ES3069712T3

ES3069712T3 - Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells

Info

Publication number: ES3069712T3
Application number: ES12860751T
Authority: ES
Inventors: Alireza Rezania
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2026-06-10
Anticipated expiration: 2032-12-07
Also published as: US20130189777A1; AU2019201293A1; CA2860107A1; CN105143446A; RS68035B1; US12215354B2; BR112014015417A2; JP2015503331A; KR102203056B1; PT2794857T; AR089426A1; KR20200030133A; US20220275340A1; EP2794857A4; BR112014015417A8; FI2794857T3; US9388386B2; US20150353895A1; JP2021052789A; US20190292523A1

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes. En particular, la presente invención proporciona métodos para producir una población de células en la que más del 10 % de las células de la población expresan marcadores característicos de las células beta pancreáticas hormonales individuales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células monohormonales positivas para insulinaCAMPO DE LA INVENCIÓN

[0003] La presente invención pertenece al campo de la diferenciación celular. Más específicamente, la invención se refiere a un método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes en una población de células del linaje del endodermo pancreático, tal como se expone en las reivindicaciones, por ejemplo, en la que más del 10 % de las células de la población diferenciada son células monohormonales positivas para la insulina. Además, la invención se refiere a un método in vitro para diferenciar células madre embrionarias humanas en células beta pancreáticas, tal como se expone en las reivindicaciones.

[0004] ANTECEDENTES

[0005] Los avances en la terapia de sustitución celular para la diabetes mellitus tipo I y la escasez de islotes de Langerhans trasplantables han centrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células β, adecuadas para el injerto. Un enfoque es la generación de células β funcionales a partir de células madre pluripotentes como, por ejemplo, las células madre embrionarias.

[0006] En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da lugar a un grupo de células que comprenden tres capas germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Tejidos como la tiroides, el timo, el páncreas, el intestino y el hígado se desarrollarán a partir del endodermo, a través de una etapa intermedia. Una etapa intermedia en este proceso es la formación del endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan una serie de marcadores, como HNF3beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 y SOX17.

[0007] Al final de la gastrulación, el endodermo se divide en dominios anterior-posterior que pueden reconocerse por la expresión de un panel de factores que marcan unívocamente las regiones anterior, media y posterior del endodermo. Por ejemplo, Hhex y Sox2 identifican la región anterior, mientras que Cdx1, 2 y 4 identifican la mitad posterior del endodermo.

[0008] La migración del tejido endodérmico sitúa en estrecha cercanía el endodermo con diferentes tejidos mesodérmicos que ayudan a la regionalización del tubo digestivo. Esto se logra mediante una gran abundancia de factores secretados, como los FGF, los Wnt, los TGF-B, el ácido retinoico (RA) y los ligandos BMP y sus antagonistas. Por ejemplo, el FGF4 y el BMP promueven la expresión de Cdx2 en el endodermo del intestino posterior presuntivo y reprimen la expresión de los genes anterioresHhexy SOX2 (Development 2000, 127:1563-1567). También se ha demostrado que la señalización de WNT funciona en paralelo a la señalización de FGF para promover el desarrollo del intestino posterior e inhibir el destino del intestino anterior (Development 2007, 134:2207-2217). Por último, el ácido retinoico secretado por el mesénquima regula el límite entre el intestino anterior y el intestino posterior (Curr Biol 2002, 12:1215-1220).

[0009] El nivel de expresión de factores de transcripción específicos puede usarse para designar la identidad de un tejido. Durante la transformación del endodermo definitivo en un tubo digestivo primitivo, el tubo digestivo se regionaliza en amplios dominios que pueden observarse a nivel molecular mediante patrones de expresión génica restringidos. Por ejemplo, el dominio regionalizado del páncreas en el tubo digestivo muestra una expresión muy alta de PDX-1 y una expresión muy baja de CDX2 y SOX2. De manera similar, la presencia de niveles elevados de Foxel es indicativa de tejido esofágico; NKX2.1 se expresa en gran medida en el tejido pulmonar; SOX2/Odd1 (OSR1) se expresan en gran medida en el tejido estomacal; la expresión de PROX1/Hhex/AFP es elevada en el tejido hepático; SOX17 se expresa en gran medida en los tejidos de la estructura biliar; PDX1, NKX6.1/PTfla y NKX2.2 se expresan en gran medida en el tejido pancreático; y la expresión de CDX2 es alta en el tejido intestinal. El resumen anterior está adaptado de Dev Dyn 2009, 238:29-42 y Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251.

[0010] La formación del páncreas surge a partir de la diferenciación del endodermo definitivo en endodermo pancreático (Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251; Dev Dyn 2009, 238:29-42). Los dominios pancreáticos dorsal y ventral surgen del epitelio del intestino anterior. El intestino anterior también da lugar al esófago, la tráquea, los pulmones, la tiroides, el estómago, el hígado, el páncreas y el sistema de conductos biliares.

[0011] Las células del endodermo pancreático expresan el gen homeobox pancreático-duodenal PDX1. En ausencia de PDX1, el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de yemas ventrales y dorsales. Por tanto, la expresión de PDX1 marca un paso crítico en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos exocrino y endocrino surgen de la diferenciación del endodermo pancreático.

[0012] [0009]D'Amouret al.describe la producción de cultivos enriquecidos de endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una alta concentración de activina y bajo nivel de suero (Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541; Patente de Estados Unidos Nº 7.704.738). El trasplante de estas células bajo la cápsula renal de ratones dio como resultado la diferenciación en células más maduras con características de tejido endodérmico (Patente de Estados Unidos Nº 7.704.738). Las células del endodermo definitivo derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse adicionalmente en células PDX1 positivas después de la adición de FGF-10 y ácido retinoico (Publicación de patente de Estados Unidos Nº 2005/0266554A1). El posterior trasplante de estas células precursoras pancreáticas bajo la cápsula renal de ratones inmunodeficientes dio como resultado la formación de células endocrinas pancreáticas funcionales tras una fase de maduración de 3 a 4 meses (Patente de Estados Unidos Nº 7.993.920 y Patente de Estados Unidos Nº 7.534.608).

[0013] Fisket al.notifican un sistema para producir células de islotes pancreáticos a partir de células madre embrionarias humanas (Patente de Estados Unidos Nº 7.033.831). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Primero, las células madre embrionarias humanas se diferenciaron en endodermo usando una combinación de butirato de sodio y activina A (Patente de Estados Unidos Nº 7.326.572,). A continuación, las células se cultivaron con antagonistas de BMP, como Noggin, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo con nicotinamida.

[0014] Para la inducción de células precursoras endocrinas pancreáticas también se han usado inhibidores de moléculas pequeñas. Por ejemplo, se han usado inhibidores de moléculas pequeñas del receptor TGF-B y de los receptores BMP (Development 2011, 138:861-871; Diabetes 2011, 60:239-247) para aumentar significativamente el número de células endocrinas pancreáticas. Además, también se han usado activadores de moléculas pequeñas para generar células del endodermo definitivo o células precursoras pancreáticas (Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).

[0015] Los intentos previos de inducción de células precursoras pancreáticas a partir de células madre embrionarias humanas han resaltado la importancia de la coexpresión de PDX-1 y NKX6.1 para identificar correctamente el endodermo pancreático. Sin embargo, aunque la técnica ha identificado que la población de células positivas en la expresión de PDX-1 y NKX6.1 tiene una expresión baja o ausente de CDX2, los informes previos no han probado la presencia de marcadores justo anteriores al páncreas en desarrollo. SOX2, que marca el endodermo anterior, no se expresa en los islotes adultos y se expresa a un nivel muy bajo en el páncreas en desarrollo (Diabetes 2005, 54:3402-4309). Por el contrario, algunos de los ejemplos de esta aplicación revelan poblaciones celulares en las que por lo menos el 30 % de las células del endodermo pancreático generadas a partir de células madre embrionarias humanas son positivas para la expresión de PDX-1 y NKX6.1, y negativas para la expresión de CDX2 y SOX2.

[0016] Todos los intentos anteriores de generar células beta pancreáticas funcionales no han logrado obtener células con las características de las células beta maduras. Las características distintivas de las células beta maduras incluyen la expresión de una insulina monohormonal, el procesamiento correcto de la proinsulina en insulina y péptido C, la expresión fuerte de PDX-1 y NKX6.1, la liberación adecuada de insulina en respuesta a la glucosa, la expresión de transportadores de glucosa y la expresión elevada de glucoquinasa. Todos los informes anteriores han dado como resultado células endocrinas que producen dos o más hormonas pancreáticas. Por ejemplo, D'Amour et al (Nature Biotech 2006, 24:1392-1401) informan de la generación de una población celular que comprende aproximadamente un 10 % de células positivas para insulina y aproximadamente un 20 % de células endocrinas, según se mide mediante sinaptofisina. Otros informes similares (Cell Res 2009, 19:429-438; Stem Cells 2007, 25:1940-1953; Diabetes Obes Metab 2008, 10:186-194) también han demostrado la diferenciación de células pluripotentes en células positivas para insulina no funcionales. De hecho, estudios recientes han establecido claramente que el trasplante de células polihormonales en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) no dio como resultado una generación de células beta funcionales (Diabetes 2011, 60:239-247; Nature Biotech 2011, 29:750-756). Mientras que en el páncreas fetal humano una fracción (aproximadamente del 10 al 20 %) de las células endocrinas son células polihormonales, las células polihormonales desaparecen en el páncreas humano adulto (, Histochem Cell Biol 1999, 112:147-153; J Histochem Cytochem 2009, 57:811-824).

[0017] A medida que el floreciente campo de la medicina regenerativa sigue madurando, resulta sumamente deseable disponer de un método para la formación de células endocrinas pancreáticas diferenciadas terminalmente y adecuadamente reguladas. Aquí demostramos que, con una manipulación adecuada y definida de las condiciones de cultivo y una sincronización precisa de la adición de activadores/inhibidores de varias vías, las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarsein vitroen células beta pancreáticas funcionales. En particular, la sincronización precisa de la inhibición de BMP, usando un gradiente de ácido retinoico junto con el uso de vitamina C, resultó eficaz en la generación de células endocrinas pancreáticas monohormonales.

[0018] RESUMEN

[0019] La presente invención se refiere a las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones y descritas a continuación en al presente.

[0020] [0016] Por consiguiente, la invención se refiere a un método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes en una población de células del linaje del endodermo pancreático, que comprende cultivarlas células en cada etapa de diferenciación en un medio que comprenda de 5 mM a 20 mM de glucosa, en el que la diferenciación escalonada comprende los pasos de

[0021] (a) diferenciar células pluripotentes en células del endodermo definitivo (DE) cultivando las células pluripotentes en un medio que comprenda de 5 mM a 20 mM de glucosa suplementado con un ligando de TGF-B y un activador de WNT,

[0022] (b) diferenciar las células DE en células del tubo digestivo cultivando las células DE en un medio que comprenda de 5 mM a 20 mM de glucosa suplementado con un ligando de FGF, y

[0023] (c) cultivar dichas células del tubo digestivo en un medio que comprenda de 5 mM a 20 mM de glucosa suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP.

