MX2014007744A

MX2014007744A - Diferenciacion de celulas madre embrionicas humanas en celulas individuales positivas de insulina hormonal.

Info

Publication number: MX2014007744A
Application number: MX2014007744A
Authority: MX
Inventors: Alireza Rezania
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2015-01-12
Also published as: US20130189777A1; AU2019201293A1; CA2860107A1; CN105143446A; RS68035B1; US12215354B2; BR112014015417A2; JP2015503331A; KR102203056B1; PT2794857T; AR089426A1; KR20200030133A; ES3069712T3; US20220275340A1; EP2794857A4; BR112014015417A8; FI2794857T3; US9388386B2; US20150353895A1; JP2021052789A

Abstract

La presente invención proporciona métodos para promover la diferenciación de células madre pluripotentes; en particular, la presente invención proporciona métodos para producir una población de células, en donde más de 10% de las células en la población expresa características marcadoras de células individuales beta pancreáticas hormonales.

Description

DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS EN CÉLULAS POSITIVAS DE INSULINA HORMONALES INDIVIDUALES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADA La presente invención reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. No. de serie 61/579,351 , presentada el 22 de diciembre de 2011 , la cual se incorpora en la presente por referencia en su totalidad para todo propósito.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al campo de la diferenciación celular. Más específicamente, la invención proporciona células productoras de insulina hormonales individuales diferenciadas de células madres pluripotentes usando condiciones definidas en cada paso de una diferenciación gradual. Más del 10 % de las células productoras de insulina diferenciadas de la población expresa marcadores característicos de células beta pancreáticas hormonales individuales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances en la terapia de reemplazo celular para la diabetes mellitus Tipo I y la escasez de islotes de Langerhans para transplantes han concentrado el interés en el desarrollo de fuentes de células productoras de insulina, o células ß, adecuadas para la funcionalidad del injerto. Un método es la generación de células funcionales ß a partir de células madre pluripotentes, tales como, por ejemplo, las células madre embrionarias.

En el desarrollo embrionario de los vertebrados, una célula pluripotente da origen a un grupo de células que comprenden tres capas de germinales (ectodermo, mesodermo y endodermo) en un proceso conocido como gastrulación. Tejidos como los de tiroides, timo, páncreas, intestino e hígado, se desarrollarán a partir del endodermo, por medio de una etapa intermedia. Una etapa intermedia en este proceso es la formación del endodermo definitivo. Las células del endodermo definitivo expresan varios marcadores, tales como HNF3beta, GATA4, MIXL1 , CXCR4 y SOX17.

Hacia el final de la gastrulación, el endodermo se divide en dominios anterior y posterior que pueden ser reconocidos por la expresión de un grupo de factores que marcan en forma única las regiones anterior, media y posterior del endodermo. Por ejemplo, Hhex y Sox2 identifican la región anterior, mientras que Cdx1 , 2 y 4 identifican la mitad posterior del endodermo.

La migración del tejido endodérmico lleva al endodermo a aproximarse a diferentes tejidos mesodérmicos que ayudan a la regionalización del tubo intestinal. Esto se realiza mediante una multitud de factores de segregación como FGF, Wnt, TGF-B, ácido retinoico (AR) y ligandos BMP y sus antagonistas. Por ejemplo, FGF4 y BMP promueven la expresión de Cdx2 en el endodermo del intestino posterior presuntivo y reprimen la expresión de los genes anteriores Hhex y SOX2 (Development 2000, 127:1563-1567). Se ha demostrado, además, que la señalización de WNT funciona en paralelo con la señalización de FGF para la promoción del desarrollo del intestino posterior y la inhibición del destino del intestino anterior (Development 2007, 134:2207-2217). Por último, el ácido retinoico secretado por el mesénquima regula el límite entre intestino anterior e intestino posterior (Curr Biol 2002, 12:1215-1220).

El nivel de expresión de factores de transcripción específicos puede usarse para diseñar la identidad de un tejido. Durante la transformación del endodermo definitivo en un tubo intestinal primitivo, el tubo intestinal se regionaliza en dominios amplios que se pueden observar a nivel molecular por sus patrones de expresión genética restringidos. Por ejemplo, el dominio regionalizado del páncreas en el tubo intestinal muestra una expresión muy alta de PDX-1 y una expresión muy baja de CDX2 y SOX2. Similarmente, la presencia de niveles altos de Foxel indican tejido esofágico; en el tejido pulmonar se expresa altamente el NKX2.1 ; en el tejido del estómago se expresan altamente SOX2/Odd1 (OSR1 ); en el tejido hepático la expresión de PROX1/Hhex/AFP es alta; en los tejidos de la estructura biliar se expresa altamente SOX17; en el tejido pancreático se expresan altamente PDX1 , NKX6.1/PTf1 a y NKX2.2; y en el tejido del intestino la expresión de CDX2 es alta. El resumen anterior se adaptó de Dev Dyn 2009, 238:29-42 y Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251.

La formación del páncreas surge de la diferenciación del endodermo definitivo en el endodermo pancreático (Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221-251 ; Dev Dyn 2009, 238:29-42). Los dominios pancreáticos dorsal y ventral surgen del epitelio del intestino anterior. El intestino anterior también da origen a esófago, tráquea, pulmones, tiroides, estómago, hígado, páncreas y sistema de conductos biliares.

Las células del endodermo pancreático expresan el gen de la caja homeótica pancreático-duodenal PDX1. En ausencia de PDX1 , el páncreas no se desarrolla más allá de la formación de las yemas ventral y dorsal. Por lo tanto, la expresión de PDX1 marca un paso crítico en la organogénesis pancreática. El páncreas maduro contiene, entre otros tipos de células, tejido exocrino y tejido endocrino. Los tejidos endocrino y exocrino se originan a partir de la diferenciación de endodermo pancreático.

D'Amour et al. describen la producción de cultivos enriquecidos del endodermo definitivo derivado de células madre embrionarias humanas en presencia de una concentración alta de activina y baja concentración de suero (Nature Biotechnol 2005, 23:1534-1541 ; patente de EE. UU. núm. 7,704,738). El transplante de estas células debajo de la cápsula renal del ratón dio como resultado una diferenciación en células más maduras con características del tejido endodérmico (patente de EE. UU. núm. 7,704,738). Las células endodérmicas definitivas derivadas de células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse, adicionaimente, en células positivas a PDX1 después de la adición de FGF-10 y ácido retinoico (publicación de patente de EE. UU. Núm. 2005/0266554A1). El transplante posterior de estas células precursoras pancreáticas debajo de la cápsula renal de ratones inmunodeficientes dio como resultado la formación de células endocrinas pancreáticas funcionales después de una fase de maduración de 3 a 4 meses (patente de EE. UU. núm. 7,993,920 y patente de EE. UU. núm. 7,534,608).

Fisk et al. informan sobre un sistema para producir células de los islotes pancreáticos de células madre embrionarias humanas (patente de EE. UU. núm. 7,033,831). En este caso, la vía de diferenciación se dividió en tres etapas. Las células madre embrionarias humanas en primer lugar se diferenciaron en endodermo mediante el uso de una combinación de butirato de sodio y activina A (patente de EE. UU. núm. 7,326,572). Después, las células de cultivaron con antagonistas de BMP, como Noggin, en combinación con EGF o betacelulina para generar células positivas para PDX1. La diferenciación terminal se indujo mediante nicotinamida.

Se han usado, además, inhibidores de pequeñas moléculas para la inducción de células precursoras endocrinas pancreáticas. Por ejemplo, se usaron inhibidores de pequeñas moléculas del receptor de TGF-B y los receptores de BMP (Development 201 1 , 138:861-871 ; Diabetes 2011 , 60:239-247) para aumentar significativamente la cantidad de células endocrinas pancreáticas. Además, los activadores de pequeñas moléculas también se han usado para generar células endodérmicas definitivas o células precursoras pancreáticas (Curr Opin Cell Biol 2009, 21 :727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258-265).

Los intentos anteriores en la inducción de células precursoras pancreáticas de las células madre embrionarias humanas han evidenciado la importancia de la coexpresión de PDX-1 y NKX6.1 en la identificación correcta del endodermo pancreático. Sin embargo, mientras que la técnica ha identificado que la población de células positivas en la expresión de PDX-1 y NKX6.1 tiene escasa o carece de expresión de CDX2, los informes anteriores han fracasado en las pruebas para determinar la presencia de marcadores anteriores al páncreas en desarrollo. El SOX2, que marca el endodermo anterior, no se expresa en los islotes adultos y se expresa a un nivel muy bajo en el páncreas en desarrollo (Diabetes 2005, 54:3402-4309). Por el contrario, algunos de los ejemplos de esta solicitud describen poblaciones celulares en las cuales al menos el 30 % de las células endodérmicas pancreáticas generadas de células madre embrionarias humanas son positivas para la expresión de PDX-1 y NKX6.1 y negativas para la expresión de CDX2 y SOX2.

Todos los intentos anteriores para generar células beta pancreáticas funcionales no han logrado obtener células con las características de las células beta maduras. Los indicadores de células beta maduras incluyen la expresión de insulina hormonal individual, el procesamiento correcto de la proinsulina en insulina y péptido C, la expresión fuerte de PDX-1 y NKX6.1 , la liberación apropiada de insulina en respuesta a la glucosa, la expresión de transportadores de glucosa y la alta expresión de glucoquinasa. Todos los informes anteriores dieron como resultado células endocrinas que producen dos o más hormonas pancreáticas. Por ejemplo, D'Amour et al (Nature Biotech 2006, 24:1392-1401) informan acerca de la generación de una población celular que comprende ~10 % de células positivas productoras de insulina y ~20 % de células endocrinas de acuerdo a la medición por sinaptofisina. Informes similares de otros (Cell Res 2009, 19:429-438; Stem Cells 2007, 25:1940-1953; Diabetes Obes Metab 2008, 10:186-194) también han demostrado la diferenciación de células pluripotentes en células positivas productoras de insulina no funcionales. En efecto, estudios recientes han establecido claramente que el transplante de células polihormonales en ratones con ¡nmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en inglés) no dieron como resultado la generación de células beta funcionales (Diabetes 2011 , 60:239-247; Nature Biotech 2011 , 29:750-756). Mientras que en el páncreas fetal humano una fracción (~10-20 %) de las células endocrinas son células polihormonales; las células polihormonales desaparecen en el páncreas humano adulto (Histochem Cell Biol 1999, 12:147-153; J Histochem Cytochem 2009, 57:811-824).

Mientras que el campo floreciente de la medicina regenerativa continúa madurando, es sumamente conveniente un método para la formación de células endocrinas pancreáticas diferenciadas terminalmente y reguladas apropiadamente. Aquí se demuestra que con una manipulación definida de condiciones culturales y una sincronización precisa de la adición de activadores e inhibidores de varias vías, las células madre embrionarias humanas pueden diferenciarse in vitro en células beta pancreáticas funcionales. Particularmente, la sincronización precisa de la inhibición de BMP, que usa un gradiente de ácido retinoico junto con el uso de vitamina C demostró su efectividad en la generación de células endocrinas pancreáticas hormonales individuales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una población de células del linaje endodérmico pancreático obtenida in vitro mediante diferenciación gradual de células pluripotentes. El medio usado en cada paso de la diferenciación se complementa con glucosa. En algunas modalidades, en cada paso de la diferenciación las células se cultivan en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

En algunas modalidades, la diferenciación de las células madre pluripotentes genera una población celular endodérmica pancreática, en donde más del 10 % de las células de la población diferenciada expresa marcadores característicos de las células beta pancreáticas hormonales individuales.

En algunas modalidades, la diferenciación de células madre pluripotentes genera una población celular endodérmica pancreática, en donde más del 30 % de la población diferenciada es positiva para la expresión de PDX-1 y NKX6.1 mientras que es negativa para la expresión de CDX2 y SOX2.

