ITRM930409A1 - Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130 - Google Patents

Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130 Download PDF

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ITRM930409A1
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Armin Lahm
Rocco Savino
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Angeletti P Ist Richerche Bio
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Description

"METODOLOGIA PER LA SELEZ IONE DI SUPERAGONISTI , ANTAGONISTI E SUPERANTAGONISTI DI ORMONI DEL CUI COMPLESSO RECETTORIALE FA PARTE GP
130"
DESCRIZIONE
La presente invenzione ha per oggetto una metodologia per la selezione di superagonisti , antagonisti e superantagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130.
Come ? noto,
insegna un metodo per la determinaz ione di agonisti o antagonisti di ormoni della crescita e ligandi con struttura conf ormazionale simile . I potenziali agonisti e antagonisti vengono messi a contatto con un recettore dell ' ormone e s i determina la formazione di un complesso ternario che consiste di una molecola del potenz iale agonista o antagonista e due molecole di detto recettore dell ' ormone da agonistizzare o da antagonistizzare. La dimerizzazione di recettori indotta da una molecola di ligando porta alla conclusione che il ligando ha due differenti siti di interazione (sito 1 e sito 2) sui quali si pu? agire mediante mutagenesi per generare di volta in volta agonisti o antagonisti.
Si ? ora trovato inaspettatamente che i ligandi del gruppo delle citochine simili alla Interleuchina 6 (IL-6) , vale a dire Oncostatina M (OSM) , Leucemia Inhibitory Factor (LIF) , Ciliary Neurotrophic Factor ( CNTF) , e Interleuchina 11 (IL-11) , inducono la formazione di un complesso recettoriale di cui f a parte la molecola di membrana gp 130. In questo complesso recettoriale sono sempre presenti il recettore specifico per ognuna di queste citochine e la molecola di membrana gp 130 come elemento comune . Si pu? pertanto ipotizzare che il sito 1 e il sito 2 , in questa classe di ormoni , si legano a due diverse molecole : il sito 1 con il recettore specifico e il sito 2 con gp 130.
La identificazione dei due siti pu? essere resa possibile, come si vedr? meglio nel seguito, dalla formulazione di un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone umano della crescita (hGH) , e sequenze dei recettori degli ormoni in questione. L'isolamento di varianti che hanno, rispetto all'ormone selvatico, una maggiore affinit? per il recettore specifico (superagonisti o superantagonisti ) si ottiene con la costruzione di librerie di fagi filamentosi, ad esempio M13 che portano l'ormone, sia nella versione selvatica che mutata.
La differenza tra il modello tridimensionale, ad esempio di IL-6, qui adottato e quello adottato in W092/21029 portano ad ipotizzare residui differenti nella elica A e C come costituenti del sito 2.
Il modeling della molecola di interleucihina 6 umana procede come segue. Sapendo da dati disponibili nella letteratura scientifica che 1 'interleuchina 6 umana appartiene ad una classe di citochine che hanno quattro eliche come motivo centrale della loro struttura tridimensionale, ? stata analizzata la sequenza amminoacidica della interleuchina 6 umana per identificare le quattro regioni con la pi? alta probabilit? di essere in una conformazione ad elica. In una fase successiva, queste quattro regioni ad elica della molecola di interleuchina 6 sono state modellate in una unit? di grafica interattiva computerizzata. All'inizio, si ? assunto che la orientazione relativa delle quattro eliche fosse simile a quella osservata in ormoni quali l'ormone della crescita o il fattore di stimolazione di colonie di granulociti macrofagi. Per ottimizzare l ' impacchettamento degli amminoacidi idrofobici nello spazio tra le quattro eliche, sono stati fatti degli aggiustamenti al posizionamento relativo delle eliche. Successivamente sono state modellate le regioni ad ansa che connettono le quattro eliche.
Questo modello tridimensionale di interleuchina 6 ha consentito di identificare i, due siti di interazione dell ' interleuchina 6 umana con i suoi due recettori: il recettore gp 80 a bassa affinit? (sito 1) e il recettore di trasduzione del segnale gp 130 ad elevata affinit? (sito 2) . Per la identificazione dei due siti si ? proceduto come segue. Dai confronti di sequenza ? gi? noto che tutti i membri di una famiglia di recettori ematopoietici sono relazionati l'uno all'altro mediante condivisione di un dominio chiamato dominio di riconoscimento delle citochine. Questa similarit? di sequenze indica con elevata probabilit? anche una similarit? strutturale delle parti corrispondenti dei diversi recettori, inclusi i due recettori dell inter leuchina 6, gp 80 e gp 130. La osservazione che le citochine che si legano a questi recettori hanno ( o si pu? predire che abbiano) tutte una struttura simile, precisamente un motivo di quattro eliche, supporta con forza l'ipotesi che l'interazione tra queste citochine e i loro recettori, via il dominio di riconoscimento delle citochine, debba essere molto simile nei complessi biologicamente attivi.
