ES3063081T3 - Anti-cd47 antibodies and methods of use thereof - Google Patents

Anti-cd47 antibodies and methods of use thereof

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ES3063081T3
ES3063081T3 ES20152992T ES20152992T ES3063081T3 ES 3063081 T3 ES3063081 T3 ES 3063081T3 ES 20152992 T ES20152992 T ES 20152992T ES 20152992 T ES20152992 T ES 20152992T ES 3063081 T3 ES3063081 T3 ES 3063081T3
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Krzysztof Masternak
Nicolas Fischer
Francois Rousseau
Elie Dheilly
Marie Kosco-Vilbois
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Novimmune SA
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Abstract

La invención se refiere a anticuerpos monoclonales y/o monovalentes que se unen a CD47. La invención se refiere a anticuerpos monoclonales y/o monovalentes que se unen a CD19. La invención también se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales biespecíficos que presentan una especificidad diferente para cada sitio de unión de la molécula de inmunoglobulina, donde uno de los sitios de unión es específico para CD47. La invención también se refiere a nuevos anticuerpos monoclonales biespecíficos que presentan una especificidad diferente para cada sitio de unión de la molécula de inmunoglobulina, donde uno de los sitios de unión es específico para CD19. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN
[0002] Anticuerpos anti-CD47 y métodos de uso de los mismos
[0003] Campo de la invención
[0004] La invención se refiere a anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales y/o monovalentes, que se unen a CD47.
[0005] Antecedentes de la invención
[0006] CD47 o proteína asociada a integrina (IAP) es una glucoproteína transmembrana ubicua de 50 kDa con múltiples funciones en la comunicación célula-célula. Interactúa con múltiples ligandos, como integrinas, SIRPα (proteína reguladora de señales alfa), SIRPγ y trombospondinas (Oldenborg, P.A., CD47: A Cell Surface Glycoprotein Which Regulates Multiple Functions of Hematopoietic Cells in Health and Disease, ISRN Hematol. 2013; 2013:614619; Soto-Pantoja DR,et al., Therapeutic opportunities for targeting the ubiquitous cell surface receptor CD47 (2012), Expert Opin Ther Targets. 2013 Jan;17(1):89-103; Sick E,et al., CD47 Update: a multifaced actor in the tumor microenvironment of potential therapeutic interest, Br J Pharmacol. 2012 Dec;167(7):1415-30). En el contexto del sistema inmune innato, CD47 funciona como un marcador de sí mismo, transmitiendo una señal inhibitoria de “no me destruyas” a través de la unión a SIRPα expresada por células mieloides, tal como macrófagos, neutrófilos y células dendríticas., El papel de la expresión generalizada de CD47 en la situación fisiológica es, por lo tanto, proteger las células sanas contra la eliminación por el sistema inmune innato (Oldenborg PA,et al., CD47-Signal Regulatory Protein α (Sirpα) Regulates Fcγ and Complement Receptor-Mediated Phagocytosis, J Exp Med.2001 Apr 2;193(7):855-62; Mattias Olsson, Role of the CD47/SIRPα-interaction in regulation of macrophage phagocytosis, Departamento de Biología Médica Integrativa, Sección de Histología y Biología Celular, Umeå University,Umeå, Suecia, Tesis; Oldenborg PA., Role of CD47 in erythroid cells and in autoimmunity, Leuk Lymphoma. 2004 Jul;45(7):1319-27; Oldenborg PA,et al., Role of CD47 as a Marker of Self on Red Blood Cells., Science. 2000 Jun 16;288(5473):2051-4; Brown EJ, Frazier WA., integrin-associated protein (CD47) and its ligands., Trends Cell Biol.2001 Mar;11(3):130-5).
[0007] Las células tumorales secuestran este mecanismo inmunosupresor al sobreexpresar CD47, lo cual les ayuda eficientemente a escapar de la vigilancia inmunitaria y la destrucción por parte de las células inmunitarias innatas. (Majeti R, Chet al., CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells, Cell. 2009 Jul 23;138(2):286-99; S. Jaiswalet al., CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis., Cell.2009 Jul 23;138(2):271-85). La expresión de CD47 está regulada positivamente en la mayoría de los cánceres humanos (por ejemplo, NHL, AML, cáncer de mama, de colon, glioblastoma, glioma, de ovario, de vejiga y de próstata) y el aumento de los niveles de expresión de CD47 se correlaciona claramente con una enfermedad agresiva y una mala supervivencia. (Majeti R,et al., Cell.
[0008] 2009 Jul 23;138(2):286-99; S. Jaiswalet al., Cell. 2009 Jul 23;138(2):271-85; Willingham SB,et al., The CD47-signal regulatory protein alpha (SIRPα) interaction is a therapeutic target for human solid tumors, Proc Natl Acad Sci U S A.2012 Apr 24;109(17):6662-7; Chao MP,et al., Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia., Cancer Res.2011 Feb 15;71(4):1374-84).
[0009] La expresión generalizada de CD47 en tejidos sanos plantea la cuestión de la seguridad y eficacia del tratamiento: En primer lugar, dirigirse a CD47 con un anticuerpo monoclonal neutralizante (Mab) podría afectar a las células sanas, dando como resultado toxicidades graves como se muestra en estudios preclínicos con ratones y monos cynomolgus (Macaca fascicularis) (Willingham SB,et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Apr 24;109(17):6662-7; Weiskopf K,et al., Engineered SIRPα Variants as Immunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies, Science.
[0010] 2013 Jul 5;341(6141):88-91). En segundo lugar, incluso si se pudieran evitar o mitigar las toxicidades graves mediante el uso de formatos alternativos (Weiskopf K,et al., Science. 2013 Jul 5;341(6141):88-91), la amplia expresión de CD47 aún podría causar una rápida eliminación de las moléculas de unión a CD47 a través de la disposición del fármaco mediada por la diana, lo que resulta en una mala farmacocinética y una disminución de la eficacia.
[0011] El documento WO2011/034969 A1 describe anticuerpos que son específicos para CD47 y que interrumpen la interacción CD47-SIRPα.
[0012] Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos y agentes terapéuticos que permitan el direccionamiento de CD47 y superen estos obstáculos.
[0013] Breve descripción de la invención
[0014] La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier otro aspecto, configuración o instancia como se establece en el presente documento que no caiga dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para información. Cualquier referencia a métodos de tratamiento debe interpretarse como referencia al anticuerpo de la invención para su uso en tal método de tratamiento.
[0015] La invención proporciona un anticuerpo que se une a CD47 que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende: una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 1 (CDRH1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 2 (CDRH2), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 3 (CDRH3) y una región variable de cadena ligera que comprende: una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 1 (CDRL1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 2 (CDRL2) y una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 3 (CDRL3) , en donde
[0017] i) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
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[0032] xvi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258;
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[0035] xix) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 239; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255;
[0036] xx) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248;
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[0039] xxiii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 241; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249;
[0040] xxiv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256;
[0041] xxv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
[0042] xxvi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256; o
[0043] xxvii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 235; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254.
[0044] Estos anticuerpos pueden ser monoclonales y tales anticuerpos se denominan colectivamente en la presente anticuerpos monoclonales anti-CD47 o mAb anti-CD47. Los anticuerpos monoclonales son específicos para por lo menos CD47 humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales que reconocen CD47 humano también tienen reactividad cruzada para por lo menos otra proteína CD47 no humana, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD47 de primate no humano, por ejemplo, CD47 de mono cynomolgus y/o CD47 de roedor. Estos anticuerpos monoclonales anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 y la proteína reguladora de señal alfa (SIRPα). En algunas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPα humano.
[0045] Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos que incluyen por lo menos un primer brazo que es específico para CD47. Preferentemente, los anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos son específicos para por lo menos CD47 humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos que reconocen CD47 humano también tienen reactividad cruzada para por lo menos otra proteína CD47 no humana, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD47 de primate no humano, por ejemplo, CD47 de mono cynomolgus y/o CD47 de roedor. En algunas realizaciones, estos anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 y la proteína reguladora de señal alfa (SIRPα). En algunas realizaciones, estos anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPα humano.
[0046] El anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico que reconoce CD47 y una segunda diana, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor (TAA). En algunas realizaciones, el TAA es un antígeno que se expresa en la superficie celular de una célula cancerosa. En algunas realizaciones, la célula cancerosa se selecciona de una célula de cáncer de pulmón, una célula de cáncer bronquial, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de leucemia, una célula de cáncer de linfoma, una célula de cáncer de esófago, una célula de cáncer de hígado, una célula de cáncer urinario y/o de vejiga, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de cavidad oral, una célula de cáncer faríngeo, una célula de cáncer uterino y/o una célula de cáncer de melanoma. En algunas realizaciones, los TAA adecuados, a modo de ejemplo no limitativo, incluyen CD20, HER2, HER3, EGFR, IGF1R, c-Met, PDGFR1, CD40, CD40L, CD30, CS1, CD70, glipicanos, mesotelina, PSMA, PSCA, MUC1, CA125, CEA, FRA, EpCAM, DR5, HGFR1, y/o 5T4.
[0047] CD47 (Grupo de diferenciación 47) funciona como una señal de “no me comas” para las células fagocíticas y se sabe que muchos tumores lo sobreexpresan (escape inmunitario). CD47 interactúa con SIRPα, la cual se expresa en células fagocíticas. CD47 regula negativamente la actividad fagocítica. CD47 inhibe la maduración y activación de las células dendríticas (CD). CD47 también se ha implicado en procesos tales como, por ejemplo, apoptosis, supervivencia, proliferación, adhesión, migración y regulación de la angiogénesis, presión arterial, perfusión tisular y/u homeostasis plaquetaria.
[0048] CD47 también se ha implicado en el cáncer. Por ejemplo, CD47 se sobreexpresa en diversas neoplasias hematológicas y sólidas. CD47 es un marcador documentado de células madre cancerosas/células iniciadoras de tumores. Se cree que la sobreexpresión de CD47 puede ayudar a las células tumorales a escapar de la vigilancia inmunitaria y la destrucción por parte de las células inmunitarias innatas. Los niveles altos de CD47 también se asocian con un mal resultado clínico en cánceres tales como, por ejemplo, leucemias, linfomas, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de próstata y/o glioma. Por lo tanto, dirigirse a CD47 sería útil para tratar, retrasar la progresión o mejorar de otro modo un síntoma de cáncer.
[0049] Como CD47 se expresa de forma ubicua, es una diana difícil para un anticuerpo monoclonal (mAb). Sin embargo, los anticuerpos que son específicos para CD47 descritos en la presente pueden ser útiles como anticuerpos monoespecíficos y se pueden utilizar para intervención terapéutica o como un reactivo de investigación o diagnóstico. Los anticuerpos de la invención que se unen a CD47, como se define en las reivindicaciones, incluyen los anticuerpos de ejemplo descritos en la presente, por ejemplo, el anticuerpo 5A3M3, el anticuerpo KE8, el anticuerpo KE8-P6H5 (también denominado en la presente KE8H5), el anticuerpo KE8-P3B2 (también denominado en la presente KE8B2), el anticuerpo KE8-P2A2 (también denominado en la presente KE8A25), el anticuerpo KE8F2, el anticuerpo KE8G2, el anticuerpo KE84G9, el anticuerpo KE81G9, el anticuerpo KE81A3, el anticuerpo KE8E8, el anticuerpo KE8G6, el anticuerpo KE8H3, el anticuerpo KE8C7, el anticuerpo KE8A4, el anticuerpo KE8A8, el anticuerpo KE8G11, el anticuerpo KE8B7, el anticuerpo KE8F1, el anticuerpo KE8C4, el anticuerpo KE8A3, el anticuerpo KA3, el anticuerpo KA3-P5G2 (también denominado en la presente KA3G2), el anticuerpo KA3-P1A3 (también denominado en la presente KA3A3), el anticuerpo KA3H8, el anticuerpo KA3A2, el anticuerpo KA3D3 y fragmentos de los mismos. En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos que no se reivindica, los anticuerpos adicionales que se unen a CD47 incluyen el anticuerpo 5A3, el anticuerpo 5A3M4, el anticuerpo 5A3M5, el anticuerpo KE86G9, el anticuerpo KE8H6, el anticuerpo KA3-P5C5 (también denominado en la presente KA3C5), el anticuerpo KA3B2, el anticuerpo KA3H3, el anticuerpo KC4, el anticuerpo KC4-P1G11KC4-P4C11, el anticuerpo KC4-P6B1KC4-P4F4 y el anticuerpo KC4-P2E2 (también denominado en la presente KC4E2), el anticuerpo KC4, el anticuerpo KC4F4, el anticuerpo KC4A1, el anticuerpo KC4C11, el anticuerpo KC4E10, el anticuerpo KC4B1, el anticuerpo KC4C3, el anticuerpo KC4A4, el anticuerpo KC4G11, el anticuerpo KC4G9 y fragmentos de estos.
[0051] Los anticuerpos de la invención que se unen a CD47 y fragmentos de estos sirven para modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la actividad funcional de CD47. Las actividades funcionales de CD47 incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, la interacción con SIRPα. Se considera que los anticuerpos modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren de otra manera con la interacción CD47-SIRPα cuando el nivel de interacción CD47-SIRPα en presencia del anticuerpo disminuye en por lo menos 95 %, por ejemplo, en 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de interacción CD47-SIRPα en ausencia de unión con un anticuerpo descrito en la presente. Se considera que los anticuerpos modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren parcialmente con la interacción CD47-SIRPα cuando el nivel de interacción CD47-SIRPα en presencia del anticuerpo disminuye en menos del 95 %, por ejemplo, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % en comparación con el nivel de interacción CD47-SIRPα en ausencia de unión con un anticuerpo descrito en la presente.
[0053] Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Estos anticuerpos biespecíficos se dirigen a CD47 y un segundo antígeno, por ejemplo,un antígeno asociado a tumor (TAA). En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico incluye una porción Fc funcional. El brazo de unión a TAA del anticuerpo biespecífico dirige el brazo CD47 a la célula tumoral o a la célula madre cancerosa. El brazo CD47 bloquea, inhibe o reduce de otra manera la interacción entre CD47 y SIRPα, transmitiendo así una señal de “cómeme” al fagocito. En algunas realizaciones, el brazo de unión a TAA del anticuerpo biespecífico incluye una secuencia de anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión al antígeno de esta.
[0055] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico exhibe una afinidad “equilibrada” por cada una de las dos dianas. En otras realizaciones, el anticuerpo biespecífico exhibe una afinidad “desequilibrada” por cada una de las dos dianas. Por ejemplo, en un anticuerpo biespecífico anti-CD47/CD19, la afinidad del brazo anti-CD19 aumenta. Por ejemplo, en un anticuerpo biespecífico anti-CD47/CD19, la afinidad del brazo anti-CD47 disminuye. Por ejemplo, en un anticuerpo biespecífico anti-CD47/CD19, la afinidad del brazo anti-CD19 aumenta y la afinidad del brazo anti-CD47 disminuye. Estos anticuerpos biespecíficos de afinidad desequilibrada son útiles, por ejemplo, para mejorar la selectividad para una célula diana o grupo de células diana.
[0057] En algunas realizaciones, la afinidad del brazo anti-CD19 aumenta por lo menos 100 veces después de la maduración de la afinidad. En algunas realizaciones, la afinidad del brazo anti-CD47 disminuye por lo menos 2 veces después de la maduración inversa de afinidad. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el brazo anti-CD47 exhibe una afinidad por CD47 que es entre aproximadamente 2 veces y 100 veces menor después de la maduración inversa por afinidad.
[0059] Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen por lo menos un brazo anti-CD47 que sirve para modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o interferir de otro modo con la actividad funcional de CD47. Las actividades funcionales de CD47 incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, la interacción con SIRPα. Se considera que los anticuerpos biespecíficos modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren de otra manera con la interacción CD47-SIRPα cuando el nivel de interacción CD47-SIRPα en presencia del anticuerpo biespecífico disminuye en por lo menos 95 %, por ejemplo, en 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % en comparación con el nivel de interacción CD47-SIRPα en ausencia de unión con un anticuerpo biespecífico descrito en la presente. Se considera que los anticuerpos biespecíficos modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o interfieren parcialmente con la interacción CD47-SIRPα cuando el nivel de interacción CD47-SIRPα en presencia del anticuerpo biespecífico disminuye en menos del 95 %, por ejemplo, 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 75 %, 80 %, 85 % o 90 % en comparación con el nivel de interacción CD47-SIRPα en ausencia de unión con un anticuerpo biespecífico descrito en la presente.
[0061] Los brazos anti-CD47 de los anticuerpos biespecíficos de la invención son útiles con una cantidad de brazos que se unen a otros antígenos, por ejemplo, TAA. Los ejemplos de brazos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen los anticuerpos denominados en la presente como el anticuerpo 5A3M3, el anticuerpo KE8, el anticuerpo KE8-P6H5 (también denominado en la presente como KE8H5), el anticuerpo KE8-P3B2 (también denominado en la presente como KE8B2), el anticuerpo KE8-P2A2 (también denominado en la presente como KE8A25), el anticuerpo KE8F2, el anticuerpo KE8G2, el anticuerpo KE84G9, el anticuerpo KE81G9, el anticuerpo KE81A3, el anticuerpo KE8E8, el anticuerpo KE8G6, el anticuerpo KE8H3, el anticuerpo KE8C7, el anticuerpo KE8A4, el anticuerpo KE8A8, el anticuerpo KE8G11, el anticuerpo KE8B7, el anticuerpo KE8F1, el anticuerpo KE8C4, el anticuerpo KE8A3, el anticuerpo KA3, el anticuerpo KA3-P5G2 (también denominado en la presente como KA3G2), el anticuerpo KA3-P1A3 (también denominado en la presente como KA3A3), el anticuerpo KA3H8, el anticuerpo KA3A2, el anticuerpo KA3D3 y fragmentos de los mismos. En algunas realizaciones, el brazo de unión a TAA del anticuerpo biespecífico incluye una secuencia de anticuerpo anti-CD19 o fragmento de unión al antígeno de esta. En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos el cual no se reivindica, otros ejemplos de brazos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos incluyen: el anticuerpo 5A3, el anticuerpo 5A3M4, el anticuerpo 5A3M5, el anticuerpo KE86G9, el anticuerpo KE8H6, el anticuerpo KA3-P5C5 (también denominado en la presente KA3C5), el anticuerpo KA3B2, el anticuerpo KA3H3, el anticuerpo KC4, el anticuerpo KC4-P1G11KC4-P4C11, el anticuerpo KC4-P6B1KC4-P4F4 y el anticuerpo KC4-P2E2 (también denominado en la presente KC4E2), el anticuerpo KC4, el anticuerpo KC4F4, el anticuerpo KC4A1, el anticuerpo KC4C11, el anticuerpo KC4E10, el anticuerpo KC4B1, el anticuerpo KC4C3, el anticuerpo KC4A4, el anticuerpo KC4G11, el anticuerpo KC4G9 y fragmentos de los mismos.
