RS68035B1 - Diferencijacija humanih embrionalnih matičnih ćelija u pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije - Google Patents

Diferencijacija humanih embrionalnih matičnih ćelija u pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije

Info

Publication number
RS68035B1
RS68035B1 RS20260511A RSP20260511A RS68035B1 RS 68035 B1 RS68035 B1 RS 68035B1 RS 20260511 A RS20260511 A RS 20260511A RS P20260511 A RSP20260511 A RS P20260511A RS 68035 B1 RS68035 B1 RS 68035B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
pancreatic
expression
differentiation
medium supplemented
Prior art date
Application number
RS20260511A
Other languages
English (en)
Inventor
Alireza Rezania
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of RS68035B1 publication Critical patent/RS68035B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

[0001] Opis
[0002] OBLAST PRONALASKA
[0003] Predmetni pronalazak je u oblasti ćelijske diferencijacije. Konkretnije, pronalazak se odnosi na in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija u populaciju ćelija pankreasne endodermne loze, kao što je navedeno u patentnim zahtevima, na primer, pri čemu više od 10% ćelija u diferenciranoj populaciji su pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije. Štaviše, pronalazak se odnosi na in vitro postupak za diferencijaciju humanih embrionalnih matičnih ćelija u pankreasne beta ćelije, kao što je navedeno u patentnim zahtevima.
[0005] STANJE TEHNIKE
[0006] Napredak u terapiji zamene ćelija za dijabetes melitus tipa I i nedostatak transplantabilnih Langerhansovih ostrvaca usmerili su pažnju na razvoj izvora ćelija koje proizvode insulin, ili β ćelija, pogodnih za kalemljenje. Jedan pristup je stvaranje funkcionalnih β ćelija iz pluripotentnih matičnih ćelija, kao što su, na primer, embrionalne matične ćelije.
[0008] U embrionalnom razvoju kičmenjaka, pluripotentna ćelija stvara grupu ćelija koje se sastoje od tri klicina sloja (ektoderm, mezoderm i endoderm) u procesu poznatom kao gastrulacija. Tkiva kao što su štitna žlezda, timus, pankreas, creva i jetra razviće se iz endoderma, preko međufaze. Međufaza u ovom procesu je formiranje definitivnog endoderma. Ćelije definitivnog endoderma eksprimuju brojne markere, kao što su HNF3beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 i SOX17.
[0010] Do kraja gastrulacije, endoderm je podeljen na prednje-zadnje domene koji se mogu prepoznati ekspresijom niza faktora koji jedinstveno obeležavaju prednji, srednji i zadnji region endoderma. Na primer, Hhex i Sox2 identifikuju prednji region, dok Cdx1, 2 i 4 identifikuju zadnju polovinu endoderma.
[0012] Migracija endodermnog tkiva dovodi endoderm u neposrednu blizinu različitih mezodermalnih tkiva koja pomažu u regionalizaciji crevne cevi. Ovo se postiže obiljem sekretovanih faktora, kao što su FGF, Wnt, TGF-B, retinoinska kiselina (RA) i BMP ligandi i njihovi antagonisti. Na primer, FGF4 i BMP pospešuju ekspresiju Cdx2 u pretpostavljenom endodermu zadnjeg creva i potiskuju ekspresiju prednjih gena Hheks i SOX2 (Development 2000, 127:1563-1567). Takođe je pokazano da WNT signalizacija deluje paralelno sa FGF signalizacijom kako bi se podstakao razvoj zadnjeg creva i inhibirala sudbina prednjeg creva (Development 2007, 134:2207-2217). Konačno, retinoinska kiselina koju luči mezenhim reguliše granicu između prednjeg i zadnjeg creva (Curr Biol 2002, 12:1215-1220).
[0014] Nivo ekspresije specifičnih transkripcionih faktora može se koristiti za označavanje identiteta tkiva. Tokom transformacije definitivnog endoderma u primitivnu crevnu cev, crevna cev postaje regionalizovana u široke domene koji se mogu posmatrati na molekularnom nivou ograničenim obrascima ekspresije gena. Na primer, regionalizovani domen pankreasa u crevnoj cevi pokazuje veoma visoku ekspresiju PDX-1 i veoma nisku ekspresiju CDX2 i SOX2. Slično tome, prisustvo visokih nivoa Foxel-a ukazuje na tkivo jednjaka; NKX2.1 je visoko eksprimovan u plućnom tkivu; SOX2/Odd1 (OSR1) su visoko eksprimovani u želudačnom tkivu; ekspresija PROX1/Hhex/AFP je visoka u tkivu jetre; SOX17 je visoko eksprimovan u tkivima bilijarnih struktura; PDX1, NKX6.1/PTfla i NKX2.2 su visoko eksprimovani u tkivu pankreasa; a ekspresija CDX2 je visoka u tkivu creva. Gore navedeni rezime je adaptiran iz Dev Dyn 2009, 238:29-42 i Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221‑251.
[0016] Formiranje pankreasa nastaje diferencijacijom definitivnog endoderma u pankreasni endoderm (Annu Rev Cell Dev Biol 2009, 25:221‑251; Dev Dyn 2009, 238:29‑42). Dorzalni i ventralni pankreasni domeni nastaju iz epitela prednjeg creva. Iz prednjeg creva takođe nastaju jednjak, dušnik, pluća, štitna žlezda, želudac, jetra, pankreas i žučni putevi.
[0018] Ćelije pankreasnog endoderma eksprimuju pankreasno-duodenalni homeoboks gen PDX1. U odsustvu PDX1, pankreas se ne razvija dalje od formiranja ventralnih i dorzalnih pupoljaka. Stoga, ekspresija PDX1 označava kritičan korak u pankreasnoj organogenezi. Zreli pankreas sadrži, između ostalih tipova ćelija, egzokrino tkivo i endokrino tkivo. Egzokrino i endokrino tkivo nastaju diferencijacijom pankreasnog endoderma.
[0019] D’Amour i sar. opisuju proizvodnju obogaćenih kultura definitivnog endoderma izvedenog iz humanih embrionalnih matičnih ćelija u prisustvu visoke koncentracije aktivina i niskog seruma (Nature Biotechnol 2005, 23:1534‑1541; U.S. Patent br. 7,704,738). Transplantacija ovih ćelija ispod bubrežne kapsule miševa rezultirala je diferencijacijom u zrelije ćelije sa karakteristikama endodermalnog tkiva (U.S. Patent br. 7,704,738). Definitivne endodermne ćelije izvedene iz humanih embrionalnih matičnih ćelija mogu se dalje diferencirati u PDX1 pozitivne ćelije nakon dodavanja FGF-10 i retinoinske kiseline (U.S. patentna publikacija br. 2005/0266554A1). Naknadna transplantacija ovih prekursorskih ćelija pankreasa ispod bubrežne kapsule imunodeficijentnih miševa rezultirala je formiranjem funkcionalnih endokrinih ćelija pankreasa nakon faze sazrevanja od 3-4 meseca (U.S. Patent br.7,993,920 i U.S. Patent br.7,534,608).
[0021] Fisk i sar. prijavljuju sistem za proizvodnju ćelija pankreasnih ostrvaca iz humanih embrionalnih matičnih ćelija (U.S. Patent br. 7,033,831). U ovom slučaju, put diferencijacije je podeljen u tri faze. Humane embrionalne matične ćelije su prvo diferencirane u endoderm korišćenjem kombinacije natrijum butirata i aktivina A (U.S. Patent br.7,326,572). Ćelije su zatim kultivisane sa BMP antagonistima, kao što je Noggin, u kombinaciji sa EGF ili betacelulinom da bi se generisale PDX1 pozitivne ćelije. Terminalna diferencijacija je indukovana nikotinamidom.
[0023] Inhibitori malih molekula su, takođe, korišćeni za indukciju ćelija prekursora endokrinog sistema pankreasa. Na primer, inhibitori malih molekula TGF-B receptora i BMP receptora (Development 2011, 138:861‑871; Diabetes 2011, 60:239-247) su korišćeni za značajno povećanje broja endokrinih ćelija pankreasa. Pored toga, aktivatori malih molekula su, takođe, korišćeni za generisanje definitivnih ćelija endoderma ili ćelija prekursora pankreasa (Curr Opin Cell Biol 2009, 21:727-732; Nature Chem Biol 2009, 5:258‑265).
[0025] Prethodni pokušaji indukcije ćelija prekursora pankreasa iz humanih embrionalnih matičnih ćelija istakli su važnost koekspresije PDX-1 i NKX6.1 u pravilnoj identifikaciji pankreasnog endoderma. Međutim, iako je u struci identifikovana populacija ćelija pozitivnih na ekspresiju PDX-1 i NKX6.1 kao niska ili bez ekspresije CDX2, prethodni izveštaji nisu uspeli da testiraju prisustvo markera neposredno ispred pankreasa u razvoju. SOX2, koji obeležava prednji endoderm, ne eksprimuje se u odraslim ostrvcima i eksprimuje se na veoma niskom nivou u pankreasu u razvoju (Diabetes 2005, 54:3402‑4309). Nasuprot tome, neki od primera u ovoj prijavi otkivaju ćelijske populacije gde je najmanje 30% ćelija pankreasnog endoderma generisanih iz humanih embrionalnih matičnih ćelija pozitivno na ekspresiju PDX-1 i NKX6.1, a negativno na ekspresiju CDX2 i SOX2.
[0027] Svi prethodni pokušaji generisanja funkcionalnih beta ćelija pankreasa nisu uspeli da postignu ćelije sa karakteristikama zrelih beta ćelija. Obeležja zrelih beta ćelija uključuju ekspresiju pojedinačnog hormonskog insulina, ispravnu obradu proinsulina u insulin i C-peptid, snažnu ekspresiju PDX-1 i NKX6.1, odgovarajuće oslobađanje insulina kao odgovor na glukozu, ekspresiju transportera glukoze i visoku ekspresiju glukokinaze. Svi prethodni izveštaji su rezultirali endokrinim ćelijama koje proizvode dva ili više pankreasnih hormona. Na primer, D'Amour i sar. (Nature Biotech 2006, 24:1392-1401) izveštavaju o stvaranju ćelijske populacije koja sadrži ~10% insulin-pozitivnih ćelija i ~20% endokrinih ćelija mereno sinaptofizinom. Slični izveštaji drugih (Cell Res 2009, 19:429‑438; Stem Cells 2007, 25:1940‑1953; Diabetes Obes Metab 2008, 10:186‑194) su, takođe, pokazale diferencijaciju pluripotentnih ćelija u nefunkcionalne insulin-pozitivne ćelije. Zaista, nedavne studije su jasno utvrdile da transplantacija polihormonalnih ćelija kod miševa sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID) nije dovela do stvaranja funkcionalnih beta ćelija (Diabetes 2011, 60:239‑247; Nature Biotech 2011, 29:750‑756). Dok u pankreasu ljudskog fetusa deo (~10-20%) endokrinih ćelija čine polihormonske ćelije; polihormonske ćelije nestaju u pankreasu odraslog čoveka Histochem Cell Biol 1999, 112:147‑153; J Histochem Cytochem 2009, 57:811‑824).
[0029] Kako se oblast regenerativne medicine u razvoju nastavlja razvijati, veoma je poželjan postupak za formiranje terminalno diferenciranih, odgovarajuće regulisanih endokrinih ćelija pankreasa. Ovde pokazujemo da se uz odgovarajuću i definisanu manipulaciju uslovima kulture i precizno vreme dodavanja aktivatora/inhibitora različitih puteva, humane embrionalne matične ćelije mogu diferencirati in vitro u funkcionalne beta ćelije pankreasa. Posebno, precizno određivanje vremena inhibicije BMP, korišćenjem gradijenta retinoinske kiseline zajedno sa upotrebom vitamina C, pokazalo se efikasnim u stvaranju pojedinačnih hormonskih endokrinih ćelija pankreasa.
[0030] SUŠTINA PRONALASKA
[0031] Predmetni pronalazak se odnosi na realizacije kako su naznačene u patentnim zahtevima i kako je opisano u daljem tekstu.
[0033] Shodno tome, pronalazak se odnosi na in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija u populaciju ćelija pankreasne endodermne loze, koji obuhvata kultivisanje ćelija u svakoj fazi diferencijacije u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze, pri čemu postepena diferencijacija obuhvata korake
[0034] (a) diferencijacije pluripotentnih ćelija u ćelije definitivnog endoderma (DE) kultivisanjem pluripotentnih ćelija u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze dopunjene TGF-B ligandom i WNT aktivatorom,
[0035] (b) diferencijacije DE ćelija u ćelije crevnih cevi kultivisanjem DE ćelija u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze dopunjene FGF ligandom, i
[0036] (c) kultivisanja pomenutih ćelija crevnih cevi u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze dopunjene shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom.
[0038] Štaviše, pronalazak se odnosi na in vitro postupak za diferencijaciju humanih embrionalnih matičnih ćelija u beta ćelije pankreasa koji obuhvata:
[0039] a) kultivisanje nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija u medijumu dopunjenom TGF-B ligandom i WNT aktivatorom, da bi se generisala populacija ćelija definitivnog endoderma (DE);
[0040] b) kultivisanje DE ćelija u medijumu dopunjenom FGF ligandom da bi se generisala populacija ćelija crevnih cevi;
[0041] c) kultivisanje ćelija crevne cevi u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom da bi se generisala populacija ćelija zadnjeg dela prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i SOX2;
[0042] d) kultivisanje ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dopunjenom PKC aktivatorom, shh inhibitorom, retinoidom i BMP inhibitorom da bi se generisala populacija ćelija pankreasa prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i NKX6.1, i eksprimuju niži nivo SOX2 u poređenju sa ćelijama zadnjeg dela prednjeg creva;
[0043] e) kultivisanje pankreasnih ćelija prednjeg creva u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, TGF-B inhibitorom i retinoidom da bi se dobila populacija ćelija pankreasnog endoderma koje eksprimuju PDX-1, viši nivo NKX6.1 i niži nivo SOX2 u poređenju sa pankreasnim ćelijama prednjeg creva; i
[0044] f) diferencijacija ćelija pankreasnog endoderma u populaciju pankreasnih beta ćelija, što obuhvata kultivisanje ćelija u medijumu;
[0045] pri čemu medijum u svakom od koraka a) do f) sadrži 5 mM do 20 mM glukoze.
[0047] U ilustrativne svrhe, otkrivena je populacija ćelija pankreasne endodermne loze dobijena in vitro postepenom diferencijacijom pluripotentnih ćelija. Medijum koji se koristi u svakom koraku diferencijacije je dopunjen glukozom. U nekim realizacijama, u svakom koraku diferencijacije ćelije se kultivišu u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze.
[0049] U nekim realizacijama, diferencijacija pluripotentnih matičnih ćelija generiše populaciju ćelija pankreasnog endoderma pri čemu više od 10% ćelija u diferenciranoj populaciji eksprimuje markere karakteristične za pojedinačne hormonske beta ćelije pankreasa.
[0051] U nekim realizacijama, diferencijacija pluripotentnih matičnih ćelija generiše populaciju ćelija pankreasnog endoderma, pri čemu je više od 30% diferencirane populacije pozitivno na ekspresiju PDX-1 i NKX6.1, dok je negativno na ekspresiju CDX2 i SOX2.
[0053] U nekim realizacijama, postepena diferencijacija obuhvata kultivisanje nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija u medijumu dodatno dopunjenom TGF-B ligandom. U nekim realizacijama, postepena diferencijacija obuhvata kultivisanje nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija u medijumu dodatno dopunjenom WNT aktivatorom. Postepena diferencijacija obuhvata kultivisanje definitivnih endodermnih ćelija u medijumu dodatno dopunjenom FGF ligandom. Postepena diferencijacija može obuhvatati kultivisanje ćelija crevnih cevi u medijumu dodatno dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i gradijentom BMP inhibitora. U nekim realizacijama, postepena diferencijacija obuhvata kultivisanje ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dodatno dopunjenom PKC aktivatorom, shh inhibitorom, retinoidom i BMP inhibitorom. U nekim realizacijama, postepena diferencijacija obuhvata kultivisanje ćelija u medijumu dodatno dopunjenom askorbinskom kiselinom.
[0055] Pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija u populaciju ćelija pankreasne endodermne loze, koji obuhvata kultivisanje ćelija u svakoj fazi diferencijacije u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze. In vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju pluripotentnih ćelija u ćelije definitivnog endoderma (DE) kultivisanjem pluripotentnih ćelija u medijumu dopunjenom TGF-B ligandom i WNT aktivatorom. In vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju DE ćelija u ćelije crevnih cevi kultivisanjem DE ćelija u medijumu dopunjenom FGF ligandom. U nekim realizacijama, in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju ćelija crevnih cevi u ćelije zadnjeg dela prednjeg endoderma kultivisanjem ćelija crevnih cevi u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom. U nekim realizacijama, in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju ćelija crevne cevi u endodermne ćelije zadnjeg dela prednjeg creva kultivisanjem ćelija crevne cevi u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom. U nekim realizacijama, in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju endodermnih ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u ćelije pankreasnog prednjeg creva kultivisanjem endodermnih ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dopunjenom PKC aktivatorom, shh inhibitorom, retinoidom i BMP inhibitorom. U nekim realizacijama, in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju ćelija pankreasnog prednjeg creva u ćelije pankreasnog endoderma kultivisanjem ćelija pankreasnog prednjeg creva u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, TGF-B inhibitorom i retinoidom. U nekim realizacijama, in vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija dalje obuhvata diferencijaciju ćelija pankreasnog endoderma u populaciju pankreasnih beta ćelija.
[0057] U jednoj realizaciji, u najmanje jednom koraku in vitro postupka za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija, medijum je dodatno dopunjen askorbinskom kiselinom. U nekim realizacijama, više od 10% ćelija u diferenciranoj populaciji su pojedinačne hormonske insulinpozitivne ćelije. U nekim realizacijama, više od 30% ćelija pankreasnog endoderma u kulturi generisanoj postupcima pronalaska su PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- i CDX2-.
[0059] Dalje je, u ilustrativne svrhe, opisan in vitro postupak za diferencijaciju humanih embrionalnih matičnih ćelija u beta ćelije pankreasa koji obuhvata: a) kultivisanje nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija u medijumu dopunjenom glukozom, TGF-B ligandom i WNT aktivatorom, da bi se generisala populacija ćelija definitivnog endoderma (DE); b) kultivisanje DE ćelija u medijumu dopunjenom glukozom i FGF ligandom da bi se generisala populacija ćelija crevnih cevi; c) kultivisanje ćelija crevnih cevi u medijumu dopunjenom glukozom, shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i gradijentom BMP inhibitora da bi se generisala populacija ćelija zadnjeg dela prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i SOX2; d) kultivisanje ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dopunjenom glukozom, PKC aktivatorom, shh inhibitorom, retinoidom i BMP inhibitorom da bi se generisala populacija pankreasnih ćelija prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i NKX6.1, i koje eksprimuju niži nivo SOX2 u poređenju sa ćelijama zadnjeg dela prednjeg creva; e) kultivisanje pankreasnih ćelija prednjeg creva u medijumu dopunjenom glukozom, shh inhibitorom, TGF-B inhibitorom i retinoidom da bi se dobila populacija ćelija pankreasnog endoderma koje eksprimuju PDX-1, viši nivo NKX6.1 i niži nivo SOX2 u poređenju sa pankreasnim ćelijama prednjeg creva; i f) diferencijacija ćelija pankreasnog endoderma u populaciju beta ćelija pankreasa. U nekim realizacijama, populacija beta ćelija pankreasa generisana postupcima pronalaska je PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- i CDX2-. U nekim realizacijama, medijum u najmanje jednom koraku postupka stepenaste diferencijacije je dodatno dopunjen askorbinskom kiselinom. U nekim realizacijama, beta ćelije pankreasa dobijene postupcima pronalaska su pojedinačne hormonske ćelije koje proizvode insulin, a koje su takođe NKX6.1+ i PDX-1+.