Dato che per uno di questi complessi (il complesso tra l'ormone della crescita e il dominio extracellulare del recettore dimerico dell'ormone della crescita) ? stata determinata mediante cristallografia a raggi X la struttura tridimensionale, il nostro modello di inter leuchina 6 umana ci permette di identificare i siti potenziali di interazione tra interleuchina 6 e i suoi due recettori gp 80 (sito 1) e gp 130 (sito 2) . Ci? per analogia con il complesso che coinvolge l'ormone della crescita ed assumendo che gli amminoacidi importanti sotto il profilo funzionale siano localizzati in posizioni simili sulla superficie dei due ormoni.
L'esigenza di disporre di una metodologia per la messa a punto di agonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni del sistema immunitario il cui complesso recettoriale ? costituito anche da gp 130, verr? chiarita con riferimento al caso di interleuchina-6.
Come ? noto, l inter leuchina 6 ? un polipeptide di 184 amminoacidi che, come abbiamo visto, appartiene alla classe delle citochine elicoidali. L interleuchina 6 ? una citochina multifunzionale prodotta da vari tipi di cellule. Essa agisce come fattore di differenziazione e crescita su cellule di vario tipo, quali ad esempio cellule del sistema immunitario, epatociti, cellule renali, cellule staminali ematopoietiche, cheratinociti e neuroni.
La messa a punto di superantagonisti della interleuchina 6 consentirebbe di adottare dosaggi terapeutici inferiori a quelli necessari con 1?interleuchina 6 selvatica nella cura di numerose malattie gravi. La interleuchina 6 infatti trova importanti e promettenti applicazioni nella terapia del cancro al seno, della leucemia, e di malattie infettive o legate a disordini delle cellule progenitrici del midollo osseo.
D ' a ltro canto la messa a punto di antagonisti o superantagonisti della interleuchina 6 umana consent irebbe la inibi z ione del l inter leuchina 6 in numerose ma latt ie caratterizzate da una sua sovrapproduzione, quali disordini autoimmuni cronici, mieloma/plasmacitoma, osteoporosi successiva alla menopausa e cachessia da cancro .
La metodolog ia per la selez ione di superagonisti, antagonisti oppure superantagonisti di un ormone che utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della f isiologia cellulare, secondo la presente invenzione, comprende le seguenti operazioni:
- confrontare le sequenze amminoacidiche dell ' ormone della crescita con le sequenze di detto ormone;
- confrontare le sequenze amminoacidiche del recettore dell ' ormone della crescita con quelle dei due recettori dell ' ormone in questione : il recettore ormone-specifico e gp 130;
- sulla base dei confronti , formulare un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone della crescita e i due recettori dell'ormone in questione; e
identificare i residui dell'ormone selvatico in questione che fanno parte rispettivamente del sito di interazione con il recettore specifico e del sito di interazione con gp 130.
L'ormone in questione pu? essere scelto dal gruppo comprendente Inter leuchina 6 (IL-6) , Oncostatina M (OSM) , Leukemia Inhibitory Factor (LIF) , Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) e Interleuchina 11 (IL-11) .
Per la selezione di superagonist i di interleuchina 6, la metodologia secondo la presente invenzione comprende inoltre le seguenti operazioni addizionali:
- produzione di una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei seguenti residui selvatici della interleuchina 6 presente come prodotto di fusione con proteine di fagi filamentosi
Giu 42, Giu 51, Ser 52, Ser 53, Lys 54, Giu 55,
Asn 63, Lys 66, Met 67, Ala 68, Giu 69, Lys 70, Asp 71, Phe 170, Gin 175, Ser 176, Ser 177, Leu 181, Gin 183;
- generazione di una libreria di fagi, ognuno con una sequenza di inter leuchina 6 mutante ;
- selezione, dalla popolazione mista di fagi che esprimono interleuchine 6 mutanti, quella o quelle che presentano una affinit? per il recettore specifico superiore alla interleuchina 6 selvatica; e
- identificazione della migliore o delle migliori sequenze amminoacidiche leganti il recettore mediante sequenziamento del DNA estratto dalle particelle fagiche selezionate.
