JPH06279318A - 水溶性重合体含有試薬 - Google Patents

水溶性重合体含有試薬

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JPH06279318A
JPH06279318A JP6023584A JP2358494A JPH06279318A JP H06279318 A JPH06279318 A JP H06279318A JP 6023584 A JP6023584 A JP 6023584A JP 2358494 A JP2358494 A JP 2358494A JP H06279318 A JPH06279318 A JP H06279318A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 生体内で徐々に蛋白質を放出する水溶性重合
体−蛋白質結合体を製造するための原料化合物である水
溶性重合体含有試薬を提供する。 【構成】 蛋白質アミノ基又はその誘導体と反応して可
逆性結合基を形成しうる基よりなる水溶性重合体試薬。 【効果】 上記結合体を製造できる。この結合体は、人
に投与されたとき臨床上有用な速度で生体内の条件で崩
壊し、本来の蛋白質を放出するので、その活性が損なわ
れることはなく、本来の蛋白質活性を保持したまま、抗
原性、クリアランスの抑制を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は製薬上有用な蛋白質の共
役物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を製造するための原料化
合物である水溶性重合体含有試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質及び水溶性重合体の共役物は広い
範囲の製薬上の目的に製造されてきている。１個以上の
重合体分子の付着は通常蛋白質と他の巨大分子又は細胞
との相互反応を妨害する効果を有する。従って蛋白質の
抗原性はアレルゲン性が消失するか又は血流からのその
クレアランスが延長される。例えばウロキナーゼのプラ
ズマ・クレアランスはメトキシポリエチレングリコール
の不可逆性付着により延長される。又は共役物は新規な
性質を有してもよく例えばヨーロッパ特許第０，０３
８，１５４号は免疫抑制性を有するポリザルコシンとア
レルゲンとの共役物を開示している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】クリアランスを遅延さ
せるか又は抗原性を低下させる蛋白質への重合体の付着
は低分子量の基質に作用する蛋白質通常酵素にとり最も
用いられる。もし治療上の効果をもたらすために蛋白質
が巨大分子又は細胞に結合した基質へ作用する必要があ
るならば重合体の付着がこの相互反応を妨害して活性の
損失をもたらすことが予想されよう。このような効果は
ストレプキナーゼ及びポリエチレングリコールについて
示されてきておりその際減少した抗原性がフイブリン溶
解活性の低下によってのみ達成された。しばしばたとえ
ばもし蛋白質が低分子量の基質に作用するならば重合体
の付着による活性の低下に出合う。
【０００４】
【問題点を解決するための手段】本発明によれば、可逆
的結合基により少なくとも１種の水溶性重合体に結合し
た製薬上有用な蛋白質よりなる共役物を製造するための
原料化合物である、蛋白質アミノ基又はその誘導体と反
応して可逆性結合基を形成しうる基よりなる水溶性重合
体含有試薬が提供される。
【０００５】本明細書に用いられるとき用語「製薬上有
用な蛋白質（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｕｓ
ｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とはヒト又は動物の体に
治療的又は薬理学上の効果をもたらす蛋白質を意味す
る。
【０００６】用語「可逆性結合基（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌ
ｅ ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」とは臨床上有用な
速度で生体内の条件下で崩壊される結合を意味する。適
当には結合基の崩壊の凝一次速度定数は１０-6〜１０-3
／秒の範囲内にあるだろう。
【０００７】このタイプの共役物は活性蛋白質の徐放性
をもたらす。
【０００８】共役物は一般式（Ｉ）化３
【０００９】
【化３】Ｐ−Ｌ−Ｘ （Ｉ）
【００１０】（式中Ｐは水溶性重合体であり；Ｌは可逆
性結合基であり；そしてＸは製薬上有用な蛋白質であ
る）により示されよう。
【００１１】このやり方で蛋白質に結合しそして望まし
くない性質（例えば抗原性、早いクリアランス）を除く
水溶性重合体の分子の数は蛋白質の性質に依存しそして
通常の方法により求められうる。しかし重合体分子の可
逆性結合による蛋白質の変性の度（即ち蛋白質に結合し
た重合体分子の数）は不可逆性重合体蛋白質共役物の場
合よりも重要ではない。
【００１２】それぞれの蛋白質分子はそれに付着した１
個よりも多い結合基を有しそしてそれぞれの結合基はそ
れに付着した１個より多い水溶性重合体を有しよう。
【００１３】水溶性重合体（Ｐ）の分子量は好ましくは
５００〜１０6 の範囲そして最も好ましくは２０００〜
２００００の範囲内になければならない。
【００１４】適当な水溶性重合体（Ｐ）の例はポリアミ
ノ酸又はポリイミノ酸例えばポリサルコシン、ポリ−
Ｄ，Ｌ−アラニン、ポリヒドロキシプロリン又は多糖類
及びそれらの誘導体例えばデキストラン、ヒドロキシエ
チルでん粉又はフイコル（Ｆｉｃｏｌｌ）又は誘導され
ていてもよい合成重合体例えばポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコール、ポリビニルピロリド
ン、ポリビニルアルコール又はポリアクリルアミドを含
む。
【００１５】適当には水溶性重合体（Ｐ）はメトキシポ
リエチレングリコールである。
【００１６】製薬上有用な蛋白質（Ｘ）は酵素、前酵素
