HUP0000737A2

HUP0000737A2 - Hialuronsav mikrorészecskékbe foglalt hatóanyagokat tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású készítmény

Info

Publication number: HUP0000737A2
Application number: HU0000737A
Authority: HU
Inventors: Myung Jin Kim; Sun Jin Kim; Oh Ryong Kwon
Original assignee: Lg Chemical Limited
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-03-26
Publication date: 2000-09-28
Also published as: ATE285245T1; BG102969A; US20130230598A1; BR9804802A; IL127220A; ES2232939T3; TW514532B; WO1998043664A1; CA2256596C; CN1132625C; MY132812A; US20080063727A1; DE69828252T2; CA2256596A1; NZ333019A; AU6524198A; EP0918535A1; ZA982533B; ID20584A; PT918535E

Abstract

Nyújtőtt hatóanyag-leadású készítmény, amely a hialűrőnsavnak vagyszervetlen sójának mikrőrészecskéit és a mikrőrészecskékbe főglaltfehérje vagy peptid hatóanyagőt tartalmaz, ahől a mikrőrészecskékátlagős mérete 0,1 és 40 mm közötti. ŕ

Description

2717M

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

Hialuronsav mikrorészecskékbe foglalt hatóanyagokat tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású készítmény

A jelen találmány nyújtott hatóanyagleadású készítményre vonatkozik, amely hialuronsavnak vagy sóinak szilárd mikrorészecskéibe foglalt fehérje vagy peptid hatóanyagot tartalmaz.

A fehérje vagy peptid hatóanyagokat általában injekció formájában adják be, mivel ezek az anyagok orális adagolást követően nehezen szívódnak fel. Injektálás után in vivo hatásuk csak rövid ideig tart, ezért sok alkalommal kell az ilyen anyagokat injekció formájában beadni, ha hosszú ideig tartó kezelésre van szükség. Például olyan gyerekek kezelésére, akik agyalapi növekedési hormon hiányban szenvednek, rekombináns humán növekedési hormont hat hónapnál hosszabb ideig kell naponta, injekció formájában beadni. Ennek megfelelően egy olyan nyújtott hatású készítmény, amely esetében nincs szükség a fáradságos napi adagolásra, ilyen alkalmazás céljára nagyon kívánatos lenne.

Fehérje vagy peptid hatóanyag, például humán növekedési hormon esetében jellemző nyújtott hatású készítményt úgy állítanak elő, hogy a hatóanyagot biológiailag lebontható polimer mátrix anyag mikrorészecskéibe foglalják, és a készítmény a mátrix anyag in vivo lebomlásával párhuzamosan, lassan adja le a hatóanyagot. Ezen a vonalon kiterjedt vizsgálatokat folytattak a nyújtott hatóanyagleadású készítményekben alkalmazható biológiailag lebontható polimerek kifejlesztésére, és erre a célra a biológiailag lebontható észtereket, így a polilaktidot, a poliglkolidot, polilaktid-ko-glikolidot), a poli(ortoészter)t és a polianhidridet találták megfelelőnek [M. Chasin and R. Langer et al., Biodegradable Polymers as Drug Delivery System, Mercel, Dekker (1990) és J.Heller, Adv. Drug. Del. Rev., W, 163 (1993)].

Más kutatásokat is folytattak nyújtott hatóanyagleadású készítmény kifejlesztésére, ezekhez a készítményekhez természetes polimer anyagokat, így zselatint, kollagént, kitozánt, karboxi-metil-cellulózt, alginázt és hialuronsavat használtak. Egy természetes polimer vizes környezetbe kerülve általában gélt képez, és a nagyon viszkózus gél mátrix ezen típusát, amelyen keresztül a hatóanyag nagyon lassan diffundál, nyújtott hatóanyagleadású készítmények előállítására használták.

Például az 5 416 017 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan nyújtott hatóanyagleadású eritropoietin injekciós készítményt ismertetnek, amelyhez 0,01-3% hialuronsavat tartalmazó gélt alkalmaznak, az 1287041 (1989) számú japán szabadalmi közzétételi iratban inzulint tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású készítményt írnak le, amelynek előállításához 1% hialuronsawal készült gélt használnak; és a 2-00213 (1990) számú japán szabadalmi közzétételi iratban kalcitonint, elkanonint vagy humán növekedési hormont magábafoglaló nyújtott hatóanyagleadású készítményekről számolnak be, amelyeket 5% hialuronsavat tartalmazó gél felhasználásával állítottak elő. Meyer és munkatársai granulocita telep stimuláló faktort tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású készítményt fejlesztettek ki, ehhez 0,5-4% hialuronsavat tartalmazó gélt használtak [James Meyer et al., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)].