[0062] Los anticuerpos de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 1 (CDRH1) de la SEQ ID NO: 225, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 2 (CDRH2) de la SEQ ID NO: 226, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 3 (CDRH3) de la SEQ ID NO: 227, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 1 (CDRL1) seleccionada de la SEQ ID NO: 228, 229 y 231-241, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 2 (CDRL2) de la SEQ ID NO: 242, y una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 3 (CDRH3) seleccionada de 246-252 y 254-260, como se enumera en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
[0063] En un caso relacionado que no se reivindica y se proporciona con fines ilustrativos, en la presente se describen anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 1 (CDRH1) de la SEQ ID NO: 225, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 2 (CDRH2) de la SEQ ID NO: 226, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 3 (CDRH3) de la SEQ ID NO: 227, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 1 (CDRL1) seleccionada de la SEQ ID NO: 230 y 262-272, una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 2 (CDRL2) seleccionada de la SEQ ID NO: 243-245 y 273-280, y una secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 3 (CDRH3) seleccionada de la SEQ ID NO: 253, 261 y 281.
[0064] En algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 114 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable seleccionada de la SEQ ID NO: 120, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 162, 164, 168, 170, 174, 176, 182 y 184..
[0065] En un caso relacionado que no se reivindica y se proporciona con fines ilustrativos, en la presente se describen anticuerpos que comprenden una secuencia de aminoácidos de cadena pesada variable de la SEQ ID NO: 114 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera variable seleccionada de la SEQ ID NO: 116, 118, 122, 160, 166, 172, 178, 180, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204 y 206.
[0066] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico incluye dos copias de un polipéptido de cadena pesada sencilla y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en donde la primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.
[0067] En algunas realizaciones, por lo menos una parte de la primera cadena ligera es del tipo Kappa y por lo menos una parte de la segunda cadena ligera es del tipo Lambda. En algunas realizaciones, la primera cadena ligera incluye por lo menos una región constante Kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena ligera además incluye una región variable Kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena ligera además incluye una región variable Lambda. En algunas realizaciones, la segunda cadena ligera incluye por lo menos una región constante Lambda. En algunas realizaciones, la segunda cadena ligera además incluye una región variable Lambda. En algunas realizaciones, la segunda cadena ligera además incluye una región variable Kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena ligera incluye una región constante Kappa y una región variable Kappa, y en donde la segunda cadena ligera incluye una región constante Lambda y una región variable Lambda.
[0068] En algunas realizaciones, las secuencias de región marco constante y variable son humanas.
[0069] La invención también proporciona anticuerpos monovalentes que se unen a CD47, como se indica en las reivindicaciones. Estos anticuerpos se denominan colectivamente en la presente anticuerpos monovalentes antiCD47 o mAb monov anti-CD47. Los anticuerpos monovalentes de la invención incluyen un brazo que reconoce específicamente CD47, y un segundo brazo denominado en la presente un brazo simulado. El brazo simulado incluye una secuencia de aminoácidos que no se une ni reacciona de forma cruzada con una proteína humana. En algunas realizaciones, el brazo simulado incluye una secuencia de aminoácidos que no se une ni reacciona de forma cruzada con una proteína humana que se encuentra en la sangre completa. Los expertos en la técnica apreciarán que las proteínas humanas que se encuentran en la sangre son un sustituto que representa todos, o sustancialmente todos, los antígenos presentes en la circulación del sistema. En algunas realizaciones, el brazo simulado incluye una secuencia de aminoácidos que no se une ni reacciona de forma cruzada con una proteína humana que se encuentra en el tejido sólido. Preferentemente, los anticuerpos monoclonales son específicos para por lo menos el CD47 humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos monovalentes que reconocen CD47 humano también tienen reactividad cruzada para por lo menos otra proteína CD47 no humana, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD47 de primate no humano, por ejemplo, CD47 de mono cynomolgus y/o CD47 de roedor.
[0071] Los anticuerpos biespecíficos de la invención se generan usando cualquier método conocido en la técnica tal como, a modo de ejemplo no limitativo, el uso de fragmentos reticulados, cuadromas y/o cualquiera de una variedad de formatos recombinantes tales como, a modo de ejemplos no limitativos, fragmentos de anticuerpos unidos, heterodímeros forzados y/o formatos recombinantes basados en dominios individuales. Los ejemplos de formatos biespecíficos incluyen, entre otros, IgG biespecífica basada en el intercambio de brazos Fab (Grameret al., 2013 MAbs. 5(6)); el formato CrossMab (Klein Cet al., 2012 MAbs 4(6)); múltiples formatos basados en enfoques de heterodimerización forzada como la tecnología SEED (Davis JHet al., 2010 Protein Eng Des Sel.23(4):195-202), dirección electrostática (Gunasekaran Ket al., J Biol Chem.2010285(25):19637-46.) o botón en ojal (Ridgway JBet al., Protein Eng. 1996 9(7):617-21.) u otros conjuntos de mutaciones que previenen la formación de homodímeros (Von Kreudenstein TSet al., 2013 MAbs. 5(5): 646-54.); formatos biespecíficos basados en fragmentos tales como scFv en tándem (tales como BiTE) (Wolf Eet al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44.); anticuerpos tetravalentes biespecíficos (Pörtner LMet al., 2012 Cancer Immunol Immunother.61(10):1869-75.); moléculas de redireccionamiento de doble afinidad (Moore PAet al., 2011Blood.117 (17):4542-51), diacuerpos (Kontermann REet al., Nat Biotechnol.199715(7):629-31).
[0073] En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos portan una especificidad diferente en cada sitio de combinación e incluyen dos copias de un polipéptido de cadena pesada sencilla y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en donde la primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.
[0075] Los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos de la invención, tal como se definen en el conjunto de reivindicaciones, se pueden utilizar para la intervención terapéutica o como un reactivo de investigación o diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos de la invención son útiles en métodos para tratar, prevenir y/o retrasar la progresión de patologías asociadas con la expresión y/o actividad aberrante de CD47 y/o CD47-SIRPα o aliviar un síntoma asociado con tales patologías, mediante la administración de un anticuerpo de la invención a un sujeto en el que se desea tal tratamiento o prevención. El sujeto que va a tratarse es, por ejemplo, un ser humano. El anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico se administra en una cantidad suficiente para tratar, prevenir, retrasar la progresión o aliviar un síntoma asociado con la patología.
[0076] En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos descritos en la presente se utilizan junto con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación prevista, tal como, por ejemplo, cáncer, inflamación y/o enfermedades autoinmunes. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos se pueden usar junto con rituximab.
[0078] En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos y el agente adicional se formulan en una única composición terapéutica, y el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico y el agente adicional se administran simultáneamente. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos ac y el agente adicional están separados entre sí, por ejemplo,cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico y el agente adicional se administran simultáneamente, o los anticuerpos monoclonales, monovalentes y/o biespecíficos y el agente adicional se administran en diferentes momentos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico se administra antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico se administra después de la administración del agente adicional, o el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico y el agente adicional se administran de manera alterna. Como se describe en la presente, el anticuerpo monoclonal, monovalente y/o biespecífico y el agente adicional se administran en dosis únicas o en dosis múltiples.
[0080] Las patologías tratadas y/o prevenidas usando los anticuerpos de la invención incluyen, por ejemplo, cáncer o cualquier otra enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad aberrante de CD47.
[0082] Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden incluir un anticuerpo de la invención y un portador. Estas composiciones farmacéuticas se pueden incluir en kits, tales como, por ejemplo, kits de diagnóstico.
[0083] Breve descripción de los dibujos
[0085] La Figura 1 es una ilustración del alineamiento de secuencias entre la secuencia de cadena ligera variable (VL) del anticuerpo anti-CD475A3 (SEQ ID NO: 116) a su secuencia de línea germinal más cercana (SEQ ID NO: 282), la IGKV1-33 humana según la nomenclatura IMGT.
[0086] La Figura 2 es una gráfica que representa la potencia de bloqueo de las variantes de anticuerpo 5A3-M3 y 5A3-M5 en comparación con el anticuerpo parental 5A3 en un ensayo de unión a CD47/SIRPα.
[0087] La Figura 3 es una gráfica que representa la especificidad de varios anticuerpos monoclonales CD47 (Mab) como se indica por la unión de CD47 Mab purificados a células CHO transfectadas con CD47 humano, evaluado por citometría de flujo (barras grises). Los CD47 MAb no se unieron a las células CHO no transfectadas (barras negras).
[0088] La Figura 4 es una gráfica que representa la unión a CD47 natural y la especificidad de los CD47 MAb como se muestra mediante la unión de los CD47 Mab purificados a las células HEK293-P como se evalúa mediante citometría de flujo (barras grises). La unión a células HEK293-P transfectadas de forma estable con siARN específico de hCD47 disminuye significativamente (barras negras).
[0089] La Figura 5 es una gráfica que representa la unión a CD47 humano natural y la reactividad cruzada con CD47 de cynomolgus. Se evaluó la unión de CD47 Mab purificados a PBMC CD4 humanos (barras de color gris claro) y de cynomolgus (barras de color gris oscuro) células T.
[0090] La Figura 6 es una gráfica que representa la potencia de los CD47 Mab para bloquear la interacción CD47-SIRPα, como se probó en el ensayo de inhibición de CD47-SIRPα (inhibición competitiva de la unión de SIRPα humana soluble recombinante a células CHO que expresan hCD47, como se describe en el Ejemplo 4). Se muestran los valores de IC50 obtenidos en los experimentos de dosis-respuesta. Los CD47 Mab se agrupan por familia y se clasifican de mayor a menor potencia. La actividad neutralizante de los anticuerpos de la presente invención se compara con el anticuerpo B6H12 CD47 disponible en el mercado.
[0091] La Figura 7 es una ilustración que representa la actividad de hemaglutinación de los anticuerpos CD47. La hemaglutinación se evidencia como un depósito agrupado de glóbulos rojos, en forma de una media luna en la parte inferior alrededor del borde inferior del pocillo, mientras que los no aglutinados no forman agregados y se distribuyen uniformemente sobre el área de la superficie del pocillo. La Figura 7 demuestra que los CD47 Mab de alta afinidad de las familias 5A3, Ke8 y Ka3 inducen hemaglutinación; a diferencia de las otras tres familias, los anticuerpos de la familia Kc4 analizados en este experimento no inducen hemaglutinación. La Figura 8 es una gráfica que representa la curva de dosis-respuesta para un ensayo de unión a FACS realizado con células Raji y el clon anti-CD19 original 1B7, el clon D11 identificado después de la primera ronda de maduración de afinidad y el clon final L7B7_c2, emitido desde la segunda ronda de maduración de afinidad.
[0092] Las Figuras 9A-9C son una serie de gráficas de la capacidad de un CD47xCD19 BsAb para acoplar conjuntamente las dos dianas en la superficie de las células. Las gráficas en las Figuras 9A-9C presentan perfiles de FACS generados con anticuerpos monovalentes y biespecíficos que se unen a células B-NHL CD19-negativas (DS-1) y células de linfoma de Burkitt CD19-positivas (Raji). Todos los anticuerpos fueron de formato IgG1 humano y se analizaron a cuatro concentraciones como se indica.
[0093] La Figura 10 es una serie de gráficos que representan la actividad de bloqueo de SIRPα de anticuerpos monovalentes y biespecíficos. La Figura 10 demuestra el acoplamiento conjunto de CD19 y CD47 en la superficie de la célula diana, al mostrar que la neutralización de la interacción CD47-SIRPα por CD47xCD19 BsAb es dependiente de CD19. Los experimentos se realizaron por cuadruplicado. Se muestran la media y SEM. Las curvas de inhibición de dosis-respuesta se ajustaron con el software GraphPad.
[0094] Las Figuras 11A-11C muestran curvas de dosis-respuesta de ADCC generadas con cuerpos CD47xCD19 κλ (negro) o los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes (gris). Se muestra ADCC con el CD19 Mab C2 para comparación (gris discontinuo). El ensayo de ADCC se realizó con PBMC humanas completas como células efectoras y Raji teñidas con Calceína AM (Figura 11A, 11C) o Ramos (Figura 11B) como células diana (relación efector a diana: 50). La citotoxicidad se calculó a partir del grado de liberación de calceína de las células diana. Se muestra el porcentaje de destrucción celular específica /- SD. Los experimentos se realizaron por duplicado. Las Figuras 11A-11B demuestran la capacidad de los CD47xCD19 BsAb para destruir células positivas a CD19 dependiente de CD19, ya que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes fueron mucho menos eficientes o no eficientes en absoluto. La Figura 11C demuestra que la eficacia de la destrucción de células Raji con anticuerpos CD47xCD19 fue comparable a rituximab y mucho mayor que con el CD19 Mab C2.
[0095] La Figura 12 es una gráfica que representa la actividad fagocítica de tres de los cuerpos CD47xCD19 κλ de la presente invención (líneas negras) en comparación con los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes (líneas grises) en el experimento ADCP de respuesta a la dosis. Se muestra la fagocitosis con el B6H12 Mab CD47 (en el fondo de IgG1 humana, línea negra punteada) y con el CD19 Mab C2 (línea gris punteada) para comparación. El experimento ADCP se realizó con macrófagos humanos diferenciados de monocitos de sangre periférica y Raji como células diana (relación efector: diana 1:5). La fagocitosis se evaluó mediante FACS. Se muestra el porcentaje de macrófagos que han fagocitado por lo menos una célula diana. Los cuerpos CD47xCD19 κλ fagocitan las células CD19 positivas en un análisis de manera dependiente de CD19, ya que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes fueron mucho menos eficientes o no eficientes en absoluto.
[0096] La Figura 13 es una gráfica que representa la actividad de varios anticuerpos en un xenoinjerto de linfoma de células B Raji en ratones NOD/SCID. El tratamiento con anticuerpos comenzó después de que el injerto tumoral haya alcanzado aproximadamente 0,1 cm<3>y terminó el D25. Los grupos de tratamiento (n=5) fueron como se indica en el recuadro. Se muestra la evolución del volumen tumoral promedio por grupo de tratamiento /- SD. La Figura 13 muestra que la eficacia de BsAB es similar a B6H12 o rituximab y que la erradicación del tumor fue dependiente de CD19, ya que el monovalente correspondiente fue menos eficaz. La Figura 14 es una gráfica que representa que los anticuerpos CD47 de afinidad alta y moderada se adsorben de manera eficiente en los eritrocitos. En el caso de los BsAb, este fenómeno se limita a moléculas que tienen brazos CD47 de alta afinidad, como 5A3.
[0098] Descripción detallada
[0100] La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0102] La invención proporciona anticuerpos monoclonales que se unen a CD47 como se indica en las reivindicaciones. Estos anticuerpos se denominan colectivamente en este documento como anticuerpos monoclonales anti-CD47 o mAb anti-CD47. Los anticuerpos monoclonales son específicos para por lo menos CD47 humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales que reconocen CD47 humano también tienen reactividad cruzada para por lo menos otra proteína CD47 no humana, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD47 de primate no humano, por ejemplo, CD47 de mono cynomolgus y/o CD47 de roedor. En algunas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 y la proteína reguladora de señal alfa (SIRPα). En algunas realizaciones, estos anticuerpos monoclonales anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPα humano.
[0104] La invención también proporciona anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos que incluyen por lo menos un primer brazo que es específico para CD47, como se indica en el conjunto de reivindicaciones. Preferentemente, los anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos son específicos para por lo menos CD47 humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos monovalentes y/o anticuerpos biespecíficos que reconocen CD47 humano también tienen reactividad cruzada para por lo menos otra proteína CD47 no humana, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, CD47 de primate no humano, por ejemplo, CD47 de mono cynomolgus y/o CD47 de roedor. En algunas realizaciones, estos anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 y la proteína reguladora de señal alfa (SIRPα). En algunas realizaciones, estos anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos anti-CD47 inhiben la interacción entre CD47 humano y SIRPα humano.
[0106] Los anticuerpos biespecíficos de la invención permiten la unión simultánea de los dos brazos de anticuerpos a dos antígenos en la superficie de la célula (denominado acoplamiento conjunto), lo cual da como resultado un aumento aditivo o sinérgico de la afinidad debido al mecanismo de avidez. Como consecuencia, el acoplamiento conjunto confiere una alta selectividad hacia las células que expresan ambos antígenos en comparación con las células que expresan solo un único antígeno. Además, las afinidades de los dos brazos de un anticuerpo biespecífico con sus respectivas dianas se pueden establecer de manera que la unión a las células diana esté impulsada principalmente por uno de los brazos del anticuerpo. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico incluye un primer brazo que se une a CD47 y un segundo brazo que se une a un antígeno asociado a tumor (TAA), donde el segundo brazo se une al TAA con alta afinidad, y el primer brazo se une a CD47 con baja afinidad, es decir una afinidad que es suficiente para inhibir CD47/SIRPα tras el acoplamiento conjunto del TAA. Este diseño permite que los anticuerpos biespecíficos de la invención inhiban preferentemente CD47 en células cancerosas frente a células normales. En los ejemplos proporcionados en la presente, un anticuerpo biespecífico con un primer brazo que se une a CD47 con baja afinidad y un segundo brazo que se une a CD19 con alta afinidad (denominado biespecífico CD47xCD19) permite la inhibición preferencial de CD47 en cáncer frente a células normales. Además de los dos brazos de unión al antígeno, el anticuerpo biespecífico CD47 x TAA requiere una porción Fc funcional para reclutar macrófagos y/u otras células efectoras inmunitarias. Un formato de IgG biespecífico completamente humano (tal como el formato de cuerpo κλ descrito en la presente) es muy adecuado para la generación de anticuerpos biespecíficos CD47 x TAA de doble direccionamiento. Como se muestra en los ejemplos proporcionados en la presente, la capacidad de los anticuerpos biespecíficos de doble direccionamiento para acoplar conjuntamente CD47 y CD19 da como resultado un aumento significativo en la afinidad de unión a células positivas para CD19 y en la neutralización dependiente de CD19 de la interacción CD47-SIRPα. Esto, a su vez, se traduce en la destrucción eficiente y selectiva de células cancerosas mediada por el anticuerpo biespecífico CD47xCD19, como se demuestra en los experimentos ADCC y ADCP proporcionados en la presente.
