IT8268274A1 - Nuovi derivati di attivatori di plasminogeno procedimento per la loro preparazione ed agente trombolitico comprendente tali derivati - Google Patents

Description

DOCUMENTAZIONE

RILEGATA

DESCRIZIONE dell'invenzione industriale dal titolo:

,? "derivati di attivatori di plasminogeno, procedimento TTR-Ar/1429 per la loro preparazione e agente trombolitico comprendente

tali derivati"

di : NIPPON CHEMIPHAR CO., LTD., nazionalit? giapponese,

2-2-3, Iwamoto-cho, Chiyoda-ku, Tokyo,Giappone

Inventori designati: Kimihiro Shimizu, Tsuguji Nakahara,

Taketoshi Kinoshita

Depositata il : 29 ottobre 1982 68274 A/82 cs Ce3t?

*? ^c*a co? RIASSUNTO <'>*3 E' descritto un derivato di un attivatore di plasminom geno non immunogenico,di origine uman?che comprende almeno un

polialchilen-glicole legato,con almeno un agente di accoppiamento,alle catene laterali di amminoacido di detto attivatore

di plasminogeno, detto polialchilen-glicole avendo un peso molecolare compreso tra 200 e 20.000 e contenendo facoltativamente uno o pi? gruppo alchilici e/o alcanoilici come sostituenti. Sono anche descritti un procedimento per la preparazione di tale derivato ed un agente trombolitico contenente

tale derivato.

b * * * * *

SFONDO DELL'INVENZIONE

Campo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce a nuovi derivati

CE PA/tf

di attivatori di plasminogeno non immunogenici?diorigine umana

ed in particolare ad un tale derivato comprendente almeno un

polialchilen-glicole legato,con almeno un agente di accoppiamento,alle catene laterali di amminoacido di un attivatore di

plasminogeno del tipo descritto precedentemente, il polialchi?

len?glicole avendo un peso molecolare situato nell'intervallo

compreso tra 200 e 20.000 e contenendo facoltativamente uno

o pi? gruppi alchilici e/o alcanoilici come sostituenti. L'invenzione concerne,inoltre,un procedimento per la preparazione

og c? di tale nuovo derivato ed un agente trombolitico contenente

-e tale nuovo derivato. ?3 Descrizione della tecnica anteriore

Si E ' noto che i tessuti umani contengono una variet? di

sostanze, che attivano il plasminogeno ad enzima fibrinolitico o plasmina. Tra tali sostanze conosciute, la pi? rappresentativa ? un attivatore del plasminogeno, cio? 1'urochinasi,

che ? formato nel tessuto del rene ed espulso nell'urina. La

urochinasi pu? essere ottenuta mediante isolamento e purificazione dall'urina umana, dalla coltura di tessuti o mediante ingegneria genetica. Come attivatori dell'enzima fibrinolitico che hanno attualmente trovato diffusa utilit? commerciale,vi sono le proteine derivate dagli streptococchi emolitici e 1'urochinasi, che ? un enzima derivato dall'urina umana. In considerazione nel suo comportamento immunogenico, la

urochinasi risultante da tale sorgente ? vantaggiosamente im

piegata per applicazioni cliniche poich? non ? immunogenica

per gli esseri umani. L'urochinasi derivata dall'urina umana

si ritiene contenga tanto urochinasi di peso molecolare eleva?

to (peso molecolare : 54.000) quanto urochinasi di peso mole?

colare basso (peso molecolare : 33.000). L'urochinasi ? stata

usata, in anni recenti, come agente trombolitico o coadiuvan?

te per sostanze carcinostatiche ed il suo consumo per applica?

zioni cliniche cresce di anno in anno.

L'urochinasi, tuttavia, in certe condizioni ? insta?

bile,poich? ? un enzima e perde la sua attivit? enzimatica,

p ad esempio, nel corso dell'estrazione, dell'isolamento e del- *

la purificazione a partire da una materia prima contenente

urochinasi, ad esempio dall'urina; durante il processo di lio?

filizzazione nella preparazione di preparati dosabili; duran?

te il trattamento termico per inattivare i virus; oppure quan?

do ? introdotta allo stato diluito in una bottiglia di goccio-

lamento e tenuta per un periodo di tempo prolungato in tale

stato diluito a temperatura ambiente per l'applicazione cli?

nica. Questa natura fisicamente instabile dell'urochinasi ha

creato un grave problema nella preparazione e formulazione del

l'urochinasi su scala industriale oppure nell'impiego pratico

della stessa per scopi clinici. Come additivo all?urochinasi,

per migliorarne la stabilit?,? stata impiegata l'albumina u-

mana. Questa non pu? tuttavia in alcun modo essere una bril?

lante soluzione per il problema discusso in quanto precede,

perch? l'albumina pura, cio? una frazione di globulina, ?

difficile da ottenere senza contaminazione immunogenica; la

albumina pura ? costosa; l'albumina e l'urochinasi formano

un complesso di peso molecolare elevato nelle condizioni di

inattivazione dei virus,in cui l'urochinasi ? sottoposta a

trattamento termico a 60?C per 10 ore insieme con l'albumina

aggiunta per stabilizzare l'urochinasi; e tale stabilizzante,

se aggiunto, pu? essere efficace in certa misura per protegc* gere l'urochinasi dalla perdita della sua attivit? enzimatica t?

cC?? alla liofilizzazione, ma non pu? evitarne la perdita di attic? vit? nell'effettivo impiego clinico. ?<?>a L'attivit? fisiologica dell'urochinasi, quando som-

ministrata per via endovenosa ai corpi viventi, ? rapida?

mente rallentata dagli inibitori di proteasi presenti nel san?

gue (inibitori di Cl^-macroglobulina <e >di plasmina e simili) e la velocit? metabolica dell'urochinasi per s? ? altissima, ci? che porta ad un semi-periodo di vita estremamen?

te abbreviato che non oltrepassa persino pi? minuti. Niente

? stato finora proposto per risolvere il problema del semi-

periodo breve dell'urochinasi nel sangue.

La richiedente ha effettuato un'ampia ricerca allo

scopo di sviluppare nuovi derivati di attivatori del plasmi-

nogeno non immunogenici,di origine umana,che ovviino ai su?

indicati inconvenienti delle tecniche anteriori. Come risul?

tato, essa ? riuscita a trovare nuovi derivati di attivatori

del plasminogeno, che sono stabili e difficilmente rallenta?

ti dagli inibitori presenti nel sangue e pertanto raggiungono

un semi-periodo di vita prolungato nel sangue, portando cosi

alla presente scoperta.

SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Uno scopo della presente invenzione ? di provvedere

un nuovo derivato di un attivatore di plasminogeno non immu-

nogenico,di origine umana, che ? stabile e presenta attivit?

fibrinolitica prolungata quando viene somministrato ai corpi

<? viventi.

? Un altro scopo dell'invenzione ? di provvedere un

procedimento per la preparazione del nuovo derivato di atti-? vatore di plasminogeno.

Un ulteriore scopo dell<1 >invenzione ? di provvedere

un agente trombolitico terapeuticamente accettabile, compren?

dente il nuovo derivato di attivatore di plasminogeno.

Questi ed altri scopi e vantaggi dell'invenzione pos?

sono essere raggiunti provvedendo un derivato di un attivato?

re di plasminogeno non immunogenico,di origine umana, compren

dente almeno un polialchilen-glicole legato,con almeno un

agente di accoppiamento,alle catene laterali di amminoacido

dell'attivatore di plasminogeno, il polialchilen-glicole a-

vendo peso molecolare situato nell'intervallo compreso tra

200 e 20.000 e contenendo facoltativamente uno o pi? gruppi

alchilici e/o alcanoilici come sostituenti.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Una pi? completa valutazione della presente invenzio?

ne e di molti dei vantaggi che l'accompagnano sar? facilmente

ottenuta, mentre l'invenzione viene meglio compresa, mediante

riferimento alla seguente descrizione particolareggiata con?

siderata in combinazione con i disegni allegati, nei quali:

la figura 1 mostra gli intervalli di pH ottimali del-

1'urochinasi di peso molecolare elevato modificata (PEG-DCT-

UK) e dell'urochinasi di peso molecolare elevato non modifi C3

?ca cata (peso molecolare : 54.000),quali misurati come attivit?

di amidasi con un substrato sintetico (S-2444), i cerchi a- '33 perti corrispondendo a PEG-DCT-UK ed i cerchi pieni all'uro?

chinasi non modificata;

la figura 2 mostra gli intervalli di pH ottimali del-

1'urochinasi di basso peso molecolare modificata (PEG-DCT-L-

UK) e dell'urochinasi di basso peso molecolare non modifica?

ta (peso molecolare : 33.000), quali misurati come attivit?