又は非酵素性蛋白質でよい。
【００１７】適当な非酵素性蛋白質はインターフェロ
ン、リンホキン特にインターロイキン−２、スタヒロコ
ツカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ）からのプロテイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ）
Ａ、又はホルモン例えばインシュリン、成長ホルモン又
はワクチン例えばアレルゲン抽出物で用いられる蛋白質
又はウイルス被覆蛋白質を含む。
【００１８】製薬上有用な蛋白質（Ｘ）は酵素又は前酵
素である例は止血薬に含まれるプロテアーゼ（それらの
前酵素とともに）、フイブリン分解酵素及びそれらの前
酵素、アルギナーゼ、ウリカーゼ、アスパラギナーゼ、
グルタミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ及び種
々の酵素欠乏疾患にかかっている患者に存在しない酵素
例えばヘキソサミニダーゼＡ及びグルコセレブロシター
ゼを含む。
【００１９】特に好ましい態様において製薬上有用な蛋
白質（Ｘ）はフイブリン溶解酵素（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙ
ｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）又はその前酵素（ｐｒｏ−ｅｎ
ｚｙｍｅ）である。
【００２０】本明細書に用いられる用語「フイブリン溶
解酵素」とはヨーロッパ特許第０，００９，８７９号
（米国特許第４２８５９３２号）に規定されている生体
内のフイブリン溶解活性を示す任意の酵素を意味する。
【００２１】これらの酵素は組織培養、血液、尿又は組
織からの抽出により又は組み換えＤＮＡ法により製造さ
れよう。
【００２２】これら酵素の例は組織プラスミノーゲン活
性剤例えばメラノーマプラスミノーゲン活性剤を含むプ
ラスミノーゲン活性剤、ウロキナーゼ（高分子量及び低
分子量の両者及び単鎖の形）、そしてストレプトキナー
ゼとプラスミンとの複合体である。
【００２３】適当な前酵素は前ウロキナーゼ及び前組織
プラスミノーゲン活性剤を含む。
【００２４】フイブリン溶解酵素及びその前酵素として
上記に規定された製薬上有用な蛋白質の群は又以下のも
のを含む。
【００２５】（ａ）ヨーロッパ公開出願第０１５５３８
７号に開示されたフイブリン溶解活性ハイブリッド蛋白
質； （ｂ）ヨーロッパ公開出願第０１５５３８８号に開示さ
れたフイブリン溶解酵素の誘導体；そして （ｃ）ヨーロッパ公開出願第０１５２７３６号に開示さ
れた蛋白質共役物。
【００２６】フイブリン溶解酵素は任意にヨーロッパ特
許第０，００９，８７９号（米国特許第４２８５９３２
号）に記載されたようにそれらの活性中心でブロックさ
れていてもよい。
【００２７】結合基（Ｌ）はその結合が臨床上有用な速
度で生体内の条件下で破壊されるようなものである。
【００２８】結合基（Ｌ）の開裂は加水分解により又は
分子間再配置により生じよう。それは結合基（Ｌ）それ
自体の中で又は重合体と又は蛋白質との結合基（Ｌ）の
境界で生じよう。
【００２９】好ましくは開裂は未変性の蛋白質を生じさ
せなければならない。
【００３０】適当な結合基（Ｌ）は置換されたマレイン
酸に基く。
【００３１】形成された共役物は一般式（ＩＩ）化４
【００３２】
【化４】
【００３３】〔式中Ｘは前記同様でありそしてＮＨ部分
はＸの蛋白質アミノ基から誘導され；そして（ｉ）Ｒ1
及びＲ2 はそれぞれ非重合性有機基又は式−Ｒ3 −Ｐ
（式中Ｐは前記同様でありＲ3 は橋かけ基である）の基
であるか；又は（ｉｉ）Ｒ1 及びＲ2 は一緒になってＣ
3 〜5 ポリメチレンであって５−〜７−員脂環族環を完
成するか又は一緒になって芳香族環を完成しその際脂環
族又は芳香族の環は基Ｒ4 及びＲ5 （式中それぞれ非重
合性有機基又は式−Ｒ3 −Ｐの基である）により置換さ
れ；そしてＲ1 及びＲ2 の少なくとも１個又はＲ4 及び
Ｒ5 の少なくとも１個は基−Ｒ3 −Ｐである〕により示
されうる。
【００３４】ｐＨ７．４及び３７℃の生理学的な条件を
含む中性及び酸性溶液中で式（ＩＩ）の共役物中のＣＯ
−ＮＨ結合は隣接するカルボキシル基により促進される
方法により加水分解されそれにより未変性の蛋白質を生
じさせる。脱アシル化の速度は二重結合に近い原子に依
存しその性質は脱アシル化速度が劣ったように変化され
ないならば重要ではない。
【００３５】適当な橋かけ基Ｒ3 の例は直鎖又は枝分れ
鎖のＣ1 〜10脂肪族炭化水素鎖を含みそれは任意にアミ
ン又はエステル部分により又は酵素、硫黄又は窒素から
選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子により中断又は終
了してもよく任意にＣ1 〜6アルキル基により置換され
ていてもよい。
【００３６】好ましくはＲ3 は二重結合に隣接した電子
供与部分例えばメチレンを含む。
【００３７】適当な基−Ｒ3 −Ｐの例はＰ−（ＣＨ2 ）
ｎ−、ＰＯ（ＣＨ2 ）ｎ−、ＰＯ−、Ｐ（ＣＨ2 ）ｎＯ
−、ＰＣＨ（ＣＨ3 ）−、ＰＣ（ＣＨ3 ）2 −、ＰＯＣ
ＣＨ（ＣＨ3 ）−又はＰＯＣ（ＣＨ3 ）2 −（式中ｎは
１〜６の整数である）を含む。
【００３８】Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ4 及びＲ5 に関する適当な
非重合性有機基は任意にＣ1 〜6 アルキル基により置換
されていてもよく酵素、硫黄又は窒素から選ばれたヘテ
ロ原子により中断又は末端におかれてもよい脂肪族Ｃ1
〜10炭化水素基を含む。
【００３９】好ましくは非重合性有機基は二重結合に隣
接する電子供与部分例えばメチレン又はメチルを含む。
【００４０】Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ4 及びＲ5 に関するこれら
の基の例はＲ6 、Ｒ6 −Ｏ−又は（Ｒ6 ）2 Ｎ−（式中
Ｒ6 は直鎖又は枝分れ鎖のＣ1 〜6 アルキルである）を
含む。
【００４１】特にＲ1 、Ｒ2 、Ｒ4 又はＲ5 はＣＨ3 、