En algunas modalidades, la diferenciación gradual comprende el cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio complementado, adicionalmente, con un ligando TGF-B. En algunas modalidades, la diferenciación gradual comprende el cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio complementado, adicionalmente, con un activador de WNT. En algunas modalidades, la diferenciación gradual comprende el cultivo de células de endodermo definitivo en un medio complementado, adicionalmente, con un ligando FGF. En algunas modalidades, la diferenciación gradual comprende el cultivo de células del tubo intestinal en un medio complementado, adicionalmente, con un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador PKC, un ligando TGF-B, un retinoide y un gradiente de un inhibidor de BMP. En algunas modalidades, la diferenciación gradual comprende el cultivo de células de la parte posterior del tubo intestinal anterior en un medio complementado, adicionalmente, con un activador PKC, un inhibidor de ssh, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas modalidades la diferenciación gradual comprende el cultivo celular en un medio complementado, adicionalmente, con ácido ascórbico.

En una modalidad, la invención proporciona un método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes en una población de células del linaje endodérmico pancreático; el método comprende el cultivo de células en cada etapa de diferenciación en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa. En algunas modalidades el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de células pluripotentes en células de endodermo definitivo (ED) mediante el cultivo de células pluripotentes en un medio complementado con ligando TGF-B y activador de WNT. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de células del ED en células del tubo intestinal mediante el cultivo de células del ED en un medio complementado con un ligando FGF. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de las células de tubo intestinal en células de la parte posterior del endodermo de intestino anterior mediante el cultivo de las células de tubo intestinal en un medio complementado con un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de las células de tubo intestinal en células de la parte posterior del endodermo de intestino anterior mediante el cultivo de células de tubo intestinal en un medio complementado con un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de células endodérmicas de la parte posterior del intestino anterior en células de intestino anterior pancreático mediante el cultivo de las células de la parte posterior del tubo intestinal anterior en un medio complementado con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de las células pancreáticas del intestino anterior en células endodérmicas pancreáticas mediante el cultivo de células pancreáticas del intestino anterior en un medio complementado con un inhibidor de shh, inhibidor de TGF-B y un retinoide. En algunas modalidades, el método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes comprende, adicionalmente, la diferenciación de células endodérmicas pancreáticas en una población de células beta pancreáticas.

En una modalidad, en al menos un paso del método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes el medio se complementa, adicionalmente, con ácido ascórbico. En algunas modalidades más del 10 % de las células de la población diferenciada son células positivas de insulina hormonales individuales. En algunas modalidades más del 30 % de las células endodérmicas pancreáticas en un cultivo generado por los métodos de la invención son PDX-1 +, NKX6.1 +, SOX2- y CDX2-.

En una modalidad, la invención se relaciona con un método in vitro para diferenciar las células madre embrionarias humanas en células beta pancreáticas que comprenden: a) cultivar células madre embrionarias humanas indiferenciadas en medio complementado con glucosa, un ligando TGF-B y un activador de WNT, para generar una población de células de endodermo definitivo (ED); b) cultivar células de ED en un medio complementado con glucosa, y un ligando FGF para generar una población de células del tubo intestinal; c) cultivar células de tubo intestinal en un medio complementado con glucosa, un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide y un gradiente de un inhibidor de BMP para generar una población de células de la parte posterior del endodermo de intestino anterior que expresan PDX-1 y SOX2; d) cultivar células de la parte posterior del intestino anterior en un medio complementado con glucosa, un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células de intestino anterior pancreático que expresan PDX-1 y NKX6.1 y que expresar un nivel menor de SOX2 en comparación con las células de la parte posterior del intestino anterior, e) cultivar células pancreáticas del intestino anterior en un medio complementado con glucosa, un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide para obtener -^jna población de células de endodermo pancreático que expresan PDX-1 , un mayor nivel de NKX6.1 y un menor nivel de SOX2 en comparación con las células pancreáticas de intestino anterior; y f) diferenciar células pancreáticas en una población de células beta pancreáticas. En algunas modalidades, la población de células beta pancreáticas generadas por los métodos de la invención es PDX-1 +, NKX6.1+, SOX2- y CDX2-. En algunas modalidades, el medio en al menos un paso del método de diferenciación gradual se complementa, adicionalmente, con ácido ascórbico. En algunas modalidades, las células beta pancreáticas obtenidas por medio de los métodos de la invención son células productoras de la hormona insulina individual que también son NKX6.1+ y PDX-1 +.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A a 1G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S3 día 2 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1. FIG 1A: control de isotipo; FIG 1 B: cromogranina; FIG 1C: KI-67; FIG 1 D: NKX6.1 ; FIG 1E: SOX2; FIG 1 F: CDX2; FIG 1G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 2A a 2G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y se recolecta en S4 el día 2. FIG 2A: control de isotipo; FIG 2B: cromogranina; FIG 2C: KI-67; FIG 2D: NKX6.1 ; FIG 2E: SOX2; FIG 2F: CDX2; FIG 2G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 3A a 3G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y recolectadas en S5 el día 2. FIG 3A: control de isotipo; FIG 3B: cromogranina; FIG 3C: KI-67; FIG 3D: NKX6.1 ; FIG 3E: SOX2; FIG 3F: CDX2; FIG 3G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 4A a 4G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y recolectadas en S5 el día 7. FIG 4A: control de isotipo; FIG 4B: cromogranina; FIG 4C: KI-67; FIG 4D: NKX6.1 ; FIG 4E: SOX2; FIG 4F: CDX2; FIG 4G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 5A a 5C representan los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y recolectadas en S5 el día 2. FIG 5A: cromogranina (eje y) y CDX2 (eje x); FIG 5B: cromogranina (eje y) y SOX2 (eje x); FIG 5C: cromogranina (eje y) y NKX6.1 (eje x). La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 6A a 6T muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y que se recolectan en S2, S3, S4 y S5. FIG 6A: CDX2; FIG 6B: CD142; FIG 6C: FOXE1 ; FIG 6D: HNF4-alfa; FIG 6E: NKX2.1 ; FIG 6F: NKX2.2; FIG 6G: NKX6.1 ; FIG 6H: OSR1 ; FIG 61: PDX-1 ; FIG 6J: PROX1 ; FIG 6K: PTF1 a; FIG 6L: SOX17; FIG 6M: SOX2; FIG 6N: insulina; FIG 60: ZIC1; FIG 6P: cromogranina; FIG 6Q: glucagón; FIG 6R: Ngn3; FIG 6S: NeuroD; FIG 6T: somatostatina.

Las Figuras 7A a 7G representan datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en las células de la línea celular H1 diferenciada de acuerdo al Ejemplo 2 y recolectada el día 3 de S2, S3, o S4. FIG 7A: NKX6.1 ; FIG 7B: PDX-1 ; FIG 7C: cromogranina; FIG 7D: NGN3; FIG 7E: CDX2; FIG 7F: albúmina; FIG 7G: SOX2.

Las Figuras 8A a 8G representan datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes marcadores en células H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 3 y recolectada en S2, S3, S4 o S5. FIG 8A: NKX6.1 ; FIG 8B: PDX-1 ; FIG 8C: NGN3; FIG 8D: NeuroD; FIG 8E: cromogranina; FIG 8F: CDX2; FIG 8G: SOX2.

Las Figuras 9A a 9H representan datos del análisis en tiempo real de la expresión de los siguientes marcadores en células H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 4 y recolectadas el día 4 de S3 y S4. FIG 9A: NKX6.1 ; FIG 9B: PDX-1 ; FIG 9C: cromogranina; FIG 9D: NGN3; FIG 9E: NeuroD; FIG 9F: CDX2; FIG 9G: albúmina; FIG 9H: SOX2.

Las Figuras 10A a 10H representan datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 5 y recolectadas en la etapa 4. FIG. 10A: NKX6.1 ; FIG 10B: PDX-1 ; FIG 10C: cromogranina; FIG 10D: NGN3; FIG 10E: NeuroD; FIG 10F: CDX2; FIG 10G: albúmina; FIG 10H: SOX2.

Las Figuras 11A a 11 H muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 6 y recolectadas el día 3 de S3 o S6. FIG 11 A: NKX6.1 ; FIG 11 B: PDX-1 ; FIG 11C: cromogranina; FIG 11 D: NGN3; FIG 11E: NeuroD; FIG 11 F: CDX2; FIG 11 G: albúmina; FIG 11 H: SOX2.

Las Figuras 12A a 12G muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 7 y recolectadas el día 3 de S3, S4 o S5. FIG 12A: NKX6.1 ; FIG 12B: PDX-1 ; FIG 12C: cromogranina; FIG 12D: NGN3; FIG 12E: NeuroD; FIG 12F: CDX2; FIG 12G: SOX2.

Las Figuras 13A a 13G muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 8 y recolectadas en S3, S4, S5 o S6. FIG 13A: NKX6.1 ; FIG 13B: PDX-1 ; FIG 13C: cromogranina; FIG 13D: NGN3; FIG 13E: NeuroD; FIG 13F: CDX2; FIG 13G: SOX2.

Las Figuras 14A a 14H muestran los perfiles de expresión de histograma FACS de los siguientes marcadores en S3 el día 4 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9. FIG 14A: control de isotipo; FIG. 14B: cromogranina; FIG. 14C: KI-67; FIG. 14D: NKX6.1 ; FIG. 14E: SOX2; FIG. 14F: HNF3B; FIG. 14G: CDX2; FIG. 14H: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 15A a 15G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S4 el día 2 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9. FIG 15A: control de isotipo; FIG 15B: NKX6.1 ; FIG 15C: KI-67; FIG 15D: cromogranina; FIG 15E: SOX2; FIG 15F CDX2; FIG 15G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 16A a 16F muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S4 el día 4 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9. FIG 16A: control de isotipo; FIG 16B: NKX6.1 ; FIG 16C: cromogranina; FIG 16D: SOX2; FIG 16E: CDX2; FIG 16F: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 17A a 17J muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9 y se recolectan en S1D3, S2D3, S3D4, S4D2 y S4D4. FIG 17A: CDX2; FIG 17B: HHex; FIG 17C: FOXE1 ; FIG 17D: IPF1 (PDX-1); FIG 17E: NKX2.1 ; FIG 17F: NKX2.2; FIG 17G: NKX6.1 ; FIG 17H: PROX1 ; FIG 171: SOX2; FIG 17J: SOX9.

Las Figuras 18A a 18G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S3 día 3 de las células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 10. FIG 8A: control de isotipo; FIG 18B: NKX6.1 ; FIG 18C: cromogranina; FIG 18D: SOX2; FIG 18E: CDX2; FIG 18F: KI-67; FIG 18G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 19A a 19G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S4 día 5 de las células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 10. FIG 19A: control de isotipo; FIG 19B: NKX6.1 ; FIG 19C: cromogranina; FIG 19D: SOX2; FIG 19E: CDX2; FIG 19F: KI-67; FIG 19G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 20A a 20J muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 11. FIG 20A: somatostatina; FIG 20B: PDX1 ; FIG 20C: Pax6; FIG 20D: Pax4; FIG. 20E: NKX6.1 ; FIG 20F: NGN3; FIG 20G: glucagón; FIG 20H: NeuroD; FIG 20?: insulina; FIG 20J: cromogranina.

Las Figuras 21 A a 21J muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 12 y se recolectará en S4 día 2, S5 día 2 y S5 día 9. FIG 21A: somatostatina; FIG 21 B: PDX1 ; FIG 21C: Pax6; FIG 21D: Pax4; FIG 21 E: NKX6.1 ; FIG 21F: NGN3; FIG 21G: NeuroD; FIG 21H: insulina; FIG 211: glucagón; FIG 21J: cromogranina.

Las Figuras 22A a 22L muestran datos del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 13 y se recolectará en S5 día 3. FIG 22A: Pax4; FIG 22B: Pax6; FIG 22C: PDX1 ; FIG 22D; PTF1a; FIG 22E: glucagón; FIG 22F: insulina; FIG 22G: NeuroD; FIG 22H: ngn3; FIG 22I: Zid ; FIG 22J: CDX2; FIG 22K: albúmina; FIG 22L: NKX6.1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para mayor claridad de la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la presente invención.

