mesto interakcije verovatno nalazi na/blizu C-terminalnog regiona (kako je ovde definisano) ili da navedeno mesto interakcije čini deo C-terminalnog regiona (ili da C-terminalni region čini deo ovog mesta interakcije). Ovo je, na primer, zasnovano barem delom na opažanju da, ako ISV ima tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju i ima VTVSS (SEQ ID NO: 33) kao aminokiselinske ostatke na svom C-terminalnom kraju, pričvršćivanje bilo ograničenog broja aminokiselinskih ostataka (kao što je 1 do 10, na primer 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5), ili alternativno markera ili drugog peptida, proteina ili drugog dela molekula na ovaj C-terminalni kraj obično značajno redukuje ili suštinski uklanja navedenu tendenciju. U nekim slučajevima je utvrđeno da čak i dodavanje 1, 2 ili 3 aminokiselinska ostatka na C-terminalni VTVSS (SEQ ID NO: 33) (što može biti bilo koja pogodna aminokiselina (ili aminokiseline) ili kombinacija aminokiselina, pri čemu svaka može biti nezavisno odabrana iz bilo kojih prirodno javljajućih aminokiselina kao što su one navedene u tabeli A-2 na strani 64 WO 09/138519, na primer i bez ograničenja, od alanina, glicina, valina, leucina ili izoleucina) može već značajno redukovati ili suštinski ukloniti navedenu tendenciju. Ovo je takođe delom zasnovano na opažanju da u nekim slučajevima, gde VHH prirodno sadrži ostatak alanina na poziciji 14 (koji, kao što je pomenuto, čini deo C-terminalnog regiona; videti sliku 2), prirodno javljajući VHH često nema (ili ima nisku) tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju, dok odgovarajući VHH u kojem je navedeni alanin na poziciji 14 zamenjen ostatkom prolina (na primer, u svrhu humanizacije ili sekvencijalne optimizacije) može kao rezultat imati povećanu tendenciju da izazove takvu proteinsku interferenciju (tj. u poređenju sa VHH sa alaninom na poziciji 14).
[0246] [0114] U jednom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na VHH, nanotelo (kako je ovde definisano, a posebno na humanizovani VHH ili kamelizovani VH, kao što je kamelizovan humani VH) ili drugi ISV (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima sa VHH, nanotelom ili drugim ISV na svom C-terminalnom kraju) koji je modifikovan (na primer, uvođenjem jedne ili više supstitucija, dodavanja ili delecija aminokiselina), a posebno modifikovan u C-terminalnim regionima (kao što je jednom ili više supstitucija ili dodavanja aminokiselina u C-terminalnom regionu), tako da (i) ima značajno redukovanu tendenciju (kao što je barem statistički relevantna redukovana tendencija) da izazove proteinsku interferenciju (kako je ovde definisano); i/ili tako da (ii) ima, u metodi pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima (kao što je specifičan test opisan u primeru 3 ili 5), značajno redukovanu sposobnost da bude vezan analitičkim antitelom kako je ovde opisano (kao što je poliklonsko antitelo opisano u primeru 2 i korišćeno u primerima 3 i 5), u oba slučaja prvenstveno u poređenju sa istim VHH, nanotelom ili ISV, ali bez modifikacija.
[0248] Dakle, u jednom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na VHH, nanotelo (kako je ovde definisano, a posebno na humanizovani VHH ili kamelizovani VH, kao što je kamelizovan humani VH) ili drugi ISV (ili lek zasnovan na ISV ili lek zasnovan na nanotelima sa VHH, nanotelom ili drugim ISV na svom C-terminalnom kraju) koji je VHH ili VH domen (tj. ISV koji je VH domen ili je izveden iz VH domena) i/ili koji je zasnovan na ili izveden iz (aminokiselinske sekvence) VHH ili VH domena, koji VHH, nanotelo ili ISV sadrži aminokiselinsku sekvencu VTVSS(X)<n>(SEQ ID NO: 34) na svom C-terminalnom kraju, u kojoj je n od 1 do 10, prvenstveno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i prvenstveno 1 ili 2, kao što je 1), i u kojoj je svako X ostatak aminokiseline (prvenstveno prirodno javljajuće) koji je nezavisno odabran (i prvenstveno nezavisno odabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I); međutim, kao što se može videti iz dole prikazanih podataka, mogu se koristiti i drugi (prvenstveno prirodno javljajući) aminokiselinski ostaci ili kombinacije prethodno pomenutih preferiranih aminokiselinskih ostataka sa drugim aminokiselinskim ostacima (kao što su serin, prolin, treonin i/ili lizin). Prvenstveno, navedeni VHH, nanotelo ili ISV sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS(X)<n>(SEQ ID NO: 34) na svom C-terminalnom kraju je takav da (i) ima značajno redukovanu tendenciju (kao što je barem statistički relevantna redukovana tendencija) da izazove proteinsku interferenciju (kako je ovde definisano); i/ili takav da (ii) ima, u metodi pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima (kao što je u specifičnom testu opisanom u primeru 3 ili 5), značajno redukovanu sposobnost da bude vezan analitičkim antitelom kako je ovde opisano (kao što je poliklonsko antitelo opisano u primeru 2), u oba slučaja prvenstveno u poređenju sa istim VHH, nanotelom ili ISV, ali sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 33) na svom C-terminalnom kraju. Upućuje se, na primer, na test i podatke predstavljene u primeru 3.
[0250] [0116] Gore pomenuti VHH, nanotela ili (drugi) ISV su prvenstveno takvi da imaju RU vrednost za vezivanje pomoću 21-4 manju od 500 (određenu prema protokolu navedenom u primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu). Takođe treba napomenuti da, svaki put kada se u ovdašnjem opisu ili u patentnim zahtevima upućuje na bilo koju C-terminalnu sekvencu VTVSS(X)<n>(uključujući bilo koji od aspekata (a) do (p) u nastavku), prema jednom specifičnom aspektu, nijedna od aminokiselina X nije ostatak cisteina.
[0252] Na primer, u nekim poželjnim aspektima, C-terminalni kraj ISV ili konstrukta koji sadrži ISV (kada je taj C-terminalni kraj ISV izveden iz VH, VHH ili nanotelo) može biti:
[0253] (a) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 1 i X = Ala;
[0254] (b) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Ala;
[0255] (c) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Ala;
[0256] (d) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i najmanje jedno X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0257] (e) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0258] (f) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0259] (g) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 1 i X = Gly;
[0260] (h) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Gly;
[0261] (i) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Gly;
[0262] (j) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i najmanje jedno X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0263] (k) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0264] (l) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile);
[0265] (m)VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Ala ili Gly;
[0266] (n) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Ala ili Gly;
[0267] (o) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Ala ili Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile); or (p) VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Ala ili Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile); pri čemu su aspekti (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) naročito poželjni, aspekti u kojima je n = 1 ili 2 su poželjni, a aspekti u kojima je n = 1 su naročito poželjni.
[0269] Takođe treba napomenuti da, svaki put kada se u ovdašnjem opisu ili u patentnim zahtevima upućuje na bilo koju C-terminalnu sekvencu VTVSS(X)<n>(uključujući bilo koji od aspekata (a) do (p) gore), prema jednom specifičnom aspektu, nijedna od aminokiselina X nije ostatak cisteina.
[0271] Dakle, u jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 1 i X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0273] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0275] [0121] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i najmanje jedno X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0277] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0279] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Ala (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0281] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Ala (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0283] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 1 i X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0284] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0286] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0288] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i najmanje jedno X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0290] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0291] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0293] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 2 i svako X = Ala ili Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0295] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i svako X = Ala ili Gly (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0297] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje jedno X = Ala ili Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju). ili
[0299] [0134] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 3 i najmanje dva X = Ala ili Gly (pri čemu su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno odabrani iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali su prvenstveno nezavisno odabrani između Val, Leu i/ili Ile) (ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju).
[0301] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je n = 1, 2 ili 3 i u kojoj je svako X = Ala ili Gly.
[0303] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je:
[0304] − n = 1, 2 ili 3 pri čemu je svako X = Ala ili Gly; ili
[0305] − n = 2 ili 3 pri čemu su svi osim jednog X = Ala ili Gly (pri čemu je preostali aminokiselinski ostatak X nezavisno odabran iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali je prvenstveno nezavisno odabran između Val, Leu i/ili Ile)
[0306] ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju.
[0308] U još jednom poželjnom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV), koji je ili nanotelo ili (drugi) ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence (pri čemu su nanotela poželjna), koji ima C-terminalni kraj sekvence VTVSS(X)<n>, u kojoj je:
[0309] − n = 1, 2 ili 3 pri čemu je svako X = Ala ili Gly; ili
[0310] − n = 2 ili 3 pri čemu je najmanje jedno X = Ala ili Gly (pri čemu je preostali aminokiselinski ostatak X nezavisno odabran iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali je prvenstveno nezavisno odabran između Val, Leu i/ili Ile);
[0311] − n = 2 ili 3 pri čemu su svi osim jednog X = Ala ili Gly (pri čemu je preostali aminokiselinski ostatak X nezavisno odabran iz bilo koje prirodno javljajuće aminokiseline, ali je prvenstveno nezavisno odabran između Val, Leu i/ili Ile);
[0312] ili protein ili polipeptid koji sadrži takav ISV (i prvenstveno takvo nanotelo) na svom C-terminalnom kraju.
[0314] U gore navedenim aspektima, pod navedenim (drugim) „ISV koji obuhvata VH sekvencu ili je izveden iz VH sekvence” podrazumeva se bilo koji ISV koji obuhvata VH sekvencu ili koji je izveden iz VH sekvence, a koji nije nanotelo (tj. nije VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH). Na primer, takav (drugi) ISV može biti (pojedinačno) domensko antitelo zasnovano na VH, dAb<™>zasnovan na VH ili mikrotelo zasnovano na VH (videti WO 00/29004).
[0316] Ponovo treba napomenuti da, svaki put kada jedan od ISV na koje se ovde upućuje ima C-terminalnu sekvencu VTVSS(X)<n>(uključujući bez ograničenja ISV pomenute u prethodnim aspektima), prema jednom specifičnom aspektu, nijedna od aminokiselina X u sekvenci VTVSS(X)<n>nije ostatak cisteina.
[0318] Kao što je dalje ovde opisano, svaki takav protein ili polipeptid može, na primer, biti konstrukt koji sadrži dva ili više ISV (kao što su dva ili više nanotela), opciono povezanih putem jednog ili više pogodnih linkera. Tako, na primer, takav konstrukt može biti bivalentan, trivalentan, tetravalentan ili pentavalentan konstrukt (kao što je bivalentan, trivalentan, tetravalentan ili pentavalentan konstrukt nanotela), i može, na primer, biti bispecifičan, trispecifičan ili biparatopni konstrukt (uključujući, na primer, monospecifične, bispecifične ili biparatopne konstrukte koji se takođe mogu vezati za serumski albumin (poželjno) ili drugi serumski protein radi produženja poluvremena eliminacije).
[0320] Ponovo, nanotela, ISV i proteini/polipeptidi prema svakom od gore opisanih aspekata prvenstveno su takvi da imaju RU vrednost za vezivanje pomoću 21-4 manju od 500 (određenu prema protokolu navedenom u primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu korišćenog ISV ili proteina prema gore navedenoj formuli).
[0322] [0142] Kao što je ovde pomenuto, takođe se predviđa da se pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima može primeniti i na druge proteine ili polipeptide (a posebno na fragmente antitela kao što su Fab fragmenti ili druge proteine ili polipeptide zasnovane na fragmentima antitela, kao što su ScFv) koji imaju VH-domen na svom C-terminalnom kraju. Dakle, u drugom aspektu, pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima odnosi se na takav protein ili polipeptid (kao što je ScFv) koji ima VH domen na svom C-terminalnom kraju sa aminokiselinskom sekvencom VTVSS(X)<n>(SEQ ID NO:34) na svom C-terminalnom kraju, u kojoj je n od 1 do 10, prvenstveno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5, i u kojoj je svako X ostatak aminokiseline (prvenstveno prirodno javljajuće) koji je nezavisno odabran (i prvenstveno nezavisno odabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I)). Ponovo, prema nekim specifičnim aspektima, navedeni C-terminalni kraj može biti prema bilo kojem od gore navedenih (a) do (p), i prvenstveno prema jednom od (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) ili (n), pri čemu je n jednako 1, 2 ili 3, a prvenstveno 1 ili 2.
[0324] Ponovo, takvi proteini ili polipeptidi prvenstveno su takvi da imaju RU vrednost za vezivanje pomoću 21-4 manju od 500 (određenu prema protokolu navedenom u primeru 9, i nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti za molekulsku masu korišćenog ISV ili proteina prema gore navedenoj formuli). Takođe, ponovo, prema jednom specifičnom aspektu ovog aspekta, nijedna od aminokiselina X u C-terminalnoj sekvenci
[0325] VTVSS(X)<n>nije ostatak cisteina.
[0327] Pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima dalje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ISV (i prvenstveno terapijski ISV) ili protein ili polipeptid koji obuhvata najmanje jedan ISV (i prvenstveno najmanje jedan terapijski ISV), pri čemu je navedeni ISV, protein ili polipeptid onakav kako je ovde dalje opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više ovde opisanih aspekata, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranama; i još konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata), i najmanje jedan pogodan nosač, razblaživač ili ekscipijens (tj. pogodan za farmaceutsku upotrebu), i opciono jednu ili više daljih aktivnih supstanci. Takve kompozicije, nosači, razblaživači ili ekscipijensi mogu, na primer, biti onakvi kakvi su opisani u WO 08/020079 za farmaceutske kompozicije koje obuhvataju nanotelo ili protein ili polipeptid koji obuhvata najmanje jedno nanotelo (a kao što je već pomenuto, prema predmetnom pronalasku kako je definisan u patentnim zahtevima, ISV je takođe prvenstveno nanotelo).
[0328] Pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima dalje se odnosi na ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata najmanje jedan ISV za upotrebu u terapiji bolesti kod čoveka (npr. pacijenta kojem je takva terapija potrebna), pri čemu je navedeni ISV, protein ili polipeptid onakav kako je ovde dalje opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više ovde opisanih aspekata, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranama; i još konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).
[0330] Pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima dalje se odnosi na upotrebu ISV ili proteina ili polipeptida koji obuhvata najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutske kompozicije, pri čemu je navedeni ISV, protein ili polipeptid onakav kako je ovde dalje opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više ovde opisanih aspekata, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranama; i još konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata).