In questo caso, si pu? produrre una serie di librerie fagiche contenenti mutuazioni dei detti residui selvatici dell <1 >interleuchina 6 presente come prodotto di fusione. con la proteina pili di MI 3.
La metodologia per la selezione di antagonisti di interleuchina 6, secondo la presente invenzione, comprende - oltre alle operazioni sopra menzionarte - le seguenti operazioni:
mutagenesi dei residui identificati per essere parte del sito di interazione con gp 130 (Arg 30, Tyr 31, Gly 35, Ser 37, Ala 38, Ser 118, Lys 120, Val 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lys 128 e Lys 129) con tecniche convenzionali di biologia molecolare;
valutazione dell'attivit? biologica e dell'affinit? per il recettore specifico per la interleuchina 6 dei mutanti prodotti come sopra, al fine di identificare varianti di interleuchina 6 con intatta affinit? al recettore specifico che presentano riduzioni o perdita dell'attivit? biologica; e
valutazione delle suddette varianti di interleuchina 6 come antagonisti dell'attivit? biologica dell ' interleuchina 6 selvatica.
Nel caso di selezione di superantagonisti dell ' interleuchina 6 mediante combinazioni delle variazioni di sequenza amminoacidiche responsabili dell'attivit? antagonista, identificate come sopra, con variazioni amminoacidiche responsabili di una aumentata affinit? del recettore specifico per 1 ' interleuchina 6.
Nella metodologia per la selezione di antagonisti o superantagonisti di interleuchina 6, la mutagenesi dei residui identificati come sopra pu? essere eseguita con una tecnica di biologia molecolare scelta dal gruppo comprendente Polimerase Chain Reaction, Primer Extension, Oligonucleotide Directed Mutagenesis, e loro combinazioni .
La presente invenzione non si limita alla metodologia per la selezione di agonisti, antagonisti o superantagonisti di inter leuchina 6 . Si estende invece anche agli agonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni che utilizzano la molecola di membrana gpl30 per attivare meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, e che sono ottenibili con la metodologia di selezione descritta in precedenza.
Si ? data finora del ritrovato oggetto della presente invenzione una descrizione di carattere generale. Con l'aiuto dei seguenti esempi verr? ora fornita una descrizione particolareggiata di specifiche forme di realizzazione della invenzione finalizzate a farne meglio comprendere scopi, caratteristiche, vantaggi e modalit? applicative.
La figura 1 mostra il costrutto pHen?j,hIL-6 e la produzione di particelle fasmidiche (v. esempio 1, "Costruzione del vettore") , utilizzabili per la selezione di agonisti della hIL-6.
La figura 2 mostra l?attivit? antagonistica del mutante
Tyr31Asp/Gly35Phe/Serll8Arg/Vall21Asp al crescere della sua concentrazione (v. esempio 4).
DEPOSITI
Batteri E.Coli K12 - trasformati con il plasmi- de pHen A hIL-6 che contiene, dal sito di riconoscimento per l'enzima di restrizione Sali a quello per l'enzima di restrizione Noti, una sequenza nucleotidica codificante per la sequenza amminoacidica dell<1>interleuchina-6 umana selvatica - sono stati depositati in data 10/6/1993 presso The National Collection of Industriai and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen Scozia, UK, con il numero di accesso NCIMB 40563.
Esempio 1
App l ica z ione del la metodolog ia secondo l ' invenzione per la selezione di aqonisti della interleuchina-6
1) COSTRUZIONE DEL VETTORE
La strategia consiste nel costruire un gene ibrido contenente tutta la regione codificante per hIL-6 seguita dagli ultimi 157 amminoacidi della proteina pili del fago M13 e preceduta dalla sequenza Pel B , che indiriz z er? la proteina sintetizzata nello spazio periplasmico.
L ' espressione del gene ibrido viene guidata dal promotore lacZ. Il costrutto viene realizzato nel contesto del vettore pHen/^e prende il nome di pHen^ hIL-6 (vedi unica figura annessa). Questo plasmide ? dotato anche di una origine di replicazione fagica. Se una cellula batterica contenente questo plasmide viene infettata da un batteriofago detto "helper" , come M13K07, dal plasmide verranno prodotte copie a singolo filamento che verranno rivestite dalle proteine fagiche, proprio come se si trattasse di un vero genoma fagico. Queste particelle fagiche contenenti il plasmide vengono definite fasmidi. Essi conterranno, oltre alle normali molecole di pili anche le molecole di fusione hIL6-pIII. Nella medesima entit? sono quindi riuniti una molecola di hIL-6 e il gene che ne codifica la sequenza amminoacidica. Nel caso di molecole mutanti, sar? possibile conoscere la sequenza amminoacidica di molecole esposte sulla superficie di fagi risultanti da procedure di selezione semplicemente sequenziando il DNA del fasmide.