[0108] Los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-CD47, anticuerpos monoespecíficos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos de la invención en los cuales por lo menos un sitio de unión es específico para CD47 incluyen, por ejemplo, el anticuerpo 5A3M3, el anticuerpo KE8, el anticuerpo KE8-P6H5 (también denominado en el presente documento KE8H5), el anticuerpo KE8-P3B2 (también denominado en el presente documento KE8B2), el anticuerpo KE8-P2A2 (también denominado en el presente documento KE8A25), el anticuerpo KE8F2, el anticuerpo KE8G2, el anticuerpo KE84G9, el anticuerpo KE81G9, el anticuerpo KE81A3, el anticuerpo KE8E8, el anticuerpo KE8G6, el anticuerpo KE8H3, el anticuerpo KE8C7, el anticuerpo KE8A4, el anticuerpo KE8A8, el anticuerpo KE8G11, el anticuerpo KE8B7, el anticuerpo KE8F1, el anticuerpo KE8C4, el anticuerpo KE8A3, el anticuerpo KA3, el anticuerpo KA3-P5G2 (también denominado en este documento como KA3G2), el anticuerpo KA3-P1A3 (también denominado en la presente como KA3A3), el anticuerpo KA3H8, el anticuerpo KA3A2, el anticuerpo KA3D3, así como los fragmentos activos inmunitariamente activos y/o de unión a antígeno del mismo.
[0109] Los anticuerpos monoclonales anti-CD47, monoespecíficos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen una combinación de regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y cadena ligera como se indica en las reivindicaciones. Las secuencias de CDR se muestran en las Tablas 1, 2 y 3, donde las CDR que se muestran en las Tablas 1, 2 y 3 se definen de acuerdo con la nomenclatura IMGT.
[0110] En algunas realizaciones, los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-CD47, anticuerpos monoespecíficos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen la combinación de secuencias de CDR de cadena pesada de la Tabla 1 y dos conjuntos de CDR de cadena ligera seleccionados de las secuencias de CDRL1, CDRL2 y CDRL3 que se muestran en las Tablas 2 y 3, como se indica en el conjunto de reivindicaciones.
[0111] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, los ejemplos de anticuerpos monoclonales anti-CD47, anticuerpos monoespecíficos anti-CD47, anticuerpos monovalentes anti-CD47 y/o anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen la combinación de secuencias de CDR de cadena pesada de la Tabla 1 y un primer conjunto de CDR de cadena ligera seleccionadas de las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 mostradas en la Tabla 2 y un segundo conjunto de CDR de cadena ligera seleccionadas de las secuencias CDRL1, CDRL2 y CDRL3 mostradas en la Tabla 3.
[0112] Tabla 1: CDR de cadena esada anti-CD47
[0115]
[0117] Tabla 2: CDR de cadena li era Ka a anti-CD47
[0120]
[0122] Tabla 3: CDR de cadena li era Lambda anti-CD47
[0125]
[0126]
[0128] Cada uno de los ejemplos de anticuerpos anti-CD47, anti-CD19, monovalentes y biespecíficos descritos en la presente incluye una cadena pesada común (HC), una cadena kappa o una cadena lambda para anticuerpos anti-CD47 y anti-CD19, una cadena ligera kappa y una cadena ligera lambda (LC) para anticuerpos monovalentes y biespecíficos, como se muestra en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos correspondientes enumeradas a continuación. Cada uno de los ejemplos de anticuerpos anti-CD47, anti-CD19, monovalentes y biespecíficos descritos a continuación incluye un dominio pesado variable común (VH), un dominio ligero variable kappa o un dominio ligero variable lambda para anticuerpos anti-CD47 y anti-CD19, un dominio ligero variable kappa y uno lambda (VL) para anticuerpos monovalentes y biespecíficos, como se muestra en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos correspondientes enumeradas a continuación.
[0129] Si bien las secuencias de anticuerpos a continuación se proporcionan en la presente como ejemplos, debe entenderse que estas secuencias pueden usarse para generar anticuerpos biespecíficos usando cualquiera de una variedad de técnicas reconocidas en la técnica. Los ejemplos de formatos biespecíficos incluyen, entre otros, IgG biespecífica basada en el intercambio de brazos Fab (Grameret al., 2013 MAbs.5(6)); el formato CrossMab (Klein Cet al., 2012 MAbs 4(6)); múltiples formatos basados en enfoques de heterodimerización forzada como la tecnología SEED (Davis JHet al., 2010 Protein Eng Des Sel.23(4):195-202), dirección electrostática (Gunasekaran Ket al., J Biol Chem.2010285(25):19637-46.) o botón en ojal (Ridgway JBet al., Protein Eng.19969(7):617-21.) u otros conjuntos de mutaciones que previenen la formación de homodímeros (Von Kreudenstein TSet al., 2013 MAbs.5(5): 646-54.); formatos biespecíficos basados en fragmentos tales como scFv en tándem (tales como BiTE) (Wolf Eet al., 2005 Drug Discov. Today 10(18):1237-44.); anticuerpos tetravalentes biespecíficos (Pörtner LMet al., 2012 Cancer Immunol Immunother. 61(10):1869-75.); moléculas de redireccionamiento de doble afinidad (Moore PAet al., 2011Blood.117 (17):4542-51), diacuerpos (Kontermann REet al., Nat Biotechnol.199715(7):629-31).
[0130] Los ejemplos de anticuerpos anti-CD47, anti-CD19, monovalentes y biespecíficos incluyen una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1.
[0131] >COMMON-HC-NT (SEQ ID NO: 1)
[0132]
[0134] Los anticuerpos anti-CD47, anti-CD19, monovalentes y biespecíficos incluyen un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113.
[0135] >COMMON-VH-NT (SEQ ID NO: 113)
[0136]
[0137] ANTICUERPOS ANTI-CD47
[0138] El anticuerpo 5A3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 4) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3.
[0139] >5A3-LC-NT (SEQ ID NO: 3)
[0141]
[0143] El anticuerpo 5A3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 116) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 115.
[0144] >5A3-VL-NT (SEQ ID NO: 115)
[0146]
[0148] El anticuerpo 5A3-M4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 6) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 5.
[0149] >5A3-M4-LC-NT (SEQ ID NO: 5)
[0150]
[0152] El anticuerpo 5A3-M4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 118) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 117.
[0153] >5A3-M4-VL-NT (SEQ ID NO: 117)
[0155]
[0157] El anticuerpo 5A3-M3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 8) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 7.
[0158] >5A3-M3-LC-NT (SEQ ID NO: 7)
[0160]
[0161] >5A3-M3-LC-AA (SEQ ID NO: 8)
[0163]
[0165] El anticuerpo 5A3-M3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 120) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 119.
[0166] >5A3-M3-VL-NT (SEQ ID NO: 119)
[0168]
[0170] El anticuerpo 5A3-M5 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 10) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 9. >5A3-M5-LC-NT (SEQ ID NO: 9)
[0172]
[0174] El anticuerpo 5A3-M5 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 122) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 121.
[0175] >5A3-M5-VL-NT (SEQ ID NO: 121)
[0176]
[0178] El anticuerpo Ke8 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 12) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 11.
[0179] >Ke8-LC-NT (SEQ ID NO: 11)
[0181]
[0183] El anticuerpo Ke8 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 124) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 123.
[0184] >Ke8-VL-NT (SEQ ID NO: 123)
[0186]
[0188] El anticuerpo Ke8H5 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 14) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 13.
[0189] >KE8H5-LC-NT (SEQ ID NO: 13)
[0191]
[0194] El anticuerpo Ke8H5 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 126) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 125.
[0196] >KE8H5-VL-NT (SEQ ID NO: 125)
[0198]
[0201] El anticuerpo Ke8B2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 16) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 15.
[0203] >KE8B2-LC-NT (SEQ ID NO: 15)
[0205]
[0206] >KE8B2-LC-AA (SEQ ID NO: 16)
[0208]
[0210] El anticuerpo Ke8B2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 128) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 127.
[0211] >KE8B2-VL-NT (SEQ ID NO: 127)
[0213]
[0215] El anticuerpo Ke8A2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 18) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 17.
[0216] >KE8A2-LC-NT (SEQ ID NO: 17)
[0218]
[0220] El anticuerpo Ke8A2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 130) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 129.
[0221] >KE8A2-VL-NT (SEQ ID NO: 129)
[0222]
[0224] El anticuerpo Ke8E8 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 20) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 19.
[0225] >KE8E8-LC-NT (SEQ ID NO: 19)
[0227]
[0229] El anticuerpo Ke8E8 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 132) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 131.
[0230] >KE8E8-VL-NT (SEQ ID NO: 131)
[0232]
[0234] El anticuerpo Ke8H3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 22) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 21.
[0235] >KE8H3-LC-NT (SEQ ID NO: 21)
[0237]
[0240] El anticuerpo Ke8H3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 134) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 133.
[0242] >KE8H3-VL-NT (SEQ ID NO: 133)
[0244]
[0247] El anticuerpo Ke8G6 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 24) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 23.
[0249] >KE8G6-LC-NT (SEQ ID NO: 23)
[0251]
[0252] >KE8G6-LC-AA (SEQ ID NO: 24)
[0254]
[0256] El anticuerpo Ke8G6 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 136) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 135.
[0257] >KE8G6-VL-NT (SEQ ID NO: 135)
[0259]
[0261] El anticuerpo Ke8A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 26) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 25.
[0262] >KE8A3-LC-NT (SEQ ID NO: 25)
[0264]
[0266] El anticuerpo Ke8A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 138) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 137.
[0267] >KE8A3-VL-NT (SEQ ID NO: 137)
[0268]
[0270] El anticuerpo Ke81A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 28) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 27.
[0271] >KE81A3-LC-NT (SEQ ID NO: 27)
[0273]
[0275] El anticuerpo Ke81A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 140) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 139.
[0276] >KE81A3-VL-NT (SEQ ID NO: 139)
[0278]
[0280] El anticuerpo Ke8A8 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 30) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 29.
[0281] >KE8A8-LC-NT (SEQ ID NO: 29)
[0283]
[0285] El anticuerpo Ke8A8 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 142) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 141.
[0286] >KE8A8-VL-NT (SEQ ID NO: 141)
[0288]
[0290] El anticuerpo Ke8C7 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 32) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 31.
[0291] >KE8C7-LC-NT (SEQ ID NO: 31)
[0292]
[0294] El anticuerpo Ke8C7 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 144) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 143.
[0295] >KE8C7-VL-NT (SEQ ID NO: 143)
[0297]
[0299] El anticuerpo Ke8G2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 34) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 33.
[0300] >KE8G2-LC-NT (SEQ ID NO: 33)
[0302]
[0305] >KE8G2-LC-AA (SEQ ID NO: 34)
[0306]
[0308] El anticuerpo Ke8G2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 146) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 145.
[0309] >KE8G2-VL-NT (SEQ ID NO: 145)
[0311]
[0313] El anticuerpo Ke81G9 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 36) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 35.
[0314] >KE81G9-LC-NT (SEQ ID NO: 35)
[0316]
[0318] El anticuerpo Ke81G9 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 148) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 147.
[0319] >KE81G9-VL-NT (SEQ ID NO: 147)
[0320]
[0322] El anticuerpo Ke8F2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 38) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 37.
[0323] >KE8F2-LC-NT (SEQ ID NO: 37)
[0325]
[0327] El anticuerpo Ke8F2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 150) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 149.
[0328] >KE8F2-VL-NT (SEQ ID NO: 149)
[0330]
[0332] El anticuerpo Ke8B7 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 40) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 39.
[0333] >KE8B7-LC-NT (SEQ ID NO: 39)
[0334]
[0336] El anticuerpo Ke8B7 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 152) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 151.
[0337] >KE8B7-VL-NT (SEQ ID NO: 151)
[0339]
[0341] El anticuerpo Ke8C4 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 42) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 41.
[0342] >KE8C4-LC-NT (SEQ ID NO: 41)
[0344]
[0347] >KE8C4-LC-AA (SEQ ID NO: 42)
[0348]
[0350] El anticuerpo Ke8C4 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 154) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 153.
[0351] >KE8C4-VL-NT (SEQ ID NO: 153)
[0353]
[0355] El anticuerpo Ke8F1 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 44) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 43.
[0356] >KE8F1-LC-NT (SEQ ID NO: 43)
[0358]
[0360] El anticuerpo Ke8F1 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 156) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 155.
[0361] >KE8F1-VL-NT (SEQ ID NO: 155)
[0362]
[0364] El anticuerpo Ke8G11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 46) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 45.
[0365] >KE8G11-LC-NT (SEQ ID NO: 45)
[0367]
[0369] El anticuerpo Ke8G11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 158) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 157.
[0370] >KE8G11-VL-NT (SEQ ID NO: 157)
[0372]
[0373] El anticuerpo Ke8H6 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 48) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 47. >KE8H6-LC-NT (SEQ ID NO: 47)
[0375]
[0377] El anticuerpo Ke8H6 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 160) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 159.
[0378] >KE8H6-VL-NT (SEQ ID NO: 159)
[0380]
[0382] El anticuerpo Ke84G9 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 50) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 49.
[0383] >KE84G9-LC-NT (SEQ ID NO: 49)
[0384]
[0386] El anticuerpo Ke84G9 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 162) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 161.
[0387] >KE84G9-VL-NT (SEQ ID NO: 161)
[0389]
[0391] El anticuerpo Ke8A4 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 52) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 51.
[0392] >KE8A4-LC-NT (SEQ ID NO: 51)
[0394]
[0397] >KE8A4-LC-AA (SEQ ID NO: 52)
[0398]
[0400] El anticuerpo Ke8A4 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 164) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 163.
[0401] >KE8A4-VL-NT (SEQ ID NO: 163)
[0403]
[0405] El anticuerpo Ke86G9 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 54) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 53.
[0406] >KE86G9-LC-NT (SEQ ID NO: 53)
[0408]
[0410] El anticuerpo Ke86G9 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 166) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 165.
[0411] >KE86G9-VL-NT (SEQ ID NO: 165)
[0412]
[0414] El anticuerpo Ka3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 56) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 55.
[0415] >KA3-LC-NT (SEQ ID NO: 55)
[0417]
[0419] El anticuerpo Ka3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 168) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 167.
[0420] >KA3-VL-NT (SEQ ID NO: 167)
[0422]
[0424] El anticuerpo Ka3A2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 58) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 57.
[0425] >KA3A2-LC-NT (SEQ ID NO: 57)
[0427]
[0429] El anticuerpo Ka3A2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 170) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 169.
[0430] >KA3A2-VL-NT (SEQ ID NO: 169)
[0432]
[0434] El anticuerpo Ka3H3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 60) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 59. >KA3H3-LC-NT (SEQ ID NO: 59)
[0435]
[0438] El anticuerpo Ka3H3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 172) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 171.
[0440] >KA3H3-VL-NT (SEQ ID NO: 171)
[0442]
[0445] El anticuerpo Ka3A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 62) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 61.
[0447] >KA3A3-LC-NT (SEQ ID NO: 61)
[0448]
[0450] El anticuerpo Ka3A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 174) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 173.
[0451] >KA3A3-VL-NT (SEQ ID NO: 173)
[0453]
[0455] El anticuerpo Ka3H8 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 64) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 63.
[0456] >KA3H8-LC-NT (SEQ ID NO: 63)
[0458]
[0459] >KA3H8-LC-AA (SEQ ID NO: 64)
[0461]
[0463] El anticuerpo Ka3H8 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 176) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 175.
[0464] >KA3H8-VL-NT (SEQ ID NO: 175)
[0466]
[0468] El anticuerpo Ka3B2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 66) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 65. >KA3B2-LC-NT (SEQ ID NO: 65)
[0470]
[0472] El anticuerpo Ka3B2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 178) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 177.
[0473] >KA3B2-VL-NT (SEQ ID NO: 177)
[0474]
[0476] El anticuerpo Ka3C5 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 68) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 67. >KA3C5-LC-NT (SEQ ID NO: 67)
[0478]
[0480] El anticuerpo Ka3C5 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 180) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 179.
[0481] >KA3C5-VL-NT (SEQ ID NO: 179)
[0483]
[0485] El anticuerpo Ka3G2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 70) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 69. >KA3G2-LC-NT (SEQ ID NO: 69)
[0487]
[0489] El anticuerpo Ka3G2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 182) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 181.
[0490] >KA3G2-VL-NT (SEQ ID NO: 181)
[0492]
[0494] El anticuerpo Ka3D3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 72) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 71. >KA3D3-LC-NT (SEQ ID NO: 71)
[0495]
[0497] El anticuerpo Ka3D3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 184) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 183.
[0498] >KA3D3-VL-NT (SEQ ID NO: 183)
[0500]
[0502] El anticuerpo Kc4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 74) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 73. >KC4-LC-NT (SEQ ID NO: 73)
[0503]
[0505] El anticuerpo Kc4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 186) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 185.
[0506] >KC4-VL-NT (SEQ ID NO: 185)
[0508]
[0510] El anticuerpo Kc4G11 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 76) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 75. >KC4G11-LC-NT (SEQ ID NO: 75)
[0512]
[0513] >KC4G11-LC-AA (SEQ ID NO: 76)
[0515]
[0517] El anticuerpo Kc4G11 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 188) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 187.
[0518] >KC4G11-VL-NT (SEQ ID NO: 187)
[0520]
[0522] El anticuerpo Kc4C11 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 78) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 77. >KC4C11-LC-NT (SEQ ID NO: 77)
[0524]
[0526] El anticuerpo Kc4C11 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 190) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 189.
[0527] >KC4C11-VL-NT (SEQ ID NO: 189)
[0529]
[0531] El anticuerpo Kc4A1 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 80) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 79. >KC4A1-LC-NT (SEQ ID NO: 79)
[0533]
[0535] El anticuerpo Kc4A1 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 192) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 191.
[0536] >KC4A1-VL-NT (SEQ ID NO: 191)
[0538]
[0539] El anticuerpo Kc4A4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 82) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 81. >KC4A4-LC-NT (SEQ ID NO: 81)
[0541]
[0543] El anticuerpo Kc4A4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 194) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 193.
[0544] >KC4A4-VL-NT (SEQ ID NO: 193)
[0546]
[0548] El anticuerpo Kc4E10 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 84) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 83. >KC4E10-LC-NT (SEQ ID NO: 83)
[0550]
[0551]
[0553] El anticuerpo Kc4E10 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 196) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 195.
[0554] >KC4E10-VL-NT (SEQ ID NO: 195)
[0556]
[0558] El anticuerpo Kc4G9 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 86) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 85. >KC4G9-LC-NT (SEQ ID NO: 85)
[0560]
[0562] >KC4G9-LC-AA (SEQ ID NO: 86)
[0563]
[0565] El anticuerpo Kc4G9 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 198) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 197.
[0566] >KC4G9-VL-NT (SEQ ID NO: 197)
[0568]
[0570] El anticuerpo Kc4C3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 88) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 87. >KC4C3-LC-NT (SEQ ID NO: 87)
[0572]
[0574] El anticuerpo Kc4C3 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 200) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 199.
[0575] >KC4C3-VL-NT (SEQ ID NO: 199)
[0576]
[0578] El anticuerpo Kc4F4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 90) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 89. >KC4F4-LC-NT (SEQ ID NO: 89)
[0580]
[0582] El anticuerpo Kc4F4 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 202) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 201.