[0332] Pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima dalje se odnosi na terapijsku upotrebu koja obuhvata primenu humanom ispitaniku (npr. pacijentu kojem je takav tretman potreban) ISV ili proteina ili polipeptida koji obuhvata najmanje jedan ISV u pripremi farmaceutske kompozicije, pri čemu je navedeni ISV, protein ili polipeptid onakav kako je ovde dalje opisano (tj. ISV, protein ili polipeptid prema jednom ili više ovde opisanih aspekata, a posebno prema jednom ili više aspekata opisanih na prethodnim stranama; i još konkretnije ISV, protein ili polipeptid koji ima C-terminalni kraj/sekvencu koja je prema jednom ili više ovde opisanih aspekata); ili farmaceutske kompozicije (kao što je gore opisano) koja obuhvata najmanje jedan takav ISV, protein ili polipeptid.
[0334] [0148] U vezi sa gore navedenim, biće jasno da je terapijska upotreba ISV, proteina i polipeptida opisanih ovde veoma važan aspekt pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, jer takva terapijska upotreba (ili klinički razvoj takvih ISV, proteina i polipeptida za takvu terapijsku upotrebu) može uključivati upotrebu ADA testova kako bi se odredilo da li je navedeni ISV, protein ili polipeptid imunogen (tj. da li može izazvati stvaranje anti-lek antitela kada se primeni humanom ispitaniku). U tom pogledu, takođe će biti jasno da će se zabrinutost oko moguće imunogenosti posebno morati rešavati kada se terapijsko sredstvo koristi tokom dužih vremenskih perioda (tokom nedelja, meseci ili godina) i/ili ima poluvreme eliminacije (prvenstveno izraženo kao t1/2-beta) kod humanog ispitanika od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedna nedelja, pa do 10 dana ili više. Svako upućivanje na metode lečenja smatra se upućivanjem na jedinjenja i kompozicije predmetnog pronalaska za upotrebu u metodi lečenja koja se sprovodi na čoveku/životinji.
[0336] Dakle, prema jednom specifičnom aspektu pronalaska kako je definisan u patentnim zahtevima, ISV, protein, polipeptid ili farmaceutska kompozicija, kako su ovde opisani, namenjeni su za upotrebu u lečenju hronične bolesti kod čoveka, i/ili je takav ISV, protein ili polipeptid, kako je ovde opisan, namenjen da bude prisutan u cirkulaciji ispitanika (tj. na farmakološki aktivnim nivoima) kojem se primenjuje (tj. u terapijski aktivnoj dozi) tokom perioda od najmanje jedne nedelje, prvenstveno najmanje dve nedelje, kao što je najmanje mesec dana; i/ili je takav ISV, protein ili polipeptid, kako je ovde opisan, takav da ima poluvreme eliminacije (prvenstveno izraženo kao t1/2-beta) kod humanog ispitanika od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedna nedelja, pa do 10 dana ili više; i/ili je takav ISV, protein, polipeptid ili farmaceutska kompozicija, kako su ovde opisani, namenjen za primenu čoveku u vidu dve ili više doza koje se primenjuju tokom perioda od najmanje 3 dana, kao što je najmanje jedna nedelja, na primer najmanje dve nedelje ili najmanje mesec dana, ili čak i duže (tj. najmanje 3 meseca, najmanje 6 meseci ili najmanje godinu dana), ili se čak primenjuje hronično.
[0338] Pronalazak kako je definisan u patentnim zahtevima dalje se odnosi na metodu za (značajno) redukovanje ili suštinsko uklanjanje tendencije ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima da izazovu proteinsku interferenciju, pri čemu navedena metoda obuhvata najmanje sledeće korake:
[0339] − opciono određivanje tendencije ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima da izazovu proteinsku interferenciju, korišćenjem metode koja obuhvata najmanje korake (i) i (ii) kako je ovde navedeno;
[0340] − modifikovanje navedenog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima uvođenjem jedne ili više supstitucija, dodavanja ili delecija aminokiselina u navedeni ISV ili nanotelo, ili u C-terminalni ISV ili nanotelo (ako postoji) leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima; a posebno uvođenjem jedne ili više supstitucija ili dodavanja aminokiselina u C-terminalni region navedenog ISV ili nanotela, ili u C-terminalni region C-terminalnog ISV ili nanotela (ako postoji) leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima, na primer dodavanjem na C-terminalni kraj sekvence 1 do 10, kao što je 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih ostataka od kojih je svaki nezavisno odabran iz bilo kojih prirodno javljajućih aminokiselina (kao što su one navedene u tabeli A-2 na strani 64 WO 09/138519, na primer i bez ograničenja, od alanina, glicina, valina, leucina ili izoleucina);
[0341] − određivanje tendencije tako modifikovanog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima da izazovu proteinsku interferenciju, korišćenjem metode koja obuhvata najmanje korake (i) i (ii) kako je ovde navedeno; opciono na način koji omogućava da se tendencija tako modifikovanog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima da izazovu proteinsku interferenciju uporedi sa tendencijom originalnog ISV, nanotela, leka zasnovanog na ISV ili leka zasnovanog na nanotelima da izazovu proteinsku interferenciju (uključujući, bez ograničenja, njihovo poređenje u kompetitivnom testu za vezivanje za analitičko antitelo kako je ovde opisano). Alternativno, može se koristiti ovde opisana metoda koja uključuje upotrebu 21-4.
[0343] Pronalazak će sada biti dalje opisan putem sledećih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika, u kojima:
[0344] − Slike 1A do 1C shematski prikazuju neke neograničavajuće primere formata ADA testa.
[0345] Neki reprezentativni, ali neograničavajući protokoli za izvođenje ovih testova navedeni su u primeru 4.
[0346] − Slika 2 shematski prikazuje reprezentativnu 3D strukturu ISV, kao što je nanotelo.
[0347] − Slika 3 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 3.4 do 3.9 (SEQ ID NO: 5 do 10) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0348] − Slika 4 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 3.4, 3.11, 3.12 i 3.13 (SEQ ID NO: 5, 12, 13 i 14) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0349] − Slika 5 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 3.4, 3.14 i 3.15 (SEQ ID NO: 5, 15 i 16) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0350] − Slika 6 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 3.1, 3.2 i 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 i 5) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0351] − Slika 7 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 4.1 i 4.2 (SEQ ID NO: 17 i 18) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0352] − Slika 8 je kriva vezivanja (dobijena korišćenjem BIACORE testa opisanog u primeru 3) koja prikazuje vezivanje Nb 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 (SEQ ID NO: 19 do 22) za imobilizovano poliklonsko antitelo dobijeno u primeru 2.
[0353] − Slika 9 daje tabelu koja prikazuje sekvence korišćene u primeru 8 (SEQ ID NO: 37 do 89) i navodi odgovarajuću referentnu sekvencu.
[0355] Sekvence na koje se upućuje u predmetnom opisu i patentnim zahtevima navedene su u tabeli A u nastavku (SEQ ID NO: 1 do 37) i na slici 9 (SEQ ID NO: 38 do 89).
[0356] TABELA A
Naziv SEQ ID NO: Sekvenca
[0357]
[0358] Naziv SEQ ID NO: Sekvenca TABELA A (nastavak)
[0359] Naziv SEQ Sekvenca ID NO:
[0360] Naziv SEQ Sekvenca
[0361]
[0362] Naziv SEQ Sekvenca
[0363]
[0365] TABELA A (nastavak)
[0366]
[0369] Eksperimentalni deo:
[0371] Primer 1: Generisanje poliklonskog analitičkog antitela.
[0373] Poliklonsko antitelo (IgG frakcija) koje se može koristiti kao „analitičko antitelo” generisano je na sledeći način:
[0375] A. Identifikacija pogodnih uzoraka plazme za izolovanje poliklonskog antitela
[0377] Dvadeset uzoraka plazme zdravih pojedinaca koji nikada nisu bili tretirani pomoću ISV evaluirano je na prisustvo antitela protiv ISV koja se mogu koristiti kao analitičko antitelo u pronalasku.
[0379] ISV koji je inicijalno korišćen u ovom primeru bio je SEQ ID NO: 1. Naknadno, kako bi se potvrdilo da interakcija nije specifična za ovaj konkretni ISV, već da je reč o aspecifičnoj protein-protein interakciji koja se može javiti kod većeg broja ISV, dole navedeni testovi su ponovljeni sa drugim ISV (videti stav C) u nastavku). Kao alternativa za SEQ ID NO: 1, na primer, može se koristiti i SEQ ID NO: 2.
[0381] [0156] Korišćeni test bio je test premošćavanja zasnovan na ECL (elektrohemiluminiscenciji) koji je koristio biotinilovani ISV (biotinilovana varijanta SEQ ID NO: 1) za hvatanje i sulfoobeležen ISV za detekciju anti-lek antitela. Sličan format se takođe koristi za izvođenje ADA testova. Biotinilacija i sulfo-obeležavanje ISV urađeni su korišćenjem standardne hemije kuplovanja na primarne amine pomoću Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) i Sulfo-tag NHS-Ester (MSD), respektivno, prema uputstvima proizvođača. Uzorci plazme su razblaženi 1/5 u PBS/0,1% kazeinu i inkubirani 30 minuta na 37°C, 600 RPM u polipropilenskim pločama sa 96 bunarčića. Uzorci (50 µL) su zatim razblaženi 1/3 u 1:1 smeši (100 µL) od 2 µg/ml biotinilovanog i 2 µg/ml sulfo-obeleženog ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi, pri 600 obrtaja u minuti. MSD MA<®>standardne streptavidinske ploče sa 96 bunarčića blokirane su sa 150 µL po bunarčiću rastvora Superblock<®>T20 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim isprane 3 puta pomoću PBS/0,05% Tween20 (= pufer za pranje). Smeša uzorka u odnosu 1:1 (biotinilovani i sulfo-obeleženi ISV (SEQ ID NO: 1)) (50,0 µL) prebačena je iz polipropilenske ploče na MSD ploču i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi pri 600 obrtaja u minuti. Ploče su isprane tri puta pre dodavanja 2 x mernog pufera (MSD) (150 µL po bunarčiću) i očitavanja ECL jedinica (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač). Uzorci su skrinovani kao pozitivni ili negativni korišćenjem granične vrednosti skrininga određene tokom validacije metode. Granična vrednost skrininga izračunata je na osnovu pozadinskih vrednosti 118 pojedinačnih uzoraka plazme zdravih pojedinaca koji nikada nisu bili tretirani pomoću ISV, koristeći odgovarajuću statističku analizu preporučenu smernicama za razvoj ADA testova (Shankar, 2008). Korišćena je neparametrijska procena, a granična vrednost je izračunata na osnovu 95. percentila, nakon isključenja ekstremnih vrednosti.
[0383] Šest uzoraka plazme je jasno ocenjeno kao pozitivno: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 i IHuP#002-001-ABL-20 (tabela I).
[0385] [0158] Ovi uzorci su dalje analizirani u postavci istiskivanja leka (potvrdni test) kako bi se potvrdila specifičnost pozitivnog rezultata skrininga (tabela II). Zbog toga su uzorci razblaženi 1/5 u PBS/0,1% kazeinu koji sadrži 12,5 µg/mL ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 30 minuta na 37°C pri 600 obrtaja u minuti u polipropilenskim pločama sa 96 bunarčića. Uzorci (50 µL) su zatim razblaženi 1/3 u 1:1 smeši (100 µL) od 2 µg/ml biotinilovanog i 2 µg/ml sulfoobeleženog ISV (SEQ ID NO: 1) i inkubirani 1 sat na sobnoj temperaturi pri 600 obrtaja u minuti. Nakon toga, 50,0 µL smeše uzorka i 1: 1 smeše (biotinilovani i sulfo-obeleženi ISV) prebačeno je iz polipropilenske ploče na blokiranu MSD MA<®>standardnu streptavidinsku ploču sa 96 bunarčića, kao što je gore opisano za test skrininga, i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi pri 600 obrtaja u minuti. Ploče su isprane tri puta pre dodavanja 2 x mernog pufera (MSD) (150 µL po bunarčiću) i merenja ECL jedinica (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač). Uzorci su potvrđeni kao istinski pozitivni korišćenjem potvrdne granične vrednosti određene tokom validacije metode, koja je izračunata na osnovu ECL odgovora 118 pojedinačnih uzoraka plazme zdravih pojedinaca koji nikada nisu bili tretirani pomoću ISV, u koje je dodato 50 µg/ml ISV (SEQ ID NO: 1), koristeći odgovarajuću statističku analizu preporučenu smernicama za razvoj ADA testova (Shankar, 2008). Minimalna redukcija signala od 50% izračunata je na osnovu 99% intervala poverenja.
[0387] Uzorci koji su bili pozitivni u ECL testu premošćavanja i koji su potvrđeni kao pozitivni u testu postavke istiskivanja leka, odabrani su kao izvor za generisanje poliklonskog antitela korišćenjem afinitetne hromatografije.
[0389] Tabela I: rezultati skrininga 20 uzoraka plazme u ADA ISV testu.
[0391]
[0392]
[0395] Tabela II: Potvrda pozitivno skrinovanih uzoraka plazme u potvrdnom testu. Za evaluaciju rezultata korišćena je potvrdna granična vrednost od 50%. Jedan uzorak nije potvrđen kao istinski pozitivan uzorak
[0396] ID uzorka plazme ECLU test skrininga: ECLU potvrdni test: % inhibicije
[0399]
[0402] Još tri uzorka seruma pojedinaca koji nisu bili tretirani pomoću ISV takođe su evaluirana korišćenjem gore opisanog ECL testa premošćavanja i potvrđena pomoću testa postavke istiskivanja leka.
[0403] Dva uzorka seruma su jasno ocenjena kao pozitivna u ECL testu premošćavanja: IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20 (tabela III). Ova dva pozitivno skrinovana uzorka su dalje analizirana u postavci istiskivanja leka kako bi se potvrdila specifičnost pozitivnog rezultata skrininga.
[0405] Tabela III: Rezultati skrininga i potvrdnog testa za 3 uzorka seruma i odgovarajuću prečišćenu IgG frakciju
[0407] testa potvrdnog inhibicije testa potvrdnog inhibicije skrininga: testa: serum signala skrininga: testa: IgG signala serum
[0410]
[0413] B. Generisanje prečišćene poliklonske IgG frakcije.