[0024] Además, la invención se refiere a un método in vitro para diferenciar células madre embrionarias humanas en células beta pancreáticas que comprende:

[0025] a) cultivar células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio suplementado con un ligando de TGF-B y un activador de WNT, para generar una población de células del endodermo definitivo (DE);

[0026] b) cultivar las células DE en un medio suplementado con un ligando de FGF para generar una población de células del tubo digestivo;

[0027] c) cultivar las células del tubo digestivo en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células del endodermo del intestino anterior posterior que expresen PDX-1 y SOX2;

[0028] d) cultivar las células del endodermo del intestino anterior posterior en un medio suplementado con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células del intestino anterior pancreático que expresen PDX-1 y NKX6.1, y que expresen un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior posterior;

[0029] e) cultivar las células del intestino anterior pancreático posterior en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide para obtener una población de células del endodermo pancreático que expresen PDX-1, un nivel más alto de NKX6.1 y un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior pancreático; y

[0030] f) diferenciar las células del endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas, lo que comprende cultivar las células en medio;

[0031] en el que el medio en cada uno de los pasos a) a f) comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

[0032] A modo ilustrativo, se divulga una población de células del linaje del endodermo pancreático obtenida in vitro mediante la diferenciación escalonada de células pluripotentes. El medio usado en cada paso de la diferenciación se suplementa con glucosa. En algunas realizaciones, en cada paso de la diferenciación, las células se cultivan en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

[0033] En algunas realizaciones, la diferenciación de células madre pluripotentes genera una población de células del endodermo pancreático en la que más del 10 % de las células de la población diferenciada expresan marcadores característicos de las células beta pancreáticas monohormonales.

[0034] En algunas realizaciones, la diferenciación de células madre pluripotentes genera una población de células del endodermo pancreático en la que más del 30 % de la población diferenciada es positiva para la expresión de PDX-1 y NKX6.1, mientras que es negativa para la expresión de CDX2 y SOX2.

[0035] En algunas realizaciones, la diferenciación escalonada comprende cultivar las células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio suplementado adicionalmente con un ligando de TGF-B. En algunas realizaciones, la diferenciación escalonada comprende cultivar las células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio suplementado adicionalmente con un activador de WNT. La diferenciación escalonada comprende cultivar la células del endodermo definitivo en un medio suplementado adicionalmente con un ligando de FGF. La diferenciación escalonada puede comprender cultivar la células del tubo digestivo en un medio suplementado adicionalmente con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un gradiente de un inhibidor de BMP. En algunas realizaciones, la diferenciación escalonada comprende cultivar la células del intestino anterior posterior en un medio suplementado adicionalmente con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas realizaciones, la diferenciación escalonada comprende cultivar la células en un medio suplementado adicionalmente con ácido ascórbico.

[0036] [0022] La invención proporciona un método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes en una población de células del linaje del endodermo pancreático, que comprende cultivar la células en cada etapa de diferenciación en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa. El método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células pluripotentes en células del endodermo definitivo (DE) cultivando las células pluripotentes en un medio suplementado con un ligando de TGF-B y un activador de WNT. El método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células DE en células del tubo digestivo cultivando las células DE en un medio suplementado con un ligando de FGF. En algunas realizaciones, el método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células del tubo digestivo en células del endodermo del intestino anterior posterior cultivando las células del tubo digestivo en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas realizaciones, el método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células del tubo digestivo en células del endodermo del intestino anterior posterior cultivando las células del tubo digestivo en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas realizaciones, el método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células del endodermo del intestino anterior posterior en células del intestino anterior pancreático cultivando las células del endodermo del intestino anterior posterior en un medio suplementado con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas realizaciones, el método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células del intestino anterior pancreático en células del endodermo pancreático cultivando las células del intestino anterior pancreático en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide. En algunas realizaciones, el método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes comprende además diferenciar las células del endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas.

[0038] En una realización, en por lo menos un paso del método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes, el medio se suplementa además con ácido ascórbico. En algunas realizaciones, más del 10 % de las células de la población diferenciada son células monohormonales positivas para insulina. En algunas realizaciones, más del 30 % de las células del endodermo pancreático en cultivo generadas por los métodos de la invención son PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- y CDX2-.

[0040] Se divulga además, con propósitos de ilustración, un método in vitro para diferenciar células madre embrionarias humanas en células beta pancreáticas que comprende: a) cultivar células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio suplementado con glucosa, un ligando de TGF-B y un activador de WNT, para generar una población de células del endodermo definitivo (DE); b) cultivar las células DE en un medio suplementado con glucosa y un ligando de FGF para generar una población de células del tubo digestivo; c) cultivar las células del tubo digestivo en un medio suplementado con glucosa, un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un gradiente de un inhibidor de BMP para generar una población de células del endodermo del intestino anterior posterior que expresen PDX-1 y SOX2; d) cultivar las células del intestino anterior posterior en un medio suplementado con glucosa, un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células del intestino anterior pancreático que expresen PDX-1 y NKX6.1, y que expresen un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior posterior; e) cultivar las células del intestino anterior pancreático en un medio suplementado con glucosa, un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide para obtener una población de células del endodermo pancreático que expresen PDX-1, un nivel más alto de NKX6.1 y un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior pancreático; y f) diferenciar las células del endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas. En algunas realizaciones, la población de células beta pancreáticas generada por los métodos de la invención es PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- y CDX2-. En algunas realizaciones, el medio en por lo menos un paso del método de diferenciación escalonada se suplementa además con ácido ascórbico. En algunas realizaciones, las células beta pancreáticas obtenidas mediante los métodos de la invención son células monohormonales productoras de insulina que también son NKX6.1+ y PDX-1+.

[0042] BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0044]

[0046] La Figuras 1A a 1G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 2 de S3 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1. FIG. 1A: control de isotipo; FIG. 1B: cromogranina; FIG. 1C: KI-67; FIG. 1D: NKX6.1; FIG. 1E: SOX2; FIG. 1F: CDX2; FIG. 1G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0047] Las Figuras 2A a 2G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas en el día 2 de S4. FIG.2A: control de isotipo; FIG.

[0048] 2B: cromogranina; FIG. 2C: KI-67; FIG. 2D: NKX6.1; FIG. 2E: SOX2; FIG. 2F: CDX2; FIG. 2G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0049] Las Figuras 3A a 3G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas en el día 2 de S5. FIG.3A: control de isotipo; FIG.

[0050] 3B: cromogranina; FIG. 3C: KI-67; FIG. 3D: NKX6.1; FIG. 3E: SOX2; FIG. 3F: CDX2; FIG. 3G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0051] Las Figuras 4A a 4G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas en el día 7 de S5. FIG.4A: control de isotipo; FIG.

[0052] 4B: cromogranina; FIG. 4C: KI-67; FIG. 4D: NKX6.1; FIG. 4E: SOX2; FIG. 4F: CDX2; FIG. 4G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0053] Las Figuras 5A a 5C muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas en el día 2 de S5. FIG.5A: cromogranina (eje y) y CDX2 (eje x); FIG.5B: cromogranina (eje y) y SOX2 (eje x); FIG. 5C: cromogranina (eje y) y NKX6.1 (eje x). En cada histograma se muestra el porcentaje de coexpresión para cada gráfico.

[0054] Las Figuras 6A a 6T muestran los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas en S2, S3, S4 y S5. FIG.6A: CDX2; FIG.6B: CD142; FIG.6C: FOXE1; FIG.6D: HNF4-alfa; FIG.6E: NKX2.1; FIG. 6F: NKX2.2; FIG. 6G: NKX6.1; FIG.6H: OSR1; FIG. 6I: PDX-1; FIG. 6J: PROX1; FIG. 6K: PTF1a; FIG. 6L: SOX17; FIG. 6M: SOX2; FIG. 6N: insulina; FIG. 6O: ZIC1; FIG. 6P: cromogranina; FIG. 6Q: glucagón; FIG.6R: Ngn3; FIG.6S: NeuroD; FIG.6T: somatostatina.

[0055] Las Figuras 7A a 7G representan los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea celular H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 2 y recogidas en el día 3 de S2, S3 o S4. FIG. 7A: NKX6.1; FIG. 7B: PDX-1; FIG. 7C: cromogranina; FIG. 7D: NGN3; FIG. 7E: CDX2; FIG. 7F: albúmina; FIG.7G: SOX2.

[0056] Las Figuras 8A a 8G representan los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes marcadores en células H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 3 y recogidas en S2, S3, S4 o S5. FIG. 8A: NKX6.1; FIG. 8B: PDX-1; FIG. 8C: NGN3; FIG. 8D: NeuroD; FIG. 8E: cromogranina; FIG. 8F: CDX2; FIG. 8G: SOX2.

[0057] Las Figuras 9A a 9H representan los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes marcadores en células H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 4 y recogidas en el día 4 de S3 y S4. FIG.9A: NKX6.1; FIG. 9B: PDX-1; FIG. 9C: cromogranina; FIG. 9D: NGN3; FIG. 9E: NeuroD; FIG. 9F: CDX2; FIG. 9G: albúmina; FIG.9H: SOX2.

[0058] Las Figuras 10A a 10H representan los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 5 y recogidas en la etapa 4. FIG. 10A: NKX6.1; FIG 10B: PDX-1; FIG 10C: cromogranina; FIG 10D: NGN3; FIG 10E: NeuroD; FIG 10F: CDX2; FIG 10G: albúmina; FIG 10H: SOX2.

[0059] Las Figuras 11A a 11H muestran los datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 6 y recogidas en el día 3 de S3 o S6. FIG. 11A: NKX6.1; FIG. 11B: PDX-1; FIG. 11C: cromogranina; FIG. 11D: NGN3; FIG.11E: NeuroD; FIG.11F: CDX2; FIG.11G: albúmina; FIG.11H: SOX2.

[0060] Las Figuras 12A a 12G muestran los datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 7 y recogidas en el día 3 de S3, S4 o S5. FIG.12A: NKX6.1; FIG.12B: PDX-1; FIG.12C: cromogranina; FIG.12D: NGN3; FIG.12E: NeuroD; FIG.12F: CDX2; FIG.12G: SOX2.

[0061] Las Figuras 13A a 13G representan los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 8 y recogidas en S3, S4, S5 o S6. FIG.13A: NKX6.1; FIG.13B: PDX-1; FIG.13C: cromogranina; FIG.

[0062] 13D: NGN3; FIG.13E: NeuroD; FIG.13F: CDX2; FIG.13G: SOX2.

[0063] Las Figuras 14A a 14H muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 4 de S3 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9. FIG. 14A: control de isotipo; FIG. 14B: cromogranina; FIG.14C: KI-67; FIG.14D: NKX6.1; FIG.14E: SOX2;

[0064] FIG.14F: HNF3B; FIG.14G: CDX2; FIG.14H: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0065] Las Figuras 15A a 15G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 2 de S4 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9. FIG. 15A: control de isotipo; FIG. 15B: NKX6.1; FIG.15C: KI-67; FIG.15D: cromogranina; FIG.15E: SOX2; FIG.15F CDX2; FIG.15G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0066] Las Figuras 16A a 16F muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 4 de S4 de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9. FIG.16A: control de isotipo; FIG.16B: NKX6.1; FIG.16C: cromogranina; FIG.16D: SOX2; FIG.16E: CDX2; FIG.16F: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0067] Las Figuras 17A a 17J muestran los datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9 y recogidas en S1D3, S2D3, S3D4, S4D2 y S4D4. FIG. 17A: CDX2; FIG. 17B: HHex; FIG. 17C: FOXE1; FIG.

[0068] 17D: IPF1 (PDX-1); FIG.17E: NKX2.1; FIG.17F: NKX2.2; FIG.17G: NKX6.1; FIG.17H: PROX1; FIG.17I: SOX2; FIG.17J: SOX9.