[0061] KRATAK OPIS CRTEŽA
[0062] Slike 1A do 1G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S32. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 1. Sl. 1A: Izotipska kontrola; Sl. 1B: hromogranin; Sl. 1C: KI-67; Sl.1D: NKX6.1; Sl.1E: SOX2; Sl.1F: CDX2; Sl.1G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0063] Slike 2A do 2G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u ćelijama diferenciranim prema Primeru 1 i sakupljenim u S42. dana. Sl. 2A: Kontrola izotipa; Sl.2B: hromogranin; Sl.2C: KI-67; Sl.2D: NKX6.1; Sl.2E: SOX2; Sl.2F: CDX2; Sl. 2G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0065] Slike 3A do 3G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u ćelijama diferenciranim prema Primeru 1 i sakupljenim u S52. dana. Sl. 3A: Izotipska kontrola; Sl. 3B: hromogranin; Sl. 3C: KI-67; Sl. 3D: NKX6.1; Sl. 3E: SOX2; Sl. 3F: CDX2; Sl. 3G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0067] Slike 4A do 4G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera ćelija diferenciranih prema Primeru 1 i sakupljenih u S5 7. dana. Sl.4A: Izotipska kontrola; Sl.
[0068] 4B: hromogranin; Sl. 4C: KI-67; Sl.4D: NKX6.1; Sl.4E: SOX2; Sl. 4F: CDX2; Sl.4G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0070] Slike 5A do 5C prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u ćelijama diferenciranim prema Primeru 1 i sakupljenim iz ćelija sakupljenih u S52. dana. Sl. 5A: hromogranin (y-osa) i CDX2 (x osa); Sl.5B: hromogranin (y-osa) i SOX2 (x osa); Sl. 5C: hromogranin (y-osa) i NKX6.1 (x osa). Procentualna koekspresija za svaki grafikon je prikazana na svakom histogramu.
[0072] Slike 6A do 6T prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 1 i sakupljenih u S2, S3, S4 i S5. Sl.6A: CDX2; Sl.6B: CD142; Sl.6C: FOXE1; Sl. 6D: HNF4-alfa; Sl.6E: NKX2.1; Sl.6F: NKX2.2; Sl.6G: NKX6.1; Sl.6H: OSR1; Sl.
[0073] 6I: PDX-1; Sl.6J: PROX1; Sl.6K: PTF1a; Sl.6L: SOX17; Sl.6M: SOX2; Sl.6N: insulin; Sl. 6O: ZIC1; Sl. 6P: hromogranin; Sl.6Q: glukagon; Sl. 6R: Ngn3; Sl. 6S: NeuroD; Sl.
[0074] 6T: somatostatin.
[0075] Slike 7A do 7G prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama ćelijske linije H1 diferenciranih prema Primeru 2 i sakupljenih 3. dana u S2, S3 ili S4. Sl. 7A: NKX6.1; Sl. 7B: PDX-1; Sl. 7C: hromogranin; Sl. 7D: NGN3; Sl.
[0076] 7E: CDX2; Sl.7F: albumin; Sl.7G: SOX2.
[0078] Slike 8A do 8G prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih markera u H1 ćelijama diferenciranim prema Primeru 3 i sakupljenim u S2, S3, S4 ili S5. Sl. 8A: NKX6.1; Sl.8B: PDX-1; Sl.8C: NGN3; Sl.8D: NeuroD; Sl.8E: hromogranin; Sl.
[0079] 8F: CDX2; Sl.8G: SOX2.
[0081] Slike 9A do 9H prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih markera u H1 ćelijama diferenciranim prema Primeru 4 i sakupljenim 4. dana u S3 i S4. Sl. 9A: NKX6.1; Sl.9B: PDX-1; Sl.9C: hromogranin; Sl.9D: NGN3; Sl.9E: NeuroD; Sl.
[0082] 9F: CDX2; Sl.9G: albumin; Sl.9H: SOX2.
[0084] Slike 10A do 10H prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 5 i sakupljenih u fazi 4. Sl.10A: NKX6.1; Sl.10B: PDX-1; Sl.10C: hromogranin; Sl. 10D: NGN3; Sl.10E: NeuroD; Sl.10F: CDX2; Sl.10G: albumin; Sl.10H: SOX2.
[0086] Slike 11A do 11H prikazuju podatke iz PCR analize u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 6 i sakupljenih 3. dana u S3 ili S6. Sl. 11A: NKX6.1; Sl.11B: PDX-1; Sl. 11C: hromogranin; Sl. 11D: NGN3; Sl. 11E: NeuroD; Sl. 11F: CDX2; Sl. 11G: albumin; Sl.
[0087] 11H: SOX2.
[0089] Slike 12A do 12G prikazuju podatke iz PCR analize u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 7 i sakupljenih 3. dana u S3, S4 ili S5. Sl.12A: NKX6.1; Sl.12B: PDX-1; Sl.12C: hromogranin; Sl. 12D: NGN3; Sl.12E: NeuroD; Sl.12F: CDX2; Sl.12G: SOX2.
[0090] Slike 13A do 13G prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 8 i sakupljenih u S3, S4, S5 ili S6. Sl.13A: NKX6.1; Sl.13B: PDX-1; Sl. 13C: hromogranin; Sl. 13D: NGN3; Sl.13E: NeuroD; Sl.13F: CDX2; Sl.13G: SOX2.
[0092] Slike 14A do 14H prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S3 4. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 9. Sl. 14A: Kontrolni izotip; Sl. 14B: hromogranin; Sl. 14C: KI-67; Sl.14D: NKX6.1; Sl.14E: SOX2;
[0094] Slika 14F: HNF3B; Sl. 14G: CDX2; Sl. 14H: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0096] Slike 15A do 15G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 2. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 9. Sl.15A: Kontrolni izotip; Sl.15B: NKX6.1; Sl. 15C: KI-67; Sl. 15D: hromogranin; Sl. 15E: SOX2; Sl. 15F CDX2; Sl. 15G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0098] Slike 16A do 16F prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 4. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 9. Sl.16A: Kontrolni izotip; Sl.16B: NKX6.1; Sl. 16C: hromogranin; Sl. 16D: SOX2; Sl. 16E: CDX2; Sl. 16F: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0100] Slike 17A do 17J prikazuju podatke iz PCR analize u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 9 i sakupljenih u S1D3, S2D3, S3D4, S4D2 i S4D4. Sl. 17A: CDX2; Sl. 17B: HHex; Sl.17C: FOXE1; Sl.17D: IPF1 (PDX-1); Sl.17E: NKX2.1; Sl.17F: NKX2.2; Sl.
[0101] 17G: NKX6.1; Sl.17H: PROX1; Sl.17I: SOX2; Sl.17J: SOX9.
[0103] Slike 18A do 18G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S3 3. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 10. Sl. 18A: Kontrolni izotip; Sl. 18B: NKX6.1; Sl.18C: hromogranin; Sl.18D: SOX2; Sl.18E: CDX2; Sl.18F: KI-67; Sl.18G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0105] Slike 19A do 19G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 5. dana ćelija diferenciranih prema Primeru 10. Sl. 19A: Kontrolni izotip; Sl. 19B: NKX6.1; Sl.19C: hromogranin; Sl.19D: SOX2; Sl.19E: CDX2; Sl.19F: KI-67; Sl.19G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0107] Slike 20A do 20J prikazuju PCR analizu u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 11. Sl. 20A: somatostatin; Sl.20B: PDX1; Sl.20C: Pax6; Sl.20D: Pax4;
[0109] Slika 20E: NKX6.1; Sl.20F: NGN3; Sl.20G: glukagon; Sl.20H: NeuroD; Sl.20I: insulin; Sl. 20J: hromogranin.
[0111] Slike 21A do 21J prikazuju podatke iz PCR analize u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 12 i sakupljenih u S42. dana, S52. dana i S59. dana. Sl.21A: somatostatin; Sl.
[0112] 21B: PDX1; Sl. 21C: Pax6; Sl. 21D: Pax4; Sl. 21E: NKX6.1; Sl. 21F: NGN3; Sl. 21G: NeuroD; Sl.21H: insulin; Sl.21I: glukagon; Sl.21J: hromogranin.
[0114] Slike 22A do 22L prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama embrionalne ćelijske linije H1 diferenciranih prema primeru 13 i sakupljenih u S53. dana. Sl.22A: Pax4; Sl.22B: Pax6; Sl.22C: PDX1; Sl.22D: PTF1a; Sl. 22E: glukagon; Sl.22F: insulin; Sl.22G: NeuroD; Sl.22H: ngn3; Sl.22I: Zic1; Sl.22J: CDX2; Sl.22K: albumin; Sl.22L: NKX6.1.
[0116] DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0117] Radi jasnoće izlaganja, a ne u cilju ograničavanja, detaljan opis pronalaska je podeljen na sledeće pododeljke koji opisuju ili ilustruju određene karakteristike, realizacije ili primene predmetnog pronalaska.
[0118] Definicije
[0119] Matične ćelije su nediferencirane ćelije definisane svojom sposobnošću, na nivou jedne ćelije, da se i samoobnavljaju i diferenciraju. Matične ćelije mogu proizvesti ćelije potomstva, uključujući samoobnavljajuće progenitore, neobnavljajuće progenitore i terminalno diferencirane ćelije. Matične ćelije se, takođe, karakterišu svojom sposobnošću diferencijacije in vitro u funkcionalne ćelije različitih ćelijskih loza iz više klicinih listića (endoderma, mezoderma i ektoderma). Matične ćelije, takođe, formiraju tkiva iz više klicinih listića nakon transplantacije i značajno doprinose većini, ako ne i svih tkiva, nakon ubrizgavanja u blastociste.
[0121] Matične ćelije se klasifikuju prema svom razvojnom potencijalu kao: (1) totipotentne, što znači sposobne da formiraju sve embrionalne i ekstraembrionalne tipove ćelija; (2) pluripotentne, što znači sposobne da se diferenciraju u sve tipove embrionalnih ćelija; (3) multipotentne, što znači sposobne da formiraju podskup ćelijskih linija, ali sve unutar određenog tkiva, organa ili fiziološkog sistema (na primer, hematopoetske matične ćelije (HSK) mogu proizvesti potomstvo koje uključuje HSK (samoonbavljanje), oligopotentne progenitore ograničene na krvne loze i sve tipove ćelija i elemenata (npr. trombocite) koji su normalni sastojci krvi); (4) oligopotentne, što znači sposobne da formiraju još ograničeniji podskup ćelijskih linija od multipotentnih matičnih ćelija; i (5) unipotentne, što znači sposobne da formiraju samo jednu ćelijsku lozu (npr. spermatogene matične ćelije).
[0123] Diferencijacija je proces kojim nespecijalizovana („neposvećena“) ili manje specijalizovana ćelija stiče karakteristike specijalizovane ćelije kao što je, na primer, nervna ćelija ili mišićna ćelija. Diferencirana ćelija ili ćelija indukovana diferencijacijom je ona koja je zauzela specijalizovaniji („posvećeni“) položaj unutar ćelijske loze. Izraz „posvećena“, kada se primenjuje na proces diferencijacije, odnosi se na ćeliju koja je napredovala putem diferencijacije do tačke u kojoj će, pod normalnim okolnostima, nastaviti da se diferencira u određeni tip ćelija ili podskup tipova ćelija i ne može, pod normalnim okolnostima, da se diferencira u drugi tip ćelija ili da se vrati na manje diferencirani tip ćelija. „Dediferencijacija“ se odnosi na proces kojim se ćelija vraća na manje specijalizovani (ili posvećeni) položaj unutar ćelijske loze. Kako se ovde koristi, ćelijska loza definiše nasleđe ćelije, tj. od kojih ćelija je nastala i koje sve ćelije od nje mogu nastati.
[0124] Ćelijska loza smešta ćeliju unutar nasledne šeme razvoja i diferencijacije. Marker specifičan za lozu odnosi se na karakteristiku specifično povezanu sa fenotipom ćelija loze od interesa i može se koristiti za procenu diferencijacije neopredeljene ćelije u lozu od interesa.
[0126] „Markeri“, kako se ovde koriste, su molekuli nukleinske kiseline ili polipeptida koji su diferencijalno eksprimovani u ćeliji od interesa. U ovom kontekstu, diferencijalna ekspresija znači povećan nivo za pozitivni marker i smanjen nivo za negativni marker. Detektabilni nivo markera nukleinske kiseline ili polipeptida je dovoljno viši ili niži u ćelijama od interesa u poređenju sa drugim ćelijama, tako da se ćelija od interesa može identifikovati i razlikovati od drugih ćelija korišćenjem bilo kog od različitih postupaka poznatih u tehnici.
[0128] Kako se ovde koristi, ćelija je „pozitivna na“ određeni marker ili „pozitivna“ kada je specifični marker detektovan u ćeliji. Slično tome, ćelija je „negativna na“ određeni marker ili „negativna“ kada specifični marker nije detektovan u ćeliji.
[0130] Kako se ovde koristi, „faza 1“ i „S1“ se koriste naizmenično za identifikaciju ćelija koje eksprimuju markere karakteristične za definitivni endoderm (DE).
[0132] „Definitivni endoderm“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije koje nose karakteristike ćelija koje nastaju iz epiblasta tokom gastrulacije i koje formiraju gastrointestinalni trakt i njegove derivate. Ćelije definitivnog endoderma eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera: HNF3 beta, GATA4, SOX17, CXCR4, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 i MIXL1.
[0134] „Crevna cev“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije izvedene iz definitivnog endoderma koje eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera: HNF3-beta, HNF1-beta ili HNF4-alfa. Ćelije crevne cevi mogu dati osnovu svim endodermalnim organima, kao što su pluća, jetra, pankreas, želudac i creva.
[0136] Ovde se naizmenično koriste „faza 2“ i „S2“ koji identifikuju ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za primitivnu crevnu cev.
[0137] „Entoderm prednjeg creva“ odnosi se na ćelije endoderma koje daju poreklo jednjaka, pluća, želuca, jetre, pankreasa, žučne kese i dela dvanaestopalačnog creva.
[0139] „Zadnji deo prednjeg creva“ odnosi se na ćelije endoderma od kojih mogu nastati zadnji deo želuca, pankreas, jetra i deo dvanaestopalačnog creva.
[0141] „Entoderm srednjeg creva“ odnosi se na ćelije endoderma od kojih mogu nastati creva, delova dvanaestopalačnog creva, slepog creva i uzlaznog debelog creva.
[0143] „Entoderm zadnjeg creva“ odnosi se na ćelije endoderma od kojih mogu nastati distalne trećine poprečnog debelog creva, silaznog debelog creva, sigmoidnog debelog creva i rektuma.
[0145] I „faza 3“ i „S3“ se koriste naizmenično za identifikaciju ćelija koje eksprimuju markere karakteristične za endoderm prednjeg creva. „Ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za lozu prednjeg creva“, kako se ovde koristi, odnose se na ćelije koje eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera: PDX-1, FOXA2, CDX2, SOX2 i HNF4 alfa.
[0147] Ovde se naizmenično koriste „faza 4“ i „S4“ za identifikaciju ćelija koje eksprimuju markere karakteristične za pankreasni prekursor prednjeg creva. „Ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za lozu prekursora pankreasnog prednjeg creva“, kako se ovde koristi, odnose se na ćelije koje eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera: PDX-1, NKX6.1, HNF6, FOXA2, PTF1a, Prox1 i HNF4 alfa.
[0149] Kako se ovde koristi, „faza 5“ i „S5“ se koriste naizmenično za identifikaciju ćelija koje eksprimuju markere karakteristične za pankreasni endoderm i pankreasne endokrine prekursorske ćelije.
[0151] „Ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za lozu pankreasnog endoderma“, kako se ovde koristi, odnose se na ćelije koje eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera: PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 ili PROX1. Ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za lozu pankreasnog endoderma ne eksprimuju značajno CDX2 ili SOX2.
[0153] Kako se ovde koristi, „faza 6“ i „S6“ se koriste naizmenično za identifikaciju ćelija obogaćenih endokrinim ćelijama pankreasa.
[0155] „Pankreatična endokrina ćelija“, ili „ćelija koja eksprimuje pankreasne hormone“, ili „ćelije koje eksprimuju markere karakteristične za pankreasnu endokrinu lozu“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćeliju sposobnu da eksprimuje najmanje jedan od sledećih hormona: insulin, glukagon, somatostatin, grelin i pankreatični polipeptid.
[0157] „Pankreatična endokrina prekursorska ćelija“ ili „pankreatična endokrina progenitorska ćelija“ odnosi se na ćelije pankreasnog endoderma sposobne da postanu ćelije koje eksprimuju pankreasne hormone. Takva ćelija može da eksprimuje najmanje jedan od sledećih markera: NGN3, NKX2.2, NeuroD, ISL-1, Pax4, Pax6 ili ARX.
[0159] „Funkcionalna pankreasna beta ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na jednu hormonsku insulin-pozitivnu ćeliju sposobnu da reaguje na glukozu i da bude pozitivna na PDX-1 i NKX6.1.
[0161] Ovde se naizmenično koriste „d1“, „d 1“ i „dan 1“; „d2“, „d 2“ i „dan 2“; „d3“, „d 3“ i „dan 3“, itd. Ove kombinacije brojeva i slova određuju dan inkubacije u različitim fazama tokom protokola postepene diferencijacije ove prijave.
[0163] „Askorbinska kiselina“ i „vitamin C“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na esencijalni hranljivi sastojak za ljude i druge životinjske vrste.
[0165] „Glukoza“ i „D-glukoza“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na dekstrozu, šećer koji se često nalazi u prirodi.
[0167] Ćelija „pozitivna“ za određeni marker ili koja je marker „+“ (tj. PDX-1+) je ćelija u kojoj se određeni marker može detektovati. Ćelija „negativna“ za određeni marker ili koja je marker „-“ (tj. NKX6.1-) je ćelija u kojoj marker nije detektovan postupcima opisanim u predmetnoj specifikaciji.
[0169] U ovoj prijavi, „hromogranin“ i „CHGN“ se koriste naizmenično za identifikaciju gena koji kodira kiseli sekretorni glikoprotein hromogranin.
[0171] Ovde se naizmenično koriste termini „NeuroD“ i „NeuroD1“ koji identifikuju protein eksprimovan u endokrinim progenitorskim ćelijama pankreasa i gen koji ga kodira.
[0173] Ovde se naizmenično koriste „LDN“ i „LDN-193189“ da bi se označio inhibitor BMP receptora dostupan od Stemgent-a, Kalifornija, SAD.
[0175] Izolacija, ekspanzija i kultura pluripotentnih matičnih ćelija
[0176] Pluripotentne matične ćelije mogu eksprimovati jedan ili više stadijumski specifičnih embrionalnih antigena (SSEA) 3 i 4, i markera koji se mogu detektovati pomoću antitela označenih kao Tra-1-60 i Tra-1-81 (Thomson i sar., Science 282:1145, 1998 (što je navedeno samo u ilustrativne svrhe). Diferencijacija pluripotentnih matičnih ćelija in vitro dovodi do gubitka ekspresije SSEA-4, Tra-1-60 i Tra-1-81. Nediferencirane pluripotentne matične ćelije obično imaju aktivnost alkalne fosfataze, što se može detektovati fiksiranjem ćelija sa 4% paraformaldehidom, a zatim razvijanjem sa Vektor Red kao supstratom, kako je opisano od strane proizvođača (Vector Laboratories, Kalifornija, SAD). Nediferencirane pluripotentne matične ćelije, takođe, obično eksprimuju OCT4 i TERT, što se detektuje RT-PCR.
[0178] Još jedan poželjan fenotip razmnoženih pluripotentnih matičnih ćelija je potencijal da se diferenciraju u ćelije sva tri germinativna sloja: endoderma, mezoderma i ektoderma. Pluripotentnost matičnih ćelija može se potvrditi, na primer, ubrizgavanjem ćelija u SCID miševe, fiksiranjem teratoma koji se formiraju pomoću 4% paraformaldehida, a zatim njihovim histološkim ispitivanjem radi dokaza tipova ćelija iz tri germinativna sloja. Alternativno, pluripotentnost se može utvrditi stvaranjem embrioidnih tela i procenom embrioidnih tela na prisustvo markera povezanih sa tri germinativna sloja.
[0179] Razmnožene pluripotentne linije matičnih ćelija mogu se kariotipizirati korišćenjem standardne tehnike G-pruganja i uporediti sa objavljenim kariotipovima odgovarajućih vrsta primata. Poželjno je dobiti ćelije koje imaju „normalan kariotip“, što znači da su ćelije euploidne, pri čemu su svi humani hromozomi prisutni i nisu primetno izmenjeni. Pluripotentne ćelije se mogu lako razmnožavati u kulturi korišćenjem različitih slojeva hranilica ili korišćenjem posuda obloženih matričnim proteinima. Alternativno, hemijski definisane površine u kombinaciji sa definisanim medijumima kao što je mTesr<™>1 medijum (StemCell Technologies, Vankuver, Kanada) može se koristiti za rutinsku ekspanziju ćelija. Pluripotentne ćelije se mogu lako ukloniti sa ploča za kultivaciju korišćenjem enzimskih, mehaničkih ili upotrebom različitih helatora kalcijuma kao što je EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina). Alternativno, pluripotentne ćelije se mogu širiti u suspenziji u odsustvu bilo kakvih matričnih proteina ili sloja za hranjenje.
[0181] Izvori pluripotentnih matičnih ćelija