[0415] Poliklonski IgG je prečišćen iz uzoraka IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20 (videti gore) korišćenjem Protein G HP Spin Trap kolona (GE Healthcare) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, nakon uklanjanja rastvora za skladištenje iz kolone centrifugiranjem (30 s na 100 x g), kolona je uravnotežena dodavanjem pufera za vezivanje (20 mM natrijum-fosfat, pH 7,0). Nakon centrifugiranja, dodat je rastvor koji sadrži željeni poliklonal (maksimalno 1 mg u 600 µl) i kolona je inkubirana 4 minuta uz nežno mešanje. Kolona je zatim centrifugirana i isprana 2 puta uzastopnim dodavanjem pufera za vezivanje (600 µl) i centrifugiranjem. Nakon dodavanja 400 µl pufera za eluaciju (0,1 M glicin-HCl, pH 2,7) i mešanja inverzijom, antitelo je eluirano centrifugiranjem u 30 µl pufera za neutralizaciju (1 M Tris-HCl, pH 9,0).
[0417] [0163] Kako bi se potvrdilo da je tako dobijena IgG frakcija uključena u aspecifično vezivanje za ISV, prečišćeno IgG antitelo je analizirano u gore opisanom ECL testu premošćavanja i potvrđeno korišćenjem testa postavke istiskivanja leka koji je korišćen u gore navedenoj tački A). U oba uzorka (IHUS#B09032311A3 i IHUS#B09032311A20), potvrđeno je da je prečišćeno IgG antitelo uključeno u aspecifično vezivanje koje dovodi do pozitivnog signala u testovima (tabela III). Ovo je potvrdilo da se prečišćeni poliklonski IgG može koristiti kao „analitičko antitelo”, i kao takvo je korišćeno u (testovima u) primerima 3 i 5.
[0419] C. Aspecifično vezivanje za druge ISV.
[0421] Kako bi se utvrdilo da li je uočena proteinska interferencija specifična za jedan ISV, i/ili specifična za određeni region, epitop ili antigensku determinantu na ISV, i/ili za određene mutacije uvedene u ISV divljeg tipa (kao što su jedna ili više mutacija humanizacije), ECL test premošćavanja i test postavke istiskivanja leka (oba opisana u tački A gore, uz korišćenje SEQ ID NO: 1 kao sulfo-obeleženog ISV) ponovljeni su korišćenjem uzoraka plazme IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 i IHUS#B09032311A1. Pošto ovi uzorci plazme sadrže poliklonsko „analitičko” antitelo izolovano u tački B gore, ovo takođe pruža informacije o specifičnosti, selektivnosti i prepoznavanju epitopa poliklonskog analitičkog antitela.
[0423] Testirano je 8 ISV (SEQ ID NO: 23 do 30, redom - videti Tabelu A gore), od kojih je jedan bio VHH divljeg tipa (SEQ ID NO: 23), dok su ostalih 7 ISV bile humanizovane verzije sekvence divljeg tipa sa različitim supstitucijama humanizacije. Dva ISV (SEQ ID NO: 29 i 30) su takođe sadržala dodatne aminokiselinske ostatke na C-terminalnom kraju (1, odnosno 3 dodatna ostatka alanina).
[0425] [0166] Podaci su prikazani u tabeli IV. Bez ograničavanja na bilo kakvo objašnjenje ili hipotezu, može se uočiti da izmene u C-terminalnom regionu (kako je ovde definisano) očigledno mogu snažno uticati na stepen u kojem korišćeni uzorci plazme mogu izazvati proteinsku interferenciju. Na primer, može se videti da dodavanje jednog ili tri aminokiselinska ostatka na C-terminalni kraj može snažno redukovati tendenciju ka nastanku proteinske interferencije (na primer, samo 18% i 13% redukcije u ECLU testu sa uzorkom IHUS#B09032311A3 za SEQ ID NO: 29 i 30, u poređenju sa 90% redukcije za SEQ ID NO: 28, što je odgovarajuća humanizovana varijanta bez ikakvih dodatih aminokiselinskih ostataka na C-terminalnom kraju). Slično tome, uvođenje ostatka prolina na poziciju 14 sekvence divljeg tipa očigledno takođe može snažno uticati na stepen u kojem korišćeni uzorci plazme izazivaju proteinsku interferenciju (na primer, samo 20% redukcije u ECLU testu sa uzorkom IHUS#B09032311A3 za sekvencu divljeg tipa SEQ ID NO: 23, u poređenju sa 91% redukcije za SEQ ID NO: 24, što je sekvenca divljeg tipa sa A14P supstitucijom). K83R i Q108L, koje su takođe supstitucije blizu C-terminalnog regiona, takođe dovode do određenog povećanja tendencije ka izazivanju proteinske interferencije, ali ne u tolikoj meri kao A14P supstitucija, a ukupni kombinovani efekat A14P+K83R+Q108L supstitucija može se poništiti dodavanjem jednog ili više aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj (ponovo uporedite podatke za SEQ ID NO: 29 i 30 sa podacima za ostale humanizovane varijante).
[0427] Na osnovu ovih podataka, takođe je zaključeno da poliklonsko analitičko antitelo očigledno prepoznaje C-terminalni region (kako je ovde definisano) ISV uopšte. Kao što se može videti sa slike 2, pozicija 14 (i u manjoj meri pozicije 83 i 108) takođe čine delove C-terminalnog regiona jednog ISV (kada se uzme u obzir trodimenzionalna tercijarna struktura ISV).
[0429] Tabela IV: Evaluacija različitih varijanti nanotela kao kompetitora u ADA ISV testu korišćenjem analitičkog antitela.
[0430] ID uzorka seruma IHUS#B09032311 THUS#B09032311 THUS#B09032311
[0432]
[0434] (desna kolona navodi potvrdni redukcije potvrdni redukcije potvrdni redukcije
[0437]
[0438] ID uzorka seruma IHUS#B09032311 THUS#B09032311 THUS#B09032311
[0439]
[0441] (desna kolona navodi potvrdni redukcije potvrdni redukcije potvrdni redukcije
[0443]
[0445] Tabela IV (nastavak)
[0446]
[0448] kolona navodi supstitucije potvrdni redukcije potvrdni redukcije potvrdni redukcije
[0449]
[0450]
[0452] kolona navodi supstitucije potvrdni redukcije potvrdni redukcije potvrdni redukcije
[0453]
[0455] Primer 2: afinitetno prečišćavanje analitičkog antitela
[0456] [0168] Ovaj primer opisuje dve metode koje se mogu koristiti da se iz biološke tečnosti humanog subjekta izoluje analitičko antitelo koje je sposobno da prepozna i/ili veže C terminalni kraj ISV. Antitelo je izolovano iz 4 različita uzorka seruma koji su okarakterisani time što su indukovali pozitivan signal u ADA testu prema testu opisanom u primeru 1.
[0458] Polazeći od uzoraka seruma, svaki od ovih protokola obezbeđuje prečišćeni preparat faktora interferencije koji se može koristiti kao analitičko antitelo u ovde opisanim metodama. Ove metode se takođe mogu šire koristiti za prečišćavanje faktora interferencije u druge svrhe (na primer, faktori interferencije prečišćeni korišćenjem protokola u nastavku takođe su eksperimentalno korišćeni u primeru 8 kako bi se pokazalo da je vezivanje monoklonskog antitela 21-4 za ISV ili ISV konstrukt prediktivno za vezivanje istog ISV ili ISV konstrukta od strane faktora interferencije, a time i za tendenciju navedenog ISV ili ISV konstrukta da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji u ADA testu).
[0460] Primer 2A: prečišćavanje korišćenjem proteina A i afinitetne hromatografije
[0462] U prvom koraku, IgG frakcija antitela je obogaćena iz uzoraka seruma korišćenjem afinitetne hromatografije sa proteinom A. Tipične kolone korišćene za ovo obogaćivanje uključivale su HiTrap MabselectSure i MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). Prečišćavanje IgG antitela iz uzoraka seruma izvedeno je na automatizovan i sličan način u svim eksperimentima. Hromatografska razdvajanja su vršena na AKTA purifier sistemima (GE Healthcare) i beležena u realnom vremenu korišćenjem UNICORN softvera za prečišćavanje proteina (GE Healthcare). Ukratko, uzorak seruma je razblažen 1:1 sa D-PBS (Dulbekov fiziološki rastvor puferovan sa fosfatom) i filtriran kroz filter od 0,22 µm pre nanošenja na kolonu pri fiksnom protoku od 0,5 mL/min. Kolona je isprana radi uklanjanja komponenti koje se nespecifično vezuju tokom 5 zapremina kolone korišćenjem D-PBS pri protoku od 0,5 mL/min. IgG frakcija je eluirana kiselom eluacijom, korišćenjem 100 mM glicinskog pufera pH 2,6, uz protok od 0,5 mL/min. Nakon eluacije, frakcije su neutralizovane korišćenjem 1,5 M Tris pufera pH 8,8. Rađen je SDS-PAGE kako bi se potvrdilo izolovanje IgG antitela u eluatu.
[0464] [0171] U drugom koraku, interferirajući IgG su dodatno obogaćeni nanošenjem IgG frakcije prečišćene proteinom A iz 4 različita seruma na afinitetne kolone sa kuplovanim ISV. Konkretnije, interferirajući IgG su dalje obogaćeni vezivanjem za kolonu koja sadrži ISV sa sekvencom SEQ ID NO: 1. U tu svrhu, ISV je kovalentno povezan za Sepharose 4 fast flow (GE Healthcare) korišćenjem metode kuplovanja pomoću cijanogen-bromida (CNBr) prema postupku proizvođača. Afinitetno prečišćavanje je izvedeno na automatizovan i sličan način u svim eksperimentima. Hromatografska razdvajanja su vršena na AKTA purifier sistemima i beležena u UNICORN softver. Ukratko, uzorak obogaćen IgG-om (do 10 mL zapremine nanošenja) nanet je na kolonu pri fiksnom protoku od 0,5 mL/min. Kolona je isprana radi uklanjanja komponenti koje se nespecifično vezuju tokom 5 zapremina kolone korišćenjem D-PBS pri protoku od 0,5 mL/min. Komponente koje vezuju ISV eluirane su kiselom eluacijom, korišćenjem 100 mM glicinskog pufera pH 2,6, uz protok od 0,5 mL/min. Nakon eluacije, frakcije su neutralizovane korišćenjem 1,5 M Tris pufera pH 8,8. Frakcije su analizirane korišćenjem SDS-PAGE, čime je potvrđeno izolovanje IgG antitela u eluatu (podaci nisu prikazani).
[0466] Ove frakcije su sakupljene i korišćene za dalje analize, poput onih opisanih u primeru 3.
[0468] Primer 2B: prečišćavanje korišćenjem CaptureSelect<™>hromatografije.
[0470] Alternativno, faktori interferencije su dobijeni iz plazme i prečišćeni korišćenjem komercijalno dostupne afinitetne smole koja vezuje IgA, CaptureSelect hIgA<™>(BAC BV), koja je zasnovana na varijabilnim domenima samo teških lanaca (VHH) poreklom od kamelida. Sakupljena „IgA frakcija” koja sadrži IgA zajedno sa interferirajućim IgG je naknadno naneta na kolonu sa proteinom A kako bi se uklonila IgA frakcija. Kolona sa proteinom A je obrađena prema opštim uslovima za prečišćavanje IgG (radni pufer: PBS; elucioni pufer: 100mM glicin pH=2,7; neutralizacija nakon eluacije pomoću 1 M Tris). Faktor interferencije je dobijen iz eluata sa proteina A u prinosu većem od 95%.
[0472] [0174] U varijaciji ove metode, korišćena je druga CaptureSelect afinitetna smola (CaptureSelect Alpha-1 Antitrypsin smola, komercijalno dostupna afinitetna smola zasnovana na VHH, koja ne cilja nijedan protein povezan sa antitelima). Ova smola je obezbedila visoku efikasnost vezivanja faktora interferencije i omogućila selektivnu eluaciju u 2 koraka: antitripsin putem eluacije na neutralnom pH korišćenjem 2,0 M MgCl2, nakon čega je usledila eluacija faktora interferencije putem kiselog koraka (0,1 M glicin pH 3,0, slično uslovima eluacije za protein A/G; neutralizacija pomoću 1,5 M Tris). Ovo prečišćavanje u jednom koraku dalo je do 15 µg interferirajućeg IgG1 po mL plazme sa visokom interferencijom, što je približno 0,3% od ukupno prisutnog IgG. Opciono, neutralizovana frakcija interferencije može se odsoliti i dalje prečistiti putem kolone za ekskluzionu hromatografiju ekvilibrisane u D-PBS.
[0474] Primer 3: Uticaj različitih ISV supstitucija na tendenciju ISV da izazove proteinsku interferenciju
[0476] Kao što je pomenuto u gornjem opisu, ovaj pronalazak stavlja na raspolaganje određene testove i tehnike koje omogućavaju procenu da li data ISV ima tendenciju da izazove proteinsku interferenciju. To uključuje ECL test premošćavanja i test postavke istiskivanja leka korišćene u primeru 1, kao i BIACORE test opisan u ovom primeru 3 i ADA test premošćavanja/kompeticije opisan u daljim primerima u nastavku.
[0478] Kao što je takođe pomenuto u gornjem opisu, ovi testovi se takođe mogu koristiti za određivanje da li specifične promene (kao što su delecije, supstitucije ili dodaci aminokiselina) mogu uticati na (i po mogućstvu redukovati) tendenciju date ISV da izazove proteinsku interferenciju. Neke od ovih promena će biti ili postati jasne stručnjaku na osnovu ovde izloženog otkrića i eksperimentalnih podataka predstavljenih u primeru 1 i ovom primeru 3.
[0480] Kao što je već ukazano podacima dobijenim u primeru 1, čini se da određene mutacije u C-terminalnom kraju ili blizu njega (kako je ovde definisano) jedne ISV mogu (snažno) uticati na njenu tendenciju da izazove proteinsku interferenciju. Na primer, dodavanje nekoliko aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj (kao što su 1 ili 3 ostatka alanina) izgleda da snažno redukuje tendenciju ISV da izazove proteinsku interferenciju, i čak izgleda da može da poništi prisustvo drugih supstitucija (na primer, u C-terminalnom kraju ili blizu njega) koje, čini se, povećavaju tendenciju ka nastanku proteinske interferencije (na primer, A14P supstitucija).
[0482] U ovom primeru 3, ispitivan je i efekat drugih supstitucija kao i efekat dodavanja dodatnih aminokiselina na C-terminalni kraj poređenjem srodnih ISV sa različitim supstitucijama, korišćenjem analitičkog poliklonskog antitela generisanog u primeru 2. Analiza je urađena merenjem kinetike interakcije između svake od ispitivanih ISV i analitičkog poliklonskog antitela putem površinske plazmonske rezonance (SPR) korišćenjem Biacore<™>T100 biosenzora kompanije GE Healthcare. ISV testirane u ovom primeru 3 bile su one sa SEQ ID NO: 3 do 22 (videti Tabelu A gore i Tabelu V u nastavku).