ＣＨ3 ＣＨ2 −、（ＣＨ3 ）2 ＣＨ−、ＣＨ3 ＣＨ2 Ｃ
Ｈ2 −、（ＣＨ3 ）3 Ｃ−、ＣＨ3 Ｏ−、ＣＨ3 ＣＨ2
Ｏ−又は（ＣＨ3 ）2 Ｎ−であろう。
【００４２】Ｒ1 及びＲ2 がそれぞれ非重合性有機基又
は前述の式−Ｒ3 −Ｐの基であり少なくとも１個のＲ1
及びＲ2 が基−Ｒ3 −Ｐである式（ＩＩＡ）の式（Ｉ
Ｉ）内の共役物の下位群がある。
【００４３】式（ＩＩＡ）の共役物に好ましくはＲ1 及
びＲ2 の１個は基Ｐ−ＣＨ2 −であって他はメチルであ
る。
【００４４】Ｒ1 及びＲ2 が一緒になって結合している
式（ＩＩ）の共役物の例は式（ＩＩＢ）化５
【００４５】
【化５】
【００４６】（式中ｒ，ｓ及びｔはそれぞれ独立して
０，１又は２であってｒ＋ｓ＋ｔは０より大きくそして
４より小さく即ち１〜３の整数でありＲ4 及びＲ5 は前
記同様である）の環状構造を含む。
【００４７】又Ｒ1 及びＲ2 は一緒に結合して芳香族構
造を形成しよう。式（ＩＩ）のこのような共役物の例は
式（ＩＩＣ）化６
【００４８】
【化６】
【００４９】（式中Ｒ4 及びＲ5 は式（ＩＩ）に関して
規定した通りである）の共役物を含む。
【００５０】式（ＩＩＢ）及び（ＩＩＣ）のＲ4 又はＲ
4 に関するこのような非重合性有機基は式（ＩＩ）につ
いて上述したものを含む。
【００５１】さらに蛋白質アミノ基又はその誘導基と反
応して前述の可逆性結合基を形成しうる基よりなる水溶
性重合体含有試薬と製薬上有用な蛋白質とを反応させる
ことよりなる前記の共役物を製造する方法が提供され
る。
【００５２】重合体含有試薬は式（ＩＩＩ）化７
【００５３】
【化７】 Ｐ−Ｌ1 （ＩＩＩ）
【００５４】（式中Ｐは前記同様でありそしてＬ1 は前
述の如く結合基（Ｌ）を形成しうる基である）により示
されよう。
【００５５】共役物を製造するのに用いられる条件は重
合性試薬及び蛋白質の性質及び形成される結合の安定性
に依存しそして当業者に明らかであろう。
【００５６】適当には蛋白質は好ましくは中程度のアル
カリ性ｐＨ例えばｐＨ７．０〜９．５及び０〜４０℃の
範囲内の温度で水性緩衝液中に溶解される。ｐＨは反応
中手動又は自動の何れかでもし必要ならば酸又は塩基の
添加によりコントロールされよう。
【００５７】用いられる水溶性重合体含有試薬〔式（Ｉ
ＩＩ）〕の量は蛋白質に付着するようになる重合体分子
の数をきめる。少なくとも１モル過剰の試薬〔式（ＩＩ
Ｉ）〕を加えなければならない。
【００５８】反応が完了した後過剰の試薬及び望ましく
ない反応生成物は除去されよう。適当な除去法は硫酸ア
ンモニウム沈殿、透析、透析濾過又は多数のクロマトグ
ラフィ法例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィ、疏水性相互反応クロマトグラフィ又はアフイニテイ
クロマトグラフィを含む。
【００５９】フイブリン溶解酵素及び他のセリンプロテ
アーゼについてベンズアミジンセフアロース（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）のアフイニテイクロマトグラフィが特に好
ましい方法である。
【００６０】フイブリン溶解酵素についてそれらの活性
中心の任意のブロッキングが重合体共役反応の前又は後
に行われよう。
【００６１】式（ＩＩ）の共役物に示された結合のタイ
プは適当には式（ＩＶ）化８
【００６２】
【化８】
【００６３】（式中Ｒ1 及びＲ2 は前記同様である）の
試薬と製薬上有用な蛋白質のアミノ基との反応により得
られる。
【００６４】蛋白質アミノ基は原則として何れかのカル
ボニル基と反応するので形成された式（ＩＩ）の共役物
がもしＲ1 ＝Ｒ2 ならば結合で異性を示すことは理解さ
れよう。
【００６５】式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）の試薬は新規で
ありそしてそれ自体本発明の一部を形成する。
【００６６】式（ＩＶ）の試薬は式（ＩＶＡ）化９
【００６７】
【化９】
【００６８】〔式中Ａ1 及びＡ2 はそれぞれヒドロキシ
基であるか又は一緒になって−Ｏ−でありＢ1 及びＢ2
は一緒なって結合であるか又は結合を形成するため除去
可能な基でありそして（ｉ）Ｒ′1 及びＲ′2 はそれぞ
れ前述の非重合性有機基又は基Ｘであり；又は（ｉｉ）
Ｒ′1 及びＲ′2 は一緒になってＣ3 〜5 ポリメチレン
となって５−〜７−員脂環族環を完成するか又は一緒に
なって芳香族環を完成しその際脂環族又は芳香族の環は
基Ｒ′4 及びＲ′5 （それぞれ前述の非重合性有機基又
は基Ｘである）により置換され少なくとも１個のＲ′1
及びＲ′2 又は少なくとも１個のＲ′4 及びＲ′5 は基
Ｘである〕の化合物と化合物ＰＹ（式（ＩＶＢ）（式中
Ｐは前記同様であり；基Ｘ及びＹは一緒に反応して橋か
け基Ｒ3 を形成しうる基である）とを反応させ；そして
次にＡ1 及びＡ2 がそれぞれヒドロキシのとき反応の生
成物を脱水する及び／又はＢ1 及びＢ2 が除去可能な基
のとき反応の生成物を除去することにより製造されよ
う。
【００６９】好ましくは式（ＩＶＡ）の化合物において
基Ａ1 及びＡ2 は一緒になって−Ｏ−でありそして基Ｂ
1 及びＢ2 は一緒になって結合である。
【００７０】基Ｘ及びＹの性質及び従って用いられる反
応条件はもたらされる橋かけ基Ｒ3により決められる。
【００７１】橋かけ基が前述のヘテロ原子を含む脂肪族
炭化水素鎖のとき基Ｙ及びＸはそれぞれ適切な長さの炭
化水素鎖であってそれぞれ適切な求核性ヘテロ原子Ｏ，
Ｓ又はＮ及び適当な脱離基例えばハロゲン（好ましくは
臭素又は沃素）、メタンスルホニル又は４−トルエンス
ルホニルを末端に有する。橋かけ基Ｒ3 が脂肪族炭化水
素鎖のとき基Ｙは重合体Ｐ上の末端求核性ヘテロ原子で
ありそして基Ｘは適当な脱離基により誘導された対応す
る炭化水素鎖である。これらの場合の脱離基の求核性置
換の反応条件は従来行われているものでありそして主と
して重合体により決定されよう。それ故求核基が−Ｏで
あるとき反応は反応が完了するまで乾燥窒素の雰囲気下
任意の非極性溶媒中で行われよう。