Definiciones Las células madre son células indiferenciadas definidas por su habilidad, a nivel celular único, de autorrenovarse y diferenciarse. Las células madre pueden producir células de la progenie, que incluyen progenitores autorrenovadores, progenitores no renovadores y células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su habilidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células madre también dan lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del transplante y contribuyen sustancialmente a la mayoría, si no a todos, los tejidos después de la inyección en los blastocistos.

Las células madre se clasifican según su potencial de desarrollo como: (1 ) totipotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios y extraembrionarios; (2) pluripotentes, que significa que pueden producir todos los tipos celulares embrionarios; (3) multipotentes, que significa que pueden producir un subconjunto de linajes celulares pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovación), progenitoras oligopotentes restringidas a la sangre y todos los tipos y elementos celulares (por ejemplo, plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotentes, que significa que pueden producir un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madres multipotentes; y (5) unipotente, que significa ser capaz de originar un único linaje celular (por ejemplo, células madre espermatogénicas).

La diferenciación es un proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada, adquiere las características de una célula especializada, tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida por diferenciación es aquella que ha asumido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometida", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha seguido la vía de la diferenciación hasta un punto en donde, bajo circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula específico o subconjunto de tipos de células o revertirá a un tipo de célula menos diferenciada. La "desdiferenciación" se refiere al proceso mediante el cual una célula revierte a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Como se usa en la presente descripción, el linaje de una célula define la herencia de una célula, es decir, de qué células proviene y qué células puede originar. El linaje de una célula posiciona a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico para el linaje se refiere a una característica específicamente asociada con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida para linaje de interés.

"Marcadores", como se usa en la presente descripción, son moléculas de ácidos nucleicos o de polipéptidos que se expresan diferencialmente en una célula de interés. En este contexto, expresión diferencial significa un nivel aumentado para un marcador positivo y un nivel disminuido para un marcador negativo. El nivel detectable del marcador de ácido nucleico o polipéptido es suficientemente más alto o más bajo en las células de interés en comparación con otras células, de manera que la célula de interés pueda identificarse y distinguirse de otras células por medio del uso de cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, una célula es "positiva para" un marcador específico o "positiva" cuando se detecta el marcador específico en la célula. Similarmente, la célula es "negativa para" un marcador específico o "negativa" cuando no se detecta el marcador específico en la célula.

Como se usa en la presente descripción, "etapa 1" y "S1" se usan indistintamente para identificar células que expresan marcadores característicos del endodermo definitivo (ED).

"Endodermo definitivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que portan las características de las células derivadas del epiblasto durante la gastrulación, las cuales forman el tracto gastrointestinal y sus derivados. Las células del endodermo definitivo expresan al menos uno de los siguientes marcadores: HNF3 beta, GATA4, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 y MIXL1.

"Tubo intestinal", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células derivadas del endodermo definitivo que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: HNF3-beta, HNF1-beta o HNF4-alfa. Las células del tubo intestinal pueden originar todos los órganos endodérmicos, como pulmones, hígado, páncreas, estómago e intestino.

Se usan indistintamente en la presente descripción "etapa 2" y "S2" que identifica células que expresan los marcadores característicos del tubo intestinal primitivo.

"Endodermo del intestino anterior" se refiere a las células endodérmicas que originan esófago, pulmones, estómago, hígado, páncreas, vesícula biliar y una parte del duodeno.

"Parte posterior del intestino anterior" se refiere a las células endodérmicas que originan la parte posterior de estómago, páncreas, hígado y una parte del duodeno.

"Endodermo del intestino medio" se refiere a las células endodérmicas que originan los intestinos, partes del duodeno, apéndice y colon ascendente.

"Endodermo del intestino posterior" se refiere a las células endodérmicas que originan el tercio distal del colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide y el recto.

"Etapa 3" y "S3" se usan indistintamente para identificar las células que expresan marcadores característicos del endodermo del intestino anterior. "Células que expresan marcadores característicos del linaje del intestino anterior", como se usa en la presente descripción, se refiere a las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1 , FOXA2, CDX2, SOX2 y HNF4 alfa.

En la presente descripción se usan indistintamente "etapa 4" y "S4" para identificar células que expresan marcadores características del precursor del intestino anterior pancreático. "Células que expresan marcadores característicos del linaje precursor del intestino anterior pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX-1 , NKX6.1 , HNF6, FOXA2, PTF1a, Proxl y HNF4 alfa.

Como se usan en la presente descripción, "etapa 5" y "S5" se usan indistintamente para identificar células que expresan marcadores característicos de endodermo pancreático y células precursoras endocrinas pancreáticas. "Células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores: PDX1 , NKX6.1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 o PROXL Las células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático no expresan sustancialmente CDX2 o SOX2.

Como se usa en la presente descripción, "etapa 6" y "S6" se usan indistintamente para identificar células enriquecidas en células endocrinas pancreáticas.

"Célula endocrina pancreática" o "célula que expresa hormonas pancreáticas" o "células que expresan marcadores característicos del linaje endocrino pancreático", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, grelina y polipéptido pancreático.

"Célula precursora endocrina pancreática" o "célula progenitora endocrina pancreática" se refieren a células endodérmicas pancreáticas capaces de transformarse en una célula que expresa hormonas pancreáticas. Esa célula expresa al menos uno de los siguientes marcadores: NGN3, NKX2.2, NeuroD, ISL-1 , Pax4, Pax6 o ARX.

"Célula beta pancreática funcional", como se usa en la presente descripción, se refiere a una célula positiva individual productora de la hormona insulina capaz de responder a la glucosa y positiva para PDX-1 y NKX6.1.

En la presente descripción se usan indistintamente "d1", "d 1" y "día 1"; "d2", "d 2" y "día 2"; "d3", "d 3" y "día 3", etc. Estas combinaciones de números y letras especifican el día de la incubación en las diferentes etapas durante el protocolo de diferenciación gradual de la aplicación instantánea. "Ácido ascórbico" y "Vitamina C" se usan indistintamente en la presente descripción y se relacionan con un nutriente esencial para los seres humanos y otras especies animales.

"Glucosa" y "Glucosa D" se usan indistintamente y se refieren a dextrosa, un azúcar comúnmente encontrado en la naturaleza.

Una célula "positiva" para un marcador específico o que es el marcador "+" (por ejemplo, PDX-1+) es una célula en la cual el marcador particular puede detectarse. Una célula "negativa" para un marcador específico o que es marcador "-" (por ejemplo., NKX6.1-) es una célula en la cual el marcador no se detecta por métodos enseñados en la especificación instantánea.

En la aplicación instantánea "cromogranina" y "CHGN2" se usan indistintamente para identificar el gen que codifica la glucoproteína secretora ácida cromogranina.

En la presente descripción se usan indistintamente "NeuroD" y "NeuroDI" que identifica una proteína expresada en células progenitoras endocrinas pancreáticas y el gen que la codifica.

Se usan indistintamente en la presente descripción "LDN" y "LDN-193189" para indicar un inhibidor del receptor de BMP comercializado por Stemgent, CA, EE. UU.

Aislamiento, expansión y cultivo de células madre pluripotentes Las células madre pluripotentes pueden expresar uno o más antígenos embrionarios específicos de etapa (SSEA) 3 y 4 y los marcadores detectables mediante el uso de los anticuerpos designados Tra-1-60 y Tra-1-81 (Thomson y otros, Science 282:1145, 1998). La diferenciación de células madre pluripotentes in vitro da como resultado la pérdida de la expresión de SSEA-4, Tra-1-60 y Tra-1-81. Las células madre pluripotentes no diferenciadas tienen, típicamente, actividad de fosfatasa alcalina, la cual se puede detectar al fijar las células con paraformaldehído al 4 % y, después, desarrollarlas con el Vector Rojo como sustrato, según lo describe el fabricante (Vector Laboratories, CA, EE. UU.). Además, las células madre pluripotentes indiferenciadas expresan, típicamente, OCT4 y TERT, como se detectó por RT-PCR.

Otro fenotipo deseable de células madre pluripotenciales propagadas es un potencial para diferenciarse en células de las tres capas germinales: tejidos de endodermo, mesodermo y ectodermo. La pluripotencia de las células madre se puede confirmar, por ejemplo, al inyectar células en ratones SCID, al fijar los teratomas que se forman por medio del uso de paraformaldehído al 4 % y, después, examinarlos histológicamente con respecto a la evidencia de los tipos de células provenientes de las tres capas germinales. Alternativamente, la pluripotencia se puede determinar por la creación de cuerpos embrioides y el análisis los cuerpos embrioides para la presencia de marcadores asociados con las tres capas germinales.

Las líneas de células madre pluripotentes propagadas se pueden cariotipar por medio del uso de una técnica estándar de bandas G y por la comparación con los cariotipos publicados de las especies de primates correspondientes. Es deseable la obtención de células que tengan un "cariotipo normal", lo cual significa que las células son euploides, en donde todos los cromosomas humanos están presentes y no notablemente alterados. Las células pluripotentes pueden expandirse fácilmente en el cultivo mediante el uso de varias capas del alimentador o mediante el uso de recipientes recubiertos con la proteína matriz. Alternativamente, las superficies químicamente definidas combinadas con medios definidos como el medio mTesr™1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) puede usarse para una expansión de las células de rutina. Las células pluripotentes pueden eliminarse fácilmente de las placas de cultivo mediante el uso de enzimáticos, mecánicos o de varios quelantes del calcio como EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Alternativamente, las células pluripotentes pueden expandirse en suspensión en ausencia de cualquier proteína de matriz o capa del alimentador.

Fuentes de las células madre pluripotentes Los tipos de células madre pluripotentes que se pueden usar incluyen las líneas establecidas de células pluripotentes derivadas del tejido formado después de la gestación, que incluye tejido preembrionario (tal como, por ejemplo, un blastocisto), tejido embrionario o tejido fetal tomado en cualquier momento durante la gestación, típicamente, pero no necesariamente antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestación. Ejemplos no limitantes son líneas establecidas de células madre embrinarias humanas (hESC) o células germinales embrionarias humanas, como, por ejemplo, las líneas de células madre embrionarias humanas H1 , H7 y H9 (WiCell Research Institute, Madison, Wl, EE. UU.). Además, son adecuadas las células tomadas de una población de células madre pluripotentes ya cultivadas, en ausencia de células del alimentador. Además, son adecuadas las células pluripotentes inducibles (IPS) o células pluripotentes reprogramadas que pueden derivar de células somáticas adultas mediante el uso de la expresión forzada de una cantidad de factores de transcripción pluripotentes relacionados, como OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 y ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 201 1 , 12:165-185). Las células madre embrionarias humanas que se usan en los métodos de la invención también pueden prepararse como lo describen Thomson et al. (patente de EE. UU. núm. 5,843,780; Science, 1998, 282:1 45; Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133; Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92:7844).

Formación de células que expresan marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático a partir de células madre pluripotentes Las características de las células madre pluripotentes son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, y se continúan identificando las características adicionales de las células madre pluripotentes. Los marcadores de células madre pluripotentes incluyen, por ejemplo, la expresión de uno o más de los siguientes: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, Connexin43, Connexin45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.

Las células madre pluripotentes adecuadas para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, la línea de células madre embrionarias humanas H9 (código NIH: WA09), la línea de células madre embrionarias humanas H1 (código NIH: WA01), la línea de células madre embrionarias humanas H7 (código NIH: WA07), y la línea de células madre embrionarias humanas SA002 (Cellartis, Suecia). Además, son adecuadas para el uso en la presente invención las células que expresan al menos uno de los siguientes marcadores característicos de las células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1 , ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, y Tra 1-81.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo se seleccionan del grupo que consiste en SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1 , Nodal, FGF8, brachyuray, proteína de homeosecuencia tipo mezcla, FGF4, CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 y OTX2. Para el uso en la presente invención, es apropiada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula precursora de la línea primitiva. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula mesendodérmica. En un aspecto alternativo, una célula que expresa marcadores característicos del linaje del endodermo definitivo es una célula del endodermo definitivo.