[0069] Las Figuras 18A a 18G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 3 de S3 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 10. FIG.18A: Control de isotipo; FIG.18B: NKX6.1; FIG.18C: cromogranina; FIG.18D: SOX2; FIG.18E: CDX2; FIG.18F: KI-67; FIG.18G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0070] Las Figuras 19A a 19G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 5 de S4 de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 10. FIG. 19A: control de isotipo; FIG. 19B: NKX6.1; FIG.19C: cromogranina; FIG.19D: SOX2; FIG.19E: CDX2; FIG.19F: KI-67; FIG.19G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0071] Las Figuras 20A a 20J muestran el análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 11. FIG.

[0072] 20A: somatostatina; FIG.20B: PDX1; FIG.20C: Pax6; FIG.20D: Pax4;

[0073] FIG. 20E: NKX6.1; FIG. 20F: NGN3; FIG. 20G: glucagón; FIG. 20H: NeuroD; FIG. 20I: insulina; FIG. 20J: cromogranina.

[0074] Las Figuras 21A a 21J muestran los datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 12 y recogidas en el día 2 de S4, el día 2 de S5 y el día 9 de S5. FIG 21A: somatostatina; FIG 21B: PDX1; FIG 21C: Pax6; FIG 21D: Pax4; FIG 21E: NKX6.1; FIG 21F: NGN3; FIG 21G: NeuroD; FIG 21H: insulina; FIG 21I: glucagón; FIG 21J: cromogranina.

[0075] Las Figuras 22A a 22L muestran datos de análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 13 y recogidas en el día 3 de S5. FIG.22A: Pax4; FIG.22B: Pax6; FIG.22C: PDX1; FIG.22D: PTF1a; FIG.22E: glucagón; FIG.

[0076] 22F: insulina; FIG.22G: NeuroD; FIG.22H: ngn3; FIG.22I: Zic1; FIG.22J: CDX2; FIG.22K: albúmina; FIG. 22L: NKX6.1.

[0078] DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0080] Para mayor claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la presente invención.

[0082] Definiciones

[0084] Las células madre son células indiferenciadas que se definen por su capacidad, a nivel de células individuales, tanto para autorrenovarse como para diferenciarse. Las células madre pueden producir células de la progenie, incluidas progenitoras autorrenovables, progenitoras no renovables y células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarsein vitroen células funcionales de diversos linajes celulares a partir de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre también dan lugar a tejidos de múltiples capas germinales tras el trasplante y contribuyen sustancialmente a la mayoría, si no a la totalidad, de los tejidos tras su inyección en blastocistos.

[0086] Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1) totipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotentes, lo que significa que son capaces de dar lugar a un único linaje celular (por ejemplo, las células madre espermatogénicas).

[0088] La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o una célula inducida por diferenciación es aquella que ha adoptado una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometida", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la vía de diferenciación hasta un punto en el que, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o un subconjunto de tipos de células específico y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciada. La "desdiferenciación" se refiere al proceso mediante el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Tal como se usa en la presente, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula sitúa a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico del linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de las células de un linaje de interés y puede usarse para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida con el linaje de interés.

[0090] Los "marcadores", tal como se usan en la presente, son moléculas de ácidos nucleicos o polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, la expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del ácido nucleico o polipéptido marcador es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de tal manera que la célula de interés puede identificarse y distinguirse de otras células usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

[0091] Tal como se usa en la presente, una célula es "positiva para" un marcador específico o "positiva" cuando se detecta el marcador específico en la célula. De manera similar, la célula es "negativa para" un marcador específico o "negativa" cuando no se detecta el marcador específico en la célula.

[0092] Tal como se usa en la presente, "etapa 1" y "S1" se usan indistintamente para identificar células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo (DE).

[0093] "Endodermo definitivo", tal como se usa en la presente, se refiere a las células que poseen las características de las células que surgen del epiblasto durante la gastrulación y que forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1.

[0094] "Tubo digestivo", tal como se usa en la presente, se refiere a las células derivadas del endodermo definitivo que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: HNF3-beta, HNF1-beta o HNF4-alfa. Las células del tubo digestivo pueden dar lugar a todos los órganos endodérmicos, como los pulmones, el hígado, el páncreas, el estómago y el intestino.

[0095] En la presente, los términos "etapa 2" y "S2", que identifican a las células que expresan marcadores característicos del tubo digestivo primitivo, se usan indistintamente.

[0096] "Endodermo del intestino anterior" se refiere a las células del endodermo que dan lugar al esófago, los pulmones, el estómago, el hígado, el páncreas, la vesícula biliar y una parte del duodeno.

[0097] "Intestino anterior posterior" se refiere a las células del endodermo que pueden dar lugar al estómago posterior, el páncreas, el hígado y una parte del duodeno.

[0098] "Endodermo del intestino medio" se refiere a las células del endodermo que pueden dar lugar al intestino, partes del duodeno, el apéndice y el colon ascendente.

[0099] "Endodermo del intestino posterior" se refiere a las células del endodermo que pueden dar lugar al tercio distal del colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide y el recto.

[0100] Tanto "etapa 3" como "S3" se usan indistintamente para identificar las células que expresan marcadores característicos del endodermo del intestino anterior. Las "células que expresan marcadores característicos del linaje del intestino anterior", tal como se usan en la presente, se refieren a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2 y HNF4 alfa.

[0101] En la presente "etapa 4" y "S4" se usan indistintamente para identificar las células que expresan marcadores característicos del precursor del intestino anterior pancreático. Las "células que expresan marcadores característicos del linaje precursor del intestino anterior pancreático", tal como se usan en la presente, se refieren a las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 y HNF4 alfa.

[0102] Tal como se usan en la presente, "etapa 5" y "S5" se usan indistintamente para identificar células que expresan marcadores característicos del endodermo pancreático y de las células precursoras endocrinas pancreáticas.

[0103] Las "células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", tal como se usan en la presente, se refieren a células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 o PROX1. Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático no expresan sustancialmente CDX2 o SOX2.

[0104] Tal como se usan en la presente, "etapa 6" y "S6" se usan indistintamente para identificar células enriquecidas en células endocrinas pancreáticas.

[0105] "Célula endocrina pancreática", "célula que expresa hormonas pancreáticas" o "células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático", tal como se usan en la presente, se refieren a una célula capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, grelina y polipéptido pancreático.

[0106] "Célula precursora endocrina pancreática" o "célula progenitora endocrina pancreática" se refiere a las células del endodermo pancreático capaces de convertirse en una célula que expresa hormonas pancreáticas. Dicha célula puede expresar por lo menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NKX2.2, NeuroD, ISL-1, Pax4, Pax6 o ARX.

[0107] "Célula beta pancreática funcional", tal como se usa en la presente, se refiere a una célula monohormonal positiva para insulina capaz de responder a la glucosa y positiva para PDX-1 y NKX6.1.

[0108] En la presente "d1", "d 1" y "día 1"; "d2", "d 2" y "día 2"; "d3", "d 3" y "día 3", etc. se usan indistintamente. Estas combinaciones de números y letras especifican el día de incubación en las diferentes etapas durante el protocolo de diferenciación escalonada de la presente solicitud.

[0109] En la presente, "ácido ascórbico" y "vitamina C" se usan indistintamente y se refieren a un nutriente esencial para los humanos y otras especies animales.

[0110] En la presente, "glucosa" y "D-glucosa" se usan indistintamente y se refieren a la dextrosa, un azúcar que se encuentra comúnmente en la naturaleza.

[0111] Una célula "positiva" para un marcador específico o que es "+" para ese marcador (es decir, PDX-1+) es una célula en la que puede detectarse ese marcador en particular. Una célula "negativa" para un marcador específico o que es "-" para ese marcador (es decir, NKX6.1-) es una célula en la que no se detecta el marcador mediante los métodos enseñados en la presente memoria descriptiva.

[0112] En la presente solicitud, "cromogranina" y "CHGN" se usan indistintamente para identificar el gen que codifica la glicoproteína secretora ácida cromogranina.

[0113] En la presente, "NeuroD" y "NeuroD1" se usan indistintamente para identificar una proteína expresada en las células progenitoras endocrinas pancreáticas y el gen que la codifica.

[0114] En la presente, "LDN" y "LDN-193189" se usan indistintamente para indicar un inhibidor del receptor de BMP disponible en Stemgent, CA, EE. UU.

[0115] Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes

[0116] Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más de los antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4, y marcadores detectables usando anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998, que se cita solo con fines ilustrativos). La diferenciación de las células madre pluripotentesin vitroda como resultado la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Las células madre pluripotentes indiferenciadas tienen típicamente actividad de fosfatasa alcalina, que puede detectarse fijando las células con paraformaldehído al 4 % y desarrollándolas con Vector Red como sustrato, tal como describe el fabricante (Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Las células madre pluripotentes indiferenciadas también expresan típicamente OCT4 y TERT, según se detecta mediante RT-PCR.

[0117] Otro fenotipo deseable de las células madre pluripotentes propagadas es su potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos del endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre puede confirmarse, por ejemplo, inyectando células en ratones SCID, fijando los teratomas que se forman usando paraformaldehído al 4 % y a continuación examinándolos histológicamente para buscar evidencias de tipos de células de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia puede determinarse mediante la creación de cuerpos embrioides y la evaluación de los cuerpos embrioides para detectar la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

[0118] Las líneas de células madre pluripotentes propagadas pueden cariotiparse usando una técnica estándar de bandeo G y compararse con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable obtener células que tengan un "cariotipo normal", lo que significa que las células son euploides, en las que están presentes todos los cromosomas humanos y no presentan alteraciones apreciables. Las células pluripotentes pueden expandirse fácilmente en cultivo usando varias capas alimentadoras o usando recipientes recubiertos con proteína de la matriz. Alternativamente, para la expansión rutinaria de las células pueden usarse superficies químicamente definidas en combinación con medios definidos, como el medio mTesr™ 1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá). Las células pluripotentes pueden eliminarse fácilmente de las placas de cultivo usando medios enzimáticos, mecánicos o varios quelantes de calcio, como el EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Alternativamente, las células pluripotentes pueden expandirse en suspensión en ausencia de proteínas de la matriz o de una capa alimentadora.

[0119] Fuentes de células madre pluripotentes

[0120] [0058] Los tipos de células madre pluripotentes que se describen en la presente por referencia incluyen líneas establecidas de células pluripotentes derivadas de tejido formado después de la gestación, lo que incluye tejido preembrionario (como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente, antes de aproximadamente de 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos de referencia no limitativos son las líneas establecidas de células madre embrionarias humanas (hESC) o células germinales embrionarias humanas como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1, H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, WI, EE. UU.). También se divulgan células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas en ausencia de células alimentadoras. Son adecuadas las células pluripotentes inducibles (IPS) o las células pluripotentes reprogramadas que pueden derivarse de células somáticas adultas usando la expresión forzada de una serie de factores de transcripción relacionados con la pluripotencia, como OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165-185). Como se divulga a modo de referencia, las células madre embrionarias humanas pueden prepararse tal como se describe en Thomsonet al.(Patente de Estados Unidos Nº 5.843.780; Science, 1998, 282:1145; Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92:7844), que se cita solo como referencia.

[0121] Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático a partir de células madre pluripotentes

[0122] Las características de las células madre pluripotentes son bien conocidas por los expertos en la materia, y se siguen identificando características adicionales de las células madre pluripotentes. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

[0123] Las células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07) y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia), que se divulgan por referencia. Para su uso en la presente invención son adecuadas las células que expresan por lo menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 y Tra 1-81.