[0483] U tipičnom eksperimentu, rastvor poliklonskog antitela je pripremljen u koncentraciji od 10 µg/ml u 10 mM NaOAc pH 5,0. Ovo poliklonsko antitelo je zatim imobilizovano na CM5 senzorskom čipu korišćenjem aminskog kuplovanja EDC/NHS metodom (EDC=N-etil-N'-[3-dietilamino-propil]-karbodiimid; NHS=N-hidroksisukcinimid) prema postupku proizvođača. Imobilizovana količina je dala približno 2700 rezonantnih jedinica (RU). Fiksna koncentracija od 500 nM ISV je zatim ubrizgana na površinu tokom 120 sekundi pri protoku od 45 µl u minuti. Pošto nije mogao biti identifikovan efikasan pufer za regeneraciju, vreme disocijacije je produženo na 2400 sekundi. Signal dobijen ubrizgavanjem ISV na praznu (blank) protočnu ćeliju oduzet je od signala dobijenog ubrizgavanjem ISV na protočnu ćeliju sa vezanim poliklonskim antitelom. Prazna protočna ćelija je aktivirana/deaktivirana na sličan način kao i protočna ćelija za poliklonsko antitelo, ali bez dodavanja proteina. Takođe, ubrizgavanje slepe probe (HBS-EP radni pufer (HBS= HEPES puferovan fiziološki rastvor: GE Healthcare) je oduzeto radi korekcije mogućeg drifta bazne linije.
[0485] Da bi se ispitao efekat dodavanja aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj, ispitivan je uticaj dodavanja 1 ili 2 alanina i 1, 2 ili 3 glicina poređenjem vezivanja ISV sa različitim dodacima, korišćenjem analitičkog poliklonskog antitela generisanog kao što je opisano u primeru 2. ISV generisane i testirane u ovu svrhu bile su NB 3.4 do 3.9 (SEQ ID NO: 5 do 10).
[0487] Kao reprezentativni primeri vrste dobijenih podataka, Slika 3 prikazuje vezivanje NB 3.4 do 3.9 za imobilizovano poliklonsko antitelo. Tabela V sumira dobijene rezultate.
[0489] TABELA V
[0492]
[0493] ID zici ozici ozici ozicija Vezivanje** klona 13<(1)>114<(1)>115<(1)>116<(1)>
[0495] NB 3.8 S G G
[0498] NB 3.9
S
G
G
G
[0500] **: Signal vezivanja dobijen na kraju injektiranja (= maksimalni RU sign
[0501] <(1)>U ovom numerisanju, pozicija 113113 je poslednje „S” u okviru C-terminalnog VTVSS motiva, a pozicije 114, 115 i 116 su pozicije koje neposredno slede (nizvodno) nakon navedene pozicije 113.
[0503] Da bi se ispitao efekat (drugih) supstitucija u C-terminalnom regionu, istraživan je uticaj različitih supstitucija upoređivanjem srodnih ISV koje sadrže ove supstitucije, korišćenjem istog analitičkog poliklonskog antitela kao što je gore opisano. Analiza je urađena na prethodno opisani način.
[0505] ISV koje sadrže navedene supstitucije a koje su testirane bile su NB 3.1, 3.2 i 3.4 (SEQ ID NO: 3, 4 i 5); NB 3.10 do 3.15 (SEQ ID NO: 11 do 16), koje su upoređene sa NB 3.4; NB 4.1 i 4.2 (SEQ ID NO: 17 i 18) i NB 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 (SEQ ID NO: 19 do 22).
[0507] Kao reprezentativni primeri vrste dobijenih podataka:
[0508] − Slika 4 prikazuje vezivanje NB 3.4, 3.11, 3.12 i 3.13 za imobilizovano poliklonsko antitelo; − Slika 5 prikazuje vezivanje NB 3.4, 3.14 i 3.15 za imobilizovano poliklonsko antitelo; − Slika 6 prikazuje vezivanje NB 3.1, 3.2 i 3.4 za imobilizovano poliklonsko antitelo;
[0509] − Slika 7 prikazuje vezivanje NB 4.1 i 4.2 za imobilizovano poliklonsko antitelo;
[0510] − Slika 8 prikazuje vezivanje NB 6.1, 6.2, 6.4 i 6.5 za imobilizovano poliklonsko antitelo.
[0512] Tabele VI, VII i VIII sumiraju dobijene rezultate.
[0514] TABELA VI ID klona SEQ ID NO Pozicija 14<(1)>Pozicija 83<(1)>Pozicija 108<(1)>Vezivanje**
[0516]
[0517] ID klona SEQ ID NO Pozicija 14<(1)>Pozicija 83<(1)>Pozicija 108<(1)>Vezivanje**
[0518]
[0520] TABELA VII
[0522]
[0524] TABELA VIII ID SEQ ID Pozicija 14 Pozicija 83<(1)>Pozicija 108<(2)>Oznaka* Vezivanje**
[0526]
[0527]
[0530] Ponovo, bez ograničavanja na bilo koju specifičnu hipotezu ili objašnjenje, gore predstavljeni podaci pokazuju da (različite) supstitucije u C-terminalnom regionu (kako je ovde definisano) jedne ISV mogu izmeniti/poboljšati njenu tendenciju da izazove proteinsku interferenciju.
[0532] Primer 4: reprezentativni protokoli za izvođenje ADA testova sa slike 1.
[0534] Ovaj primer daje neke reprezentativne, ali neograničavajuće uslove koji se mogu koristiti za izvođenje kompetitivnih/premošćavajućih ADA testova šematski prikazanih na slici 1:
[0535] − ADA test sa slike 1A u rastvoru: Uzorci 100% matriks, 30 minuta, 37°C, tretman kiselinom korišćenjem sirćetne kiseline u odnosu 1/10 matriksa, 5 minuta, sobna temperatura, preinkubacija/neutralizacija kiseline uzorka: ISV-sulfo (:Tris) 1:1:1 (1: 0,9:0,9: 0,1), 1 sat, sobna temperatura; na ploči 1 sat, sobna temperatura; pranje 3x, merni pufer 4X.
[0536] − ADA test sa slike 1B u rastvoru: Uzorci 20% matriks, 30 minuta, 37°C, preinkubacija uzorka: ISV- -sulfo 1:1:1, 1 sat, sobna temperatura, na ploči 1 sat, sobna temperatura, pranje 3x, merni pufer 2x
[0537] − Sekvencijalni ADA test sa slike 1C: Hvatanje ISV-Bio, 1 sat, sobna temperatura, pranje 3x, uzorci 20% matriks, 15 minuta, sobna temperatura, na ploči: 2 sata, sobna temperatura, pranje 3X, detekcija ALX-0141-sulfo, 1 sat, sobna tenperatura, pranje 3x, merni pufer 4X
[0539] Primer 5: Predviđanje osetljivosti ISV na aspecifičnu proteinsku interferenciju korišćenjem analitičkog antitela.
[0541] Ovaj primer opisuje ADA test premošćavanja/kompeticije korišćenjem analitičkog antitela koji se može koristiti za predviđanje osetljivosti ISV na aspecifičnu proteinsku interferenciju.
[0543] ISV koja se testira razblažuje se do koncentracije od 10 µg/ml i inkubira sa analitičkim antitelom koncentracije 400 ng/ml, prečišćenim prema primeru 2, i to na 37°C pri 600 obrtaja u minuti u polipropilenskim pločama sa 96 bunarčića. Uzorak (50 µL) se zatim razblažuje 1/3 u smeši 1:1 (100 µL) biotinilovane ISV (2 µg/ml) i sulfo-označene ISV (2 µg/ml) i inkubira tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, pri 600 obrtaja u minuti. MSD MA<®>ploče sa 96 bunarčića sa standardnim streptavidinom se blokiraju sa 150 µL po bunarčiću rastvora Superblock<®>T20 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim isperu 3 puta sa PBS/0,05% Tween20 (= pufer za pranje). Uzorak/ 1:1 smeša (biotinilovana i sulfo-označena ISV) (50,0 µL) se prebacuje iz polipropilenske ploče na MSD ploču i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi, pri 600 obrtaja u minuti. Ploče se ispiraju tri puta pre dodavanja 2 x mernog pufera (MSD) (150 µL po bunarčiću) i očitavanja ECL jedinica (ECLU) na MSD instrumentu (Sector Imager 2400 čitač).
[0545] orišćenjem ovog testa, testirane su i upoređene ISV sa SEQ ID NO: 23 do 30. Podaci su prikazani u tabeli IX. Ovi podaci ne samo da pokazuju da se test opisan u ovom primeru može koristiti za predviđanje tendencije ISV da izazove proteinsku interferenciju, već generisani podaci takođe potvrđuju nalaze iz ranijih primera o efektu supstitucija u C-terminalnom regionu. Kao što se može videti, dodavanje 3 (i u manjoj meri 1) ostatka alanina na C-terminalni kraj potpuno humanizovane ISV eliminisalo je njenu sposobnost da se takmiči sa vezivanjem analitičkog antitela. Mutacija pozicije 14 na varijanti ISV divljeg tipa iz alanina u prolin jasno je povećala njen kapacitet kao kompetitora u testu (= čineći varijantu ISV sklonijom aspecifičnoj proteinskoj interferenciji), dok mutiranje pozicija 83 i 108 nije jasno uticalo na osetljivost ISV na aspecifičnu proteinsku interferenciju.
[0546] Tabela IX
[0547]
[0549] i C-terminalne dodatke napravljene u poređenju sa sekvencom potvrdni redukcije
[0551]
[0553] Primer 6: Uticaj dodavanja aminokiselina na C-terminalni kraj anti-OX40L nanotela na njihovu jačinu blokiranja OX40L.
[0554] Ovaj primer pokazuje da C-terminalni produžetak nema uticaja na aktivnost ili jačinu blokiranja nanotela.
[0555] In vitro jačina trivalentne bispecifične sekvence optimizovanog anti-OX40L nanotela Nb 3.16 (SEQ ID NO: 31) upoređena je sa jačinom odgovarajućeg nanotela koje sadrži jedan dodatni Ala na svom C-terminalnom kraju, Nb 3.17 (SEQ ID NO: 32).
[0557] Prvi test, test aktivacije T-ćelija, izveden je na sledeći način. PBMC su izolovane iz su izolovane iz trombocitno-leukocitnih međuslojeva (Red Cross, Gent, Belgija) od zdravih davalaca korišćenjem Ficoll Paque Plus reagensa (GE Healthcare) i isprane korišćenjem RPMI 1640 kompletnog medijuma (RPMI1640 GlutaMAX 25 mM HEPES 10% fetalni goveđi serum 1% penicilin/streptomicin; Invitrogen). PBMC (1x10<5>cćelija po bunarčiću) su stimulisane fitohemaglutininom (PHA-L; krajnja koncentracija 0,6 µg/ml) pre dodavanja u 1x10<4>hOX40L ćelija koje eksprimiraju hOX40L (ozračene gama scintilatorom na 3000 RAD; UZ Gent, Belgija) i serije razblaženja anti-OX40L nanotela u RPMI 1640 kompletnom medijumu, i inkubirane tokom 22 sata na 37°C u CO<2>inkubatoru. Produkcija IL2 od strane PBMC je merena ELISA testom. Bunarčići Maxisorp ploče su obloženi preko noći na 4°C antihumanim IL2 monoklonskim antitelom (BD Biosciences). Nakon pranja i blokiranja obloženih bunarčića, dodat je supernatant ćelija razblažen ½. Kao standard su uključena serijska razblaženja ½ rekombinantnog humanog IL2 (BD Biosciences) počevši od 2000 pg/ml. Detekcija je urađena korišćenjem biotinilovanog anti-humanog IL2 monoklonskog antitela (BD Biosciences), streptavidina konjugovanog sa HRP (Thermo Scientific) i esTMB (SDT Reagents). Reakcija je zaustavljena sa 1N HCl, a optička gustina (OD) je očitana na 450 nm. Kao što je i očekivano, jačina trivalentne bispecifične sekvence optimizovanog nanotela Nb 3.17 (IC50 = 0,13nM, 95% CI = 0,098-0,17nM) bila je uporediva sa jačinom Nb 3.16 (IC50= 0,10nM, 95% CI = 0,071-0,15 nM).
[0559] [0194] U drugom kompetitivnom testu zasnovanom na ELISA metodi, serija razblaženja (od 1,5 µM do 0,083 pM) nanotela je prethodno inkubirana preko noći na sobnoj temperaturi sa 100 ng/ml humanog OX40/Fc (R&D Systems) i 10 ng/ml biotinilovanog humanog OX40L (R&D Systems; interna biotinilacija kao što je opisano u primeru 1) u PBS 0,1% BSA 0,01% Tween-20. Zatim su uzorci inkubirani na Maxisorp pločama obloženim sa 10 µg/ml antihumanog Fc nanotela (interno generisanog) i blokirani sa PBS 1% BSA 0,1% Tween-20. Vezani humani OX40/Fc je detektovan korišćenjem streptavidina konjugovanog sa HRP (Thermo Scientific) i sTMB (SDT Reagents). Reakcija je zaustavljena sa 1N HCl, a optička gustina (OD) je očitana na 450 nm. U skladu sa testom na bazi ćelija, jačina trivalentne bispecifične sekvence optimizovanih nanotela Nb 3.17 (IC50= 0,178nM, 95% CI = 0,152-0,200nM) bila je uporediva sa jačinom Nb 3.16 (IC50 = 0,179nM, 95% CI = 0,149-0,215nM).
[0561] Primer 7: generisanje monoklonskog antitela 21-4-3.
[0563] Dve grupe različitih sojeva miševa (BALB/c i NMRI - po tri miša u svakoj) imunizovane su intraperitonealno konstruktom nanotela sa SEQ ID NO: 98 iz WO 2006/122825, u emulziji tipa voda-u-ulju sa jednakim zapreminama antigena i Frojndovog kompletnog ili nekompletnog adjuvansa tokom perioda od 39 dana, uz busterovanje dok nisu dobijeni odgovarajući titrovi antiseruma.