[0182] Vrste pluripotentnih matičnih ćelija koje su ovde opisane radi reference uključuju utvrđene linije pluripotentnih ćelija izvedenih iz tkiva formiranog nakon trudnoće, uključujući preembrionalno tkivo (kao što je, na primer, blastocista), embrionalno tkivo ili fetalno tkivo uzeto u bilo kom trenutku tokom trudnoće, obično, ali ne nužno, pre približno 10 do 12 nedelja trudnoće. Neograničavajući referentni primeri su utvrđene linije humanih embrionalnih matičnih ćelija (hESCs) ili humanih embrionalnih germinalnih ćelija, kao što su, na primer, linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1, H7 i H9 (WiCell Research Institute, Medison, Vinskonsin, SAD). Takođe su opisane ćelije uzete iz populacije pluripotentnih matičnih ćelija koje su već kultivisane u odsustvu ćelija hranilica. Pogodne su inducibilne pluripotentne ćelije (IPS) ili reprogramirane pluripotentne ćelije koje se mogu izvesti iz odraslih somatskih ćelija korišćenjem prisilne ekspresije brojnih pluripotentnih srodnih transkripcionih faktora, kao što su OCT4, Nanog, Sox2, KLF4 i ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet, 2011, 12:165‑185). Kao što je otkriveno radi reference, humane embrionalne matične ćelije mogu se pripremiti kao što su opisali Thomson i sar. (U.S. Patent No. 5,843,780; Science, 1998, 282:1145; Curr. Top. Dev. Biol., 1998, 38:133; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1995: 92:7844), što je navedeno samo kao referenca.
[0183] Formiranje ćelija koje eksprimuju markere karakteristične za lozu pankreasnog endoderma iz pluripotentnih matičnih ćelija
[0184] Karakteristike pluripotentnih matičnih ćelija su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti, a dodatne karakteristike pluripotentnih matičnih ćelija se i dalje identifikuju. Markeri pluripotentnih matičnih ćelija uključuju, na primer, ekspresiju jednog ili više od sledećih: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
[0186] Pluripotentne matične ćelije uključuju, na primer, liniju humanih embrionalnih matičnih ćelija H9 (NIH kod: WA09), liniju humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 (NIH kod: WA01), liniju humanih embrionalnih matičnih ćelija H7 (NIH kod: WA07) i liniju humanih embrionalnih matičnih ćelija SA002 (Cellartis, Švedska), koje su otkrivene kao referenca. Pogodne za upotrebu u predmetnom pronalasku su ćelije koje eksprimuju najmanje jedan od sledećih markera karakterističnih za pluripotentne ćelije: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA‑3, SSEA‑4, Tra 1‑60 i Tra 1‑81.
[0188] Markeri karakteristični za definitivnu endodermnu liniju su odabrani iz grupe koja se sastoji od SOX17, GATA4, HNF3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, homeoboks protein nalik Mix-u, FGF4, CD48, eomezodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 i OTX2. Ovde je otkrivena ćelija koja eksprimuje barem jedan od markera karakterističnih za definitivnu endodermnu liniju. Ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za definitivnu endodermnu liniju može biti ćelija prekursor primitivnih pruga. Alternativno, ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za definitivnu endodermnu liniju može biti ćelija mezendoderma. Alternativno, ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za definitivnu endodermnu liniju može biti ćelija definitivnog endoderma.
[0190] Markeri karakteristični za lozu pankreasnog endoderma su odabrani iz grupe koja se sastoji od PDX1, NKX6.1, HNF1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HNF4 alfa, SOX9, HB9 i PROX1. Dalje je ovde opisana ćelija koja eksprimuje najmanje jedan od markera karakterističnih za lozu pankreasnog endoderma. Ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za lozu pankreasnog endoderma može biti ćelija pankreasnog endoderma u kojoj je ekspresija PDX-1 i NKX6.1 znatno veća od ekspresije CDX2 i SOX2.
[0192] Markeri karakteristični za pankreasnu endokrinu lozu su odabrani iz grupe koja se sastoji od NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2 i PAX6. Pankreasna endokrina ćelija može biti sposobna da eksprimuje najmanje jedan od sledećih hormona: insulin, glukagon, somatostatin i pankreasni polipeptid. Takođe je otkrivena ćelija koja eksprimuje najmanje jedan od markera karakterističnih za pankreasnu endokrinu lozu. Ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za pankreasnu endokrinu lozu može biti pankreasna endokrina ćelija. Pankreasna endokrina ćelija može biti ćelija koja eksprimuje pankreasne hormone. Alternativno, pankreasna endokrina ćelija može biti ćelija koja luči pankreasne hormone.
[0194] Štaviše, endokrina ćelija pankreasa može biti ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za β ćelijsku liniju. Ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za β ćelijsku liniju eksprimuje PDX1 i najmanje jedan od sledećih transkripcionih faktora: NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 beta, MAFA, PAX4 i PAX6. Ćelija koja eksprimuje markere karakteristične za β ćelijsku liniju može biti β ćelija.
[0196] Dalje je ovde opisan in vitro postupak i populacija ćelija koje mogu da generišu pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije koje su, takođe, pozitivne na PDX-1 i NKX6.1. Postupak može da uključuje niz faza koje usmeravaju, postepeno, diferencijaciju humanih pluripotentnih ćelija u pojedinačne hormonske ćelije kroz sledeće međufaze:
[0197] a) generisanje ćelija definitivnog endoderma (DE) iz nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija, što obuhvata kultivaciju pluripotentnih ćelija u medijumu koji sadrži glukozu, TGF-B ligand i WNT aktivator;
[0198] b) diferencijaciju DE ćelija u ćelije crevnih cevi koja obuhvata kultivaciju DE ćelija u medijumu koji sadrži glukozu, vitamin C i FGF ligand;
[0199] c) diferencijaciju ćelija crevnih cevi u ćelije zadnjeg dela prednjeg endoderma koje eksprimuju PDX-1 i SOX2. Ova diferencijacija se postiže kultivacijom ćelija crevnih cevi u prisustvu shh inhibitora, BMP inhibitora, TGF-B liganda, FGF liganda, retinoinske kiseline, vitamina C i PKC aktivatora;
[0200] d) diferencijaciju ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u ćelije pankreasnog prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i NKX6.1, i eksprimuju niži nivo SOX2 u poređenju sa ćelijama zadnjeg dela prednjeg creva. Ova diferencijacija se postiže kultivacijom ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u prisustvu shh inhibitora, BMP inhibitora, niske doze retinoinske kiseline, vitamina C i PKC aktivatora;
[0201] e) diferencijaciju ćelija pankreasnog prednjeg creva u ćelije pankreasnog endoderma koje eksprimuju PDX-1, viši nivo NKX6.1 i niži nivo SOX2 u poređenju sa ćelijama pankreasnog prednjeg creva. Diferencijacija se postiže kultivacijom ćelija pankreasnog prednjeg creva u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, TGF-B inhibitorom, niskom dozom retinoinske kiseline i vitaminom C; i
[0202] f) diferencijaciju ćelija pankreasnog endoderma u prekursorske ćelije endokrinog pankreasa, a zatim u endokrine ćelije pankreasa koje luče samo jedan hormon. Diferencijacija se postiže kultivacijom ćelija pankreasnog endoderma u medijumu dopunjenom inhibitorom shh, niskom dozom retinoinske kiseline i vitaminom C.
[0204] Ćelije u svim fazama postepene diferencijacije mogu se kultivisati u medijumu koji sadrži manje od 25 mM glukoze. Koncentracija glukoze može biti u rasponu od oko 8 mM do oko 20 mM glukoze.
[0206] U nekim realizacijama, formulacije medijuma koje se koriste za generisanje ćelija u fazi crevne cevi i svi naredni koraci sadrže askorbinsku kiselinu (takođe poznatu kao vitamin C). U jednoj realizaciji, koncentracija askorbinske kiseline je od oko 0,01 mM do oko 1 mM. U jednoj realizaciji, koncentracija askorbinske kiseline je od oko 0,1 mM do oko 0,5 mM.
[0208] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan, ali nije ograničen, sledećim referentnim primerima.
[0210] Referentni primer 1
[0211] Diferencijacija humanih embrionalnih matičnih ćelija ćelijske linije H1 u pankreasne endokrine prekursorske ćelije u odsustvu fetalnog goveđeg seruma - Modulacija BMP/TGF-B puteva rezultira poboljšanom produkcijom populacije pankreasnog endoderma i smanjenim procentom SOX2+ populacije
[0212] Ovaj primer je sproveden da bi se pokazalo da se kulture pankreasnog endoderma mogu generisati sa veoma visokim nivoima ekspresije PDX-1 i NKX6.1, dok imaju nizak nivo ekspresije CDX2 i SOX2.
[0214] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 (hESC H1) su sakupljene u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) i zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>-om (1:30 razblaživanje; BD Biosciences, Nju Džerzi, SAD) obložene posude u mTeSR<®>1 medijum (StemCell Technologies, Vankuver, Kanada) sa dodatkom 10 µM Y27632 (Rock inhibitor, kataloški broj Y0503, SigmaAldrich, Misuri, SAD). Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su isprane i inkubirane u nekompletnom PBS (fosfatno puferovani fiziološki rastvor bez Mg ili Ca) tokom približno 30 sekundi. Kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0215] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 3 dana): Ćelije su kultivisane jedan dan u medijumu faze 1: medijum MCDB-131 (kataloški broj 10372-019, Invitrogen, Kalifornija, SAD) dopunjen sa 0,1% BSA bez masnih kiselina (kataloški broj 68700, Proliant, Ajova, SAD), 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata (kataloški broj S3187, SigmaAldrich, Misuri, SAD), 1X GlutaMax<™>(Kataloški # 35050-079, Invitrogen), 5 mM D-glukoze (Katalog # G8769, SigmaAldrich, Misuri, SAD), koji sadrži 100 ng/ml GDF8 (R&D Sistems, MN, SAD) i 1 µM MCX jedinjenja (GSK3B inhibitor, 14-prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-heptaazatetraciklo [19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptakosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-nonaen-16-on, US patetna prijava br.12/494,789). Ćelije su zatim kultivisane jedan dan u MCDB-131 medijumu dopunjenom sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 100 nM MCX jedinjenja. Ćelije su zatim kultivisane jedan dan u MCDB-131 medijumu u koji je dodato 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze i 100 ng/ml GDF8. b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 2 dana): Ćelije faze 1 su tretirane dva dana medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D glukoze i 25 ng/ml FGF7.
[0216] c. Faza 3 (prednje crevo - 2 dana): Ćelije faze 2 su kultivisane jedan dan u medijumu faze 3: medijum MCDB-131 dopunjen sa 1:200 razblaženjem ITS-X (Invitrogen), 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 25 ng/ml FGF7, 10 ng/ml aktivina-A (R & D systems), 0,25 µM SANT-1 (shh inhibitor, SigmaAldrich), 1 µM retinoinske kiseline (RA) (SigmaAldrich) i 200 nM TPB (PKC aktivator; kataloški broj 565740; EMD, NJ, SAD), koji sadrži 100 nM LDN-193189 (inhibitor BMP receptora; kataloški broj 04-0019; Stemgent, Kalifornija, SAD). Ćelije su zatim kultivisane još jedan dan u medijumu za fazu 3 dopunjenom sa 10 nM LDN-193189.
[0217] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 2 dana): Ćelije faze 3 su kultivisane dva dana u MCDB-131 medijumu dopunjenom razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, 200 nM TPB i 50 nM LDN-193189.
[0218] e. Faza 5 (pankreasni endoderm, 2-7 dana): Ćelije faze 4 su kultivisane 2-7 dana u MCDB-131 medijumu dopunjenom ITS-X razblaženjem od 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1 i 50 nM RA.
[0220] U određenim fazama, uzorci su sakupljeni i analizirani pomoću PCR u realnom vremenu, imunohistohemije ili sortiranja ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).
[0222] Za FACS analize, ćelije izvedene iz hESC su puštene u suspenziju pojedinačnih ćelija inkubacijom u TrypLE Express-u (kataloški br.12604, Invitrogen) na 37°C tokom 3-5 minuta. Ćelije su zatim dva puta isprane u puferu za bojenje (PBS koji sadrži 0,2% BSA bez masnih kiselina) (kataloški br. 554657, BD Biosciences, NJ, SAD). Za bojenje intracelularnih antitela, ćelije su prvo inkubirane 20 minuta na 4°C sa zelenom fluorescentnom bojom LIVE/DEAD ćelija (Invitrogen kataloški br. L23101), kako bi se omogućilo razlikovanje živih/mrtvih ćelija tokom analize, nakon čega je usledilo jedno ispiranje u hladnom PBS. Ćelije su fiksirane u 250 µl Cytofix/Cytoperm pufera (BD Biosciences kataloški br.554722) tokom 20 minuta na 4°C, nakon čega su usledila dva ispiranja u BD Perm/Wash puferskom rastvoru (BD Biosciences kataloški br. 554723). Ćelije su resuspendovane u 100 µl rastvora za bojenje/blokiranje koji se sastoji od Perm/Wash pufera dopunjenog sa 2% normalnog seruma (odgovarajuće vrste sekundarnog antitela). Ćelije su zatim inkubirane 30 minuta na 4°C sa primarnim antitelima u empirijski unapred određenim razblaženjima, nakon čega su usledila dva ispiranja u Perm/Wash puferu. Na kraju, ćelije su inkubirane sa odgovarajućim sekundarnim antitelima 30 minuta na 4°C, nakon čega su usledila dva ispiranja sa Perm/Wash puferom pre analiza na BD FACS Canto II.
[0224] Korišćena su sledeća razblaženja primarnih antitela: zečji anti-insulin (1:100; kataloški broj C27C9; Cell Signaling, Masačusets, SAD), mišji anti-insulin (1:100; kataloški broj ab6999, Abcam, Masačusets, SAD), mišji anti-glukagon (1:1250; kataloški broj G2654; Sigma-Aldrich), zečji anti-sinaptofizin (1:100; kataloški broj A0010, Dako, Kalifornija, SAD), zečji antihromogranin A (1:800; Dako), mišji anti-NKX6.1 (1:50; DSHB, Univerzitet u Ajovi, Ajova, SAD), mišji anti-CDX2 (1:250; Invitrogen), kozji anti-NeuroD (1:500; R&D Systems), mišji anti-SOX2 (BD, Kalifornija, SAD), mišji anti-NKX2.2 (DSHB), mišji anti-Pax6 (BD, Kalifornija, SAD), mišji anti-PDX-1 (BD, Kalifornija, SAD). Sekundarna antitela su korišćena u sledećim razblaženjima: kozji anti-mišji Alexa 647 (1:500; Invitrogen), kozji anti-zečji PE (1:200; Invitrogen), magareći anti-kozji (1:800; Invitrogen). Uzorci su inkubirani 30 minuta na 4°C nakon dodavanja sekundarnih antitela, nakon čega je usledilo završno ispiranje u Perm/Wash puferu. Ćelije su analizirane na BD FACS Canto II pomoću BD FACS Diva softvera sa najmanje 30.000 prikupljenih događaja.
[0226] Slike 1A do 1G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije izotipa kontrole (Sl. 1A), hromogranina (Sl. 1B), KI-67 (Sl.1C), NKX6.1 (Sl.1D), SOX2 (Sl.1E), CDX2 (Sl.1F), PDX-1 (Sl. 1G) ćelija diferenciranih prema Primeru 1 i analiziranih u S32. dana. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu. Drugog dana faze 3, preko 95% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju PDX-1 (Sl. 1G), a oko 60% ćelija u populaciji je bilo pozitivno na ekspresiju SOX2 (Sl.1E), dok je manje od 10% ćelija bilo pozitivno na ekspresiju CDX2 (Sl.1F) ili NKX6.1 (Sl.1D), ili hromogranina (Sl.1B). Značajan procenat ćelija u fazi 3 bio je u aktivnom ćelijskom ciklusu, što je pokazano visokim procentom KI-67 pozitivnih ćelija (Sl.1C).
[0228] Slike 2A do 2G prikazuju profile ekspresije izotipa kontrole (Sl.2A), hromogranina (Sl.2B), KI-67 (Sl.2C), NKX6.1 (Sl.2D), SOX2 (Sl.2E), CDX2 (Sl.2F), PDX-1 (Sl.2G), određenog FACS bojenjem, ćelija diferenciranih prema Primeru 1, sakupljenih 2. dana u S4. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu. Slično kao u fazi 3, preko 95% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju PDX-1 (Sl.2G), dok je oko 10% ćelija bilo pozitivno na ekspresiju CDX2 (Sl. 2F), a oko 40% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju NKX6.1 (Sl.2D). Oko 45% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju SOX2 (Sl.2E), što je pad sa 60% na S3. Ekspresija hromogranina bila je približno 3% (Sl.2B). Značajan procenat ćelija u fazi 4 bio je u aktivnom ćelijskom ciklusu, što pokazuje visok procenat KI-67 pozitivnih ćelija (Sl.2C).
[0230] Slike 3A do 3G prikazuju relativne profile ekspresije, određene FACS analizama, ćelija sakupljenih 2. dana faze 5 prateći protokol diferencijacije opisan u ovom primeru. Sl.3A: kontrola izotipa; Sl. 3B: hromogranin; Sl. 3C: KI-67; Sl. 3D: NKX6.1; Sl.3E: SOX2; Sl. 3F: CDX2; Sl.
[0231] 3G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu. Slično fazama 3 i 4, preko 95% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju PDX-1, dok je približno 10% ćelija bilo pozitivno na ekspresiju CDX2, a preko 67% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju NKX6.1. Ekspresija SOX2, na približno 50%, bila je niža u poređenju sa fazom 3, ali slična njenoj ekspresiji u S4.
[0233] Slike 4A do 4G prikazuju ekspresiju PDX-1 (Sl.4G), NKX6.1 (Sl.4D), CDX2 (Sl.4F), SOX2 (Sl.
[0234] 4E), Ki-67 (marker proliferacije; Sl.4C) i hromogranina (pan endokrini marker; Sl.4B) mereno FACS bojenjem ćelija sakupljenih i analiziranih 7. dana 5. faze diferencijacije prateći protokol opisan u ovom primeru. Slično fazama 3 i 4, >90% ćelija je bilo pozitivno na ekspresiju PDX-1, dok je ekspresija CDX2 bila manja od 10%, ekspresija NKX6.1 je značajno porasla na >70%, a ekspresija SOX2 je dramatično smanjena na oko 2%.
[0236] Štaviše, većina ćelija koje eksprimuju SOX2, CDX2 i NKX6.1 bile su negativne na ekspresiju hromogranina (videti Sl.5A do Sl.5C). Stoga, S5 kulture pripremljene prema protokolu opisanom u ovom primeru rezultiraju populacijom ćelija gde najmanje 50% ćelija eksprimuje PDX-1 i NKX6.1, dok su negativne na CDX-2, SOX2 i hromogranin. Tabela I sumira procentualnu ekspresiju različitih endodermnih markera u S3-S5.
[0237] Tabela I
[0239]
[0242] Slike 6A do 6T prikazuju profile ekspresije mRNK merene PCRm u realnom vremenu ćelija S2, S3, S4 i S5 diferenciranih prateći protokol opisan u ovom primeru, i prikazane kao višestruka promena u odnosu na ekspresiju u nediferenciranim H1 ćelijama. U fazi 3, postojala je veoma niska ekspresija markera prednjeg dela prednjeg creva kao što su FOXe1 (Sl.6C) i NKX2.1 (Sl.
[0243] 6E). Međutim, u fazi 3, SOX2 (Sl.6M) i OSR1 (Sl.6H), koji označavaju želudačni region crevne cevi, bili su značajno pojačani i njihova ekspresija je opala u S4-S5. Markeri pankreasnog endoderma, kao što su PTF1a (Sl.6K), NKX6.1 (Sl.6G) i PDX-1 (Sl.6I) dostigli su maksimalne nivoe ekspresije u S5 drugog dana kulture. PCR podaci ukazuju da u fazi 3 ćelije prelaze kroz PDX-1+ SOX2+ populaciju pre nego što postanu PDX-1+ NKX6.1+ SOX2- CDX2- u S4-S5 fazi. (Videti Sl. 6I, Sl. 6G, Sl. 6M i Sl. 6A.) Ekspresija endokrinih markera (hromogranin, insulin, glukagon i somatostain) dostigla je maksimalni nivo ekspresije na kraju S5. Ekspresija pankreasnih endokrinih prekursorskih markera, NKX2.2, NeuroD i NGN3, dostigla je maksimalni nivo ekspresije u S4-S5. Ekspresija drugih linijskih markera, kao što su ZIC1 i SOX17, ostala je niska u S4-S5.
[0245] Zaključno, ćelije u fazi 5, drugog dana, koje su diferencirane prateći protokol opisan u ovom primeru, eksprimuju niske nivoe CDX2 i SOX2, dok održavaju visok nivo ekspresije NKX6.1 i PDX-1. Veruje se da jedinstvena kombinacija blagovremene inhibicije BMP, upotrebe niske doze RA u S4-S5, upotrebe visoke glukoze u S1-S2 rezultira populacijom ćelija opisanom u Primeru 1.