[0124] Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína homeobox similar a Mix, FGF4, CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. En la presente se divulga una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo puede ser una célula precursora de la línea primitiva. Alternativamente, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo puede ser una célula del mesendodermo. Alternativamente, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo puede ser una célula del endodermo definitivo.

[0125] Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 y PROX1. Además, en la presente se divulga una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático puede ser una célula del endodermo pancreático en la que la expresión de PDX-1 y NKX6.1 es sustancialmente mayor que la expresión de CDX2 y SOX2.

[0126] Los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 y PAX6. Una célula endocrina pancreática puede ser capaz de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. También se divulga una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático puede ser una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que expresa hormonas pancreáticas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormonas pancreáticas.

[0127] Además, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que exprese marcadores característicos del linaje de células β. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células β expresa PDX1 y por lo menos uno de los siguientes factores de transcripción: NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células β puede ser una célula β.

[0128] Además, en la presente se divulga un método in vitro y una población celular que pueden generar células monohormonales positivas para insulina que también son positivas para PDX-1 y NKX6.1. El método puede incluir una serie de etapas que dirigen, de manera escalonada, la diferenciación de células pluripotentes humanas en células monohormonales a través de las siguientes etapas intermedias:

[0129] a) generación de células del endodermo definitivo (DE) a partir de células madre embrionarias humanas indiferenciadas, que comprende cultivar la células pluripotentes en un medio que comprenda glucosa, un ligando de TGF-B y un activador de WNT;

[0130] b) diferenciación de células DE en células del tubo digestivo, que comprende cultivar la células DE en un medio que comprenda glucosa, vitamina C y un ligando de FGF;

[0131] c) diferenciación de las células del tubo digestivo en células del endodermo del intestino anterior posterior que expresen PDX-1 y SOX2. Esta diferenciación se logra cultivando las células del tubo digestivo en presencia de un inhibidor de shh, un inhibidor de BMP, un ligando de TGF-B, un ligando de FGF, ácido retinoico, vitamina C y un activador de PKC;

[0132] d) diferenciación de las células del intestino anterior posterior en células del intestino anterior pancreático que expresen PDX-1 y NKX6.1, y que expresen un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior posterior. Esta diferenciación se logra cultivando las células del intestino anterior posterior en presencia de un inhibidor de shh, un inhibidor de BMP, una dosis baja de ácido retinoico, vitamina C y un activador de PKC. e) diferenciación de las células del intestino anterior pancreático en células del endodermo pancreático que expresen PDX-1, un nivel más alto de NKX6.1 y un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior pancreático. La diferenciación se logra cultivando las células del intestino anterior pancreático en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B, una dosis baja de ácido retinoico y vitamina C; y

[0133] f) diferenciación de las células del endodermo pancreático en células precursoras endocrinas pancreáticas, seguidas de células endocrinas pancreáticas monohormonales. La diferenciación se lleva a cabo cultivando las células del endodermo pancreático en un medio suplementado con un inhibidor de shh, una dosis baja de ácido retinoico y vitamina C.

[0134] Las células en todas las etapas de la diferenciación escalonada pueden cultivarse en una formulación de medio que contenga menos de 25 mM de glucosa. La concentración de glucosa puede encontrarse en el intervalo de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 20 mM de glucosa.

[0135] En algunas realizaciones, las formulaciones de medio usadas para generar células en la etapa de tubo digestivo y todos los pasos posteriores contienen ácido ascórbico (también conocido como vitamina C). En una realización, la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM. En una realización, la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 0,5 mM.

[0136] La presente invención se ilustra con más detalle, sin limitarse a ellos, mediante los siguientes ejemplos de referencia.

[0137] Ejemplo de referencia 1

[0138] Diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1 en células precursoras endocrinas pancreáticas en ausencia de suero fetal bovino - la modulación de las vías BMP/TGF-B da como resultado una mejora en la producción de la población del endodermo pancreático y una reducción del porcentaje de la población SOX2+.

[0139] Este ejemplo se llevó a cabo para demostrar que pueden generarse cultivos de endodermo pancreático con niveles muy altos de expresión de PDX-1 y NKX6.1, a la vez que tienen un nivel bajo de expresión de CDX2 y SOX2.

[0140] Se recogieron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (hESC H1) en varios pases (del pase 40 al pase 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en MATRIGEL<™>(dilución 1:30; BD Biosciences, NJ, EE. UU.) recubiertas en placas en medio mTeSR® 1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) suplementado con 10 µM de Y27632 (inhibidor de Rock, Nº de catálogo Y0503, SigmaAldrich, MO, EE. UU.). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron y se incubaron en PBS incompleto (solución salina tamponada con fosfato sin Mg ni Ca) durante aproximadamente 30 segundos. Los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0141] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE], 3 días): las células se cultivaron durante un día en medio de etapa 1: medio MCDB-131 (Nº de catálogo 10372-019, Invitrogen, CA, EE. UU.) suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 % (Nº de catálogo 68700, Proliant, IA, EE. UU.), 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico (Nº de catálogo S3187, SigmaAldrich, MO, EE. UU.), 1X GlutaMax™ (Nº de catálogo 35050-079, Invitrogen), 5 mM de D-glucosa (Nº de catálogo G8769, SigmaAldrich, MO, EE. UU.), que contiene 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems, MN, EE. UU.) y 1 µM de compuesto MCX (un inhibidor de GSK3B, 14-Prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciclo [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-ona, Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de serie 12/494,789). A continuación, las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, D-glucosa 5 mM, 100 ng/ml de GDF8 y compuesto MCX 100 nM. A continuación, las células se cultivaron durante un día en medio MCDB-131 al que se había añadido BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

[0142] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 2 días): Las células de la Etapa 1 se trataron durante dos días con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 25 ng/ml de FGF7.

[0143] c. Etapa 3 (intestino anterior, 2 días): Las células de la Etapa 2 se cultivaron durante un día en medio de la Etapa 3: medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X (Invitrogen), 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 25 ng/ml de FGF7, 10 ng/ml de activina-A (R & D Systems), 25 µM de SANT-10 (inhibidor de shh, SigmaAldrich), 1 µM de ácido retinoico (RA) (SigmaAldrich) y 200 nM de TPB (activador de PKC; Nº de catálogo 565740; EMD, Nueva Jersey, EE. UU.), que contenía 100 nM de LDN-193189 (inhibidor del receptor BMP; Nº de catálogo 04-0019; Stemgent, California, EE. UU.). A continuación, las células se cultivaron durante un día más en el suplemento del medio de la Etapa 3 con 10 nM de LDN-193189.

[0145] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 2 días): Las células de la Etapa 3 se cultivaron durante dos días en medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, 200 nM de TPB y 50 nM de LDN-193189.

[0147] e. Etapa 5 (endodermo pancreático, de 2 a 7 días): Las células de la Etapa 4 se cultivaron durante 2 a 7 días en medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico e, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1 y 50 nM de RA.

[0149] En etapas especificadas, se recogieron muestras y se analizaron mediante PCR en tiempo real, inmunohistoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

[0151] Para los análisis FACS, las células derivadas de hESC se liberaron en suspensión de células individuales mediante incubación en TrypLE Express (Nº de catálogo 12604, Invitrogen) a 37 °C durante 3 a 5 minutos. A continuación, las células se lavaron dos veces en tampón de tinción (PBS con BSA sin ácidos grasos al 0,2 %) (Nº de catálogo 554657, BD Biosciences, NJ, EE. UU.). Para la tinción intracelular con anticuerpos, las células se incubaron primero durante 20 minutos a 4 °C con el colorante celular fluorescente verde LIVE/DEAD (Invitrogen, Nº de catálogo L23101), para permitir la discriminación entre células vivas y muertas durante el análisis, seguido de un único lavado en PBS frío. Las células se fijaron en 250 µl de tampón Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Nº de catálogo 554722) durante 20 minutos a 4 °C, seguido de dos lavados en solución tampón BD Perm/Wash (BD Biosciences, Nº de catálogo 554723). Las células se volvieron a suspender en 100 µl de solución de tinción/bloqueo compuesta por tampón Perm/Wash suplementado con suero normal al 2 % (de la especie adecuada del anticuerpo secundario). A continuación, las células se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos primarios a diluciones predeterminadas empíricamente, seguidas de dos lavados en tampón Perm/Wash. Por último, las células se incubaron con los anticuerpos secundarios adecuados durante 30 minutos a 4 °C, seguido de dos lavados con tampón Perm/Wash antes de los análisis en el BD FACS Canto II.

[0153] Se usaron las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: anticuerpo de conejo antiinsulina (1:100; Nº de catálogo C27C9; Cell Signaling, MA, EE. UU.), anticuerpo de ratón antiinsulina (1:100; Nº de catálogo ab6999, Abcam, MA, EE. UU.), anticuerpo de ratón antiglucagón (1:1250; Nº de catálogo G2654; Sigma-Aldrich), anticuerpo de conejo antisinaptofisina (1:100; Nº de catálogo A0010, Dako, CA, EE. UU.), anticuerpo de conejo anticromogranina A (1:800; Dako), anticuerpo de ratón anti-NKX6.1 (1:50; DSHB, Universidad de Iowa, IA, EE. UU.), anticuerpo de ratón anti-CDX2 (1:250; Invitrogen), anticuerpo de cabra anti-NeuroD (1:500; R&D Systems), anticuerpo de ratón anti-SOX2 (BD, CA, EE. UU.), anticuerpo de ratón anti-NKX2.2 (DSHB), anticuerpo de ratón anti-Pax6 (BD, CA, EE. UU.), anticuerpo de ratón anti-PDX-1 (BD, CA, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios se usaron a las siguientes diluciones: cabra antiratón Alexa 647 (1:500; Invitrogen), cabra anti-conejo PE (1:200; Invitrogen), burro anti-cabra (1:800; Invitrogen). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4 °C después de la adición de los anticuerpos secundarios, seguido de un lavado final en tampón Perm/Wash. Las células se analizaron en un BD FACS Canto II usando el software BD FACS Diva, con la adquisición de por lo menos 30.000 eventos.

[0155] Las Figuras 1A a 1G representan los perfiles de expresión de histogramas FACS del control de isotipo (FIG.

[0156] 1A), cromogranina (FIG.1B), KI-67 (FIG.1C), NKX6.1 (FIG.1D), SOX2 (FIG.1E), CDX2 (FIG.1F) y PDX-1 (FIG.1G) de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y analizadas en el día 2 de S3. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador. En el día 2 de la etapa 3, más del 95 % de las células eran positivas para la expresión de PDX-1 (FIG.1G) y aproximadamente el 60 % de las células de la población eran positivas para la expresión de SOX2 (FIG.1E), mientras que menos del 10 % de las células eran positivas para la expresión de CDX2 (FIG. 1F) o NKX6.1 (FIG. 1D) o cromogranina (FIG. 1B). Un porcentaje significativo de células en la etapa 3 se encontraba en ciclo celular activo, como lo demuestra el alto porcentaje de células positivas para KI-67 (FIG.1C).