[0565] Nakon asfiksije stimulisanih miševa u CO2, slezine su aseptično uklonjene i pripremljena je suspenzija pojedinačnih ćelija iz objedinjenih slezina. Ćelije slezine i ćelije mijeloma isprane su nekoliko puta sa DMEM medijumom i fuzionisane u prisustvu 1 ml 50% (w/v) PEG 3350 (odnos ćelija slezine prema SP2/0 bio je 3:1). Za fuziju je korišćena ćelijska linija mijeloma SP2/0-Ag14 iz Nemačke zbirke mikroorganizama i ćelijskih kultura (DSMZ GmbH, Braunšvajg). Ova ćelijska linija je hibrid između ćelija slezine BALB/c miša i ćelijske linije mijeloma P3x63Ag8. Tako dobijeni hibridomi su resuspendovani u CGM medijumu koji sadrži 20% FCS i aminopterin (HAT medijum) i zasađeni (140 µl po bunarčiću) u osam ploča za kulturu tkiva sa 96 bunarčića sa ravnim dnom (Corning-Costar) koje sadrže 140 µl po bunarčiću CGM (20% FCS) sa ćelijama peritonealnog eksudata kao fider ćelijama. Ploče su inkubirane 10 dana u kompletnom medijumu za rast (CGM) koji sadrži DMEM sa dodacima 2-merkaptoetanola, L-glutamina, stabilnog glutamina, HT i neesencijalnih aminokiselina (u koncentracijama koje preporučuje dobavljač) i FCS u različitim koncentracijama (10%, 15% ili 20%). Tokom ovog perioda, ćelije su dva puta punjene HAT medijumom. Supernatanti ćelijskih kultura iz hibridomskih ćelija obično su sadržali 1 do 20 µg/ml antitela, koja su testirana u ELISA testu vezivanja kako bi se potvrdilo vezivanje za konstrukt nanotela sa SEQ ID NO: 98 iz WO 2006/122825.
[0567] [0197] Ćelije iz bunarčića pozitivnih na produkciju IgG prebačene su u bunarčiće ploča sa 48 bunarčića i kultivisane 2-4 dana (zavisno od karakteristika rasta ćelija). ELISA testovi vezivanja na ALX081 i humani/cinomolgus IgG su izvedeni kako bi se isključili aspecifični vezivni agensi. Ćelije hibridoma koje eksprimiraju vezivne agense specifične za konstrukt nanotela sa SEQ ID NO: 98 iz WO 2006/122825 klonirane su dva puta metodom graničnog razblaženja Nakon fuzije i ponovnog skrininga, identifikovano je 7 primarnih kultura koje produkuju antitela protiv ALX-081. Sve ove primarne kulture produkovale su antitela koja ne reaguju unakrsno sa humanim ili cinomolgus IgG. Primarne kulture su ponovo klonirane (dva puta).
[0569] Klon 21-4 (jedan od klonova koji je stabilno produkovao antitela protiv ALX-081 nakon drugog kloniranja) dobio je oznaku „ABH0015” i deponovan je u Belgijskoj koordinisanoj zbirci mikroorganizama (BCCM) u Gentu, Belgija, 4. juna 2012. godine pod pristupnim brojem LMBP-9680-CB. Mišje monoklonsko antitelo koje produkuje ABH0015 nazvano je 21-4-3: određivanje izotipa za 21-4-3 pokazalo je IgG1 težak lanac i kapa laki lanac, koji su sekvencirani (videti SEQ ID NO: 35 i 36, respektivno). Pokazano je da se 21-4-3 vezuje za C-terminalni region konstrukta nanotela sa SEQ ID NO: 98 iz WO 2006/122825 (podaci nisu prikazani).
[0571] Primer 8: vezivanje 21-4 za ISV predviđa tendenciju ISV da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji
[0573] Ovaj primer, zajedno sa sledećim primerom 9, pokazuje da se vezivanje monoklonskog antitela 21-4 za ISV može koristiti za predviđanje (u okviru stepena izvesnosti navedenog u ovom primeru) da li će data ISV imati tendenciju da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji (npr. u ADA testu).
[0575] Ovaj primer 8 konkretno pokazuje da se 21-4 može koristiti za predviđanje da li će određene predložene modifikacije date ISV (kao što je dodavanje jednog ili više aminokiselinskih ostataka na C-terminalni kraj ISV i/ili supstitucija jedne ili više aminokiselina unutar C-terminalnog regiona ISV) dovesti do redukcije tendencije navedene ISV da podleže aspecifičnoj proteinskoj interferenciji.
[0577] Ukratko, set od 53 različita nanotela i konstrukta nanotela (videti sliku 9 i SEQ ID NO: 38 do 89) testiran je na vezivanje monoklonskim antitelom 21-4-3. Ista nanotela i konstrukti nanotela takođe su testirani na vezivanje pomoću prečišćenih preparata faktora interferencije dobijenih od tri različita humana davaoca (koji se ovde pominju kao „davalac 8”, „davalac 19” i „davalac 30”), kako bi se videlo da li postoji korelacija između vezivanja antitelom 21-4 i prečišćenim faktorima interferencije.
[0578] Utvrđeno je da se vezivanje jedne ISV antitelom 21-4 zaista može koristiti za predviđanje vezivanja iste te ISV faktorima interferencije (u okviru ukupnog stepena pouzdanosti koji pružaju ovde navedeni podaci).
[0580] Da bi se to pokazalo, kao što je detaljno opisano u eksperimentalnim podacima u nastavku, vezivanje 53 nanotela ili konstrukta nanotela (navedenih na slici 9; videti SEQ ID NO: 38 do 89) antitelom 21-4 mereno je korišćenjem instrumenta Biacore T100 (prema niže navedenom protokolu) i upoređeno je sa vezivanjem referentnog nanotela ili konstrukta (takođe navedenog na slici 9), merenim na istom Biacore instrumentu i po istom protokolu. Rezultati su prikazani u tabeli X u nastavku.
[0582] Tabela X
[0583] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za -3 a >
[0585] ije nja ela
[0587]
enc SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0589]
[0590] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0592]
[0593] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0595]
[0596] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0598]
[0599] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0601]
[0602] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0604]
[0605] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0607]
[0608] SE C- mutacije redukcij redukcija redukcija redukcija Više od
Više od Q terminalna( u C- a interferen interferen interferen 70% 90% ID e) terminal vezivanj cije u cije u cije u redukcije redukcije N aminokiseli nom a 21-4-3 serumu serumu serumu vezivanja vezivanja O: na(e) regionu u davaoca davaoca davaoca nanotela za nanotela za
[0610]
[0613] Za svako od 53 testirana nanotela ili konstrukta nanotela, referenca je izabrana tako da je u poređenju sa njom testirano nanotelo ili konstrukt nanotela imalo jedan ili više dodatnih ostataka aminokiselina na C-terminalnom kraju (koji su dodati kako bi se ispitao efekat takvog dodavanja na proteinsku interferenciju, a posebno kako bi se navedena interferencija redukovala) i/ili jednu ili više mutacija unutar C-terminalnog regiona (na primer, kao rezultat humanizacije u poređenju sa referencom).
[0615] Rezultati su izraženi kao procentualna redukcija vezivanja (merena u RU jedinicama) za dato nanotelo u odnosu na vezivanje reference (takođe mereno u RU jedinicama - na primer, ako je izmereni nivo vezivanja (RU) referentnog nanotela bio 276, a nivo vezivanja datog nanotela bio 9, tada je redukcija nivoa vezivanja bila na nivo od [9 RU/276 RU] x 100% = 3%), što znači redukciju od 97% u poređenju sa referencom (100%).
[0617] [0206] Slično tome, vezivanje prečišćenog faktora interferencije od svakog od tri davaoca za svako od 53 nanotela ili konstrukta nanotela mereno je korišćenjem istog Biacore instrumenta i upoređeno sa vezivanjem prečišćenog faktora interferencije za istu referentnu ISV ili konstrukt. Rezultati su na sličan način izraženi kao procentualna redukcija vezivanja faktora interferencije za dato nanotelo ili konstrukt nanotela u odnosu na referencu.
[0619] Ustanovljeno je da je za suštinski svako nanotelo ili konstrukt nanotela kod kojeg je dodat jedan ili više ostataka aminokiselina na C-terminalni kraj u poređenju sa referencom, vezivanje faktora interferencije bilo dramatično redukovano. Ovo ponovo potvrđuje da dodavanje jednog ili više ostataka aminokiselina na C-terminalni kraj jedne ISV (VTVSS) može redukovati aspecifičnu proteinsku interferenciju u ADA testu. Takođe je ustanovljeno da u većini slučajeva, samo uvođenje supstitucija unutar C-terminalnog regiona (tj. bez dodavanja jednog ili više ostataka aminokiselina na C-terminalni kraj) u poređenju sa referencom često nije imalo sličan dramatičan uticaj na vezivanje faktora interferencije.
[0621] Podaci su zatim dalje analizirani kako bi se utvrdilo da li je redukcija vezivanja za 21-4 u poređenju sa referencom na bilo koji način u korelaciji sa redukcijom vezivanja za svaki od tri različita preparata prečišćenog faktora interferencije u poređenju sa referencom. Takve korelacije su pronađene.
[0623] Na primer, ustanovljeno je da je od 53 testirana nanotela ili konstrukta nanotela, 36 pokazalo redukciju vezivanja za 21-4 od više od 70% u poređenju sa njihovom odgovarajućom referentnom sekvencom (pri čemu je većina od ovih 36 imala jedan ili više dodatnih ostataka aminokiselina na C-terminalnom kraju, u nekim slučajevima u kombinaciji sa supstitucijama unutar C-terminalnog regiona). Od ovih 36, njih 32 je takođe pokazalo redukciju vezivanja za faktor(e) interferencije u poređenju sa referencom od više od 50% (a u velikom broju slučajeva, posebno za nanotela ili konstrukte nanotela sa jednim ili više ostataka aminokiselina dodatih na C-terminalni kraj, redukcija je bila daleko veća od 50%, kao što je više od 70% ili čak više od 90%, videti podatke date u tabeli X). Ovo pokazuje da je u 32 od 36 slučajeva (tj. 89%), redukcija vezivanja za 21-4 od više od 70% (u poređenju sa referencom = 100%) prediktivna za redukciju vezivanja faktorima interferencije od više od 50% (u poređenju sa istom referencom). Radi jasnoće, u svakom slučaju, redukcija je izračunata kao 100% - [procenat dat u tabelama ispod za nivo postignute redukcije sa testiranim nanotelom].
[0625] [0210] Slično tome, ustanovljeno je da je od 53 testirana nanotela ili konstrukta nanotela, 33 pokazalo redukciju vezivanja za 21-4 od više od 90% u poređenju sa njihovom odgovarajućom referentnom sekvencom (ponovo, pri čemu je većina od ova 33 imala jedan ili više dodatnih ostataka aminokiselina na C-terminalnom kraju, u nekim slučajevima u kombinaciji sa supstitucijama unutar C-terminalnog regiona). Od ova 33, njih 32 je takođe pokazalo redukciju vezivanja za faktor(e) interferencije u poređenju sa njihovom odgovarajućom referentnom sekvencom od više od 50%. Ovo pokazuje da je u 32 od 33 slučaja (tj. 97%), redukcija vezivanja za 21-4 od više od 90% (u poređenju sa referencom) prediktivna za redukciju vezivanja faktorima interferencije od više od 50% (u poređenju sa istom referencom).
[0627] Takođe treba napomenuti da takva redukcija vezivanja faktora interferencije za više od 50% (što je potvrđeno redukcijom vezivanja za 21-4 od više od 70%) znači da takav faktor(i) interferencije suštinski više ne interferira(ju) sa ADA testom za predmetnu ISV: eksperimentalna potvrda korišćenjem ADA testa pokazala je da kada je vezivanje faktora interferencije redukovano za više od 45%, ne može se uočiti značajan uticaj prisustva faktora interferencije na ADA test. U tom pogledu, stručnjaku će takođe biti jasno da će to još više biti slučaj kada je vezivanje faktora interferencije redukovano u meri daleko većoj od 50% (kao što je za više od 70% ili čak više od 90%), kao što je primećeno u nekim slučajevima (ponovo videti ovde predstavljene podatke).
[0629] Zapravo, ustanovljeno je da je redukcija vezivanja za 21-4 od više od 45% indikativna za redukciju vezivanja faktorima interferencije od više od 45%, što, kao što je pomenuto, znači da faktor(i) interferencije više ne interferiraju sa ADA testom.
[0631] Štaviše, ovde predstavljeni podaci o korelaciji između (redukcije) vezivanja za 21-4 i (redukcije) vezivanja faktorom interferencije takođe su omogućili pronalazačima da postave apsolutnu vrednost za vezivanje za 21-4 ispod koje se može očekivati (u okviru pouzdanosti koju pružaju podaci izneti u ovom primeru 8) da ISV ili konstrukt zasnovan na ISV neće biti podložan vezivanju faktorima interferencije na način koji bi mogao da interferira sa ADA testom. Kao što je navedeno u sledećem primeru 9, ova vrednost je 500 RU (određena i izračunata kako je navedeno u primeru 9).
[0633] [0214] Monoklonsko antitelo 21-4 je prečišćeno iz medijuma kulture hibridoma dobijenog u gornjem primeru 7, na sledeći način: Ćelije hibridoma koje sekretuju monoklonsko antitelo 21-4-3 kultivisane su u spiner bocama u beserumskom medijumu (CD Hybridoma, Gibco, dopunjen sa 8 mM L-glutamina (Invitrogen) i 1× holesterolom (250× cholesterol lipid concentrate, Gibco)) u zapremini od 100 mL ili 500 mL. Bistri supernatant je filtriran, a mišji IgG1 je uhvaćen na ProteinA koloni (HiTrap MabSelect SuRe, 5mL, GE Healthcare) pri smanjenom protoku od 2 mL/min. Vezano antitelo je eluirano u 0,1 M citratnom puferu pH 3,0, a frakcije eluata (od 5 mL) su direktno neutralisane sa 1 mL 1 M TRIS-a pH 9. Čistoća antitela je potvrđena redukujućom i neredukujućom SDS-PAGE elektroforezom.
[0635] Prečišćeni preparati faktora interferencije od davalaca 8 i 19 dobijeni su iz uzoraka seruma navedenih davalaca putem afinitetnog prečišćavanja, suštinski kako je opisano u primeru 2A. Faktori interferencije od davaoca 30 dobijeni su iz uzorka seruma davaoca 30, suštinski kako je opisano u primeru 2B.
[0637] Za određivanje vezivanja 21-4 za svako od nanotela ili konstrukta nanotela, korišćen je protokol opisan u primeru 9.
[0639] Vezivanje faktora interferencije od tri davaoca za svako od nanotela ili konstrukta nanotela određeno je korišćenjem Biacore T100 instrumenta suštinski kako je opisano u primeru 3, korišćenjem faktora interferencije od svakog od davalaca 8, 19 i 30, direktno imobilizovanih na CM5 senzorski čip.
[0641] Primer 9: protokol za predviđanje tendencije ISV ka aspecifičnoj proteinskoj interferenciji (korišćenjem monoklonskog antitela 21-4).