Los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 , NKX6.1 , HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 y PROX1. Para el uso en la presente invención, es apropiada una célula que expresa por lo menos uno de los marcadores característicos del linaje del endodermo pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endodérmico pancreático es una célula endodérmica pancreática en donde la expresión de PDX-1 y NKX6.1 es sustancialmente mayor que la expresión de CDX2 y SOX2.

Los marcadores característicos del linaje endocrino pancréatico se seleccionan del grupo consistente de NGN3, NEUROD, ISL1 , PDX1 , NKX6.1 , PAX4, ARX, NKX2.2 y PAX6. En una modalidad una célula endocrina pancreática tiene la capacidad de expresar por lo menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático. Para el uso de la invención es adecuada una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente invención, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática que expresa hormonas. Alternativamente, la célula endocrina pancreática puede ser una célula pancreática secretora de hormonas.

En un aspecto de la presente invención la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß expresa PDX1 y por lo menos uno de los factores de transcripción siguientes: NKX2.2, NKX6.1 , NEUROD, ISL1 , HNF3 beta, MAFA, PAX4 y PAX6. En un aspecto de la presente invención una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células ß es una célula ß.

Esta invención describe un método in vitro y una población celular que puede generar células individuales positivas productoras de la hormona insulina que también son positivas para PDX-1 y NKX6.1. El método usado en esta invención incluye una serie de etapas que dirigen, gradual, la diferenciación de las células pluripotentes humanas en células hormonales individuales mediante las siguientes etapas intermedias: a) generación de células del endodermo definitivo (ED) a partir de células madre embrionarias humanas no diferenciadas que comprende el cultivo de células pluripotentes en un medio que comprende glucosa, un ligando TGF-B y el activador de WNT; b) diferenciación de células del ED en células del tubo intestinal que comprende el cultivo de células del ED en un medio que comprende glucosa, vitamina C y un ligando FGF; c) diferenciación de células del tubo intestinal en células endodérmicas de intestino anterior que expresan PDX-1 y SOX2. Esta diferenciación se lleva a cabo mediante el cultivo de células del tubo intestinal en presencia de un inhibidor de shh, un inhibidor de BMP, un ligando TGF-B, un ligando FGF, ácido retinoico, vitamina C y un activador de PKC; d) diferenciación de las células de la parte posterior del intestino anterior en células de intestino anterior pancreático que expresan PDX-1 y NKX6.1 y expresan un nivel menor de SOX2 en comparación con las células de la parte posterior del intestino anterior. Esta diferenciación se lleva a cabo mediante el cultivo de células de la parte posterior del intestino anterior en presencia de un inhibidor de shh, un inhibidor de BMP, una dosis baja de ácido retinoico, vitamina C y un activador de PKC. e) diferenciación de células del intestino anterior pancreático en células del endodermo pancreático que expresan PDX-1 , un mayor nivel de NKX6.1 y un menor nivel de SOX2 en comparación con las células del intestino anterior pancreático. La diferenciación se lleva a cabo mediante el cultivo de células del intestino anterior pancreático en un medio complementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B, una dosis baja de ácido retinoico y vitamina C; y f) diferenciación de células endodérmicas pancreáticas en células precursoras endocrinas pancreáticas seguido de células endocrinas pancreáticas hormonales individuales. La diferenciación se lleva a cabo mediante el cultivo de células endodérmicas pancreáticas en un medio complementado con un inhibidor de shh, una dosis baja de ácido retinoico y vitamina C.

En una modalidad, las células en todas las etapas de diferenciación gradual se cultivan en una fórmula para el medio que contiene menos de 25 mM de glucosa. En algunas modalidades la concentración de glucosa es del intervalo de aproximadamente 8 mM a aproximadamente 20 mM de glucosa.

En algunas modalidades, las formulaciones de los medios usados para generar células de la etapa de tubo intestinal y todas las etapas siguientes contienen ácido ascórbico (también conocido como vitamina C). En una modalidad, la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 1 mM. En una modalidad, la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 0.5 mM.

La presente invención se ilustra, adicionalmente, pero no se limita a, los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 La diferenciación de células madre embrionarias humanas de la línea celular H1 de células precursoras endocrinas pancreáticas en ausencia de la modulación de suero bovino fetal de las vías de BMP/TGF-B da como resultado una mejor producción de la población endodérmica pancreática y un porcentaje reducido de la población de SOX2+ Este ejemplo se realizó para demostrar que los cultivos de endodermo pancréatico pueden generarse a niveles de expresión de PDX-1 y NKX6 muy altos, al mismo tiempo que a un nivel de expresión de CDX2 y SOX2 bajo.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 (hESC H1 ) se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células únicas con una densidad de 100,000 células/cm2 en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30; BD Biosciences, NJ, EE. UU.) en medio TeSR®1 (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá) complementado con 10 µ? de Y27632 (inhibidor Rock, Catálogo núm. Y0503, SigmaAldrich, MO, EE. UU.). Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se lavaron e incubaron en PBS incompleto (solución salina regulada con fosfato sin Mg o Ca) durante 30 segundos aproximadamente. Los cultivos se diferenciaron en el linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (Endodermo definitivo (ED): 3 días): Las células se cultivaron durante un día en el medio de la etapa 1: medio MCDB-131 (catálogo núm. 10372-019, Invitrogen, CA, EE. UU.) complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos (catálogo núm. 68700, Proliant, IA, EE. UU.), 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico (catálogo núm. S3187, SigmaAldrich, MO, EE. UU.), 1X GlutaMax™ (catálogo núm. 35050-079, Invitrogen), 5 mM de D-glucosa (catálogo núm.G8769, SigmaAldrich, MO, EE. UU.), que contenía 100 ng/ml de GDF8 (R&D Systems, MN, EE. UU.) y 1 µ? del compuesto MCX (un inhibidor de GSK3B, 14-Prop-2-en-1 -il-3,5,7, 14, 17,23,27-heptaazatetraciclo [19.3.1.1 ~2,6~.1-8,12~]heptacosa-1 (25),2(27),3,5,8(26),9, 11,21 ,23-nonaen-16-ona, solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/494,789; que se incorpora en su totalidad como referencia a la presente descripción). Después, las células se cultivaron por un día en medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 100 nM de compuesto MCX. Después, las células se cultivaron por un día en medio MCDB-131 al cual se adicionaron 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 2 días): Las células de la etapa 1 fueron tratadas por dos días con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 25 ng/ml de FGF7. c. Etapa 3 (intestino anterior: 2 días): las células de la etapa 2 se cultivaron por un día en el medio de la Etapa 3: medio MCDB-131 complementado con una dilución al 1:200 de ITS-X (Invitrogen), 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato disódico, 2 % de BSA de ácidos grasos, 25 ng/ml de FGF7, 10 ng/ml de activina-A (R & sistemas D), 0.25 µ? SANT-1 (inhibidor de shh, SigmaAldrich), 1 µ? de ácido retinoico (AR) (SigmaAldrich) y 200 nM de TPB (activador de PKC; catálogo núm. 565740; EMD, NJ, EE. UU.), que contenía 100 nM LDN-193189 (inhibidor del receptor de BMP; catálogo núm. 04-0019; Stemgent, CA, EE. UU.). Las células después se cultivaron durante otro día más en el medio de la Etapa 3 complementado con 10 nM de LDN-193189. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: 2 días): Las células de la Etapa 3 se cultivaron por dos días en medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA de ácidos grasos, 0.25 µ? de SANT-1 , 50 nM de RA, 200 nM de TPB y 50 nM de LDN-193189. e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 2 a 7 días): Las células de la Etapa 4 se cultivaron durante 2 a 7 días en medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? de SANT-1 y 50 nM de RA.

En las etapas especificadas, se recolectaron y analizaron muestras mediante PCR en tiempo real, inmunohistoquímica o muestras o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Para el análisis de FACS, las células derivadas de hESC se liberaron en una suspensión de células individuales por incubación en TrypLE Express (catálogo núm. 12604, Invitrogen) a 37 °C durante 3 a 5 minutos. Las células después se lavaron dos veces en regulador para tinción (PBS que contenía 0.2 % de BSA libre de ácidos grasos) (catálogo núm. 554657, BD Biosciences, NJ, EE. UU.). Para la tinción de anticuerpos intracelulares, las células, en primer lugar, se incubaron durante 20 minutos a 4 °C con colorante de células VIVAS/MUERTAS fluorescente verde (Invitrogen Catálogo núm. L23101), para permitir la discriminación de células vivas/muertas durante el análisis, seguido de un lavado simple en PBS frío. Las células se fijaron en 250 µ? de regulador Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, catálogo núm. 554722) durante 20 minutos a 4 °C seguido de dos lavados en solución regulador BD Perm/Wash (BD Biosciences, catálogo núm. 554723). Las células se volvieron a suspender en 100 µ? de solución de tinción/bloqueo que consiste en el regulador Perm/Wash complementado con 2 % de suero normal (de la especie apropiada del anticuerpo secundario). Las células después se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con anticuerpos primarios en diluciones empíricamente predeterminadas seguido de dos lavados en regulador Perm/Wash. Por último, las células se incubaron en los anticuerpos secundarios correspondientes durante 30 minutos a 4 °C seguido de dos lavados con regulador Perm/Wash antes de los análisis de BD FACS Canto II.

Se usaron las siguientes diluciones de anticuerpos primarios: anti-insulina de conejo (1 :100; catálogo núm. C27C9; Cell Signaling, MA, EE. UU.), anti-insulina de ratón (1 :100; catálogo núm. ab6999, Abcam, MA, EE. UU.), anti-glucagón de ratón (1 :1250; catálogo núm. G2654; Sigma-Aldrich), anti-sinaptofisina de conejo (1:100; catálogo núm. A0010, Dako, CA, EE. UU.), anti-cromagranina A de conejo (1 :800; Dako), anti-NKX6.1 de ratón (1 :50; DSHB, University of lowa, IA, EE. UU ), anti-CDX2 de ratón (1 :250; Invitrogen), anti-NeuroD de cabra (1 :500; R&D Systems), anti-SOX2 de ratón (BD, CA, EE. UU.), anti-NKX2.2 de ratón (DSHB), anti-Pax6 de ratón (BD, CA, EE. UU.), anti-PDX-1 de ratón (BD, CA, EE. UU.). Los anticuerpos secundarios se usaron en las siguientes diluciones: Alexa 647 cabra anti-ratón (1 :500; Invitrogen), PE cabra anti-conejo(1 :200; Invitrogen), burro anti-cabra (1 :800; Invitrogen). Las muestras se incubaron durante 30 minutos a 4 °C después de la adición de anticuerpos secundarios, seguidos de un lavado final en regulador Perm/Wash. Las células se analizaron con un BD FACS Canto II mediante el uso del software BD FACS Diva y se adquirieron al menos 30,000 eventos.

Las Figuras 1A a 1G representan los perfiles de expresión del histograma FACS del control de isotipo (FIG 1A), cromogranina (FIG 1B), KI-67 (FIG 1C), NKX6.1 (FIG 1D), SOX2 (FIG 1E), CDX2 (FIG 1F), PDX-1 (FIG 1G) de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y analizado en S3 día 2. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma. El día 2 de la etapa 3, más del 95 % de las células resultaron positivas para la expresión de PDX-1 (FIG 1G) y aproximadamente 60 % de las células de la población resultaron positivas para la expresión de SOX2 (FIG E), mientras que menos del 10 % de las células resultaron positivas para la expresión de CDX2 (FIG 1 F) o NKX6.1 (FIG 1 D), o cromogranina (FIG 1B). Un porcentaje significativo de células en la etapa 3 estaban en el ciclo celular activo como lo demuestra el alto porcentaje de células positivas KI-67 (FIG 1C).