[0158] [0075] Las Figuras 2A a 2G representan los perfiles de expresión del control de isotipo (FIG.2A), la cromogranina (FIG. 2B), KI-67 (FIG. 2C), NKX6.1 (FIG. 2D), SOX2 (FIG. 2E), CDX2 (FIG. 2F) y PDX-1 (FIG. 2G), según se determinan mediante tinción FACS, de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 1 y recogidas el día 2 de S4. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador. De manera similar a la etapa 3, más del 95 % de las células fueron positivas para la expresión de PDX-1 (FIG.2G), mientras que aproximadamente el 10 % de las células fueron positivas para la expresión de CDX2 (FIG. 2F) y aproximadamente el 40 % de las células fueron positivas para la expresión de NKX6.1 (FIG.2D). Aproximadamente el 45 % de las células fueron positivas para la expresión de SOX2 (FIG. 2E), lo que supone un descenso con respecto al 60 % en S3. La expresión de cromogranina fue de aproximadamente el 3 % (FIG. 2B). Un porcentaje significativo de células en la etapa 4 se encontraban en ciclo celular activo, como lo demuestra el alto porcentaje de células positivas para KI-67 (FIG.2C).

[0159] Las Figuras 3A a 3G representan los perfiles de expresión relativa, como se determinan mediante análisis FACS, de las células recogidas el día 2 de la etapa 5 tras el protocolo de diferenciación indicado en este ejemplo. FIG.

[0160] 3A: control de isotipo; FIG.3B: cromogranina; FIG.3C: KI-67; FIG.3D: NKX6.1; FIG.3E: SOX2; FIG.3F: CDX2; FIG.

[0161] 3G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador. De manera similar a las etapas 3 y 4, más del 95 % de las células eran positivas para la expresión de PDX-1, mientras que aproximadamente el 10 % de las células eran positivas para la expresión de CDX2 y más del 67 % de las células eran positivas para la expresión de NKX6.1. La expresión de SOX2, aproximadamente del 50 %, fue menor en comparación con la etapa 3, pero similar a su expresión en S4.

[0162] Las Figuras 4A a 4G representan la expresión de PDX-1 (FIG.4G), NKX6.1 (FIG.4D), CDX2 (FIG.4F), SOX2 (FIG.4E), Ki-67 (marcador de proliferación; FIG.4C) y cromogranina (marcador endocrino general; FIG. 4B) medida mediante tinción FACS de células recogidas y analizadas en el día 7 de la etapa 5 de la diferenciación siguiendo el protocolo indicado en este ejemplo. De manera similar a las etapas 3 y 4, más del 90 % de las células fueron positivas para la expresión de PDX-1, mientras que la expresión de CDX2 fue menor del 10 %, y la expresión de NKX6.1 aumentó significativamente hasta más del 70 % y la expresión de SOX2 disminuyó drásticamente hasta aproximadamente el 2 %.

[0163] Además, la mayoría de las células que expresaban SOX2, CDX2 y NKX6.1 eran negativas para la expresión de cromogranina (véanse las FIG.5A a FIG.5C). Por tanto, los cultivos S5 preparados siguiendo el protocolo indicado en este ejemplo dan como resultado una población de células en la que por lo menos el 50 % de las células expresan PDX-1 y NKX6.1, mientras que son negativas para CDX-2, SOX2 y cromogranina. La Tabla I resume el porcentaje de expresión de varios marcadores endodérmicos en S3-S5.

[0164] Tabla I

[0167]

[0169] Las Figuras 6A a 6T representan los perfiles de expresión del ARNm medidos mediante PCR en tiempo real de las células de S2, S3, S4 y S5 diferenciadas siguiendo el protocolo indicado en este ejemplo, y se notifican como el factor de cambio con respecto a la expresión en células H1 indiferenciadas. En la etapa 3, se observó una expresión muy baja de marcadores de la porción anterior del intestino anterior, como FOXe1 (FIG.6C) y NKX2.1 (FIG.6E). Sin embargo, en la etapa 3, SOX2 (FIG. 6M) y OSR1 (FIG. 6H), que marcan la región estomacal del tubo digestivo, se regulaban significativamente al alza y su expresión disminuía en S4-S5. Los marcadores del endodermo pancreático, como PTF1a (FIG.6K), NKX6.1 (FIG.6G) y PDX-1 (FIG.6I), alcanzaron niveles máximos de expresión en el día 2 de cultivo de la S5. Los datos de PCR indican que, en la etapa 3, las células pasan por una población PDX-1+ SOX2+ antes de convertirse en PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- CDX2- en S4-S5. (Véanse FIG 6I, FIG 6G, FIG 6M y FIG 6A). La expresión de los marcadores endocrinos (cromogranina, insulina, glucagón y somatostatina) alcanzó un nivel de expresión máximo al final de S5. La expresión de los marcadores precursores endocrinos pancreáticos, NKX2.2, NeuroD y NGN3, alcanzó un nivel máximo de expresión en S4-S5. La expresión de otros marcadores de linaje, como ZIC1 y SOX17, se mantuvo baja en S4-S5.

[0170] En conclusión, las células en el día 2 de la etapa 5 que se diferenciaron siguiendo el protocolo indicado en este ejemplo expresan niveles bajos de CDX2 y SOX2, mientras que mantienen un nivel alto de expresión de NKX6.1 y PDX-1. Se cree que la combinación única de inhibición oportuna de BMP, uso de dosis bajas de RA en S4-S5 y uso de glucosa alta en S1-S2 da como resultado la población de células descrita en el Ejemplo 1.

[0171] Ejemplo de referencia 2

[0172] Efecto de la inhibición de BMP y la activación de PKC sobre la expresión de SOX2 en S3-S4

[0173] El protocolo indicado en este ejemplo se llevó a cabo para esclarecer los efectos de la inhibición de BMP, la adición de FGF7 junto con la activación de PKC sobre la expresión de SOX2 en S3-S4.

[0174] Se recogieron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™(dilución 1:30) recubiertas en placas en medio mTesr™ 1 suplementado con 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0175] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE] - 3 días): antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 y 3.

[0176] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la Etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 durante tres días.

[0177] c. Etapa 3 (intestino anterior, 3 días): Las células de la Etapa 2 se trataron con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %e, 0,25 µM de SANT-1, 20 ng/ml de activina-A, 2 µM de RA, en presencia o ausencia de 50 ng/ml de FGF7, 50 nM o 200 nM de LDN-193189 y/o 200 nM de TPB. Las células se incubaron durante tres días en medio usando las combinaciones que se enumeran en la tabla II, a continuación:

[0179] Tabla II

[0182]

[0185] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 200 nM de TPB, 400 nM de LDN-193189, 2 µM de inhibidor de ALk5 (SD-208, divulgado en Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161), y 100 nM de inhibidor de CYP26A (N-{4-[2-etil-1-(1H-1,2,4-triazol-1-il)butil]fenil}-1,3-benzotiazol-2-amina, Janssen, Bélgica) durante tres días.

[0187] Se recogió ARNm en S2-S4 para todas las condiciones enumeradas anteriormente y se analizó usando PCR en tiempo real. Las condiciones de control, en S3, se refieren a cultivos en los que se usaron FGF7, AA, SANT, RA y 200 nM de LDN-193189 a las concentraciones indicadas en el paso c anterior. Como es evidente a partir de los datos de PCR mostrados en las Figuras 7A a 7G, la eliminación de LDN-193189 en S3 dio como resultado una disminución significativa de los marcadores endocrinos, como NGN3 (FIG. 7D), y del marcador panendocrino, como la cromogranina (véase la FIG.7C). La adición del activador de PKC y la eliminación de LDN-193189 en S3 disminuyeron aún más los marcadores endocrinos, a la vez que aumentaron la expresión de NKX6.1 (véanse las FIG. 7A a FIG.

[0188] 7G). Además, la adición de 50 nM de LDN-193189 fue tan eficaz como 200 nM de LDN-193189 en la inducción de marcadores endocrinos (cromogranina y NGN3). La eliminación de LDN-193189 y la adición de TPB en S3 mejoraron la expresión de CDX2 (FIG. 7E) y albúmina (FIG. 7F), a la vez que suprimieron la expresión de SOX2 (FIG. 7G). Además, la eliminación tanto de FGF7 como de LDN-193189 aumentó significativamente la expresión de SOX2 (FIG.

[0189] 7G) y redujo la expresión de albúmina (FIG.7F) en comparación con los cultivos en los que se eliminó LDN-193189 y se mantuvo FGF7. Estos datos demuestran que la modulación precisa de la inhibición de BMP, la activación de FGF y la activación de PKC puede dar como resultado un dominio del endodermo rico en PDX-1 y NKX6.1, pero pobre en CDX2, SOX2 y albúmina. Por último, la inhibición sostenida de BMP en S3-S4 mejoró la expresión de genes proendocrinos y reguló al alza la expresión de SOX2. Esto resalta que la inhibición de BMP debe ajustarse con precisión para aumentar los genes endocrinos pancreáticos sin regular al alza la expresión de SOX2, que está ausente o es baja en el desarrollo del páncreas, pero presente en los órganos del endodermo de la porción anterior del intestino anterior, como el estómago.

[0191] Ejemplo de referencia 3

[0192] La inhibición temprana de BMP en la etapa del intestino anterior es necesaria para la posterior inducción de marcadores endocrinos

[0193] Este ejemplo muestra que la inhibición temprana de la señalización de BMP en S3 es necesaria para la posterior inducción de marcadores endocrinos. Sin embargo, la inhibición sostenida de BMP en la etapa 3 también da como resultado una fuerte expresión de SOX2. Para obtener tanto una alta expresión de marcadores endocrinos como una baja expresión de SOX2, se requirió un gradiente de inhibición de BMP para inducir marcadores endocrinos propancreáticos, a la vez que se mantenía una baja expresión de SXO2 y CDX2.

[0194] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 suplementado con 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0195] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE], 4 días): antes de iniciar el DE, las células se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de una incubación en medio S1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron durante un día con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B). A continuación, las células se trataron durante dos días (días 2-4) con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

[0196] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron durante tres días con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7.

[0197] c. Etapa 3 (intestino anterior, 3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 20 ng/ml de Activina-A, 2 µM de RA, 50 ng/ml de FGF7, 100 nM de LDN-193189 (solo el día 1 o durante toda la etapa 3) y 200 nM de TPB. En algunos cultivos, se eliminó LDN-193189 de la etapa 3.

[0198] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 100 nM de TPB, 200 nM de LDN-193189, 2 µM de inhibidor de ALk5 y 100 nM de inhibidor de CYP26A durante tres días.

[0199] e. Etapa 5 (endodermo pancreático/endocrino -4 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 200 nM de LDN-193189 y 2 µM de ALk5 durante cuatro días.

[0200] Como evidencian los resultados de la PCR que se muestran en las Figuras 8A a 8G, la eliminación de LDN-193189 (inhibidor de BMP) de la etapa 3 suprime la expresión de los genes proendocrinos NGN3 (FIG.8C), NeuroD (FIG.8D) y cromogranina (FIG.8E) en las etapas 4 y 5. Sin embargo, la expresión de PDX-1 (FIG.8B) y NKX6.1 (FIG.

[0201] 8A) no se regula a la baja significativamente en comparación con NGN3 y NeuroD en las etapas 4-5. Además, la eliminación completa de LDN-193189 en la etapa 3 da como resultado un aumento significativo de la expresión de CDX2 (FIG.7F). La adición de LDN-193189 durante el primer día de la etapa 3, seguida de su eliminación en los días 2-3 de la etapa 3, aumentó significativamente la expresión de NGN3 y NeuroD, a la vez que disminuyó la expresión de CDX2 y SOX2 en la etapa 4. Los cultivos en los que se mantuvo LDN-193189 durante toda la etapa 3 mostraron una expresión muy alta de SOX2 (FIG.8G) en S3-S4. Estos datos muestran que la inhibición de BMP en el día 1 de la etapa 3 es suficiente para activar los marcadores endocrinos pancreáticos, a la vez que se suprime la expresión de SOX2 y CDX2.