di amidasi con S-2444, i cerchi aperti corrispondendo a PEG-

DCT-L-UK ed i cerchi pieni all'urochinasi non modificata;

la figura 3 mostra schematicamente la stabilit? di

PET-DCT-UK e dell'urochinasi non modificata a temperatura

ambiente in soluzione fisiologica di sale od in una soluzio?

ne di Ringer, le linee piene e tratteggiate indicando, rispet

tivamente, la soluzione fisiologica e la soluzione di Ringer

ed i cerchi aperti corrispondendo a PEG-DCT-UK ed i cerchi

pieni all'urochinasi non modificata;

la figura 4 mostra la stabilit? di PEG-DCT-L-UK e

dell'urochinasi non modificata (peso molecolare : 33.000)

all'operazione di congelamento seguito da scongelamento, ri?

petuta 2, 4 e 6 volte, i cerchi aperti corrispondendo a PEG-

DCT-L-UK ed i cerchi pieni all<1>urochinasi non modificata;

la figura 5 mostra le diverse quantit?, in funzione

del tempo, di un inibitore di plasmina in una frazione di

plasma F di ognuno di due gruppi di conigli sani, ad un grup eena po essendo stata somministrata PEG-DCT-UK ed all<1 >altro gruppo

urochinasi non modificata (peso molecolare : 54.000), i cer *<*>37

!?? chi aperti corrispondendo al gruppo avente ricevuto PEG-DCT-

UK ed i cerchi pieni al gruppo avente ricevuto urochinasi

non modificata;

la figura 6 mostra le diverse quantit?, in funzione

del tempo, di plasminogeno in una frazione di plasma di

ognuno di due gruppi di conigli sani, ad un gruppo essendo

stata somministrata PEG-DCT-UK ed all?altro gruppo urochina?

si non modificata (peso molecolare : 54.000), i cerchi aper?

ti corrispondendo al.gruppo avente ricevuto PEG-DCT-UK ed

i cerchi pieni al gruppo avente ricevuto urochinasi non mo?

dificata; e

la figura 7 mostra le diverse quantit?, in funzione

del tempo, di plasminogeno in una frazione di plasma F^ di

ognuno di due gruppi di conigli sani, plasma che ? stato trat

tato con un acido e poi con una base per inattivare un inibi?

tore di plasmina, ad un gruppo essendo stata somministrata

PEG-DCT-UK ed all'altro gruppo urochinasi non modificata (pe?

so molecolare : 54.000), i cerchi aperti corrispondendo al

gruppo avente ricevuto PEG-DCT-UK ed i cerchi pieni al grup?

po avente ricevuto urochinasi non modificata.

DESCRIZIONE DELLE FORME DI ATTUAZIONE PREFERITE

Il termine "attivatore di plasminogeno non immunogeni-

co di origine umana" quale qui impiegato abbraccia non soltan-3S C>ff ?-to l'urochinasi,ma anche gli attivatori di plasminogeno tis-I ?CO2 sulari ottenuti dai tessuti umani quali quello uterino, tumo-3 rale e simili. Questi attivatori di plasminogeno tissulari m comprendono anche quelli ottenuti mediante coltura di tessuti

oppure ingegneria genetica. Si dovrebbe notare che non ? im?

posta nessuna limitazione ai pesi molecolari di questi atti?

vatori, purch? essi siano ottenuti nel modo descritto in quan

to precede. Ad esempio, per quanto concerne 1'urochinasi che ?

un attivatore di plasminogeno derivato dall'urina umana, ?

possibile impiegare urochinasi di alto peso molecolare (peso

molecolare : 54.000) ed urochinasi di basso peso molecolare

(peso molecolare : 33.000),da sole oppure in combinazione.

I polialchilen-glic?li adatti che possono essere im?

piegati nell'invenzione comprendono un polietilen-glicole

ed un polipropilen-glicole. Nel caso del polipropilen-glico-

le, tanto i polipropilen-glicoli a catena lineare come quel

li rappresentati da H0[CH(CH )CH OQ H quanto i polipropilen-3 2 n

glicoli a catena ramificata come quelli rappresentati da CH^-

CH2C{CH20[CH2CH(CH3)p]nH}3 oppure H[0CH(CH3)CH2ln0CH{cH2|pCH2-

<CH(CH>3<)>]n<0H>}2?

I pesi molecolari dei polialchilen-glicoli possono

oscillare da 200 a 20.000. Sono particolarmente preferiti

i pesi molecolari situati nell'intervallo compreso tra 500

e 10.000.

C?3 I polialchilen-glicoli possono facoltativamente conoo tenere, ognuno, uno o pi? gruppi alchilici e/o alcanoilici

x*co in funzione di gruppi sostituenti. Gli esempi tipici dei grup 3

5? pi alchilici sono metile, etile, propile, stearile e simili.

? Gli esempi tipici dei gruppi alcanoilici sono acetile, propio-

nile, stearoile e simili. Come polialchilen-glicole preferi?

to, ? utile un polialchilen-glicole non sostituito oppure

metil-sostituito .

Gli agenti di accoppiamento adatti,che possono esse?

re impiegati nell'invenzione e sono atti a fissare un polial?

chilen-glicole ad un attivatore di plasminogeno non immunoge-

nico, ad esempio urochinasi, comprendono quelli in grado di

reagire con le catene laterali di amminoacido della protei?

na da modificare e di formare tra essi dei legami chimici,

ad esempio acil-azide, alogenuri dell'acido cianurico, p-

diazoniobenzil-etere , 3-(p-diazoniofenossi)-2-idrossipropil-

etere, anidride dialogenosuccinica e simili. Le seguenti for

mule parziali possono essere riportate come esempi delle strut?

ture di accoppiamento tra un polialchilen-glicole ed urochina-

si, attraverso questi agenti di accoppiamento.

-O-CH2CO-UK

-'?-?^V<UK>

<?>?^

X

-?-??<?? >oo ? o n OH . -?-??2-^~~^ -?2- UK <>>3

<a?

-O-CH2CH (OH) CH2 2-UK

-OCOCH2CH2CO-UK

ove X ? un atomo di alogeno e UK ? una parte residua della

molecola di urochinasi.

Il nuovo derivato di urochinasi secondo l'invenzio?

ne pu? essere preparato facendo reagire con urochinasi un

prodotto accoppiato di almeno un corrispondente polialchilen-

glicole ed almeno un agente di accoppiamento, il polialchi?

len-glicole avendo peso molecolare situato nell'intervallo

compreso tra 200 e 20.000 e contenendo facoltativamente uno

o pi? gruppi alchilici e/o alcanoilici come sostituenti.

Gli esempi tipici del prodotto accoppiato polialchi

len-glicole / agente di accoppiamento comprendono polialchi-

len-glicole / 4,6-dicloro-l,3,5-triazina, polialchilen-glico-

le / 4,6-difluoro-l,3,5-triazina, polialchilen-glicole / 4-

cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina, polialchilen-glicole / fl-(bro-

mocarbonil )-monopropionato, polialchilen-glicole / azidocar-

bonil-metiletere, polialchilen-glicole / (p-diazoniobenzil)-

etere, polialchilen-glicole / 3-{p-diazoniofenossi)-2-idrossi-

propil-etere e simili.

Quando si fa reagire con urochinasi il prodotto accop?

piato polialchilen-glicole / agente di accoppiamento, ? neces C3U ? CO> sario scegliere condizioni di reazione tali che l'attivit? 3>-<?? enzimatica sia conservata con una perdita minima. Cio?, ? ?? 5ar2 desiderabile effettuare la reazione a basse temperature, ad

esempio ad una temperatura compresa tra 0?C e la temperatura

ambiente, in una soluzione acquosa quale un tampone. Il tem?

po di reazione preferito pu? oscillare tra pi? minuti e 5

ore. Il pH del tampone ? preferibilmente situato in un inter?

vallo tale che l'attivit? enzimatica dell'urochinasi non ven?

ga diminuita, cio? tra 2 e 10, preferibilmente tra 5 e 9.

L'intervallo di pH preferito, tuttavia, pu? variare secondo

la reattivit? di ogni agente di accoppiamento impiegato e/o

la natura di un residuo di amminoacido. I gradi di modifica?

zione delle catene laterali di amminoacido dell'attivatore

di plasminogeno possono essere controllati variando la con?

centrazione del polialchilen-glicole attivato con l'agente

di accoppiamento in un mezzo di reazione. A titolo illustra?

tivo, monometil-etere-polietilen-glicole / 4,6-dicloro-l,3,5-

triazina avente peso molecolare medio 5.000 ? fatta reagire

a pH 7,0 con urochinasi di elevato peso molecolare per otte?

nere nuovi derivati di urochinasi, mentre la concentrazione

del primo reagente viene variata rispettivamente a 0,4, 4,0

e 6,0 mM. Gli ?-amminogruppi di lisina non modificati dei

risultanti derivati di urochinasi vengono determinati quanti?

tativamente impiegando 2,4,6-trinitrobenzensolfonato sodico.