[0246] Referentni primer 2
[0247] Uticaj inhibicije BMP i aktivacije PKC na ekspresiju SOX2 na S3-S4
[0248] Protokol opisan u ovom primeru je sproveden da bi se rasvetlili efekti inhibicije BMP, dodavanja FGF7 zajedno sa aktivacijom PKC na ekspresiju SOX2 u S3-S4.
[0250] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 su sakupljene u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) i zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obložene posude u mTesr<™>1 medijumu dopunjenom sa 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u ćelije pankreasne endokrine loze na sledeći način:
[0251] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 3 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, i 2,5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1,5 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane MCDB-131 medijumom dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 tokom 2-3 dana.
[0252] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7 u trajanju od tri dana.
[0253] c. Faza 3 (prednje crevo - 3 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 20 ng/ml aktivina-A, 2 µM RA, u prisustvu ili odsustvu 50 ng/ml FGF7, 50 nM ili 200 nM LDN-193189, i/ili 200 nM TPB. Ćelije su inkubirane tri dana u medijumu koristeći kombinacije navedene u Tabeli II, ispod:
[0254] Tabela II
[0256]
[0259] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 200 nM TPB, 400 nM LDN-193189, 2 µM ALk5 inhibitorom (SD-208, otkriven u Molecular Pharmacology 2007, 72:152-161), i 100 nM inhibitora CYP26A (N-{4-[2-etil-1-(1H-1, 2, 4-triazol-1-il)butil]fenil}-1,3-benzotiazol-2-amin, Janssen, Belgija) tokom tri dana.
[0261] mRNK je sakupljena u S2-S4 za sve gorenavedene uslove i analizirana korišćenjem PCR u realnom vremenu. Kontrolni uslovi, za S3, odnose se na kulture pri čemu su FGF7, AA, SANT, RA i 200 nM LDN-193189 korišćeni u koncentracijama navedenim gore u koraku c. Kao što je očigledno iz PCR podataka prikazanih na slikama 7A do 7G, uklanjanje LDN-193189 na S3 rezultiralo je značajnim smanjenjem endokrinih markera, kao što je NGN3 (Sl. 7D), i panendokrinih markera kao što je hromogranin (videti Sl.7C). Dodavanje PKC aktivatora i uklanjanje LDN-193189 u S3 dodatno je smanjilo endokrine markere, a istovremeno je pojačalo ekspresiju NKX6.1 (videti Sl.7A do Sl.7G). Štaviše, dodavanje 50 nM LDN-193189 bilo je jednako efikasno kao i 200 nM LDN-193189 u indukciji endokrinih markera (hromogranin i NGN3). Uklanjanje LDN-193189 i dodavanje TPB u S3 povećalo je ekspresiju CDX2 (Sl.7E) i albumina (Sl.7F), dok je suzbijalo ekspresiju SOX2 (Sl. 7G). Štaviše, uklanjanje i FGF7 i LDN-193189 značajno je povećalo ekspresiju SOX2 (Sl. 7G) i smanjilo ekspresiju albumina (Sl. 7F) u poređenju sa kulturama u kojima je LDN-193189 uklonjen, a FGF7 zadržan. Ovi podaci pokazuju da precizna modulacija inhibicije BMP, aktivacije FGF i aktivacije PKC može rezultirati endodermnim domenom koji je bogat PDX-1 i NKX6.1, dok je nizak za CDX2, SOX2 i albumin. Konačno, dugotrajna inhibicija BMP na S3-S4 pojačala je ekspresiju proendokrinih gena plus povećanje ekspresije SOX2. Ovo ukazuje na to da inhibicija BMP mora biti precizno podešena kako bi se povećali pankreasni endokrini geni, a da se pritom ne poveća ekspresija SOX2, koja je odsutna ili je slabo razvijena u pankreasu, ali je prisutna u organima endoderma prednjeg creva, kao što je želudac.
[0263] Referentni primer 3
[0264] Rana inhibicija BMP u fazi prednjeg creva je neophodna za naknadnu indukciju endokrinih markera
[0265] Ovaj primer pokazuje da je rana inhibicija BMP signalizacije u S3 neophodna za naknadnu indukciju endokrinih markera. Međutim, dugotrajna inhibicija BMP u fazi 3, takođe, dovodi do jake ekspresije SOX2. Da bi se dobila i visoka ekspresija endokrinih markera zajedno sa niskom ekspresijom SOX2, bio je potreban gradijent BMP inhibicije da bi se indukovali propankreatični endokrini markeri, a istovremeno postigla niska ekspresija SXO2 i CDX2.
[0267] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu dopunjenom sa 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u ćelije pankreasne endokrine loze na sledeći način:
[0268] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, ćelije su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je usledila inkubacija u S1 medijumu. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>obeleženim posudama su tretirane jedan dan medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukozom, 100 ng/ml GDF8, 1,5 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B). Ćelije su zatim tretirane dva dana (2-4 dan) sa MCDB-131 medijumom dupunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8.
[0269] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane tri dana medijumom MCDB-131 dupunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7.
[0270] c. Faza 3 (prednje crevo - 3 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dupunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 20 ng/ml Aktivina-A, 2 µM RA, 50 ng/ml FGF7, 100 nM LDN-193189 (samo 1. dana ili tokom trajanja 3. faze) i 200 nM TPB. U nekim kulturama, LDN-193189 je uklonjen iz 3. faze.
[0271] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dupunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 100 nM TPB, 200 nM LDN-193189, 2 µM ALk5 inhibitora i 100 nM CYP26A inhibitora tokom tri dana.
[0272] e. Faza 5 (pankreasni endoderm/endokrini - 4 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dupunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 200 nM LDN-193189 i 2 µM ALk5 tokom četiri dana.
[0274] Kao što je pokazano rezultatima PCR prikazanim na slikama 8A do 8G, uklanjanje LDN-193189 (inhibitor BMP) iz faze 3 ukida ekspresiju proendokrinih gena NGN3 (Sl.8C); NeuroD (Sl.8D); hromogranina (Sl. 8E) u fazi 4 i fazi 5. Međutim, ekspresija PDX-1 (Sl. 8B) i NKX6.1 (Sl.8A) nije značajno smanjena u poređenju sa NGN3 i NeuroD u fazama 4-5. Štaviše, potpuno uklanjanje LDN-193189 u fazi 3 dovodi do značajnog povećanja ekspresije CDX2 (Sl.7F). Dodavanje LDN-193189 prvog dana faze 3, a zatim njegovo uklanjanje 2-3 dana faze 3, značajno je povećalo ekspresiju NGN3 i NeuroD, dok je smanjilo ekspresiju CDX2 i SOX2 u fazi 4. Kulture u kojima je LDN-193189 zadržan tokom trajanja faze 3 pokazale su veoma visoku ekspresiju SOX2 (Sl.
[0275] 8G) u S3-S4. Ovi podaci pokazuju da je inhibicija BMP 1. dana faze 3 dovoljna da pokrene endokrine markere pankreasa, dok suzbija ekspresiju SOX2 i CDX2.
[0277] Ukratko, inhibicija BMP je neophodna prvog dana faze 3 da bi se indukovalo formiranje endokrinih prekursorskih ćelija u fazama 4-5 i da bi se održala ekspresija PDX-1 i NKX6.1, a istovremeno suzbila ekspresija SOX2. Štaviše, dodavanje PKC aktivatora u fazama 3 dodatno je pojačalo ekspresiju PDX-1 i NKX6.1.
[0279] Referentni primer 4
[0280] Inhibicija BMP signalizacije prvog dana treće faze je dovoljna da generiše ćelije prekursore pankreasa u četvrtoj fazi, dok inhibicija BMP signalizacije poslednjeg dana treće faze dovodi do značajno niže ekspresije endokrinih markera
[0281] Ovaj primer pokazuje da rana inhibicija BMP signalizacije u fazi 3 omogućava indukciju markera endokrinih prekursora pankreasa, dok inhibicija BMP signalizacije kasno u fazi 3 značajno smanjuje nivo ekspresije markera endokrinih prekursora u fazi 4.
[0283] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblaženje) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu dopunjenom sa 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u ćelije pankreasne endokrine loze na sledeći način:
[0284] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama su tretirane jedan dan medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1,5 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B). Ćelije su zatim tretirane tri dana medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8.
[0285] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane tri dana sa MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7.
[0286] c. Faza 3 (prednje crevo - 3 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA i kombinacije navedene u Tabeli III, u daljem tekstu, tokom tri dana.
[0287] Tabela III
[0289]
[0292] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 100 nM TPB, 200 nM LDN-193189, 2 µM ALk5 inhibitora i 100 nM CYP26A inhibitora tokom tri dana.
[0294] Slike 9A do 9H prikazuju profil ekspresije gena pankreasnog endoderma, endokrinog prekursora i markera prednjeg creva za kombinacije uslova kulture navedenih gore. U skladu sa prethodnim primerom, blokiranje BMP putanje prvog dana faze 3 je kritično za naknadnu indukciju endokrinog programa mereno ekspresijom pan-endokrinog markera, hromogranina (videti Sl.9C). Međutim, dodavanje BMP inhibitora prvog dana faze 3 pokreće ekspresiju endokrinih markera u narednim fazama. Štaviše, dodavanje BMP inhibitora prvog dana faze 3 takođe je smanjilo ekspresiju markera prednjeg creva, SOX2, u fazama 3-4 (Sl. 9H). Međutim, dodavanje BMP inhibitora tek poslednjeg dana faze 3 pokazuje značajno veću ekspresiju SOX2 na kraju faze 3 u poređenju sa ćelijama tretiranim BMP inhibitorom samo prvog dana faze 3. Nivoi ekspresije prikazani na slikama 9A do 9H su relativni u odnosu na nivoe ekspresije u nediferenciranim H1 ćelijama koje imaju veoma visok nivo ekspresije SOX2. Pored toga što je marker prednjeg dela creva, SOX2 je dobro poznati transkripcioni faktor važan za održavanje pluripotentnosti ES ćelija. Ovaj primer dodatno podržava prethodne rezultate koji ističu osetljivost kultura faze 3 na trajanje i kinetiku BMP signalizacije i naknadni uticaj na pankreasnu endokrinu indukciju i ekspresiju SOX2.
[0296] Referentni primer 5
[0297] Optimalna doza inhibicije BMP u fazi pankreasnog prednjeg creva (Faza 4)
[0298] Prethodni primeri su opisali optimalno trajanje inhibicije BMP u fazi 3. Ovaj primer identifikuje optimalnu dozu BMP inhibitora na S4 medijumu.
[0300] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu i 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način: a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 tokom 2-4 dana.
[0301] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7 tokom tri dana.
[0302] c. Faza 3 (prednje crevo - 4 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X, 2,5 mM, glukozom, 1X GlutaMax<™>u odnosu 1:200, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A, 100 nM LDN-193189 i 100 nM TPB tokom jednog dana. Ćelije su zatim kultivisane u MCDB-131 medijumu dopunjenom razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A i 100 nM TPB tokom tri dana.
[0303] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 4 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 200 nM LDN-193189-193189, 2 µM inhibitora ALk5, 100 nM inhibitora CYP26A i koncentracije LDN-193189 navedene u Tabeli IV (ispod) za dane 1-4 faze 4:
[0305] Tabela IV
[0307]
[0310] d. Faza 5 (pankreasni endoderm/endokrini prekursor - 3 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 50 nM LDN-193189 i 1 µM inhibitora ALk5 tokom tri dana.
[0312] Rezultati analize PCR u realnom vremenu ćelija sakupljenih nakon gore navedenih tretmana prikazani su na slikama 10A do 10H. Ova slika pokazuje da dodavanje 50 nM ili 100 nM LDN-193189 1, 2, 3 ili 4 dana u S4 može produžiti ekspresiju endokrinih markera, a istovremeno održati nisku ekspresiju SOX2 u S4-S5 (videti Sl.10A do Sl.10H).
[0314] Referentni primer 6
[0315] Optimalna doza inhibicije BMP u fazi prednjeg creva (faza 3)
[0316] Ovaj primer identifikuje optimalnu dozu inhibicije BMP u fazi 3 i naknadne efekte na endokrine markere u fazi 6.
[0318] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu dopunjenom sa 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u ćelije pankreasne endokrine loze na sledeći način:
[0319] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1,5 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 tokom 2-4 dana. b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7 tokom tri dana.
[0320] c. Faza 3 (prednje crevo - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A, 100 nM TPB i 10-50 nM LDN-193189 tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane MCDB-131 medijumom dopunjenim ITS-X razblaženjem od 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A i 100 nM TPB tokom dva dana.
[0321] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 20 nM LDN-193189; 2 µM ALk5 inhibitorom; 100 nM CYP26 A inhibitorom i 100 nM TPB tokom tri dana.
[0322] e. Faza 5 (pankreasni endoderm/endokrini prekursor - 3 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200; 2,5 mM glukozom; 1X GlutaMax<™>; 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata; 2% BSA bez masnih kiselina; /- 25 nM LDN-193189 i/ili 2 µM inhibitora ALk5 tokom tri dana.
[0323] f. Faza 6 (proizvodnja pankreasnih endokrinih hormona - 3 dana): Ćelije faze 5 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200; 2,5 mM glukoze; 1X GlutaMax<™>; 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata; i 2% BSA bez masnih kiselina tokom tri dana.
[0325] Slike 11A do 11H pokazuju da je potrebna niska do umerena inhibicija BMP prvog dana faze 3 da bi se pokrenula ekspresija endokrinih markera uz održavanje niske ekspresije SOX2. Štaviše, inhibicija BMP u fazi 5, uz pojačavanje endokrinih markera, takođe je dovela do povećanja ekspresije SOX2.
[0327] Podaci u ovom primeru dodatno potvrđuju rezultate predstavljene u prethodnim primerima. Podaci potvrđuju da je precizna modulacija BMP puta u fazama 3-5 potrebna da bi se pokrenula indukcija pankreasnih endokrinih markera, a istovremeno suzbila ekspresija SOX2.
[0329] Referentni primer 7
[0330] Optimalni prozor za inhibiciju BMP u S3 (faza prednjeg creva)
[0331] Ovaj primer identifikuje optimalni vremenski prozor u fazi 3 za inhibiciju BMP signalizacije, uz očuvanje endokrine indukcije u kasnijim fazama i smanjenje ekspresije SOX2.
[0333] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (Pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu i 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0334] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1,5 µM MCX jedinjenja tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane MCDB-131 medijumom dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 tokom 2-4 dana.
[0335] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 3 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7 tokom tri dana.
[0336] c. Faza 3 (prednje crevo - 3 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A i 100 nM TPB, koji sadrži 100 nM LDN-193189 samo tokom prva 2 sata, 6 sati ili 24 sata faze 3.
[0337] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 25 nM LDN-193189, 2 µM ALk5 inhibitora, 100 nM CYP26 A inhibitora i 100 nM TPB tokom tri dana. e. Faza 5 (pankreasni endoderm/endokrini prekursor - 3 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina i 2 µM inhibitora ALk5 tokom tri dana.
[0339] Slike 12A do 12G prikazuju analize PCR u realnom vremenu za podatke prikupljene u ovom primeru. Tretman u fazi 3 tokom najmanje 2 sata sa inhibitorom BMP može pokrenuti ekspresiju proendokrinih transkripcionih faktora kao što su Ngn3 (Sl.12D) i NeuroD (Sl.12E), uz održavanje veoma niske ekspresije SOX2 (Sl.12G) i značajno povećava ekspresiju NKX6.1 (Sl.12A) i PDX-1 (Sl.12B) u S4-S5. Međutim, u fazi 5, 3. dana, ekspresija CDX2 bila je veća u ćelijama tretiranim 2 ili 6 sati inhibitorom BMP nego u ćelijama tretiranim 24 sata inhibitorom (Sl.12F).
[0341] Podaci iz ovog primera ukazuju na to da je 24-časovna inhibicija BMP puta optimalna za održavanje niskog nivoa ekspresije CDX2 i SOX2, i za pokretanje endokrine diferencijacije uz održavanje visoke ekspresije markera pankreasnog endoderma.
[0342] Referentni primer 8
[0343] Optimalno trajanje faze 3 (faza prednjeg creva) i faze 4 (faza pankreasnog prekursora prednjeg creva)
[0344] Ovaj primer je sproveden da bi se odredilo optimalno trajanje S3 i S4 u postepenoj diferencijaciji pluripotentnih ćelija u populaciju ćelija pankreasne endokrine loze.
[0346] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm²<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblaženje) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu dopunjenom sa 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0347] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 4 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>; 2,5 mM D-glukoza; 100 ng/ml GDF8 i 1,5 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina; 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata; 1X GlutaMax<™>; 2,5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 tokom 2-4 dana; zatim
[0348] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 2 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 2,5 mM D-glukoze i 50 ng/ml FGF7 tokom dva dana.
[0349] c. Faza 3 (prednje crevo - 2-3 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivina-A i 100 nM TPB, koji sadrži 100 nM LDN-193189 tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane MCDB-131 medijumom dopunjenim ITS-X razblaženjem od 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 ng/ml FGF7, 2 µM RA, 20 ng/ml Aktivin-A i 100 nM TPB.
[0350] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 2-3 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 25 nM LDN-193189, 100 nM inhibitor CYP26 A i 100 nM TPB tokom dva ili tri dana.
[0351] e. Faza 5 (pankreasni endoderm/endokrini prekursor - 2 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina i 1 µM inhibitora ALk5 tokom dva dana.
[0352] f. Faza 6 (pankreatični endokrini prekursor/hormon - 2 dana): Ćelije faze 5 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata i 2% BSA bez masnih kiselina tokom dva dana.
[0354] Podaci iz PCR analiza u realnom vremenu uzoraka sakupljenih u fazi 3, fazi 4, fazi 5 ili fazi 6 prikazani su na slikama 13A do 13G. Ovi podaci pokazuju da produžavanje S3 i S4 na tri dana poboljšava ekspresiju NKX6.1, u poređenju sa kulturama koje imaju dvodnevni S3 i S4 (Sl.13A). Ćelije tretirane tri dana u fazi 3 pokazuju smanjenje ekspresije proendokrinih markera u poređenju sa kulturama pri čemu je trajanje S3 i S4 bilo samo dva dana (Sl. 13D i Sl. 13E). Štaviše, produžavanje faze 4 na tri dana značajno je povećalo ekspresiju SOX2 (Sl.13G).
[0356] Podaci dobijeni u ovom primeru su u skladu sa podacima generisanim u prethodnim primerima, pokazujući da produžena inhibicija BMP usmerava prednje crevo ka populaciji sa visokim nivoom SOX2. Na osnovu podataka iz ovog primera i prethodnih primera, može se zaključiti da je optimalno trajanje faze 3 i faze 4 dva dana. Idealan protokol će rezultirati diferenciranim ćelijama sa visokim nivoima ekspresije proendokrinih markera, visokim NKX6.1, niskim CDX2 i niskom ekspresijom SOX2.
[0358] Referentni primer 9