Az ilyen készítmények injekció formájában történő adagolásához nagyfuratú fecskendőtűt kell használni, mivel a néhány % hialuronsavat tartalmazó gél viszkozitása nagy, 107 centipoise körüli érték. Emellett, a testfolyadékkal kapcsolatba kerülve az injektált gél hígul, hatóanyagvisszatartó képessége gyorsan csökken, és ennek eredményeként a hatóanyag nyújtott felszabadulása 1 napnál nem tart tovább. Például az 1-287041 (1989) számú japán szabadalmi közzétételi iratban arról számolnak be, hogy amikor nyulaknak 1% hialuronsavat tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású inzulin injekciós készítményt adtak, a vércukorszintet visszaszorító terápiás hatás 24 óránál nem tartott tovább. Azt is leírják, hogy a vérben a hatóanyag koncentrációja 24 óránál rövidebb idő alatt a kezdeti érték kisebb mint 1/10-ére csökkent, amikor a kísérleti állatoknak 2% hialuronsavat tartalmazó granulocita telep stimuláló faktor készítményt [James Meyer et al., J. Controlled Release, 35, 67 (1995)] vagy 1,5% hialuronsavat magábafoglaló interferon-α és plazmafehérje készítményt (5 416 017 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) adtak be injekció formájában. Ennek megfelelően a hialuronsav-gélekre alapozott nyújtott hatóanyagleadású készítmények nagy hátránya, hogy a hatóanyagleadást 24 óránál hosszabb ideig nem lehet fenntartani.

A természetes hialuronsav vagy annak szervetlen sója csak vízben oldódik. A hialuronsav-benzil-észter, a HYAFF™ viszont vízben nem, hanem szerves oldószerben, például dimetil-szulfoxidban oldódik. Ilyen hidrofób hialuronsav-származékok szilárd mikrorészecskéiből és azokba foglalt hatóanyagokból álló gyógyszerkészítményekeket a hagyományos emulzióoldószer extrakciós módszerrel állítottak elő [N.S. Nightlinger et ak. Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater., 22nd. Paper No. 3205 (1995); L. Hum et al., J. Controlled Rel., 29, 133 (1994)]. Az ilyen készítmények előállítása jellemzően a következő lépésekből áll: a fehérje hatóanyagot hialuronsav-benzilészter dimetil-szulfoxidos oldatában diszpergálják, és az így kapott diszperziót ásványolajhoz adják, amikoris emulzió képződik. Az emulzióból egy szerves oldószerrel, például etil-acetáttal a dimetil-szulfoxidot kiextrahálják, és így hatóanyagból és hialuronsav-benzil-észterből álló mikrorészecskéket nyernek.

Ezzel az eljárással azonban az a probléma, hogy a fehérje hatóanyag a szerves oldószerrel vagy a hidrofób hialuronsav-benzil-észterrel érintkezve denaturálódhat. Valóban, egy teljesen észterezett hialuronsav-származékkal készült granulocita makrofág-telep stimuláló faktor (GN-CSF) mikrorészecske készítményről azt írják, hogy a GM-CSF hatóanyagból az első néhány nap alatt csak kb. 25% szabadult fel, és 17 nap után pedig semennyi sem [N.S.Nightlinger et al., Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22nd, Paper No. 3205 (1995)]. Ebben az esetben a fehérje hatóanyag nagyobb része elveszett, aminek legvalószínűbb oka az, hogy a hialuronsav-benzil-észterrel és/vagy a szerves oldószerrel való érintkezés következtében a fehérje denaturálódott.

Az előzőekből következően a jelen találmány tárgya fehérje vagy peptid hatóanyagot tartalmazó javított nyújtott hatóanyagleadású készítmény rendelkezésre bocsátása.

A jelen találmány egyik vonatkozásának megfelelően olyan nyújtott hatóanyagleadású készítményt állítunk elő, amely hialuronsavnak vagy szervetlen sójának mikrorészecskéit és ezekbe a mikrorészecskékbe foglalva fehérje vagy peptid hatóanyagot tartalmaz, ahol a mikrorészecskék átlagos mérete 0,1 és 40 pm között van.

A jelen találmány fenti és más tárgyai és jellemzői a találmány most következő leírásából a mellékelt rajzok figyelembevételével nyilvánvalóvá válnak.

Az 1. ábra a humán növekedési hormon (hGH) in vitro felszabadult mennyiségének időbeli változását mutatja;

a 2A) és 2B) ábra a jelen találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású hGH készítmény stabilitását szemlélteti fordított fázisú HPLC eljárás segítségével (A: a jelen találmány szerinti készítményből felszabadult hGH; és B: a vizes hGH kontroll);

a 3A) és 3B) ábra a jelen találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású hGH készítmény stabilitását szemlélteti méretkizárásos kromatográfiás eljárással (A: a jelen találmány szerinti készítményből felszabadult hGH; B: a vizes hGH kontroll);

a 4. ábra a találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású humán növekedési hormon készítménnyel és hagyományos készítményekkel kezelt törpe patkányok testtömegnövekedésének időbeli változását hasonlítja össze;

az 5. ábra a találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású humán növekedési hormon készítménnyel és hagyományos készítményekkel kezelt törpe patkányok testtömegnövekedésének időbeli változását állítja szembe;

a 6. ábra a humán növekedés hormon (hGH) koncentrációjának időbeli változását mutatja a vérben; és a 7. ábra a találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású humán növekedési hormon készítménnyel és hagyományos készítményekkel kezelt törpe patkányok testtömegnövekedésének időbeli változását írja le.

A jelen találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású készítmény hialuronsavnak vagy egy sójának szilárd mikrorészecskéiből és a részecskékbe foglalt fehérje vagy pepiid hatóanyagból áll. Ez a találmány szerinti készítmény jobb a hagyományos, hialuronsav gélen alapuló készítményeknél a leadási jellemzők és a kezelés könnyűsége tekintetében: azaz, a találmány szerinti mikrorészecskékből álló készítmény felhasználásával készült injekciót könnyebb beadni a kis viszkozitása miatt, és a készítmény in vivo hosszabb időn át állandó sebességgel adja le a hatóanyagot.