Una ulteriore caratteristica del costrutto pHenA <hI>L-6 ? la presenza di un codone di stop della traduzione tra il gene di IL-6 e il gene di pili. La produzione della proteina ibrida viene ef fettuata in ceppi batter ic i in grado d i soppr imere ta le codone di Stop . Viceversa l ' utilizzo di ceppi non soppressori consente la produzione di hIL-6 da sola, direttamente nello spazio periplasmico.
Gli esperimenti che seguono dimostrano la possibilit? di utilizzare shrIL-6R per purificare, mediante cicli di selezione amplificazione, tra la vasta gamma di interleuchine-6 mutanti esposte sul fago grazie a quelle che presentino affinit? maggiore per tale recettore.
2) ESPERIMENTI DI CARATTERIZZAZIONE DEL SISTEMA a) Saggio ELISA
I poz zetti di piastre ELISA sono stati rivestiti con fasmidi hIL-6 o con M13K07 e fatti reagire con shrIL-6R (Soluble Human Recombinated IL-6R) . Dopo ripetuti lavaggi la presenza del recettore ? stata rivelata con un anticorpo monoclonale specif ico coniugato con fosfatasi alcalina. Il segnale ottenuto ? maggiore nel caso dei fasmidi hIL-6 ed aumenta con l ' aumentare della quantit? del recettore utilizzato.
b) Arricchimento del fasmide hIL-6 da miscele fasmide-K07 mediante shrIL-6R
Particel le f asmidiche hIL-6 sono state miscelate con particelle di M13K07 in proporzione 1:100. Questa miscela ? stata incubata con palline di polistirene rivestite con shrIL-6R. Dopo ripetuti lavaggi a pH neutro le palline sono state sottoposte ad un lavaggio stringente a pH 4,2, seguito da una eluizione a pH 3,6. Nell'eluato risultante ? stata determinata la proporzione fasmidi hIL-6 :M13K07 . La proporzione risulta essere di 1:10, con conseguente arricchimento di dieci volte dei fasmidi hIL-6 rispetto a M13K07. c) Selezione da miscele di interleuchine-6 mutanti di quelle a maggiore affinit? per il recettore ?? 80
Sono state prodotte particelle fasmidiche recanti sulla superficie molecole mutanti di hIL-6 con affinit? maggiore (176 Arg) o minore (179 Ala) per il recettore, rispetto alla versione naturale. Queste particelle sono state miscelate in rapporto 1:1. La miscela ? stata incubata con il recettore in fase solida, come descritto al punto b). Nell'eluato a pH 3,6, il rapporto tra i due tipi di particelle ? risultato essere di 15:1 in favore di 176 Arg.
d) Determinazione dell'affinit? relativa per il recettore qp 80 delle particelle di M13K07.
fasmide hIL-6. fasmide 176 Arcr e fasmide 179 Ala Uguali quantit? di particelle dei vari tipi sopra elencati sono state incubate separatamente con le palline rivestite di recettore. Dopo la consueta serie di lavaggi ? stata determinata la quantit? di particelle recuperate nell ' eluato a pH 3 , 6 per ogni tipo di fago . Ponendo pari a 1 il valore di particelle recuperate nel caso del fasmide hIL-6 , si ottiene un valore di 3 per 176 Arg , di 0 , 2 per 179 Ala e di 0 , 18 per M13K07 . Questi valori riflettono le af finit? relative delle molecole di IL-6 non esposte sul fago. E ' infatti noto che 176 Arg lega il recettore con aff init? di tre volte superiore alla molecola naturale, mentre nel caso di 179 Ala l ' affinit? ., per il recettore ? ridotta quasi a zero ( infatti un fasmide con tale mutante si comporta , nei riguardi del legame al recettore, come M13K07) .
L' insieme di questi esperimenti ha dimostrato la possibilit? di selezionare, con la metodologia della presente ivnenzione, da miscele di mutanti esposti sul fago, quelli con affinit? maggiore per il recettore.