[0359] Produženo izlaganje inhibiciji BMP u prisustvu visokog nivoa glukoze i suplementa B27 značajno povećava ekspresiju SOX2 u S3 i S4
[0360] Ovaj protokol je sproveden da bi se utvrdili faktori koji utiču na ekspresiju SOX2 u S3 i S4 tokom postepene diferencijacije pluripotentnih ćelija u ćelije koje proizvode hormone.
[0362] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 su kultivisane na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama i kultivisane u mTesr<™>1 medijum do ~70% konfluencije i diferenciran na sledeći način:
[0363] a. Nediferencirane ćelije su kultivisane u RPMI medijumu (Invitrogen) dopunjenom sa 0,2% FBS; 100 ng/ml aktivina A; 20 ng/ml WNT-3a tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane RPMI medijumom dopunjenim sa 0,5% FBS; 100 ng/ml aktivina A tokom dodatna dva dana (Faza 1).
[0364] b. Ćelije faze 1 su tretirane DMEM/F12 medijumom dopunjenim sa 2% FBS; 50 ng/ml FGF7 tokom tri dana (faza 2).
[0365] c. Ćelije faze 2 su kultivisane u DMEM-medijumu sa visokim sadržajem glukoze dopunjenom sa 1% B27; 0,25 µM SANT-1; 2 µM RA; 100 ng/ml Noggin-a (R & D systems, MN, SAD) tokom četiri dana (faza 3).
[0366] d. Ćelije faze 3 su tretirane DMEM-medijumom sa visokim sadržajem glukoze dopunjenim sa 1% B27; 100 ng/ml Noggin-a; 1 µM ALK5 inhibitora II (Axxora, Kalifornija, SAD); i 50 nM TPB tokom četiri dana (faza 4).
[0368] Slike 14A do 14H prikazuju FACS histograme za ćelije sakupljene u fazi 3, 4. dana, dobijene za sledeće markere: izotipska kontrola (Sl.14A), hromogranin (Sl.14B), KI-67 (Sl.14C), NKX6.1 (Sl. 14D), SOX2 (Sl. 14E), HNF3B (Sl. 14F), CDX2 (Sl. 14G), PDX-1 (Sl. 14H). Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu. Većina ćelija u fazi 3 bila je pozitivna na ekspresiju PDX-1 (Sl.14H) i HNF3B (Sl.14F), negativna na ekspresiju NKX6.1 (Sl.
[0369] 14D), i pokazala je nisku ekspresiju hromogranina (Sl.14B) i CDX2 (Sl.14G). Međutim, preko 90% ćelija je, takođe, bilo snažno pozitivno na SOX2 (Sl.14E). Ovo ukazuje da je u fazi 3 većina ćelija bila pozitivna na PDX-1 i SOX2, a negativna na NKX6.1, što sugeriše uspostavljanje populacije endoderma u skladu sa populacijom prednjeg creva ispred PDX-1 domena pankreasa.
[0370] Štaviše, procenat ćelija koje su bile SOX2+ u fazi 3, u populaciji ćelija generisanih korišćenjem protokola opisanog u ovom primeru, bio je značajno veći od procenta ćelija koje su bile SOX2+ u populaciji ćelija generisanih korišćenjem protokola opisanog u Primeru 1. Ova razlika se može pripisati produženom izlaganju BMP antagonistu Noggin-u, nedostatku FGF7 i PKC aktivatora u medijumu za kultivaciju u fazi 3 ovog primera.
[0372] Slike 15A do 15G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 drugog dana ćelija diferenciranih prema Primeru 9: Sl.15A: Izotipska kontrola, Sl.15B: NKX6.1, Sl.15C: KI-67, Sl. 15D: hromogranin, Sl. 15E: SOX2, Sl. 15F: CDX2, Sl. 15G: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0374] Slike 16A do 16F prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 četvrtog dana ćelija diferenciranih prema Primeru 9. Sl.16A: Izotipska kontrola, Sl.16B: NKX6.1, Sl.16C: hromogranin, Sl. 16D: SOX2, Sl.16E: CDX2, Sl.16F: PDX-1. Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0376] Tabela V, u daljem tekstu, sumira podatke dobijene za % ekspresije endodermnih markera u S3 i S4 za ćelije diferencirane prema protokolu opisanom u ovom primeru.
[0378] Tabela V
[0380]
[0381] Slike 17A do 17J prikazuju rezultate PCR analize u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 9. Sl.17A: CDX2, Sl. 17B: HHex, Sl. 17C: FOXE1, Sl. 17D: IPF1 (PDX-1), Sl. 17E: NKX2.1, Sl. 17F: NKX2.2, Sl.17G: NKX6.1, Sl.17H: PROX1, Sl.17I: SOX2, Sl.17J: SOX9.
[0383] Kao što se vidi na slikama 14 do 17 i u Tabeli V, 2-4 dana faze 4, došlo je do značajnog povećanja ekspresije NKX6.1 uz održavanje visoke ekspresije PDX-1. Iako je ekspresija SOX2 opala sa faze 3 na fazu 4, ~75% ćelija je i dalje bilo SOX2+. Isto kao i na Sl.5, CDX2+ ćelije, SOX2+ ćelije i NKX6.1+ ćelije su se međusobno isključivale iz populacije hromogranina. Ovo implicira da populacija ćelija faze 4 generisana 4. dana korišćenjem protokola opisanog u Primeru 9 ima ~50% NKX6.1+ SOX2+ PDX-1+ CDX2-hromogranin-negativne frakcije. Ovo je u suprotnosti sa ćelijskom populacijom generisanom u Primeru 1 koja je imala 40-70% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2-, CDX2-, hromogranin-negativnu frakciju i 2-25% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+ u S4-S5. Jasno je da su ćelije generisane korišćenjem protokola u Primeru 1 imale daleko veći procenat pankreasnog endoderma, kako je definisano kao populacija koja je PDX-1+ i NXK6.1+, dok je niska ili negativna za SOX2 i CDX2, u poređenju sa ćelijama generisanim u Primeru 9.
[0385] Podaci dobijeni u ovom primeru pružaju potporu tome da produženo izlaganje inhibiciji BMP u prisustvu visokog nivoa glukoze i suplementa B27 značajno povećava ekspresiju SOX2 u fazama 3 i 4 diferencijacije.
[0387] Referentni primer 10
[0388] Prethodno objavljeni protokol rezultira formiranjem značajnog broja SOX2+ populacije u fazama 3-4
[0389] Kroon i sar. su objavili protokol za pripremu ćelija pankreasne endodermne loze iz humanih embrionalnih matičnih ćelija (Nature Biotech 2008, 26: 443-452; u daljem tekstu „Kroon“). U ovde datom primeru, humane embrionalne matične ćelije su diferencirane prateći Kroon-ov protokol i testirane na ekspresiju markera karakterističnih za različite faze diferencijacije.
[0391] Ćelije humanih embrionalnih matičnih ćelija linije H1 su zasejane na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama i kultivisane u mTesr<™>1 medijumu do ~70% konfluencije i diferencirane korišćenjem protokola koji je prethodno objavio Kroon na sledeći način:
[0392] a) Nediferencirane ćelije su izložene RPMI medijumu dopunjenom sa 0,2% FBS, 100 ng/ml aktivina A, 20 ng/ml WNT-3a tokom jednog dana, nakon čega je usledio tretman RPMI medijumom dopunjenim sa 0,5% FBS, 100 ng/ml aktivina A tokom dodatna dva dana (Faza 1).
[0393] b) Ćelije faze 1 su bile izložene RPMI medijumu dopunjenom sa 2% FBS, 50 ng/ml FGF7 tokom tri dana (faza 2).
[0394] c) Ćelije faze 2 su tretirane DMEM-medijumom sa visokim sadržajem glukoze dopunjenim sa 1% B27, 0,25 µM SANT-1, 2 µM RA, 50 ng/ml Noggin-a (R & D systems, MN) tokom tri dana (faza 3).
[0395] d) Ćelije faze 3 su kultivisane u DMEM-medijumu sa visokim sadržajem glukoze dopunjenom sa 1% B27 tokom tri dana (faza 4).
[0396] e) Ćelije faze 4 su sastrugane iz ležišta i resuspendovane kao klasteri u DMEM-medijumu sa visokim sadržajem glukoze dopunjenom sa 1% B27 tokom dva dana.
[0398] Slike 18A do 18G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S3 trećeg dana ćelija diferenciranih prema Primeru 10: Izotipska kontrola (Sl. 18A), NKX6.1 (Sl. 18B), hromogranin (Sl. 18C), SOX2 (Sl. 18D), CDX2 (Sl. 18E), KI-67 (Sl. 18F), PDX-1 (Sl. 18G). Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0400] Slike 19A do 19G prikazuju FACS histogramske profile ekspresije sledećih markera u S4 petog dana ćelija diferenciranih prema Primeru 10. Izotipska kontrola (Sl. 19A), NKX6.1 (Sl. 19B), hromogranin (Sl. 19C), SOX2 (Sl. 19D), CDX2 (Sl. 19E), KI-67 (Sl. 19F), PDX-1 (Sl. 19G). Procentualna ekspresija za svaki marker je prikazana na svakom histogramu.
[0402] Kao što je prikazano na slikama 18 i 19, do kraja faze 4 (5. dana) klasteri ćelija u suspenziji su bili ~20% NKX6.1+ PDX-1+ SOX2- i ~20% PDX-1+ NKX6.1+ SOX2+. Ovi rezultati ukazuju da je značajan deo populacije ćelija u fazi 4 generisanih prema Primeru 10, koje su bile NKX6.1+, takođe bio i SOX2+.
[0403] Tabela VI, prikazana u daljem tekstu, sumira procente endodermnih markera u S3-S4 ćelija generisanih u ovom primeru.
[0404] Tabela VI
[0406]
[0409] Referentni primer 11
[0410] Dodavanje askorbinske kiseline dovodi do značajnog smanjenja broja polihormonalnih ćelija i istovremenog povećanja broja pojedinačnih hormonskih insulin-pozitivnih ćelija
[0412] Testiran je efekat askorbinske kiseline na ekspresiju markera tokom diferencijacije pluripotentnih ćelija u ćelije koje proizvode hormone. Ćelije su kultivisane u medijumu dopunjenom glukozom u svakom koraku diferencijacije i dopunjenom askorbinskom kiselinom u formiranju faza 3, 4 i 5 na sledeći način:
[0413] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu i 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0414] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 3 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 1 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 100 nM MCX jedinjenja tokom drugog dana, nakon čega je usledio dodatni dan u MCDB-131 medijumu dopunjenom sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8.
[0415] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 2 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze i 25 ng/ml FGF7 tokom dva dana.
[0416] c. Faza 3 (prednje crevo - 2 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim ITS-X razblaženjem 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 µM SANT-1, 1µM RA, 200 nM TPB (PKC aktivator), 100 nM LDN-193189 (inhibitor BMP receptora) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane MCDB-131 medijumom dopunjenim ITS-X razblaženjem 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 µM SANT-1, 1µM RA, 200 nM TPB (PKC aktivator), 10 nM LDN-193189 tokom dodatnog dana. Neke kulture su tretirane sa 0,25 mM askorbinske kiseline (kataloški broj A4544, Sigma, Misuri, SAD) tokom trajanja 3. faze.
[0417] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 2 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, 200 nM TPB, 50 nM LDN-193189, sa ili bez 0,25 mM askorbinske kiseline tokom dva dana.
[0418] e. Faza 5 (pankreasni endoderm, 2-7 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, sa ili bez 0,25 mM askorbinske kiseline tokom 2-7 dana.
[0420] Slike 20A do 20J prikazuju analize PCR u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 11. Sl. 20A: somatostatin, Sl. 20B: PDX1, Sl.20C: Pax6, Sl.20D: Pax4, Sl.20E: NKX6.1, Sl.20F: NGN3, Sl.
[0421] 20G: glukagon, Sl.20H: NeuroD, Sl.20I: insulin, Sl.20J: hromogranin. Ova slika pokazuje da je dodavanje askorbinske kiseline u fazi 3 ili u fazama 3 i 4 značajno smanjilo ekspresiju somatostatina i glukagona u fazama 4-5, dok je povećalo ekspresiju insulina (videti Sl. 20A, Sl.
[0422] 20G i Sl.20I). Štaviše, u fazama 4-5 ekspresija markera pankreasnog endoderma, kao što su PDX-1 i NKX6.1, nije značajno izmenjena dodatkom 0,25 mM askorbinske kiseline (videti Sl.20B i Sl.
[0423] 20D). U fazama 4-5, ekspresija Pax6 je smanjena, a ekspresija Pax4 je održana (videti Sl. 20C i Sl. 20D). Na kraju faze 5, kulture tretirane /- askorbinskom kiselinom u S3-S5 su imunološki obojene na insulin, glukagon i somatostatin hormone. Tabela VII sumira prosečan procenat insulinpozitivnih ćelija, glukagon- i somatostatin-pozitivnih ćelija i polihormonalnih ćelija (ekspresija dva ili više hormona u jednoj ćeliji).
[0424] Tabela VII
[0426]
[0429] Referentni primer 12
[0430] Optimalna doza askorbinske kiseline u fazi 3
[0431] Ovaj primer je sproveden da bi se odredila optimalna doza askorbinske kiseline koja se koristi za generisanje insulin-pozitivnih ćelija koje su jednohormonske, PDX-1 pozitivne i NKX6.1 pozitivne.
[0433] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijumu i 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0434] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 3 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze i 100 ng/ml GDF8 plus 1 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8 plus 100 nM MCX jedinjenja tokom drugog dana, nakon čega je usledio dodatni dan u MCDB-131 medijumu dopunjenom sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8.
[0435] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 2 dana): Ćelije faze 1 su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze, sa ili bez dodatka 0,25 mM askorbinske kiseline i 25 ng/ml FGF7 tokom dva dana.
[0436] c. Faza 3 (prednje crevo - 2 dana): Ćelije faze 2 su tretirane medijumom MCDB131 dopunjenim ITS-X razblaženjem od 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 µM SANT-1, /- 0,25 mM askorbinske kiseline, 1 µM RA, 200 nM TPB, 100 nM LDN-193189 za 1. dan, nakon čega je sledio tretman sa MCDB131 medijumom dopunjenim sa 1:200 razblaženjem ITS-X, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 µM SANT-1, /- 0,25 mM askorbinske kiseline, 1 µM RA, 200 nM TPB, 10 nM LDN-193189 tokom dodatnog dana. d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 2 dana): Ćelije faze 3 su tretirane medijumom MCDB131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, 200 nM TPB, 50 nM LDN-193189, sa ili bez dodavanja 0,25 mM do 1 mM askorbinske kiseline tokom dva dana.
[0437] e. Faza 5 (pankreasni endoderm, 2-9 dana): Ćelije faze 4 su tretirane medijumom MCDB131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, sa ili bez dodatka 0,25 mM askorbinske kiseline tokom 2-9 dana.
[0439] Slike 21A do 21J prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije sledećih gena u ćelijama linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 diferenciranih prema Primeru 12. Sl.
[0440] 21A: somatostatin, Sl. 21B: PDX1, Sl. 21C: Pax6, Sl. 21D: Pax4, Sl. 21E: NKX6.1, Sl. 21F: NGN3, g, Sl.21G: NeuroD, Sl.21H: insulin, Sl.21I: glukagon, Sl.21J: hromogranin. U skladu sa podacima iz Primera 10, dodavanje askorbinske kiseline u fazama 2-4 značajno je smanjilo ekspresiju somatostatina, glukagona i Pax6, dok je ekspresija insulina i Pax4 održana u fazi 5. Štaviše, nije bilo značajne koristi od korišćenja, u fazi S4, 0,5-1 mM askorbinske kiseline u poređenju sa 0,25 mM askorbinske kiseline. Konačno, dodavanje askorbinske kiseline u fazi 2 takođe se pokazalo efikasnim u smanjenju ekspresije glukagona i somatostatina u fazi S3-5, uz održavanje ekspresije insulina. Dakle, askorbinska kiselina deluje na specifičan način za određenu fazu kako bi regulisala ekspresiju pojedinačnih hormonskih ćelija. Dodavanje askorbinske kiseline je važno u ranim fazama protokola diferencijacije, dok se u kasnijim fazama nije pokazalo toliko efikasnim u smanjenju broja polihormonalnih ćelija.
[0442] Referentni primer 13
[0443] Kombinacija retinoinske kiseline i askorbinske kiseline je neophodna za stvaranje pojedinačnih hormonskih insulin-pozitivnih ćelija
[0444] Ovaj primer je sproveden da bi se rasvetlili zahtevi za stvaranje pojedinačnih hormonskih insulinpozitivnih ćelija tokom diferencijacije pluripotentnih ćelija.
[0446] Ćelije linije humanih embrionalnih matičnih ćelija H1 u različitim pasažima (pasaž 40 do pasaža 52) zasejane su kao pojedinačne ćelije gustinom od 100.000 ćelija/cm<2>na MATRIGEL<™>(1:30 razblažene) obloženim posudama u mTesr<™>1 medijuma i 10 µM Y27632. Četrdeset osam sati nakon zasejavanja, kulture su diferencirane u pankreasnu endokrinu lozu na sledeći način:
[0447] a. Faza 1 (definitivni endoderm (DE) - 3 dana): Pre početka DE, kulture su isprane i inkubirane sa nekompletnim PBS (bez Mg ili Ca) tokom 30 sekundi, nakon čega je dodat medijum faze 1. Humane embrionalne matične ćelije kultivisane kao pojedinačne ćelije na MATRIGEL<™>-obloženim posudama tretirane su medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze, 100 ng/ml GDF8, 1 µM MCX jedinjenja (inhibitor GSK3B) tokom jednog dana. Ćelije su zatim tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, natrijum bikarbonatom, GlutaMax<™>, dodatnih 5 mM glukoze, 100 ng/ml GDF8 i 100 nM MCX jedinjenja tokom drugog dana, nakon čega je usledio dodatni dan u MCDB-131 medijumu dopunjenom sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM glukoze i 100 ng/ml GDF8.
[0448] b. Faza 2 (primitivna crevna cev - 2 dana): Ćelije su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim sa 0,1% BSA bez masnih kiselina, 0,0012 g/ml natrijum bikarbonata, 1X GlutaMax<™>, 5 mM D-glukoze, 0,25 mM askorbinske kiseline i 25 ng/ml FGF7 i tokom dva dana, zatim
[0449] c. Faza 3 (prednje crevo - 2 dana): Ćelije su tretirane sa MCDB131 dopunjenim sa 1:200 razblaženjem ITS-X, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 mM askorbinske kiseline, 0,25 µM SANT-1, 1µM RA, 200 nM TPB, 100 nM LDN-193189 za 1. dan, nakon čega je sledio tretman sa tMCDB131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukoze, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 10 ng/ml Aktivina A, 25 ng/ml FGF7, 0,25 mM askorbinske kiseline, 0,25 µM SANT-1, 1 µM RA, 200 nM TPB, 10 nM LDN-193189 tokom dodatnog dana.
[0450] d. Faza 4 (pankreasni prekursor prednjeg creva - 2 dana): Ćelije su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina, 0,25 µM SANT-1, 50 nM RA, 200 nM TPB, 50 nM LDN-193189, 0,1 mM askorbinske kiseline tokom dva dana, zatim
[0451] e. Faza 5 (pankreasni endoderm, 3 dana): Ćelije su tretirane medijumom MCDB-131 dopunjenim razblaženjem ITS-X u odnosu 1:200, 2,5 mM glukozom, 1X GlutaMax<™>, 0,0015 g/ml natrijum bikarbonata, 2% BSA bez masnih kiselina i sledećim uslovima kulture tokom 3 dana:
[0453] o 0,1 mM askorbinska kiselina
[0455] o 0,1 mM askorbinska kiselina 50 nM RA
[0457] o 0,1 mM askorbinska kiselina 50 nM RA 0,25 µM SANT-1
[0459] o 0,1 mM askorbinska kiselina 50 nM RA 0,25 µM SANT-1 50 nM LDN-193189
[0460] o 0,1 mM askorbinska kiselina 50 nM RA 0,25 µM SANT-1 1 µM Alk5 inh
[0461] o 0,1 mM askorbinska kiselina 50 nM RA 0,25 µM SANT-1 1 µM Alk5 inh 50 nM LDN-193189.
[0462] Slike 22A do 22L prikazuju podatke iz PCR analiza u realnom vremenu ekspresije Pax4 (Sl.22A); Pax6 (Sl.22B); PDX1 (Sl.22C); PTF1a (Sl.22D); glukagona (Sl.22E); insulina (Sl.22F); NeuroD (Sl. 22G); ngn3 (Sl.22H); Zic1 (Sl.22I); CDX2 (Sl.22J); albumina (Sl.22K); NKX6.1 (Sl.22L) u ćelijama embrionalne ćelijske linije H1 diferenciranih prema primeru 13 i sakupljenih u S5 trećeg dana.
[0464] Na kraju 5. faze, kulture tretirane gore navedenim kombinacijama su imunološki obojene na insulin, glukagon i somatostatin hormone. Tabela VIII sumira prosečan procenat insulin-pozitivnih ćelija, glukagon- i somatostatin-pozitivnih ćelija i polihormonalnih ćelija (ekspresija dva ili više hormona u jednoj ćeliji).
[0466] Kao što je prikazano na Sl.22 i u tabeli VIII ispod, dodavanje male doze retinoinske kiseline plus askorbinske kiseline u fazi 5 značajno je smanjilo ukupan broj hormonski pozitivnih ćelija, dok je povećalo procenat pojedinačnih hormonskih insulin-pozitivnih ćelija, u poređenju sa kulturama tretiranim samo vitaminom C u fazi S5. Štaviše, kombinacija retinoinske kiseline, askorbinske kiseline, inhibitora Sonic Hedgehog i inhibitora ALK5 dodatno je povećala broj pojedinačnih hormonskih insulin-pozitivnih ćelija u poređenju sa kulturama tretiranim samo askorbinskom kiselinom (vitamin C). Ovi podaci ukazuju da je potrebna jedinstvena kombinacija faktora da bi se generisale pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije.
[0468] Tabela VIII
[0470]