A találmány szerinti készítmény azért is előnyös, mert nem következik be a hatóanyag denaturálódása azelőtt, mielőtt 100%-a fel nem szabadul a készítményből.

A jelen találmány szerinti mikrorészecskékből álló készítmény, amelyben a részecskék átlagos mérete 0,1 és 40 pm közötti, előnyösen 0,1 és 10 pm közötti, a fehérje vagy a pepiid hatóanyagot és a hialuronsavat vagy sóját tartalmazó vizes oldat permetezve vagy fagyasztva szárításával állítható elő. Kívánt esetben stabilizátort adhatunk az oldathoz.

A jelen találmány szerinti szilárd mikrorészecskékből álló készítménybe foglalható hatóanyagok például a következők: humán növekedési hormon, marha szomatotropin, sertés szomatotropin, növekedési hormont felszabadító hormon, növekedési hormont felszabadító peptid, granulocita-telepet stimuláló faktor, granulocita makrofág-telepet stimuláló faktor, makrofág-telepet stimuláló faktor, eritropoietin, csont morfogenetikus fehérje, interferon, inzulin, atriopeptinIII, monoklonális antitest, TNF, makrofág aktiváló faktor, interleukin, tumor denaturáló faktor, inzulinszerű növekedési faktor, epidermális növekedési faktor, szövet plazminogén aktívátor és urokináz.

A hialuronsav jelen találmány szerinti szilárd mikroszemcsés készítmény előállítására használható szervetlen sóira példaként a nátrium-, kálium-, lítium, kalcium-, ammonium-, magnézium-, cink-, réz- és kobaltsókat említjük.

A jelen találmányban stabilizátorként többek között poliszacharid, fehérje, aminosav, lipid, zsírsav, polietilénglikol, szervetlen só és felületaktív anyag használható.

A jelen találmány szerinti mikroszemcsés nyújtott hatóanyagleadású készítmény fehérje vagy peptid hatóanyagot 1 és 90 tömeg% közötti mennyiségben, és adott esetben egy stabilizátort 1 és 90 tömeg% közötti mennyiségben tartalmazhat a készítmény tömegére vonatkoztatva.

A jelen találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású injekciós készítményt úgy állítjuk elő, hogy a találmány szerinti mikroszemcsés nyújtott hatóanyagleadású készítményt a készítmény tömegére vonatkoztatva 0,01 és 10 tömeg% közötti mennyiségben egy injekciós közegben diszpergáljuk. Kívánt esetben diszpergálószert vagy tartósítószert adunk a készítményhez. A jelen találmány szerinti injekciós készítményben jellemzően puffereit vizes oldatot, etanolt, propilénglikolt, polietilénglikolt, növényi olajat, ásványolajat, szkvalént, tőkehalmájolajat, mono-, di- és trigliceridet vagy ezek elegyét használjuk injekciós közegként.

A növényi olajokra példaként a kukoricaolajat, az olívaolajat, a szójaolajat, a napraforgóolajat, a gyapotmagolajat, a földimogyoróolajat, a szézámolajat és ezek keverékét említjük.

A találmány szerinti mikrorészecskés nyújtott hatóanyagleadású készítményből aeroszolt is előállíthatunk. Az így kapott, jelen találmány szerinti aeroszol készítményt az orr vagy a légcső nyálkahártyáján alkalmazhatjuk, ahol a mikrorészecskés készítmény a hatóanyagot szabályzott módon adja le.

A következő példák és hatásvizsgálati példák a jelen találmány további szemléltetésére szolgálnak, anélkül, hogy annak körét korlátoznák.

1. példa

Mikrorészecskék előállítása mg/ml humán növekedési hormont (hGH) tartalmazó 5 mmólos, foszfáttal puffereit sóoldathoz (PBS) 0,01 tömeg% koncentrációig Tween 80-t, majd 2 mg/ ml koncentrációig 1 000 000 móltömegű nátrium-hialuronátot adunk. A képződött oldatot permetezve-szárítóba adagoljuk (Büchi 190) 3 ml/perc sebességgel a mikrorészecskék előállítására. A permetezve-szárítóba bevezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. példa

Mikrorészecskék előállítása mg/ml humán növekedési hormont (hGH) tartalmazó 5 mmólos, foszfáttal puffereit sóoldathoz (PBS) 0,01 tömeg% koncentrációig Tween 80-t, majd 1 mg/ml koncentrációig 2 000 000 móltömegű nátrium-hialuronátot adunk. A képződött oldatot permetezve-szárítóba adagoljuk (Büchi 190) 2 ml/perc sebességgel a mikrorészecskék előállítására. A permetezve-szárítóba bevezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 2,0 pm.

3. példa

Mikrorészecskék előállítása

0,1 mg/ml humán növekedési hormont (hGH) tartalmazó 5 mmólos, foszfáttal puffereit sóoldathoz (PBS) 0,01 tömeg% koncentrációig Tween 80-t, majd 0,9 mg/ml koncentrációig 2 000 000 móltömegű nátrium-hialuronátot adunk. A képződött oldatot permetezve-szárítóba adagoljuk (Büchi 190) 3 ml/perc sebességgel a mikrorészecskék előállítására. A permetezve-szárítóba bevezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 2,0 pm.