Esempio 2
Generazione e selezione di antagonisti della interleuchina 6 con la metodologia della presente invenzione
Per tutte le reazioni di mutagenesi ? stato usato come stampo il plasmide Phen/\hIL-6. Questo plasmide ? un derivato del plasmide pHENl e contiene la regione codificante della IL-6 umana (SEQ.ID.NO.1) a monte della regione codificante per la parte carbossi-terminale (dal codone 250 alla estremit? COOH) della proteina pili del batteriofago M13; le due regioni codificanti sono in fase di lettura e sono separate da un codone di Stop Amber UAG, che pu? essere soppresso in ceppi batterici che portano integrato nel genoma il gene del soppressore SupE. La regione codificante per IL-6 umana ? anche in fase di lettura, a valle del peptide PelB, sequenza segnale per la secrezione, e l'intero gene ? sotto il controllo del promotore LacZ. Infine, ? stato introdotto un sito unico per l'enzima di restrizione Sacl nella sequenza nucleotidica che codifica per gli amminoacidi 20-21-22 di hIL-6 senza cambiare la loro identit? e, parimenti, ? stato introdotto un sito unico per l'enzima di restrizione BfrI nella regione che codifica per gli amminoacidi 38-39-40 di hIL-6, anche questa volta senza cambiarli.
? ' stata usata una strategia PCR (Polymerase Chain Reaction) per generare mutazioni entro i codoni selezionati per la regione codificante per interleuchina-6 umana. Il primer a valle ? H9 , un primer di 32 nucleotidi , corrispondente al le posizioni 426-457 (filamento antisenso) di cDNA di hIL-6 (assumendo come 1 il primo nucleotide del primo codone del polipeptide maturo) . Il sito di ibridaz ione del primer ? a val le del sito di riconoscimento per l ' enzima XbaI naturalmente presente nel cDNA. Il primer mutagenetico a monte ? IL-6 31D/35 PCR, un primer di 70 nucleotidi, la cui sequenza ? SEQ. ID.N0.2.
Il primer IL-6 31D/35 PCR si estende dalla posizione 55 alla posizione 124 (filamento senso) del cDNA di hIL-6 e introduce degenerazioni nei codoni che codif icano per 1 <1 >amminoacido 31 (tirosina del tipo selvatico) e 35 (glieina del tipo selvatico) . Un frammento di DNA di 403 paia di basi viene amplif icato mediante PCR secondo protocoll i standard di amplif icaz ione PCR . L ' amplif icazione viene eseguita in 35 cicli . Ciascun ciclo consiste di incubazione per 2 minuti a 94 ?C per la denaturazione dello stampo, 2 minuti a 50?C per l ' ibridazione dell ' oligonucleotide e 3 minuti a 72?C per l'estensione della catena. Il frammento amplificato viene digerito con Sacl e XbaI e purificato da gel di agarosio al 2%. Il frammento generato per PCR e digerito dai due enzimi viene ligato nel vettore
digerito con gli stessi due enzimi, purificato su gel di agarosio allo 0,8%, per sostituire la sequenza di tipo selvatico.
Nella seguente tabella 1 vengono riportati l'attivit? biologica , in cellule di epatoma umano, e il legame al recettore gp 80 per la interleuchina-6 selvatica e sue varianti mutate nei residui indicati con asterisco.
Come si vede dalla tabella , i mutanti (Tyr31Asp , Gly35Tyr) , (Tyr31Asp , Gly35Phe) e (Tyr31Asp , Gly35Leu, Glu42Ala) esibiscono attivit? biologica ridotta rispetto all <1 >interleuchina 6 selvatica. In tutti e tre i casi l ' attivit? residua ? 2-5% di quella della interleuchina-6 di tipo selvatico. I tre mutanti mantengono la piena capacit? di legarsi al recettore gp 80 dell <1 >interleuchina 6. In conclusione i tre mutanti hanno una attivit? decrescente nella trasduzione del segnale nelle cellule di epatoma . In altre parole essi sono antagonisti dell <1 >interleuchina 6 selvatica . In particolare, il mutante (Tyr31Asp, Gly35Phe) ? un antagonista particolarmente efficace, in quanto ? capace di ridurre l ' attivit? dell ' interleuchina-6 di tipo selvatico quando ? usata in un eccesso 50 volte molare nel saggio in cellule di epatoma umano .
Esempio 3
Generazione e selezione di ulteriori antagonisti della interleuchina 6 con la metodologia della presente invenzione
Per tutte le reazioni di mutagenesi ? stato usato come stampo il plasmide
descritto nel precedente esempio.