Las Figuras 2A a 2G representan los perfiles de expresión del control de isotipo (FIG 2A), cromogranina (FIG 2B), KI-67 (FIG 2C), NKX6.1 (FIG 2D), SOX2 (FIG 2E), CDX2 (FIG 2F), PDX-1 (FIG 2G), según lo determina la tinción de FACS, de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 1 y recolectadas el día 2 de S4. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma. De manera similar a la etapa 3, más del 95 % de las células resultaron positivas para la expresión de PDX-1 (FIG 2G), mientras que aproximadamente 10 % de las células resultaron positivas para la expresión de CDX2 (FIG 2F), y aproximadamente 40 % de las células resultaron positivas para la expresión de NKX6.1 (FIG 2D). Aproximadamente 45 % de las células resultaron positivas para la expresión de SOX2 (FIG 2E), una disminución a partir del 60 % en S3. La expresión de cromogranina fue de aproximadamente el 3 % (FIG 2B). Un porcentaje significativo de células en la etapa 4 estaba en el ciclo celular activo como lo demuestra el alto porcentaje de células positivas KI-67 (FIG 2C).

Las Figuras 3A a 3G representan perfiles de expresión relativa, determinados por los análisis FACS, de células recolectadas el día 2 de la etapa 5 después del protocolo de diferenciación que se describe en este ejemplo. FIG 3A: control de isotipo; FIG 3B: cromogranina; FIG 3C: KI-67; FIG 3D: NKX6.1 ; FIG 3E: SOX2; FIG 3F: CDX2; FIG 3G: PDX-1. En cada histograma se muestra la expresión en porcentaje para cada marcador. De manera similar a las etapas 3 y 4, más del 95 % de las células resultaron positivas para la expresión de PDX-1 , mientras que aproximadamente 10 % de las células resultaron positivas para la expresión de CDX2 y más del 67 % de las células resultaron positivas para la expresión de NKX6.1. La expresión de SOX2, a aproximadamente el 50 %, resultó inferior en comparación con la etapa 3, pero fue similar a su expresión en S4.

Las Figuras 4A a 4G representan la expresión de PDX-1 (FIG 4G), NKX6.1 (FIG 4D), CDX2 (FIG 4F), SOX2 (FIG 4E), Ki-67 (marcador de proliferación; FIG 4C) y cromogranina (marcador endocrino pancreático; FIG 4B) medido por la tinción FACS de células recolectadas y analizadas el día 7 de la etapa 5 de la diferenciación después del protocolo que se describe en este ejemplo. De manera similar a las etapas 3 y 4, >90 % de las células resultaron positivas para la expresión de PDX-1 , mientras que la expresión de CDX2 fue menor que 10 % y la expresión de NKX6.1 aumentó significativamente al >70 % y la expresión de SOX2 disminuyó dramáticamente a aproximadamente el 2 %.

Además, la mayoría de las células que expresan SOX2, CDX2 y NKX6.1 resultaron negativas para la expresión de cromogranina (vea las FIG 5A a 5C). De esta manera, los cultivos de S5 preparados de acuerdo al protocolo que se describe en este ejemplo dan como resultado una población de células en donde al menos 50 % de las células expresan PDX-1 Y NKX6.1 mientras que son negativas para CDX-2, SOX2 y cromogranina. La Tabla I resume la expresión en porcentaje de varios marcadores endodérmicos en S3 a S5.

TABLA I Expresión promedio de marcadores endodérmicos en S3 a S5 * Cantidad total de días desde el comienzo de la diferenciación.

Las Figuras 6A a 6T representan los perfiles de expresión de ARNm medidos por PCR en tiempo real de la células de S2, S3, S4 y S5 diferenciadas de acuerdo al protocolo que se describe en este ejemplo, y que se informa como un cambio en múltiplos sobre la expresión en células H1 no diferenciadas. En la Etapa 3, se observó una expresión muy baja de marcadores de la parte anterior del intestino anterior como FOXel (FIG 6C)y NKX2.1 (FIG 6E). Sin embargo, en la etapa 3, SOX2 (FIG 6M) y OSR1 (FIG 6H), que marcan la región del estómago del tubo intestinal, se regularon significativamente por incremento y su expresión disminuyó en S4 y S5. Los marcadores endodérmicos pancreáticos, como PTF a (FIG 6K), NKX6.1 (FIG 6G) y PDX-1 (FIG 61) alcanzaron los niveles de expresión máximos en S5 el día 2 del cultivo. Los datos de la PCR indican que en la etapa 3, las células hacen una transición a través de la población de PDX-1 + SOX2+ antes de transformarse en PDX-1 + NKX6.1 + SOX2- CDX2- en S4 y S5. (vea las FIG 61, FIG 6G, FIG 6M y FIG 6A.) La expresión de los marcadores endocrinos (cromogranina, insulina, glucagón y somatostatina) alcanzó un nivel de expresión máximo al final de S5. La expresión de los marcadores del precursor endocrino pancreático, NKX2.2, NeuroD y NGN3 alcanzaó un nivel de expresión máximo en S4 y S5. La expresión de otros marcadores del linaje, como ZIC1 y SOX17 permaneció baja en S4 y S5.

En conclusión, las células de la etapa 5 del día 2, que se diferenciaron después del protocolo que se describe en este ejemplo, expresan niveles bajos de CDX2 Y SOX2 mientras mantienen un nivel de expresión alto de NKX6.1 y PDX-1. Se cree que la combinación única de inhibición de BMP oportuna, el uso de una dosis baja de RA en S4 y S5, el uso de un nivel alto de glucosa en S1-S2 produce la población de células que se describe en el Ejemplo 1.

EJEMPLO 2 Efecto de la inhibición de BMP y la activación de PKC en la expresión de SOX2 en S3 y S4 El protocolo que se describe en este ejemplo se realizó para arrojar luz sobre los efectos de la inhibición de BMP, la adición de FGF7 junto con la activación de PKC en la expresión de SOX2 en S3 y S4.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 3 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1.5 µ? de compuesto MCX (inhibidor GSK3B) durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 y 3. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 y durante tres días. c. Etapa 3 (intestino anterior: 3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 20 ng/ml de activina-A, 2 µ? RA, en presencia o ausencia de 50 ng/ml de FGF7, 50 nM o 200 nM de LDN-193189, y/o 200 nM de TPB. Las células se incubaron durante tres días en un medio que usa las combinaciones enumeradas en la Tabla II, a continuación: TABLA II Tratamientos Etapa 3 d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático: 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 200 nM de TPB, 400 nM de LDN-193189, 2 µ? de inhibidor de ALk5 (SD-208, que se describe en Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161) y 100 nM de inhibidor de CYP26A (N-{4-[2-etil-1-(1 H-1 , 2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1 , 3-benzotiazol-2-amina, Janssen, Bélgica) durante tres días.

Se recoleto ARNm en S2 y S4 para todas las condiciones enumeradas anteriormente y analizadas mediante PCR en tiempo real. Las condiciones controles, en S3, se refieren a los cultivos en los que se usó FGF7, AA, SANT, RA y 200 nM de LDN-193189 en las concentraciones enumeradas en el paso c, arriba. Como evidencian los datos de PCR en las Figuras 7A a 7G, la eliminación de LDN-193189 en S3 produjo como resultado una disminución significativa de los marcadores endocrinos, como NGN3 (FIG 7D) y un marcador endocrino pancreático como cromogranina (vea la FIG 7C). La adición del activador de PKC y la eliminación de LDN-193189 en S3 redujo aún más los marcadores endocrinos mientras que aumentó la expresión de NKX6.1 (vea las FIG 7A a FIG 7G). Además, la adición de 50 nM de LDN-193189 resultó tan efectiva como 200 nM de LDN-193189 en la inducción de los marcadores endocrinos (cromogranina y NGN3). La eliminación de LDN-193189 y la adición de TPB en S3 aumentó la expresión de CDX2 (FIG 7E) y albúmina (FIG 7F) mientras que suprimió la expresión de SOX2 (FIG 7G). Por otra parte, la eliminación de FGF7 y LDN-193189 aumentó significativamente la expresión de SOX2 (FIG 7G) y redujo la expresión de albúmina (FIG 7F) en comparación con cultivos en los cuales se eliminó LDN-193189 y se retuvo FGF7. Estos datos demuestran que la modulación precisa de la inhibición de BMP, la activación de FGF y la activación de PKC pueden producir un dominio endodérmico rico en PDX-1 y NKX6.1 mientras que tiene un bajo nivel de CDX2, SOX2 y albúmina. Por último, la inhibición de BMP sostenida en S3 y S4 aumentó la expresión de genes proendocrinos más la regulación por incremento de la expresión de SOX2. Esto pone en evidencia que la inhibición de BMP necesita ser ajustada con precisión para aumentar los genes endocrinos pancreáticos mientras que no regula por incremento la expresión de SOX2 que está ausente o en un nivel bajo en el desarrollo del páncreas pero está presente en los órganos endodérmicos de la parte anterior del intestino anterior, como el estómago.

EJEMPLO 3 Se necesita una inhibición temprana de BMP en la etapa del intestino anterior para la inducción posterior de marcadores endocrinos Este ejemplo demuestra que se necesita una inhibición temprana de la señalización de BMP en S3 para la inducción posterior de marcadores endocrinos. Sin embargo, la inhibición sostenida de BMP en la etapa 3 también es resultado de la fuerte expresión de SOX2. Para obtener una expresión alta de los marcadores endocrinos junto con una expresión baja de la expresión de S0X2, se necesita un gradiente de inhibición de BMP para inducir marcadores endocrinos propancreáticos mientras se tiene una expresión baja de SX02 y CDX2.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, las células se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de incubación en medio de S1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8, 1.5 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B). Las células después se trataron durante dos días (días 2 y 4) con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): las células de la etapa 1 se trataron por tres días con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7. c. Etapa 3 (intestino anterior: 3 días): Las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 medio complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 20 ng/ml de activina-A, 2 µ? RA, 50 ng/ml de FGF7, 100 nM de LDN-193189 (el día 1 solamente o por la duración de la etapa 3) y 200 nM de TPB. En algunos cultivos, se eliminó LDN-193189 de la etapa 3. d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático: 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 100 nM de TPB, 200 nM de LDN-193189, 2 µ? de inhibidor de ALk5 y 100 nM de inhibidor de CYP26A durante tres días. e. Etapa 5 (endodermo pancreático/endocrino: 4 días): Las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 200 nM de LDN-193189 y 2 µ? de ALk5 durante cuatro días.

Como evidencian los resultados de la PCR que se muestran en las Figuras 8A a 8G, la eliminación de LDN-193189 (inhibidor de BMP) a partir de la etapa 3 suprime la expresión de los genes pro-endocrinos NGN3 (FIG 8C); NeuroD (FIG 8D); cromogranina (FIG 8E) en la etapa 4 y la etapa 5. Sin embargo, la expresión de PDX-1 (FIG 8B) y NKX6.1 (FIG 8A) no está significativamente regulada a la baja en comparación con NGN3 y NeuroD en las etapas 4 y 5. Además, la eliminación completa de LDN-193189 en la etapa 3 produce un aumento significativo en la expresión de CDX2 (FIG 7F). La adición de LDN-193189 para el primer día de la etapa 3 seguida de su eliminación los días 2 y 3 de la etapa 3 reforzó significativamente la expresión de NGN3 y NeuroD mientras disminuía la expresión de CDX2 y SOX2 en la etapa 4. Los cultivos en los que se retuvo LDN-193189 por la duración de la etapa 3 demostraron una expresión muy alta de SOX2 (FIG 8G) en S3 y S4. Este dato demuestra que la inhibición de BMP el día 1 de la etapa 3 es suficiente para activar los marcadores endocrinos pancreáticos mientras suprime la expresión de SOX2 y CDX2.

En síntesis, se necesita la inhibición de BMP el día 1 de la etapa 3 para inducir la formación de células precursoras endocrinas en las etapas 4 y 5 y para mantener la expresión de PDX-1 y NKX6.1 mientras suprime la expresión de SOX2. Además, la adición de un activador de PKC en las etapas 3 aumenta, adicionalmente, la expresión de PDX-1 y NKX6.1.