1, Hatásvizsgálati példa

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1., 2. és 3. példában előállított mikrorészecskéket 150 mM nátriumkloridot, 10 mM foszfátot és 0,05% nátrium-azidot tartalmazó, 7,4-es pH-jú puffer-oldatban szuszpendáltuk olyan mennyiségben, hogy a hGH koncentrációja 1,0 mg/ml legyen. Az így kapott diszperziót szárítószekrénybe tettük, és a hGH felszabadulását 37°C-on keverés közben vizsgáltuk. Az előre meghatározott mintavételi időben a képződött diszperziót 800 g-n 10 percig centrifugáltuk. Az így kapott felülúszóból egy részletet kivettünk, ami a diszperzió 1/10-ének felelt meg. Azonos térfogatú puffért adtunk a diszperzióhoz, és a hatóanyagleadási vizsgálatot 37°C-on tovább folytattuk. A felülúszóban a hGH koncentrációját Lowry módszerével és nagyteljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással mértük, hogy a felszabadult hGH mennyiségét az idő függvényében meghatározzuk. Az eredmények a 1. ábrán láthatók.

Az 1. ábra a hGH in vitro felszabadult mennyiségének időbeli változását mutatja. Amint látható, a hGH felszabadulási sebessége lassul, ahogy a hialuronsav molekulatömege nő és a hGH-tartalom csökken. Valójában, a 3. példában kapott mikrorészecskék hatóanyagleadásának a legkisebb a sebessége. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hatóanyag nyújtott leadásának idejét a hialuronsav molekulatömegének, a hGH-tartalomnak és hasonló körülményeknek a szabályozásával be lehet állítani, Emellett a jelen találmány szerint előállított mikrorészecskék állandó sebességet mutatnak in vitro a hGH 70%-ának felszabadulásáig, kezdeti gyors növekedés nélkül.

2. hatásvizsgálati példa

A hGH stabilitása a mikrorészecskékben

Annak bizonyítására, hogy a hGH a találmány szerinti mikrorészecskékben azonos a mikrorészecskék előállítására használt vizes hGH-val, a mikrorészecskékből az in vitro leadási vizsgálatban felszabadult hGH-t fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás és méretkizárásos kromatográfiás eljárás segítségével vizsgáltuk.

A hGH oxidáció és deamidálás következtében történő denaturálódása RP-HPLC eljárással bizonyítható, és az eredmények a 1A) és 2B) ábrán láthatók.

A 2A) és 2B) ábra a jelen találmány szerinti hGH- tartalmú nyújtott hatóanyagleadású készítmény stabilitását mutatja RP-HPLC eljárással vizsgálva, ahol a 2A) ábrán a találmány szerinti készítményből felszabaduló hGH és a 2B) ábrán a vizes hGH kontroll RP-HPLC profilja látható.

A hGH aggregációnak tulajdonítható denaturálódása méretkizárásos kromatográfiás eljárással igazolható, és az eredmények a 3A) és 3B) ábrán láthatók.

A 3A) és 3B) ábra a jelen találmány szerinti, hGH-t tartalmazó nyújtott hatóanyagleadású készítmény stabilitását mutatja méretkizárásos kromatográfiás eljárás segítségével, ahol a 3A) ábrán a jelen találmány szerinti készítményből felszabadult hGH, és a 3B) ábrán a vizes hGH kontroll méretkizárásos kromatográfiás profilja látható.

Amint azt a 2A), 2B), 3A) és 3B) ábra mutatja, a találmány szerinti készítményekből felszabadult hGH azonos a vizes hGH kontrollal, és a hGH monomer-tartalom 95%-nál nagyobb. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hGH denaturálódása nem következett be a találmány szerinti mikrorészecskék előállítása és a 37°C-on végzett hatóanyagleadási vizsgálat során.

3. hatásvizsgálati példa

Az in vivo hatóanyaqleadás vizsgálata

A jelen találmány szerinti mikrorészecskék nyújtott hatóanyagleadási tulajdonságának vizsgálatához törpe patkányokat használtunk, amelyeknek öröklött tulajdonsága az alacsonyszintű növekedési hormon kiválasztás.

Az 1. példában előállított nyújtott hatóanyagleadású mikrorészecskét propilénglikol és etanol 7:3 térfogatarányú elegyében szuszpendáltuk olyan mennyiségben, hogy a hGH koncentrációja 5 mg/ml legyen. A kapott diszperziót puffereit vizes oldattal (150 mM nátrium-klorid és 10 mM foszfát, pH 7,4) hígítottuk olyan mértékben, hogy a hGH koncentrációja 0,5 mg/ml legyen.

darab héthetes, átlagosan 103 g testtömegű törpe patkányt három hatos csoportba osztottunk. Az első csoportba sorolt patkányoknak szubkután injektálva 0,1 ml fentebb előállított mikrorészecske-diszperziót adagoltunk (ami pg hGH-nak felelt meg) napi egy alkalommal, két héten át (kísérleti csoport). A második csoport patkányainak a fenti körülmények között Eutropin®-t adtunk, amely a kereskedelemben kapható hGH-készítmény vizes injekció céljára (összehasonlító csoport). A harmadik csoport patkányai nem kaptak hGH-t (kezeletlen kontroll csoport). A patkányokat minden nap megmértük a testömegükben bekövetkezett változás vizsgálatára.