[0583] >KC4F4-VL-NT (SEQ ID NO: 201)
[0585]
[0587] El anticuerpo Kc4B1 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 92) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 91. >KC4B1-LC-NT (SEQ ID NO: 91)
[0589]
[0591] El anticuerpo Kc4B1 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 204) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 203.
[0592] >KC4B1-VL-NT (SEQ ID NO: 203)
[0594]
[0596] El anticuerpo Kc4E2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 94) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 93. >KC4E2-LC-NT (SEQ ID NO: 93)
[0597]
[0599] El anticuerpo Kc4E2 (proporcionado con fines ilustrativos) incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 206) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 205.
[0600] >KC4E2-VL-NT (SEQ ID NO: 205)
[0602]
[0603] ANTICUERPOSANTI-CD19(proporcionados con fines ilustrativos)
[0604] El anticuerpo C2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95.
[0605] >C2-LC-NT (SEQ ID NO: 95)
[0606]
[0608] El anticuerpo C2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0609] >C2-VL-NT (SEQ ID NO: 207)
[0611]
[0613] El anticuerpo A6 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 98) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 97.
[0614] >A6-LC-NT (SEQ ID NO: 97)
[0615]
[0618] El anticuerpo A6 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 210) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 209.
[0620] >A6-VL-NT (SEQ ID NO: 209)
[0622]
[0625] El anticuerpo C6 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 100) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 99.
[0627] >C6-LC-NT (SEQ ID NO: 99)
[0628]
[0631] El anticuerpo C6 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 212) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 211.
[0633] >C6-VL-NT (SEQ ID NO: 211)
[0635]
[0638] El anticuerpo C9 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 102) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 101.
[0640] >C9-LC-NT (SEQ ID NO: 101)
[0641]
[0643] El anticuerpo C9 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 214) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 213.
[0644] >C9-VL-NT (SEQ ID NO: 213)
[0646]
[0648] El anticuerpo B11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 104) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 103.
[0649] >B11-LC-NT (SEQ ID NO: 103)
[0651]
[0652] >B11-LC-AA (SEQ ID NO: 104)
[0654]
[0656] El anticuerpo B11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 216) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 215.
[0657] >B11-VL-NT (SEQ ID NO: 215)
[0659]
[0661] El anticuerpo D11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105.
[0662] >D11-LC-NT (SEQ ID NO: 105)
[0664]
[0666] El anticuerpo D11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0667] >D11-VL-NT (SEQ ID NO: 217)
[0668]
[0670] El anticuerpo B7 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1 e incluye una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 108) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 107.
[0671] >B7-LC-NT (SEQ ID NO: 107)
[0673]
[0675] El anticuerpo B7 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113 e incluye un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 220) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 219.
[0676] >B7-VL-NT (SEQ ID NO: 219)
[0678]
[0681] >B7-VL-AA (SEQ ID NO: 220)
[0682]
[0684] La cadena ligera simulada 2 (SEQ ID NO: 112) es codificada por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 111.
[0685] >DUMMY-LC2-NT (SEQ ID NO: 111)
[0686]
[0688] ANTICUERPOS MONOVALENTES
[0689] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo monovalente 5A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 4) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente 5A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 116) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 115 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0690] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente 5A3-M3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 8) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente 5A3-M3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 120) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 119 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0691] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo monovalente 5A3-M5 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 10) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente 5A3-M5 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 122) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 121 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0693] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 12) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 124) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 123 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0695] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8A2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 18) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8A2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 130) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 129 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0697] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8B2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 16) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8B2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 128) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 127 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0699] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8G11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 46) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8G11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 158) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 157 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0701] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8C4 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 42) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8C4 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 154) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 153 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0703] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 26) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 25 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ke8A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 138) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 137 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0704] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 56) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 168) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 167 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0705] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3A3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 62) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3A3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 174) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 173 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0706] En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3G2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 70) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3G2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 182) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 181 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0707] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo monovalente Ka3H3 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 60) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera simulada lambda 1 (SEQ ID NO: 110) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 109. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente Ka3H3 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 172) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 171 y un dominio ligero variable simulado lambda 1 (SEQ ID NO: 222) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 221.
[0708] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo monovalente C2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera simulada kappa 2 (SEQ ID NO: 112) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 111 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo monovalente C2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable simulado kappa 2 (SEQ ID NO: 224) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 223 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0709] ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS
[0710] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico 5A3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 4) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 116) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 115 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0711] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 8) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 120) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 119 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0713] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M3xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 8) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 7 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M3xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 120) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 119 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0715] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico 5A3-M5xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 10) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M5xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 122) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 121 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0717] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico 5A3-M5xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 10) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 9 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico 5A3-M5xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 122) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 121 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0719] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 12) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 124) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 123 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0721] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 12) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 11 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 124) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 123 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0723] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A2xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 18) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 17 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A2xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 130) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 129 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0725] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8B2xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 16) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8B2xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 128) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 127 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0727] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8G11xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 46) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 45 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8GxC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 158) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 157 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0729] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8C4xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 42) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8C4xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 154) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 153 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0731] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8C4xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 42) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 41 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8C4xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 154) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 153 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0733] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 26) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 25 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 138) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 137 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0735] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A3xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 26) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 25 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ke8A3xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 138) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 137 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0737] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 56) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 168) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 167 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0739] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 56) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 168) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 167 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0741] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3A3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 62) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 61 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3A3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 174) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 173 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0743] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico Ka3G2xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 70) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3G2xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 182) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 181 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0745] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico Ka3G2xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 70) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 69 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3G2xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 182) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 181 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0747] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico Ka3H3xD11 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 60) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 106) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 105. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3H3xD11 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 172) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 171 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 218) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 217.
[0749] En un caso relacionado proporcionado con fines ilustrativos, el anticuerpo biespecífico Ka3H3xC2 incluye una cadena pesada común (SEQ ID NO: 2) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 1, una cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 60) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera lambda (SEQ ID NO: 96) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 95. En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico Ka3H3xC2 incluye un dominio pesado variable común (SEQ ID NO: 114) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 113, un dominio ligero variable kappa (SEQ ID NO: 172) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 171 y un dominio ligero variable lambda (SEQ ID NO: 208) codificado por la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEQ ID NO: 207.
[0750] Definiciones:
[0752] A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. En general, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química e hibridación de proteínas y oligo o polinucleótidos descritas en la presente son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y exponen a lo largo de la presente memoria descriptiva. Ver,por ejemplo,Sambrooket al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son las conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y administración, y tratamiento de pacientes.
[0754] Tal como se utilizan de acuerdo con la presente descripción, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados:
[0756] Como se usa en la presente, el término “anticuerpo” se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunitariamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno. Por “se une específicamente” o “inmunorreacciona con” o “se une inmunoespecíficamente” se entiende que el anticuerpo reacciona con uno o más determinantes antigénicos del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o se une a una afinidad mucho menor (K<d>> 10<-6>). Los anticuerpos incluyen, de modo no limitativo, policlonales, monoclonales, quiméricos, dAb (anticuerpo de dominio), de cadena sencilla, fragmentos F<ab>, F<ab'>y F<(ab')2>, scFv y una biblioteca de expresión de F<ab>.
[0758] Se sabe que la unidad estructural del anticuerpo básico comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena “ligera” (alrededor de 25 kDa) y una cadena “pesada” (alrededor de 50-70 kDa). La porción terminal amino de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción terminal carboxi de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se refieren a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases también tienen subclases, como IgG<1>, IgG<2>y otras. Además, en humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.
[0760] El término “anticuerpo monoclonal” (MAb) o “composición de anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie molecular de molécula de anticuerpo que consiste en un producto génico de cadena ligera único y un producto génico de cadena pesada único. En particular, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAb contienen un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno caracterizado por una afinidad de unión única para este.
[0761] El término “sitio de unión al antígeno” o “porción de unión” se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables (“V”) del extremo N de las cadenas pesada (“H”) y ligera (“L”). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, denominadas “regiones hipervariables”, se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como “regiones marco” o “FR”. Por lo tanto, el término “FR” se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan “regiones determinantes de complementariedad” o “CDR”. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), Chothiaet al. Nature 342:878-883 (1989).
[0763] Tal como se usa en la presente, el término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina, un scFv o un receptor de células T. El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden generarse contra péptidos terminales del extremo N o del extremo terminal C de un polipéptido. Un anticuerpo es para unirse específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es ≤ 1 µM; por ejemplo, ≤ 100 nM, preferentemente ≤ 10 nM y más preferentemente ≤ 1 nM.
[0764] Tal como se usa en la presente, los términos “unión inmunitaria” y “propiedades de unión inmunitaria” se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunitaria se puede expresar en términos de la constante de disociación (K<d>) de la interacción, en donde una K<d>más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunitaria de los polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de estos métodos implica medir las tasas de formación y disociación del complejo sitio de unión al antígeno/antígeno, en donde esas tasas dependen de las concentraciones de los socios del complejo, la afinidad de la interacción y los parámetros geométricos que influyen igualmente en la tasa en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la “constante de velocidad de asociación” (K<on>) como la “constante de velocidad de disociación” (K<off>) se pueden determinar mediante el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. (Ver Nature 361:186-87
[0765] (1993)). La relación de K<off>/K<on>permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constante de disociación K<d>. (Ver, en general,Davieset al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Un anticuerpo de la presente invención se une específicamente a su diana, cuando la constante de unión en equilibrio (K<d>) es ≤1 µM, por ejemplo, ≤ 100 nM, preferentemente ≤ 10 nM, y más preferentemente ≤ 1 nM, tal como se mide mediante ensayos tales como ensayos de unión de radioligandos o ensayos similares conocidos por los expertos en la técnica.
[0766] El término “polinucleótido aislado”, como se usa en la presente, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de estos, que en virtud de su origen, el “polinucleótido aislado” (1) no está asociado con la totalidad o una porción de un polinucleótido en el que el “polinucleótido aislado” se encuentra en la naturaleza, (2) está unido de manera funcional a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Los polinucleótidos de acuerdo con la invención incluyen las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas en la presente.
[0767] El término “proteína aislada” al que se hace referencia en la presente significa una proteína de ADNc, ARN recombinante u origen sintético o alguna combinación de estos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación, la “proteína aislada” (1) no está asociada con proteínas que se encuentran en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) es expresada por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza.
[0768] El término “polipéptido” se usa en la presente como un término genérico para referirse a una proteína nativa, fragmentos o análogos de una secuencia polipeptídica. Por lo tanto, los fragmentos de proteínas naturales y los análogos son especies del género de polipéptidos. Los polipéptidos de acuerdo con la invención comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada y las moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera descritas en la presente, así como moléculas de anticuerpo formadas por combinaciones que comprenden las moléculas de inmunoglobulina de cadena pesada con moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera, tales como moléculas de inmunoglobulina de cadena ligera kappa, y viceversa, así como fragmentos y análogos de las mismas.
[0769] El término “de origen natural”, tal como se usa en la presente, tal como se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos los virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio o de otro modo es de origen natural. El término “unido de manera funcional”, como se usa en la presente, se refiere a las posiciones de los componentes así descritos en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control “unida de manera funcional” a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0770] El término “secuencia de control”, como se usa en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosómico y secuencia de terminación de la transcripción en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. El término “secuencias de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas de fusión. El término “polinucleótido”, como se menciona en la presente, significa un boro polimérico de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias.
[0772] Tal como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos α-, α-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4 hidroxiprolina, γcarboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil lisina, ε-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, σ-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación polipeptídica utilizada en la presente, la dirección izquierda es la dirección amino terminal y la dirección derecha es la dirección carboxi terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar.
[0773] Tal como se aplica a los polipéptidos, el término “identidad sustancial” significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de manera óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de huecos predeterminados, comparten por lo menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más preferentemente por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencia y lo más preferentemente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia.
[0775] Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos.
[0777] Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticashidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisinaarginina, alanina valina, glutámico-aspártico y asparagina-glutamina.
[0779] Como se expone en la presente, se contemplan variaciones menores en las secuencias de aminoácidos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina como abarcadas por la presente invención, siempre que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan por lo menos 75 %, más preferentemente por lo menos 80 %, 90 %, 95 % y más preferentemente 99 %. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácidos conservadores. Los reemplazos conservadores son aquellos que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en familias: (1) los aminoácidos ácidos son aspartato, glutamato; (2) los aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) los aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano, y (4) los aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, las cuales son la familia hidroxi alifática; (ii) asparagina y glutamina, las cuales son la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, las cuales son la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, los cuales son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto importante sobre la unión o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no implica un aminoácido dentro de un sitio marco. Se puede determinar fácilmente si un cambio de aminoácido da como resultado un péptido funcional mediante el ensayo de la actividad específica del derivado polipeptídico. Los ensayos se describen en detalle en la presente. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina. Los extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de los datos de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas. Preferentemente, se utilizan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteínas previstos que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Bowieet al. Science 253:164
[0780] (1991). Por lo tanto, los ejemplos anteriores demuestran que los expertos en la técnica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que se pueden utilizar para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención.
[0781] Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alteran las afinidades de unión y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos simples o múltiples (preferentemente sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (preferentemente en la parte del polipéptido fuera del dominio o dominios que forman contactos intermoleculares. Una sustitución conservadora de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia original). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
[0782] Tal como se usa en el presente documento, los términos “marcador” o “marcado” se refieren a la incorporación de un marcador detectable, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o calorimétricos). En ciertas situaciones, la etiqueta o marcador también puede ser terapéutico. En la técnica se conocen y pueden usarse diversos métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, de modo no limitativo, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>1,<131>I), marcadores fluorescentes (por ejemplo,FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopos). En algunas realizaciones, las etiquetas están unidas por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el potencial impedimento estérico. El término “agente o fármaco farmacéutico”, tal como se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición química capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente.
[0783] Otros términos químicos en la presente se utilizan de acuerdo con el uso convencional en la técnica, como se ejemplifica en The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). Tal como se usa en la presente, “sustancialmente puro” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferentemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie objeto comprende por lo menos alrededor de 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.
[0784] Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de alrededor de 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferentemente más de alrededor de 85 %, 90%, 95 % y 99 %. Más preferentemente, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante métodos de detección convencionales), en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
[0785] El término paciente incluye sujetos humanos y veterinarios.
[0786] Anticuerpos
[0787] Se pueden utilizar diversos procedimientos conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales dirigidos contra una diana dada, tal como, por ejemplo, CD47, un antígeno asociado a tumor u otra diana, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos de los mismos. (Ver,por ejemplo,Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
[0788] Los anticuerpos se purifican mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de afinidad usando proteína A o proteína G, las cuales proporcionan principalmente la fracción IgG del suero inmunitario. Posteriormente, o de forma alternativa, el antígeno específico que es el objetivo de la inmunoglobulina buscada, o un epítopo de esta, se puede inmovilizar en una columna para purificar el anticuerpo específico inmunitario mediante cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas es explicada, por ejemplo, por D.
[0789] Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol.14, No.8 (April 17, 2000), pp.25-28).
[0790] En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se generan, por ejemplo, mediante el uso de los procedimientos establecidos en los Ejemplos proporcionados en la presente. Los anticuerpos también se generan, por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c con combinaciones de transfectantes celulares que expresan altos niveles de un objetivo dado en su superficie. Los hibridomas resultantes de las fusiones de mieloma/células B se seleccionan para determinar la reactividad con la diana seleccionada.
[0791] Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza usualmente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.
[0792] El agente inmunizante incluirá usualmente el antígeno proteico, un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica si se desean células de origen humano, o se utilizan células de bazo o células de ganglios linfáticos si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos se fusionan después con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Las líneas celulares inmortalizadas generalmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origen roedor, bovino y humano. Por lo general, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá usualmente hipoxantina, aminopterina y timidina (“medio HAT”), cuyas sustancias previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
[0793] Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan de manera eficiente, soportan una expresión estable de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Centro de Distribución Celular del Instituto Salk, San Diego, California y la Colección Norteamericana de Cultivos Tipo, Manassas, Virginia. También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales. (Ver Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63)).
[0794] El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se puede analizar para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de uniónin vitro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en la técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Además, en aplicaciones terapéuticas de anticuerpos monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de unión por el antígeno diana. Después de identificar las células de hibridoma deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y cultivarse mediante métodos estándar. (Ver Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma se pueden cultivarin vivocomo ascitis en un mamífero.
[0795] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido ascítico mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.
[0796] Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir mediante métodos de ADN recombinante, tales como los descritos en la patente de EE. UU. n.º 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células hospedadoras tales como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospedadoras recombinantes. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificante para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homólogas (ver la patente de EE. UU. n.º 4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o uniendo covalentemente a la secuencia codificante de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificante para un polipéptido no inmunoglobulina. Tal polipéptido no inmunoglobulínico puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.
[0798] Los anticuerpos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Estos anticuerpos son adecuados para la administración a humanos sin engendrar una respuesta inmunitaria por parte del humano contra la inmunoglobulina administrada. Las formas humanizadas de anticuerpos son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de estas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')<2>u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos) que se componen principalmente de la secuencia de una inmunoglobulina humana y contienen una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana. La humanización se realiza, por ejemplo, siguiendo el método de Winter y colaboradores (Joneset al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de CDR de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. (Ver también la Patente de EE. UU. n.º 5,225,539). En algunos casos, los residuos marco Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también comprenden, por ejemplo, residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en las secuencias CDR o marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado incluye sustancialmente todos de por lo menos uno, y usualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también incluye óptimamente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), usualmente la de una inmunoglobulina humana (Joneset al., 1986; Riechmannet al., 1988; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
[0800] Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en las cuales toda la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las CDR, se deriva de genes humanos. Tales anticuerpos se denominan “anticuerpos humanos” o “anticuerpos completamente humanos” en la presente. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante el uso de la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (ver Kozbor,et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales(ver Cole,et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales y se pueden producir mediante el uso de hibridomas humanos (ver Cote,et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con el virus de Epstein Barrin vitro(ver Cole,et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96).
[0802] Además, los anticuerpos humanos también se pueden producir usando técnicas adicionales, que incluyen bibliotecas de presentación en fagos. (Ver Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden producir mediante la introducción de loslocusde inmunoglobulina humana en animales transgénicos no humanos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras la exposición, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluido el reordenamiento génico, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.º 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en Markset al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberget al., Nature 368856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildet al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.1365-93 (1995).