EJEMPLO 4 La inhibición de la señalización de BMP el día 1 de la etapa 3 es suficiente para generar células precursoras pancreáticas en la etapa 4, mientras que la inhibición de la señalización de BMP el último día de la etapa 3 produce una expresión significativamente menor de marcadores endocrinos Este ejemplo demuestra que la inhibición temprana de la señalización de BMP en la etapa 3 permite la inducción de marcadores precursores endocrinos pancreáticos mientras la inhibición de la señalización de BMP tardía en la etapa 3 reduce significativamente el nivel de expresión de los marcadores precursores endocrinos en la etapa 4.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en MATRIGEL™ (dilución 1 :30) platos recubiertos en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1.5 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B). Las células después se trataron durante tres días con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): Las células de la etapa 1 se trataron durante tres días con MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7. c. Etapa 3 (intestino anterior: 3 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA y las combinaciones enumeradas en la Tabla III, a continuación por tres días.

TABLA III Tratamientos Etapa 3 d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático: 3 días): Las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 100 nM de TPB, 200 nM de LDN-193189, 2 µ? de inhibidor de ALk5 y 100 nM de inhibidor de CYP26A durante tres días.

Las Figuras 9A a 9H representan el perfil de expresión genética de los marcadores de endodermo pancreático, precursor endocrino y endodermo de intestino anterior para las combinaciones de las condiciones de cultivo enumeradas anteriormente. Consistente con el ejemplo anterior, la vía de bloqueo de BMP el primer día de la etapa 3 es crítica para la inducción subsiguiente del programa endocrino medido por la expresión del marcador endocrino pancreático, cromogranina. (Ver la FIG 9C.) Sin embargo, la adición del inhibidor de BMP el día uno de la etapa 3 activa la expresión de marcadores endocrinos en las etapas posteriores. Además, la adición del inhibidor de BMP el día uno de la etapa 3 también disminuyó la expresión del marcador del intestino anterior, SOX2, en las etapas 3 y 4 (FIG 9H). Sin embargo, la adición del inhibidor de BMP solo el último día de la etapa 3 muestra una expresión significativamente mayor de SOX2 al final de la etapa 3 en comparación con células tratadas con el inhibidor de BMP solo el primer día de la etapa 3. Los niveles de expresión que se muestran en las FIG 9A a 9H son relativos a los niveles de expresión en células H1 indiferenciadas que tienen un nivel de expresión muy alto de SOX2. Además de ser un marcador de la parte anterior del intestino anterior, SOX2 es un factor de transcripción, muy conocido, importante en el mantenimiento de la pluripotencia de las células ES. Este ejemplo soporta, adicionalmente, los resultados anteriores resaltando la sensibilidad de los cultivos de la etapa 3 a la duración y cinética de señalización de BMP y posterior impacto en la inducción endocrina pancreática y expresión de SOX2.

EJEMPLO 5 La dosis óptima de la inhibición de BMP en la etapa del intestino anterior pancreático (etapa 4) Ejemplos previos describieron la duración óptima de la inhibición de BMP en la etapa 3. Este ejemplo identifica la dosis óptima del inhibidor de BMP en el medio S4.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa . Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 y 4. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 y durante tres días. c. Etapa 3 (intestino anterior: 4 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT- , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A, 100 nM de LDN-193189 y 100 nM de TPB durante un día. Las células después se cultivaron en medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A y 100 nM de TPB durante tres días. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: 4 días) las células de la etapa 3 de trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 200 nM de LDN-193189-193189, 2 µ? de inhibidor de ALk5, 100 nM de inhibidor de CYP26A y las concentraciones de LDN-193189 enumeradas en la Tabla IV (a continuación) los días 1 a 4 de la etapa 4: TABLA IV Concentraciones de LDN-193189 usadas en S4 d. Etapa 5 (precursor endocrino/endodermo pancreático: 3 días): las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 50 nM de LDN-193189 y 1 µ? de inhibidor de ALk5 durante tres días.

Los resultados de los análisis de PCR en tiempo real de células recolectadas después de los tratamientos anteriores se muestran en las Figuras 10A a 10H. Esta figura muestra que la adición de 50 nM o 100 nM de LDN-193189 los días 1 , 2, 3, o 4 de S4 puede prolongar la expresión de los marcadores endocrinos mientras mantiene una expresión baja de SOX2 en S4 y S5. (Ver las FIG 10A a 10H.) EJEMPLO 6 Dosis óptima de inhibición de BMP en la etapa del intestino anterior (etapa 3) Este ejemplo identifica la dosis óptima de la inhibición de BMP en la etapa 3 y efectos posteriores sobre los marcadores endocrinos en la etapa 6.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1.5 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) por un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 y 4. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 y durante tres días c. Etapa 3 (intestino anterior: 3 días): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A, 100 nM de TPB y 10-50 nM de LDN-193189 durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A y 00 nM de TPB durante dos días. d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático: 3 días): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 20 nM de LDN-193189; 2 µ? de inhibidor de ALk5; 100 nM de inhibidor de CYP26 A y 100 nM de TPB durante tres días. e. Etapa 5 (precursor endocrino/endodermo pancreático: 3 días): las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X; 2.5 mM de glucosa; 1X GlutaMax™; 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico; 2 % de BSA libre de ácidos grasos; +/- 25 nM de LDN-193189 y/o 2 µ? de inhibidor de ALk5 durante tres días. f. Etapa 6 (productora de hormona endocrina pancreática: 3 días) las células de la etapa 5 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X; 2.5 mM de glucosa; 1X GlutaMax™; 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico; y 2 % de BSA libre de ácidos grasos durante tres días.

Las Figuras 11A a 11 H muestran que se necesita una inhibición de baja a moderada de BMP el primer día de la etapa 3 para activar la expresión de los marcadores endocrinos mientras mantiene una baja expresión de SOX2. Además, la inhibición de BMP en la etapa 5, mientras aumenta los marcadores endocrinos, también conduce a una regulación en incremento de la expresión de SOX2.

Los datos en este ejemplo confirman, adicionalmente, los resultados presentados en los ejemplos anteriores. Los datos confirman que se necesita una modulación precisa de la vía de BMP en las etapas 3 y 5 para activar la inducción de marcadores endocrinos pancreáticos mientras se suprime la expresión de SOX2.

EJEMPLO 7 Ventana óptima para la inhibición de BMP en S3 (etapa de intestino anterior) Este ejemplo identifica la ventana óptima de tiempo en la etapa 3 para la inhibición de la señalización de BMP mientras se preserva la inducción endocrina en etapas posteriores y la reducción de la expresión de SOX2.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 y 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1.5 µ? de compuestos MCX durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 y 4. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 3 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 y durante tres días c. Etapa 3 (intestino anterior: 3 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A y 100 nM de TPB, que contenía 100 nM de LDN-193189 solo por las primeras 2 horas, 6 horas o 24 horas de la etapa 3. d. Etapa 4 (precursor del intestino anterior pancreático: 3 días): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos graso, 25 nM de LDN-193189, 2 µ? de inhibidor de ALk5, 100 nM de inhibidor de CYP26 A y 100 nM de TPB durante tres días. e. Etapa 5 (precursor endocrino/endodermo pancreático: 3 días): las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos y 2 µ? de inhibidor de Al_k5 durante tres días.

Las Figuras 12A a 12G muestra los análisis de PCR en tiempo real para los datos reunidos en este ejemplo. El tratamiento de la etapa 3 por lo menos durante 2 horas con un inhibidor de BMP puede activar la expresión de los factores de transcripción pro-endocrina como Ngn3 (FIG 12D) y NeuroD (FIG 12E) mientras mantiene una expresión muy baja de SOX2 (FIG 12G) y aumenta significativamente la expresión de NKX6.1 (FIG 12A) y PDX-1 (FIG 12B) en S4-S5. Sin embargo, en la etapa 5 día 3, la expresión de CDX2 resultó mayor en las células tratadas por 2 o 6 horas con inhibidor de BMP que en las células tratadas por 24 horas con el inhibidor (FIG 12F).

Los datos de este ejemplo sugieren que una inhibición de la vía de BMP durante 24 horas es óptima para mantener un nivel bajo de expresión de CDX2 y expresión de SOX2 y para iniciar la diferenciación endocrina mientras se mantiene una alta expresión de marcadores endodérmicos pancreáticos.

EJEMPLO 8 Duración óptima de las etapas 3 (etapa de intestino anterior) y etapa 4 (etapa precursora del intestino anterior pancreático) Este ejemplo se llevó a cabo para determinar la duración óptima de S3 y S4 en la diferenciación gradual de células pluripotentes a una población de células de linaje endocrino pancreático.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se recolectaron en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) y se sembraron como células individuales en una densidad de 100,000 células/cm2 en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 complementado con 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 4 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™; 2.5 mM de D-glucosa; 100 ng/ml de GDF8 y 1.5 µ? de compuesto MCX (inhibidor GSK3B) durante un día. Las células se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos; 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico; 1X GlutaMax™; 2.5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 durante los días 2 a 4; entonces b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 2 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 2.5 mM de D-glucosa y 50 ng/ml de FGF7 y durante dos días. c. Etapa 3 (intestino anterior: 2 a 3 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A y 100 nM de TPB, que contenía 100 nM de LDN-193189 durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1, 50 ng/ml de FGF7, 2 µ? RA, 20 ng/ml de activina-A y 100 nM de TPB. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: días 2 y 3): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos graso, 25 nM de LDN-193189, 100 nM de inhibidor de CYP26 A y 100 nM de TPB durante dos o tres días. e. Etapa 5 (precursor endocrino/endodermo pancreático: 2 días): las células se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos y 1 µ? de inhibidor de ALk5 durante dos días. f. Etapa 6 (hormona/precursor endocrino pancreático: 2 días): las células de la etapa 5 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico y 2 % de BSA libre de ácidos grasos durante dos días.

Los datos de los análisis de PCR en tiempo real de muestras recolectadas en la etapa 3, etapa 4, etapa 5, o etapa 6 se muestran en las Figuras 13A a 13G. Este dato muestra que extender S3 y S4 a tres días aumenta la expresión de NKX6.1 , cuando se compara con cultivos que tienen S3 y S4 de dos días (FIG 13A). Las células tratadas durante tres días en la etapa 3 muestra una regulación hacia la baja de la expresión de marcadores proendocrinos cuando se compararon con cultivos en los cuales la duración de S3 y S4 fue de solo dos días (FIG 13D y FIG 13E). Además, prolongar la etapa 4 a tres días aumentó significativamente la expresión de SOX2 (FIG 13G).

Los datos obtenidos en este ejemplo son compatibles con los datos generados en los ejemplos anteriores al mostrar que la inhibición de BMP prolongado inclina el intestino anterior hacia una población con alto nivel de SOX2. En base a los datos de este ejemplo y a los ejemplos anteriores, se puede concluir que la duración óptima de la etapa 3 y la etapa 4 es de dos días. El protocolo ideal dará como resultado células diferenciadas con altos niveles de expresión de los marcadores pro-endocrinos, alta expresión de NKX6.1 , baja expresión de CDX2 y de SOX2.

EJEMPLO 9 La exposición prolongada a la inhibición de BMP en presencia de alta glucosa y complemento de B27 aumenta significativamente la expresión de SOX2 en S3 y S4 Este protocolo se realizó para determinar los factores que afectan la expresión de SOX2 en S3 y S4 durante la diferenciación gradual de células pluripotentes en células productoras de hormonas.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se cultivaron en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1:30) y cultivados en medio mTesr™1 hasta ~70 % de confluencia y diferenciada como sigue: a. Las células indiferenciadas se cultivaron en medio RPMI (Invitrogen) complementado con 0.2 % de FBS; 100 ng/ml de activina A; 20 ng/ml de WNT-3a durante un día. Las células después se trataron con medio RPMI complementado con 0.5 % de FBS; 100 ng/ml de activina A durante dos días adicionales (etapa 1). b. Las células de la etapa 1 se trataron con medio DMEM/F12 complementado con 2 % de FBS; 50 ng/ml de FGF7 durante tres días (etapa 2). c. Las células de la etapa 2 se cultivaron en medio DMEM-alta glucosa complementado con 1 % de B27; 0.25 µ? SANT-1 ; 2 µ? RA; 100 ng/ml de Noggin (R & D systems, MN, EE. UU.) durante cuatro días (etapa 3). d. Las células de la etapa 3 se trataron con medio DMEM-alta glucosa complementado con 1 % de B27; 100 ng/ml de Noggin; 1 µ? de inhibidor de ALK5 II (Axxora, CA, EE. UU.); y 50 nM de TPB durante cuatro días (etapa 4).