A 4. ábra összehasonlítja a tömeggyarapodásban bekövetkezett változást a kísérleti, az összehasonlító és a kontroll csoport tagjaira vonatkozóan.

Amint az a 4. ábrán látható, a kísérleti csoportben levő patkányok testtömege folyamatosan gyarapodott a két hét alatt, és ez a gyarapodás nagyobb mértékű volt, mint az összehasonlító és a kontroll csoport patkányai esetében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti mikrorészecske készítmény hatékonyabb a hagyományos készítményeknél a nyújtott hatóanyagleadó tulajdonsága következtében.

4. hatásvizsgálati példa

Az in vivo hatóanyagleadás vizsgálata

A 2. példában előállított nyújtott hatóanyagleadású mikrorészecskéket gyapotmagolajban diszpergáltuk olyan mennyiségben, hogy a hGH koncentrációja 1,5 mg/ml legyen.

darab héthetes, átlagosan 105 g testtömegű törpe patkányt négy hatos csoportba osztottunk. Az első csoportba sorolt patkányoknak szubkután injektálva 0,1 ml fentebb előállított mikrorészecske-diszperziót adagoltunk (ami 50 pg hGH-nak felelt meg) minden harmadik napon, két héten át (kísérleti csoport). A második csoport patkányainak a fenti körülmények között Eutropin®t adtunk (1. összehasonlító csoport). A harmadik csoport patkányai naponta 50 pg hGH-nak megfelelő eutropint kaptak két héten át (2. összehasonlító csoport). A negyedik csoport patkányainak nem adtunk hGH-t (kezeletlen kontroll csoport). A patkányokat minden nap megmértük a testömegükben bekövetkezett változás vizsgálatára.

• · · · · · · • · ····· · ··· ··· · ··

Az 5. ábra szembeállítja a tömeggyarapodásban bekövetkezett változás módját a kísérleti, az összehasonlító és a kontroll csoport tagjaira vonatkozóan.

Amint az az 5. ábrán látható, a kísérleti csoportben levő patkányok tömege jobban gyarapodott, mint az összehasonlító és a kontroll csoport patkányainak testtömege. Az 1. összehasonlító csoport patkányai szignifikáns testtömeggyarapodást mutattak az 1. napon, azonban a kontrollcsoportban levő patkányokénál kisebbbet az adagolást követő 2. és 3. napon. A kísérleti csoportban és a 2. összehasonlító csoportban a patkányok testtömege folyamatosan gyarapodott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti mikrorészecske készítmény hatékony nyújtott hatóanyagleadást biztosító tulajdonsága legalább három napig megmarad.

5. hatásvizsgálati példa

Az in vivo hatóanyaqleadás vizsgálata

A 2. példában előállított nyújtott hatóanyagleadású mikrorészecskéket gyapotmagolajban diszpergáltuk olyan mennyiségben, hogy a hGH koncentrációja 1,5 mg/ml legyen. Nyolc, átlagosan 2,5 kg testtömegű nyulat két négyes csoportba osztottunk. Az egyik csoportban levő nyulaknak injektálással 3700 pg hGH-nak megfelelő mennyiségű, fenti módon előállított mikrorészecske-diszperziót adtunk (kísérleti csoport). A másik csoportban levő nyulak nem kaptak hGH-t (kontroll csoport).

A beadás után a nyulaktól 6 napon át naponta vettünk vérmintát.

A vérmintákban levő hGH mennyiségét RIA (radio-immun assay) módszerrel határoztuk meg.

A 6. ábra a vérben a humán növekedési hormon koncentrációjának időbeli változását mutatja.

Amint az a 6. ábrán látható, a hGH mennyisége a beadást követően 4 napon át 0-11 ng/ml között volt, majd az 5. naptól kezdve fokozatosan csökkent. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a találmány szerinti mikrorészecske készítmény 4 napon át állandó sebességgel adta le a hatóanyagot, és ezután a leadás sebessége fokozatosan csökkent. Ez az eredmény egybevág az 1. hatásvizsgálati példa eredményével, ahol a hGH in vivo felszabadulási sebessége lineáris volt addig, amíg a hGH 70%-a felszabadult. Ezzel szemben a hGH koncentrációja a kontroll csoport vérében a RIA módszerrel kimutatható koncentráció (1 ng/ml) alatti, és így figyelmen kívül hagyható volt.

4. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása mg/ml marha szomatotropint (bST) tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult bST stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult bST mennyiségét és minőségét méretkizárásos kromatográfiás eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint a bST-nek több mint 85%-a felszabadult 72 óra alatt, és a bST nem denaturálódott.

5. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása mg/ml sertés szomatotropont (pST) tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult pST stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult pST mennyiségét és minőségét méretkizárásos kromatográfiás eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint a pST-nek több mint 90%-a felszabadult 72 óra alatt, és a pST nem denaturálódott.

6. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása

0,4 mg/ml granulocita makrofág-telepet stimuláló faktort (GM-CSF) tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 1,6 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezveszárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult GM-CSF stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult GM-CSF mennyiségét és minőségét méretkizárásos kromatográfiás eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint a GM-CFS-nek több mint 92%-a felszabadult 72 óra alatt, és a GM-CSF nem denaturálódott.

7. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanvaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása

1000 NE/ml eritropoietint (EPO) és 0,5 mg/ml szérum albumint tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2,5 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,5 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult EPO stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult EPO mennyiségét és minőségét méretkizárásos kromatográfiás eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint az EPO-nak több mint 70%-a felszabadult 72 óra alatt, és az EPO nem denaturálódott.

8. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanvaqleadás vizsgálata

1, lépés

Mikrorészecskék előállítása x 10⁵ NE/ml interferon-a-t, 0,2 mg/ml D-mannitot és 0,2 mg/ml szérum albumint tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2,5 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 105°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,5 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálat

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult interferon-α stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult interferon-α mennyiségét és minőségét fordított fázisú HPLC eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint az interferon-a-nak több mint 90%-a felszabadult 72 óra alatt, és az interferon-α nem denaturálódott.

9. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása x 10⁵ NE/ml interferon-y-t, 0,2 mg/ml D-mannitot és 0,2 mg/ml szérum albumint tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2,5 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 105°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,5 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult interferon-γ stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult interferon-γ mennyiségét és minőségét fordított fázisú HPLC eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint az interferon-y-nak több mint 90%-a felszabadult 72 óra alatt, és az interferon-γ nem denaturálódott.

10. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecskék előállítása

NE/ml inzulint tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2,5 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult inzulin stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult inzulin mennyiségét és minőségét fordított fázisú HPLC eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint az inzulinnak több mint 95%-a felszabadult 72 óra alatt, és az inzulin nem denaturálódott.

11. példa

Mikrorészecskék előállítása és az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

1, lépés

Mikrorészecskék előállítása mg/ml inzulinszerű növekedési faktort tartalmazó 5 mM PBS oldathoz Tween 80-t adunk 0,01 tömeg% koncentrációig, majd 1 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot 2 mg/ml koncentrációig. A képződött oldatot permetezve-szárító készülékbe (Büchi 190) tápláljuk 3 ml/perc sebességgel mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárítóba vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálatát az 1. lépésben előállított mikrorészecskék alkalmazásával az 1. hatásvizsgálati példában leírt módszerrel végeztük, és a felszabadult inzulinszerű növekedési faktor stabilitását a 2. hatásvizsgálati példában leírt módszer szerint határoztuk meg.

A felszabadult inzulinszerű növekedési faktor mennyiségét és minőségét fordított fázisú HPLC eljárással vizsgáltuk. A kapott eredmény szerint az inzulinszerű növekedési faktornak több mint 90%-a felszabadult 72 óra alatt, és az inzulinszerű növekedési faktor nem denaturálódott.

1. összehasonlító példa

Gél-készítmény előállítása és az in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata 1. lépés

Gél-készítmény előállítása

2,3 mg/ml hGH-t tartalmazó 5 mM PBS oldathoz 2 000 000 molekulatömegű nátrium-hialuronátot adunk 20 mg/ml koncentrációig, így hGH-t tartalmazó 2%-os hialuronátgél készítményt kapunk.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1. lépésben előállított gél-készítményt az 1. hatásvizsgálati példa szerinti eljárással vizsgáltuk. Azt az eredményt kaptuk, hogy a hGH 100%-a felszabadult 1 óra alatt. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a gél-készítmény rövidebb idő alatt adja le a hatóanyagot, mint a találmány szerinti mikrorészecskék, mivel a gél-készítmény vízzel könnyen hígítható.

2, összehasonlító példa

Gél-készítmény előállítása és az in vivo hatóanyaqleadás vizsgálata

1, lépés

Gél-készítmény előállítása

1,5 mg/ml hGH-t tartalmazó 5 mM PBS oldathoz 20 mg/ml koncentrációig 2 000 000 móltömegű nátrium-hialuronátot adunk, így hGH-t tartalmazó nemfolyékony gél-készítményt kapunk.

2. lépés

Az in vivo hatóanyagleadás vizsgálata

Huszonnégy héthetes, átlagosan 95 g testtömegű törpe patkányt négy hatos csoportba oszottunk. Az első csoportban levő patkányok szubkután injekció formájában 0,3 ml 1. lépésben előállított emulziót kaptak (ami 150 pg hGH-nak felelt meg) (1. csoport).

Az emulzió-készítmény hatékonyságának más készítményekével való összehasonlítása érdekében egy másik csoport patkányainak a 2. példa szerint előállított nyújtott hatóanyagleadású mikrorészecskék gyapotmagoiajjal készült diszperzióját adagoltuk, amelyben a hGH koncentrációja 150 pg volt (2. csoport); és egy harmadik csoport patkányainak Eutropin®-t adtunk, amely 150 pg hGHnak felelt meg (3. csoport). Az utolsó csoport patkányai nem kaptak hGH készítményt (kontroll csoport). A beadás után a patkányok testtömegváltozását 6 napon át figyeltük.