I loro gradi di modificazione vengono esaminati in base ai

<?>p risultati ottenuti mediante le analisi quantitative. Le per- *

centuali di modificazione degli ? -amminogruppi di lisina,

che sono reattivi con il 2,4,6-trinitrobenzensolfonato sodi?

co, sono 6-7% a 0,4 mM, circa 40% a 4,0 mM e circa 60% a 6,0

mM. Inoltre, i pesi molecolari di questi prodotti di reazio?

ne vengono determinati mediante elettroforesi in SDS-polia-

crilammide-gel . I pesi molecolari medi dei prodotti di rea?

zione sono circa 60.000 a 0,4 mM e circa 120.000 a 4,0 mM.

Questo risultato ? sostanzialmente in conformit? con i risul?

tati ottenuti precedentemente mediante le analisi quantita?

tive degli ?-amminogruppi di lisina. Di conseguenza, ? ne?

cessario effettuare la reazione tra il polialchilen-glicole

attivato con l'agente di accoppiamento e l'attivatore di pla-

sminogeno ad un valore di pH elevato e ad un'elevata concen?

trazione del primo reagente quando si desiderano gradi di

modificazione elevati dell'attivatore di plasminogeno. Dal?

l'altra parte, quando sono preferibili gradi di modificazio?

ne ridotti, la reazione dovrebbe essere condotta ad un valore

di pH relativamente basso e ad una bassa concentrazione del

prodotto accoppiato. I gradi di modificazione possono ovvia-

mente essere variati controllando il tempo di reazione. Com?

binando adeguatamente queste condizioni di reazione, ? possi?

bile ottenere i nuovi derivati d? attivatori di plasminogeno

voluti, che sono stabili ed hanno prolungate attivit? fibrino

C3 O

litiche .

?<? >?>5 P co? ? ^ Il polialchilen-glicole attivato con l'agente di ac-<?*? coppiamento pu? essere ottenuto nel modo seguente. Un pro m ?3= dotto polialchilen-glicole / 4,6-dialogeno-l,3,5-triazina

a sostituzione terminale ? ottenuto facendo reagire il suo

corrispondente polialchilen-glicole monosostituito con un

alogenuro di acido cianurico in un solvente anidro ed in pre?

senza di una base. Un prodotto polialchilen-glicole / 4-alo-

geno-6-idrossi-l ,3,5-triazina ? formato facendo dapprima rea?

gire il suo corrispondente polialchilen-glicole con alogenu?

ro di acido cianurico e poi trattando con acqua il risultan?

te prodotto di reazione. Un prodotto polialchilen-glicole /

acetoazide ? formato mediante reazione di un anione del suo

corrispondente polialchilen-glicole con cloroacetato etilico,

seguita da trattamento del prodotto di reazione con idrazina

ed infine attivazione della risultante idrazide con acido

nitroso. Un prodotto polialchilen-glicole / p-diazoniobenzil-

etere od un polialchilen-glicole / 3-(p-diazoniofenossi)-2-

idrossipropil-etere ? ottenuto facendo reagire il suo corri?

spondente polialchilen-glicole con cloruro di p-nitrobenzile

oppure p-nitrofenilgliceril-etere e, dopo riduzione del nitro-

gruppo ad amminogruppo, diazotando con acido nitroso il pro?

dotto risultante.

Dopo completamento della reazione del polialchilen-

glicole attivato con un agente di accoppiamento e dell'atticn? vatore di plasminogeno, l'isolamento e la purificazione del

prodotto di reazione possono essere effettuati in un modo <>>3 biochimico per s? conosciuto nella tecnica, ad esempio impie m ss gando, singolarmente od in combinazione, filtrazione su gel,

dialisi, cromatografia di scambio ionico, cromatografia di

affinit? e simili. Di preferenza, il coniugato ? conservato

sotto forma di una soluzione contenente un tampone od un sa?

le fisiologico, congelando la soluzione al di sotto di -20?C

oppure liofilizzando la soluzione.

I valori di pH ottimali per i nuovi derivati di uro-

chinasi preparati in quanto precede variano secondo i pesi

molecolari ed i tipi dei polialchilen-glicoli impiegati, i

tipi degli agenti di accoppiamento impiegati, i gradi di modi

ficazione dell<1>urochinasi, le condizioni di modificazione e

le condizioni di misura, quali i substrati, impiegate. Quan?

do ? misurato in base all'attivit? di amidasi impiegando un

substrato sintetico S-2444, il valore di pH ottimale ? situato nell'intervallo di circa 8 a 9. Nel caso dell'urochinasi

di elevato peso molecolare modificata mediante reazione con

monometil-etere-polietilen-glicole/4, 6-dicloro-l ,3,5-triazina

avente un peso molecolare medio di 5.000 a pH 7,0 e ad una

temperatura di 0?C per 3 ore, impiegando quest'ultimo reagente ad una concentrazione di 4,0 mM? (in seguito qui abbreviata in PEG-DCT-UK), il pH ottimale quale misurato in base all'attivit? di amidasi ? 8,2 come rappresentato nella figura

1. Il pH ottimale dell<1>urochinasi di basso peso molecolare

modificata nelle stesse condizioni (in seguito qui abbrevia- <* >ta in PEG-DCT-L-UK) ?, quale misurato in base all'attivit?

di amidasi, 8,2 come rappresentato nella figura 2.

I nuovi derivati di urochinasi secondo l'invenzione

hanno stabilit? estremamente accresciuta a paragone con l'urochinasi non modificata. Ad esempio, la figura 3 mostra i risultati dell'attivit? residua dell<1>urochinasi,ottenuti con il

trascorrere del tempo quando l'urochinasi ? diluita con una

soluzione di Ringer,oppure una soluzione fisiologica,ad una

concentrazione quale quella usata mediante somministrazione

a gocciolamento per applicazioni cliniche e poi lasciata in

riposo a temperatura ambiente. Come risultato, ? stato trovato che PEG-DCT-UK disciolta ad una concentrazione di 105,3

iu/ml nella soluzione di Ringer conserva un'attivit? di 73,4%

di quella all'inizio dell'esperimento anche dopo 6 ore. Inol

tre, PEG-DCT-UK conserva 79,4? dell'attivit? iniziale nella

soluzione fisiologica. Dall'altra parte, l'urochinasi non

modificata, disciolta ad una concentrazione di 76,1 iu/ml in

una soluzione di Ringer,conserva soltanto 33,3% della sua

attivit? iniziale persino dopo due ore. In soluzione fisiolo?

gica, l'attivit? residua ? di appena 26,3%.

La figura 4 illustra i risultati ottenuti confrontan?

do la stabilit? di PEG-DCT-L-UK e di urochinasi di basso peso

?3 molecolare non modificata, ambedue nel corso di operazioni

ca era di congelamento seguito da scongelamento. I risultati confer ?<1>

7 co mano che l'eccellente stabilit? di PEG-DCT-L-UK ? ottenuta 3

anche in tali condizioni.

Inoltre, i nuovi derivati di urochinasi secondo l'in?

venzione hanno attivit? di urochinasi prolungate,nel sangue,

a paragone con l'urochinasi non modificata. Ad esempio, l'ef?

ficacia dell'urochinasi ? stata studiata somministrando 8.000

iu/kg, ognuna, di PEG-DCT-UK e di urochinasi non modificata

a conigli sani mediante iniezione endovenosa, prelevando pe?

riodicamente campioni di sangue prima della somministrazione

e fino dopo il trascorrere di 4 ore e misurando le quantit?

dell 'inibitore di plasmina e di plasminogeno presenti nel

trattato con

plasmaVcitrato . I risultati sono illustrati nelle figure 5,

6 e 7. In base a questi risultati,? stato confermato che PEG-

DCT-UK altera in misura sostanziale i parametri biochimici,

quali un inibitore di plasmina ed il plasminogeno, e mantie

ne i parametri a valori ridotti per un periodo di tempo pro?

lungato a paragone con l'urochinasi non modificata.

Pertanto, i nuovi derivati di urochinasi secondo l'in?

venzione sono eccellenti attivatori del plasminogeno che,

mentre conservano il potere attivante il plasminogeno presen?

tato dall<1>urochinasi non modificata, hanno superato gli in?

convenienti dell'urochinasi quali la scadente stabilit? ed

il breve semi-periodo di vita nel sangue.