Las Figuras 14A a 14H representan histogramas FACS para células recolectadas en la etapa 3 día 4 obtenidas para los siguientes marcadores: control de isotipo (Fig 14A), cromogranina (FIG 14B), KI-67 (FIG 14C), NKX6.1 (FIG 14D), SOX2 (FIG 14E), HNF3B (FIG 14F), CDX2 (FIG 14G), PDX-1 (FIG 14H). La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma. La mayoría de las células de la etapa 3 resultó positiva para la expresión de PDX-1 (FIG 14H) y HNF3B (FIG 14F), negativa para la expresión de NKX6.1 (FIG 14D) y se mostró una expresión baja de cromogranina(FIG 14B) y CDX2 (FIG 14G). Sin embargo, más del 90 % de las células también resultaron fuertemente positivas para SOX2 (FIG 14E). Esto indica que en la etapa 3, la mayoría de las células resultaron positivas para PDX-1 y SOX2 y negativas para NKX6.1 lo que sugiere el establecimiento de una población endodérmica compatible con una población de intestino anterior al dominio de PDX-1 del páncreas.

Además, el porcentaje de las células que eran SOX2+ en la etapa 3, en la población de células generadas mediante el uso del protocolo que se describe en este ejemplo, resultó significativamente mayor que el porcentaje de células que eran SOX2+ en la población de células generadas mediante el uso del protocolo que se describe en el Ejemplo 1. Esta diferencia se puede atribuir a la exposición prolongada al antagonista de BMP Noggin, falta de FGF7 y activador de PKC en el medio de cultivo de la etapa 3 de este ejemplo.

Las Figuras 15A a 15G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S4 día 2 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9: FIG 15A: control de isotipo, FIG 15B: NKX6.1, FIG 15C: KI-67, FIG 15D: cromogranina, FIG 15E: SOX2, FIG 15F: CDX2, FIG 15G: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 16A a 16F muestra los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S4 el día 4 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9. FIG 16A: control de isotipo, FIG 16B: NKX6.1 , FIG 16C: cromogranina, FIG 16D: SOX2, FIG 16E: CDX2, FIG 16F: PDX-1. La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

La Tabla V, a continuación, resume los datos obtenidos para la expresión en % de marcadores endodérmicos en S3 y S4 para las células difdiferenciadas acuerdo al protocolo que se describe en este ejemplo.

TABLA V % de expresión de marcadores endodérmicos en S3 y S4 Las Figuras 17A a 17J representan los resultados del análisis PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 9. FIG 17A: CDX2, FIG 17B: HHex, FIG 17C: FOXE1 , FIG 17D: IPF1 (PDX-1), FIG 17E: NKX2.1 , FIG 17F: NKX2.2, FIG 17G: NKX6.1 , FIG 17H: PROX1 , FIG 171: SOX2, FIG 17J: SOX9.

Como se observa en las Figuras 14A a 17J y en la Tabla V, los días 2 a 4 de la etapa 4, hubo un aumento significativo en la expresión de NKX6.1 mientras se mantenía una expresión alta de PDX-1. Sin bien la expresión de SOX2 disminuyó de la etapa 3 a la etapa 4, -75 % de las células aún eran SOX2+. Al igual que en las Figuras 5A a 5C, las células CDX2+, las células S0X2+ y las células NKX6.1+ se excluyeron mutuamente de la población de cromogranina. Esto implica que la población de células de la etapa 4 día 4 generadas mediante el uso del protocolo que se describe en el Ejemplo 9 tiene -50 % NKX6.1+ SOX2+ PDX-1+ fracción de cromogranina negativa de CDX2. Esto se contrapone a la población celular generada en el Ejemplo 1 que tuvo 40 a 70 % PDX-1+ NKX6.1+ fracción de cromogranina negativa de SOX2 y CDX2 y 2-25 % PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+ en S4-S5. Claramente, las células generadas mediante el uso del protocolo del Ejemplo 1 tuvo un porcentaje bastante mayor de endodermo pancreático, según se define como una población que es PDX-1+ y NXK6.1+ mientras que es bajo o negativo para SOX2 y CDX2, según se comparó con las células generadas en el Ejemplo 9.

Los datos obtenidos en este ejemplo respaldan el hecho de que la exposición prolongada a la inhibición de BMP en presencia de alto contenido de glucosa y complemento de B27 aumenta significativamente la expresión de SOX2 en las etapas 3 y 4 de la diferenciación.

EJEMPLO 10 El protocolo publicado anteriormente da como resultado la formación de una cantidad significativa de la población de SOX2+ en las etapas 3 y 4 Kroon et al. publicaron un protocolo para preparar células del linaje endodérmico pancreático de células madre embrionarias humanas (Nature Biotech 2008, 26: 443-452; en adelante "Kroon"). En el ejemplo que se proporciona aquí, las células madre embrionarias humanas se diferenciaron al seguir el protocolo Kroon y ensayar la expresión de marcadores característicos de las diferentes etapas de diferenciación.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 se colocaron en placas en platos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) y cultivados en medio mTesr™1 hasta el -70 % de confluencia y se diferenció mediante el uso del protocolo publicado anteriormente por Kroon como sigue: a) Las células indiferenciadas fueron expuestas al medio RPMI complementado con 0.2 % de FBS, 100 ng/ml de activina A, 20 ng/ml de WNT-3a durante un día seguido por el tratamiento con medio RPMI complementado con 0.5 % de FBS, 100 ng/ml de activina A durante dos días adicionales (etapa 1). b) Las células de la etapa 1 fueron expuestas al medio RPMI complementado con 2 % de FBS, 50 ng/ml de FGF7 durante tres días (etapa 2). c) Las células de la etapa 2 se trataron con medio DMEM-alta glucosa complementado con 1 % de B27, 0.25 µ? SANT-1 , 2 µ? RA, 50 ng/ml de Noggin (R & D systems, MN) durante tres días (etapa 3). d) Las células de la etapa 3 se cultivaron en medio DMEM-alta glucosa complementado con 1 % de B27 durante tres días (etapa 4). e) Las células de la etapa 4 se rasparon de los pocilios y se volvieron a suspender como grupos en medio DMEM-alta glucosa complementado con 1 % de B27 durante dos días.

Las Figuras 18A a 18G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores en S3 día 3 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 10: Control de isotipo (FIG 18A), NKX6.1 (FIG 18B), cromogranina (FIG 18C), SOX2 (FIG 18D), CDX2 (FIG 18E), KI-67 (FIG 18F), PDX-1 (FIG 18G). La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Las Figuras 19A a 19G muestran los perfiles de expresión del histograma FACS de los siguientes marcadores el día 5 de células diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 10. Control de isotipo (FIG 19A), NKX6.1 (FIG 19B), cromogranina (FIG 19C), SOX2 (FIG 19D), CDX2 (FIG 19E), KI-67 (FIG 19F), PDX-1 (FIG 19G). La expresión en porcentaje para cada marcador se muestra en cada histograma.

Como se muestra en las Figuras 18A a 19G, hacia el final de la etapa 4 (día 5) los grupos de células en suspensión eran -20 % NKX6.1 + PDX-1 + SOX2- y -20 % PDX-1 + NKX6.1+ SOX2+. Estos resultados indican que se generó una fracción significativa de la población de células de la etapa 4 de acuerdo al Ejemplo 10 que era NKX6.1 + también era SOX2+.

La Tabla VI, que se presenta a continuación, resume los porcentajes de marcadores endodérmicos en S3 y S4 de células generadas en este ejemplo.

TABLA VI Expresión de marcadores endodérmicos en S3 y S4 en células diferenciadas de acuerdo a Kroon Últimos dos días en cultivo en suspensión.

EJEMPL0 11 La adición de ácido ascórbico da como resultado una disminución significativa en la cantidad de células polihormonales y un aumento concomitante en la cantidad de células positivas a la insulina hormonal individuales Se probó el efecto del ácido ascórbico sobre la expresión de los marcadores durante la diferenciación de células pluripotentes a las células productoras de hormonas. Las células se cultivaron en medio complementado con glucosa en cada paso de diferenciación y complementado con ácido ascórbico en la formación de las etapas 3, 4 y 5 como sigue: Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 y 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (endodermo definitivo (ED): 3 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 100 nM de compuesto MCX durante dos días, seguido de un día adicional en medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 2 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días. c. Etapa 3 (intestino anterior: 2 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 µ? SANT-1 , 1 µ? RA, 200 nM de TPB (activador de PKC), 100 nM de LDN-193189 (inhibidor del receptor de BMP) durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 µ? SANT-1 , 1 µ? RA, 200 nM de TPB (activador de PKC), 10 nM de LDN-193189 durante un día adicional. Algunos cultivos se trataron con 0.25 mM de ácido ascórbico (catálogo núm. A4544, Sigma, MO, EE. UU.) por la duración de la etapa 3. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: 2 días): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 nM RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189, con o sin 0.25 mM de ácido ascórbico durante dos días. e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 2 a 7 días): las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 nM de RA, con o sin 0.25 mM de ácido ascórbico durante 2 a 7 días.

Las Figuras 20A a 20J representan el análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los genes siguientes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 11. FIG 20A: somatostatina, FIG 20B: PDX1 , FIG 20C: Pax6, FIG 20D: Pax4, FIG 20E: NKX6.1 , FIG 20F: NGN3, FIG 20G: glucagón, FIG 20H: NeuroD, FIG 20I: insulina, FIG 20J: cromogranina. Esta figura muestra que una adición de ácido ascórbico en la etapa 3 o en las etapas 3 y 4 disminuyó significativamente la expresión de somatostatina y glucagón en las etapas 4 y 5 mientras aumentaba la expresión de insulina (vea las FIG 20A, 20G y 201). Además, en las etapas 4 y 5 la expresión de los marcadores endodérmicos pancreáticos, como PDX-1 y NKX6.1 no resultaron alterados significativamente por la adición de 0.25 mM de ácido ascórbico (vea las FIG 20B y 20D). en las etapas 4 y 5, la expresión de Pax6 se reguló hacia la baja y la expresión de Pax4 se mantuvo (vea las FIG 20C y FIG 20D). Al final de la etapa 5, se realizó tinción inmune para las hormonas insulina, glucagón y somatostatina de los cultivos tratados con +/-ácido ascórbico en S3 y S5. La Tabla VII resume el porcentaje promedio de células positivas a insulina, células positivas a glucagón y somatostatina y células polihormonales (dos expresiones hormonales más en una célula).

TABLA VII Expresión de hormonas como porcentaje de un recuento total de hormonas EJEMPLO 12 Dosis óptima de ácido ascorbico en la etapa 3 Este ejemplo se llevó a cabo para determinar la dosis óptima de ácido ascorbico que se usará para generar células positivas a la insulina que son hormonales individuales, positivas a PDX-1y positivas a NKX6.1.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1 :30) en medio mTesr™1 y 10 µ? de Y27632. Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (Endodermo definitivo (ED): 3 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa y 100 ng/ml de GDF8 más 1 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. Las células se trataron, después, con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8 más 100 nM de compuesto MCX el día dos, seguido de un día adicional en medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 2 días): las células de la etapa 1 se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, con o sin la adición de 0.25 mM de ácido ascórbico y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días. c. Etapa 3 (intestino anterior: 2 días): las células de la etapa 2 se trataron con medio MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 µ? SANT-1, +/- 0.25 mM de ácido ascórbico, 1 µ? RA, 200 nM de TPB, 100 nM de LDN-193189 durante el día 1 , seguido del tratamiento con medio MCDB131 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 µ? SANT-1, +/- 0.25 mM de ácido ascórbico, 1 µ? RA, 200 nM de TPB, 10 nM de LDN-193189 durante un día adicional. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: 2 días): las células de la etapa 3 se trataron con medio MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 nM de RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189, con o sin la adición de 0.25 mM a 1 mM de ácido ascórbico durante dos días. e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 2 a 9 días): las células de la etapa 4 se trataron con medio MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 nM de RA, con o sin la adición de 0.25 mM de ácido ascórbico durante 2 a 9 días.