[0202] En resumen, la inhibición de BMP es necesaria en el día 1 de la etapa 3 para inducir la formación de células precursoras endocrinas en las etapas 4-5 y para mantener la expresión de PDX-1 y NKX6.1, a la vez que se suprime la expresión de SOX2. Además, la adición de un activador de PKC en la etapa 3 mejoró aún más la expresión de PDX-1 y NKX6.1.

[0203] Ejemplo de referencia 4

[0204] La inhibición de la señalización BMP en el día 1 de la etapa 3 es suficiente para generar células precursoras pancreáticas en la etapa 4, mientras que la inhibición de la señalización BMP en el último día de la etapa 3 da como resultado una expresión significativamente menor de los marcadores endocrinos.

[0205] Este ejemplo muestra que la inhibición temprana de la señalización BMP en la etapa 3 permite la inducción de marcadores precursores endocrinos pancreáticos, mientras que la inhibición de la señalización BMP al final de la etapa 3 reduce significativamente el nivel de expresión de los marcadores precursores endocrinos en la etapa 4.

[0207] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 suplementado con 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático de la siguiente manera: a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE]: 4 días): antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron durante un día con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B). A continuación, las células se trataron durante tres días con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron durante tres días con MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7.

[0208] c. Etapa 3 (intestino anterior, 3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA y las combinaciones que se enumeran en la tabla III, durante tres días.

[0210] Tabla III

[0213]

[0216] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 100 nM de TPB, 200 nM de LDN-193189, 2 µM de inhibidor de ALk5 y 100 nM de inhibidor de CYP26A durante tres días.

[0218] Las Figuras 9A a 9H muestran el perfil de expresión génica de los marcadores del endodermo pancreático, el precursor endocrino y el endodermo del intestino anterior para las combinaciones de condiciones de cultivo enumeradas anteriormente. En consonancia con el ejemplo anterior, el bloqueo de la vía de BMP el primer día de la etapa 3 es fundamental para la posterior inducción del programa endocrino, según se mide mediante la expresión del marcador panendocrino, la cromogranina. (Véase la FIG. 9C). Sin embargo, la adición del inhibidor de BMP en el primer día de la etapa 3 desencadena la expresión de marcadores endocrinos en etapas posteriores. Además, la adición del inhibidor de BMP en el primer día de la etapa 3 también disminuyó la expresión del marcador del intestino anterior, SOX2, en las etapas 3-4 (FIG.9H). Sin embargo, la adición del inhibidor de BMP solo en el último día de la etapa 3 muestra una expresión significativamente más alta de SOX2 al final de la etapa 3 en comparación con las células tratadas con el inhibidor de BMP solo en el primer día de la etapa 3. Los niveles de expresión que se muestran en las FIGS.9A a 9H son con respecto a los niveles de expresión en células H1 indiferenciadas, que tienen un nivel de expresión muy alto de SOX2. Además de ser un marcador de la porción anterior del intestino anterior, SOX2 es un factor de transcripción bien conocido importante para el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES. Este ejemplo respalda adicionalmente los resultados anteriores que resaltan la sensibilidad de los cultivos en la etapa 3 a la duración y la cinética de la señalización BMP y el impacto posterior en la inducción endocrina pancreática y la expresión de SOX2.

[0219] Ejemplo de referencia 5

[0220] Dosis óptima de inhibición de BMP en la etapa del intestino anterior pancreático (etapa 4)

[0221] Los ejemplos anteriores describían la duración óptima de la inhibición de BMP en la etapa 3. Este ejemplo identifica la dosis óptima de inhibidor de BMP en el medio de S4.

[0222] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 y 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0223] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE], 4 días): Antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2-4.

[0224] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 durante tres días.

[0225] c. Etapa 3 (intestino anterior, 4 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM, glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de Activina-A, 100 nM de LDN-193189 y 100 nM de TPB durante un día. A continuación, las células se cultivaron en medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM, glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de Activina-A y 100 nM de TPB durante tres días.

[0226] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 4 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 200 nM de LDN-193189-193189, 2 µM de inhibidor ALk5, 100 nM de inhibidor CYP26A y las concentraciones de LDN-193189 que se indican en la tabla IV (a continuación) durante los días 1-4 de la etapa 4:

[0227] Tabla IV

[0230]

[0232] d. Etapa 5 (endodermo pancreático/precursor endocrino, 3 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 50 nM de LDN-193189 y 1 µM de inhibidor ALk5 durante tres días.

[0233] Los resultados de los análisis de PCR en tiempo real de las células recogidas después de los tratamientos anteriores se muestran en las Figuras 10A a 10H. Esta figura muestra que la adición de 50 nM o 100 nM de LDN-193189 en los días 1, 2, 3 o 4 de S4 puede prolongar la expresión de marcadores endocrinos a la vez que se mantiene una baja expresión de SOX2 en S4-S5. (Véanse las FIGS.10A a 10H).

[0234] Ejemplo de referencia 6

[0235] Dosis óptima de inhibición de BMP en la etapa del intestino anterior (etapa 3)

[0236] Este ejemplo identifica la dosis óptima de inhibición de BMP en la etapa 3 y los efectos posteriores sobre los marcadores endocrinos en la etapa 6.

[0237] [0095] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 suplementado con 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0238] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE], 4 días): antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2-4.

[0239] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 durante tres días.

[0240] c. Etapa 3 (intestino anterior, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de Activina-A, 100 nM de TPB y de 10 a 50 nM de LDN-193189 durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de Activina-A y 100 nM de TPB durante dos días.

[0241] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 20 nM de LDN-193189; 2 µM de inhibidor ALk5; 100 nM de inhibidor CYP26 A y 100 nM de TPB durante tres días.

[0242] e. Etapa 5 (endodermo pancreático/precursor endocrino, 3 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; 2,5 mM de glucosa; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico; BSA sin ácidos grasos al 2 %; /- 25 nM LDN-193189 y/o 2 µM inhibidor ALk5 durante tres días.

[0243] f. Etapa 6 (producción de hormonas endocrinas pancreáticas, 3 días): Las células de la etapa 5 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X; 2,5 mM de glucosa; 1X GlutaMax™; 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico; y BSA sin ácidos grasos al 2 % durante tres días.

[0244] Las Figuras 11A a 11H muestran que para desencadenar la expresión de marcadores endocrinos a la vez que se mantiene una expresión baja de SOX2 es necesaria una inhibición de baja a moderada de BMP el primer día de la etapa 3,. Además, la inhibición de BMP en la etapa 5, a la vez que se potenciaban los marcadores endocrinos, también llevó a una regulación al alza de la expresión de SOX2.

[0245] Los datos de este ejemplo confirman aún más los resultados presentados en los ejemplos anteriores. Los datos confirman que se requiere una modulación precisa de la vía BMP en las etapas 3-5 para desencadenar la inducción de marcadores endocrinos pancreáticos, a la vez que se suprime la expresión de SOX2.

[0246] Ejemplo de referencia 7

[0247] Ventana óptima para la inhibición de BMP en S3 (etapa del intestino anterior)

[0248] Este ejemplo identifica la ventana de tiempo óptima en la etapa 3 para la inhibición de la señalización BMP, a la vez que se preserva la inducción endocrina en etapas posteriores y se reduce la expresión de SOX2.

[0249] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 y 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0250] a. Etapa 1 (endodermo definitivo (DE), 4 días): Antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico<,>GlutaMax™ 1X, 2,5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 24.

[0251] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 durante tres días.

[0252] c. Etapa 3 (intestino anterior, 3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de activina A y 100 nM de TPB, que contenía 100 nM de LDN-193189 solo durante las primeras 2 horas, 6 horas o 24 horas de la etapa 3. d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 25 nM de LDN-193189, 2 µM de inhibidor ALk5, 100 nM de inhibidor CYP26 A y 100 nM de TPB durante tres días.

[0253] e. Etapa 5 (endodermo pancreático/precursor endocrino, 3 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 % y 2 µM de inhibidor ALk5 durante tres días.

[0254] Las Figuras 12A a 12G muestran los análisis de PCR en tiempo real para los datos recopilados en este ejemplo. El tratamiento en la etapa 3 durante por lo menos 2 horas con un inhibidor de BMP puede desencadenar la expresión de factores de transcripción proendocrinos como Ngn3 (FIG. 12D) y NeuroD (FIG. 12E), a la vez que mantiene una expresión muy baja de SOX2 (FIG. 12G) y aumenta significativamente la expresión de NKX6.1 (FIG.

[0255] 12A) y PDX-1 (FIG. 12B) en S4-S5. Sin embargo, en el día 3 de la etapa 5 la expresión de CDX2 fue mayor en las células tratadas durante 2 o 6 horas con el inhibidor de BMP que en las células tratadas durante 24 horas con el inhibidor (FIG.12F).

[0256] Los datos de este ejemplo sugieren que una inhibición de 24 horas de la vía BMP es óptima para mantener un nivel bajo de expresión de CDX2 y SOX2, e iniciar la diferenciación endocrina mientras se mantiene una alta expresión de marcadores del endodermo pancreático.

[0257] Ejemplo de referencia 8

[0258] Duración óptima de las etapas 3 (etapa del intestino anterior) y 4 (etapa precursora del intestino anterior pancreático)

[0259] Este ejemplo se llevó a cabo para determinar la duración óptima de S3 y S4 en la diferenciación escalonada de células pluripotentes a una población de células del linaje endocrino pancreático.

[0261] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 suplementado con 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0262] a. Etapa 1 (endodermo definitivo [DE], 4 días): Antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X 2,5 mM de D-glucosa; 100 ng/ml de GDF8 y 1,5 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %; 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico; 1X GlutaMax™; 2,5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2-4; luego

[0263] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 2 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2,5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 durante dos días.

[0264] c. Etapa 3 (intestino anterior, 2-3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de Activina-A y 100 nM de TPB, que contenía 100 nM de LDN-193189 durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µM de RA, 20 ng/ml de activina A y 100 nM de TPB.

[0265] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 2-3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 25 nM de LDN-193189, 100 nM de inhibidor de CYP26 A y 100 nM de TPB durante dos o tres días.

[0266] e. Etapa 5 (endodermo pancreático/precursor endocrino, 2 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 % y 1 µM de inhibidor ALk5 durante dos días.

[0267] f. Etapa 6 (precursor endocrino pancreático/hormona, 2 días): Las células de la etapa 5 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico y BSA sin ácidos grasos al 2 % durante dos días.

[0268] En las Figura 13A a 13G se muestran los datos de los análisis de PCR en tiempo real de las muestras recogidas en la etapa 3, la etapa 4, la etapa 5 o la etapa 6. Estos datos muestran que la prolongación de S3 y S4 a tres días mejora la expresión de NKX6.1, en comparación con los cultivos que tienen dos días de S3 y S4 (FIG.13A). Las células tratadas durante tres días en la etapa 3 muestran una regulación a la baja de la expresión de marcadores proendocrinos en comparación con los cultivos en los que la duración de S3 y S4 fue de solo dos días (FIG. 13D y FIG. 13E). Además, la prolongación de la etapa 4 a tres días mejoró significativamente la expresión de SOX2 (FIG.

[0269] 13G).