【００７２】橋かけ基がアミド又はエステル部分を含む
脂肪族炭化水素鎖のとき基Ｘ及びＹはそれぞれ適切な長
さの炭化水素鎖であり末端の一つはカルボキシル基であ
り他はヒドロキシル又はアミノ基である。反応条件はエ
ステル又はアミド結合の形成に従来用いられている条件
であり例えば適当な活性剤例えばジシクロヘキシルカル
ボジイミドにより非水性条件下で酸を活性化しそして次
に適切なアルコール又はアミンと反応させる。
【００７３】式（ＩＶＢ）の化合物を得る重合体Ｐの誘
導体化は式（ＩＶＡ）の化合物の製造と同じく従来行わ
れている方法により行われよう。
【００７４】式（ＩＶ）の特に適当な試薬は式（Ｖ）化
１０
【００７５】
【化１０】
【００７６】（式中Ｐは前記同様である）の無水物であ
る。
【００７７】結合基（Ｌ）への水溶性重合体（Ｐ）の付
着の態様は重合体の化学的な性質に依存しよう。従って
もしＰが式（Ｖ）のメトキシポリエチレングリコールな
らば試薬は適当には式（ＶＩ）化１１のものである。
【００７８】
【化１１】
【００７９】もし重合体がポリザルコシンのとき適当な
試薬は式（ＶＩＩ）化１２のものである。
【００８０】
【化１２】
【００８１】式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）においてｎ及び
ｍはそれぞれ重合体の分子量が上述の範囲内に入るよう
な整数である。
【００８２】他の重合体は結合基への適当な接続がなさ
れうる前に従来行われている方法で誘導体化されねばな
らないだろう。
【００８３】式（ＩＶ）の他の適当な試薬は式（ＶＩＩ
Ｉ）化１３
【００８４】
【化１３】
【００８５】（式中Ｐは前記同様である）の無水物であ
る。
【００８６】Ｐ基の付着の態様は式（ＩＶ）について前
述した通りであろう。
【００８７】蛋白質共役物は好ましくは製薬組成物とし
て投与される。
【００８８】従って又製薬上許容される担体と組み合わ
された共役物よりなる製薬組成物を提供する。
【００８９】組成物は一般に処方された蛋白質それ自体
と同一又は同様な方法で処方されよう。これは錠剤、カ
プセル、クリーム、シロップ、懸濁液、溶液、再生可能
な粉末及び注射又は灌流に適した滅菌物を含むだろう。
このような組成物は従来行われている製薬上の実際上の
やり方に従って製薬上許容しうる物質例えば希釈剤、結
合剤、着色剤、香料、保存剤、崩壊剤などを含みうる。
【００９０】組成物中の蛋白質は通常それが従来用いら
れる量に近い量で投与されよう。ｍｇ／ｋｇ投与量はそ
れに結合した重合体分子及び共役物の能力及びファマー
コキネテイックスを考慮に入れて適切にそれより多く調
節される。
【００９１】製薬上有用な蛋白質（Ｘ）がフイブリン溶
解酵素のとき組成物はヒトへの静脈内投与に適した製薬
組成物と同じく従来行われている方法に従って処方され
る。
【００９２】代表的には静脈内投与用の組成物は滅菌等
張性水性緩衝液中の滅菌誘導体の溶液である。必要なら
ば組成物は又共役物を溶液として保つ溶解剤及び注射の
部位の痛みを和らげる局所麻酔例えばリグノカインを含
んでもよい。一般に共役物は単位投与物の形で投与され
そして例えば遊離の蛋白質が遊離される時間を指示する
と同時に活性単位で蛋白質の量を示す熱的にシールされ
た容器例えばアンプル又はパック中の乾燥粉末又は水の
ない濃縮物である。共役物が灌流により投与されるとき
それは滅菌の製薬上の品質「注射用水」又は生理食塩水
を含む灌流瓶により供給されよう。共役物が注射により
投与されるときそれは注射用の滅菌水のアンプルにより
供給されよう。注射用又は灌流用の組成物は投与前に成
分を混合することにより作られよう。
【００９３】投与の正確な量及び投与の態様は治療を行
う医者によって環境に従って必ず患者の状態に応じて決
定されねばならない。しかし、一般にフイブリン溶解共
役物により血栓症を治療する患者は一般に灌流により又
は５回以内の注射により０．００１〜３．０ｍｇ／ｋｇ
体重の蛋白質投与に等しい１日当たりの投与量を得る。
好ましい投与量は５０〜１００ｍｇ／日である。
【００９４】どんな毒性も認められなかったし又は上述
の投与範囲では示されない。
【００９５】他の態様によれば患者に有効且つ非毒性の
量の蛋白質共役物を投与することよりなる前述の製薬上
有用な蛋白質を必要とする患者を治療する方法が提供さ
れる。
【００９６】特に患者に有効且つ非毒性量の前述のフイ
ブリン溶解酵素共役物を投与することよりなる血栓症疾
患を治療する方法が提供される。
【００９７】又活性の治療物質として用いられる共役物
を提供する。さらに製薬上有用な蛋白質が活性治療物質
として用いられそして特に血栓症疾患の治療に用いられ
るフイブリン溶解酵素又は前酵素である共役物を提供す
る。
【００９８】
【実施例】下記の実施例は本発明を説明する。
【００９９】下記の実施例において結合基において蛋白
質について２個の潜在的な結合点（即ち無水マレイン酸
誘導体の２個のカルボキシル基）が存在することに注意
すべきであり、そして簡便のために２個の潜在的異性体
の中１個のみが名指しされそして説明されているが両者
の間を区別する試みはなされなかった。
【０１００】添付書面において 第１図：Ｇ３０００ ＳＷ ＨＰＬＣ溶離プロフィル
（ＯＤ280 ） ａ）ＨＳＡ（若干の二重体を含む） ｂ）ＰＥＧ−ＨＳＡ反応混合物（実施例２） ｃ）ｐＨ５．０、３７℃、２時間の加水分解後のＰＥＧ
−ＨＳＡピーク。
【０１０１】第２図：Ｇ３０００ ＳＷ ＨＰＬＣ溶離
プロフィル（ＯＤ280 、125 Ｉ） ａ）ウロキナーゼ（高分子量） ｂ）ＰＥＧ−ＵＫ反応混合物（実施例２） ｃ）３日間ＲＴで加水分解後のＰＥＧ−ＵＫ。 −ｘ−ｘは125 Ｉプロフィルを示す。
【０１０２】第３図：下記の分析ｈｐｌｃゲル濾過溶離
プロフィル： ａ）ｔＰＡ ｂ）ＰＥＧ−ｔＰＡ共役物（実施例４） ｃ）３７℃２１時間後の共役物 ｄ）３７℃４４時間後の共役物。 見掛け上の分子量はバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）標準
物による較正曲線から求められる。
【０１０３】第４図：ウロキナーゼ（■）及びＰＥＧ−
ウロキナーゼ（実施例３、●）による生体外のヒト血塊