Claims (8)

1. Patentni zahtevi
1. In vitro postupak za postepenu diferencijaciju pluripotentnih ćelija u populaciju ćelija pankreasne endodermne loze, koji obuhvata kultivisanje ćelija u svakoj fazi diferencijacije u medijumu koji sadrži 5 mM do 20 mM glukoze, pri čemu postepena diferencijacija obuhvata korake
(a) diferencijacije pluripotentnih ćelija u ćelije definitivnog endoderma (DE) kultivisanjem pluripotentnih ćelija u medijumu dopunjenom TGF-B ligandom i WNT aktivatorom, (b) diferencijacije DE ćelija u ćelije crevnih cevi kultivisanjem DE ćelija u medijumu dopunjenom FGF ligandom,
(c) diferencijacije ćelija crevne cevi u ćelije endoderma zadnjeg dela prednjeg creva kultivisanjem ćelija crevne cevi u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom,
(d) diferencijacije endodermnih ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u pankreasne ćelije prednjeg creva kultivisanjem endodermnih ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dopunjenom aktivatorom PKC, inhibitorom shh, retinoidom i inhibitorom BMP, i (e) diferencijacije ćelija prednjeg creva pankreasa u ćelije pankreasnog endoderma kultivisanjem pankreasnih ćelija prednjeg creva u medijumu dopunjenom inhibitorom shh, inhibitorom TGF-B i retinoidom.
2. In vitro postupak prema zahtevu 1, koji dodatno obuhvata diferencijaciju ćelija pankreasnog endoderma u populaciju pankreasnih beta ćelija.
3. In vitro postupak prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je više od 30% diferenciranih ćelija pankreasnog endoderma PDX-1+ NKX6.1+, SOX2- i CDX2-.
4. In vitro postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, pri čemu više od 10% ćelija u diferenciranoj populaciji čine pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije.
5. In vitro postupak za diferencijaciju humanih embrionalnih matičnih ćelija u beta ćelije pankreasa koji obuhvata:
(a) kultivisanje nediferenciranih humanih embrionalnih matičnih ćelija u medijumu dopunjenom TGF-B ligandom i WNT aktivatorom, radi generisanja populacije ćelija definitivnog endoderma (DE);
(b) kultivisanje DE ćelija u medijumu dopunjenom FGF ligandom da bi se generisala populacija ćelija crevnih cevi;
(c) kultivisanje ćelija crevne cevi u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, FGF ligandom, PKC aktivatorom, TGF-B ligandom, retinoidom i BMP inhibitorom da bi se generisala populacija ćelija zadnjeg dela prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i SOX2; (d) kultivisanje ćelija zadnjeg dela prednjeg creva u medijumu dopunjenom PKC aktivatorom, shh inhibitorom, retinoidom i BMP inhibitorom da bi se generisala populacija ćelija pankreasa prednjeg creva koje eksprimuju PDX-1 i NKX6.1, i eksprimuju niži nivo SOX2 u poređenju sa ćelijama zadnjeg dela prednjeg creva;
(e) kultivisanje ćelija pankreasnog prednjeg creva u medijumu dopunjenom shh inhibitorom, TGF-B inhibitorom i retinoidom da bi se dobila populacija ćelija pankreasnog endoderma koje eksprimuju PDX-1, viši nivo NKX6.1 i niži nivo SOX2 u poređenju sa pankreasnim ćelijama prednjeg creva; i
(f) diferencijacija ćelija pankreasnog endoderma u populaciju beta ćelija pankreasa, što obuhvata kultivisanje ćelija u medijumu;
pri čemu medijum u svakom od koraka a) do f) sadrži 5 mM do 20 mM glukoze.
6. Postupak prema zahtevu 5, pri čemu je populacija beta ćelija pankreasa PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- i CDX2-.
7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6, pri čemu su beta ćelije pankreasa pojedinačne hormonske ćelije koje proizvode insulin, a koje su takođe NKX6.1+ i PDX-1+.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu je u najmanje jednom koraku medijum dodatno dopunjen askorbinskom kiselinom.
RS20260511A 2011-12-22 2012-12-07 Diferencijacija humanih embrionalnih matičnih ćelija u pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije RS68035B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161579351P 2011-12-22 2011-12-22
PCT/US2012/068439 WO2013095953A1 (en) 2011-12-22 2012-12-07 Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells
EP12860751.2A EP2794857B1 (en) 2011-12-22 2012-12-07 Differentiation of human embryonic stem cells into single hormonal insulin positive cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS68035B1 true RS68035B1 (sr) 2026-05-29