[0643] Merenja vezivanja su vršena pomoću instrumenta Biacore T100 uz korišćenje CM5 T120416 senzorskog čipa, sa radnim puferom HBS-EP+ na 25°C. Antitelo 21-4 je uhvaćeno preko imobilizovanog zečijeg anti-mišjeg IgG, jer je ustanovljeno da se površina sa direktno imobilizovanim mAb 21-4-3 nije mogla efikasno regenerisati. Korišćeni anti-mišji IgG bio je poliklonsko zečije anti-mišje IgG antitelo koje reaguje sa svim IgG podklasama, IgA i IgM (GE Healthcare; Cat#BR-1008-38; Lot#10056316). Imobilizacija anti-mišjeg IgG izvršena je manuelnim kuplovanjem amina korišćenjem 7-minutne injekcije EDC/NHS za aktivaciju i 7-minutne injekcije 1M etanolamin HCl pH 8,5 za deaktivaciju (Biacore, komplet za kuplovanje amina). Uslovi vezivanja su navedeni u tabeli XI. Na osnovu nivoa imobilizacije i molekulske mase (MW) proteina, teoretski R<max>za vezivanje mAb 21-4-3 na imobilizovani anti-mišji IgG iznosio je ~13000 RU (kada se jedan molekul mAb 21-4-3 vezuje za jedan molekul anti-mišjeg IgG).
[0644] Tabela XI
[0647]
[0650] Uslovi korišćeni za eksperiment vezivanja (Biacore T100) uz upotrebu 21-4 imobilizovanog na ovaj način dati su u tabeli XII. Površina sa anti-mišjim IgG mogla se uspešno regenerisati nakon hvatanja mAb 21-4-3 i injekcije svih uzoraka (uz ograničeno povećanje baznog nivoa nakon svake regeneracije).
[0652] Tabela XII
[0654]
[0655]
[0658] Gornji protokol je korišćen za generisanje podataka o vezivanju 21-4 navedenih u tabeli X. Kada su razmatrane apsolutne vrednosti za RU (nakon prilagođavanja izmerene RU vrednosti molekulskoj masi ISV, proteina ili polipeptida prema formuli ([izmereni RU]/[MW proteina] x 10<6>), ustanovljeno je da su nanotela i konstrukti nanotela pomenuti u tabeli X, koji su imali dodat ostatak alanina i koji su pokazali redukciju vezivanja od >90% kako za 21-4 tako i za faktore interferencije, uglavnom davali RU vrednosti između 30 RU i 400 RU (pri čemu su odgovarajuća referentna nanotela ili polipeptidi - kao što je navedeno na slici 9 - imali RU vrednosti veće od 1000, obično veće od 1500, a često i veće od 2000).
[0660] Na osnovu ovoga, smatralo se da bi (prilagođena) RU vrednost manja od 500 u ovom testu bila jasan pokazatelj da se za ISV (ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV, kako je ovde opisano) faktori interferencije (suštinski) neće vezivati na način koji bi interferirao sa ADA testom.

Claims (22)

1. Patentni zahtevi
1. Metoda za predviđanje da li će imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (ISV) ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV izazvati proteinsku interferenciju u imunotestu kao što je test na antitela protiv leka (ADA), pri čemu navedena metoda obuhvata izvođenje imunotesta koji bar obuhvata korake:
(i) dovođenje u kontakt navedene ISV ili proteina/polipeptida sa antitelom koje je dobijeno od humanog ispitanika i koje je selektovano/izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za C-terminalni kraj ISV koja na svom C-terminalnom kraju ima aminokiselinsku sekvencu VTVSS (SEQ ID NO:33); i
(ii) određivanje da li je navedena ISV, protein ili polipeptid vezan navedenim antitelom u navedenom imunotestu
pri čemu činjenica da se ISV, protein ili polipeptid vezuje za navedeno antitelo u koraku (ii) znači da ISV, protein ili polipeptid može izazvati, ili ima visok ili povećan rizik od izazivanja takve proteinske interferencije.
2. Metoda prema patentnom zahtevu 1, u kojoj je antitelo selektovano/izolovano na osnovu njegove sposobnosti da prepozna i/ili se veže za epitop na navedenoj ISV, pri čemu epitop obuhvata C-terminalnu sekvencu VTVSS (SEQ ID NO:33), aminokiselinski ostatak na poziciji 14, i opciono dalje obuhvata aminokiselinske ostatke na pozicijama 83 i 108 i aminokiselinske ostatke na pozicijama 13, 15, 82b, 83, 84 i 107.
3. Metoda prema patentnom zahtevu 1 ili 2, u kojoj je ISV zapravo VHH, sekvencijalno optimizovana VHH, humanizovana VHH ili kamelizovana VH.
4. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u kojoj protein ili polipeptid ima navedenu ISV na svom C-terminalnom kraju.
5. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 4, u kojoj je antitelo poliklonsko antitelo.
6. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, u kojoj je antitelo poliklonsko antitelo koje je dobijeno, polazeći od biološkog uzorka humanog ispitanika koji je
pogodan kao polazni materijal za dobijanje poliklonskih antitela, metodom koja obuhvata bar jedan korak imunoafinitetne hromatografije u kojoj se ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV koristi kao afinitetni antigen, i opciono jedan ili više daljih koraka za izolovanje i/ili prečišćavanje poliklonskog antitela iz navedenog uzorka.
7. Metoda prema patentnom zahtevu 6, u kojoj je ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV, a koji se koristi kao afinitetni antigen, zapravo ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33), ili u kojoj protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV, a koji se koristi kao afinitetni antigen, na svom C-terminalnom kraju ima ISV koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33).
8. Metoda prema patentnom zahtevu 6 ili 7, u kojoj je ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV, a koji se koristi kao afinitetni antigen, zapravo ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33) i koja ima prolinski ostatak na poziciji 14; ili u kojoj protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV, a koji se koristi kao afinitetni antigen, na svom C-terminalnom kraju ima ISV koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33) i koja ima prolinski ostatak na poziciji 14.
9. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, u kojoj je ISV koja se koristi kao afinitetni antigen sekvencijalno optimizovana i/ili humanizovana VHH, kamelizovana VH, sekvencijalno optimizovana VH ili kamelizovana humana VH.
10. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 8 ili 9, u kojoj je ISV koja se koristi kao afinitetni antigen sekvencijalno optimizovana i/ili humanizovana VHH, ili sekvencijalno optimizovana VH koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33) i koja ima prolinski ostatak na poziciji 14 koji je uveden kao deo humanizacije i/ili sekvencijalne optimizacije odgovarajuće prirodne VHH.
11. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, u kojoj je antitelo monoklonsko antitelo.
12. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili 11, u kojoj je antitelo monoklonsko antitelo koje je dobijeno, polazeći od biološkog uzorka humanog ispitanika koji je pogodan kao polazni materijal za dobijanje monoklonskih antitela, metodom koja obuhvata bar jedan korak skrininga ili selekcije u kojem se ISV koristi za skrining i selekciju monoklonskog antitela koje se vezuje za navedenu ISV, i opciono jedan ili više daljih koraka za izolovanje i/ili prečišćavanje monoklonskog antitela iz navedenog uzorka.
13. Metoda prema patentnom zahtevu 12, u kojoj se ISV koja se koristi u koraku skrininga ili selekcije na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33).
14. Metoda prema patentnom zahtevu 12 ili 13, u kojoj se ISV koja se koristi u koraku skrininga ili selekcije na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33) i ima prolinski ostatak na poziciji 14.
15. Metoda prema patentnom zahtevu 13 ili 14, u kojoj je ISV koja se koristi u koraku skrininga ili selekcije sekvencijalno optimizovana i/ili humanizovana VHH, kamelizovana VH, sekvencijalno optimizovana VH ili kamelizovana humana VH.
16. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 14 do 15, u kojoj je ISV koja se koristi u koraku skrininga ili selekcije sekvencijalno optimizovana i/ili humanizovana VHH, ili sekvencijalno optimizovana VH koja se na svom C-terminalnom kraju završava aminokiselinskom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO:33) i koja ima prolinski ostatak na poziciji 14 koji je uveden kao deo humanizacije i/ili sekvencijalne optimizacije odgovarajuće prirodne VHH.
17. Metoda za predviđanje da li će ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV izazvati proteinsku interferenciju u imunotestu, pri čemu navedena metoda obuhvata izvođenje imunotesta koji bar obuhvata korake:
(i) dovođenje u kontakt navedene ISV ili proteina ili polipeptida koji obuhvata bar jednu ISV sa monoklonskim antitelom 21-4 kako ga eksprimira hibridomska ćelijska linija LMBP-9680-CB, tj. koje se koristi kao analitičko antitelo; i
(ii) određivanje da li je navedena ISV ili protein ili polipeptid koji obuhvata bar jednu ISV vezan navedenim monoklonskim antitelom 21-4 u navedenom imunotestu.
18. Metoda prema patentnom zahtevu 17, u kojoj je ISV ili VHH, sekvencijalno optimizovana VHH, humanizovana VHH ili kamelizovana VH, ili ISV koja nije VHH, humanizovana VHH ili kamelizovana VH.
19. Metoda prema patentnom zahtevu 17 ili 18, u kojoj je ISV zapravo VHH, sekvencijalno optimizovana VHH, humanizovana VHH ili kamelizovana VH.
20. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 19, u kojoj protein ili polipeptid ima navedenu ISV na svom C-terminalnom kraju.
21. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 20, koja se izvodi u imunotestu izabranom između ELISA testa, sendvič ELISA testa, površinske plazmonske rezonance ili kompetitivnog testa premošćavanja.
22. Metoda prema patentnom zahtevu 21, koja se izvodi u površinskoj plazmonskoj rezonanci u kojoj je analitičko antitelo naneto na čip.
RS20260072A 2011-06-23 2012-06-25 Tehnike za predviđanje, detekciju i redukciju interferencije specifičnih proteina u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina RS67664B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161500360P 2011-06-23 2011-06-23
US201161500464P 2011-06-23 2011-06-23
US201161541368P 2011-09-30 2011-09-30
PCT/EP2011/067132 WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2011-09-30 Biological materials related to c-met
US13/435,567 US8703135B2 (en) 2010-09-30 2012-03-30 Biological materials related to c-Met
PCT/EP2012/061304 WO2012175400A1 (en) 2011-06-23 2012-06-14 Serum albumin binding proteins
EP15179669.5A EP2974737B1 (en) 2011-06-23 2012-06-25 Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS67664B1 true RS67664B1 (sr) 2026-02-27

Family

ID=47423024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260072A RS67664B1 (sr) 2011-06-23 2012-06-25 Tehnike za predviđanje, detekciju i redukciju interferencije specifičnih proteina u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina

Country Status (26)

Country Link
US (11) US20180009888A9 (sr)
EP (1) EP2723769B2 (sr)
JP (7) JP6258199B2 (sr)
KR (8) KR102025035B1 (sr)
CN (5) CN108659120A (sr)
AU (7) AU2012273929B2 (sr)
BR (3) BR122018012485B1 (sr)
CA (3) CA2837998C (sr)
DK (1) DK2723769T4 (sr)
ES (2) ES2622006T5 (sr)
FI (1) FI2974737T3 (sr)
HR (1) HRP20260089T1 (sr)
HU (1) HUE031828T2 (sr)
IL (5) IL229503B (sr)
IN (1) IN2014CN00373A (sr)
LT (2) LT2723769T (sr)
MX (2) MX350074B (sr)
NZ (1) NZ780183A (sr)
PH (7) PH12013502669B1 (sr)
PL (2) PL2974737T3 (sr)
PT (2) PT2723769T (sr)
RS (1) RS67664B1 (sr)
RU (1) RU2700630C2 (sr)
SG (4) SG10201805064SA (sr)
WO (1) WO2012175741A2 (sr)
ZA (1) ZA201309295B (sr)

Families Citing this family (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2691717T3 (es) 2009-10-30 2018-11-28 Novartis Ag Bibliotecas universales del dominio de unión del lado inferior de tipo iii de la fibronectina de tipo III
EP2566892B1 (en) 2010-05-06 2017-12-20 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) antibodies
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
EP2723771B1 (en) 2011-06-23 2019-09-11 Ablynx NV Serum albumin binding proteins
RS55775B2 (sr) 2011-06-23 2022-10-31 Ablynx Nv Tehnike za predviđanje, otkrivanje i smanjenje nespecifične proteinske interferencije u testovima koji uključuju pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina
SG10201805064SA (en) * 2011-06-23 2018-07-30 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
PE20141522A1 (es) * 2011-08-17 2014-11-17 Glaxo Group Ltd Proteinas y peptidos modificados
WO2013073968A2 (en) * 2011-09-12 2013-05-23 Industrial Research Limited Agents for modulation of cell signalling
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
ES2666856T3 (es) 2011-11-04 2018-05-08 Novartis Ag Proteína 6 relacionada con lipoproteínas de baja densidad (LRP6) - constructos extensores de la vida media
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2014043509A2 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Novartis Ag Antigen binding molecule with terminal modifications
WO2015105955A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
IL318433A (en) 2014-05-16 2025-03-01 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable complexes
EP4707303A2 (en) * 2014-05-16 2026-03-11 Ablynx NV Improved immunoglobulin variable domains
US11009511B2 (en) * 2014-05-16 2021-05-18 Ablynx N.V. Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
JP7001474B2 (ja) 2015-01-21 2022-01-19 インヒブルクス，インコーポレイティド 非免疫原性単一ドメイン抗体
CA3255406A1 (en) 2015-03-31 2025-07-03 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Tnf-alpha binding polypeptides
SG11201706840WA (en) 2015-03-31 2017-09-28 Vhsquared Ltd Peptide construct having a protease-cleavable linker
WO2016156468A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptides
ES3029413T3 (en) 2015-04-02 2025-06-24 Ablynx Nv Bispecific cxcr4-cd-4 polypeptides with potent anti-hiv activity
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
LT3611192T (lt) 2015-05-13 2025-06-25 Ablynx N.V. T ląstelių rekrutingo polipeptidai tcr alfa/beta reaktyvumo pagrindu
CN114920848B (zh) 2015-05-13 2024-10-11 埃博灵克斯股份有限公司 基于cd3反应性的t细胞募集多肽
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
CN108350069B (zh) 2015-10-30 2021-11-12 埃博灵克斯股份有限公司 针对il-23的多肽
TWI746473B (zh) * 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
EP3374395A1 (en) 2015-11-12 2018-09-19 Ablynx NV Improved p2x7 receptor binders and polypeptides comprising the same
NO2768984T3 (sr) 2015-11-12 2018-06-09
LT3374392T (lt) 2015-11-13 2022-01-25 Ablynx Nv Patobulinti serumo albuminą surišantys imunoglobulino kintami domenai
AU2016355569B2 (en) 2015-11-18 2020-01-02 Merck Sharp & Dohme Llc CTLA4 binders
CA3003777A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1/ctla4 binders
IL300122A (en) 2015-11-18 2023-03-01 Merck Sharp ַ& Dohme Llc Substances that bind to PD1 and/or LAG3
AU2016357460B2 (en) * 2015-11-18 2023-07-27 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
KR20180080337A (ko) 2015-11-27 2018-07-11 아블린쓰 엔.브이. Ｃｄ40ｌ을 억제하는 폴리펩티드
UA122079C2 (uk) 2015-12-04 2020-09-10 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Поліпептид, що специфічно зв'язується з lrp5 і lrp6
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
AU2017281421B2 (en) * 2016-06-23 2024-07-25 Ablynx N.V. Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains
US11098113B2 (en) 2016-09-15 2021-08-24 Vib Vzw Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
EP3519438A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 VHsquared Limited Compositions
WO2018075830A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
BR112019010061A2 (pt) 2016-11-16 2019-08-13 Ablynx Nv polipeptídeos de recrutamento de células t capazes de se ligarem ao cd123 e tcr alfa/beta
RU2022101604A (ru) 2016-12-07 2022-03-29 Аблинкс Нв Улучшенные отдельные вариабельные домены иммуноглобулина, связывающиеся с сывороточным альбумином
JP7219220B2 (ja) 2017-01-17 2023-02-07 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
IL267897B2 (en) 2017-01-17 2025-02-01 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
US12480957B2 (en) 2017-03-31 2025-11-25 Ablynx N.V. Method of screening for anti-drug antibodies against immunoglobulin single variable domain-based drugs
EP3630816B1 (en) 2017-05-31 2024-03-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
TW202417517A (zh) 2017-06-02 2024-05-01 德商麥克專利有限公司 與ｍｍｐ１３結合之免疫球蛋白
JP7249961B2 (ja) 2017-06-02 2023-03-31 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３およびアグリカンに結合するポリペプチド
CN118894939A (zh) * 2017-06-02 2024-11-05 默克专利股份有限公司 结合adamts的免疫球蛋白
NZ759601A (en) 2017-06-02 2023-06-30 Merck Patent Gmbh Aggrecan binding immunoglobulins
CA3070253A1 (en) 2017-07-19 2019-01-24 Vib Vzw Serum albumin binding agents
JP6708797B2 (ja) 2017-08-23 2020-06-10 本田技研工業株式会社 鞍乗り型車両のエアバッグ装置
KR20200091400A (ko) 2017-10-31 2020-07-30 브이아이비 브이지더블유 신규한 항원-결합 키메라 단백질 및 이의 방법 및 용도
KR102439221B1 (ko) 2017-12-14 2022-09-01 프로디자인 소닉스, 인크. 음향 트랜스듀서 구동기 및 제어기
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
TWI848953B (zh) 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
AU2019301614B2 (en) 2018-07-10 2025-11-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for mitigating drug target interference in an anti-drug antibody (ADA) immunoassay
FR3088640A1 (fr) 2018-10-14 2020-05-22 Smart Diagnostix Pharma Nouveau polypeptide se liant specifiquement a la proteine p16
EP3962599A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 Vib Vzw Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator stabilizing agents
KR20220063148A (ko) 2019-06-21 2022-05-17 소리소 파마슈티컬스 인크. 조성물
US12559552B2 (en) 2019-06-21 2026-02-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. IL-23 and TNF-alpha binding bi-specific heavy chain polypeptides
CA3144567A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Scott Crowe Polypeptides
TWI878355B (zh) 2019-10-02 2025-04-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白
GB201914468D0 (en) 2019-10-07 2019-11-20 Crescendo Biologics Ltd Binding Molecules
US20220411495A1 (en) 2019-11-27 2022-12-29 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
KR20220111313A (ko) 2019-12-06 2022-08-09 아블린쓰 엔.브이. TNFα 및 OX40L을 표적으로 하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드
IL293561A (en) 2019-12-06 2022-08-01 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin with one variable domain targeting TNFa and IL-23
MX2022007035A (es) 2019-12-09 2022-06-23 Ablynx Nv Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp.