溶解の時間の経過。
【０１０４】第５図：モルモットの血流からのフイブリ
ン溶解活性のクリアランス。○はＰＥＧ−ウロキナーゼ
（実施例３）（ｎ＝４）であり、△はウロキナーゼ（ｎ
＝４）である。
【０１０５】
【実施例１】 ２−（メトキシポリエチレン（５０００）グリコキシメ
チレン）−３−メチル無水マレイン酸の製造
【０１０６】（ｉ）乾燥且つ再蒸留した四塩化炭素（３
０ｍリットル）中の２，３−ジメチル無水マレイン酸
（２．０ｇ、１５．９ｍモル）にＮ−ブロモサクシンイ
ミド（５．７２ｇ、３２ｍモル）及び過酸化ベンゾイル
（５ｍｇ）を加えた。攪拌した混合物を２２時間温和な
還流下加熱した。溶液を放置して冷却しそして濾過蒸発
させて褐色の油（２．９７ｇ）を得た。これをバルク対
バルクの蒸留（１ｍｍＨｇ、１７０℃）にかけて淡緑色
の油（１．４０ｇ）を得た。これは１Ｈｎｍｒにより〜
８５％の所望のモノブロモ誘導体であることが示され
た。少量の痕跡のジブロモ化及び未ブロモ化物質が又存
在していることが分かったがこれらは容易に除去され得
ないので物質は他の変換において単離されて用いられ
た。
【０１０７】1 Ｈｎｍｒ（ＣＤＣｌ3 ）δ４．２（ＣＨ
2 Ｂｒジ置換物質）、４．１（ＣＨ 2 Ｂｒモノ置換物
質）、２．２（ＣＨ 3 モノ置換物質）、２．２（ＣＨ 3
未置換）。
【０１０８】（ｉｉ）乾燥したメトキシポリエチレング
リコール（５０００）（１１．７ｇ、２．３４ｍモル）
をベンゼン（１５０ｍリットル）中のナトリウムアミド
（９１ｍｇ、２．３４ｍモル）の攪拌した混合物に加え
た。ブロモメチル無水物（４８０ｍｇ、２．３４ｍモ
ル）を加えた。反応物を２２時間還流下攪拌した。冷却
して溶液を濾過し石油エーテル（６００ｍリットル）を
加えた。沈殿した固体を濾過し減圧乾燥してワックス
（１０ｇ）を得た。これは位相差赤外線分光分析により
所望の化合物を含有することが示された。少しの又は全
く開環は検知されなかった。構造の他の特徴はＮａＯＨ
による加水分解されたサンプルの滴定により求められ
た。１．０８モル無水物／モルＰＥＧが検知された。
【０１０９】
【実施例２】 ２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキシメチレ
ン〕，３−メチルマレイル−ヒト血清アルブミン化１４
の製造
【０１１０】
【化１４】
【０１１１】室温において０．１Ｍピロ燐酸ナトリウム
／ＨＣｌ、０．０１％ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）８０、
ｐＨ７．４緩衝液（２．０ｍリットル）中のＨＳＡ〔シ
グマ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍｇ〕の攪拌した溶液に２−
（メトキシポリエチレン（５０００）グリコキシメチレ
ン）−３−メチル無水マレイン酸（４００ｍｇ）を加え
０．１Ｍ ＮａＯＨの添加によりｐＨを８．０に保っ
た。塩基の吸収が終わった後に一部をＨＰＬＣゲル濾過
により分析した。変性したＨＳＡがアルブミン二重体の
見掛け上の分子量即ち１３０，０００に相当する広いピ
ークとして溶離した（第１ｂ図）。関係のある画分を集
めた。
【０１１２】脱アシル化がｐＨ５．０で一層早いので可
逆性をｐＨ５．０で調べた。共役物の集まりの一部を希
ＨＣｌによりｐＨ５．０に調節し３７℃に置いた。２時
間後一部をＨＰＬＣにより分析した。第１ｃ図は殆んど
完全な可逆性が達成されたことを示す。
【０１１３】
【実施例３】 ２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキシメチレ
ン〕，３−メチルマレイル−ウロキナーゼ化１５の製造
【０１１４】
【化１５】
【０１１５】（ｉ）０℃において０．１Ｍピロ燐酸ナト
リウム／ＨＣｌ、０．０１％ツウィーン８０、ｐＨ８．
０緩衝液（０．５ｍリットル）中のウロキナーゼ〔セロ
ノ（Ｓｅｒｏｎｏ）、高分子量、１．８ｍｇ／ｍリット
ル〕及び〔125 Ｉ〕ウロキナーゼ（０．２μＣｉ）の攪
拌した溶液に２−（メトキシポリエチレン（５０００）
グリコキシメチレン）−３−メチル無水マレイン酸（１
００ｍｇ）を加え０．１Ｍ ＮａＯＨの添加によりｐＨ
を８．０に保った。反応後プラスミノーゲン活性化定量
の活性は元の活性の約４４％であることが分かった。発
色基質活性は殆んど変化しなかった。反応混合物を４℃
でセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６ＢＣＬのカラ
ム（５．１ｍリットル）に適用しそして０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ4 、
０．０１％ツゥイーン８０、ｐＨ７．４により平衡化し
た。共役物はカラムの容量後溶離する広いピークとして
溶離した。関連のある画分を集めそして共役物を−４０
℃で凍結保存した。
【０１１６】共役物の一部をＨＰＬＣゲル濾過により分
析した。放射能プロフィルは約１６０，０００の見掛け
上の分子量で溶離する広いピークを示した（第２ｂ
図）。３日間室温に置かれた共役物の一部は平均分子量
が殆んど遊離のウロキナーゼのそれに実質的に低下した
が（第２ｃ図）明らかにこれらの条件下では１００％の
可逆性が得られなかった。
【０１１７】変性の可逆性は又プラスミノーゲン活性定
量を用いても定量された。共役物の一部に２０％になる
ようにグリセロールを加えそして溶液を３７℃に置い
た。一部ずつを間隔を置いて定量した。活性の回収は３
×１０-5／秒の凝第一次速度定数の大略第一次速度論に
従った。
【０１１８】（ｉｉ）二番目の製造は次の如く行われ
た。
【０１１９】ウロキナーゼ（セロノ、５ｍｇ）を室温で
ピロ燐酸塩緩衝液（１．２ｍリットル）に溶解させそし
て試薬を攪拌しつつ約２分間にわたって３×２５０ｍｇ
ずつ加えた。ｐＨを０．５Ｍ ＮａＯＨの添加により
８．０に保った。塩基の吸収が終わった後に溶液を０．
０５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ4 、０．１ＭＮ
ａＣｌ、０．０１％ツゥイーン８０ｐＨ７．４により平