[0804] Los anticuerpos humanos pueden producirse adicionalmente usando animales no humanos transgénicos que se modifican para producir anticuerpos completamente humanos en lugar de los anticuerpos endógenos del animal en respuesta a la exposición a un antígeno. (Ver la publicación PCT WO94/02602). Los genes endógenos que codifican las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera en el hospedero no humano se han incapacitado, y loslocusactivos que codifican las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera humanas se insertan en el genoma del hospedero. Los genes humanos se incorporan, por ejemplo, utilizando cromosomas artificiales de levadura que contienen los segmentos de ADN humano necesarios. Un animal que proporciona todas las modificaciones deseadas se obtiene entonces como progenie cruzando animales transgénicos intermedios que contienen menos del complemento total de las modificaciones. Un ejemplo de tal animal no humano es un ratón denominado Xenomouse<™>como se describe en las publicaciones PCT WO 96/33735 y WO 96/34096. Este animal produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas. Los anticuerpos se pueden obtener directamente del animal después de la inmunización con un inmunógeno de interés, como, por ejemplo, una preparación de un anticuerpo policlonal, o alternativamente de células B inmortalizadas derivadas del animal, tales como hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Además, los genes que codifican las inmunoglobulinas con regiones variables humanas pueden recuperarse y expresarse para obtener los anticuerpos directamente, o pueden modificarse adicionalmente para obtener análogos de anticuerpos tales como, por ejemplo, moléculas Fv monocatenarias (scFv).
[0805] Un ejemplo de un método para producir un hospedero no humano, ejemplificado como un ratón, que carece de expresión de una cadena pesada de inmunoglobulina endógena se describe en la patente de EE. UU. n.º 5,939,598. Se puede obtener mediante un método, el cual incluye eliminar los genes del segmento J de por lo menos unlocusde cadena pesada endógeno en una célula madre embrionaria para evitar la reordenación dellocusy para evitar la formación de una transcripción de unlocusde cadena pesada de inmunoglobulina reordenado, la eliminación se efectúa mediante un vector de direccionamiento que contiene un gen que codifica un marcador seleccionable; y producir a partir de la célula madre embrionaria un ratón transgénico cuyas células somáticas y germinales contienen el gen que codifica el marcador seleccionable.
[0806] Un método para producir un anticuerpo de interés, tal como un anticuerpo humano, se describe en la patente de EE. UU. n.º 5,916,771. Este método incluye introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada en una célula hospedadora de mamífero en cultivo, introducir un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera en otra célula hospedadora de mamífero y fusionar las dos células para formar una célula híbrida. La célula híbrida expresa un anticuerpo que contiene la cadena pesada y la cadena ligera.
[0807] En una mejora adicional de este procedimiento, se describen un método para identificar un epítopo clínicamente relevante en un inmunógeno y un método correlativo para seleccionar un anticuerpo que se une específicamente al epítopo relevante con alta afinidad en la publicación PCT WO 99/53049.
[0808] El anticuerpo puede expresarse mediante un vector que contiene un segmento de ADN que codifica el anticuerpo monocatenario descrito anteriormente.
[0809] Estos pueden incluir vectores, liposomas, ADN desnudo, ADN asistido por adyuvante, biolística, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos tales como los descritos en el documento WO 93/64701, los cuales tienen un resto de direccionamiento (por ejemplo,un ligando a un receptor de superficie celular) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo,polilisina), vector viral (por ejemplo,un vector viral de ADN o ARN), proteínas de fusión tales como las descritas en el documento PCT/US 95/02140 (WO 95/22618) la cual es una proteína de fusión que contiene un resto diana (por ejemplo,un anticuerpo específico para una célula diana) y un resto de unión a ácido nucleico (por ejemplo,una protamina), plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.
[0810] Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney. Se prefieren los vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores orthopox o avipox, vectores de virus de herpes tales como un vector de virus de herpes simplex I (HSV) (ver Geller, A. I.et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F.,et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I.et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.90:7603 (1993); Geller, A. I.,et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), vectores adenovirus (ver LeGal LaSalleet al., Science, 259:988 (1993); Davidson,et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang,et al., J. Virol.69:2004 (1995) y vectores de virus adenoasociados (ver Kaplitt, M. G.et al., Nat. Genet.8:148 (1994).
[0811] Los vectores virales de la viruela introducen el gen en el citoplasma de las células. Los vectores del virus Avipox dan como resultado solo una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Se prefieren los vectores de adenovirus, los vectores de virus adenoasociados y los vectores del virus del herpes simple (HSV) para introducir el ácido nucleico en las células neurales. El vector de adenovirus da como resultado una expresión a más corto plazo (alrededor de 2 meses) que el virus adenoasociado (alrededor de 4 meses), que a su vez es más corto que los vectores de HSV. El vector particular elegido dependerá de la célula diana y del padecimiento que se esté tratando. La introducción puede ser mediante técnicas estándar, por ejemplo, infección, transfección, transducción o transformación. Los ejemplos de modos de transferencia génica incluyen,por ejemplo, ADN desnudo, precipitación de CaPO<4>, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección celular y vectores virales.
[0812] El vector puede emplearse para dirigirse esencialmente a cualquier célula diana deseada. Por ejemplo, la inyección estereotáxica se puede utilizar para dirigir los vectores (por ejemplo, adenovirus, HSV) a una ubicación deseada. Además, las partículas se pueden administrar mediante infusión intracerebroventricular (icv) utilizando un sistema de infusión de minibomba, tal como un sistema de infusión SynchroMed. Un método basado en el flujo a granel, denominado convección, también ha demostrado ser eficaz para administrar moléculas grandes a áreas extendidas del cerebro y puede ser útil para administrar el vector a la célula diana.(Ver Boboet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrisonet al., Am. J. Physiol.266:292-305 (1994)). Otros métodos que se pueden utilizar incluyen catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y vías de administración orales u otras conocidas.
[0814] Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión para por lo menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para una diana tal como CD47 o cualquier fragmento de la misma. La segunda diana de unión es cualquier otro antígeno, y ventajosamente es una proteína de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.
[0816] Los métodos para producir anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la expresión conjunta de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpos diferentes, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta generalmente se logra mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Trauneckeret al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
[0817] Los anticuerpos biespecíficos y/o monovalentes de la invención se pueden preparar utilizando cualquiera de una variedad de técnicas reconocidas en la técnica, incluidas las descritas en la solicitud conjunta en trámite WO 2012/023053, presentada el 16 de agosto de 2011. Los métodos descritos en el documento WO 2012/023053 generan anticuerpos biespecíficos que son idénticos en estructura a una inmunoglobulina humana. Este tipo de molécula se compone de dos copias de un polipéptido de cadena pesada único, una primera región variable de cadena ligera fusionada a un dominio Kappa constante y una segunda región variable de cadena ligera fusionada a un dominio Lambda constante. Cada sitio de combinación muestra una especificidad de antígeno diferente a la que contribuyen tanto la cadena pesada como la ligera. Las regiones variables de cadena ligera pueden ser de la familia Lambda o Kappa y se fusionan preferentemente a dominios constantes Lambda y Kappa, respectivamente. Esto se prefiere para evitar la generación de uniones polipeptídicas no naturales. Sin embargo, también es posible obtener anticuerpos biespecíficos de la invención fusionando un dominio variable de cadena ligera Kappa a un dominio Lambda constante para una primera especificidad y fusionando un dominio variable de cadena ligera Lambda a un dominio Kappa constante para la segunda especificidad. Los anticuerpos biespecíficos descritos en el documento WO 2012/023053 se denominan IgGκλ, anticuerpos o “cuerpos κλ”, un nuevo formato de IgG biespecífica completamente humana. Este formato de cuerpo κλ permite la purificación por afinidad de un anticuerpo biespecífico que es indistinguible de una molécula de IgG estándar con características que son indistinguibles de un anticuerpo monoclonal estándar y, por lo tanto, favorables en comparación con los formatos anteriores.
[0819] Una etapa esencial del método es la identificación de dos regiones Fv de anticuerpo (cada una compuesta por un dominio de cadena ligera variable y de cadena pesada variable) que tienen diferentes especificidades antigénicas que comparten el mismo dominio variable de cadena pesada. Se han descrito numerosos métodos para la generación de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos. (Ver,por ejemplo,Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en las que la secuencia tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, incluidas las CDR 1 y 2, se deriva de genes humanos. La región CDR3 puede ser de origen humano o diseñada por medios sintéticos. Tales anticuerpos se denominan “anticuerpos humanos” o “anticuerpos completamente humanos” en la presente. Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden preparar mediante el uso de la técnica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (ver Kozbor,et al., 1983 Immunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Cole,et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Se pueden utilizar anticuerpos monoclonales humanos y pueden producirse mediante el uso de hibridomas humanos (ver Cote,et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) o mediante la transformación de células B humanas con el virus de Epstein Barrin vitro(ver Cole,et al., 1985 En: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96).
[0821] Los anticuerpos monoclonales se generan, por ejemplo, mediante la inmunización de un animal con un antígeno diana o un fragmento inmunogénico, derivado o variante de este. Alternativamente, el animal se inmuniza con células transfectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica el antígeno diana, de modo que el antígeno diana se exprese y se asocie con la superficie de las células transfectadas. Una variedad de técnicas son bien conocidas en la técnica para producir animales no humanos xenogénicos. Por ejemplo, ver las patentes de EE. UU n.º 6,075,181 y n.º 6,150,584.
[0823] Alternativamente, los anticuerpos se obtienen mediante el cribado de una biblioteca que contiene secuencias de anticuerpo o de dominio de unión al antígeno para la unión al antígeno diana. Esta biblioteca se prepara, por ejemplo,en bacteriófago como fusiones de proteínas o péptidos a una proteína de cubierta de bacteriófago que se expresa en la superficie de partículas de fago ensambladas y las secuencias de ADN codificantes contenidas dentro de las partículas de fago (es decir “biblioteca presentada en fago”).
[0825] Los hibridomas resultantes de las fusiones de mieloma/células B se seleccionan para determinar la reactividad con el antígeno diana. Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, utilizando métodos de hibridoma, tales como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedador apropiado, se inmuniza usualmente con un agente inmunizante para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizarin vitro.
[0827] Aunque no es estrictamente imposible, la identificación fortuita de diferentes anticuerpos que tienen el mismo dominio variable de cadena pesada pero dirigidos contra diferentes antígenos es muy poco probable. De hecho, en la mayoría de los casos, la cadena pesada contribuye en gran medida a la superficie de unión al antígeno y también es la más variable en secuencia. En particular, la CDR3 en la cadena pesada es la CDR más diversa en secuencia, longitud y estructura. Por lo tanto, dos anticuerpos específicos para diferentes antígenos llevarán casi invariablemente diferentes dominios variables de cadena pesada.
[0829] Los métodos descritos en la solicitud conjunta en trámite WO 2012/023053 superan esta limitación y facilitan en gran medida el aislamiento de anticuerpos que tienen el mismo dominio variable de cadena pesada mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos en las cuales el dominio variable de cadena pesada es el mismo para todos los miembros de la biblioteca y, por lo tanto, la diversidad se limita al dominio variable de cadena ligera. Tales bibliotecas se describen, por ejemplo, en las solicitudes conjuntas en trámite WO 2010/135558 y WO 2011/084255. Sin embargo, como el dominio variable de cadena ligera se expresa junto con el dominio variable pesado, ambos dominios pueden contribuir a la unión al antígeno. Para facilitar aún más el proceso, las bibliotecas de anticuerpos que contienen el mismo dominio variable de cadena pesada y una diversidad de cadenas ligeras variables Lambda o cadenas ligeras variables Kappa se pueden utilizar en paralelo para la selecciónin vitrode anticuerpos contra diferentes antígenos. Este enfoque permite la identificación de dos anticuerpos que tienen una cadena pesada común, pero uno que porta un dominio variable de cadena ligera Lambda y el otro un dominio variable de cadena ligera Kappa que se pueden utilizar como bloques de construcción para la generación de un anticuerpo biespecífico en el formato de inmunoglobulina completa de la invención. Los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden ser de diferentes isotipos y su porción Fc puede modificarse para alterar las propiedades de unión a diferentes receptores Fc y de esta manera modificar las funciones efectoras del anticuerpo, así como sus propiedades farmacocinéticas. Se han descrito numerosos métodos para la modificación de la porción Fc y son aplicables a los anticuerpos de la invención. (ver, por ejemplo, Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009 (6):685-91; patente de EE.UU. n.º 6,528,624; PCT/US2009/0191199 presentada el 9 de enero de 2009). Los métodos de la invención también se pueden utilizar para generar anticuerpos biespecíficos y mezclas de anticuerpos en un formato F(ab')2 que carece de la porción Fc.
[0831] La cadena pesada común y dos cadenas ligeras diferentes se expresan de manera conjunta en una sola célula para permitir el ensamblaje de un anticuerpo biespecífico de la invención. Si todos los polipéptidos se expresan al mismo nivel y se ensamblan igualmente bien para formar una molécula de inmunoglobulina, entonces la proporción de monoespecíficos (mismas cadenas ligeras) y biespecíficos (dos cadenas ligeras diferentes) debe ser del 50 %. Sin embargo, es probable que diferentes cadenas ligeras se expresen a diferentes niveles y/o no se ensamblen con la misma eficiencia. Por lo tanto, se utiliza un medio para modular la expresión relativa de los diferentes polipéptidos para compensar sus características de expresión intrínsecas o diferentes propensiones a ensamblarse con la cadena pesada común. Esta modulación se puede lograr a través de la fuerza del promotor, el uso de sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) con diferentes eficiencias u otros tipos de elementos reguladores que pueden actuar a niveles transcripcionales o traduccionales, así como actuar sobre la estabilidad del ARNm. Diferentes promotores de diferente fuerza podrían incluir CMV (promotor del virus del citomegalovirus inmediatotemprano); EF1-1α (promotor de la subunidad 1α del factor de elongación humano); Ubc (promotor de ubiquitina C humana); SV40 (promotor del virus de simio 40). También se han descrito diferentes IRES de origen mamífero y viral. (Ver,por ejemplo,Hellen CU and Sarnow P. Genes Dev 200115: 1593-612). Estos IRES pueden diferir mucho en su longitud y eficiencia de reclutamiento de ribosomas. Además, es posible ajustar aún más la actividad mediante la introducción de múltiples copias de un IRES (Stephenet al. 2000 Proc Natl Acad Sci USA 97: 1536-1541). La modulación de la expresión también se puede lograr mediante múltiples transfecciones secuenciales de células para aumentar el número de copias de genes individuales que expresan una u otra cadena ligera y, por lo tanto, modificar sus expresiones relativas. Los ejemplos proporcionados en la presente demuestran que controlar la expresión relativa de las diferentes cadenas es fundamental para maximizar el ensamblaje y el rendimiento general del anticuerpo biespecífico.
[0833] La expresión conjunta de la cadena pesada y dos cadenas ligeras genera una mezcla de tres anticuerpos diferentes en el sobrenadante del cultivo celular: dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos y un anticuerpo bivalente biespecífico. Este último tiene que ser purificado de la mezcla para obtener la molécula de interés. El método descrito en la presente facilita en gran medida este procedimiento de purificación mediante el uso de medios de cromatografía de afinidad que interactúan específicamente con los dominios constantes de cadena ligera Kappa o Lambda, tales como las matrices de afinidad CaptureSelect Fab Kappa y CaptureSelect Fab Lambda (BAC BV, Holanda). Este enfoque de purificación por cromatografía de afinidad de múltiples etapas es eficiente y generalmente aplicable a los anticuerpos de la invención. Esto está en marcado contraste con los métodos de purificación específicos que deben desarrollarse y optimizarse para cada anticuerpo biespecífico derivado de cuadromas u otras líneas celulares que expresan mezclas de anticuerpos. De hecho, si las características bioquímicas de los diferentes anticuerpos en las mezclas son similares, su separación utilizando una técnica de cromatografía estándar, como la cromatografía de intercambio iónico, puede ser difícil o no ser posible en absoluto. Otros métodos de purificación adecuados incluyen los descritos en la solicitud conjunta en trámite PCT/IB2012/003028, presentada el 19 de octubre de 2012, publicada como WO2013/088259.
[0834] En otras realizaciones de producción de anticuerpos biespecíficos, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se pueden fusionar a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se transfectan de manera conjunta en un organismo hospedador adecuado. Para obtener más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Sureshet al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
[0835] De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede modificarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfaz preferida incluye por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeños de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). Se crean “cavidades” compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por otras más pequeñas (por ejemplo,alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados, tales como homodímeros.
[0836] En la literatura se han descrito técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos utilizando enlazamiento químico. Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. También se han descrito diversas técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente del cultivo de células recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de leucina. Kostelnyet al., J. Immunol.148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab’ de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se volvieron a oxidar para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de “diacuerpo” descrita por Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V<H>) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V<L>) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V<H>y V<L>de un fragmento se ven obligados a emparejarse con los dominios V<L>y V<H>complementarios de otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. También se ha informado de otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso de dímeros Fv monocatenarios (sFv). Ver, Gruberet al., J. Immunol.
[0837] 152:5368 (1994).
[0838] Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tuttet al., J. Immunol.147:60 (1991).
[0839] Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes, por lo menos uno de los cuales se origina en el antígeno proteico de la invención. Alternativamente, un brazo antiantigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que se une a una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula receptora de células T (por ejemplo,CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores Fc para IgG (FcγR), tales como FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) y FcγRIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden utilizar para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión al antígeno y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelante de radionúclidos, como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al antígeno proteico descrito en la presente y además se une al factor tisular (TF).
[0840] Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (ver la Patente de EE. UU. n.º 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (ver los documentos WO 91/00360; fWO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos se pueden prepararin vitroutilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluidos aquellos que implican agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un enlace tioéter. Los ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y los descritos, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. n.º 4,676,980.
[0841] Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo,la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer y/u otras enfermedades y trastornos asociados con la expresión y/o actividad aberrante de CD47. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fc, lo que permite la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción celular mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). (Ver Caronet al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fc duales y, por lo tanto, pueda tener capacidades mejoradas de lisis del complemento y ADCC. (Ver Stevensonet al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
[0842] La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como una toxina (por ejemplo,una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de esta), o un isótopo radiactivo (es decir un radioconjugado).
[0843] Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Se dispone de una variedad de radionúclidos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y y<186>Re.
[0844] Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bisdiazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolileno) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitettaet al., Science 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el anticuerpo. (Ver el documento WO94/11026).
[0845] Los expertos en la técnica reconocerán que se puede acoplar una gran variedad de restos posibles a los anticuerpos resultantes de la invención. (Ver,por ejemplo,“Conjugate Vaccines,” Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
[0846] El acoplamiento se puede lograr mediante cualquier reacción química que se una a las dos moléculas siempre que el anticuerpo y el otro resto conserven sus respectivas actividades. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y complejación. Sin embargo, la unión preferida es la unión covalente. La unión covalente se puede lograr mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de unión bivalentes o polivalentes son útiles para acoplar moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente invención, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. Este listado no pretende ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica, sino que, más bien, es un ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes. (Ver Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansenet al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); y Vitettaet al., Science 238:1098 (1987).