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
US20240027467A1 (en) 2019-12-20 2024-01-25 Vib Vzw Nanobody Exchange Chromatography
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
KR20230012464A (ko) 2020-02-25 2023-01-26 브이아이비 브이지더블유 류신-풍부 반복 키나제 2 알로스테릭 조절제
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
AU2021350156A1 (en) 2020-09-25 2023-06-08 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-13 and ox40l
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
JP2024508207A (ja) 2020-12-02 2024-02-26 ブイアイビー ブイゼットダブリュ がんに対する組み合わせ治療におけるｌｔｂｒアゴニスト
PH12023500013A1 (en) 2020-12-04 2024-03-11 Tidal Therapeutics Inc Ionizable cationic lipids and lipi nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
CN116964090A (zh) 2020-12-14 2023-10-27 武田药品工业有限公司 条件性双特异性结合蛋白
EP4263602A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Ablynx N.V. Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-6 and tnf-alpha
IL303740A (en) 2020-12-18 2023-08-01 Sanofi Sa T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
CA3205422A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting glypican-3 and t cell receptor
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
IL304929A (en) 2021-02-05 2023-10-01 Vib Vzw [Be/Be Sarbevirus binders
EP4294516A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders
CN113173978B (zh) * 2021-04-22 2024-03-01 温州医科大学 一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
EP4377352A2 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
US20250026842A1 (en) * 2021-11-29 2025-01-23 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Modified protein or polypeptide
EP4448783A1 (en) 2021-12-13 2024-10-23 Heraeus Medical GmbH Tests and methods for detecting bacterial infection
KR20240122867A (ko) 2021-12-17 2024-08-13 아블린쓰 TCRαβ, CD33, 및 CD123을 표적화하는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
AR128593A1 (es) 2022-02-23 2024-05-22 Takeda Pharmaceuticals Co Proteínas de unión condicionalmente biespecíficas
US20250235534A1 (en) 2022-04-13 2025-07-24 Vib Vzw An LTBR Agonist In Combination Therapy Against Cancer
CA3249283A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw BINDERS OF SARBECOVIRUS SPICULE S2 SUBUNITS
WO2023240156A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
AU2023290487A1 (en) 2022-06-14 2025-01-30 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
US20240132624A1 (en) 2022-07-27 2024-04-25 Ablynx N.V. Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
EP4594348A1 (en) 2022-09-27 2025-08-06 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus
EP4605077A1 (en) 2022-10-18 2025-08-27 Confo Therapeutics N.V. Amino acid sequences directed against the melanocortin 4 receptor and polypeptides comprising the same for the treatment of mc4r-related diseases and disorders
EP4357778A1 (en) 2022-10-20 2024-04-24 Heraeus Medical GmbH Treatment of microbial infections diagnosed using the biomarker d-lactate
CN120380024A (zh) 2022-12-21 2025-07-25 建新公司 抗pd-1×4-1bb结合蛋白
AR131494A1 (es) 2022-12-23 2025-03-26 Ablynx Nv Vehículos de conjugación a base de proteína
JP2026503077A (ja) 2023-01-09 2026-01-27 オデッセイ セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｔｎｆｒ２抗原結合タンパク質及びその使用
KR20250133776A (ko) 2023-02-10 2025-09-08 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. 전립선-특이적 막 항원(psma)을 표적화하는 조성물 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
TW202448926A (zh) 2023-02-17 2024-12-16 比利時商艾伯霖克斯公司 結合新生兒fc受體之多肽
WO2024175787A1 (en) 2023-02-24 2024-08-29 Vrije Universiteit Brussel Anti-inflammatory pannexin 1 channel inhibitors
TW202444757A (zh) 2023-03-14 2024-11-16 美商奧迪希治療公司 抗cd25抗原結合蛋白及其用途
AU2024243709A1 (en) 2023-04-03 2025-11-06 Katholieke Universiteit Leuven Blood-brain barrier crossing antibodies
KR20260008776A (ko) 2023-05-08 2026-01-16 사노피 면역글로불린 단일 가변 도메인의 글리코실화
EP4713364A1 (en) 2023-05-17 2026-03-25 Odyssey Therapeutics, Inc. Modified single-domain antibodies
EP4731770A1 (en) 2023-06-22 2026-04-29 Ablynx NV Chimeric proteins for modulating cytokine receptor activity
KR20260032566A (ko) 2023-06-29 2026-03-09 오디세이 테라퓨틱스, 인코포레이티드 항-trailr2 항원-결합 단백질 및 그의 용도
WO2025008537A1 (en) 2023-07-05 2025-01-09 Ablynx Nv Improved fcrn antagonists for treatment of igg-related diseases and disorders
WO2025051767A1 (en) 2023-09-04 2025-03-13 Sanofi Polypeptides for use in the treatment of glypican-3-expressing tumours
TW202532432A (zh) 2023-09-22 2025-08-16 比利時商艾伯霖克斯公司 二及多價白蛋白結合劑
TW202530265A (zh) 2023-10-13 2025-08-01 美商奧迪希治療公司 抗cdh17抗原結合蛋白及其用途
TW202540169A (zh) 2023-11-08 2025-10-16 法商賽諾菲公司 基於ｃｄ２５的溶酶體降解物及其用途
WO2025109176A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Exevir Bio Bv Optimized sarbecovirus spike s2 subunit binders and compositions comprising the same
WO2025114529A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Ablynx Nv Multispecific antibodies recognising human serum albumin, tcr and a tumor antigen recognising moiety
WO2025125577A1 (en) 2023-12-14 2025-06-19 Vib Vzw Antibodies against influenza b virus
TW202543670A (zh) 2023-12-22 2025-11-16 比利時商艾伯霖克斯公司 用於核內投予之基於蛋白質的接合載劑
TW202542180A (zh) 2023-12-22 2025-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 用於位點特異性胺軛合的基於蛋白質的載體
WO2025174825A2 (en) 2024-02-12 2025-08-21 Aera Therapeutics, Inc. Delivery compositions
WO2025181155A1 (en) 2024-02-26 2025-09-04 Vib Vzw Human beta-glucocerebrosidase binders and uses thereof
WO2025217240A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-tnfr2 antigen-binding proteins and uses thereof
WO2025219231A1 (en) 2024-04-15 2025-10-23 Vib Vzw Computer-implemented means and methods for the de novo design of antibodies targeting a specific epitope
WO2025255558A2 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-thymic stromal lymphopoietin (tslp) antigen-binding proteins and uses thereof
WO2025255435A2 (en) 2024-06-07 2025-12-11 Odyssey Therapeutics, Inc. Antigen-binding proteins against serum albumin and uses thereof
US20260007757A1 (en) 2024-06-18 2026-01-08 Ablynx Nv Antibody-recruiting molecules
WO2025265116A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 Georgia State University Research Foundation, Inc. Nanobodies to henipavirus and uses thereof
WO2026006708A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Odyssey Therapeutics, Inc. Anti-cd25 antigen-binding proteins and uses thereof
WO2026006809A1 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Odyssey Therapeutics, Inc. Multispecific molecules binding tnfr2 and cd25 and uses thereof
WO2026008665A1 (en) 2024-07-01 2026-01-08 Vib Vzw Binders of the pd-1•pd-l1 complex and their use
WO2026024863A2 (en) 2024-07-24 2026-01-29 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Compositions targeting prostate-specific membrane antigen (psma) in combination with androgen receptor antagonists
WO2026030375A2 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Genzyme Corporation Lipid nanoparticles and methods of manufacture and use thereof
WO2026052756A1 (en) 2024-09-05 2026-03-12 Ablynx Nv Her2 binding immunoglobulin single variable domains, constructs comprising the same and uses thereof
WO2026062214A1 (en) 2024-09-19 2026-03-26 Sanofi Formulations comprising lunsekimig
WO2026072557A2 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Genzyme Corporation Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
WO2026078159A1 (en) 2024-10-10 2026-04-16 Ablynx Nv Immune cell engagers and methods comprising the same
WO2026083296A1 (en) 2024-10-16 2026-04-23 Bright Peak Therapeutics Ag Trispecific compositions comprising il-18, vegf binding domains, and pd-1 binding domains
WO2026083295A1 (en) 2024-10-16 2026-04-23 Bright Peak Therapeutics Ag Trispecific compositions comprising il-2, vegf binding domains, and pd-1 binding domains

Family Cites Families (120)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1545106C3 (de) 1963-07-16 1979-05-31 Union Carbide Corp., New York, N.Y. (V.St.A.) Verfahren zur Herstellung von linearen Polyarylenpolyäthern
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
US6150584A (en) * 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
GB9016299D0 (en) * 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5608039A (en) * 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
DK0488470T3 (da) 1990-11-26 1997-12-22 Akzo Nobel Nv Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer
DE69321823T2 (de) 1992-10-21 1999-06-02 Taito Co., Ltd., Tokio/Tokyo 2-amino-1, 3- propandiolverbindung und immunosuppressium
JPH1180026A (ja) 1997-09-02 1999-03-23 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd 新規免疫抑制剤、その使用方法およびその同定方法
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
ATE497171T1 (de) 1999-07-05 2011-02-15 Leuven K U Res & Dev Von willebrand-faktor-aktivitätsnachweis
US6541225B1 (en) 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
US20020155574A1 (en) 2000-08-01 2002-10-24 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
WO2002026829A1 (en) 2000-09-25 2002-04-04 Rega Stichting Vzw Method for the production of human antibodies, antibodies thus obtained and their use in therapy and diagnosis
ATE513854T1 (de) 2000-12-13 2011-07-15 Bac Ip B V Proteinraster aus variablen domänen der schweren immunoglobulinkette von kamelen
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
WO2004041863A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses therefor
ES2374068T3 (es) 2002-12-03 2012-02-13 Ucb Pharma, S.A. Ensayo para identificar células productoras de anticuerpos.