衡されたベンズアミジンセファロースのカラム（９．５
ｍｍ×１１ｃｍベッド重量）に適用した。過剰（加水分
解された）の試薬を溶離した後緩衝液を０．５Ｍアルギ
ニン、０．５ＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリスヒドロキシメ
チルアミノメタン、ｐＨ７．４に変えると変性したウロ
キナーゼが単一のピークとして溶離した。
【０１２０】分析用ＨＰＬＣは見掛け上の平均分子量１
４０，０００を有する広い共役されたピーク（画分の発
色基質定量による）を示した。
【０１２１】
【実施例４】２−〔ω−メトキシポリエチレングリコキ
シメチレン〕，３−メチルマレイル−組織プラスミノー
ゲン活性剤０．０２Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰＯ
4 、０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ４−グアニジノ酪
酸、０．０１％ツゥイーン８０、ｐＨ７．４中の組織プ
ラスミノーゲン活性剤（ｔ−ＰＡ）の溶液を亜鉛キレー
トクロマトグラフィ、リジン・セフアロース上のアフイ
ニテイ・クロマトグラフィ、セフアデックスＧ２５のゲ
ル濾過、再びリジン・セフアロースクロマトグラフィ、
ＰＥＧ透析、セフアデックスＧ２５のゲル濾過そして再
びＰＥＧ透析により培養されたヒトメラノーマ細胞上澄
み液から濃度１２０，０００ＳＵ／ｍリットル（約１ｍ
ｇ／ｍリットル）で得た。この溶液（１ｍリットル）を
次にセフアデックスＧ２５Ｍ〔ＰＤ−１０、ファーマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）〕ゲル濾過して０．１Ｍ４−
グアニジノ酪酸及び０．０１％ツウィーン８０を含む
０．１Ｍピロ燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０（１．５
ｍリットル）へ落とした。溶液を室温で充分に攪拌しそ
して２−（メトキシポリエチレン（５０００）グリコキ
シメチレン）−３−メチル無水マレイン酸を２５０ｍｇ
ずつ３回約２分間の間隔で加えその間オートビューレッ
ト〔ラジオメータ（Ｒａｄｉｏ−ｍｅｔｅｒ）〕から
０．２Ｍ ＮａＯＨの添加によりｐＨを８．０に保っ
た。塩基の吸収が終わった後に溶液をセフアデックスＧ
２５Ｍ（２本のＰＤ−１０カラム）を用いて４℃でゲル
濾過して０．０５Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ／Ｎａ2 ＨＰ
Ｏ4 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ツウィーン８
０、ｐＨ７．４に入れ次に同じ緩衝液により平衡にした
ベンズアミジンセフアロースのカラム（９．５ｍｍ×１
１ｃｍベッド）に適用した。
【０１２２】過剰の（加水分解された）試薬を溶離した
後緩衝液を０．５Ｍアルギニン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、
２０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタンｐＨ７．
４へ変えると変性した蛋白質が単一のピークとして溶離
した。関連のある画分を集めそして４本のＰＤ−１０カ
ラムを用いて１００ｍＭ ＮＨ4 ＨＣＯ3 、０．２％Ｄ
−マニトールへ脱塩した。この溶液を次に凍結乾燥し
た。
【０１２３】変性の程度及び可逆性はｈｐｌｃにより定
量した（第３図）。ＰＥＧ−ｔ−ＰＡ共役物が広いピー
クとして溶離しそして見掛け上の分子量は１３０，００
０であった。０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメ
タン、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（９，９００ＳＵ
／ｍリットル）中で３７℃で２１時間後共役物は高度に
脱アシル化されて見掛け上の分子量は７５，０００とな
った。４４時間後脱アシル化は完了した。
【０１２４】方法
【０１２５】（ａ）発色基質定量
【０１２６】ウロキナーゼは２５℃で０．１Ｍトリエタ
ノールアミンＨＣｌ ｐＨ８．０中の１ｍＭの濃度で発
色基質Ｓ−２４４４〔カビビトラム（ＫａｂｉＶｉｔｒ
ｕｍ）、スウェーデン〕について定量された。ＳＵは１
ｃｍ路長セル中で１ｍリットルの基質中の０．００１／
分の４０５ｎｍでのＯＤ増大をもたらす活性の量として
規定される。
【０１２７】（ｂ）プラスミノーゲン活性定量
【０１２８】キュベットに０．１Ｍトリエタノールアミ
ン緩衝液ｐＨ７．０（２５μリットル）中の１０ｍＭＳ
−２２５１（カビビトラム、スウェーデン）、１０ｍｇ
／ｍリットルのリス（ｌｙｓ）−プラスミノーゲン（カ
ビビトラム、スウェーデンそしてアプロチニン・アガロ
ースにより処理）及び適当な濃度（５μリットル）のテ
スト活性剤を入れた。これらを溶液を混合させることな
くキュベットに加えた。ブランクのキュベットに活性剤
以外の上記の溶液を加えた。両方のキュベットに０．１
Ｍトリエタノールアミン緩衝液ｐＨ８．０（１ｍリット
ル）の添加により定量を開始しそしてＯＤ405 （テスト
対ブランク）を調べた。（時間）2 に対するＯＤのプロ
ットの最初のスロープはブラスミノーゲン活性の速度の
目安として取られた。
【０１２９】（ｃ）γーカウント
【０１３０】これはパッカード（Ｐａｃｋａｒｄ）自動
ガンマシンチレーションスペクトロメーターを用いて行
われた。
【０１３１】（ｄ）ＨＰＬＣ 分析用ゲル濾過ＨＰＬＣは０．７５ｍリットル／分の流
速を用いて２０％エタノールを含む０．０８Ｍ Ｎａ2
ＨＰＯ4 ／ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．３２Ｍ ＮａＣｌ緩衝
液ｐＨ７．０により平衡にされたＴＳＫＧ３０００ＳＷ
のカラム（ＳＷ６０ＣＭ）により行われた。分子量の測
定はバイオラッドからの標準蛋白質について行った。
【０１３２】（ｅ）ヒトプラズマ血塊溶解
【０１３３】血液（４０ｍリットル）をヒト志願者から