E ' stata usata una strategia PCR (Polymerase Chain Reaction) per generare mutazioni entro i codoni selezionati nella regione codificante per 1 <1 >inter leuchina 6 umana. Il primer a monte ? HP/1, un primer di 29 nucleotidi, corrispondente alle posizioni 1-19 (filamento senso) del cDNA di hIL-6 (assumendo come 1 il primo nucleotide del primo codone del polipeptide maturo) . Il sito di ibridazione del primer ? a monte del sito di riconoscimento per l'enzima Sacl, artificialmente introdotto nel cDNA senza cambiare la sequenza codificata dallo stesso, come descritto nell'esempio 2. Il primer mutagenico a valle ? IL-6 118RCLF/121VD, un primer di 72 nucleotidi la cui sequenza ? SEQ ID NO: 3.
Il primer IL-6 118RCLF/121VD si estende dalla posizione 334 alla posizione 405 (filamento antisenso) del cDNA di hIL-6 ed introduce degenerazioni nei codoni che codificano per 1 ' amminoacido 118 (serina nel tipo selvatico) e 121 (vaiina nel tipo selvatico) . Un frammento di DNA di 415 paia di basi viene amplificato mediante PCR secondo protocolli standard di amplificazione PCR. L'amplificazione viene eseguita in 35 cicli. Ciascun ciclo consiste di incubazione per 2 minuti a 94 ?C per la denaturazione dello stampo, 2 minuti a 50 ?C per l'ibridazione dell oligonucleotide e 3 minuti a 72?C per l'estensione della catena. Il frammento amplificato viene digerito con Sacl e con XbaI e purificato su gel di agarosio al 2%. Il frammento generato per PCR e digerito dai due enzimi viene ligato nel vettore pHENAhIL-6, digerito con gli stessi due enzimi, purificato su gel di agarosio allo 0,8%, per sostituire la sequenza del tipo selvatico.
Nella seguente tabella 2 vengono riportati l'attivit? biologica in c?llule di epatoma umano e il legame al recettore per la interleuchina 6 selvatica e le sue varianti mutate nei residui indicati.
Si pu? notare come il mutante IL-6 Ser 118Arg/Vall21Asp abbia caratteristiche molto simili al mutante IL-6 Tyr 3lAsp/Gly 35Phe , descritto nella tabella 1, cio? una normale attivit? di legame al recettore di tipo I della inter leuchina 6, ma una riduzione di circa 30 volte della attivit? biologica della citochina.
Esempio 4
Generazione e selezione di pi? potenti antagonisti della interleuchina 6 con la metodologia della presente invenzione
Per tutte le reazioni di mutagenesi questa volta ? stato usato come stampo il plasmide pHENAhIL-6 Tyr31Asp/Gly35Phe, ottenuto come descritto nell'esempio 2.
E' stata usata una strategia PCR (Polymerase Chain Reaction) per generare mutazioni entro i codoni selezionati nella regione codificante per 1'interleuchina 6 umana. Il primer a monte ? HP/l, descritto nel precedente esempio. Il primer mutagenico a valle ? IL-6118RCLF/121VD, descritto anch'esso nel precedente esempio. Un frammento di DNA di 415 paia di basi viene amplificato mediante PCR secondo protocolli standard di amplificazione PCR. L amplificazione viene eseguita in 35 cicli . Ciascun ciclo consiste di incubazione per 2 minuti a 94 ?C per la denaturazione dello stampo, 2 minuti a 50?C per l ibridazione dell oligonucleotide e 3 minuti a 72 ?C per l ' estensione della catena . Il frammento amplificato viene digerito con Sacl e con XbaI e purificato su gel di agarosio al 2% . Il frammento generato per PCR e digerito dai due enz imi viene l igato nel vettore pHENAhIL-6 , digerito con gli stessi due enzimi, purificato su gel di agarosio allo 0 , 8% , per sostituire la sequenza del tipo selvatico.
Nella seguente tabella 3 vengono riportati l ' attivit? biologica in cellule di epatoma umano e il legame al recettore per la interleuchina 6 selvatica e le sue varianti mutate nei residui indicati . -
Tre delle varianti che contengono mutazioni sia sull'elica A che sull'elica C non mostrano nessun segno di attivit? biologica in cellule di epatoma umano, mentre preservano ancora la capacit? di legare il recettore gp80. Tra le tre proteine, il mutante IL-6 Tyr3 lAsp/Gly3 5Phe/ Serll8Arg/Vall2 lAsp ? stato scelto per esperimenti di competizione dell'attivit? biologica dell ' inter leuchina 6 selvatica in cellule di epatoma umano- Le cellule vengono stimolate con interleuchina 6 selvatica a 4 nanogrammi per millilitro (ng/ml) di mezzo di cultura, in presenza di concentrazioni crescenti del mutante- Come illustrato in figura 2 (in cui l'attivit? biologica della interleuchina 6 selvatica ? espressa in unit? arbitrarie) , concentrazioni crescenti del mutante riescono ad antagonizzare gli effetti della interleuchina 6 selvatica sulle cellule di epatoma umano.