Family

ID=48669355

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20260511A RS68035B1 (sr) 2011-12-22 2012-12-07 Diferencijacija humanih embrionalnih matičnih ćelija u pojedinačne hormonske insulin-pozitivne ćelije

Country Status (25)

Country Link
US (5) US9388386B2 (sr)
EP (2) EP4752215A2 (sr)
JP (5) JP6441080B2 (sr)
KR (2) KR102090751B1 (sr)
CN (1) CN105143446B (sr)
AR (1) AR089426A1 (sr)
AU (3) AU2012355698B2 (sr)
BR (1) BR112014015417A8 (sr)
CA (1) CA2860107C (sr)
DK (1) DK2794857T3 (sr)
ES (1) ES3069712T3 (sr)
FI (1) FI2794857T3 (sr)
HK (1) HK1203552A1 (sr)
HR (1) HRP20260251T1 (sr)
LT (1) LT2794857T (sr)
MX (1) MX2014007744A (sr)
PH (1) PH12014501429A1 (sr)
PL (1) PL2794857T3 (sr)
PT (1) PT2794857T (sr)
RS (1) RS68035B1 (sr)
RU (2) RU2705001C2 (sr)
SG (2) SG11201403473QA (sr)
SI (1) SI2794857T1 (sr)
SM (1) SMT202600177T1 (sr)
WO (1) WO2013095953A1 (sr)

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
CN107574142B (zh) 2007-11-27 2021-07-06 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
BRPI0908033A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Centocor Ortho Biotech Inc Método placas de superfície modificada e composições para adesão, cultura e desprendimento de célula
CA2729121C (en) 2008-06-30 2019-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
EP2346988B1 (en) 2008-10-31 2017-05-31 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
JP2012507289A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
MX2011005288A (es) 2008-11-20 2011-06-01 Centocor Ortho Biotech Inc Celulas madre pluripotentes en microportadores.
CA2744227C (en) 2008-11-20 2018-10-02 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates
EP2456862A4 (en) 2009-07-20 2013-02-27 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
US12441985B2 (en) 2009-12-23 2025-10-14 Janssen Biotech, Inc. Methods for making insulin in vivo
DK2516625T3 (da) 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
AU2011223900A1 (en) 2010-03-01 2012-09-13 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
AU2011250912A1 (en) 2010-05-12 2012-11-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
KR101836850B1 (ko) 2010-08-31 2018-03-09 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
CN103221536B (zh) 2010-08-31 2016-08-31 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
RU2705001C2 (ru) 2011-12-22 2019-11-01 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки
MX354775B (es) 2012-03-07 2018-03-20 Janssen Biotech Inc Medios definidos para la expansion y el mantenimiento de celulas madre pluripotentes.
CN104334719B (zh) 2012-06-08 2018-02-13 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
KR102084561B1 (ko) 2012-12-31 2020-03-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양
DK2938722T3 (da) 2012-12-31 2022-02-14 Janssen Biotech Inc Suspension og klyngedannelse af humane pluripotente celler til differentiering til endokrine pankreasceller
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
US10370644B2 (en) * 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
AU2014278178B2 (en) 2013-06-11 2021-01-21 President And Fellows Of Harvard College SC-beta cells and compositions and methods for generating the same
SG11201602012RA (en) 2013-09-25 2016-04-28 Pronutria Inc Compositions and formulations for maintaining and increasing muscle mass, strength, and performance and methods of production and use thereof
RU2689710C2 (ru) * 2013-11-01 2019-05-29 Янссен Байотек, Инк. Суспендирование и кластеризация плюрипотентных стволовых клеток человека с целью их дифференцировки в панкреатические эндокринные клетки
SG11201609473XA (en) * 2014-05-16 2016-12-29 Janssen Biotech Inc Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells
US10457916B2 (en) 2014-05-20 2019-10-29 Tokyo Institute Of Technology Method for inducing differentiation of insulin-producing cells
CN106536718B (zh) * 2014-05-21 2021-04-27 国立大学法人京都大学 胰芽细胞的制造方法及含有胰芽细胞的胰疾病治疗剂
CN107075471A (zh) * 2014-10-08 2017-08-18 新加坡科技研究局 将干细胞分化为肝细胞谱系的方法
CN107614678B (zh) 2014-12-18 2021-04-30 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
ES2985135T3 (es) 2014-12-18 2024-11-04 Harvard College Procedimientos para generar células ß derivadas de células madre y usos de las mismas
US10443042B2 (en) 2014-12-18 2019-10-15 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived beta cells and uses thereof
WO2016100921A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF
CN107250349A (zh) * 2014-12-19 2017-10-13 詹森生物科技公司 多能干细胞的悬浮培养
WO2017180361A1 (en) * 2016-04-14 2017-10-19 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to intestinal midgut endoderm cells
CA3027879A1 (en) * 2016-06-21 2017-12-28 Janssen Biotech, Inc. Generation of human pluripotent stem cell derived functional beta cells showing a glucose-dependent mitochondrial respiration and two-phase insulin secretion response
WO2019099725A1 (en) * 2017-11-15 2019-05-23 Semma Therapeutics, Inc. Islet cell manufacturing compositions and methods of use
WO2019169351A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Semma Therapeutics, Inc. Methods of enhancing stem cell differentiation into beta cells
US20210214690A1 (en) * 2018-05-07 2021-07-15 President And Fellows Of Harvard College Stem cell-derived alpha cells and methods of generating same
WO2019217875A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Cornell University Method of differentiation of human pluripotent stem cells to monohormonal cells
EP3833365A4 (en) 2018-08-10 2022-05-11 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Stem cell derived islet differentiation
US12378572B2 (en) 2018-09-07 2025-08-05 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
TWI862513B (zh) * 2018-09-19 2024-11-21 日商千紙鶴治療公司 包含胰島素產生細胞之細胞集團、包含該細胞集團之醫藥、其用途及製造方法
CN109749986B (zh) * 2019-03-13 2021-04-02 武汉大学 一种由人多能干细胞分化获得胰腺前体细胞及胰岛β细胞的方法
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146312A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146311A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146305A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146309A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
EP3953451A1 (en) 2019-04-08 2022-02-16 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from stem cell derived definitive endoderm
EP3975926A1 (en) 2019-05-31 2022-04-06 W.L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
AU2020282355B2 (en) 2019-05-31 2023-11-02 Viacyte, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3257300A1 (en) 2019-05-31 2025-06-12 W. L. Gore & Associates, Inc. Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
US12310830B2 (en) 2019-05-31 2025-05-27 W. L. Gore & Associates, Inc. Biocompatible membrane composite
US11104918B2 (en) 2019-09-05 2021-08-31 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
US11116798B2 (en) 2019-09-05 2021-09-14 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
TW202130805A (zh) 2019-10-21 2021-08-16 日商武田藥品工業股份有限公司 增生抑制劑
JP7721105B2 (ja) * 2020-01-17 2025-08-12 国立大学法人京都大学 膵内胚葉細胞の増殖を促進する方法及びキット
JP7705448B2 (ja) 2020-07-31 2025-07-09 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 膵内分泌細胞の分化
CN112251396B (zh) * 2020-10-09 2022-08-16 北京呈诺医学科技有限公司 培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法
US11566230B2 (en) 2020-12-31 2023-01-31 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
CN113234664B (zh) * 2021-05-11 2024-05-10 澳门大学 一种胰腺祖细胞的制备方法及其应用
JP2024542041A (ja) 2021-11-01 2024-11-13 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 幹細胞由来の膵臓島分化
CN119384700A (zh) 2022-04-15 2025-01-28 艾斯本神经科学公司 细胞分化状态的分类方法和分化细胞的相关组合物
CN114836369B (zh) * 2022-05-20 2023-01-17 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 一种诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法及其在治疗i型糖尿病中的应用
WO2024151541A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Sana Biotechnology, Inc. Type-1 diabetes autoimmune mouse
WO2024243236A2 (en) 2023-05-22 2024-11-28 Sana Biotechnology, Inc. Methods of delivery of islet cells and related methods
IL328729A (en) 2023-12-01 2026-07-01 Sigilon Therapeutics Inc Methods for producing stem cell-derived islet-like cells, as well as populations and compositions comprising them