採りそして０．１容量の１２９ｍＭくえん酸三ナトリウ
ムと混合した。プラズマは４℃で１５分間１７００ｇで
の遠心分離により作成しそして４〜６人の志願者からの
プラズマを集めた。
【０１３４】プラズマの一部（０．５ｍリットル）をＣ
ａＣｌ2 を用いて再びカルシウム化して２５ｍＭの最終
濃度としそして約０．１μＣｉ〔125 Ｉ〕−フイブリノ
ーゲン〔ザ・ラジオケミカル・センター（ｔｈｅ Ｒａ
ｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｅｎｔｒｅ），アムステル
ダムにより供給される材料の硫酸アンモニウム沈殿によ
り再精製；比放射能１００μＣｉ／ｍｇ〕を加えた。補
足されたプラズマを５０μリットルのオウシトロンビン
（０．９％ＮａＣｌ中５０ＮＩＨ単位／ｍリットル）を
用いてニッケル・クロムワイヤーコイルへ塊まらせた。
血塊を３０分間２５℃に置き次に１時間４°で６容量の
０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ７．６中で洗った。
【０１３５】血塊を125 Ｉについてカウントし次に適当
にプラスミノーゲン活性剤を加えて５時間以内３７°で
３〜５ｍリットルの均質なプラズマをインキュベートし
た。溶解はフイブリン劣化生成物として放出される125
Ｉをカウントすることにより調べた。インキュベーショ
ン容量から一連の部分（５０μリットル）を採る効果を
差し引いてラジオレベルの放出％として表示される。
【０１３６】 （ｆ）モルモットの血流中のフイブリン溶解活性の定量
【０１３７】オスのダンキン・ハートレイ（Ｄｕｎｋｉ
ｎ Ｈａｒｔｌｅｙ）モルモット（３５０〜４５０ｇ）
をウレタン（２５％Ｗ／Ｖ溶液；６ｍリットル／ｋｇ．
ｉ．ｐ．）により麻酔した。１本の頸動脈を血液サンプ
ルの採取のためにカニュレートした。１本の大褪静脈を
ヘパリン（５０Ｕ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）及びテスト下の化
合物の注射のためにカニュレートした。ヘパリン処理約
５分後に投与前の血液サンプル（２ｍリットル）を採り
そして０．１容量の１２９ｍＭくえん酸三ナトリウムと
混合した。テスト下の化合物を次に１０秒かけて注射
（１ｍリットル／ｋｇ）した。さらに血液サンプルを正
確に２，４，８，１６，３０，６０及び９０分後に採っ
た。ヘパリン処理（５０Ｕ／ｋｇ，ｉ．ｖ．）を３０分
のサンプルの後で繰り返してカニューラの開通性を保っ
た。
【０１３８】すべてのくえん酸塩処理サンプルをそれぞ
れの実験の終わりまで氷中に保ち次に４°で１５分間１
７００ｇで遠心分離してプラズマを得た。それぞれのプ
ラズマのサンプルを０．０１％（Ｖ／Ｖ）ツゥイーン８
０を含む燐酸塩緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で２００倍に
希釈した。一部（３０μリットル）を次に４枚のフイブ
リンプレートに適用した。フイブリンプレートは０．４
％（Ｗ／Ｖ）ヒトフイブリノーゲン〔カビ（ｋａｂ
ｉ），グレードＬ，フロウ・ラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），スコットランド〕を１
２５ｍＭ ＮａＣｌｐＨ７．４中の０．０２９Ｍバルビ
トンに溶解し１０×１０ｃｍ平方のプラスチック皿〔ス
テリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ）〕にピペット（１０ｍリ
ットル）しそして０．３ｍリットルのオウシトロンビン
〔５０ＮＩＨ単位／ｍリットル，パーク・デービス（Ｐ
ａｒｋｅ−Ｄｅｖｉｓ），英国〕と急速に混合すること
により塊まらせることにより製造した。
【０１３９】プレートを通常１８〜２４時間３７℃でイ
ンキュベートしたがもし必要ならば長くしそして水性ブ
ロモフェノール青で染めた。それぞれの溶解帯について
互いに直角の２本の直径をベルニエル（Ｖｅｒｎｉｅ
ｒ）コンパスを用いて測定した。それぞれのサンプルの
全直径を平均しそしてこの平均を較正曲線を参照してフ
イブリン分解活性に転換した。較正曲線はテスト中の化
合物の一定量を各動物の投与前のプラズマに加えること
により得られた。これらの標準は実験サンプルと同じ方
法及び同時に処理された。較正曲線を作るために直径
（ｍｍ）の化合物のｌｏｇ10濃度に対してプロットし
た。それぞれの実験サンプル中の化合物のブラズマ濃度
は与えられた投与に基いて予想されるのと各モルモット
の体重１ｋｇ当たりの５０ｍリットルプラズマの推定と
のパーセントとして表示された。
【０１４０】
【発明の効果】蛋白質アミノ基又はその誘導体と水溶性
重合体試薬とを反応させて、生体内で徐々に蛋白質を放
出する水溶性重合体−蛋白質結合体を製造できる。
【０１４１】結果
【０１４２】（ａ）生体外のフイブリン溶解活性
【０１４３】実施例３（ｉｉ）に記載された如く製造さ
れたウロキナーゼ共役物を前述の生体外血塊溶解システ
ムでウロキナーゼと比べた。第４図はテストされた濃度
のそれぞれで共役物は最初は本来のウロキナーゼよりも
活性が低いが（約２倍）、実験中に恐らく重合体鎖の放
出によりその活性が増大したことを示す。５時間後溶解
の程度は変性及び未変性のウロキナーゼと殆んど同じで
あった。
【０１４４】（ｂ）モルモットにおけるウロキナーゼ・
ＰＥＧ共役物のクリアランス
【０１４５】第５図はモルモットの血流からの実施例３
（ｉｉ）に記載された共役物とウロキナーゼとのクリア
ランスを示す。明らかにウロキナーゼへのポリエチレン
グリコールの添加が顕著な長期間のクリアランスを生じ
させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｇ３０００ＳＷ ＨＰＬＣ溶離プロフィル（Ｈ
ＳＡ）を示す。
【図２】Ｇ３０００ ＳＷ ＨＰＬＣ溶離プロフィル
（ウロキナーゼ）を示す。
【図３】図３ａ〜図３ｄは分析用ｈｐｌｃゲル濾過溶離
プロフィル（ｔＰＡ）を示す。
【図４】ウロキナーゼ（■）及びＰＥＧ−ウロキナーゼ
（実施例３，●）による生体外ヒト血塊溶解の時間の経
過を示す。