[0270] Los datos obtenidos en este ejemplo son congruentes con los datos generados en los ejemplos anteriores, ya que muestran que la inhibición prolongada de BMP orienta el intestino anterior hacia una población con altos niveles de SOX2. Sobre la base de los datos de este ejemplo y de los ejemplos anteriores, se puede concluir que la duración óptima de la etapa 3 y la etapa 4 es de dos días. El protocolo ideal dará como resultado células diferenciadas con altos niveles de expresión de marcadores proendocrinos, altos niveles de NKX6.1, bajos niveles de CDX2 y bajos niveles de SOX2.

[0271] Ejemplo de referencia 9

[0272] La exposición prolongada a la inhibición de BMP en presencia de alto contenido de glucosa y suplemento B27 aumenta significativamente la expresión de SOX2 en S3 y S4

[0273] Este protocolo se realizó para determinar los factores que afectan a la expresión de SOX2 en S3 y S4 durante la diferenciación escalonada de células pluripotentes en células productoras de hormonas.

[0274] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se cultivaron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se cultivaron en medio mTesr™ 1 hasta que se alcanzó una confluencia de aproximadamente el 70 % y se diferenciaron de la siguiente manera:

[0275] a. Las células indiferenciadas se cultivaron en medio RPMI (Invitrogen) suplementado con FBS al 0,2 %; 100 ng/ml de activina A; 20 ng/ml de WNT-3a durante un día. A continuación, las células se trataron con medio RPMI suplementado con FBS al 0,5 %; 100 ng/ml de activina A durante dos días más (etapa 1).

[0276] b. Las células de la etapa 1 se trataron con medio DMEM/F12 suplementado con FBS al 2% ; 50 ng/ml de FGF7 durante tres días (etapa 2).

[0277] c. Las células de la etapa 2 se cultivaron en medio DMEM con alto contenido en glucosa suplementado con B27 al 1 %; 0,25 µM de SANT-1; 2 µM de RA; 100 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN, EE. UU.) durante cuatro días (etapa 3).

[0278] d. Las células de la etapa 3 se trataron con medio DMEM con alto contenido en glucosa suplementado con B27 al 1 %; 100 ng/ml de Noggin; 1 µM de inhibidor II de ALK5 (Axxora, CA, EE. UU.); y 50 nM de TPB durante cuatro días (etapa 4).

[0279] [0108] Las Figuras 14A a 14H muestran histogramas FACS de las células recogidas en el día 4 de la etapa 3 obtenidos para los siguientes marcadores: Control de isotipo (FIG.14A), cromogranina (FIG.14B), KI-67 (FIG.14C), NKX6.1 (FIG.14D), SOX2 (FIG.14E), HNF3B (FIG.14F), CDX2 (FIG.14G), PDX-1 (FIG.14H). En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador. La mayoría de las células en la etapa 3 fueron positivas para la expresión de PDX-1 (FIG. 14H) y HNF3B (FIG. 14F), negativas para la expresión de NKX6.1 (FIG. 14D) y mostraron una baja expresión de cromogranina (FIG. 14B) y CDX2 (FIG. 14G). Sin embargo, más del 90 % de las células también fueron fuertemente positivas para SOX2 (FIG.14E). Esto indica que, en la etapa 3, la mayoría de las células fueron positivas para PDX-1 y SOX2 y negativas para NKX6.1, lo que sugiere el establecimiento de una población endodérmica consistente con una población del intestino anterior que sea anterior al dominio de PDX-1 del páncreas.

[0280] Además, el porcentaje de células que eran SOX2+ en la etapa 3, en la población de células generadas usando el protocolo indicado en este ejemplo, fue significativamente mayor que el porcentaje de células que eran SOX2+ en la población de células generadas usando el protocolo indicado en el Ejemplo 1. Esta diferencia puede atribuirse a la exposición prolongada al antagonista de BMP Noggin, la falta de FGF7 y el activador de PKC en el medio de cultivo en la etapa 3 de este ejemplo.

[0281] Las Figuras 15A a 15G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 2 de S4 de células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9: FIG.15A: control de isotipo, FIG.15B: NKX6.1, FIG.15C: KI-67, FIG.15D: cromogranina, FIG.15E: SOX2, FIG.15F: CDX2, FIG.15G: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0282] Las Figuras 16A a 16F muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 4 de S4 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9. FIG. 16A: control de isotipo, FIG. 16B: NKX6.1, FIG.16C: cromogranina, FIG.16D: SOX2, FIG.16E: CDX2, FIG.16F: PDX-1. En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0283] La tabla V siguiente resume los datos obtenidos para el porcentaje de expresión de los marcadores endodérmicos en S3 y S4 para las células diferenciadas de acuerdo con el protocolo indicado en este ejemplo.

[0284] Tabla V

[0287]

[0289] Las Figuras 17A a 17J representan los resultados de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 9. FIG.17A: CDX2, FIG.17B: HHex, FIG.17C: FOXE1, FIG.17D: IPF1 (PDX-1), FIG.17E: NKX2.1, FIG.

[0290] 17F: NKX2.2, FIG.17G: NKX6.1, FIG.17H: PROX1, FIG.17I: SOX2, FIG.17J: SOX9.

[0291] Como se observa en las Figuras 14 a 17 y en la tabla V, en los días 2-4 de la etapa 4, se produjo un aumento significativo en la expresión de NKX6.1, a la vez que se mantuvo una alta expresión de PDX-1. Aunque la expresión de SOX2 disminuyó de la etapa 3 a la etapa 4, aproximadamente el 75 % de las células seguían siendo SOX2+. Al igual que en la Figura 5, las células CDX2+, las células SOX2+ y las células NKX6.1+ eran mutuamente excluyentes de la población de cromogranina. Esto implica que la población de células de la etapa 4 del día 4 generadas usando el protocolo indicado en el Ejemplo 9 tiene aproximadamente un 50 % de NKX6.1+ SOX2+ PDX-1+ CDX2-fracción negativa para cromogranina. Esto contrasta con la población celular generada en el ejemplo 1, que tenía de un 40 a un 70 % de PDX-1+, NKX6.1+, SOX2-, CDX2-, fracción negativa para cromogranina y de un 2 a un 25 % de PDX-1+, NKX6.1+, SOX2+ en S4-S5. Es evidente que las células generadas usando el protocolo del ejemplo 1 tenían un porcentaje mucho mayor de endodermo pancreático, definido como una población que es PDX-1+ y NXK6.1+, mientras que es baja o negativa para SOX2 y CDX2, en comparación con las células generadas en el Ejemplo 9.

[0292] Los datos obtenidos en este ejemplo respaldan que la exposición prolongada a la inhibición de BMP en presencia de concentraciones elevadas de glucosa y suplemento B27 aumenta significativamente la expresión de SOX2 en las etapas 3 y 4 de la diferenciación.

[0293] Ejemplo de referencia 10

[0294] Los resultados del protocolo publicado anteriormente dan como resultado la formación de una cantidad significativa de población de SOX2+ en las etapas 3-4.

[0295] Kroon et al. han publicado un protocolo para preparar células del linaje del endodermo pancreático a partir de células madre embrionarias humanas (Nature Biotech 2008, 26: 443-452; en lo sucesivo, "Kroon"). En el ejemplo proporcionado en la presente, las células madre embrionarias humanas se diferenciaron siguiendo el protocolo de Kroon y se analizaron para determinar la expresión de marcadores característicos de las diferentes etapas de diferenciación.

[0296] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se sembraron en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) y se cultivaron en medio mTesr™ 1 hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente el 70 %, y se diferenciaron usando el protocolo publicado con anterioridad por Kroon de la siguiente manera: a) Las células indiferenciadas se expusieron a medio RPMI suplementado con FBS al 0,2 %, 100 ng/ml de activina A y 20 ng/ml de WNT-3a durante un día, seguido de un tratamiento con medio RPMI suplementado con FBS al 0,5 % y 100 ng/ml de activina A durante dos días adicionales (etapa 1).

[0297] b) Las células de la etapa 1 se expusieron a medio RPMI suplementado con FBS al 2 % y 50 ng/ml de FGF7 durante tres días (etapa 2).

[0298] c) Las células de la etapa 2 se trataron con medio DMEM rico en glucosa suplementado con B27 al 1 %, 0,25 µM de SANT-1, 2 µM de RA y 50 ng/ml de Noggin (R & D Systems, MN) durante tres días (etapa 3).

[0299] d) Las células de la etapa 3 se cultivaron en medio DMEM rico en glucosa suplementado con B27 al 1 % durante tres días (etapa 4).

[0300] e) Las células de la etapa 4 se rasparon de los pocillos y se volvieron a suspender como grupos en medio DMEM rico en glucosa suplementado con B27 al 1 % durante dos días.

[0301] Las Figuras 18A a 18G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 3 de S3 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 10: Control de isotipo (FIG. 18A), NKX6.1 (FIG. 18B), cromogranina (FIG. 18C), SOX2 (FIG. 18D), CDX2 (FIG. 18E), KI-67 (FIG. 18F), PDX-1 (FIG. 18G). En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0302] Las figuras 19A a 19G muestran los perfiles de expresión de histogramas FACS de los siguientes marcadores en el día 5 de la S4 de las células diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 10. Control de isotipo (FIG.19A), NKX6.1 (FIG. 19B), cromogranina (FIG. 19C), SOX2 (FIG. 19D), CDX2 (FIG. 19E), KI-67 (FIG. 19F), PDX-1 (FIG. 19G). En cada histograma se muestra el porcentaje de expresión para cada marcador.

[0303] Como se muestra en las Figuras 18 y 19, al final de la etapa 4 (día 5), los cúmulos de células en suspensión eran de aproximadamente el 20 % de NKX6.1+ PDX-1+ SOX2- y de aproximadamente el 20 % de PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+. Estos resultados indican que una fracción significativa de la población de células en la etapa 4 generadas de acuerdo con el Ejemplo 10 que eran NKX6.1+ también eran SOX2+.

[0304] La tabla VI, que se muestra a continuación, resume los porcentajes de marcadores del endodermo en S3-S4 de las células generadas en este ejemplo.

[0305] Tabla VI

[0308]

[0310] Ejemplo de referencia 11

[0311] La adición de ácido ascórbico da como resultado una disminución significativa del número de células polihormonales y a un aumento concomitante del número de células monohormonales positivas para insulina.

[0312] Se probó el efecto del ácido ascórbico sobre la expresión de marcadores durante la diferenciación de células pluripotentes en células productoras de hormonas. Las células se cultivaron en un medio suplementado con glucosa en cada etapa de la diferenciación y suplementado con ácido ascórbico en la formación de las etapas 3, 4 y 5, como se indica a continuación:

[0313] Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 y 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0314] a. Etapa 1 (endodermo definitivo (DE), 3 días): Antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 100 nM de compuesto MCX durante el segundo día, seguido de un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

[0315] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 2 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días.

[0316] c. Etapa 3 (intestino anterior, 2 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 µM de SANT-1, 1 µM de RA, 200 nM de TPB (activador de PKC) y 100 nM de LDN-193189 (inhibidor del receptor de BMP) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 µM de SANT-1, 1 µM de RA, 200 nM de TPB (activador de PKC) y 10 nM de LDN-193189 durante un día más. Algunos cultivos se trataron durante la etapa 3 con 0,25 mM de ácido ascórbico (Nº de catálogo A4544, Sigma, MO, EE. UU.).

[0317] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 2 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189, con o sin 0,25 mM de ácido ascórbico durante dos días.

[0318] e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 2-7 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, con o sin 0,25 mM de ácido ascórbico durante 2-7 días.

[0319] Las Figuras 20A a 20J muestran los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 11. FIG.