S

I nuovi derivati dell'urochinasi secondo l'invenzio C3s

ne possono essere usati come prodotti farmaceutici per il

* c? CO

trattamento di una molteplicit? di malattie derivanti dall'i- <>>3s?-percoagulabilit? del sangue,quali le trombosi arteriose e

m 32 venose ,1'ostruzione delle arterie coronariche , l'infarto

miocardico, l'infarto endocerebrale, l'embolia polmonare,

la nefrite e simili. Questi derivati dell'urochinasi possono

essere opportunamente somministrati mediante iniezione endo?

venosa o fleboclisi o per via orale. L'iniezione endovenosa

? particolarmente preferita. Come forme di dosatura, ? prefe?

ribilmente utilizzabile la forma liofilizzata. Quando sono

forniti allo stato puro oppure con un sale fisiologico quale

un sale di una soluzione Ringer o cloruro di sodio, i prodot?

ti liofilizzati possono essere usati per applicazione clini '<0>81*3?

ca mediante dissoluzione con acqua distillata sterile od ul?

teriore diluizione con acqua distillata sterile allo scopo

di regolare la loro pressione osmotica, prima dell'uso effet

tivo. I nuovi derivati di urochinasi secondo l'invenzione,

essendo stabili, non richiedono uno stabilizzante quale albu-

mina. L'aggiunta di un tale stabilizzante, tuttavia, non ge?

nera alcun problema od inconveniente. Nel sottoporre i nuovi

derivati di urochinasi alla liofilizzazione,pu? anche essere

aggiunto un eccipiente.

La descrizione che precede descrive la presente inven?

zi?ne in modo generale. Si pu? ottenere una migliore compren-2?*CT3 sione facendo riferimento agli esempi seguenti, che sono rion portati unicamente a scopo illustrativo e non sono destinati

ad essere limitativi. La procedura di modificazione pu? esse <*>3 re effettuata in uno qualsiasi degli stadi di preparazione

degli attivatori di plasminogeno.

Esempio 1

Monometil-etere-polietilen-glicoleM ,6-dicloro-

1,3, 5-triazina

Monometiletere di polietilen-glicole avente peso mo?

lecolare medio 5.000 (25,0 g; 0,05 moli) viene disciolto sot?

to riscaldamento in benzene secco (200 mi). Dopo raffredda?

mento della risultante soluzione a temperatura ambiente, si

aggiungono carbonato di sodio anidro (5,0 g) e cloruro di

acido cianurico (2,75 g; 0,015 moli) e la miscela viene agi?

tata per una notte a temperatura ambiente. Completata la rea?

zione, la miscela di reazione viene filtrata ed al filtrato

viene aggiunto etere di petrolio (600 mi). Il risultante pre

cipitato viene raccolto per filtrazione sottovuoto e lavato

con una piccola quantit? di etere di petrolio. Il precipita?

to viene purificato mediante riprecipitazione per tre volte

da benzene secco ed etere di petrolio per eliminare il cloru?

ro cianurico in eccesso, ottenendosi cos? stechiometricamente

monometil-etere-polietilen-glicole/4 ,6-dicloro-l ,3,5?triazina

sotto forma di polvere bianca. Il prodotto, dopo essere stato

idrolizzato, presenta reazioni qualitative caratteristiche

C9 degli ioni cloruro (AgNO ). C3

3 Ct) Analogamente, monometil-eteri di polietilen-glicole

n c/p aventi pesi molecolari medi 550, 700, 2.000 e 20.000, rispet-<3? tivamente, vengono fatti reagire ognuno con cloruro di acido

55 cianurico per ottenere stechiometricamente monometil-etere-

polietilen-glicole/4, 6-dicloro-l,3,5-triazine aventi i cor?

rispondenti pesi molecolari medi.

Esempio 2

Monometil-etere-polietilen-glicole/4 ,6-dicloro-

1 ,3,5-triazine (pesi molecolari medi dei loro

gruppi di polietilen-glicole: 10.000 e 15.000)

Monometil-etere di polietilen-glicole avente peso

molecolare medio 10.000 (25,0 g; 0,025 moli) viene ripreso

sotto riscaldamento in benzene secco (200 mi). Dopo raffred?

damento della risultante soluzione, si aggiungono carbonato

di sodio anidro (2,5 g) e cloruro di acido cianurico (1,38

g; 0,0075 moli). La risultante miscela viene agitata per

una notte a 33?C. Dopo completamento della reazione, le so?

stanze indisciolte sono eliminate per filtrazione. Il filtra?

to viene addizionato di n~esano (circa 600 mi) per indurre

la riprecipitazione. Benzene secco (100 mi) viene aggiunto

al precipitato, che viene poi riscaldato e disciolto. Si ag?

giunge poi n-esano (500 mi) per indurre la riprecipitazione.

Questa procedura ? ripetuta 3 volte. Il precipitato cos? ot?

tenuto viene essiccato per una notte a 50?C sottovuoto, otte?

nendosi cos? stechiometricamente monometil-etere-polietilen-

glicole/4 ,6?dicloro-1,3,5?triazina (peso molecolare medio

V CO

del gruppo di polietilen-glicole : 10.000) sotto forma di

? polvere bianca. Il monometil-etere di polietilen-glicole aven?

te peso molecolare medio 15.000 viene fatto analogamente rea?

gire con cloruro cianurico per ottenere stechiometricamente

monometil-etere-polietilen-glicole/4 ,6-dicloro-l ,3,5-triazi?

na (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole :

15.000).

Esempio 3

Monostearil-etere-polietilen-glicole/4, 6-di-

cloro-1 ,3,5-triazina

Monostearil?etere di polietilen-glicole avente peso

molecolare medio 3.200 (16,0 g; 0,005 moli) viene disciolto

in benzene secco (200 mi), con successiva aggiunta di carbo?

nato di sodio anidro (5,0 g) e cloruro di acido cianurico

(2,75 g; 0,015 moli),sotto agitazione. La miscela risultan

te viene agitata per una notte a temperatura ambiente. Comple?

tata la reazione, le sostanze indisciolte vengono eliminate

per filtrazione. Il filtrato viene addizionato di n-esano

(circa 600 mi) per favorire la riprecipitazione. Benzene sec?

co (100 mi) viene aggiunto al precipitato per disciogliere

quest'ultimo. n-Esano (500 mi) viene aggiunto per favorire

la riprecipitazione. Questa procedura viene ripetuta tre vol?

te, ottenendosi cos? stechiometricamente monostearil-etere-

polietilen-glicole/4,6-dicloro-l,3,5-triazina (peso molecola?

re medio del gruppo di polietilen-glicole : 3.200), sotto forp ma di polvere bianca.

Esempio 4

P?lietilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-

triazina

Polietilen-glicole avente peso molecolare medio 6.000

(33,6 g) viene disciolto sotto riscaldamento in benzene sec?

co (150 mi). Dopo raffreddamento della soluzione risultante,

si aggiungono carbonato di sodio anidro (1,6 g) e cloruro

di acido cianurico (0,74 g) e si agita la miscela risultante

F<' >per una notte a temperatura ambiente. Viene poi aggiunta ac?

qua (1,0 mi), seguita da agitazione della miscela a tempera?

tura ambiente per 6 ore e poi a 40?C per un periodo di una

notte. Le sostanze indisciolte vengono eliminate mediante

centrifuga (2.000 ppm; 10 minuti) e lo strato sovrastante

viene sottoposto a condensazione a pressione ridotta. Il re

siduo viene ripreso in benzene secco sotto riscaldamento ed il solvente viene poi evaporato. Questa procedura ? ripetuta ulteriormente due volte. Il residuo viene essiccato a pressione ridotta, ottenendosi cos? polietilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-1 ,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole : 6.000).

Polietilen-glicoli aventi pesi molecolari medi differenti, di 1.000 e 4.000, vengono ognuno fatti reagire nello stesso modo indicato precedentemente con cloruro di acido cianurico ed acqua, portando alla formazione stechiometrica di polietilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l,3,5-triazine aventi i loro corrispondenti pesi molecolari medi.

Esempio 5

Stearoil-polietilen-glicole/4,6-dicloro-1,3,5-triazina

Monostearato di polietilen-glicole avente peso molecolare medio 2.700 (6,765 g) viene disciolto in benzene anidro (100 mi), con successiva aggiunta di carbonato di sodio anidro (2,5 g). Mentre la risultante miscela viene agitata, si aggiunge inoltre cloruro cianurico(1,38 g).La miscela risultante viene agitata per una notte a temperatura ambiente e poi filtrata. Il filtrato viene concentrato a pressione ridotta ed il residuo viene essiccato a pressione ridotta, ottenendosi cos? stechiometricamente stearoil-polietilenglicole/4,6-dicloro-l (3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole : 2.700) sotto forma di una

sostanza bianca simile a cera.

Esempio 6

Polipropilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina

Polipropilen-glicole avente peso molecolare medio

1.000 (4,0 g) viene ripreso in benzene anidro (50 mi), con

successiva aggiunta di carbonato di sodio anidro (1,27 g).