A 7. ábra a humán növekedési hormont tartalmazó, találmány szerinti nyújtott hatóanyagleadású készítménnyel kezelt törpe patkányok testtömeggyarapodásának változását mutatja a hagyományos készítményekkel kezeitekével összehasonlítva. Az eredmény szerint a hialuronát-gél készítménnyel kezelt törpe patkányok tömeggyarapodásának időbeli változása hasonló volt az Eutropin®-nal kezelt csoportéhoz. Azaz, a hialuronát-gél készítménnyel kezelt törpe patkányok testtömege 2 vagy három nappal a beadás után csökkent, és azután hasonló volt a kontroll csoportban levő patkányokéhoz. Azonban a találmány szerinti készítménnyel kezelt patkányok folyamatosan növekvő testtömeggyarapodása 6 nap alatt 150%-kal volt magasabb a többi csoportban levő állatokéhoz viszonyítva.

3. összehasonlító példa

Mikrorészecske készítmény előállítása nátrium-karboxi-metil-cellulózzal és az in vivo és in vitro hatóanvaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecske készítmény előállítása

0,2 mg/ml hGH-t tartalmazó 5 mM PBS oldathoz 0,01 tömeg% koncentrációig Tween 80-at, majd 1,8 mg/ml koncentrációig nátrium-karboximetil-cellulózt (Na-CMC, közepes viszkozitású minőség) adunk. A képződött oldatot 3 ml/perc sebességgel permetezve-szárító (Büchi 190) készülékbe tápláljuk mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárító készülékbe vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 3,0 pm.

2. lépés

Az in vitro hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1. lépésben előállított mikrorészecskéket az 1. hatásvizsgálati példa szerinti eljárással vizsgáltuk, és az eredmények az 1. táblázatban láthatók.

1. táblázat

Idő (óra) 0 1 3 5 7 24 48 72 144 A leadott hGH mennyisége (%) 0 32 40 48 52 57 63 65 65

Amint azt az 1. táblázat mutatja, az 1. lépésben előállított mikrorészecske készítmény in vitro hatóanyagleadásának időbeli változása különbözik a találmány szerinti mikrorészecskékétől. Azaz, nem kiegyensúlyozott a hatóanyagleadás, mivel a hGH több mint 30%-a felszabadult az első 1 óra alatt, egy másik 30%-a az első 48 óra alatt, és azután alig történt hGH felszabadulás. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a hatóanyag felszabaduláa kiegyensúlyozatlanná válik, amikor a fehérje hatóanyag és a mátrix kölcsönhatásba lép, és feltehetően a hatóanyag denaturálódása igen nagy mértékű, amikor olyan természetes szénhidrát polimert használunk mátrix anyagként, amelynek hidrofobicitása a hialuronsavénál erősebb.

3. lépés

Az in vivo hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1. lépésben előállított mikrorészecske készítményt gyapotmagolajban diszpergáltuk. A képződött diszperziót hét hetes törpe patkányoknak adtuk fejenként 300 pg hGH-t tartalmazó mennyiségben, és egy másik csoport szolgált kontrollként, amelynek nem adtunk hGH-t. A patkányok testtömeggyarapodását 7 napon át mértük, és az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze, a tömeggyarapodást kumulált formában adtuk meg.

2. táblázat

Idő (nap) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Kontroll csoport 0,6 0,8 3,3 5,5 7,6 6,7 7,4

Na-CMC készítménynyel kezelt csoport 5,2 3,3 6,4 8,3 10,5 9,4 9,0

Amint az a 2. táblázatban látható, az 1. lépésben előállított mikrorészecskékkel kezelt patkányok testtömeggyarapodásának változása a 2. összehasonlító példa szerinti hialuronátgél készítménnyel kezeitekéhez hasonló. Azaz, testtömeggyarapodás csak az 1. napon volt megfigyelhető, és a testtömeg a 2. napon csökkent. Továbbá, a testtömeggyarapodásuk lassabb volt, mint a kontroll csoportban levő patkányoké, végül a 7. napon azokéhoz hasonló testtömeggyarapodást mutattak. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a NaCMC készítmény egy más hatóanyagleadási tulajdonsággal és titerrel rendelkezik, mint a találmány szerinti hialuronát mikrorészecske, noha a NaCMC a hialuronsavhoz hasonlóan természetes szénhidrát polimer.

4. összehasonlító példa

Mikrorészecske készítmény előállítása hialuronsav-benzil-észterrel és az in vivo és in vitro hatóanyaqleadás vizsgálata

1. lépés

Mikrorészecske készítmény előállítása

Természetes hialuronsavat és benzil-alkoholt kémiailag reagáltatunk hialuronsav-benzil-észter előállítására, és azután hGH-t tartalmazó mikrorészecskéket készítünk az alábbiakban leírt módon.

mg/ml hGH-t tartalmazó 5 mM PBS oldathoz 0,01 tömeg% koncentrációig Tween 80-t adunk. A képződött oldatot 3 ml/perc sebességgel permetezve-szárító (Büchi 190) készülékbe tápláljuk mikrorészecskék előállítása céljából. A permetezve-szárító készülékbe vezetett levegő hőmérséklete 85°C. Az így kapott mikrorészecskék átlagos átmérője 2,5 pm.

Az így kapott részecskéket 6% hialuronsav-benzil-észtert tartalmazó dimetil-szulfoxidban diszpergáljuk, és a diszperziót felületaktív anyagot, Aracel ATM-t (ICI, U.S.A) tartalmazó ásványolajhoz adjuk, majd az elegyet homogenizálva mikroemulziót kapunk. A képződött mikroemulzió egy összefüggő ásványolaj fázisból és egy diszperziós, a hGH-t diszpergálva tartalmazó hialuronsav-benzil-észter/dimetil-szulfoxid oldatfázisból áll.