[0847] Los enlazadores preferidos se describen en la bibliografía. (Ver,por ejemplo,Ramakrishnan, S.et al., Cancer Res.
[0848] 44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Ver también la patente de EE. UU. n.º 5,030,719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopéptido. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) clorhidrato de (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida EDC; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metilalfa-(2-pridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosucinimidIl 6 [3-(2-piridilditio)-propianamida]hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. #24510) conjugado con EDC.
[0849] Los enlazadores descritos anteriormente contienen componentes que tienen diferentes atributos, lo que conduce a conjugados con diferentes propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen éster de NHS son menos solubles que los ésteres de sulfo-NHS. Además, el enlazador SMPT contiene un enlace disulfuro estéricamente impedido y puede formar conjugados con mayor estabilidad. Los enlaces disulfuro, en general, son menos estables que otros enlaces porque el enlace disulfuro se escindein vitro,lo que resulta en menos conjugado disponible. El sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodimida (como EDC) cuando se usan junto con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodimida sola.
[0850] Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epsteinet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwanget al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las patentes de EE. UU. n.º 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de EE. UU. n.º 5,013,556.
[0851] Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab’ del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como se describe en Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) a través de una reacción de intercambio de disulfuro.
[0852] Uso de anticuerpos anti-CD47
[0853] Se apreciará que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en las formulaciones para proporcionar una mejor transferencia, administración, tolerancia y similares. Se puede encontrar una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el Capítulo 87 de Blaug, Seymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como Lipofectin<™>), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, siempre que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la vía de administración. Ver también Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol.32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powellet al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998) y las citas en el mismo para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos por los químicos farmacéuticos.
[0854] Las formulaciones terapéuticas de la invención, las cuales incluyen un anticuerpo de la invención, se utilizan para tratar o aliviar un síntoma asociado con un cáncer, tal como, a modo de ejemplo no limitativo, leucemias, linfomas, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, glioma, cáncer de pulmón y bronquios, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de riñón y pelvis renal, cáncer de cavidad oral y faringe, cáncer de cuerpo uterino y/o melanoma. La presente invención también proporciona métodos para tratar o aliviar un síntoma asociado con un cáncer. Un régimen terapéutico se lleva a cabo mediante la identificación de un sujeto,por ejemplo,un paciente humano que padece (o está en riesgo de desarrollar) un cáncer, utilizando métodos estándar.
[0855] La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el trastorno relacionado con el sistema inmunitario en particular. El alivio de uno o más síntomas del trastorno inmunorrelacionado indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.
[0856] Los métodos para el cribado de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, de modo no limitativo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y otras técnicas mediadas inmunitariamente conocidas en la técnica.
[0857] Los anticuerpos dirigidos contra una diana tal como CD47, un antígeno asociado a tumor u otro antígeno (o un fragmento de este) se pueden utilizar en métodos conocidos dentro de la técnica relacionados con la localización y/o cuantificación de estas dianas, por ejemplo,para su uso en la medición de niveles de estas dianas dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para su uso en métodos de diagnóstico, para su uso en la obtención de imágenes de la proteína y similares). En una realización dada, los anticuerpos específicos de cualquiera de estos objetivos, o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de estos, que contienen el dominio de unión al antígeno derivado del anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (denominados en lo sucesivo “Terapéuticos”).
[0859] Un anticuerpo de la invención se puede utilizar para aislar una diana particular utilizando técnicas estándar, tales como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos de la invención (o un fragmento de estos) se pueden utilizar de forma diagnóstica para controlar los niveles de proteína en el tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica,por ejemplo,para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando (es decir uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos protésicos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, β-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen<125>I,<131>I,<35>S o<3>H.
[0861] Los anticuerpos de la invención, que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados y completamente humanos, pueden usarse como agentes terapéuticos. Tales agentes generalmente se emplearán para tratar o prevenir una enfermedad o patología asociada con la expresión o activación aberrante de un objetivo dado en un sujeto. Una preparación de anticuerpos, preferentemente una que tenga alta especificidad y alta afinidad por su antígeno diana, se administra al sujeto y generalmente tendrá un efecto debido a su unión con la diana. La administración del anticuerpo puede anular, inhibir o interferir con la función de señalización de la diana. La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la unión de la diana con un ligando endógeno al que se une naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo se une a la diana y neutraliza o inhibe de otro modo la interacción entre CD47 y SIRPα.
[0863] Una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de la invención se refiere generalmente a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como se señaló anteriormente, esta puede ser una interacción de unión entre el anticuerpo y su antígeno diana que, en determinados casos, interfiere con el funcionamiento de la diana. La cantidad requerida para ser administrada además dependerá de la afinidad de unión del anticuerpo por su antígeno específico, y también dependerá de la velocidad a la cual un anticuerpo administrado se agota del volumen libre de otro sujeto al que se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención pueden ser, a modo de ejemplo no limitativo, de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al día a una vez a la semana.
[0865] Los anticuerpos o un fragmento de los mismos de la invención se pueden administrar para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos en forma de composiciones farmacéuticas. Los principios y consideraciones involucrados en la preparación de tales composiciones, así como la orientación en la elección de los componentes se proporcionan, por ejemplo, en Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro,et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; y Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New York.
[0867] Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, con base en las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar moléculas peptídicas que conserven la capacidad de unirse a la secuencia de proteína diana. Tales péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producir mediante tecnología de ADN recombinante. (Ver,por ejemplo,Marascoet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). La formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten negativamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito previsto.
[0869] Los ingredientes activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.
[0871] Las formulaciones que se utilizarán para la administraciónin vivodeben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
[0872] Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de EE. UU. n.º 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y γ etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT<™>(microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido lácticoácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos.
[0874] Un anticuerpo de acuerdo con la invención se puede utilizar como un agente para detectar la presencia de un objetivo dado (o un fragmento de proteína del mismo) en una muestra. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene un marcador detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más preferentemente, monoclonales. Se utiliza un anticuerpo intacto, o un fragmento de este (por ejemplo,F<ab>, scFv o F<(ab)2>). El término “marcado”, con respecto a la sonda o el anticuerpo, pretende abarcar el marcado directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y el marcaje final de una sonda de ADN con biotina de modo que se pueda detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término “muestra biológica” pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Por lo tanto, se incluye dentro del uso del término “muestra biológica” la sangre y una fracción o componente de la sangre, incluido el suero sanguíneo, el plasma sanguíneo o la linfa. Es decir, el método de detección de la invención se puede utilizar para detectar un ARNm, proteína o ADN genómico de analito en una muestra biológicain vitroasí comoin vivo.Por ejemplo, las técnicasin vitropara la detección de un ARNm de analito incluyen hibridaciones Northern e hibridacionesin situ. Las técnicasin vitropara la detección de una proteína analito incluyen ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), transferencias Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicasin vitropara la detección de un ADN genómico de analito incluyen hibridaciones Southern. Los procedimientos para realizar inmunoensayos se describen, por ejemplo, en “ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; y “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicasin vivopara la detección de una proteína analito incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo anti-proteína analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puede detectar mediante técnicas de imagen estándar.
[0876] Composiciones farmacéuticas
[0878] Los anticuerpos de la invención (también denominados en la presente “compuestos activos”), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de estos, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones comprenden usualmente el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en la presente, el término “portador farmacéuticamente aceptable” pretende incluir todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo. Los ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, de modo no limitativo, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5 %. También se pueden usar liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
[0880] Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral,por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral(por ejemplo, inhalación),transdérmica(es decir tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede incluir en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
[0881] Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL<™>(BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una la cualidad de inyectarse fácilmente. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tal como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0883] Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo.
[0885] Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Con el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, pastillas o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se agita y se expectora o se traga. Se pueden incluir agentes aglomerantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglomerante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante a naranja.
[0887] Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un aerosol pulverizado desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo,un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.
[0889] La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
[0891] Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
[0892] En una realización, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. n.º 4,522,811.
[0894] Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
[0895] Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, paquete, o dispensador junto con las instrucciones de administración.
[0896] La invención se describirá adicionalmente en los siguientes ejemplos.
[0897] EJEMPLOS EJEMPLO 1: Clonación, expresión y purificación de CD47 humano
[0898] Clonación.La secuencia correspondiente al dominio extracelular de CD47 humano (hCD47) se amplificó a partir de ADNc humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos. La producción de amplificación se purificó en gel y se clonó en el vector de expresión de mamífero pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). El vector se modificó adicionalmente para introducir un Avitag<™>(Avidity, Denver CO) y una etiqueta de hexahistidina en el extremo C permitiendo la biotinilación de sitio único de la proteína y la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados). Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN.
[0899] Expresión.Después, el plásmido se transfectó en células de mamífero usando un reactivo de transfección basado en liposomas tal como TransIT-LT1 (Mirus, Madison, WI). La etapa de transfección requiere solo pequeñas cantidades de ADN y células, usualmente 2x10<5>células y 2 µg de ADN plasmídico por pocillo y la transfección se lleva a cabo en una placa de 6 pocillos. Aunque se pueden utilizar diferentes líneas celulares de mamífero, en los ejemplos que se dan a continuación, se transfectaron células epiteliales monocapa de riñón de embrión humano transformadas (células PEAK). Estas células expresan de forma estable el gen EBNA-1, lo que respalda aún más el proceso de replicación episomal, son semiadherentes y se pueden cultivar en incubadora de cultivo celular en condiciones estándar (5 % de CO2; 37 °C en medio DMEM complementado con 10 % de suero fetal de ternera). Después de 24 h, las células se colocaron en condiciones selectivas mediante la adición de medio que contenía 0,5-2 µg/mL de puromicina, ya que las células que albergan el vector episómico son resistentes a este antibiótico. De dos a tres semanas después de la transfección, se utilizaron matraces de triple cuello o biorreactores CELLine desechables para cultivo en la etapa de producción. El CELLine es un biorreactor de dos compartimentos que se puede utilizar en una incubadora de cultivo celular estándar. El compartimiento más pequeño (15 ml) contiene las células y está separado de un compartimiento más grande (un litro) que contiene el medio por una membrana semipermeable con un tamaño de corte de 10 kDa (Bruceet al.2002, McDonaldet al.2005). Este sistema permite la difusión de nutrientes, miradas y productos de desecho metabólicos, al tiempo que retiene las células y las proteínas secretadas en el compartimento más pequeño. El cultivo se mantuvo durante 7-10 días antes de la cosecha del sobrenadante. Como el medio contiene suero, las células mantienen una buena viabilidad y se pueden generar varias series de producción utilizando las mismas células y recipientes.
[0900] Purificación.Después de la cosecha, los sobrenadantes del cultivo celular se clarificaron mediante centrifugación y se filtraron a través de una membrana de 0,22 µm. El sobrenadante de los matraces de triple cuello se concentró 20-40 veces usando un dispositivo de concentración tal como un SartoFlow 200 (Sartorius) con una membrana que tenía un tamaño de corte apropiado para retener la proteína de interés. Este paso no fue necesario utilizando el biorreactor CELLline debido al bajo volumen recuperado del compartimento celular. Además, la etapa de concentración aumenta la concentración tanto de la proteína de interés como de contaminantes de alto peso molecular tales como albúmina de suero bovino o inmunoglobulinas. Por el contrario, el sobrenadante recuperado del compartimento celular del biorreactor CELLine contiene proteína recombinante concentrada y niveles reducidos de contaminantes, ya que no pueden cruzar la membrana de 10 kDa que separa las dos cámaras del reactor. Este aumento de la relación de proteína recombinante a contaminante mejora en gran medida la eficiencia de la purificación utilizando IMAC. El sobrenadante concentrado se complementó con imidazol 100 mM y se cargó en resina de cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen). La concentración relativamente alta de imidazol minimiza la unión de contaminantes a la resina. Después del lavado de la columna, las proteínas se eluyen a una velocidad de flujo de 2 mL/min usando un gradiente de imidazol de 30 mL (imidazol 20-400 mM) en un sistema de cromatografía ÄKTA Prime (Amersham Pharmacia Biotech). El gradiente de elución mejora aún más la pureza de la proteína recombinante, pero puede reemplazarse por un enfoque de elución por etapas si no se dispone de un sistema de cromatografía. Las fracciones eluidas se pueden analizar mediante SDS-PAGE o ELISA para determinar su contenido en proteína recombinante. Las fracciones de interés se agrupan y se desalan en columnas PD-10 (GE Healthcare) equilibradas con solución salina tamponada con fosfato u otro tampón apropiado. Las proteínas desaladas se pueden cuantificar utilizando diversas técnicas y su pureza se puede analizar mediante SDS-PAGE. El CD47 recombinante se biotinilóin vitroutilizando biotina ligasa (Avidity, Denver CO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de la desalación, el nivel de biotinilación se evaluó mediante ensayos de reducción utilizando perlas magnéticas de estreptavidina y análisis SDS-PAGE.
[0901] EJEMPLO 2: Clonación, expresión y purificación de CD19 humano
[0902] Clonación.La secuencia correspondiente al dominio extracelular de CD19 humano (hCD419) se amplificó a partir de ADNc humano mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando oligonucleótidos específicos. La producción de amplificación se purificó en gel y se clonó en el vector de expresión de mamífero pEAK8 (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD). El vector se modificó adicionalmente para introducir un Avitag<™>(Avidity, Denver CO) y una etiqueta de hexahistidina en el extremo C permitiendo la biotinilación de sitio único de la proteína y la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados). Las construcciones se verificaron mediante secuenciación de ADN.
[0903] Expresión y purificación.La expresión, purificación y biotinilación de hCD19 soluble se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.
[0904] EJEMPLO 3: Selección de presentación de fagos utilizando bibliotecas de scFv humanos que contienen cadena pesada variable fija
[0905] Los procedimientos generales para la construcción y el manejo de bibliotecas de scFv humanos presentados en el bacteriófago M13 se describen en Vaughanet al., (Nat. Biotech.1996, 14:309-314). Las bibliotecas utilizadas para la selección y el cribado codifican scFv que comparten el mismo dominio VH y están únicamente diversificadas en el dominio VL. Los métodos para la generación de bibliotecas de VH fijas y su uso para la identificación y ensamblaje de anticuerpos biespecíficos se describen en los documentos US 2012/0184716 y WO 2012/023053. Los procedimientos para identificar la unión de scFv a hCD19 o hCD47 se describen a continuación.
[0906] Selecciones de fase líquida.Se bloquearon alícuotas de bibliotecas de fagos scFv (10<12>Pfu) con PBS que contenía leche desnatada al 3 % (p/v) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago bloqueado se deseleccionó en perlas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago no seleccionado se incubó después con hCD19 o hCD47 biotiniladoin vivo(100 nM) durante dos horas a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. Las perlas se capturaron usando un soporte magnético seguido de cuatro lavados con PBS/Tween 20 al 0,1 % y 3 lavados con PBS. Después, las perlas se agregaron directamente a 10 ml de células TG1 de crecimiento exponencial y se incubaron durante una hora a 37 °C con agitación lenta (100 rpm). Una alícuota del TG1 infectado se diluyó en serie para titular el resultado de la selección. El TG1 infectado restante se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos y se volvió a suspender en 0,5 ml de 2xTY-AG (medio 2xTY que contenía 100 µg/ml de ampicilina y glucosa al 2 %) y se extendió en placas de bioensayo de agar 2xTYAG. Después de la incubación durante la noche a 30 °C, se añadieron 10 ml de 2xTYAG a las placas y las células se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml. Se agregó 2xTYAG que contenía 50 % de glicerol a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17 % de glicerol. Las alícuotas de la ronda de selección se mantuvieron a -80 °C.
[0907] Rescate de fagos.Se añadieron 100 µl de suspensión celular obtenida de rondas de selección anteriores a 20 ml de 2xTYAG y se cultivaron a 37 °C con agitación (240 rpm) hasta que se alcanzó una DO<600>de 0,3 a 0,5. A continuación, el cultivo se superinfectó con 3,3 x 10<10>MK13K07 fagos auxiliares MK13K07 y se incubó durante una hora a 37 °C (150 rpm). Después se cambió el medio centrifugando las células a 2000 rpm durante 10 minutos, retirando el medio y volviendo a suspender el sedimento en 20 ml de 2xTY-AK (100 µg/ml de ampicilina; 50 µg/ml de kanamicina). Después, el cultivo se cultivó durante la noche a 30 °C (240 rpm). Al día siguiente, el sobrenadante que contenía el fago se utilizó para la siguiente ronda de selección.
[0908] Selecciones de la superficie celular.Los sobrenadantes que contenían fagos se bloquearon con PBS que contenía leche desnatada al 3 % (p/v) durante una hora a temperatura ambiente en un mezclador rotatorio. El fago bloqueado se deseleccionó durante una hora en células T Jukat que no expresan CD19 y que se habían bloqueado previamente con PBS que contenía leche desnatada al 2 % (p/v). El fago no seleccionado se incubó después con 2x10<7>células Raji que expresan CD19 durante una hora a temperatura ambiente con agitación suave. A continuación, las células se sedimentaron y se lavaron diez veces con PBS. El fago unido se eluyó mediante la adición directa de 10 ml de TG1 de crecimiento exponencial al matraz T75 y la incubación durante una hora a 37°C con agitación lenta. Una alícuota del TG1 infectado se diluyó en serie para titular el resultado de la selección. Los TG1 infectados se centrifugaron a 3000 rpm durante 15 minutos y se volvieron a suspender en 0,5 ml de 2xTY-AG (medio 2xTY que contenía 100 µg/ml de ampicilina y glucosa al 2 %) y se extendieron en placas de bioensayo de agar 2xTYAG. Después de la incubación durante la noche a 30 °C, se añadieron 10 ml de 2xTYAG a las placas y las células se rasparon de la superficie y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 50 ml. Se agregó 2xTYAG que contenía 50 % de glicerol a la suspensión celular para obtener una concentración final de 17 % de glicerol. Las alícuotas de la ronda de selección se mantuvieron a -80 °C.
[0909] Preparación periplásmica de scFv para pruebas funcionales y de unión.Los clones individuales se inocularon en una placa de microtitulación de pocillos profundos que contenía 0,9 ml de medio 2xTYAG (glucosa al 0,1 %) por pocillo y se cultivaron a 37 °C durante 5-6 h (250 rpm). Después se agregaron 100 µl por pocillo de IPTG 0.2 mM en medio 2xTY para proporcionar una concentración final de IPTG 0.02 mM. Las placas se incubaron durante la noche a 30 °C con agitación a 250 rpm. Las placas de pocillos profundos se centrifugaron a 2.500 rpm durante 10 min y el sobrenadante se retiró cuidadosamente. Los sedimentos se volvieron a suspender en 150 µl de tampón TES (Tris / HCl 50 mM (pH 8), EDTA 1 mM (pH 8), sacarosa al 20 %, complementado con inhibidor de proteasa completo, Roche). Se produjo un choque hipotónico mediante la adición de 150 µl de tampón TES diluido (dilución tes: agua 1: 5) y la incubación en hielo durante 30 min. Después, las placas se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos para eliminar las células y los desechos. Los sobrenadantes se transfirieron cuidadosamente a otra placa de microtitulación y se mantuvieron en hielo para pruebas inmediatas en ensayos funcionales o ensayos de unión.