Nella tabella 4 sono riportati i livelli di inibizione (in percentuale) dell'attivit? biologica dell ' interleuchina 6 selvatica in funzione della concentrazione di antagonista (espressa rispettivamente in nanogrammi per millilitro, eccesso molare rispetto all'inter leuchina 6 selvatica e nanomoli per litro).
LISTA DI SEQUENZE
INFORMAZIONI GENERALI
(i) DEPOSITANTE: ISTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P. ANGELETTI S.p.A. (ii) TITOLO DELL'INVENZIONE: METODOLOGIA PER LA SELEZIONE DI SUPERAGONISTI, ANTAGONISTI E SUPERANTAGONISTI DI ORMONI DEL CUI COMPLESSO
RECETTORIALE FA PARTE GP 130
(ili) NUMERO DELLE SEQUENZE: 1
(iv) INDIRIZZO DI CORRISPONDENZA:
(A) DESTINATARIO: Societ? Italiana Brevetti (B) UBICAZIONE: Piazza di Pietra, 39
(C) CITTA?: Roma
(D) PAESE: Italia
(E) CAP: 00186
(vili) INFORMAZIONI SUL CONSULENTE BREVETTUALE (A) NOME: DI CERBO, Mario (Dr)
(B) NUMERO DI REGISTRAZIONE ORDINE: 455
(C) RIFERIMENTO: RM/O 90074/MDC
(IX) INFORMAZIONI PER TELECOMUNICAZIONI
(A) TELEFONO: 06/6785941
(B) TELEFAX: 06/679492
(C) TELEX: 612287 ROPAT
(1) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID.NO.:!
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 555 paia di basi
(B) TIPO: nucleotidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA
(ili) IPOTETICA: no
(iv) ANTISENSO: no
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA:
(A) SINTESI: produzione in batteri
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:
(A) NOME: IL-6 cDNA
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE: gel di poliacrilammide
(Xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.: 1
(2) INFORMAZIONI SULLA SEQ.ID. NO.:2
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 70 paia di basi
(B) TIPO: nucleotidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFIGURAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA sintetico
(ili) IPOTETICA: no
(iv) ANTISENSO: no
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA
(A) SINTESI: sintetizzatore di
oligonucleotidi
(?X) CARATTERISTICHE ULTERIORI:
(A) NOME: oligonucleotide
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE: gel di poliacrilammide
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.:2
CGCACGAGCT CAGAACGAAT TGACAAACAA ATTCGGXACA TCCTCGACYZ TATCTCAGCC 60 TTAAGAAAGG 70 in cui: X pu? essere una base scelta fra G e T
Y pu? essere una base scelta fra C e T, e
Z pu? essere una base scelta fra A, G e T.
(3) INFORMAZIONI SULLA SEQ ID NO:3
(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA
(A) LUNGHEZZA: 72 nucleotidi
(B) TIPO: nucleotidica
(C) NUMERO CATENE: singola
(D) CONFORMAZIONE: lineare
(ii) TIPO DI MOLECOLA DNA sintetico
(iii) IPOTETICA: no
(iv) ANTISENSO: s?
(v) TIPO DI FRAMMENTO: interno
(vii) FONTE IMMEDIATA:
(A) SINTESI: sintetizzatore di oligonucleotidi
(ix) CARATTERISTICHE ULTERIORI:
(A) NOME: oligonucleotide
(C) METODO DI IDENTIFICAZIONE:gel di poliacrilammide
(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA SEQ.ID.NO.:3
CGCATCTAGA TTCTTTGCCT TTTTCTGCAG GAACTGGATC AGG)?CTTTTG TGYZCATCTG 60 CACAGCTCTG GC 72 in cui: X pu? essere una base scelta tra A e T
Y pu? essere una base scelta tra A e C
Z pu? essere una base scelta tra A e G.