Az így előállított mikroemulzióhoz keverés közben etil-acetátot adunk, azután a dimetil-szulfoxidot etil-acetáttal extraháljuk, ekkor a hialuronsav-benzilészter megkeményedik, és hialuronsav-benzil-észter részecskék képződnek, amelyek hGH részecskéket tartalmaznak. Az így kapott végső részecskék átlagos átmérője 5,5 pm és hGH-tartalma 45%.

2. lépés

Az in vivo hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1. lépésben előállított mikrorészecskéket az 1. hatásvizsgálati példa szerinti eljárással vizsgáltuk, és az eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze.

3. táblázat

Idő (óra) 0 1 3 5 7 24 48 72 144

A leadott hGH mennyisége (%) 0 15 21 23 25 27 28 30 30

Amint az a 3. táblázatból látható, a természetes hialuronsavhoz képest hidrofobicitással rendelkező hialuronsav-benzil-észterrel előállított mikrorészecskékből alig szabadult fel hGH az első 5 óra eltelte után. Ennek oka a fehérje hatóanyag (hGH) és a hialuronsav-benzil-észter mátrix közötti nagyon erős kölcsönhatás.

3. lépés

Az in vivo hatóanyagleadás vizsgálata

Az 1. lépésben előállított mikrorészecskéket gyapotmagolajban diszpergáltuk. A képződött diszperziót héthetes törpe patkányoknak fejenként 300 pg hGH mennyiségben adtuk be, és kontrollként egy másik csoportot használtunk, amely nem kapott hGH-t. A patkányok testtömeggyarapodását 7 napon át mértük, és az eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze, a testtömeggyarapodást kumulált formában adtuk meg.

4. táblázat

Idő (nap) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

A 1,2 2,3 3,6 5,7 6,6 7,3 8,2

B 3,6 2,7 5,4 6,3 7,1 8,4 8,0

A: kontroll csoport

B: hialuronsav-benzil-észter mikrorészecske készítménnyel kezelt csoport

Amint az a 4. táblázatban látható, a hialuronsav-benzil-észter mikrorészecske készítmény alig hatékony az 1. nap után.

Noha a találmányt a fenti specifikus megvalósítási módokra tekintettel írtuk le, nyilvánvaló, hogy különböző módosítások és változtatások tehetők, amelyek szintén a találmány körébe tartoznak. A találmány körét a következő igénypontok határozzák meg.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Nyújtott hatóanyagleadású készítmény, amely hialuronsavnak vagy szervetlen sójának mikrorészecskéit és a mikrorészecskékbe foglalt fehérje vagy peptid hatóanyagot tartalmaz, ahol a mikrorészecskék átlagos mérete 0,1 és 40 pm közötti.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amely még stabilizátort is tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a mikrorészecskék átlagos mérete 1 és 10 pm közötti.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a hatóanyagot humán növekedési hormon, marha szomatotropin, sertés szomatotropin, növekedési hormont felszabadító hormon, növekedési hormont felszabadító peptid, granulocita-telep stimuláló faktor, granulocita makrofág-telep stimuláló faktor, makrofág-telep stimuláló faktor, eritropoietin, csont morfogenetikus fehérje, interferon, inzulin, atriopeptin-lll, monoklonális antitest, TNF, makrofág aktiváló faktor, interleukin, tumor denaturáló faktor, inzulinszerű növekedési faktor, epidermális növekedési faktor, szövet plazminogén aktívátor, urokináz és ezek keveréke közül választjuk.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, ahol a szervetlen sót a hialuronsav nátrium-, kálium-, lítium-, kalcium-, ammonium-, magnézium-, cink-, réz- és kobalt sói közül választjuk.
6. A 2. igénypont szerinti készítmény, amelyben a stabilizátort poliszacharid, fehérje, aminosav, lipid, zsírsav, polietilénglikol, szervetlen só, felületaktív anyag és ezek keveréke közül választjuk.
7. Injekciós készítmény, amely az 1. igénypont szerinti nyújtott hatóanyagleadású készítményt injekciós közegben diszpergálva tartalmazza.
8. A 7. igénypont szerinti injekciós készítmény, amely még diszpergálószert vagy tartósítószert is tartalmaz.
9. A 7. igénypont szerinti injekciós készítmény, amelyben az injekciós közeget puffereit vizes oldat, etanol, propilénglikol, polietilénglikol, növényi olaj, ásványolaj, szkvalén, tőkehalmájolaj, mono-, di- és triglicerid és ezek keveréke közül választjuk.
10. A 9. igénypont szerinti injekciós készítmény, ahol a növényi olajat a kukoricaolaj, olívaolaj, szójaolaj, napraforgóolaj, gyapotmagolaj, földimogyoróolaj, szézámolaj, kókuszdióolaj, ricinusolaj és ezek keveréke közül választjuk.
11. Aeroszol készítmény, amely 1. igénypont szerinti nyújtott hatóanyagleadású készítményt tartalmaz.

A meghatalmazott /I , K

GÖDÖLLE, KÉKES, MESSyfeoe & SZAB’ Szabadalmi és Védjegy Iroda

1024 Budapest, Keleti Károly u. 13/h Mészáros Enikő szabadalmi ügyvivő