[0910] Secuenciación de clones de fagos.Los clones individuales se colocaron en una placa de microtitulación que contenía 150 µl de medio 2xTYAG (glucosa al 2 %) por pocillo y se cultivaron a 30 °C (120 rpm) durante la noche. Al día siguiente, se transfirieron 5 µl de cultivo a otra placa que contenía 45 µl de dH<2>O y se mezclaron. A continuación, la placa se congeló a -20 °C. Después de la descongelación, se utilizó 1 µl de esta suspensión para la amplificación por PCR utilizando protocolos de PCR estándar con cebador específico para pNDS1: mycseq, 5'-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG-3' (SEQ ID NO: 283) y gene3leader, 5'-TTATTATTCGCAATTCCTTTAGTTGTTCCT-3' (SEQ ID NO: 284). Las reacciones de PCR se purificaron en formato de 96 pocillos utilizando el sistema Montage PCRµ96 (Millipore). Se secuenciaron 5 µl del ADN eluido utilizando los cebadores mycseq y gene3leader.
[0911] EJEMPLO 4: Cribado de la unión de scFv a hCD47 y scFv que inhibe la interacción SIRPα
[0912] Unión: La detección de scFv para la unión a hCD47 se probó en un ensayo homogéneo utilizando tecnología FMAT. Los siguientes reactivos se mezclaron en cada pocillo de una placa óptica 384 (Costar): 30 µl de una suspensión de perlas de estreptavidina poliestireno (Spherotech; 3000 perlas/pocillo) recubiertas con hCD47 biotinilado o una proteína biotinilada de control (NusA); 60 µl de preparación periplásmica de scFv; 10 µl de tampón de detección (PBS que contiene anticuerpo anti-cmyc a 5 µg/mL; Fc anti-ratón AlexaFluor 647 diluido 1:200). Después de mezclar a 450 rpm durante 5 minutos, las placas de 384 pocillos se incubaron a temperatura ambiente y se leyeron después de 1 y 3 horas en un sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Cada muestra de scFv se analizó por duplicado contra hCD47 y NusA. Los clones que expresan scFv que dan una señal específica para hCD47 y no NusA se seleccionaron para un análisis adicional.
[0913] Inhibición de la interacción CD47-SIRPα: Los scFv también se analizaron para determinar su capacidad para inhibir la interacción entre CD47 y SIRPα en un ensayo homogéneo basado en perlas utilizando la tecnología FMAT. Las perlas de poliestireno de proteína A (Spherotech) se incuban con 5 µg/mL de anticuerpo de cabra anti-IgG humana específica de FcY (Jackson lmmunoresearch). Después del lavado de las perlas, se agregaron 5 µg/mL de SIRPα-Fc (R&D Systems) para que la proteína de fusión pueda capturarse en la superficie de la perla. Después del bloqueo con PBS; 2 % Tropix 1-block (Applied Biosystems), se agregaron 30 µl de la suspensión de perlas (3000 perlas/pocillo) recubierta a cada pocillo de una placa óptica 384 (Costar). En una placa separada de 96 pocillos, se mezclaron 120 µl de preparación periplásmica de scFv con 24 µl de hCD47 biotinilado (300 ng/ml) y se incubaron durante 50 minutos a temperatura ambiente para que el scFv se pueda unir a hCD47. Después de la incubación, se añaden 24 µl de estreptavidina Cy5 (1 µg/ml; Invitrogen) a la mezcla y se añaden 70 µl de esta mezcla final a los 30 µl de perlas en cada pocillo de la placa de 384 pocillos. Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, la placa se leyó en un sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Los pocillos de control que no contenían scFv o un scFv irrelevante que no se unía a CD47 se incluyeron en cada placa de modo que los clones que expresaban scFv que conducían a una reducción de la señal de SIRPα-CD47 medida en los controles se seleccionaron para un análisis adicional.
[0914] Alternativamente, también se utilizó un ensayo basado en células que monitorea la interacción de SIRPα soluble con hCD47 expresado en la superficie de la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transfectada de forma estable para el cribado de candidatas. Se agregaron 20 µl de PBS-BSA 2 % azida 0,1 % que contenía 3000 células CHO que expresaban hCD47 a cada pocillo de una placa óptica 384 (Costar). Después se agregaron 50 µl de una dilución doble de la preparación periplásmica de scFv al pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que el scFv se uniera a CD47 en las células. Después de la incubación, se agregaron 30 µl de PBS 2 % BSA azida 0,1 % que contenía 10 ng/ml de SIRPα-Fc (R&D systems) y anticuerpo anti-hIgG-Fc FMAT Blue acoplado (diluido 1:2000) y se incubaron adicionalmente durante 3 horas antes de leer en un sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems).
[0915] EJEMPLO 5: Cribado de la unión de scFv a hCD19
[0916] El cribado de scFv para la unión a hCD19 recombinante se probó en un ensayo homogéneo usando tecnología FMAT como se describe en el Ejemplo 4.
[0917] También se realizó un cribado en células Raji para la unión a la forma nativa de hCD19. A cada pocillo de una placa óptica 384 (Costar) se añadieron 30 µl de PBS-BSA 2 % azida 0,1 % que contenía 3000 células Raji (una línea de células B humanas que expresan CD19) o células Jurkat (una línea de células T humanas que no expresan CD19). Después, 30 µl de una dilución doble de la preparación periplásmica de scFv, 30 µl de PBS-BSA2% y 1030 µl de tampón de detección 10X (Anticuerpo Qiagen pentaHis AF647 diluido 1:700 en PBS-BSA2%). Después de mezclar a 450 rpm durante 5 minutos, las placas de 384 pocillos se incubaron a temperatura ambiente y se leyeron después de 1 y 3 horas en un sistema de detección celular FMAT 8200 (Applied Biosystems). Los clones que expresan scFv que dan una señal específica para células Raji y no Jurkat se seleccionaron para un análisis adicional.
[0918] EJEMPLO 6: Candidatos VH fijos reformateando a IgG y expresión transitoria en células de mamíferoDespués de la selección, los candidatos scFv contra hCD19 o hCD47 se reformatearon en IgG y se expresaron mediante transfección transitoria en células PEAK. Las secuencias VH y VL de scFv seleccionados se amplificaron con oligonucleótidos específicos y se clonaron en un vector de expresión que contenía las regiones constantes de cadena pesada y ligera y las construcciones se verificaron mediante secuenciación. Los vectores de expresión se transfectaron en células de mamífero usando el reactivo de transfección Fugene 6 (Roche, Basilea, Suiza). En resumen, las células Peak se cultivaron en placas de 6 pocillos a una concentración de 6 x 10<5>células por pocillo en 2 ml de medio de cultivo que contenía suero bovino fetal. Los vectores de expresión que codifican las secuencias VH y VL candidatas se transfectaron conjuntamente en las células utilizando el reactivo de transfección Fugene 6 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Un día después de la transfección, se aspiró el medio de cultivo y se agregaron 3 ml de medio libre de suero fresco a las células y se cultivaron durante tres días a 37 °C. Después del período de cultivo de tres días, el sobrenadante se cosechó para IgG purificada en columnas de flujo rápido de proteína G-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los sobrenadantes de las células transfectadas se incubaron durante la noche a 4 °C con tampón de unión a IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). Las muestras se pasaron después sobre columnas de flujo rápido de Proteína G-Sepharose 4B y la IgG se purificó en consecuencia utilizando tampón de elución. La fracción de IgG eluida se dializó contra PBS y el contenido de IgG se cuantificó mediante absorción a 280 nm. La pureza y la integridad de IgG se verificaron mediante SDS-PAGE.
[0919] EJEMPLO 7: Modulación de afinidad de anticuerpos anti-hCD47
[0920] (a) Anticuerpos Ka3, Ke8, Kc4
[0921] Se demostró que tres anticuerpos identificados durante el proceso de selección descrito en los Ejemplos anteriores son específicos para CD47 humano y capaces de bloquear la interacción entre CD47 y SIRPα se seleccionaron para la maduración de afinidad con el fin de aumentar su afinidad y potencia. Todos estos anticuerpos comparten la misma cadena pesada variable pero tienen diferentes cadenas ligeras variables. Ka3 y Ke8 contienen una cadena ligera kappa (IGVK1-39 según la nomenclatura IMGT) mientras que Kc4 contiene una cadena ligera lambda (IGVL2-14). Se generaron varias bibliotecas de fagos que presentaban variantes de scFv mediante la introducción de diversidad en la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región de cadena ligera variable, mientras que la región variable de cadena pesada se mantuvo sin modificar. Se generó una biblioteca de 9x10<7>transformantes que cubrían una diversidad teórica de 7x10<5>para Ka3; se generaron dos bibliotecas de 2x10<8>transformantes cada una, que cubrían parcialmente una diversidad teórica de 2,4x10<9>para Ke8 y se generó una biblioteca de 3,6x10<7>transformantes que cubrían una diversidad teórica de 2,6x10<5>para Kc4. Estas bibliotecas se usaron para selecciones de expresión en fagos como se describe en el Ejemplo 3, excepto que la rigurosidad de selección aumentó entre rondas al reducir la concentración de hCD47 entre diferentes rondas: Se utilizaron 10 nM y 1 nM de hCD47 en la primera y segunda ronda de selección, respectivamente. Las variantes seleccionadas se analizaron para determinar la capacidad de inhibir la interacción entre hCD47 y SIRPα utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 4. Los clones positivos se reformatearon como IgG y se caracterizaron como se describe en los siguientes Ejemplos. Estos esfuerzos de maduración de la afinidad conducen a la identificación de los siguientes anticuerpos anti-VD47:
[0922] • Ke8H6; Ke86G9; Ke8A3; Ke8C4; Ke8F1; Ke8B7; Ke8G11; Ke8A8; Ke8A4; Ke8B2; Ke8C7; Ke8H3; Ke8A2;
[0923] Ke8H5; Ke8G6; Ke8E8; Ke81A3; Ke81G9; Ke84G9; Ke8G2; Ke8F2
[0924] • Ka3G2; Ka3D3; Ka3A2; Ka3B2; Ka3C5; Ka3A3; Ka3H8; Ka3H3
[0925] • Kc4E2; Kc4F4; Kc4A1; Kc4C11; Kc4E10; Kc4B1; Kc4C3; Kc4A4; Kc4G11; Kc4G9
[0926] (b) Modificación genética del anticuerpo 5A3 para la modulación de afinidad
[0927] La secuencia VL del anticuerpo anti-CD475A3 se modificó para disminuir su afinidad hacia su diana. La secuencia 5A3-VL se alineó con su secuencia de línea germinal más cercana, la IGKV1-33 humana de acuerdo con la nomenclatura IMGT (Fig.1). Usando esta alineación, se identificaron varios residuos en CDRL1 y CDRL2 de 5A3 VL los cuales no se conservan con la secuencia de la línea germinal. Algunos de estos aminoácidos se mutaron para alterar la afinidad de unión del anticuerpo. Los residuos de 5A3 CDRL3 también se cambiaron para modular la unión del anticuerpo mientras que al mismo tiempo se dirigían al mismo epítopo en CD47. Estas diferentes estrategias llevaron a la identificación de los candidatos 5A3-M3 y 5A3-M5.
[0928] Estas variantes se probaron primero en un ensayo de unión a CD47/SIRPα para determinar su potencia de bloqueo en comparación con el anticuerpo 5A3 parental (Figura 2). Tanto 5A3-M3 como 5A3-M5 son menos potentes para inhibir la interacción entre CD47 y SIRPα que 5A3, con 5A3-M5 mostrando el perfil de potencia de inhibición más débil.
[0929] La afinidad de estas variantes por CD47 humano se evaluó después mediante tecnología de resonancia de plasmón superficial. La K<D>de los anticuerpos 5A3, 5A3-M3 y 5A3-M5 es de aproximadamente 2,36E-08, 5,60E-08 y 2,84E-06 M, respectivamente. Estos datos confirmaron que las variantes de 5A3 se unen a CD47 con una afinidad menor en comparación con el anticuerpo parental y que 5A3-M5 tiene la afinidad más débil por CD47 humano mientras que 5A3-M3 tiene una afinidad intermedia.
[0930] EJEMPLO 8: Caracterización de anticuerpos CD47
[0931] Unión de anticuerpos CD47 a células CHO transfectadas con huCD47
[0932] La especificidad de los anticuerpos monoclonales CD47 (Mab) se demostró mediante citometría de flujo utilizando células CHO transfectadas de forma estable con CD47 humano (células CHO-huCD47). Se utilizaron células CHO no transfectadas como control. En resumen, los CD47 Mab purificados se incubaron con células CHO-huCD47 a una concentración final de 10 µg/ml durante 30 minutos. Después de dos lavados, los anticuerpos CD47 unidos se detectaron usando un anticuerpo secundario Fc anti-humano conjugado con Cy-5 (BD biosciences). La Figura 3 muestra una unión significativa de CD47 MAb a células CHO transfectadas con HU-CD47, pero sin unión (o unión a nivel de fondo) a células CHO no transfectadas, lo que demuestra la especificidad de los CD47 MAb de la presente invención.
[0933] Unión de anticuerpos CD47 a células HEK293-P
[0934] La especificidad de los CD47 Mab se confirmó adicionalmente en un experimento usando células HEK293-P con un silenciamiento del gen CD47 mediada por ARNip. Las células HEK293-P (células Peak) se derivaron de células de riñón embrionario humano y expresan niveles bajos a moderados de CD47. Se ha generado una variante deficiente en CD47 de células Peak transfectándolas de forma estable con ARNip específico para el gen CD47. La expresión en la superficie celular del antígeno CD47 se reduce en estas células de PEAK de silenciamiento de CD47 en más del 85 % (datos no mostrados). La Figura 4 demuestra la unión de los CD47 MAb seleccionados a las células Peak no transfectadas y a las células Peak silenciadas de CD47. La unión de los CD47 Mab a las células Peak transfectadas con ARNip de CD47 se reduce significativamente, confirmando así su especificidad antigénica.
[0935] Reactividad cruzada de anticuerpos CD47 con CD47 de cynomolgus; Unión de anticuerpos CD47 a CD4 humanas y de cynomolgus células T
[0936] La capacidad de los anticuerpos monoclonales CD47 de la presente invención para reaccionar de forma cruzada con CD47 de mono cynomolgus natural se probó mediante citometría de flujo. La unión de anticuerpos CD47 a linfocitos T positivos para CD4 de cynomolgus presentes en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se comparó con la unión a la población de células humanas correspondiente. En resumen, las células mononucleares de sangre periférica de cynomolgus (PBMC) se obtuvieron de Ricerca Biosciences. Las PBMC humanas se aislaron de una capa leucocitaria utilizando tubos ficoll CPT (Beckton y Dickinson). Para el análisis de citometría de flujo, las PBMC se preincubaron con reactivo de bloqueo de FcgR (Miltenyi Biotech.) durante 20 minutos para bloquear los receptores Fc gamma antes de la adición de anticuerpos CD47 (concentración final de 0,005 mg/ml). Después de un período de incubación de 30 minutos, las células se lavaron y se hicieron reaccionar con anticuerpo anti-CD4 humano conjugado con PE (clon L200, BD Pharmingen diluido 1/100) y anticuerpo Fc anti-humano de cabra conjugado con FMAT Blue (Jackson Immuno Research, 109-005-098). Después se determinó la MFI para la unión a CD47 (FL4) mediante citometría de flujo en la población CD4+ positiva (seleccionada en FL2). Como se muestra en la Figura 5, los anticuerpos monoclonales CD47 de la presente invención se unen a CD47 humano natural y reaccionan de forma cruzada con CD47 de cynomolgus.
[0937] Actividad de bloqueo SIRPα de anticuerpos CD47
[0938] La actividad de bloqueo de SIRPα de CD47 se determinó en el ensayo de unión competitiva CD47-SIRPα. Los experimentos de dosis-respuesta con CD47 Mabs permitieron determinar un valor de IC50 para cada uno de los CD47 Mab de la presente invención. En resumen, las células CHO transfectadas con CD47 humano se incubaron con SIRPα humana soluble etiquetada con His (concentración final, 200 ng/ml) y concentraciones crecientes de CD47 Mab (3,3 pM a 330 nM, por cuadruplicado). La detección de SIRPα unida se hizo como se describe en el ejemplo 4. La Figura 6 muestra la potencia de los CD47 Mab para bloquear la interacción CD47-SIRPα, representada por los valores de IC50. Los CD47 Mab se agrupan por familia y se clasifican de mayor a menor potencia. Su actividad neutralizante se comparó con el anticuerpo B6H12 CD47 disponible en el mercado. Es evidente a partir de la figura 6 que las potencias neutralizantes de los CD47 Mab de la presente invención varían en un amplio intervalo.
[0939] Actividad de hemaglutinación de anticuerpos CD47
[0940] La Figura 7 demuestra que los CD47 MAb de alta afinidad de las familias 5A3, Ke8 y Ka3 inducen la hemaglutinación; en contraste con las otras tres familias, los anticuerpos de la familia Kc4 probados en este experimento no parecen inducir la hemaglutinación incluso el que se une fuertemente a CD47 e inhibe potentemente la interacción CD47-SIRPα.
[0941] Se evaluó la capacidad de los CD47 MAb para inducir la agrupación homotípica de eritrocitos (hemaglutinación). Se diluyeron 10 microlitros de sangre entera humana en 40 microlitros de solución de anticuerpo en PBS a diferentes concentraciones (intervalo: 0.003 microg/ml a 50 microg/ml de concentración final de Mab) en placas de 96 pocillos de fondo plano. La mezcla sangre-anticuerpo se incubó durante la noche a 37 °C sin agitación. Al final de la incubación, las placas se agitaron manualmente, se inclinaron a aproximadamente 30 °C y se dejaron reposar durante aproximadamente 10 minutos.
[0942] La evidencia de hemaglutinación se demuestra por la formación de un depósito agrupado, en forma de una media luna en la parte inferior alrededor del borde inferior del pocillo. Todos menos los anticuerpos CD47 de menor afinidad de las familias 5A3, Ke8 y Ka3 (específicamente, 5A3M5, Ke8A3, Ka3A3) causaron hemaglutinación. Por el contrario, los anticuerpos CD47 de la familia Kc4 no causaron hemaglutinación, incluso los de mayor afinidad (Kc4E2, Kc4F4).