Si aggiunge inoltre, sotto agitazione, cloruro di acido cia oo g nurico (0,552 g). Dopo avere agitato la risultante miscela

? C/3 per una notte a temperatura ambiente, si aggiunge acqua (1

mi). La miscela viene agitata a temperatura ambiente per al?

tre 6 ore. La miscela di reazione viene filtrata ed il fil?

trato viene concentrato a pressione ridotta. Il residuo vie?

ne addizionato di benzene anidro e di solfato di sodio ani?

dro. La miscela viene poi agitata a temperatura ambiente per

10 minuti. Dopo filtrazione della miscela, il solvente viene

evaporato dal filtrato. Il residuo viene essiccato a pressio?

ne ridotta, ottenendosi cos? stechiometricamente polipropilen-

glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina (peso molecolare

medio del gruppo di polipropilen-glicole : 1.000),sotto for?

ma di olio viscoso incoloro.

Seguendo la stessa procedura descritta in quanto pre?

cede, si ottiene un prodotto polipropilen-glicole/4-cloro-

6-idrossi-l,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo

di polipropilen-glicole : 4.000) ed un'altro prodotto polipro-

pilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l,3,5-triazina (peso molecola?

re medio del gruppo di polipropilen-glicole : 10.000).

I polipropilen-glicoli impiegati nei precedenti esempi

sono di tipo a catena lineare, cio? quelli rappresentati dalla

formula HO[CH(CH )CH ?] H.

3 2 n

Esempio 7

Polipropilen-glicole/4-cloro?6-idrossi-l ,3,5-

triazina

Seguendo la stessa procedura dell'esempio 1, si ot-S2 tiene stechiometricamente polipropilen-glicole/4-cloro-6-i-

drossi-1 ,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di

& polipropilen-glicole : 4.000) sotto forma di una sostanza

bianca,a partire da polipropilen-glicole avente peso mole?

colare medio 4.000 (8,0 g), benzene anidro (80 mi), carbona?

to di sodio anidro (0,636 g) e cloruro di acido cianurico

(0,368 g).

Il polipropilen-glicole usato in questo esempio ?

di. un tipo a catena ramificata, cio? quelli rappresentati

dalla formula CH CH C?CH ???? CH(CH

3 2 2 <L >2 3

Inoltre, impiegando polipropilen-glicole rappresentato dalla formula

CH 0[CH CH(CH )Ol H

I 2 <L >2 3 <J>n

CHOfCH CH(CH )O? H

1 ^ 2 3 n

CH 0[CH CH(CH )?] H

ed avente peso molecolare medio 3.000, s? ottiene polipropi-

len-glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina (peso molecolare

medio del gruppo di polipropilen-glicole : 3.000).

Esempio 8

Monometil-etere-polietilen-glicole/metossi-

carboidrazide

Monometil-etere di polietilen-glicole avente peso

molecolare medio 5.000 (13,3 g; 0,0027 moli) viene ripreso

in tetraidrofurano anidro (400 mi) in atmosfera di azoto.

Si aggiunge come indicatore una piccola quantit? di acido

<?>eco difenilacetico e si aggiunge a gocce, raffreddando con ghiac?

cio, n-butil-litio finch? la soluzione di reazione vira al

giallo pallido. Si aggiunge poi a gocce, a temperatura am?

biente, cloroacetato etilico (5 mi; 0,047 moli) e la solu?

zione risultante viene agitata per una notte e poi scaldata

a ricadere per un'ora. Dopo completamento della reazione,

il solvente viene eliminato a pressione ridotta ed il resi?

duo ripreso in acetone acquoso (200 mi). La soluzione risul?

tante viene trattata con carbone di legna. Dopo filtrazione

e successiva concentrazione del filtrato, si aggiunge ben-\w

zene. Dopo eliminazione dell'acqua mediante distillazione

azeotropica, il residuo viene riprecipitato da benzene e n~

esano ottenendosi una polvere giallognola. La polvere cos?

ottenuta viene disciolta in metanolo (150 mi) e poi addizio?

nata di idrato di idrazina (15 mi). La miscela viene scalda

ta per una notte in condizioni di riflusso. Dopo eliminazio?

ne del solvente a pressione ridotta, si aggiunge acqua (150

mi) e si elimina l'eccesso di idrazina mediante distillazione

azeotropica. L'acqua,che ancora rimane nel residuo,viene eli?

minata azeotropicamente insieme con il benzene. Il residuo

viene di nuovo disciolto in benzene ed essiccato con solfato

di sodio anidro. Il solvente viene poieliminato ed il residuo

viene disciolto in benzene caldo. La soluzione benzenica vie-5= ne trattata con carbone di legna e poi concentrata. Il pro cCa3 gca c? dotto di reazione viene riprecipitato due volte da benzene

T3CO e n-esano, trattato di nuovo con carbone di legna e con gel *> EJ

di silice e poi riprecipitato da benzene e n-esano, ottenen?

dosi cos? monometil-etere-polietilen-glicole/metossicarboidrazide,sotto forma di polvere bianca. Nello stesso modo, si

pu? ottenere una variet? di idrazidi impiegando come materia?

li di partenza monometil-eteri di polietilen-glicole aventi,

rispettivamente, pesi molecolari medi 550, 700, 2.000, 10.000,

15.000 e 20.000.

Esempio 9

Urochinasi modificata con monometil-etere-poli-

etilen-glicole/4 ,6-dicloro-l,3,5-triazina (PEG-

DCT-UK)

Un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0 (2,0 mi) viene

aggiunto, sotto raffreddamento con ghiaccio, a 0,51 mi di

una soluzione di urochinasi (peso molecolare : 54.000; 66.300

iu/ml). Si aggiunge poi inoltre monometil-etere-polietilen-

glicole/4,6-dicloro-l, 3,5-triazina (peso molecolare medio

del gruppo di polietilen-glicole : 5.000) in quantit? tale

da portare la concentrazione della triazina a 4 mM. La misce?

la viene fatta reagire sotto raffreddaemnto con ghiaccio per

3 ore. Dopo completamento della reazione, la soluzione di

reazione viene trasferita in un tubo dializzatore e l'ecces?

so di derivato di triazina ? eliminato mediante dialisi. La

dialisi ? effettuata sotto raffreddamento con ghiaccio per 3

S

3 ore contro un tampone fosfato 0,1M (pH 7,2) e poi per una

altra ora contro soluzione fisiologica. Il contenuto del tu <?>p co

bo viene poi portato a 4 mi ed immagazzinato allo stato con-? gelato a -80?C. L'attivit? di urochinasi dell'urochinasi mo?

dificata con monometil-etere-polietilen-glicole/4,6~dicloro-

1,3,5-triazina (PEG-DCT-UK) cos? ottenuta,viene determinata

uguale a 4.550 iu/ml mediante il procedimento a piastra di

fibrina. L'attivit? totale ?, pertanto, 18.200 iu. Poich?

l'attivit? dell'urochinasi di partenza ? 40.443 iu, si ri?

scontra una caduta di attivit? di 55%.

Si ripete la procedura suindicata, salvo che raono-

metil-etere-polietilen-glicole/4 ,6-dicloro-l,3,5-triazina

(peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole :

5.000) viene sostituita con monometil-etere-polietilen-gli-

cole/4,6-dicloro-l ,3,5-triazine (pesi molecolari medi dei

gruppi di polietilen-glicole : rispettivamente 550, 700 e

2.000), ottenendosi cos? urochinasi modificate aventi attivi?

t? di urochinasi 9800, 10.000 e 6.000 iu/ml,quali determinate

mediante il procedimento a piastra di fibrina.

Esempio 10

Urochinasi di basso peso molecolare modificata

con monometil-etere-polietilen-glicole/4,6-di-

cloro-1 ,3,5-triazina (PEG-DCT-L-UK)

Un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0 (4,7 mi) viene

aggiunto sotto raffreddamento con ghiaccio a 0,2 mi di una

C3 soluzione di urochinasi di basso peso molecolare (peso mole-<?>p-s colare : 33.000; 567.828 iu/ml). Viene poi inoltre aggiunto

a? monometil-etere-polietilen-glicole/4,6-dicloro-l ,3,5-triazi-

na (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole :

5.000) in quantit? tale da portare la concentrazione del de?

rivato di tri?zina a 4 mM. La miscela viene fatta reagire

per 3 ore sotto raffreddamento con ghiaccio. Dopo completa?

mento della reazione, la soluzione di reazione viene trasfe?

rita in un tubo di dialisi e l'eccesso di derivato di tria-

zina viene eliminato mediante dialisi. La dialisi ? effettua?

ta, sotto raffreddamento con ghiaccio, per 3 ore contro un

tampone fosfato 0,1M (pH 7,2) e poi per un'altra ora contro

soluzione fisiologica. Dopo la dialisi, il contenuto ? por?

tato a 8 mi ed immagazzinato allo stato congelato a -80?C.