[0320] 20A: somatostatina, FIG.20B: PDX1, FIG.20C: Pax6, FIG.20D: Pax4, FIG.20E: NKX6.1, FIG.20F: NGN3, FIG.20G: glucagón, FIG.20H: NeuroD, FIG.20I: insulina, FIG.20J: cromogranina. Esta Figura muestra que la adición de ácido ascórbico en la etapa 3 o en las etapas 3 y 4 disminuyó significativamente la expresión de somatostatina y glucagón en las etapas 4-5, a la vez que aumentó la expresión de insulina (véanse FIG.20A, FIG.20G y FIG.20I). Además, en las etapas 4-5, la expresión de marcadores del endodermo pancreático, como PDX-1 y NKX6.1, no se alteró significativamente con la adición de 0,25 mM de ácido ascórbico (véanse la FIG 20B y la FIG 20D). En las etapas 4-5, la expresión de Pax6 se reguló a la baja y la expresión de Pax4 se mantuvo (véanse la FIG 20C y la FIG 20D). Al final de la etapa 5, los cultivos tratados con /- ácido ascórbico en S3-S5 se sometieron a inmunotinción para las hormonas insulina, glucagón y somatostatina. La Tabla VII resume el porcentaje medio de células positivas para insulina, glucagón y somatostatina, y células polihormonales (dos expresiones hormonales más en una célula).

[0321] Tabla VII

[0324]

[0326] Ejemplo de referencia 12

[0327] Dosis óptima de ácido ascórbico en la etapa 3

[0328] Este ejemplo se llevó a cabo para determinar la dosis óptima de ácido ascórbico que debe usarse para generar células positivas para insulina que sean monohormonales, positivas para PDX-1 y positivas para NKX6.1.

[0329] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 y 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0330] a. Etapa 1 (Endodermo definitivo (DE), 3 días): Antes del inicio del DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 5 mM de D-glucosa y 100 ng/ml de GDF8, más 1 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 más 100 nM de compuesto MCX durante el segundo día, seguido de un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA al 0,1 % libre de ácidos grasos, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

[0331] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 2 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, con o sin la adición de 0,25 mM de ácido ascórbico y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días.

[0332] c. Etapa 3 (intestino anterior, 2 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 µM de SANT-1, /- 0,25 mM de ácido ascórbico, 1 µM de RA, 200 nM de TPB y 100 nM de LDN-193189 durante el día 1, seguido de un tratamiento con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 µM de SANT-1, /- 0,25 mM de ácido ascórbico, 1 µM de RA, 200 nM de TPB y 10 nM de LDN-193189 durante un día más. d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 2 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189, con o sin la adición de 0,25 mM a 1 mM de ácido ascórbico durante dos días.

[0333] e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 2-9 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, con o sin la adición de 0,25 mM de ácido ascórbico durante 2-9 días.

[0334] Las Figuras 21A a 21J muestran los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 12. FIG.21A: somatostatina, FIG.21B: PDX1, FIG.21C: Pax6, FIG.21D: Pax4, FIG.21E: NKX6.1, FIG.21F: NGN3, FIG. 21G: NeuroD, FIG. 21H: insulina, FIG. 21I: glucagón, FIG. 21J: cromogranina. En consonancia con los datos del Ejemplo 10, la adición de ácido ascórbico en las etapas 2-4 redujo significativamente la expresión de somatostatina, glucagón y Pax6, a la vez que mantuvo la expresión de insulina y Pax4 en la etapa 5. Además, no se observó ningún beneficio significativo al usar, en S4, de 0,5 a 1 mM de ácido ascórbico en comparación con 0,25 mM de ácido ascórbico. Por último, la adición de ácido ascórbico en la etapa 2 también resultó eficaz para reducir la expresión de glucagón y somatostatina en las etapas S3-5, a la vez que se mantenía la expresión de insulina. Por lo tanto, el ácido ascórbico actúa de manera específica de cada etapa para regular la expresión de células monohormonales. La adición de ácido ascórbico es importante en las primeras etapas del protocolo de diferenciación, mientras que en etapas posteriores no resultó tan eficaz para reducir el número de células polihormonales.

[0335] Ejemplo de referencia 13

[0336] Se requiere una combinación de ácido retinoico y ácido ascórbico para generar células monohormonales positivas para insulina

[0337] Este ejemplo se llevó a cabo para esclarecer los requisitos para generar células monohormonales positivas para insulina durante la diferenciación de células pluripotentes.

[0338] Se sembraron células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pases (del pase 40 al pase 52) como células individuales a una densidad de 100.000 células/cm<2>en placas recubiertas con MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™ 1 y 10 µM de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en linaje endocrino pancreático de la siguiente manera:

[0339] a. Etapa 1 (endodermo definitivo (DE), 3 días): Antes de iniciar el DE, los cultivos se lavaron y se incubaron con PBS incompleto (sin Mg ni Ca) durante 30 segundos, seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en placas recubiertas con MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, GlutaMax™ 1X, 5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µM de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. A continuación, las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, bicarbonato sódico, GlutaMax™, 5 mM de glucosa adicional, 100 ng/ml de GDF8 y 100 nM de compuesto MCX durante el segundo día, seguido de un día adicional en medio MCDB-131 suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8.

[0340] b. Etapa 2 (tubo digestivo primitivo, 2 días): Las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con BSA sin ácidos grasos al 0,1 %, 0,0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, 0,25 mM de ácido ascórbico y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días, a continuación

[0341] c. Etapa 3 (intestino anterior, 2 días): Las células se trataron con MCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 mM de ácido ascórbico, 0,25 µM de SANT-1, 1 µM de RA, 200 nM de TPB y 100 nM de LDN-193189 durante el primer día, seguido de un tratamiento con tMCDB131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0,25 mM de ácido ascórbico, 0,25 µM de SANT-1, 1 µM de RA, 200 nM TPB, 10 nM LDN-193189 durante un día adicional.

[0342] d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático, 2 días): Las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 %, 0,25 µM de SANT-1, 50 nM de RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189 y 0,1 mM de ácido ascórbico durante dos días, y luego

[0343] e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 3 días): Las células se trataron con medio MCDB-131 suplementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2,5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0,0015 g/ml de bicarbonato sódico, BSA sin ácidos grasos al 2 % y las siguientes condiciones de cultivo durante 3 días:

[0344] • 0,1 mM de ácido ascórbico

[0345] • 0,1 mM de ácido ascórbico 50 nM de RA

[0346] • 0,1 mM de ácido ascórbico 50 nM de RA 0,25 µM de SANT-1

[0347] • 0,1 mM de ácido ascórbico 50 nM de RA 0,25 µM de SANT-1 50 nM de LDN-193189

[0348] • 0,1 mM de ácido ascórbico 50 nM de RA 0,25 µM de SANT-1 1 µM de Alk5 inh

[0349] • 0,1 mM de ácido ascórbico 50 nM de RA 0,25 µM de SANT-1 1 µM de Alk5 inh 50 nM de LDN-193189.

[0350] Las Figuras 22A a 22L muestran los datos de los análisis de PCR en tiempo real de la expresión de Pax4 (FIG.22A); Pax6 (FIG.22B); PDX1 (FIG.22C); PTF1a (FIG.22D); glucagón (FIG.22E); insulina (FIG.22F); NeuroD (FIG.22G); ngn3 (FIG.22H); Zic1 (FIG.22I); CDX2 (FIG.22J); albúmina (FIG.22K); NKX6.1 (FIG.22L) en células de la línea de células madre embrionarias H1 diferenciadas de acuerdo con el Ejemplo 13 y recogidas en el día 3 de S5.

[0351] Al final de la etapa 5, los cultivos tratados con las combinaciones enumeradas anteriormente se sometieron a tinción inmunológica para las hormonas insulina, glucagón y somatostatina. La Tabla VIII resume el porcentaje medio de células positivas para insulina, células positivas para glucagón y somatostatina, y células polihormonales (dos o más expresiones hormonales en una célula).

[0352] [0131 Como se muestra en la Figura 22 y en la Tabla VIII, a continuación, la adición de una dosis baja de ácido retinoico más ácido ascórbico en la etapa 5 redujo significativamente el número total de células positivas para hormonas, a la vez que aumentó el porcentaje de células monohormonales positivas para insulina, en comparación con los cultivos tratados solo con vitamina C en S5. Además, la combinación de ácido retinoico, ácido ascórbico, inhibidor de Sonic Hedgehog e inhibidor de ALK5 aumentó aún más el número de células monohormonales positivas para insulina, en comparación con los cultivos tratados solo con ácido ascórbico (vitamina C). Estos datos indican que se necesita una combinación única de factores para generar células monohormonales positivas para insulina.

[0353] Tabla VIII

[0356]

[0357] continuación

[0358]

Claims

1. REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para la diferenciación escalonada de células pluripotentes en una población de células del linaje del endodermo pancreático, que comprende cultivar la células en cada etapa de diferenciación en un medio que comprende entre 5 mM y 20 mM de glucosa, en el que la diferenciación escalonada comprende las etapas de (a) diferenciar células pluripotentes en células del endodermo definitivo (DE) cultivando las células pluripotentes en un medio suplementado con un ligando de TGF-B y un activador de WNT,

(b) diferenciar las células DE en células del tubo digestivo cultivando las células DE en un medio suplementado con un ligando de FGF,

(c) diferenciar las células del tubo digestivo en células del endodermo del intestino anterior posterior cultivando las células del tubo digestivo en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP,

(d) diferenciar las células del endodermo del intestino anterior posterior en células del intestino anterior pancreático cultivando las células del endodermo del intestino anterior posterior en un medio suplementado con un activador de PKC, un inhibidor shh, un retinoide y un inhibidor de BMP, y

(e) diferenciar las células del intestino anterior pancreático en células del endodermo pancreático cultivando las células del intestino anterior pancreático en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide.

2. El método in vitro de la reivindicación 1, que comprende además diferenciar las células del endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas.

3. El método in vitro de la reivindicación 1 o 2, en el que más del 30 % de las células del endodermo pancreático diferenciadas son PDX-1+ NKX6.1+, SOX2- y CDX2-.

4. El método in vitro de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que más del 10 % de las células de la población diferenciada son células monohormonales positivas para insulina.

5. Un método in vitro para diferenciar células madre embrionarias humanas en células beta pancreáticas que comprende:

(a) cultivar las células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio suplementado con un ligando de TGF-B y un activador de WNT, para generar una población de células del endodermo definitivo (DE);

(b) cultivar las células DE en un medio suplementado con un ligando de FGF para generar una población de células del tubo digestivo;

(c) cultivar las células del tubo digestivo en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un ligando de FGF, un activador de PKC, un ligando de TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células del endodermo del del intestino anterior posterior que expresan PDX-1 y SOX2;

(d) cultivar las células del intestino anterior posterior en un medio suplementado con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células del intestino anterior pancreático que expresan PDX-1 y NKX6.1, y que expresan un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior posterior;

(e) cultivar las células del intestino anterior pancreático en un medio suplementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide para obtener una población de células del endodermo pancreático que expresan PDX-1, un nivel más alto de NKX6.1 y un nivel más bajo de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior pancreático; y

(f) diferenciar las células del endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas, lo que comprende cultivar las células en medio;

en el que el medio en cada uno de los pasos a) a f) comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la población de células beta pancreáticas es PDX-1 , NKX6.1+, SOX2-y CDX2-.

7. El método de la reivindicación 5 o 6, en el que las células beta pancreáticas son células monohormonales productoras de insulina que también son NKX6.1+ y PDX-1+.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en por lo menos un paso el medio se suplementa además con ácido ascórbico.