[0943] EJEMPLO 9: Maduración por afinidad del anticuerpo CD19
[0944] (a) Anticuerpo B7
[0945] Entre los anticuerpos identificados durante el proceso de selección descrito en los Ejemplos anteriores, se seleccionó B7 para la maduración de afinidad con el fin de aumentar su afinidad por hCD19. El candidato B7 contiene una cadena ligera lambda (IGLV6-57) y se generaron varias bibliotecas de fagos que muestran variantes de scFv mediante la introducción de diversidad en la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región de cadena ligera variable, mientras que la región variable de cadena pesada se mantuvo sin modificar. Se utilizaron diferentes estrategias de diversificación para generar 20 bibliotecas que comprenden un total de 2x10<9>transformantes que cubren parcialmente una diversidad teórica de 4x10<12>.
[0946] (b) Anticuerpo L7B7_D11
[0947] El anticuerpo D11 se identificó durante la maduración de afinidad de B7 descrita anteriormente y se une a hCD19 con una afinidad mayor que el anticuerpo parental B7. Este anticuerpo se seleccionó para una segunda ronda de maduración de afinidad de su cadena ligera. Se generaron un total de 6 bibliotecas que comprendían 2,8x10<9>transformantes que cubrían parcialmente una diversidad teórica de 4x10<9>y se utilizaron para las selecciones de expresión en fagos como se describió anteriormente, excepto que se utilizó 1 nM de hCD19 para cada ronda de selección. Esta segunda ronda de maduración de afinidad condujo a la identificación de los siguientes anticuerpos y a una mejor unión a CD19: L7B7_C2; L7B7_A6; L7B7_B11; L7B7_C6 y L7B7_C9
[0948] EJEMPLO 10: Expresión y purificación de anticuerpos biespecíficos que portan una cadena ligera Lambda y Kappa.
[0949] La expresión simultánea de una cadena pesada y dos cadenas ligeras en la misma célula puede conducir al ensamblaje de tres anticuerpos diferentes. La expresión simultánea se puede lograr de diferentes maneras, como la transfección de múltiples vectores que expresan una de las cadenas que se van a expresar conjuntamente o mediante el uso de vectores que impulsan la expresión génica múltiple. Se generó previamente un vector pNovi rHλ para permitir la expresión conjunta de una cadena pesada, una cadena ligera Kappa y una cadena ligera Lambda como se describe en los documentos US 2012/0184716 y WO 2012/023053. La expresión de los tres genes está impulsada por los promotores del citomegalovirus humano (hCMV) y el vector también contiene un gen de la glutamina sintetasa (GS) que permite la selección y el establecimiento de líneas celulares estables. El gen VH y VL de la IgGλ anti-hCD19 o la IgGκ anti-hCD47 se clonaron en el vector pNovi rHλ, para la expresión transitoria en células de mamífero. Las células del pico se cultivaron en placas de 6 pocillos a una concentración de 6 x 10<5>células por pocillo en 2 ml de medio de cultivo que contenía suero bovino fetal. Se transfectaron 2 µg de ADN plasmídico en las células usando el reactivo de transfección TransIT-LT1 (Mirus) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de anticuerpos en el sobrenadante que contiene suero de las células transfectadas se midió en varios puntos de tiempo durante la producción utilizando la tecnología de interferometría de biocapa (BLI). Se utilizaron un instrumento OctetRED96 y biosensores de proteína A para la cuantificación (Pall, Basilea, Suiza). Se utilizaron 200 µL de sobrenadante para determinar la concentración de IgG; los biosensores se preacondicionaron y regeneraron utilizando glicina 10 mM pH 1,7 y se prepararon calibradores de IgG diluidos en medio celular PEAK acondicionado para generar la curva estándar. Las concentraciones se determinaron utilizando la ecuación de curva estándar Y ponderada de 5PL de respuesta a la dosis y una ecuación de tasa de unión de pendiente inicial. De acuerdo con la concentración de anticuerpo, los sobrenadantes se recolectaron de 7 a 10 días después de la transfección y se clarificaron mediante centrifugación a 1300 g durante 10 min. El proceso de purificación se componía de tres pasos de afinidad. Primero, la matriz de afinidad CaptureSelect<™>IgG-CH1 (Life Technologies, Zug, Suiza) se lavó con PBS y después se agregó al sobrenadante clarificado. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, los sobrenadantes se centrifugaron a 1000 g durante 10 min, el flujo se almacenó y la resina se lavó dos veces con PBS. Después, la resina se transfirió a columnas giratorias y se usó una solución que contenía glicina 50 mM a pH 2,7 para la elución. Se generaron varias fracciones de elución, se agruparon y se desalaron contra PBS usando unidades de filtro ultracentrífugo Amicon<®>de 50 kDa (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El producto final, que contenía IgG humanas totales del sobrenadante, se cuantificó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y se incubó durante 15 minutos a TA y 20 rpm con el volumen apropiado de matriz de afinidad CaptureSelect<™>LC-kappa (Hu) (Life Technologies, Zug, Suiza). Las etapas de incubación, recuperación de resina, elución y desalación se realizaron como se describió anteriormente. La última etapa de purificación por afinidad se realizó utilizando la matriz de afinidad CaptureSelect<™>LC-lambda (Hu) (Life Technologies, Zug, Suiza) aplicando el mismo proceso que para las dos purificaciones anteriores. El producto final se cuantificó utilizando el Nanodrop. Los anticuerpos biespecíficos purificados se analizaron mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes y reductoras. El Bioanalizador Agilent 2100 se utilizó con el kit Protein 80 según lo descrito por el fabricante (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Se mezclaron 4 µL de muestras purificadas con tampón de muestra suplementado con ditiotreitol (DTT; Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Las muestras se calentaron a 95 °C durante 5 min y después se cargaron en el chip. Todas las muestras se analizaron para determinar la contaminación por endotoxinas utilizando la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL; Charles River Laboratories, Wilmington, MA).
[0951] EJEMPLO 11: Caracterización de anticuerpos monovalentes y biespecíficos.
[0953] Los anticuerpos biespecíficos de doble direccionamiento se unen a dos antígenos diferentes en la superficie de la misma célula. La unión simultánea de los dos brazos de anticuerpos a dos antígenos en la superficie de la célula (denominada acoplamiento conjunto) da como resultado un aumento aditivo o sinérgico de la afinidad debido al mecanismo de avidez. Como consecuencia, el acoplamiento conjunto confiere una alta selectividad hacia las células que expresan ambos antígenos en comparación con las células que expresan solo un único antígeno. Además, las afinidades de los dos brazos de un anticuerpo biespecífico con sus respectivas dianas se pueden establecer de manera que la unión a las células diana esté impulsada principalmente por uno de los brazos del anticuerpo. Por ejemplo, un cuerpo κλ de doble direccionamiento compuesto por un brazo que se une con alta afinidad a un antígeno asociado a tumor (TAA), por ejemplo, CD19, y un segundo brazo que se une con menor afinidad a CD47, pero suficiente para inhibir CD47/SIRPα tras el acoplamiento conjunto de TAA, debería permitir la inhibición preferencial de CD47 en cáncer frente a células normales. Los experimentos descritos a continuación (Figuras 9 a 13) comparan la afinidad de unión, la potencia de neutralización de CD47-SIRPα y la actividad de destrucción de células tumorales del cuerpo κλ biespecífico CD47xCD19 y el anticuerpo monovalente correspondiente, es decir que tiene el mismo brazo de unión a CD47 más un brazo de no unión “simulado”.
[0954] Unión de anticuerpos monovalentes y biespecíficos a líneas de células B
[0956] Para demostrar que la unión de los cuerpos CD47xCD19 κλ a las células diana depende de CD19, se realizó una serie de experimentos FACS que compararon la unión de los cuerpos CD47xCD19 κλ a sus contrapartes monovalentes. Se utilizaron dos tipos de células, una línea celular de linfoma de Burkitt Raji positiva para CD19 (que expresa alrededor de 65.000 moléculas de CD47 por célula) y la línea celular de B-NHL negativa para CD19 DS-1 (que expresa alrededor de 150.000 moléculas de CD47 por célula) como control. Las Figuras 9A-9C demuestran que un cuerpo CD47xCD19 κλ se acopla conjuntamente a las dos dianas en la superficie de las células Raji. Esto se demuestra por (i) mayor afinidad por las células Raji en comparación con las células DS-1 y (ii) mayor afinidad por el cuerpo CD47xCD19 κλ en comparación con el anticuerpo monovalente CD47, observado con células Raji, pero no con células DS-1. Una comparación de los perfiles de FACS generados con la unión del anticuerpo monovalente CD19, el anticuerpo monovalente CD47 y el cuerpo CD47xCD19 κλ a las células Raji demuestra claramente que la unión del CD47xCD19 κλ a las células diana está impulsada principalmente por el brazo CD19.
[0957] Actividad de bloqueo SIRPα de anticuerpos monovalentes y biespecíficos
[0959] Otra serie de experimentos proporciona una prueba adicional del acoplamiento conjunto de CD19 y CD47 en la superficie de la célula diana al mostrar que la neutralización de la interacción CD47-SIRPα por los cuerpos CD47xCD19 κλ depende de CD19. En este experimento, la actividad de los cuerpos CD47xCD19 κλ y los anticuerpos monovalentes correspondientes se probaron en el ensayo de inhibición de CD47-SIRPα como se describe en el Ejemplo 4. La Figura 10 muestra que los cuerpos CD47xCD19 κλ inhibieron la interacción CD47-SIRPα en células Raji con una potencia significativamente mayor que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes. La neutralización eficiente de la interacción CD47-SIRPα requirió el acoplamiento conjunto de CD19. Los valores de IC50 obtenidos con BsAb CD47xCD19 son de 20 a 1000 veces más bajos que los valores obtenidos con el anticuerpo monovalente CD47 correspondiente (ver Tabla 4).
[0960] Tabla 4: Valores de IC50 de anticuerpos monovalentes y biespecíficos CD47
[0963]
[0965] EJEMPLO 12: La ADCC MEDIADA por anticuerpos biespecíficos es dependiente de CD19.
[0966] La capacidad de los cuerpos κλ de doble direccionamiento para acoplar conjuntamente CD47 y CD19 da como resultado un aumento significativo en la afinidad de unión a células positivas para CD19 y en la neutralización dependiente de CD19 de la interacción CD47-SIRPα. Esto, a su vez, se traduce en una destrucción eficiente y selectiva de las células cancerosas mediada por el cuerpo CD47xCD19 κλ, como se demuestra en los experimentos de ADCC y ADCP descritos en este y en el siguiente ejemplo.
[0967] Los ensayos de ADCC se realizaron con PBMC humanas no fraccionadas y células diana de linfoma de células B Raji o Ramos. Los experimentos de dosis-respuesta que se muestran en la Figura 11 demuestran que los cuerpos CD47xCD19 κλ proporcionados en la presente destruyen las células de linfoma de células B de una manera más eficiente que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes. Por lo tanto, la ADCC eficiente depende del acoplamiento conjunto de CD19. La Figura 11C muestra que la eficacia de ADCC con cuerpos CD47xCD19 κλ es comparable a rituximab y que es significativamente mayor que con el CD19 Mab C2.
[0968] EJEMPLO 13: La ADCP mediada por anticuerpos biespecíficos es dependiente de CD19
[0969] La Figura 12 demuestra que los BsAb CD47xCD19 proporcionados en la presente fagocitan las células positivas para CD19 de una manera dependiente de CD19, ya que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes son mucho menos eficientes (si los hay).
[0970] Los experimentos de ADCP se realizaron con macrófagos humanos diferenciados de monocitos de sangre periférica y Raji como células diana. Los macrófagos se incubaron junto con células Raji marcadas con CFSE (relación efector: diana 1:5) durante 2,5 horas a 37 °C en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpo biespecífico o monovalente. Al final del período de incubación, se añadieron anticuerpo anti-CD14 humano biotinilado y Strep-Cy5 para marcar los macrófagos. Después, las células se lavaron y se sometieron a análisis FACS. La fagocitosis se evidenció por eventos doble positivos.
[0971] Los experimentos de dosis-respuesta que se muestran en la Figura 12 demuestran que los cuerpos CD47xCD19 κλ son más potentes que los anticuerpos monovalentes CD47 correspondientes. Por lo tanto, la ADCC eficiente depende del acoplamiento conjunto de CD19. El acoplamiento conjunto de CD19 por el anticuerpo biespecífico impulsa la eficacia. Lo que es más, los experimentos que se muestran en la Figura 12 confirman que el bloqueo de CD47 es necesario para provocar ADCP eficiente, ya que el Mab C2 de CD19, el cual se une a las células diana con alta afinidad, no induce una fagocitosis significativa.
[0972] EJEMPLO 14: Actividad antitumoral in vivo de anticuerpos biespecíficos
[0973] La actividad antitumoral de un cuerpo CD47xCD19 κλ se evaluó en un modelo Raji de linfoma. Se implantaron 2,10<6>células Raji por vía subcutánea en ratones NOD/SCID. Los volúmenes tumorales se midieron 3 veces por semana. Después de que el injerto tumoral alcanzó 0,1 cm<3>, los ratones se asignaron al azar en 5 grupos (5 ratones por grupo) y se inició el tratamiento con anticuerpos. Este experimento comparó el efecto del cuerpo κλ de CD47xCD19 Ka3xD11 con el efecto del anticuerpo monovalente Ka3 y dos Mab de control positivo, el Mab B6H12 de CD47 y rituximab. El anticuerpo se inyectó i. p. tres veces por semana hasta el final del experimento (d25). Se administró rituximab a 200 µg por ratón por inyección. Todos los demás anticuerpos se administraron a 400 µg por ratón por inyección.
[0974] Como se muestra en la Figura 13, la eficacia del Ka3xD11 con cuerpo κλ CD47xCD19 es similar a la de B6H12, que se sabe que se une fuertemente a CD47, bloquea la interacción CD47-SIRPα y suprime el crecimiento tumoral en este modelo de linfoma. Cabe destacar que la eficacia del cuerpo κλ CD47xCD19 también fue comparable a la eficacia de rituximab. El anticuerpo CD47 monovalente fue claramente menos eficaz que el cuerpo κλ biespecífico CD47xCD19, lo que demuestra que la erradicación del tumor depende de CD19.
[0975] EJEMPLO 15: Unión del anticuerpo CD47 a eritrocitos
[0976] Con más de 5 mil millones de células por ml de sangre y 25.000 moléculas de CD47 por célula, los eritrocitos representan potencialmente el principal secuestro de antígenos para los anticuerpos de unión a CD47. Para evaluar el efecto de la adsorción de eritrocitos, los anticuerpos CD47 se incubaron con sangre entera. Después de la incubación, se determinó la fracción de anticuerpos CD47 que quedaba en el plasma mediante ELISA.
[0977] En resumen, se mezclaron 200 µl de sangre completa que contenía un anticoagulante con 20 µl de anticuerpo (110 µl/ml en PBS) y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C con agitación. Después, el plasma se separó de las células mediante centrifugación y la concentración de anticuerpo no unido se determinó mediante ELISA. Para cada anticuerpo probado, los resultados obtenidos se compararon con el control, es decir el mismo anticuerpo añadido directamente al plasma, y se normalizaron contra las IgG no unidas probadas en paralelo.
[0978] La Figura 14 demuestra que los anticuerpos CD47 de afinidad alta y moderada se adsorben de manera eficiente en los eritrocitos. Sin embargo, en el caso de los BsAb, este fenómeno se limita a moléculas que tienen brazos CD47 de alta afinidad, tal como 5A3. Esto sugiere que, en general, los BsAb son menos propensos a la adsorción de eritrocitos y TMDD que los CD47 MAb.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une específicamente a CD47 que comprende:
una región variable de cadena pesada que comprende: una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 1 (CDRH1), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 2 (CDRH2), una región determinante de complementariedad de cadena pesada variable 3 (CDRH3), y
una región variable de cadena ligera que comprende: una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 1 (CDRL1), una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 2 (CDRL2) y una región determinante de complementariedad de cadena ligera variable 3 (CDRL3), en donde
i) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
ii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246;
iii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255;
iv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 231; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 247;
v) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 235; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250;
vi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248;
vii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 234; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246;
viii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 228; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246;
ix) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 237; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 246;
x) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 236; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
xi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3
comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 260;
xii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 257;
xiii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
xiv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 229; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 259;
xv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 236; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250;
xvi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 258;
xvii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 233; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 250;
xviii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 235; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256;
xix) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 239; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255;
xx) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 248;
xxi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 236; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 255;
xxii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 251;
xxiii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 241; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 249;
xxiv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 238; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256;
xxv) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254;
xxvi) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 232; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 256; o
xxvii) la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 235; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 225; la CDRH2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 226; la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 227; la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 240; la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 242; y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 254, o la SEQ ID NO: 246.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168, 120, 182, 126, 128, 124, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 162, 164, 170, 174, 176 o 184.
4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 114 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 168, o la SEQ ID NO: 120.
5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es un fragmento de unión al antígeno y en donde el fragmento de unión al antígeno es un scFv, un Fv, un Fab, un Fab', un F(ab)2 o un F(ab')2.
6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monovalente o un anticuerpo monoespecífico.
7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo es un anticuerpo bivalente o un anticuerpo biespecífico.
8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo además se une a un antígeno no humano.
10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el anticuerpo además se une a un antígeno asociado a tumor (TAA).
11. El anticuerpo de la reivindicación 10, en donde el TAA es CD19, CD20, HER2, HER3, EGFR, IGF1R, c-Met, PDGFR1, CD40, CD40L, CD30, CS1, CD70, glipicano, mesotelina, PSMA, PSCA, MUC1, CA125, CEA, FRA, EpCAM, DR5, HGFR1 o 5T4, preferentemente en donde el TAA es CEA.
12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo comprende dos copias de un polipéptido de cadena pesada sencilla y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en donde la primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.
13. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde por lo menos una porción de la primera cadena ligera es del tipo Kappa y por lo menos una porción de la segunda cadena ligera es del tipo Lambda.
14. El anticuerpo de la reivindicación 13, en donde la primera cadena ligera comprende por lo menos una región constante Kappa.
15. El anticuerpo de la reivindicación 14, en donde la segunda cadena ligera comprende por lo menos una región constante Lambda.
16. El anticuerpo de la reivindicación 14, en donde la segunda cadena ligera además comprende una región
variable Lambda o una región variable Kappa.
17. El anticuerpo de la reivindicación 12, en donde la primera cadena ligera comprende una región constante Kappa y una región variable Kappa, y en donde la segunda cadena ligera comprende una región constante Lambda y una región variable Lambda.
18. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo completamente humano.
19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
20. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-19, para su uso en un método para tratar el cáncer, opcionalmente en donde el cáncer es leucemia, linfoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, glioma, cáncer de pulmón, cáncer bronquial, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de esófago, cáncer de hígado, cáncer urinario, cáncer de riñón, cáncer de pelvis, cáncer de cavidad oral, cáncer de faringe, cáncer de cuerpo uterino o melanoma.
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