L'attivit? di urochinasi dell'urochinasi di basso peso mole?

colare modificata con monometil-etere-polietilen-glicole/4,

6-dicloro-l ,3,5-triazina (PEG-DCT-L-UK) cos? ottenuta ? determinato uguale a 10.300 iu/ml mediante il procedimento a piastra di fibrina. L'attivit? totale ?, pertanto, 82.400 iu.

Poich? l'attivit? dell'urochinasi di partenza ? 113.566 iu,

si constata una caduta di attivit? di 27,4%.

Esempio 11

Urochinasi modificata con monometil-etere-polietilen-gllcole/4 ,6-dic1oro-1 ,3,5-triazina

Ripetendo la procedura dell'esempio 9, salvo che la concentrazione di ogni monometil-etere-polietilen-glicole/4,

6-dicloro-l ,3,5-triazina viene variata a 0,4 mM, si ottengono, con gradi di modificazione differenti da quello ottenuto nell'esempio 9, urochinasi modificate con monometil-eterepolietilen-glicole/4, 6-dicloro-l,3,5-triazina (pesi molecolari medi dei gruppi di polietilen-glicole : rispettivamente 550, 700, 2.000 e 5.000). Le attivit? di urochinasi sono

8.670, 8.900, 6.770 e 8.670 iu/ml, quali misurate mediante

il procedimento a piastra di fibrina.

Esempio 12

t Urochinasi modificata con monometil-eterepolietilen-glicol ? carbometilazide

(1) A 200 mg della monometil-etere-polietilen-glicolemetossicarboidrazide preparata nell'esempio 8 (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole : 5.000) si aggiungono, sotto raffreddamento con ghiaccio, acido cloridri

co IN (2 mi) e poi una soluzione acquosa 0,008N di nitrito

di sodio (1 mi). La risultante miscela viene agitata a temperatura ambiente per 20 minuti e si aggiunge inoltre una soluzione acquosa IN di idrossido di sodio (2 mi) per neutralizzare la miscela. La risultante soluzione di monometil-eterepolietilen-glicol-carbossimetilazide viene immagazzinata a

0?C.

(2) Un tampone fosfato 0,1M avente pH 8,0 (3,656 mi) viene aggiunto ad 1 mi di una soluzione di urochinasi (peso molecolare : 33.000; 45.600 iu/ml). Si aggiungono poi, sotto

blanda agitazione, 0,435 mi della soluzione di monometil-etere-polietilen-glicol-carbometilazide preparata nella prece m dente procedura (1). La miscela viene fatta reagire a temperatura ambiente per 2 ore. La risultante soluzione di reazione viene poi trasferita in un tubo dializzatore e dializzata, sotto raffreddamento con ghiaccio, per 4 ore contro

un tampone fosfato 0,1M (pH 7,2). Il contenuto viene portato a 8 mi. La risultante soluzione viene immagazzinata allo

stato congelato a -80?C. L'attivit? di urochinasi dell'urochinasi modificata con monometil-etere-polietilen-glicol-carbometilazide,cos? ottenuta,viene determinata uguale a 7.300

iu/ml mediante il procedimento a piastra di fibrina. A paragone con 1'urochinasi non modificata, si constata un'aumento di attivit? di 28%.

Esempio 13

Urochinasi modificata con monometil-eterepolietilen-glicole/4,6-dicloro-l ,3,5-triazina

A 0,61 mi di una soluzione di urochinasi (peso molecolare : 54.000; 101.167 iu/ml) si aggiungono, raffreddando con ghiaccio, un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0 (2,0 mi) e poi, sotto blanda agitazione, monometil-etere-polietilenglicole/4,6-dicloro-l,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole : 10.000). Il derivato di triazina ? aggiunto in quantit? tale da portare la concentrazione a 0,1 mM. La miscela viene fatta reagire per 3 ore sotto raffreddamento con ghiaccio. Dopo completamento della reazione, la soluzione di reazione viene trasferita in un tubo di dialisi ed il derivato di triazina in eccesso viene eliminato mediante dialisi. La dialisi ? effettuata, sotto raffreddamento con ghiaccio, per 3 ore contro un tampone acido fosforico 0,1M addizionato di0,035? in volume/volume di etilammina (pH 8,0) e poi per altre 2 ore contro un tampone fosfato 0,1M (pH 7,2). Il contenuto ? addizionato di 3% in peso/volume di albumina di siero bovino (0,1 mi) e poi portato a 4,0 mi con un tampone fosfato 0,1M (pH 7,0). La soluzione risultante viene immagazzinata allo stato congelato a -80?C. L'attivit? dell'urochinasi modificata con monometil-eterepolietilen-glicole/4 ,6-dicloro-l,3,5-triazina,cos? ottenuta, ? determinata uguale a 10.028 iu/ml mediante il procedimento

a piastra di fibrina. L'attivit? totale ? pertanto 40.112

iu e la caduta di attivit? ammonta a 35%. Analoghe urochina-

si modificate vengono ottenute variando la concentrazione

della monometil?etere-polietilen-glicole/4,6-dicloro-l,3,5-

triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-gli?

cole : 10.000) rispettivamente a 0,4 e 1,0 mM. Le loro atti?

vit? di urochinasi sono 8.794 e 6.634 iu/ml.

Se Inoltre, monometil-etere?polietilen?glicole/4,6-di- oce e cloro-l,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di

TJCO

polietilen-glicole : 15.000) ed urochinasi vengono fatte rea?

gire in modo analogo, ottenendosi cos? urochinasi modificata

5 con monometil-etere-polietilen-glicole/4,6-dicloro-l ,3,5-

triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-gli-?

cole : 15.000). Le attivit? delle urochinasi modificate ot?

tenute variando la concentrazione del derivato di triazina

a 0,1, 0,4 e 1,0 mM, rispettivamente, sono 11.388, 8.580 e

7.176 iu/ml.

Esempio 14

Urochinasi modificata con monostearil-etere-

polietilen-glicole/4, 6-dicloro-l,3,5-triazina

A 0,2 mi di una soluzione di urochinasi (peso mole?

colare : 54.000; 101.167 iu/ml) si aggiungono, sotto raffred?

damento con ghiaccio, un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0

(0,66 mi) e poi monostearil-etere-polietilen-glicole/4,6-di

cloro-l ,3,5-triazina (peso molecolare medio del gjrtppo di polietilen-glicole : 3.200). Il derivato di triazina viene aggiunto in quantit? tale da portare la concentrazione a 2 ri . La

miscela viene fatta reagire sotto raffreddamento con ghiaccio

per 3 ore. Dopo completamento della reazione, la soluzione

di reazione viene trasferita in un tubo di dialisi e sottoposta a dialisi per eliminare il derivato di triazina in eccesso. La dialisi ? effettuata sotto raffreddamento con ghiaccio

per 4 ore contro un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,2. Il

contenuto ? addizionato di una soluzione acquosa al 3,0% di

<?>p albumina di siero bovino (0,1 mi) e poi portato a 4,0 mi con

un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0. La risultante soluzione viene immagazzinata allo stato congelato a -80?C. L'attivit? di urochinasi della urochinasi modificata con monostearil-etere-polietilen-glicole/4,6-dicloro-l ,3,5-triazina (peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole : 3.200),

cos? ottenuta,? determinata uguale a 2.826 iu/ml mediante

il procedimento a piastra di fibrina. Poich? l'attivit? totale ? 11.304 iu, l'attivit? dell<1 >urochinasi cos? modificata ? 55,9% di quella dell<1 >urochinasi di partenza. Le attivit? delle urochinasi modificate ottenute variando la concentrazione della monostearil-etere-polietilen-glicole/4,6-dicloro-1,3,5-triazina rispettivamente a 4, 6 e 8 mM,sono 2.351,

1.430 e 1.059 iu/ml.

Esempio 15

Urochinasl modificata con polietilen-glicole/

4-cloro-6-idrossi-l,3,5-triazina

A 1 mi di una soluzione di urochinasi (peso molecola?

re : 54.000, 45.600 iu/ml) si aggiungono, sotto raffreddamento

con ghiaccio, un tampone fosfato 0,05M avente pH 9,2 (4,0

mi) e poi polietilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazi?

na (2,34 mg). Il peso molecolare medio del gruppo di polieti?

len-glicole del derivato di triazina ? 6.000. La miscela vie?

ne fatta reagire per 3 ore raffreddando con ghiaccio. Dopo

<?>p il completamento della reazione, la soluzione di reazione *

viene trasferita in un tubo dializzatore e l'eccesso di deri?

vato di triazina viene eliminato mediante dialisi. La diali?

si ? effettuata, sotto raffreddamento con ghiaccio, per 1

ora contro un tampone fosfato 0.05M avente pH 9,2 e poi per

altre 3 ore contro un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,2.