Family Cites Families (281)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5759830A (en) 1986-11-20 1998-06-02 Massachusetts Institute Of Technology Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
SU1767433A1 (ru) 1989-11-27 1992-10-07 Пермский государственный медицинский институт Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
AU668349B2 (en) 1991-04-25 1996-05-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
CA2159804A1 (en) 1993-04-08 1994-10-27 Human Cell Cultures, Inc. Cell culturing method and medium
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (sr) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
US6086874A (en) 1994-12-29 2000-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor agent effect enhancer containing IL-6 antagonist
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
US5681561A (en) 1995-06-07 1997-10-28 Life Medical Sciences, Inc. Compositions and methods for improving autologous fat grafting
JP2001508302A (ja) 1997-01-10 2001-06-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 胚性幹細胞血清置換
HUP0002842A3 (en) 1997-04-24 2002-01-28 Ortho Mcneil Pharm Inc Substituted imidazoles, process for producing them, pharmaceutical compositions containing them, their use and their intermediates
CA2294944A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ES2243007T3 (es) 1997-09-16 2005-11-16 Egea Biosciences Llc Sintesis quimica completa y sintesis de genes de genomas.
WO1999020740A2 (en) 1997-10-23 1999-04-29 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells
US6372779B1 (en) 1997-12-29 2002-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Anti-inflammatory compounds
WO1999047163A2 (en) 1998-03-18 1999-09-23 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
US6458593B1 (en) 1999-01-21 2002-10-01 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
ATE378398T1 (de) 1999-02-11 2007-11-15 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Pluripotente embryonale keimzellinie aus vögeln
US20020018787A1 (en) 1999-05-21 2002-02-14 Roger V. Kendall Methods and compositions for modulating immune response and for the treatment of inflammatory disease
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
EP1224259A4 (en) 1999-09-27 2005-04-27 Univ Florida INVERSION OF INSULIN DEPENDENT DIABETES BY ISOLATED STEM CELLS, PROGENITOR ISLANDIC CELLS, AND INSULAR TYPE STRUCTURES
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
JP2003517592A (ja) 1999-12-13 2003-05-27 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 膵島αおよびβ前駆体の同定ならびに単離のためのマーカー
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
CN1449439A (zh) 2000-06-26 2003-10-15 株式会社雷诺再生医学研究所 细胞级分包括能分化为神经细胞的细胞
AU2002246855B2 (en) 2000-10-23 2005-12-22 Smithkline Beecham Corporation Novel compounds
RU2275373C2 (ru) 2000-12-08 2006-04-27 Орто-Макнейл Фармасьютикал, Инк. Макрогетероциклические соединения
BR0116468A (pt) 2000-12-08 2004-06-29 Ortho Mcneil Pharm Inc Compostos de pirrolina substituìda por indazolila como inibidores de cinase
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
CA2435826A1 (en) 2001-01-24 2002-08-01 The Government Of The United States Of America Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
CA2435146C (en) 2001-01-25 2011-03-29 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
EP1379626A2 (en) 2001-04-19 2004-01-14 DeveloGen Aktiengesellschaft für entwicklungsbiologische Forschung A method for differentiating stem cells into insulin-producing cells
CN100516204C (zh) 2001-04-24 2009-07-22 味之素株式会社 干细胞及其分离方法
WO2002092756A2 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
US7432104B2 (en) 2001-08-06 2008-10-07 Bresgen Inc. Methods for the culture of human embryonic stem cells on human feeder cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
US20050053588A1 (en) 2001-10-18 2005-03-10 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
US8021876B2 (en) 2001-11-15 2011-09-20 Children's Medical Center Corporation Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof
CA2469370C (en) 2001-12-07 2014-07-08 Macropore Biosurgery, Inc. Adipose-derived cell processing unit
GB2399823B (en) * 2001-12-07 2006-02-15 Geron Corp Islet cells from primate pluripotent stem cells
AU2002218893A1 (en) 2001-12-21 2003-07-09 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
CN1671835A (zh) 2001-12-28 2005-09-21 塞拉提斯股份公司 一种建立多能人胚泡衍生的干细胞的方法
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
US20030180268A1 (en) 2002-02-05 2003-09-25 Anthony Atala Tissue engineered construct for supplementing or replacing a damaged organ
US20050208029A1 (en) 2002-04-17 2005-09-22 Akihiro Umezawa Method of forming pancreatic beta cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
CA2485527A1 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Janssen Pharmaceutica N.V. Substituted pyrroline kinase inhibitors
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
WO2003102171A1 (en) 2002-05-28 2003-12-11 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
JP2005531609A (ja) 2002-06-05 2005-10-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ キナーゼ阻害剤としてのシスインドリル−マレイミド誘導体
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
EP1539930A4 (en) 2002-07-29 2006-08-09 Es Cell Int Pte Ltd METHOD IN MULTIPLE STAGES OF DIFFERENTIATION OF POSITIVE INSULIN-SENSITIVE CELLS, GLUCOSE
US20040063204A1 (en) 2002-08-14 2004-04-01 Lijun Yang Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc CD56-POSITIVE HUMAN ADULTS PANCREATIC ENDOCRINE PRECURSOR CELLS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
US20060252150A1 (en) 2002-11-08 2006-11-09 Linzhao Cheng Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
AU2003302702B2 (en) 2002-12-05 2008-08-07 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
PT1572984E (pt) 2002-12-16 2016-06-03 Technion Res & Dev Foundation Sistema de cultura para células estaminais embrionárias humanas sem células alimentadoras e sem xeno
US20050118148A1 (en) 2002-12-20 2005-06-02 Roland Stein Compositions and methods related to mammalian Maf-A
WO2004067001A1 (ja) 2003-01-29 2004-08-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited 被覆製剤の製造法
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
US20070155661A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Standord Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
WO2004087885A2 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
US20060194315A1 (en) 2003-03-31 2006-08-31 Condie Brian G Compositions and methods for the control, differentiaton and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
ES2569780T3 (es) 2003-06-27 2016-05-12 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido placentario y métodos de preparación y uso de las mismas
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
US7569385B2 (en) 2003-08-14 2009-08-04 The Regents Of The University Of California Multipotent amniotic fetal stem cells
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
EP1670900A4 (en) 2003-08-27 2008-06-11 Stemcells California Inc ENHANCED PANCREATIC STEM CELL AND PRECURSOR CELL POPULATIONS AND METHOD OF IDENTIFYING, INSULATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
GB0329498D0 (en) 2003-12-19 2004-01-28 Novartis Ag Organic compounds
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
US7541185B2 (en) 2003-12-23 2009-06-02 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
CN109628371B (zh) 2003-12-23 2021-02-19 维亚希特公司 定形内胚层
EP2722387B1 (en) * 2003-12-23 2019-12-11 Viacyte, Inc. Definitive endoderm
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
WO2005071066A1 (en) 2004-01-23 2005-08-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for preparing pancreatic insulin secreting cells
WO2005080551A2 (en) 2004-02-12 2005-09-01 University Of Newcastle Upon Tyne Stem cells
WO2005080598A1 (ja) 2004-02-19 2005-09-01 Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
JP2008500809A (ja) 2004-03-09 2008-01-17 ライフスキャン・インコーポレイテッド インスリン産生細胞を発生させるための方法
US20090155218A1 (en) 2004-03-10 2009-06-18 Alberto Hayek Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
SG150567A1 (en) 2004-03-23 2009-03-30 Akaike Toshihiro Pluripotent stem cell growing method
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
KR20070029681A (ko) 2004-04-01 2007-03-14 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 줄기 세포의 내배엽 및 이자 혈통으로의 분화
CN103103158B (zh) 2004-04-27 2016-08-03 韦尔赛特公司 细胞培养基
CA2966883A1 (en) 2004-07-09 2006-02-16 Cythera, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
US8187878B2 (en) 2004-08-13 2012-05-29 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods for increasing definitive endoderm differentiation of pluripotent human embryonic stem cells with PI-3 kinase inhibitors
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
BRPI0514641A (pt) 2004-09-08 2008-06-17 Wisconsin Alumni Res Found cultivação das células tronco embriÈnica humana
BRPI0514778B1 (pt) 2004-09-08 2018-07-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Meio para cultivar células tronco embrionárias
EP1853698A1 (en) 2005-01-28 2007-11-14 NovaThera Ltd. Methods for embryonic stem cell culture
AU2006210955A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
US20060182724A1 (en) 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
PL1860950T3 (pl) 2005-03-04 2017-09-29 Lifescan, Inc. Dojrzałe komórki podścieliska pochodzenia trzustkowego
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
DK1864132T3 (da) 2005-03-31 2012-07-16 Stemnion Inc Fra amnion stammende cellesammensætninger, fremgangsmåder til fremstilling deraf og anvendelser deraf
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
EP1876893B1 (en) 2005-04-15 2012-04-11 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
JP4913730B2 (ja) * 2005-04-26 2012-04-11 一人 里村 膵臓β細胞再生方法および装置
US20080227656A1 (en) 2005-04-26 2008-09-18 Flemming Besenbacher Biosurface Structure Array
JP5092124B2 (ja) 2005-05-24 2012-12-05 国立大学法人 熊本大学 Ｅｓ細胞の分化誘導方法
AU2006202209B2 (en) 2005-05-27 2011-04-14 Lifescan, Inc. Amniotic fluid derived cells
AU2006257859B2 (en) 2005-06-10 2009-12-10 Irm Llc Compounds that maintain pluripotency of embryonic stem cells
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
EP1931764A1 (en) 2005-06-21 2008-06-18 GE Healthcare Bio-Sciences AB Method for cell culture
US9074181B2 (en) 2005-06-22 2015-07-07 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
UA92608C2 (en) 2005-06-30 2010-11-25 Янссен Фармацевтика Н.В. Cyclic anilino - pyridinotriazines as gsk-3 inhibitors
WO2007016485A2 (en) 2005-07-29 2007-02-08 Athersys, Inc. Use of a gsk-3 inhibitor to maintain potency of cultured cells
WO2007012144A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
WO2007026353A2 (en) 2005-08-29 2007-03-08 Technion Research & Development Foundation Ltd. Media for culturing stem cells
WO2007027157A1 (en) 2005-09-02 2007-03-08 Agency For Science, Technology And Research Method of deriving progenitor cell line
WO2007030870A1 (en) 2005-09-12 2007-03-22 Es Cell International Pte Ltd Cardiomyocyte production
US20100322906A1 (en) 2005-10-05 2010-12-23 Osaka University Method for Obtaining Pancreatic Endocrine Cells From Adipose Tissue-Origin Cells
CA2625883A1 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
US7732202B2 (en) 2005-10-21 2010-06-08 International Stem Cell Corporation Oxygen tension for the parthenogenic activation of human oocytes for the production of human embryonic stem cells
ES2687233T3 (es) 2005-10-27 2018-10-24 Viacyte, Inc. Endodermo de intestino proximal dorsal y ventral que expresa PDX-1
EP2206724A1 (en) 2005-12-13 2010-07-14 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
EP2420565B1 (en) 2006-02-23 2017-08-30 ViaCyte, Inc. Compositions and methods useful for culturing differentiable cells
NZ571427A (en) 2006-03-02 2012-07-27 Viacyte Inc Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
ES2725601T3 (es) 2006-04-28 2019-09-25 Lifescan Inc Diferenciación de células madre embriónicas humanas
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
GB2452186B (en) 2006-05-02 2011-01-26 Wisconsin Alumni Res Found Method of differentiating stem cells into cells of the endoderm and pancreatic lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
US9598673B2 (en) 2006-05-19 2017-03-21 Creative Medical Health Treatment of disc degenerative disease
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
US20090298169A1 (en) 2006-06-02 2009-12-03 The University Of Georgia Research Foundation Pancreatic and Liver Endoderm Cells and Tissue by Differentiation of Definitive Endoderm Cells Obtained from Human Embryonic Stems
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
ES2610812T3 (es) 2006-06-26 2017-05-03 Lifescan, Inc. Cultivo de células madre pluripotentes
GB2454386B (en) 2006-07-06 2011-07-06 Es Cell Int Pte Ltd Method for embryonic stem cell culture on a positively charged support surface
WO2008013664A2 (en) 2006-07-26 2008-01-31 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
DK2733203T3 (en) 2006-08-02 2019-02-04 Technion Res & Dev Foundation PROCEDURES FOR EXPANSION OF EMBRYONAL STEM CELLS IN A SUSPENSION CULTURE
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
CN101611016B (zh) 2006-10-17 2012-01-25 斯蒂菲尔实验室公司 他拉罗唑代谢物
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
CA2666789C (en) 2006-10-18 2016-11-22 Yong Zhao Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
EP2088190A4 (en) 2006-11-09 2011-01-05 Japan Government METHOD FOR THE CULTURE AND PASSING OF AN EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELL AND METHOD FOR INDUCING THE DIFFERENTIATION OF THE EMBRYONAL STEM CELL
US8217027B2 (en) 2006-12-21 2012-07-10 Abbott Laboratories Sphingosine-1-phosphate receptor agonist and antagonist compounds
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US20090053182A1 (en) 2007-05-25 2009-02-26 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
AU2008272949B2 (en) 2007-06-29 2014-05-15 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
EP2559756B1 (en) 2007-07-01 2019-12-18 Janssen Biotech, Inc. Single pluripotent stem cell culture
WO2009012428A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
CA2694956C (en) 2007-07-31 2017-12-19 Lifescan, Inc. Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells
RU2473685C2 (ru) * 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
KR101544498B1 (ko) 2007-08-24 2015-08-17 스티칭 허트 네덜란드 칸커 인스티튜트 종양성 질환의 치료를 위한 조성물
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
CN107574142B (zh) * 2007-11-27 2021-07-06 生命扫描有限公司 人胚胎干细胞的分化
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
BRPI0908033A2 (pt) 2008-02-21 2015-08-04 Centocor Ortho Biotech Inc Método placas de superfície modificada e composições para adesão, cultura e desprendimento de célula
JPWO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2011-07-14 独立行政法人科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
WO2009116951A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 Agency For Science, Technology And Research Microcarriers for stem cell culture
RU2359030C1 (ru) 2008-03-19 2009-06-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Лаборатория Клеточных Технологий" Способ получения эндотелиальных клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (варианты)
US8338170B2 (en) * 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
DK2283117T3 (da) 2008-04-21 2014-01-20 Viacyte Inc Fremgangsmåde til oprensning af pancreatiske endodermceller afledt fra humane embryoniske stamceller
US8728812B2 (en) 2008-04-22 2014-05-20 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of PDX1+ pancreatic cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US20090291494A1 (en) * 2008-05-21 2009-11-26 Bioe, Inc. Differentiation of Multi-Lineage Progenitor Cells to Pancreatic Cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DK2993226T3 (da) 2008-06-03 2021-02-22 Viacyte Inc Vækstfaktorer til fremstilling af en definitiv endoderm
CA2729121C (en) 2008-06-30 2019-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
US9683215B2 (en) 2008-08-22 2017-06-20 President And Fellows Of Harvard College Methods of reprogramming cells
EP2334804B1 (en) * 2008-10-07 2013-12-04 True North Therapeutics, Inc. Co-culture compositions and methods
JP2012507289A (ja) * 2008-10-31 2012-03-29 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
EP2346988B1 (en) 2008-10-31 2017-05-31 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
CN108342353B (zh) 2008-11-04 2022-01-11 韦尔赛特公司 干细胞聚集体悬浮组合物及其分化方法
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP2356227B1 (en) 2008-11-14 2018-03-28 Viacyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
MX2011005288A (es) 2008-11-20 2011-06-01 Centocor Ortho Biotech Inc Celulas madre pluripotentes en microportadores.
WO2010063848A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
EP2456858B1 (en) 2009-07-20 2018-08-29 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2540016C2 (ru) 2009-07-20 2015-01-27 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
EP2456862A4 (en) 2009-07-20 2013-02-27 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS
EP2464723B1 (en) 2009-08-12 2016-06-22 Kyoto University Method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural precursor cells
PH12012500818A1 (en) 2009-10-29 2019-11-29 Janssen Biotech Inc Pluripotent stem cells
WO2011058558A2 (en) 2009-11-12 2011-05-19 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture media, cell cultures and methods of culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
RU2664864C1 (ru) 2009-12-23 2018-08-23 Янссен Байотек, Инк. Способы увеличения экспрессии ngn3 и nkx6.1 в эндокринных клетках поджелудочной железы
DK2516625T3 (da) 2009-12-23 2024-09-09 Janssen Biotech Inc Differentiering af humane embryonale stamceller
EP2505639B1 (en) 2009-12-29 2018-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for manufacturing pancreatic-hormone-producing cells
TR201000243A2 (tr) 2010-01-13 2010-06-21 Akdeni̇z Ahmet Mile açılan kama kanalını ölçmeye ve kontrol etmeye yarayan ölçüm cihazı
US20130023045A1 (en) 2010-02-03 2013-01-24 National Cancer Center Induced hepatic stem cell and process for production thereof, and applications of the cell
AU2011223900A1 (en) * 2010-03-01 2012-09-13 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
WO2011108993A1 (en) 2010-03-02 2011-09-09 National University Of Singapore Culture additives to boost stem cell proliferation and differentiation response
CA2800498C (en) 2010-03-31 2021-11-16 The Scripps Research Institute Reprogramming cells
JP2013524836A (ja) 2010-04-25 2013-06-20 マウント・シナイ・スクール・オブ・メディスン 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成
AU2011250912A1 (en) * 2010-05-12 2012-11-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2011158960A1 (en) 2010-06-15 2011-12-22 Kyoto University Method for selecting human induced pluripotent stem cells
WO2011160066A1 (en) 2010-06-17 2011-12-22 Regents Of The University Of Minnesota Production of insulin producing cells
CN108531444A (zh) 2010-08-05 2018-09-14 威斯康星校友研究基金会 用于人多能细胞培养的简化基础培养基
AU2011290123B2 (en) 2010-08-09 2016-11-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of producing pancreatic hormone-producing cells
KR101836850B1 (ko) 2010-08-31 2018-03-09 얀센 바이오테크 인코포레이티드 인간 배아 줄기 세포의 분화
WO2012030540A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
WO2012117333A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Stempeutics Research Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
WO2013055834A2 (en) 2011-10-11 2013-04-18 The New York Stem Cell Foundation Er stress relievers in beta cell protection
US8951798B2 (en) 2011-10-13 2015-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
WO2013055397A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Children's Medical Center Corporation Inhibition and enhancement of reprogramming by chromatin modifying enzymes
RU2705001C2 (ru) 2011-12-22 2019-11-01 Янссен Байотек, Инк. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека в одногормональные инсулинположительные клетки
US9092957B2 (en) 2011-12-22 2015-07-28 Intel Corporation Always-available embedded theft reaction subsystem
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
CN104334719B (zh) 2012-06-08 2018-02-13 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化
EP2893000B1 (en) 2012-09-03 2019-04-10 Novo Nordisk A/S Generation of pancreatic endoderm from pluripotent stem cells using small molecules
KR102084561B1 (ko) 2012-12-31 2020-03-04 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포로의 분화를 위한 공기-액체 계면에서의 인간 배아 줄기세포의 배양
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
WO2014127164A1 (en) 2013-02-14 2014-08-21 Allergan, Inc. Substituted dihydropyrazoles as sphingosine receptor modulators
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
TW201522637A (zh) 2013-03-15 2015-06-16 Jackson Lab 非胚胎幹細胞之單離及其用途
AU2014278178B2 (en) 2013-06-11 2021-01-21 President And Fellows Of Harvard College SC-beta cells and compositions and methods for generating the same
EP3420073B1 (en) 2016-02-24 2023-11-08 Novo Nordisk A/S Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors

Also Published As

Publication number Publication date
US20130189777A1 (en) 2013-07-25
AU2019201293A1 (en) 2019-03-14
CA2860107A1 (en) 2013-06-27
CN105143446A (zh) 2015-12-09
US12215354B2 (en) 2025-02-04
BR112014015417A2 (pt) 2017-06-13
JP2015503331A (ja) 2015-02-02
KR102203056B1 (ko) 2021-01-14
PT2794857T (pt) 2026-03-06
AR089426A1 (es) 2014-08-20
KR20200030133A (ko) 2020-03-19
ES3069712T3 (en) 2026-06-10
US20220275340A1 (en) 2022-09-01
EP2794857A4 (en) 2015-07-08
BR112014015417A8 (pt) 2017-07-04
FI2794857T3 (fi) 2026-03-25
US9388386B2 (en) 2016-07-12
US20150353895A1 (en) 2015-12-10
JP2021052789A (ja) 2021-04-08
US20190292523A1 (en) 2019-09-26
EP2794857A1 (en) 2014-10-29
JP6441080B2 (ja) 2018-12-19
HK1203552A1 (en) 2015-10-30
SG11201403473QA (en) 2014-10-30
WO2013095953A1 (en) 2013-06-27
LT2794857T (lt) 2026-03-25
JP2025134890A (ja) 2025-09-17
SI2794857T1 (sl) 2026-06-30
SMT202600177T1 (it) 2026-05-12
AU2021221411A1 (en) 2021-09-16
AU2021221411B2 (en) 2024-03-07
US10358628B2 (en) 2019-07-23
RU2018132199A3 (sr) 2019-05-24
JP7191925B2 (ja) 2022-12-19
EP4752215A2 (en) 2026-06-03
RU2018132199A (ru) 2018-10-31
JP2023025204A (ja) 2023-02-21
JP2019047810A (ja) 2019-03-28
PL2794857T3 (pl) 2026-06-08
EP2794857B1 (en) 2026-02-11
KR20140103179A (ko) 2014-08-25
SG10201608914WA (en) 2016-12-29
US11377640B2 (en) 2022-07-05
HRP20260251T1 (hr) 2026-03-27
MX2014007744A (es) 2015-01-12
CN105143446B (zh) 2020-11-03
AU2012355698A1 (en) 2014-07-10
AU2012355698B2 (en) 2018-11-29
JP7702929B2 (ja) 2025-07-04
RU2705001C2 (ru) 2019-11-01
RU2668798C2 (ru) 2018-10-02
PH12014501429A1 (en) 2014-09-22
AU2019201293B2 (en) 2021-05-27
CA2860107C (en) 2021-06-01
JP6851358B2 (ja) 2021-03-31
US20250230414A1 (en) 2025-07-17
KR102090751B1 (ko) 2020-03-19
RU2014130042A (ru) 2016-02-20
DK2794857T3 (da) 2026-05-04