Las Figuras 21 A a 21 J representan datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de los siguientes genes en células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 12. FIG 21 A: somatostatina, FIG 21 B: PDX1 , FIG 21 C: Pax6, FIG 21 D: Pax4, FIG 21E: NKX6.1, FIG 21 F: NGN3, FIG 21G: NeuroD, FIG 21 H: insulina, FIG 211: glucagón, FIG 21 J: cromogranina. En forma compatible con los datos del Ejemplo 10, la adición de ácido ascórbico en las etapas 1 a 4 redujo significativamente la expresión de somatostatina, glucagón y Pax6 mientras mantuvo la expresión de insulina y Pax4 en la etapa 5. Además, no se observó un beneficio significativo con el uso, en S4, de 0.5-1 mM de ácido ascórbico en comparación con 0.25 mM de ácido ascórbico. Por último, la adición de ácido ascórbico en la etapa 2 también resultó efectiva para reducir la expresión de glucagón y somatostatina en la etapa S3 a 5 mientras mantenía la expresión de insulina. Por lo tanto, el ácido ascórbico actúa en una forma específica para la etapa para regular la expresión de células hormonales individuales. La adición de ácido ascórbico es importante en las etapas tempranas del protocolo de diferenciación, mientras que las etapas tardías no resultaron tan efectivas en la reducción de la cantidad de células polihormonales.

EJEMPLO 13 La combinación del ácido retinoico v ácido ascórbico es necesaria para generar células positivas a la insulina hormonal individual Este ejemplo se llevó a cabo para arrojar luz en los requisitos para generar células positivas a la insulina hormonal individual durante la diferenciación de células pluripotentes.

Las células de la línea de células madre embrionarias humanas H1 en varios pasajes (pasaje 40 a pasaje 52) se sembraron como células individuales a una densidad de 100,000 células/cm2 en discos recubiertos MATRIGEL™ (dilución 1:30) en medio mTesr™1 y 10 µ? de Y27632.

Cuarenta y ocho horas después de la siembra, los cultivos se diferenciaron en células del linaje endocrino pancreático como sigue: a. Etapa 1 (Endodermo definitivo (ED): 3 días): antes del comienzo del ED, los cultivos se lavaron e incubaron con PBS incompleto (sin Mg o Ca) durante 30 segundos seguido de la adición del medio de la etapa 1. Las células madre embrionarias humanas cultivadas como células individuales en platos recubiertos MATRIGEL™ se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™ y 5 mM de D-glucosa, 100 ng/ml de GDF8 y 1 µ? de compuesto MCX (inhibidor de GSK3B) durante un día. Las células después se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, bicarbonato de sodio, GlutaMax™, 5 mM de glucosa adicional, 100 ng/ml de GDF8 y 100 nM de compuesto MCX el día dos seguido de un día adicional en medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato de sodio, 1X GlutaMax™, 5 mM de glucosa y 100 ng/ml de GDF8. b. Etapa 2 (tubo intestinal primitivo: 2 días): las células se trataron con medio MCDB-131 complementado con 0.1 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.0012 g/ml de bicarbonato sódico, 1X GlutaMax™, 5 mM de D-glucosa, 0.25 mM de ácido ascórbico y 25 ng/ml de FGF7 durante dos días, después. c. Etapa 3 (intestino anterior: 2 días): las células se trataron con MCDB131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GlutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 mM de ácido ascórbico, 0.25 µ? SANT-1 , 1 µ? RA, 200 nM de TPB, 100 nM de LDN-193189 durante el día 1 , seguido del tratamiento con MCDB 31 complementado con una dilución 1:200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GIutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 10 ng/ml de activina A, 25 ng/ml de FGF7, 0.25 mM de ácido ascórbico, 0.25 µ? SANT-1, 1 µ? RA, 200 nM de TPB, 10 nM de LDN-193189 durante un día adicional. d. Etapa 4 (precursor de intestino anterior pancreático: 2 días): las células se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GIutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos, 0.25 µ? SANT-1 , 50 nM de RA, 200 nM de TPB, 50 nM de LDN-193189, 0.1 mM de ácido ascórbico durante dos días, después. e. Etapa 5 (endodermo pancreático, 3 días): las células se trataron con medio MCDB-131 complementado con una dilución 1 :200 de ITS-X, 2.5 mM de glucosa, 1X GIutaMax™, 0.0015 g/ml de bicarbonato sódico, 2 % de BSA libre de ácidos grasos y las siguientes condiciones de cultivo durante 3 días: • +0.1 mM de ácido ascórbico • 0.1 mM de ácido ascórbico + 50 nM de RA · 0.1 mM de ácido ascórbico + 50 nM de RA + 0.25 µ? SANT-1 • 0.1 mM de ácido ascórbico + 50 nM de RA + 0.25 µ? SANT-1 + 50 nM de LDN-193189 • 0.1 mM de ácido ascórbico + 50 nM de RA + 0.25 µ? SANT-1+ 1 µ? de inh. de Alk5 • 0.1 mM de ácido ascórbico + 50 nM de RA + 0.25 µ? SANT-1+ 1 µ? de inh. de Alk5 + 50 nM de LDN-193189.

Las Figuras 22A a 22L muestran datos del análisis de PCR en tiempo real de la expresión de Pax4 (FIG 22A); Pax6 (FIG 22B); PDX1 (FIG 22C); PTF1a (FIG 22D); glucagón (FIG 22E); insulina (FIG 22F); NeuroD (FIG 22G); ngn3 (FIG 22H); Zic1 (FIG 22I); CDX2 (FIG 22J); albúmina (FIG 22K); NKX6.1 (FIG 22L) en células de la línea de células madre embrionarias H1 diferenciadas de acuerdo al Ejemplo 13 y recolectadas en S5 el día 3.

Al final de la etapa 5, a los cultivos tratados con las combinaciones enumeradas anteriormente se les realizó tinción inmune para las hormonas insulina, glucagón y somatostatina. La Tabla resume el porcentaje promedio de células positivas a insulina, células positivas a glucagón y somatostatina y células polihormonales (dos expresiones hormonales más en una célula).

Como se muestra en las Figuras 22A a 22L y en la Tabla VIII, debajo, la adición de una dosis baja de ácido retinoico más ácido ascórbico en la etapa 5 redujo significativamente la cantidad general de células positivas a hormonas mientras aumentó el porcentaje de células positivas de insulina hormonales individuales en comparación con cultivos tratados con vitamina C en S5. Además, la combinación de ácido retinoico, ácido ascórbico, inhibidor del erizo Sonic y el inhibidor de ALK5 aumentó, adicionalmente, la cantidad de células positivas a la insulina hormonal individual en comparación con cultivos tratados solo con ácido ascórbico (vitamina C). Este dato indica que se necesita una combinación única de factores para generar células positivas a la insulina hormonal individual.

TABLA VIII Expresión de hormonas como porcentaje del recuento hormonal total en S5 el día 3

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas in vitro obtenida de la diferenciación gradual de células pluripotentes, en donde las células en cada paso de la diferenciación se cultivan en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

2. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque más del 30 % de las células endodérmicas pancreáticas diferenciadas son PDX-1 + NKX6.1 +, SOX2- y CDX2-.

3. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada además porque más del 10 % de las células de la población diferenciada son células positivas de insulina hormonales individuales.

4. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio complementado adicionalmente con un ligando de TGF-B.

5. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células madre embrionarias humanas indiferenciadas en un medio complementado adicionalmente con un activador de WNT.

6. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células endodérmicas definitivas en un medio complementado adicionalmente con un ligando de FGF.

7. La población diferenciada de células de endodermo pancreático de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células del tubo intestinal en un medio complementado adicionalmente con un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide, y un gradiente de un inhibidor de BMP.

8. La población diferenciada de células de endodermo pancreático de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células de la parte posterior del intestino anterior en un medio complementado adicionalmente con un inhibidor de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide, y un inhibidor de BMP.

9. La población de células endodérmicas pancreáticas diferenciadas de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada además porque la diferenciación gradual comprende el cultivo de células en un medio complementado adicionalmente con ácido ascórbico.

10. Un método in vitro para la diferenciación gradual de células pluripotentes en una población de células del linaje endodérmico pancreático, que comprende cultivar células en cada etapa de diferenciación en un medio que comprende de 5 mM a 20 mM de glucosa.

11. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar las células pluripotentes en células de endodermo definitivo (ED) mediante el cultivo de las células pluripotentes en un medio complementado con un ligando TGF-B y un activador de WNT.

12. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar las células de ED en células del tubo intestinal mediante el cultivo de células de ED complementado con un ligando FGF.

13. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar las células del tubo intestinal en células de la parte posterior del endodermo del intestino anterior mediante el cultivo de las células del tubo intestinal en un medio complementado con un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide, y un inhibidor de BMP.

14. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar las células de la parte posterior del endodermo del intestino anterior en células del intestino anterior pancreático mediante el cultivo de las células de la parte posterior del endodermo del intestino anterior en un medio complementado con un activador de PKC, un inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP.

15. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar las células del intestino anterior pancreático mediante el cultivo de las células del intestino anterior pancreático en un medio complementado con un inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide.

16. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque comprende adicionalmente diferenciar de células de endodermo pancreático en una población de células beta pancreáticas.

17. El método in vitro de conformidad con las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado además porque al menos en un paso el medio se complementa adicionalmente con ácido ascórbico.

18. El método in vitro de conformidad con las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado además porque más del 10 % de las células de la población diferenciada son células positivas a la insulina hormonal individual.

19. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque más del 30 % de las células endodérmicas pancreáticas del cultivo son PDX-1+, NKX6.1+, SOX2-, y CDX2-.

20. Un método in vitro para diferenciar células madre embrionarias humanas diferenciadas en células beta pancreáticas; el método comprende: a) cultivar células madre embrionarias humanas no diferenciadas en medio complementado con glucosa, un ligando TGF-B y un activador de WNT, para generar una población de células de endodermo definitivo (ED); b) cultivar células de ED en un medio complementado con glucosa, y un ligando FGF para generar una población de células del tubo intestinal; c) cultivar células de tubo intestinal en un medio complementado con glucosa, un inhibidor de shh, un ligando FGF, un activador de PKC, un ligando TGF-B, un retinoide y un gradiente de un inhibidor de BMP para generar una población de células posteriores de endodermo de intestino anterior que expresan PDX-1 y SOX2; d) cultivar células posteriores de intestino anterior en un medio complementado con glucosa, un activador de PKC, inhibidor de shh, un retinoide y un inhibidor de BMP para generar una población de células de intestino anterior pancreático que expresan PDX-1 y NKX6.1 y que expresan un nivel menor de SOX2 en comparación con las células de la parte posterior del intestino anterior; e) cultivar células de intestino anterior pancreáticas en un medio complementado con glucosa, inhibidor de shh, un inhibidor de TGF-B y un retinoide para obtener una población de células de endodermo pancreático que expresan PDX-1 , un mayor nivel de NKX6.1 y un menor nivel de SOX2 en comparación con las células pancreáticas de intestino anterior; y f) diferenciar células endodérmicas pancreáticas en una población de células beta pancreáticas.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la población de células beta pancreáticas es PDX-1 +, NKX6.1+, SOX2- y CDX2-.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20 o 21 , caracterizado además porque al menos un paso del medio se complementa adicionalmente con el ácido ascórbico.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque las células beta pancreáticas son células productoras de hormona insulina individual que son, además, NKX6.1+ y PDX-1 +.