Il contenuto ? portato a 8,0 mi con un tampone fosfato 0,1M

avente pH 7,2. La risultante soluzione viene immagazzinata

allo stato congelato a -80?C. L'attivit? di urochinasi del-

1'urochinasi modificata con polietilen-glicole/4-cloro-6-i-

drossi-1 ,3,5-triazina cos? ottenuta (peso molecolare medio

del gruppo di polietilen-glicole : 6.000) viene determinata

uguale a 460 iu/ml mediante il procedimento a piastra di fi?

brina.

Analogamente, si ottengono altre urochinasi modifi

cete con polietilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l,3,5-triazina

(pesi molecolari medi dei gruppi di polietilen-glicole : 4.000

e 1.000, rispettivamente).

Esempio 16

Urochinasi modificata con stearoil-polietilen-

glicole/4,6-dicloro-l,3,5-triazina

A 0,5 mi di una soluzione di urochinasi (peso mole?

colare : 54.000; 101.167 iu/ml) si aggiungono, raffreddando

? con ghiaccio, un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0 (1,5 mi) n=

5Oo e poi 0,05 mi di una soluzione diossanica di stearoil-poli-<an a CO etilen-glicole/4 ,6-dicloro-l,3,5-triazina (270 mg/ml)(peso

molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole: 2.700).

La miscela viene fatta reagire per 3 ore raffreddando con

ghiaccio. Completata la reazione, la soluzione di reazione

viene trasferita in un tubo di dialisi e sottoposta a diali?

si per eliminare il derivato di triazina in eccesso. La dia?

lisi ? effettuata sotto raffreddamento con ghiaccio per 4

ore contro un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,2. Il conte?

nuto ? portato a 5 mi con un tampone fosfato. La risultante

soluzione viene immagazzinata allo stato congelato a -80?C.

L'urochinasi modificata con stearoil-polietilen-gli-

cole/4,6-dicloro-l ,3,5-triazina cos? ottenuta,risulta, in

base alla misura dell'attivit? di urochinasi mediante il pro?

cedimento a piastra di fibrina, avere un'attivit? uguale a

106% di quella dell'urochinasi di partenza.

Altre urochinasi modificate con steaoroil-polietilenglicole/4,6-dicloro-l, 3,5-triazina aventi gradi di modificazione differenti vengono ottenute mediante reazione con urochinasi impiegando una soluzione diossanica di stearoil-polietilen-glicole/4 ,6-dicloro-l,3,5-triazina (270 mg/ml) rispettivamente nelle quantit? di 0,1 e 0,2 mi. Il peso molecolare medio del gruppo di polietilen-glicole del derivato di triazina ? 2.700. Le urochinasi modificate cos? preparate hanno attivit? uguale a 106 e 101% di quella dell'urochinasi di partenza.

Esempio 17

Urochinasi modificata con polipropilen-glicole/ 4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina

A 0,5 mi di una soluzione di urochinasi (peso molecolare : 54.000; 101.167 iu/ml) si aggiungono, sotto raffreddamento con ghiaccio, un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,0 (1,5 mi) e poi 0,05 mi di una soluzione diossanica della polipropilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l, 3,5-triazina (100 mg/ mi) ottenuta nell'esempio 6. Il peso molecolare medio del gruppo di polipropilen-glicole del derivato di triazina ? 1.000. La miscela viene fatta reagire per 3 ore raffreddando con ghiaccio. Dopo completamento della reazione, la soluzione di reazione viene trasferita in un tubo dializzatore e sottoposta a dialisi per eliminare il derivato di triazina in eccesso. La dialisi ? effettuata sotto raffreddamento con ghiaccio per 4 ore contro un tampone fosfato 0,1M avente pH 7,2. Il

contenuto ? portato a 5 mi con un tampone fosfato e poi imma?

gazzinato allo stato congelato a -80?C. L'urochinasi modifi?

cata con polipropilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazi-

na cos? ottenuta risulta conservare, mediante il procedimento

a piastra di fibrina, una attivit? uguale a 96,4% di quella

dell 'urochinasi di partenza.

Altre urochinasi modificate con polipropilen-glicole/

? 4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina aventi gradi differenti di ?co modificazione vengono ottenute in modo analogo impiegando s ? CO una soluzione diossanica di polipropilen-glicole/4-cloro-6-

idrossi-1,3,5-triazina (100 mg/ml) rispettivamente nelle quan

as tit? di 0,1 e 0,2 mi. Il peso molecolare medio del gruppo

di polipropilen-glicole del derivato di triazina ? 1.000.

Le urochinasi modificate presentano attivit? uguali a 99,3

e 106,8% a paragone con quella dell'urochinasi di partenza

non modificata.

Esempio 18

Urochinasi modificata con polipropilen-glicole/

4-cloro-6-idrossi-l ,3,5-triazina

Urochinasi modificate con polipropilen-glicole/4-clo-

ro-6-idrossi-l ,3,5-triazina aventi gradi differenti di modi?

ficazione vengono ottenute esattamente nello stesso modo del?

l'esempio 3, impiegando una soluzione diossanica contenente

400 mg/ml della polipropilen-glicole/4-cloro-6-idrossi-l,3,5

triazina ottenuta nell'esempio 7 rispettivamente in quantit?

di 0,05, 0,1 e 0,02 mi. Il peso molecolare medio del gruppo

di polietilen-glicole del derivato di triazina ? 4.000. Le

loro attivit? di urochinasi risultano essere, mediante il

procedimento a piastra di fibrina, uguali a 89,7, 100,0 e

98,9% di quella dell'urochinasi di partenza.

Esempio 19

pH Ottimale per l<1>urochinasi modificata, quale

misurato attraverso l'attivit? di amidasi

& oo PEG-DCT-UK ottenuta nell'esempio 9 ed urochinasi non

P CO

modificata vengono diluite, ognuna, con soluzione fisiologica

contenente 0,1% di albumina umana in modo da ottenere due m Si soluzioni di 167 iu/ml. Ognuna delle soluzioni viene divisa

in porzioni di 0,3 mi, che vengono addizionate di tamponi

tris-HCl 50 mM aventi pH differenti {ognuno 1,0 mi) e poi

di un substrato sintetico S-2444 (pyrGlu-Gly -Arg-p-nitroani-

lide fabbricata da Kabi Corporation). Le miscele risultanti

vengono tenute in incubazione a 37?C per 10 minuti. Le rea?

zioni vengono arrestate mediante aggiunta di acido acetico

al 30%. Il loro coefficiente di assorbimento viene misurag>-to a 405 nm. Come risultato, i valori di pH ottimali per PEG-

DCT-UK ed urochinasi non modificata sono, rispettivamente,

8,2 ed 8,5, quali misurati attraverso l'attivit? di amidasi

quando viene impiegato il substrato sintetico S-2444. I ri?

sultati sono riportati nella figura 1.

I valori di pH ottimali per PEG-DCT-L-UK ottenuta nell'esempio 4 e per l'urochinasi di basso peso molecolare non modificata vengono determinati in modo analogo attraverso 1<1 >attivit? di amidasi e risultano essere rispettivamente 8,2 e 8,4. I risultati sono riportati nella figura 2.

Esempio 20

Stabilit? a temperatura ambiente dell'urochinasi modificata

PEG-DCT-UK ottenuta nell'esempio 9 viene diluita ad una concentrazione di 105,3 iu/ml sia con soluzione Ringer sia con soluzione fisiologica. A scopo di confronto, anche l'urochinasi non modificata viene diluita ad una concentrazione di 76,1 iu/ml sia con soluzione Ringer sia con soluzione fisiologica. 3,5 mi di ognuna delle soluzioni cos? diluite vengono lasciati in riposo a tenperatura ambiente (27?C) per 6 ore. L'attivit? di urochinasi residua viene misurata periodicamente mediante il procedimento a piastra di fibrina finch? ? trascorso tale intervallo di 6 ore. L'entit? della perdita di attivit? dell'urochinasi modificata secondo l'invenzione ? di gran lunga inferiore a quella dell'urochinasi non modificata. I risultati sono riportati nella figura 3. Esempio 21

Stabilit? dell<1>urochinasi modificata al trattamento di congelamento e scongelamento

PEG-DCT-L-UK ottenuta nell'esempio 10 viene diluita con soluzione fisiologica fino ad una concentrazione di 200

iu/ml. A scopo di confronto, urochinasi di basso peso moleco?

lare non modificata viene diluita con soluzione fisiologica

fino ad una concentrazione di 200 iu/ml. Ognuna delle soluzio?

ni cos? diluite viene congelata a -80?C e successivamente

scongelata a temperatura ambiente. Le operazioni di congela?

mento e scongelamento vengono ripetute 0, 2, 4 e 6 volte.