Claims (8)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodologia per la selezione di superagonisti , antagonisti oppure superantagonisti di un ormone che utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, comprendente le seguenti operazioni: - confrontare le sequenze amminoacidiche dell'ormone della crescita con le sequenze di detto ormone ; - confrontare le sequenze amminoacidiche del recettore dell'ormone della crescita con quelle dei due recettori dell?ormone in questione, cio? il recettore ormone-specifico e gp 130; - sulla base dei confronti, formulare un modello tridimensionale del complesso recettoriale basato sulla analogia funzionale tra sequenze del recettore dell'ormone della crescita e i due recettori dell'ormone in questione; e identificare i residui dell'ormone selvatico in questione che fanno parte rispettivamente del sito di interazione con il recettore specifico e del sito di interazione con gp 130.
  2. 2. Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti o superantagonisti di un ormone che utilizza la molecola di membrana gp 130 per attivare i meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare come da rivendicazione 1, in cui l'ormone in questione ? scelto dal gruppo comprendente Inter leuchina 6 (IL-6) , Oncostatina M (OSM) , Leukemia Inhybitory Factor (LIF) , Ciliary Neurotrophic Factor ( CNTF ) e Interleuchina 11 (IL-11) .
  3. 3. Metodologia per la selezione di superagonist i di interleuchina 6 come da rivendicazione 2, comprendente inoltre le seguenti operazioni addizionali: - produzione di una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei seguenti residui selvatici dell <1 >inter leuchina 6 presente come prodotto di fusione con proteine di fagi filamentosi Giu 42, Giu 51, Ser 52, Ser 53, Lys 54, Giu 55, Asn 63, Lys 66, Met 67, Ala 68, Giu 69, Lys 70, Asp 71, Phe 170, Gin 175, Ser 176, Ser 177, Leu 181, Gin 183; - generazione di una libreria di fagi, ognuno con una sequenza di interleuchina 6 mutante; - selezione, dalla popolazione mista di fagi esprimenti inter leuchine 6 mutanti, quella o quelle che presentano una affinit? per il recettore specifico superiore alla interleuchina 6 selvatica; e - identificazione della migliore o delle migliori sequenze amminoacidiche leganti il recettore mediante sequenziamento del DNA estratto dalle particelle fagiche selezionate.
  4. 4. Metodologia per la selezione di super agon i st i di interleuchina 6 come da rivendicazione 3, in cui si produce una serie di librerie fagiche contenenti mutazioni dei detti residui selvatici dell ' interleuchina 6 presente come prodotto di fusione con la proteina pili di MI 3.
  5. 5. Metodologia per la selezione di antagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazioni da 1 a 2 , comprendente inoltre le seguenti operazioni addizionali: - mutagenesi dei residui identificati come da rivendicazione 1, per essere parte del sito di interazione con gp 130 (Arg 30, Tyr 31, Gly 35, Ser 37, Ala 38, Ser 118, Lys 120, Val 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lys 128 e Lys 129) con tecniche convenzionali di biologia molecolare; - valutazione dell'attivit? biologica e dell' affinit? per il recettore specifico per 1 ' inter leuchina 6 dei mutanti prodotti come sopra, al fine di identificare varianti di interleuchina 6 con intatta affinit? al recettore specifico che presentano riduzione o perdita dell'attivit? biologica; e valutazione delle suddette varianti di interleuchina 6 come antagonisti dell'attivit? biologica dell <1 >interleuchina 6 selvatica.
  6. 6. Metodologia per la selezione di superantagonisti della interleuchina 6 come da rivendicazioni da 2 a 5 mediante combinazione delle variazioni di sequenze amminoacidiche responsabili dell' attivit? antagonista, identificate come sopra, con variazioni amminoacidiche responsabili di una aumentata affinit? del recettore specifico per 1 ' interleuchina 6 .
  7. 7. Metodologia per la selezione di antagonisti o superantagonisti di interleuchina 6 come da rivendicazione 6, in cui la mutagenesi dei residui identificati come sopra ? eseguita con una tecnica di biologia molecolare scelta dal gruppo comprendente Polimerase Chain Reaction, Primer Extension, Oligonucleotide Directed Mutagenesis, e loro combinazioni.
  8. 8. Agonisti, antagonisti e superantagonisti di ormoni che utilizzano la molecola di membrana gp 130 per attivare meccanismi di regolazione della fisiologia cellulare, ottenibili con la metodologia delle rivendicazioni da 1 a 7.
ITRM930409A 1993-06-23 1993-06-23 Metodologia per la selezione di superagonisti, antagonisti e super- antagonisti di ormoni del cui complesso recettoriale fa parte gp 130. IT1261787B (it)

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