【図５】モルモットの血流からのフイブリン溶解活性の
クリアランスを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１月２８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】
【化４】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３７】適当な基−Ｒ3 −Ｐの例はＰ−（ＣＨ2 ）
ｎ−、ＰＯ（ＣＨ2 ）ｎ−、ＰＯ−、Ｐ（ＣＨ2 ）ｎＯ
−、ＰＣＨ（ＣＨ3 ）−、ＰＣ（ＣＨ3 ）2 −、ＰＯＣ
Ｈ（ＣＨ3 ）−又はＰＯＣ（ＣＨ3 ）2 −（式中ｎは１
〜６の整数である）を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６７】
【化９】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００６８】〔式中Ａ1 及びＡ2 はそれぞれヒドロキシ
基であるか又は一緒になって−Ｏ−でありＢ1 及びＢ2
は一緒になって結合であるか又は結合を形成するため除
去可能な基でありそして（ｉ）Ｒ′1 及びＲ′2 はそれ
ぞれ前述の非重合性有機基又は基Ｗであり；又は（ｉ
ｉ）Ｒ′1 及びＲ′2 は一緒になってＣ3 〜5 ポリメチ
レンとなって５−〜７−員脂環族環を完成するか又は一
緒になって芳香族環を完成しその際脂環族又は芳香族の
環は基Ｒ′4 及びＲ′5 （それぞれ前述の非重合性有機
基又は基Ｗである）により置換され少なくとも１個の
Ｒ′1 及びＲ′2 又は少なくとも１個のＲ′4 及びＲ′
5 は基Ｗである〕の化合物と化合物ＰＹ（式（ＩＶＢ）
（式中Ｐは前記同様であり；基Ｗ及びＹは一緒に反応し
て橋かけ基Ｒ3 を形成しうる基である）とを反応させ；
そして次にＡ1 及びＡ2 がそれぞれヒドロキシのとき反
応の生成物を脱水する及び／又はＢ1 及びＢ2 が除去可
能な基のとき反応の生成物を除去することにより製造さ
れよう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７０】基Ｗ及びＹの性質及び従って用いられる反
応条件はもたらされる橋かけ基Ｒ3により決められる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７１】橋かけ基が前述のヘテロ原子を含む脂肪族
炭化水素鎖のとき基Ｙ及びＷはそれぞれ適切な長さの炭
化水素鎖であってそれぞれ適切な求核性ヘテロ原子Ｏ，
Ｓ又はＮ及び適当な脱離基例えばハロゲン（好ましくは
臭素又は沃素）、メタンスルホニル又は４−トルエンス
ルホニルを末端に有する。橋かけ基Ｒ3 が脂肪族炭化水
素鎖のとき基Ｙは重合体Ｐ上の末端求核性ヘテロ原子で
ありそして基Ｗは適当な脱離基により誘導された対応す
る炭化水素鎖である。これらの場合の脱離基の求核性置
換の反応条件は従来行われているものでありそして主と
して重合体により決定されよう。それ故求核基が−Ｏで
あるとき反応は反応が完了するまで乾燥窒素の雰囲気下
任意の非極性溶媒中で行われよう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７２】橋かけ基がアミド又はエステル部分を含む
脂肪族炭化水素鎖のとき基Ｗ及びＹはそれぞれ適切な長
さの炭化水素鎖であり末端の一つはカルボキシル基であ
り他はヒドロキシル又はアミノ基である。反応条件はエ
ステル又はアミド結合の形成に従来用いられている条件
であり例えば適当な活性剤例えばジシクロヘキシルカル
ボジイミドにより非水性条件下で酸を活性化しそして次
に適切なアルコール又はアミンと反応させる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００７８】
【化１１】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８１】式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）においてｐ及び
ｍはそれぞれ重合体の分子量が上述の範囲内に入るよう
な整数である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１０】
【化１４】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１１４】
【化１５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/66 Ｆ 8314−4Ｃ

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 蛋白質アミノ基又はその誘導体と反応し
    て可逆性結合基を形成しうる基よりなる水溶性重合体含
    有試薬。
  2. 【請求項２】 式（ＩＶ）化１の化合物である特許請求
    の範囲第（１）項記載の試薬。 【化１】 〔式中、（ｉ）Ｒ1 及びＲ2 はそれぞれ非重合性有機基
    又は式−Ｒ3 −Ｐ（式中Ｐは水溶性重合体でありＲ3 は
    橋かけ基である）の基であるか；又は（ｉｉ）Ｒ1 及び
    Ｒ2 は一緒になってＣ3 〜5 ポリメチレンであって５−
    〜７−員脂環族環を完成するか又は一緒になって芳香族
    環を完成し、その際脂環族又は芳香族の環は基Ｒ4 及び
    Ｒ5 （それらはそれぞれ非重合性有機基又は式−Ｒ3 −
    Ｐの基である）により置換され；そしてＲ1 及びＲ2 の
    少なくとも１個又はＲ4 及びＲ5 の少なくとも１個は−
    Ｒ3 −Ｐである〕
  3. 【請求項３】 式（ＶＩＩＩ）化２の化合物である特許
    請求の範囲第（２）項記載の試薬。 【化２】 （式中Ｐは水溶性重合体である）
  4. 【請求項４】 試薬が２−〔メトキシポリエチレン（５
    ０００）グリコキシメチレン〕−３−メチル無水マレイ
    ン酸である特許請求の範囲第（２）項記載の試薬。
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