L'attivit? residua dell<1>urochinasi viene misurata impieganera do un substrato sintetico S-2444 (fabbricato da Kabi Corpo?

ration). L'entit? della perdita di attivit? dell'urochinasi

? modificata secondo l'invenzione ? estremamente bassa a para?

gone con quella dell'urochinasi di basso peso molecolare non

modificata. I risultati sono riportati nella figura 4.

Esempio 22

Otto conigli maschio sani (Japanese white) aventi

ognuno un peso corporeo di 2,6-3,1 kg vengono suddivisi in

due gruppi. Ad un gruppo vengono somministrate 8.000 iu/kg

di PEG-DCT-UK ed all'altro 8.000 iu/kg di urochinasi non mo?

dificata, entrambe attraverso le vene dell'orecchio. Sangue

viene raccolto dalle vene dell'orecchio prima della sommi?

nistrazione e al momento in cui sono trascorse 1, 2 e 4 ore

dalla somministrazione. I campioni di sangue vengono addizio?

nati di una soluzione di citrato di sodio per separare il

plasma. Dopo eliminazione per 18 giorni delle urochinasi

modificata e non modificata, i due gruppi vengono incrocia

ti tra loro e si effettuano esperimenti analoghi per ottenere campioni di plasma. Una parte di ognuno dei campioni di

plasma cos? ottenuti viene separata e sottoposta a cromatografia di affinit? in colonna impiegando Lysine Sepharose 4B,

ottenendosi cos? una frazione di inibitore di plasmina (frazione F ) ed una frazione di plasmina e plasminogeno (frazione F ). Le variazioni della quantit? di inibitore di plasmina nella frazione F^ con il passare del tempo vengono determinate aggiungendo plasmina alla frazione e misurando la

quantit? di plasmina residua che non ? pregiudicata dall'inibitore, con un substrato sintetico S-2251 (fabbricato da Kabi ? Corporation). L'inibitore di plasmina nel gruppo avente ricevuto PEG-DCT-UK presenta una sua evidente diminuzione e pi?

lento ricupero. Nel gruppo avente ricevuto urochinasi non modificata, la diminuzione dell'inibitore di plasmina ? assai

inferiore e le sue variazioni nel corso del tempo non sono

chiarite. I risultati sono riportati nella figura 5.

Dall'altra parte, la quantit? di plasminogeno nella

frazione F viene determinata aggiungendo urochinasi alla fra-3

zione per produrre plasmina e misurando la quantit? della ? < f e' plasmina cos? prodotta, mediante un substrato sintetico S-2251. Nel gruppo avente ricevuto PEG-DCT-UK, il plasminogeno

diminuisce fino a circa 50% dopo due ore e poi presenta un

ricupero graduale. Invece, nel gruppo avente ricevuto urochinasi non modificata il plasmogeno diminuisce fino a circa

65% dopo un'ora, ma non continua a diminuire ulteriormente.

Si osserva una tendenza al ricupero di plasminogeno persino

due ore dopo la somministrazione. I risultati sono illustra?

ti nella figura 6.

Inoltre, una parte di ogni plasma viene prelevata co?

me campione e trattata con un acido fino a pH 5,2 in modo da

inattivarvi 1'inibitore. Viene poi neutralizzata e la quanti?

t? di plasminogeno presente nel plasma trattato con acido vie?

ne misurata,aggiungendo urochinasi al plasma trattato con a-? cido per produrre plasmina e misurando la quantit? della pla-?2 smine cos? prodotta, impiegando un substrato sintetico S-2251. ,g 3 ?> Nel gruppo avente ricevuto PEG-DCT-UK, il plasminogeno dimi?

nuisce fino a circa 70% dopo due ore, ma presenta successi?

vamente un suo ricupero graduale. Nel gruppo avente ricevuto

urochinasi non modificata, tuttavia, la quantit? di plasmino?

geno diminuisce fino a circa 84% dopo un'ora, ma non diminui?

sce ulteriormente. Successivamente, la quantit? di plasmino?

geno aumenta gradualmente. I risultati sono ugualmente ripor?

tati nella figura 6. Per inciso, nessuna attivit? di plasmi?

na ? rivelata dalla frazione F .

3

Esempio 23

Prodotto liofilizzato adatto per la preparazione

di preparati iniettabili

La soluzione di PEG-DCT-UK ottenuta nell'esempio 9

viene concentrata mediante un filtro a membrana (Amicon Gel:

marchio di fabbrica) e poi addizionata di soluzione fisiologica e di un tampone fosfato 0,05M. La risultante miscela viene filtrata asetticamente impiegando un filtro a membrana.

Il filtrato viene versato per porzioni in fiale sterili e poi

liofilizzato. L'attivit? fibrinolitica del prodotto liofilizzato di PEG-DCT-UK,adatto per la preparazione di preparati

iniettabili,risulta essere 57.000 iu/fiala mediante il procedimento a piastra di fibrina.

Esempio 24

Prodotto liofilizzato adatto per la preparazione

.n ??IJ di preparati iniettabili

La soluzione di PEG-DCT-UK ottenuta nell'esempio 9

viene concentrata mediante un filtro a membrana (Amicon Gel:

marchio di fabbrica) e poi.addizionata di soluzione fisiologica. La risultante miscela viene filtrata asetticamente impiegando un filtro a membrana. Il filtrato viene versato per

porzioni in fiale sterili e poi liofilizzato. L'attivit? fibrinolitica del prodotto liofilizzato cos? ottenuto, di PEG-DCT-UK,adatto per la preparazione di preparati iniettabili

risulta, mediante il procedimento a piastra di fibrina, uguale a 67.000 iu/fiala.

L'invenzione essendo ora stata completamente descritta, sar? evidente al comune esperto del ramo che molti cambiamenti e modifiche vi possono essere apportati senza scostarsi

dallo spirito o dall'ambito dell'invenzione quale qui esposta.

Claims (1)

1. RIVENDICAZIONI

   1 . Derivato di un attivatore di plasminogeno non immuno-

   genico di origine umana, comprendente almeno un polialchilen-

   glicole legato,con almeno un agente di accoppiamento,alle ca?

   tene laterali di amminoacido di detto attivatore di plasmino?

   geno, detto polialchilen-glicole avendo peso molecolare situa?

   to nell'intervallo di 200 a 20.000 e contenendo facoltativa?

   mente uno o pi? gruppi alchilici e/o alcanoilici come gruppi

   sostituenti. Cn3 rat 3 2. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui detto

   attivatore di plasminogeno ? 1'urochinasi.

   e> 3. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui detto

   5 polialchilen-glicole ? scelto nel gruppo costituito da un po-

   lietilen? e da un polipropilen?glicole,che possono facoltati?

   vamente contenere uno o pi? gruppi alchilici e/o alcanoilici

   come gruppi sostituenti.

   4. Derivato secondo le rivendicazioni 1 o 3, in cui det?

   to polialchilen-glicole ? un monoalchil-etere di polietilen-

   glicole.

   5. Derivato secondo le rivendicazioni 1 o 3, in cui det?

   to polialchilen-glicole ? un polipropilen-glicole.

   6. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui detto

   polialchilen-glicole ha peso molecolare situato nell'interval?

   lo di 500 a 10.000.

   7. Derivato secondo la rivendicazione 1, in cui detto

   agente di accoppiamento ? un alogenuro di acido cianurico.

   8. Urochinasi modificata con monometil-etere-polietilen?

   glicole/4,6-dicloro-l,3,5-triazina, il cui gruppo di polieti-

   len-glicole ha peso molecolare medio 5.000.

   9. Urochinasi modificata con polipropilen-glicole/4-clo-

   ro-6-idrossi-l, 3,5-triazina, il cui gruppo di polipropilen-

   glicole ha peso molecolare medio 4.000.

   10. Procedimento per la preparazione di un derivato di

   un attivatore di plasminogeno non immunogenico di origine umagoCk na,che comprende lo stadio di fare reagire con un attivatore

   ISco di plasminogeno un prodotto accoppiato di almeno un polialchi- <?>a len-glicole e di almeno un agente di accoppiamento, detto po-

   lialchilen-glicole avendo peso molecolare situato nell'inter?

   vallo compreso tra 200 e 20.000 e contenendo facoltativamente,

   come gruppi sostituenti, uno o pi? gruppi alchilici e/o alca-

   noilici .

   11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui det?

   to attivatore di plasminogeno ? 1<1>urochinasi.

   12. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui det?

   to prodotto accoppiato e detto attivatore di plasminogeno ven?

   gono fatti reagire in condizioni tali che quest'ultimo attiva?

   tore non perda la sua attivit? fisiologica.

   13. Agente trombolitico comprendente un derivato di un at?

   tivatore di plasminogeno non immunogenico di origine umana secondo la rivendicazione 1. O INCARICO