EP1578801A2 (en) * 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
JP2006517789A (ja) 2003-01-10 2006-08-03 アブリンクス エン．ヴェー． 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用
WO2004065416A2 (en) * 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1623229A2 (en) 2003-05-15 2006-02-08 Cytos Biotechnology AG Selection of b cells with specificity of interest: method of preparation and use
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
KR20070118199A (ko) 2003-11-04 2007-12-13 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 고지혈증·고알부민혈증 모델 동물
CA2575402A1 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
MX2007006593A (es) 2004-12-02 2008-03-04 Domantis Ltd Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
US8188223B2 (en) 2005-05-18 2012-05-29 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins
ES2694247T3 (es) * 2005-05-20 2018-12-19 Ablynx N.V. NanobodiesTM mejorados para el tratamiento de trastornos mediados por agregación
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
WO2006129843A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
US7875465B2 (en) 2005-05-31 2011-01-25 Canon Kabushiki Kaisha Target substance capturing molecule
JP2007008925A (ja) * 2005-05-31 2007-01-18 Canon Inc 標的物質捕捉分子
JP2009519011A (ja) 2005-12-01 2009-05-14 ドマンティス リミテッド インターロイキン１受容体１型に結合する非競合ドメイン抗体フォーマット
EA200801166A1 (ru) 2005-12-01 2008-12-30 Домантис Лимитед Форматы конкурентного доменного антитела, которые связываются с рецептором интерлейкина 1 первого типа
FR2894741B1 (fr) 2005-12-08 2009-12-04 Centre Nat Etd Spatiales Chaine de reception par satellite
US20100047171A1 (en) * 2006-01-24 2010-02-25 Roland Beckmann Fusion Proteins That Contain Natural Junctions
US8101727B2 (en) 2006-03-30 2012-01-24 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies of c-Met
US7741273B2 (en) 2006-04-13 2010-06-22 Warsaw Orthopedic, Inc. Drug depot implant designs
EP2064244B1 (en) 2006-08-03 2019-06-05 MedImmune Limited ANTIBODIES DIRECTED TO alphaVbeta6 AND USES THEREOF
WO2008020079A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
AU2007293614A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
ATE536369T1 (de) 2006-10-11 2011-12-15 Ablynx Nv Im wesentlichen ph-wert-unabhängigerweise an serumproteine bindende aminosäuresequenzen, verbindungen, die diese enthalten, und deren verwendung
US20080267949A1 (en) 2006-12-05 2008-10-30 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
WO2008073300A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies against angptl3
AU2007331672A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
WO2008077945A2 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Ablynx N.V. Anti-chemokine (ccl2, ccl3, ccl5, cxcl11, cxcl12) single-domain antibodies
EP2121757A2 (en) 2007-02-21 2009-11-25 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
GB0706793D0 (en) 2007-04-05 2007-05-16 Evotec Ag Compounds
CA2687903C (en) 2007-05-24 2016-09-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
AR062123A1 (es) 2007-07-27 2008-10-15 Inst Nac De Tecnologia Agropec Dominio vhh monomerico derivado de anticuerpos de camelidos anti-vp6 dominio dimerico, metodo de inmunodeteccion de rotavirus, composiciones, metodos de prevencion y tratamiento de infecciones con rotavirus
WO2009032949A2 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
WO2009042589A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Vanderbilt University Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof
US8206966B2 (en) 2007-11-05 2012-06-26 Danisco Us Inc. Alpha-amylase variants with altered properties
EP2650311A3 (en) 2007-11-27 2014-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
US8030454B2 (en) 2007-12-28 2011-10-04 Genentech, Inc. Anti-hedgehog antibodies
US8603474B2 (en) * 2008-01-29 2013-12-10 Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd. Membrane transporter NaPi2b (SCL34A1) epitope for antibody therapy, antibodies directed thereto, and target for cancer therapy
WO2009127691A1 (en) * 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
DE102008023620A1 (de) 2008-05-15 2009-11-19 Mettler-Toledo (Albstadt) Gmbh Funktionseinheit mit einer aufrufbaren Funktion und Verfahren zu deren Aufruf
EP2285833B1 (en) 2008-05-16 2014-12-17 Ablynx N.V. AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME
US7858729B2 (en) 2008-05-29 2010-12-28 Novomer, Inc. Methods of controlling molecular weight distribution of polymers and compositions thereof
LT2285408T (lt) 2008-06-05 2019-01-25 Ablynx N.V. Aminorūgščių sekos, nukreiptos prieš viruso apvalkalo baltymus, ir tokias sekas turintys polipeptidai, skirti virusinių ligų gydymui
EP2143735A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
WO2010042815A2 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Duke University Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
US8372808B2 (en) 2008-10-31 2013-02-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Suppression of glial fibrillary acidic protein
US10005830B2 (en) † 2009-03-05 2018-06-26 Ablynx N.V. Antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
CN104127880A (zh) 2009-03-27 2014-11-05 葛兰素集团有限公司 药用融合体和缀合物
NZ595461A (en) 2009-04-10 2013-01-25 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
US8450888B2 (en) 2009-04-20 2013-05-28 General Electric Company Integrated brushless starter/generator system
WO2010130832A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions
WO2011003622A1 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
US8306355B2 (en) 2009-07-13 2012-11-06 Sharp Laboratories Of America, Inc. Methods and systems for reducing compression artifacts
WO2011064382A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
EP3309176B1 (en) 2009-12-14 2025-10-01 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and their therapeutic use
CA2784498A1 (en) * 2009-12-18 2011-06-23 Sanofi Novel antagonist antibodies and their fab fragments against gpvi and uses thereof
KR101721187B1 (ko) 2009-12-23 2017-03-29 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 면역원성의 감소 방법
NZ601117A (en) 2010-03-03 2014-06-27 Boehringer Ingelheim Int Biparatopic abeta binding polypeptides
PT3904391T (pt) 2010-03-10 2024-10-14 Genmab As Anticorpos monoclonais contra c-met
WO2011117423A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7
WO2011135026A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Ablynx Nv Amino acid sequences of nanobodies directed against p19 subunit of the heterodimeric cytokine il-23
EP2571901B1 (en) 2010-05-20 2019-01-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
WO2012093125A1 (en) * 2011-01-06 2012-07-12 Glaxo Group Limited Ligands that bind tgf-beta receptor ii
MX361242B (es) 2011-03-30 2018-11-30 Ablynx Nv Anticuerpos de dominio sencillo contra tnf-alfa y usos de los mismos.
WO2012130314A1 (en) † 2011-03-31 2012-10-04 Elara Pharmaceuticals Gmbh Composition comprising docetaxel
SG10201805064SA (en) 2011-06-23 2018-07-30 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2723771B1 (en) * 2011-06-23 2019-09-11 Ablynx NV Serum albumin binding proteins
US20150344568A1 (en) 2011-06-23 2015-12-03 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
JP5987057B2 (ja) 2011-07-27 2016-09-06 グラクソ グループ リミテッドＧｌａｘｏ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ Ｆｃドメインと融合した抗ｖｅｇｆ単一可変ドメイン
PE20141522A1 (es) 2011-08-17 2014-11-17 Glaxo Group Ltd Proteinas y peptidos modificados
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
US8614548B2 (en) 2012-01-19 2013-12-24 Sonoco Development Incorporated Electroluminescent display and method for production
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2013177271A2 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Owens Corning Intellectual Capital, Llc Laminated foam product and methods for making laminated foam products
WO2014111550A1 (en) † 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
US11009511B2 (en) * 2014-05-16 2021-05-18 Ablynx N.V. Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies
EP4707303A2 (en) 2014-05-16 2026-03-11 Ablynx NV Improved immunoglobulin variable domains
CA2963712A1 (en) 2014-10-21 2016-04-28 Ablynx Nv Treatment of il-6r related diseases
NO2768984T3 (sr) 2015-11-12 2018-06-09
LT3374392T (lt) 2015-11-13 2022-01-25 Ablynx Nv Patobulinti serumo albuminą surišantys imunoglobulino kintami domenai
AU2016357460B2 (en) 2015-11-18 2023-07-27 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
CA3003777A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1/ctla4 binders
AU2016355569B2 (en) 2015-11-18 2020-01-02 Merck Sharp & Dohme Llc CTLA4 binders
IL300122A (en) 2015-11-18 2023-03-01 Merck Sharp ַ& Dohme Llc Substances that bind to PD1 and/or LAG3
EP3408299A1 (en) 2016-01-26 2018-12-05 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Anti-vwf d'd3 single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof
RU2022101604A (ru) * 2016-12-07 2022-03-29 Аблинкс Нв Улучшенные отдельные вариабельные домены иммуноглобулина, связывающиеся с сывороточным альбумином
JP7219220B2 (ja) * 2017-01-17 2023-02-07 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
NZ759601A (en) 2017-06-02 2023-06-30 Merck Patent Gmbh Aggrecan binding immunoglobulins
TW202417517A (zh) 2017-06-02 2024-05-01 德商麥克專利有限公司 與ｍｍｐ１３結合之免疫球蛋白
JP7249961B2 (ja) 2017-06-02 2023-03-31 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３およびアグリカンに結合するポリペプチド
CN118894939A (zh) * 2017-06-02 2024-11-05 默克专利股份有限公司 结合adamts的免疫球蛋白
EP3749696A1 (en) 2018-02-06 2020-12-16 Ablynx N.V. Methods of treating initial episode of ttp with immunoglobulin single variable domains
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
CA3205422A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting glypican-3 and t cell receptor

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020230299A1 (en) 2020-10-01
CN108653728B (zh) 2022-11-18
IL229503A0 (en) 2014-01-30
AU2018202782B2 (en) 2020-07-16
KR101965462B1 (ko) 2019-04-04
US20220119497A1 (en) 2022-04-21
IL293163A (en) 2022-07-01
NZ617995A (en) 2016-06-24
PL2723769T5 (pl) 2022-10-17
PH12022550310A1 (en) 2023-01-23
JP2018162305A (ja) 2018-10-18
SG10201805064SA (en) 2018-07-30
KR20240033183A (ko) 2024-03-12
AU2019201606B2 (en) 2021-04-01
US12006352B2 (en) 2024-06-11
US20230242620A1 (en) 2023-08-03
AU2020230299B2 (en) 2022-10-06
AU2021201506A1 (en) 2021-03-25
CA3142288A1 (en) 2012-12-27
KR102240318B1 (ko) 2021-04-15
PL2974737T3 (pl) 2026-03-09
RU2019128430A (ru) 2019-10-25
JP2017160230A (ja) 2017-09-14
CN108663504B (zh) 2021-06-22
US11192937B2 (en) 2021-12-07
US20170275360A1 (en) 2017-09-28
PH12022550311A1 (en) 2023-01-23
AU2024200309A1 (en) 2024-02-08
JP6258199B2 (ja) 2018-01-10
CA2837998C (en) 2022-03-01
KR20190107200A (ko) 2019-09-18
DK2723769T3 (en) 2017-04-03
US11192938B2 (en) 2021-12-07
ES2622006T3 (es) 2017-07-05
JP6869923B2 (ja) 2021-05-12
KR102025035B1 (ko) 2019-11-04
SG194982A1 (en) 2013-12-30
US20210388061A1 (en) 2021-12-16
EP2723769B1 (en) 2017-01-11
JP2014520134A (ja) 2014-08-21
EP2723769A2 (en) 2014-04-30
KR20220114104A (ko) 2022-08-17
CN108663504A (zh) 2018-10-16
BR112013032145B1 (pt) 2022-09-20
HUE031828T2 (en) 2017-08-28
CA3141978A1 (en) 2012-12-27
LT2723769T (lt) 2017-04-10
US12516105B2 (en) 2026-01-06
PT2974737T (pt) 2026-01-20
ES2622006T5 (es) 2022-10-13
SG10201707604SA (en) 2017-11-29
PH12022550312A1 (en) 2023-01-23
US20210403536A1 (en) 2021-12-30
ES3059435T3 (en) 2026-03-20
CN104203975B (zh) 2018-05-11
US20140199295A1 (en) 2014-07-17
KR102246924B1 (ko) 2021-04-30
US20180355031A1 (en) 2018-12-13
NZ716279A (en) 2017-07-28
KR20180086280A (ko) 2018-07-30
KR20210047369A (ko) 2021-04-29
BR122017005075A2 (pt) 2019-09-03
MX2018007826A (es) 2021-12-08
IN2014CN00373A (sr) 2015-04-03
AU2019201606A1 (en) 2019-04-04
JP2024050769A (ja) 2024-04-10
RU2014102007A (ru) 2015-11-27
US20200325221A1 (en) 2020-10-15
IL324872A (en) 2026-01-01
PH12017501178A1 (en) 2018-07-23
IL293163B1 (en) 2026-04-01
IL293155A (en) 2022-07-01
JP2021107426A (ja) 2021-07-29
PH12013502669A1 (en) 2014-02-10
MX2013014614A (es) 2014-08-01
FI2974737T3 (fi) 2026-01-22
AU2017204339A1 (en) 2017-07-13
MX350074B (es) 2017-08-25
AU2012273929B2 (en) 2017-04-27
US20200216532A1 (en) 2020-07-09
CN108659121A (zh) 2018-10-16
US20220298227A9 (en) 2022-09-22
LT2974737T (lt) 2026-02-10
US20210388062A1 (en) 2021-12-16
CN108659120A (zh) 2018-10-16
ZA201309295B (en) 2015-01-28
KR20140040779A (ko) 2014-04-03
BR112013032145A2 (pt) 2017-12-05
IL250396B (en) 2022-06-01
AU2017204339B2 (en) 2019-03-28
AU2021201506B2 (en) 2023-10-19
KR102430693B1 (ko) 2022-08-08
EP2723769B2 (en) 2022-06-15
JP2022031790A (ja) 2022-02-22
DK2723769T4 (da) 2022-09-05
KR102880093B1 (ko) 2025-10-31
PL2723769T3 (pl) 2017-07-31
PT2723769T (pt) 2017-04-04
WO2012175741A3 (en) 2013-02-14
US10858418B2 (en) 2020-12-08
KR20190041513A (ko) 2019-04-22
RU2700630C2 (ru) 2019-09-18
IL250396A0 (en) 2017-03-30
JP2026067951A (ja) 2026-04-21
CN104203975A (zh) 2014-12-10
BR112013032145A8 (pt) 2018-07-03
NZ780183A (en) 2024-12-20
US20180009888A9 (en) 2018-01-11
KR102929408B1 (ko) 2026-02-20
HRP20260089T1 (hr) 2026-02-27
BR122017005075B1 (pt) 2022-09-20
WO2012175741A2 (en) 2012-12-27
US20170275361A1 (en) 2017-09-28
PH12022550313A1 (en) 2023-01-23
IL293155B1 (en) 2026-01-01
PH12013502669B1 (en) 2018-08-10
IL229503B (en) 2022-06-01
AU2018202782A1 (en) 2018-05-10
KR20260035287A (ko) 2026-03-12
CA2837998A1 (en) 2012-12-27
SG10201605048XA (en) 2016-07-28
CN108653728A (zh) 2018-10-16
PH12022550309A1 (en) 2023-01-23
BR122018012485B1 (pt) 2022-09-20
JP6982400B2 (ja) 2021-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12516105B2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2974737B1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20150050266A9 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20150344568A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
HK1260347A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
HK1260064A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
EP4350345A2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
HK1262399A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
NZ617995B2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
NZ716279B2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains