PT656117E - Metodo de seleccao de superagonistas de antagonistas e de superantagonistas da interleucina 6 - Google Patents
Metodo de seleccao de superagonistas de antagonistas e de superantagonistas da interleucina 6 Download PDFInfo
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Description
Descrição “Método de selecção de superagonistas, de antagonistas e de superantagonistas da interleucina 6” [0001] A presente invenção refere-se a uma metodologia para seleccionar superagonistas, antagonistas e superantagonistas da interleucina 6 cujo receptor complexo compreende a gp 130.
[0002] Como se sabe, a patente de invenção WO 92/21029 de ‘Genentec Inc.’ explica um método para a determinação de agonistas ou de antagonistas das hormonas do crescimento e de ligandos com uma conformação estrutural semelhante. Os agonistas e antagonistas potenciais são colocados em contacto com um receptor da hormona e isto determina a formação de um complexo ternário constituído por uma molécula do agonista ou do antagonista potencial e duas moléculas de tal receptor para que a hormona seja agonizada ou antagonizada. A dimerização de receptores, induzida por uma molécula de um ligando, permite concluir que o ligando possui dois locais diferentes de interacção (local 1 e local 2) onde é possível trabalhar por mutagénese para gerar agonistas ou antagonistas.
[0003] Descobriu-se agora, surpreendentemente, que os ligandos do grupo das citoquinas semelhantes à interleucina 6 (IL-6), isto é, a oncostatina M (OSM), o factor inibidor da leucemia (FIL), o factor neurotrófico ciliar (FNTC) e a interleucina 11 (IL-11), induzem a formação de um complexo receptor de que faz parte a molécula membranar gp 130. Neste complexo receptor estão sempre presentes, enquanto elementos comuns, o receptor específico para cada uma destas citoquinas e a molécula membranar gp 130. Assim, é possível formular a hipótese de que o local 1 e o local 2 se ligam a duas moléculas diferentes nesta classe de hormonas: o local 1 a um receptor específico e o local 2 à gp 130.
[0004] A identificação dos dois locais é possibilitada, conforme adiante melhor se verá, construindo o modelo tridimensional do complexo receptor, com base na semelhança funcional entre as sequências do receptor da hormona de crescimento humano (HCh) e as sequências dos receptores das hormonas em questão. O isolamento de variantes que tenham, no que diz respeito à hormona de tipo natural, uma maior afinidade com o receptor específico (superagonistas ou superantagonistas) é conseguido por construção de bancos de fagos filamentosos, por exemplo, ο M13, portadores da hormona tanto de tipo natural como na versão mutante.
[0005] A diferença entre o modelo tridimensional, por exemplo, da IL-6, aqui adoptada, e aquela que foi adoptada na patente de invenção WO 92/21029, leva a formular a hipótese de haver resíduos diferentes nas hélices A e C enquanto constituintes do local 2.
[0006] A criação de um modelo da molécula de interleucina 6 humana realiza-se conforme a seguir se descreve. Sabendo que a interleucina 6 humana, tendo em conta os dados disponíveis na literatura científica, pertence a uma classe de citoquinas que possuem 4 hélices que formam o núcleo da sua estrutura tridimensional, efectuou-se a análise da sequência de aminoácidos da interleucina 6 humana para identificar as 4 regiões em que havia a mais alta probabilidade de formação de uma hélice. Na fase subsequente criou-se um modelo destas 4 regiões helicoidais da molécula de interleucina 6, utilizando um computador equipado com uma unidade gráfica interactiva. Para começar, admitiu-se que a orientação das 4 hélices poderia ser igual à observada em hormonas tais como a hormona do crescimento ou o factor estimulador de colónias de macrófagos granulócitos. Para optimizar o acondicionamento dos aminoácidos hidrofóbicos no espaço entre as 4 hélices foram realizados ajustamentos no que diz respeito às posições relativas das hélices. A seguir criou-se um modelo dos elos que ligam as 4 hélices.
[0007] Este modelo tridimensional da interleucina 6 possibilitou a identificação dos dois locais de interacção entre a interleucina 6 humana e os seus dois receptores: o receptor gp 80 de fraca afinidade (local 1) e o receptor gpl30 de elevada afinidade (local 2) para a trans-dução do sinal. Utilizou-se o procedimento a seguir descrito para identificar os dois locais. Por comparação de sequências sabe-se que todos os membros de uma família de receptores hematopoiéticos estão relacionados entre si pelo facto de partilharem um domínio, conhecido por domínio de reconhecimento das citoquinas. Esta semelhança de sequências indica também uma probabilidade elevada de semelhança estrutural nas partes correspondentes dos diversos receptores, incluindo os dois receptores da interleucina 6, o gp 80 e o gp 130. A observação de que as citoquinas que se ligam a estes receptores têm todas elas (ou é possível presumir que tenham) uma estrutura semelhante, isto é, uma matriz de 4 hélices, fundamenta perfeitamente a hipótese de que a interacção entre estas citoquinas e os seus receptores, por meio do domínio de reconhecimento das citoquinas, deve ser bastante semelhante nos complexos biologicamente activos.
[0008] Considerando que a estrutura tridimensional de um destes compostos (o complexo formado pela hormona do crescimento e pelo domínio extracelular do receptor dimérico da hormona do crescimento) foi determinada por cristalografia aos raios X, então o nosso modelo da interleucina 6 humana permite-nos identificar os locais potenciais de interacção entre a interleucina 6 e os seus dois receptores, o gp 80 (local 1) e o gp 130 (local 2). Conclui-se isto por comparação com o complexo a que está associada a hormona do crescimento e admitindo que os aminoácidos funcionalmente importantes estão localizados em posições semelhantes na superfície das duas hormonas.
[0009] A necessidade de haver uma metodologia para a produção de agonistas, antagonistas e superantagonistas, para as hormonas do sistema imunitário cujo complexo receptor compreende o gp 130, será explicada tomando como referência o caso da interleucina 6.
[0010] Como se sabe, a interleucina 6 é um polipeptido de 184 aminoácidos que pertencem, conforme descrito, à classe das citoquinas helicoidais. A interleucina 6 é uma citoquina multifuncional produzida por diversos tipos de células. Actua como um factor de diferenciação e de crescimento em células de diversos tipos tais como, por exemplo, as células do sistema imunitário, os hepatócitos, os esplenócitos, as células histaminais hematopoiéticas, os ceratinócitos e os neurónios.
[0011] A produção de superagonistas da interleucina 6 poderia permitir a utilização de doses terapêuticas menores do que as necessárias com a interleucina 6 natural para o tratamento de inúmeras doenças graves. Com efeito, a interleucina 6 possui importantes e promissoras aplicações no tratamento do cancro da mama, da leucemia e de doenças infecciosas ou de doenças associadas a disfunções da medula óssea produtora de células.
[0012] Por outro lado, a produção de superantagonistas ou de superantagonistas da interleucina 6 humana poderia permitir a inibição da interleucina 6 em inúmeras doenças caracterizadas pela sua produção excessiva, tais como as doenças crónicas de natureza auto-imunitária, o mieloma/plasmacitoma, a osteoporose pós-menopausa e a caquexia cancerosa.
[0013] A metodologia para a selecção de superagonistas, antagonistas ou superanta-gonistas de uma interleucina 6, utilizando a molécula membranar gp 130 para activar o mecanismo regulador da fisiologia celular, de acordo com a presente invenção, compreende as operações seguintes: - comparar as sequências de aminoácidos da hormona do crescimento com as sequências da referida interleucina 6; - comparar as sequências de aminoácidos do receptor da hormona do crescimento com as dos dois receptores da interleucina 6, ou seja, com o receptor específico da interleucina 6 e com o gp 130; - com base nas comparações anteriores, formular um modelo tridimensional do complexo receptor, assente na semelhança funcional entre as sequências do receptor da hormona do crescimento e as dos dois receptores da interleucina 6 em questão; - identificar os resíduos da interleucina 6 de tipo natural que são uma parte do local de interacção com um receptor específico e os do local de interacção com o gp 130, respectivamente; - introduzir mutações nos locais de interacção da interleucina 6; - avaliar a actividade biológica dos mutantes.
[0014] Para a selecção de superagonistas da interleucina 6, a metodologia de acordo com a presente invenção compreende ainda as seguintes operações complementares: - produção de um conjunto de fagotecas (bancos de fagos) que contenham mutações dos seguintes resíduos de tipo natural da interleucina 6, presentes sob a forma de um produto de fusão com as proteínas dos fagos filamentosos
Glu 42, Glu 51, Ser 52, Ser 53, Lis 54, Glu 55, Asn 63, Lis 66, Met 67, Ala 68,
Glu 69, Lis 70, Asp 71, Phe 170, Gin 175, Ser 176, Ser 177, Leu 181, Gin 183; - gerar uma fagoteca, em que cada fago possui uma sequência de interleucina 6 mutante; - seleccionar, entre a população de fagos que exprimem os mutantes de interleucina 6, aquele ou aqueles que possuam com o receptor específico uma afinidade superior à da interleucina de tipo natural; 6
- identificar a melhor sequência ou as melhores sequências de aminoácidos que se ligam ao receptor, por sequenciação do ADN extraído das partículas de fagos seleccionados.
[0015] Neste caso, é possível produzir um conjunto de fagotecas que contenham mutações dos referidos resíduos de tipo natural da interleucina 6, presente como produto de fusão com a proteína pIII do M13.
[0016] A metodologia para seleccionar antagonistas da interleucina 6, de acordo com a presente invenção, compreende, conjuntamente com as operações indicadas supra, as operações seguintes: - mutacionar os resíduos identificados na reivindicação 1 para fazerem parte do local de interacção com o gp 130 (Arg 30, Tir 31, Gli 33, Ser 37, Ala 38, Ser 118, Lis 120, Vai 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lis 128 e Lis 129), utilizando para tal técnicas convencionais da biologia molecular; - avaliar a actividade biológica e a afinidade com o receptor específico da interleucina 6, dos mutantes produzidos conforme descrito supra, com a finalidade de identificar variantes da interleucina 6 cuja afinidade com o receptor específico esteja intacta e que revelem uma redução ou uma perda da actividade biológica; - avaliar as referidas variantes da interleucina 6, enquanto antagonistas da actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural.
[0017] No caso de se efectuar a selecção de superantagonistas da interleucina 6, por combinação das variações das sequências de aminoácidos responsáveis pela actividade antagonista, conforme indicado supra, com as variações de aminoácidos responsáveis por um aumento da afinidade do receptor específico com a interleucina 6.
[0018] Na metodologia para seleccionar os superantagonistas da interleucina 6, a mutagénese dos resíduos, identificados conforme enunciado antes, pode ser realizada utilizando uma técnica da biologia molecular seleccionada entre o grupo que compreende a reacção em cadeia com a polimerase, o prolongamento do iniciador, a mutagénese dirigida com um oligonucleótido e suas combinações.
[0019] Até este ponto apresentou-se uma descrição geral do assunto da presente invenção. Com o auxílio dos exemplos seguintes apresentar-se-á uma descrição minuciosa dos casos específicos da invenção, com a finalidade de se proporcionar uma melhor compreensão dos objectivos, características, vantagens e métodos da sua aplicação. A figura 1 ilustra o arquétipo pHenAhlL-6 (o mesmo que pHenAIL-6h) e a produção de partículas fasmídicas (ver o exemplo 1 “Construção dos vectores”) utilizadas para a selecção de agonistas da hIL-6 (o mesmo que IL-6h). A figura 2 ilustra a variação da actividade antagonista do mutante Tir31 Asp/Gli35Phe/ /Serl 18Arg/Vali21Asp da IL-6 em função do aumento da sua concentração.
DEPÓSITOS
[0020] Efectuou-se o depósito de bactérias E. coli K12 - transformadas utilizando o plasmídeo pHenAhIL-6 que contém, desde o local de reconhecimento da enzima de restrição Sall até ao da enzima de restrição Notl, uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de aminoácidos da interleucina 6 humana de tipo natural - em 10/6/1993 na Colecção Nacional de Bactérias Industriais e Marinhas Lda. (National Collection of Industrial and Marine Bactéria Ltd., NCIMB), Aberdeen, Escócia, Reino Unido, com o número de acesso NCIMB 40563. 8
Exemplo 1
Aplicação da metodologia de acordo com a presente invenção à seleccão de agonistas de interleucina 6
1) CONSTRUÇÃO DOS VECTQRES
[0021] A estratégia consiste em construir um gene híbrido que contenha toda a região que codifica a IL-6h seguida pelos últimos 157 aminoácidos da proteína ρΙΠ do fago M13 e precedida pela sequência Pel B, o qual veicula a proteína sintetizada para o espaço periplásmico.
[0022] A expressão do gene híbrido é comandada pelo promotor lacZ. A construção é realizada no contexto do vector pHenAe e recebe o nome de pHenAhIL-6 (ver o único número inscrito). Este plasmídeo contém também uma origem de replicação do fago. Se uma célula bacteriana que contenha este plasmídeo for infectada por um bacteriófago designado por “auxiliar”, tal como ο M13K07, serão produzidas cópias filamentares singulares pelo plasmídeo e irão ser recobertas com as proteínas do fago, exactamente como um genoma genuíno do fago. Estas partículas do fago que contêm o plasmídeo são conhecidas por fasmídeos. Conjuntamente com as moléculas ρΙΠ normais, também contêm as moléculas de fusão hIL6-pIII (o mesmo que IL-6h-pIII). Assim, uma molécula hIL-6 e o gene que codifica a sua sequência de aminoácidos estão contidos na mesma unidade. No caso das moléculas mutantes irá ser possível determinar a sequência de aminoácidos das moléculas expostas sobre as superfícies dos fagos obtidos pelos processos de selecção, sequenciando simplesmente o ADN fasmídico.
[0023] Uma outra característica da construção do pHen hJL-6 é a presença de um codão de paragem da tradução entre o gene da EL-6 e o gene da ρΙΠ. A produção da proteína híbrida tem lugar em estirpes bacterianas capazes de suprimirem este codão de paragem. 9
Mutatis mutandis, a utilização de estirpes não supressoras permite a produção apenas de hJL-6, directamente no espaço periplásmico.
[0024] As experiências a seguir descritas demonstram a possibilidade de se utilizar shrIL-6R (o mesmo que IL-6Rhrs) para purificar, entre o grande conjunto de interleucinas 6 mutantes expostas ao fago, utilizando pHen hIL-6, as que possuam a máxima afinidade com o referido receptor, por meio de ciclos de selecção por amplificação.
2) EXPERIÊNCIAS DE CARACTERIZAÇÃO DO SISTEMA
a) Teste de EISLE
[0025] Numa experiência efectuada por EISLE (o mesmo que ELISA), recobriu-se as cavidades das placas com fasmídeos de hIL-6 ou com M13K07 e fez-se com que reagissem com shrIL-6R (IL-6R humana recombinante solúvel). Após lavagens repetidas, a presença do receptor foi revelada utilizando um anticorpo monoclonal específico conjugado com fosfatase alcalina. O sinal obtido é maior no caso dos fasmídeos de hIL-6 e aumenta à medida que aumenta também a quantidade de receptor utilizado.
b) Enriquecimento do fasmídeo de hfL-6 com misturas de fasmídeo K07 utilizando shrIL-6R
[0026] Misturou-se partículas do fasmídeo de hIL-6 com partículas de M13K07 à razão de 1:100. Efectuou-se a incubação desta mistura com esferas de estireno recobertas com shrIL-6R. Após lavagens repetidas, para valores neutros do pH, submeteu-se as referidas esferas a uma lavagem rigorosa a pH 4,2, seguindo-se a eluição a pH 3,6. Determinou-se então a proporção definida pela relação fasmídeos de hIL-6:M13K07 no produto resultante da eluição. Comprovou-se que essa proporção era de 1:10, com um enriquecimento consequente em cerca de 10 vezes mais fasmídeos de hIL-6 comparativamente com ο M13K07. c) Seleccão de misturas que possuem a afinidade mais elevada com o receptor gp 80, a partir de misturas de interleucinas 6 mutantes [0027] Foram produzidas partículas fasmídicas que possuem, sobre as suas superfícies, moléculas mutantes de hIL-6 com uma afinidade superior (176 Arg) ou inferior (179 Ala) com o receptor, comparativamente com a versão natural. Misturou-se estas partículas à razão de 1:1. Efectuou-se a incubação da mistura com o receptor numa fase sólida (conforme descrito na alínea b). No produto da eluição a pH 3,6, a proporção entre os dois tipos de partículas foi de 15:1 favorável a 176 Arg. d) Determinação da afinidade relativa das partículas de M13K07. das partículas fasmídicas de hEL-6, das partículas fasmídicas de 176 Arg e das partículas fasmídicas de 179 Ala com o receptor gp 80 [0028] Efectuou-se a incubação, separadamente, de quantidades iguais de partículas dos diversos tipos enumerados supra com esferas recobertas com o receptor. A seguir à habitual sequência de lavagens, determinou-se para cada tipo de fago o número de partículas recuperadas a partir do eluente, a pH 3,6. Tendo em conta que o valor das partículas recuperadas no caso do fasmídeo hIL-6 era igual a 1, obteve-se um valor igual a 3 no caso da 176 Arg, igual a 0,2 no caso da 179 Ala e igual a 0,18 no caso do M13K07. Estes valores reflectem as afinidades relativas das moléculas de IL-6 não expostas no fago. Com efeito, sabe-se que a 176 Arg se liga ao receptor com uma finidade três vezes superior à da molécula natural, ao passo que no caso da 179 Ala a afinidade de ligação ao receptor é reduzida quase a 0 (na realidade, um fasmídeo com o seu mutante, no que diz respeito à ligação ao receptor, comporta-se como ο M13K07). 11
13 [0029] Este conjunto de experiências comprovou que é possível seleccionar, utilizando o método de acordo com a presente invenção, a partir de misturas de mutantes expostos aos fagos, aqueles que possuam a maior afinidade com o receptor.
Exemplo 2
Geração e seleccão de antagonistas da interleucina 6 utilizando a metodologia de acordo com a presente invenção [0030] Utilizou-se o plasmídeo PhenAhIL-6 como matriz para todas as reacções de mutagénese. Este plasmídeo é um derivado do plasmídeo pHEN 1 e contém a zona que codifica a EL-6 humana (SEQ Π) NO:l) a montante da zona que codifica a parte do terminal carboxi (desde o codão 250 até à extremidade COOH) da proteína ρΙΠ do bacteriófago M13; as duas zonas codificantes estão no quadro de leitura ininterrupta e estão separadas por um codão de paragem UAG Ambar, o qual pode ser suprimido nas estirpes bacterianas que possuam o gene do supressor SupE integrado no seu genoma. A zona que codifica a IL-6 humana também está no quadro de leitura ininterrupta, por baixo do péptido PelB, uma sequência de sinal para secreção, e o gene integral está sob o controlo do promotor LacZ. Finalníente, introduziu-se um local singular para a enzima de restrição Saci na sequência nucleotídica que codifica os aminoácidos 20-21-22 da hIL-6, sem alterar a sua identidade, e introduziu-se também um local singular para a enzima de restrição Bfrl na zona codificahte dos aminoácidos 38-39-40 da hIL-6, também neste caso sem efectuar modificações.
[0031] Recorreu-se a uma estratégia de RCP (Reacção em Cadeia com Polimerase) para gerar mutações dentro dos codões seleccionados nà zona que codifica a interleucina 6 humana. O iniciador de jusante é ο H9, um iniciador de 32 nucleótidos, correspondente às
posições 426-457 (filamento anti-sentido) do ADNc da hIL-6 (atribuindo o número 1 ao primeiro nucleótido do primeiro codão do polipeptido maduro). O local de hibridação do iniciador está a jusante do local de reconhecimento para a enzima Xbal, naturalmente presente no ADNc. O iniciador mutagénico de montante é o ‘IL-6 31D/35 PCR’ um iniciador de 70 nucleótidos cuja sequência é a SEQID NO:2.
[0032] O iniciador ‘IL-6 31D/35 PCR’ vai desde a posição 55 até à posição 124 (filamento de sentido normal) do ADNc da hIL-6 e introduz degenerações nos codões que codificam os aminoácidos 31 (tirosina de tipo natural) e 35 (glicina de tipo natural). Amplificou--se um fragmento de ADN de 403 pares de bases recorrendo à RCP, em conformidade com protocolos convencionais de amplificação por RCP. A amplificação foi efectuada em 35 ciclos. Cada ciclo consistiu de uma incubação durante 2 minutos a 94°C para desnaturar a matriz, 2 minutos a 50°C para hibridar o oligonucleótido e 3 minutos a 72°C para prolongar a cadeia. O fragmento amplificado foi então digerido com Saci e Xbal e purificado utilizando gel de agarose a 2%. O fragmento gerado por RCP e digerido pelas duas enzimas foi então ligado dentro do vector pHen hIL-6 digerido com as mesmas duas enzimas, purificado sobre gel de agarose a 0,8%, para substituir a sequência de tipo natural.
[0033] O quadro I a seguir apresentado mostra a actividade biológica, em células do hepatoma humano, e a ligação ao receptor gp 80 da interleucina 6 de tipo natural e suas mutações, estando as mutações assinaladas com um asterisco. 13 QUADRO 1
Propriedades de ligação ao receptor e actividade biológica da interleucina 6 de tipo
natural e dos seus mutantes na hélice A 27 30 35 -40 Acuvidade Ligação ao biológica receptor
Lis* On De Arg Ti* De Leu Asp ca* De Ser Ala Leu Arg Lis Glu 100% 100% Ala Gin Qe Aig Tir De Leu Asp Gin Ώιτ Ser Ala Leu Arg Lis du 80· 19% 100 4% Lis Gin De Arg Asp De Leu Asp Tir De Ser Ala Leu Arg Lis Glu 45 1% 83% Lis Gin De Aig Asp De Leu Asp Phe De Ser Ak Leu Arg Lis Ou 2*0,5% 80 B 2% Lis Gin De Aig Asp De Leu Asp Leu De Ser Ala Leu Arg Lis Ala 6· 4% 177 B 7% Lis Gin Be Aig Asp De Leu Asp His De Ser Ala Leu Arg Lis Glu 38 B 8% 85 B 15% Lis Gin De Aig Asp De Leu Asp Cis De Ser Ala Leu Arg Lis Ou 30 1% 82 B 18%
Conforme se conclui a partir deste quadro, os mutantes (Tir31Asp, Gli35Tir), (Tir31Asp, Gli35Phe) e (Tir31Asp, Gli35Leu, Glu42Ala) possuem menor actividade biológica quando comparados com a interleucina 6 de tipo natural. Na totalidade dos três casos a actividade residual é de 2-5% da actividade da interleucina 6 de tipo natural. Os três mutantes mantêm a sua capacidade total pra se ligarem ao receptor gp 80 da interleucina 6. Em conclusão, os três mutantes possuem uma actividade de transdução do sinal decrescente nas células do hepatoma. Dito por outras palavras, são antagonistas da interleucma 6 de tipo natural. Em particular, o mutante (Tir31Asp, Gli35Phe) é um antagonista particularmente eficaz na medida em que é capaz de reduzir a actividade da interleucina 6 de tipo natural quando utilizado com um excesso molar 50 vezes superior nos testes realizados com células do hepatoma humano.
Exemplo 3
Geração e selecção de outros antagonistas da interleucina 6 utilizando a metodologia de acordo com a presente invenção
Utilizou-se como matriz o plasmídeo pHENAhIL-6, descrito no exemplo anterior, em todas as reacções mutagénicas. Recorreu-se a uma estratégia de RCP (Reacção em Cadeia
com Polimerase) para gerar mutações dentro dos codões seleccionados para a zona codi-ficante da interleucina 6 humana. O iniciador referido supra é o HP/1, um iniciador com 29 nucleótidos, correspondendo às posições 1-19 (filamento de sentido natural) do ADNc da hIL-6 (sendo atribuído o número 1 ao primeiro nucleótido do primeiro codão do polipeptido maduro). O local de hibridação do iniciador está a montante do local de reconhecimento da enzima Saci, introduzido artificialmente no ADNc, sem alteração da sequência por este codificada, conforme descrito no exemplo 2. O iniciador mutagénico por baixo é o ‘IL-6 118RCLF/121VD’, um iniciador com 72 nucleótidos, cuja sequência é a SEQ ID NO:3. O iniciador ‘EL-6 118RCLF/121VD’ vai desde a posição 334 até à posição 405 (filamento anti-sentido) do ADNc da hIL-6 e introduz degenerações nos codões que codificam o aminoácido 118 (serina de tipo natural) e o aminoácido 121 (valina de tipo natural). Amplificou-se um fragmento de ADN de 415 pares de bases por RCP, em conformidade com protocolos convencionais de amplificação por RCP. A amplificação foi realizada em 35 ciclos. Cada ciclo consistiu de uma incubação durante 2 minutos a 94°C para desnaturar a matriz, 2 minutos a 50°C para hibridar o oligonucleótido e 3 minutos a 72°C para aumentar a cadeia. O fragmento amplificado foi digerido com as enzimas Saci e Xbal e purificado utilizando gel de agarose a 2%. O fragmento gerado por RCP e digerido pelas duas enzimas foi ligado dentro do vector pHenAhIL-6 digerido com as mesmas duas enzimas, purificado sobre gel de agarose a 0,8%, para substituir a sequência de tipo natural.
[0034] O quadro 2 a seguir apresentado mostra a actividade biológica, nas células do hepatoma humano, e a ligação ao receptor da interleucina 6 e das suas versões com mutações nos resíduos indicados.
15 QUADRO 2
Propriedades de ligação ao receptor e actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural e das versões com suas mutações na hélice C 118 Ser 121 Vai Actividade biológica Ligação ao receptor a 100% a 100% Arg Vai 66% 81% Leu Asp 36 4% 92% Arg Asp 3,5 0,5% 66 5% Ser Asp 58 23% 78 a 2% [0035] É possível observar que o mutante IL-6 Ser 118Arg/Vall21Asp possui caracte-rísticas muito semelhantes às do mutante IL-6 Tir3 lAsp/Gli35Phe descrito no quadro 1, ou seja, liga-se normalmente ao receptor de tipo I da interleucina 6, mas a actividade biológica das citoquinas é reduzida aproximadamente 30 vezes.
Exemplo 4
Geração e selecção de antagonistas mais poderosos da interleucina 6 utilizando a metodologia de acordo com a presente invenção [0036] Neste caso utilizou-se o plasmídeo pHENAhIL-6 Tir31Asp/Gli35Phe, obtido conforme descrito no exemplo 2, como matriz para todas as reacções mutagénicas.
[0037] Praticou-se uma estratégia de RCP (Reacção em Cadeia com Polimerase) para gerar mutações dentro dos codões seleccionados para a zona que codifica a interleucina 6 humana. O iniciador referido antes é o HP/1, descrito no exemplo anterior. O iniciador muta-génico por baixo é ‘IL-6 118RCLF/121VD’, também descrito no exemplo anterior. Amplificou--se um fragmento de ADN de 415 pares de bases recorrendo à RCP, em conformidade com protocolos convencionais de amplificação por RCP. A amplificação foi realizada em 35 ciclos. Cada ciclo consistiu de uma incubação durante 2 minutos a 94°C para desnaturar a matriz, 2 minutos a 50°C para hibridar o oligonucleótido e 3 minutos a 72°C para aumentar a cadeia. O fragmento amplificado foi digerido com as enzimas Saci e Xbal e purificado utilizando gel de agarose a 2%. O fragmento gerado por RCP e digerido pelas duas enzimas foi ligado dentro do vector pHen hIL-6 digerido com as mesmas duas enzimas, purificado sobre gel de agarose a 0,8%, para substituir a sequência de tipo natural.
[0038] O quadro 3 seguinte mostra a actividade biológica, em células do hepatoma humano, e a ligação ao receptor da interleucina 6 de tipo natural e das suas versões com mutações nos resíduos indicados. QUADRO 3
Propriedades de ligação ao receptor e actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural e das suas versões com mutações nas hélices A e C Hélice A Hélice C 31 35 118 121 Actividade biológica Ligação ao receptor Tir Gli Ser Vai 100% 100% Asp Phe Leu Vai 1,4% N.D. Asp Phe Arg Vai 5,4· 1,1% 66 2% Asp Phe Leu Asp 0% 63 4% Asp Phe Arg Asp 0% 97 15% Asp Phe Phe Asp 0% 76 26% N.D. = Não determinado [0039] Três das variantes com mutações tanto na hélice A como na hélice C não revelaram nenhum sinal de actividade biológica nas células do hepatoma humano, mantendo 17 contudo a sua capacidade para se ligarem ao receptor gp 80. Entre estas três proteínas, o mutante ‘EL-6 Tir31Asp/Gli35Phe/Serll8Arg/Vall21Asp’ foi seleccionado para experiências de competição com a actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural em células do hepatoma humano. Efectuou-se a estimulação das células com interleucina 6 de tipo natural à razão de 4 nanogramas por mililitro (ng/mL) de meio de cultura, na presença de concentrações cada vez maiores de mutante. Conforme ilustrado na figura 2 (em que a actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural é expressa em unidades arbitrárias), as concentrações cada vez maiores de mutante permitem antagonizar totalmente os efeitos da interleucina 6 de tipo natural em células do hepatoma humano.
[0040] O quadro 4 ilustra os níveis de inibição (em percentagem) da actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural em função da concentração de antagonista (expresso em nanogramas por mililitro, em valor de excesso molar comparativamente com a interleucina 6 de tipo natural e ainda em nanomoles por litro). QUADRO 4
Inibição da actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural em função da concentração de antagonista IL-6 g/mL Tir31 Asp/Gli35Phe/Ser 118Arg/V al 121 Asp Inibição da 1L-6 de tipo natural (%) excesso molar concentração (nM) 16 4 X 0,7 nM 23% 60 15 X 2,7 nM 28% 164 41 X 7,5 nM 50% 500 125 X 22,7 nM 75% 1000 250 X 45,5 nM 82% 2000 500 X 90,0 nM 90% 4000 1000 X 181,8 nM 96% 18
Exemplo 5 Q antagonista da interleucina 6, gerado e seleccionado graças à metodologia descrita na presente invenção, inibe o crescimento de células do mieloma humano dependentes da interleucina 6 [0041] No exemplo anterior demonstrou-se que um dos mutantes, designadamente o ‘IL-6 Tir31Asp/Gli35Phe/Serll8Arg/Vall21Asp’ era capaz de inibir a actividade biológica da interleucina 6 (estimulação da transcrição por acçao de um promotor induzível de interleucina 6) nas células do hepatoma humano. Na parte introdutória do presente pedido de patente de invenção afirmou-se que o desenvolvimento de antagonistas ou superantagonistas da interleucina 6 iria ter aplicação prática, visto que poderiam ser utilizados para inibir a actividade da interleucina 6 em doenças caracterizadas por uma produção excessiva de interleucina 6, tal como sucede em diversas formas de plasmacitoma/mieloma múltiplo. Apresentamos aqui um outro exemplo, demonstrando que os três mutantes IL-6 Tir31Asp/Gli35Phe/Serll8Arg/Vall21Asp (DFRD), IL-6 Tir3 lAsp/Gli35Phe/Serl 18Phe/Vall21Asp (DFFD), IL-6 Tir31Asp/Gli35Phe/Serll8Leu/VaI121Asp (DFLD) inibem completamente o crescimento de uma linhagem celular do mieloma humano, designada por XG-1, dependente da interleucina 6, sendo tal linhagem obtida a partir de células de mieloma recentemente isoladas num paciente com doença terminal. O crescimento da linhagem de células de mieloma XG-1 é estritamente dependente da interleucina 6 acrescentada de forma exógena, de modo idêntico ao que foi demonstrado no caso de células recentes de mieloma, pelo que esta linhagem celular pode ser considerada um excelente modelo in vitro da doença do mieloma múltiplo (Jourdan, M., Zhang, X-G., Portier, M., Boiron, J.-M., bataille, R. e Klein, B. (1991) ‘J. Immunol.’ 147, 4402-4407). Para testar o antagonismo dos mutantes 15 sobre a interleucina 6 de tipo natural procedeu-se à criação em cultura de células do mieloma XG-1 em placas de microtitulação de 96 cavidades à razão de 6000 células/microcavidade com interleucina 6 de tipo natural na concentração de 0,1 nanogramas por mililitro (ng/mL) de meio de cultura, na presença de concentrações cada vez maiores de cada um dos três mutantes. Ao fim de 7 dias de cultura procedeu-se a uma avaliação do número de células por determinação colorimétrica dos níveis da hexosaminidase (Landegren, U. (1984) ‘J. Immunol. Methods’ 67, 379-388). O quadro 5 seguinte traduz a inibição da actividade da interleucina 6 de tipo natural em função das concentrações dos três antagonistas (expressas em nanogramas de mutante por mililitro de meio de cultura). QUADRO 5
Inibição da actividade da interleucina 6 de tipo natural (estimulação do crescimento das células do mieloma humano XG-1) em função da concentração dos três antagonistas Antagonista Inibição da interleucina 6 de tipo natural em função da concentração DFRD DFFD DFLD 3,3 ng/mL 6% 0% 0% 10 ng/mL 12% 7% 3% 30 ng/mL 25% 18% 10% 90 ng/mL 42% 35% 31% 270 ng/mL 64% 59% 53% 810 ng/mL 84% 84% 71% 2430 ng/mL 90% 90% 76% 7290 ng/mL 93% 95% 81% [0042] Conforme se pode concluir do quadro anterior, todos os mutantes são antagonistas particularmente eficazes da actividade biológica da interleucina 6 sobre as células do mieloma humano.
Exemplo 6
Aplicação da metodologia de acordo com a presente invenção para seleccionar novos superagonistas da interleucina 6 [0043] Construiu-se uma fagoteca (contendo mutações dos resíduos Gin 175, Ser 177, Leu 181 e Leu 183 da interleucina 6 de tipo natural, presente sob a forma de um produto de fusão com a proteína de fagos filamentosos), em conformidade com a técnica da biologia molecular de Ampliação do Iniciador. O oligonucleótido mutagenético é o ‘IL-6 QSLQ (AS)’, um oligonucleótido de 62 nucleótidos cuja sequência é a SEQ ID NO:4. O iniciador ‘DL-6 QSLQ (AS)’ vai desde a posição 507 até ao codão de paragem do ADNc da interleucina 6 (cadeia anti-sentido), introduz degenerações nos codões que codificam os aminoácidos 175 (Gin de tipo natural), 177 (Ser de tipo natural), 181 (Leu de tipo natural) e 183 (Gin de tipo natural) e introduz também um local de restrição Notl a jusante do codão de paragem da interleucina 6. Utilizou-se o oligonucleótido ‘IL-6 QSLQ pr. Bam’, cuja sequência é a SEQ ID NO:5, como iniciador para a reacção de Ampliação do Iniciador. O oligonucleótido ‘IL-6 QSLQ pr. Bam’ vai desde a posição 503 até à posição 522 (cadeia de sentido normal) do ADNc da interleucina 6 e contém um local de reconhecimento BamHI dentro dos nove nucleótidos de 5’. Os dois oligonucleótidos são complementares entre si numa região correspondente à extensão desde a posição 507 até à posição 522 do ADNc da interleucina 6. Os dois oligonucleótidos foram recombinados in vitro e depois esses oligonucleótidos recombinados foram utilizados como substrato para uma reacção de Ampliação do Iniciador, realizada utilizando a enzima de Klenow. O fragmento de ADN de cadeia dupla assim obtido foi então digerido com BamHI (compatível com BglH) e com Notl e ligado dentro do plasmídeo ‘phenAhIL-6’ digerido com BglII (compatível com BamHI) e com Notl, com a finalidade de
se efectuar a substituição da sequência de tipo natural pelas sequências mutacionadas. O produto de ligação foi inserido em bactérias, proporcionando grosso modo um milhão de transformantes independentes (“transformante” é o termo que serve para designar uma bactéria que tenha sido incorporada num plasmídeo recombinante). As bactérias transformadas foram infectadas com o bacteriófago auxiliar M13K07 para gerar a fagoteca (um banco de fasmídeos), coníorme descrito no exemplo 1.
[0044] Realizou-se então na fagoteca uma selecção por incubação com esferas de polistireno recobertas com shrIL-6R, conforme descrito no exemplo 1. A população de fagos, eluída a pH 3,6, foi depois amplificada em bactérias. Ao fim de 5 ciclos de selecção/ /amplificação, os fagos seleccionados aleatoriamente foram sequenciados na região mutagenizada e as correspondentes proteínas de interleucina 6 mutantes foram produzidas no espaço periplásmico da estirpe bacteriana adequada (conforme descrito no exemplo 1) e testadas para pesquisa da ligação ao receptor e da actividade biológica sobre as células do hepatoma humano. O quadro 6 demonstra que é possível, graças à utilização da metodologia da presente invenção, seleccionar superagonistas da interleucina 6, moléculas mutantes que possuem uma maior ligação ao receptor e também uma maior actividade biológica sobre as células do hepatoma humano.
QUADRO 6
Propriedades de ligação ao receptor e actividades biológicas da interleucina 6 de tipo natural e dos seus mutantes na hélice D Posição 175 177 181 183 Ligação ao receptor (%) Actividade biológica (%) tipo natural Gin Ser Leu Gin 100% 100% fago 5-4 Gin Ser Leu Tir 240% 130% fago 5-8 Gin Ser Leu Ala 240% 120% fago 5-2 De Ser Leu Ala 260% 150% fago 4-8 Gin Ser De Asn 100% N.D. fago 5-3 De Ser Vai His 80% N.D. N.D.: não determinado [0045] As mutações selecdonadas pela metodologia de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas como ponto de partida para o desenvolvimento de superagonistas da interleucina 6 mais poderosos. Isto é demonstrado neste exemplo em que a mutação identificada no fago 5-2 é combinada com a mutação Serl76Arg para a qual se sabe pela técnica anterior que aumenta simultaneamente a ligação ao receptor e a actividade biológica (ver a publicação da patente de invenção internacional WO 94/11402 de um pedido de patente de invenção PCT da presente requerente, depositado a 2/11/93 com prioridade italiana de 6/11/92). As três mutações foram agrupadas no mesmo ADNc por mutagénese dirigida com um oligo-nucleótido. O oligonucleótido 175I/176R/183A (S), cuja sequência é a SEQ ID NO:6, tem um comprimento de 73 nucleótidos e vai desde a posição 499 até ao codão de paragem (cadeia de sentido normal) do ADNc da interleucina 6 presente em ‘phen hIL-6’ e que possui um local de reconhecimento para a enzima Notl a jusante do codão de paragem. O oligonucleótido 175I/176R/183A (AS), cuja sequência é a SEQ ED NO:7, tem um comprimento de 73 nucleótidos e vai desde a posição 499 até ao codão de paragem (cadeia anti-sentido) do
23 ADNc da interleucina 6 presente em ‘phenAhIL-6’ e que possui um local de reconhecimento para a enzima Notl a montante do codão de paragem. Os dois oligonucleótidos sào complementares entre si e codificam ambos o aminoácido isoleucina na posição 175, o aminoácido serina na posição 176 e o aminoácido alanina na posição 183. Os dois oligonucleótidos foram recombinados in vitro, o fragmento de ADN de cadeia dupla assim obtido foi digerido com as enzimas de restrição Bglfi e Notl e ligado dentro do vector ‘phenAhiL-6’ digerido com as mesmas duas enzimas, com a finalidade de se substituir a sequência de tipo natural com a sequência mutacionada. A correspondente variante da interleucina 6 portadora das três mutações desejadas foi produzida no espaço periplásmico da estirpe bacteriana adequada (conforme descrito no exemplo 1) e testada para pesquisa da ligação ao receptor e da actividade biológica sobre as células do hepatoma humano. O quadro 7 adiante apresentado resume as propriedades de ligação ao receptor e a actividade biológica sobre as células do hepatoma humano, tanto do novo muíaníe triplo como do mutante duplo progenitor. QUADRO 7
Propriedades de ligação ao receptor e actividades biológicas da interleucina 6 de tipo natural e das versões com mutações duplas e triplas na hélice D Posição 175 176 183 Ligação ao receptor (%) Actividade biológica (%) tipo natural Gin Ser Gin 100% 100% fago 5-2 Ile Ser Ala 260% 150% mutante triplo lie Arg Ala 450% 260% [0046] Conforme se conclui do quadro anterior, o mutante portador das substituições Glnl75Ile/Serl76Arg/Glnl83Ala é um superagonista da interleucina 6 muito mais eficaz do que o mutante progenitor portador apenas das duas substituições Glnl75Ile/Glnl83Ala. 24
Exemplo 7
Aplicação da metodologia de acordo com a presente invenção à seleccão de superantagonistas da interleucina 6 [0047] As três mutações Glnl75Ile/Serl76Arg/Glnl83Ala, identificadas no exemplo 6, que aumentam fortemente a capacidade de ligação ao receptor, foram combinadas com as quatro mutações Tir3 lAsp/GH35Phe/Serl 18Arg/VaI12 lAsp, descritas nos exemplos 4 e 5, que manifestam o mais forte comportamento antagonístico, por meio de uma estratégia de RCP. Testou-se a proteína mutante correspondente, designada por mutante SAnt 1, e que contém a totalidade das sete mutações, tanto para pesquisa da ligação ao receptor como para investigação do comportamento antagonístico nas células do mieloma e do hepatoma humanos, estando indicadas no quadro 8 subsequente as propriedades de ligação ao receptor tanto para o SAnt 1 como para o DFDR (o mutante a partir do qual foi obtido o SAnt 1), conjuntamente com as quantidades (em nanogramas de mutante por mililitro de meio de cultura) de mutante necessárias para inibir 50% da actividade biológica da interleucina 6 (as células do hepatoma foram estimuladas com 4 nanogramas de interleucina 6 de tipo natural por mililitro de meio de cultura, ao passo que as células do mieloma foram estimuladas com 0,1 nanogramas de interleucina 6 por mililitro de meio de cultura, devido à mais elevada sensibilidade destas últimas células à interleucina 6 de tipo natural. 25 QUADRO 8
Inibição da actividade da interleucina 6 de tipo natural sobre as células do mieloma e do hepaioma humanos em função da capacidade dos antagonistas para se ligarem ao receptor Antagonista Ligação ao receptor Inibição a 50% da actividade da interleucina Actividade sobre as (% em peso) 6 nas células do hepatoma células do mieloma Hep3B HepG2 XG-1 DFRD 97% 164ng/mL 132ng/mL 190nginL SAntl 406% 19ng/mL 32ng/mL 22ng/mL
[0048] Conforme se infere do quadro, a introdução das três mutações descritas no exemplo 6 (Glnl75Ile/Serl76Arg/Glnl83Ala) aumentou simultaneamente a capacidade do mutante DFRD progenitor para se ligar ao receptor e fez diminuir fortemente a quantidade necessária de antagonista para inibir 50% da actividade biológica da interleucina 6 sobre as linhagens celulares testadas, gerando consequentemente um superantagonista muito eficaz da interleucina 6.
ENUMERAÇÃO DAS SEQUÊNCIAS INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: INSTITUTO Dl RICERCHE Dl BIOLOGIA MOLECOLARE P. ANGELETTI S.p.A. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Método de selecção de superagonistas, de antagonistas e de superantagonistas da interleucina 6 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Società Italiana Brevetti (B) RUA: Piazza di Pietra, 39 (C) CIDADE: Roma (D) PAÍS: Itália (E) CÓDIGO POSTAL: 1-00186 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: DI CERBO, Mario (Dr.)Svensson, Leonard R.
(C) REFERÊNCIA: RM/090075/MDC (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 06/6785941 (B) TELEFAX: 06/6794692
(C) TELEX: 612287 ROPAT (1) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 555 pares de bases (B) TIPO: nucleótido
(C) TIPO DE CORDÃO: duplo (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ΑΝΤΙ- SENTIDO: não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: produção em bactérias (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOME: IL-6 ADNc (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: I: OCA GTA OOC OCA GGA GAA GAT ICC AAA GAT GEA GOC GOC OCA CAC AGA 48 Pno Vai Pro Pro Gfi Gb Asp Ser Tis Asp Vai Ala Ala Pro Hs Aig 1 5 10 15 CAG OCA CIO AOG AGC TCA GAA OGA ATT GAC AAA CAA ATT OGG TAC AIC 96 Qn Pro Leu Thr Ser Ser Gb Aig Be Asp Lis Gb Be Aig Tír Be 20 25 30 CIO GAC GGC AIO TCA GOC TTA AGA AAG GAG ACA TGT AAC AAG AGT AAC 144 Leu Asp Gli De Ser Ala Leu Aig Lis Gb Hr Cis Asn Lis Ser Asn 35 40 45 ATO TGT GAA AGC AGC AAA GAG GCA CIG GCA GAA AAC AAC CIG AAC CTT 192 Met Cis Gb Ser Ser Lis Gb Ala Leu Ala Gb Asn Asn Leu Asn Leu 50 55 60 OCA AAG ΑΙΌ GCT GAA AAA GAT GGA TGC TIO CAA TCT GGA TIO ΑΑΓ GAG 240 Pro Tis Met Ala Gb lis Asp Gfi Cis Phe Gb Ser Gfi Phe Aai Gb 65 70 75 80 GAG ACT TGC CIO GIG AAA AIC AIC ACT GGT CTT TIG GAG TTT GAG GTA 288 Gb Thr Cis Leu Vai I is Be Be Thr Gfi Leu Leu Gu Phe Gb Vai 85 90 95 TAC CTA GAG TAC CIO CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GOC 336 Tir Leu Gb Trr Leu Gb Asn Aig Phe Gb Ser Ser Gb Gb Gb Ala 100 105 110
28 AGA GCT GIC CAG AIG AGT ACA AAA GIC CIG AIC CAG TIC CIG CAG AAA 384 Aig Ala Vai Gin Met Ser Thr Lis Vai Leu De Gn Phe Leu Gin Lis 115 120 125 AAG GCA AAG ΑΑΓ CTA GAT GCA ATA AGC AGC ocr GAC OCA AGC ACA AAT 432 Lis Ala T is Asn Leu Asp AI De Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn 130 135 140 GCC AGC CIG CIG AOG AAG CIG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CIG CAG GAC 480 Ala Ser Leu Leu Thr Lis Leu Gin Ala Gin Asn Gin Tip Leu Qn Asp 145 150 155 160 AIG ACA ACT CAT CIC ATT CIG AGA TCT TTT AAG GAG TIC CIG CAG ICC 528 Met Thr Thr His Leu De Leu Alg Ser Phe Us Gb Phe Leu Gin Ser 165 170 175 AGC CIG AGG GCT CTT COG CAA AIG TAG 555 Ser Leu Aig Ala Leu Aig Gin Met 180 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 70 pares de bases (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: cordão simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES:
(A) NOME: IL-6 31D35 PCR (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida 29 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:2: CGCACGAGCT CAGAACGAAT TGACAAACAA ATTCGGKACA TCCTCGACYD TATCTCAGCC 60 TAAGAAAGG 70 (3) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3:
(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 72 nucleótidos (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: sim (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOME. IL-6 118RCLF/121VD (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: CGCATCTAGA TTCTTTGCCT TTTTCTGCAG GAACTGGATC AGGKCTTTTG TGYZCATCTG 60 CACAGCTCTG GC 72 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 nucleótidos (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: cordão simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: sim (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal carboxi (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOME: IL-6 QSLQ (AS) (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:4: CCGGGCGGCC GCCCTACATM NNCCGMNNAG CCCTCAGMNN GGAMNNCAGG AACTCCTTAA 60 AG 62 INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 nucleótidos (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: cordão simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: não (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOME: IL-6 QSLQ pr. Bam
(C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 5: CGCGGATCCT TTA\GGAGTT CCTG INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 nucleótidos (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: cordão simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: não (v) TIPO DE FRAGMENTO: terminal carboxi (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES:
(A) NOME: 175I/167R/183A (S) (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:6: GCCTGAGATC TnTAAGGAG TTCCTGATCC GTAGCCTGAG GGCTCTTCGG GCTATGTAGG 60 73
GCGGCCGCAT GGC INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 73 nucleótidos (B) TIPO: nucleótido (C) TIPO DE CORDÃO: cordão simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN sintético (iii) HIPOTÉTICA: não (iv) ANTI-SENTIDO: sim (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (vii) FONTE IMEDIATA: (A) SÍNTESE: sintetizador de oligonucleótidos (ix) PARTICULARIDADES: (A) NOME: 175I/167R/183A (AS) (C) MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO: gel de poliacrilamida (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: GCCATGCGGC CGCCCTACAT AGCCCGAAGA GCCCTCAGGC TACGGATCAG GAACTCCTTA 60 AAAGATCTCA GGC 73
Lisboa, 20 d Mal
JOSÉ DE SAMPAff©~ A.O.F.L · Rua do SaSitre, í$5, r/c-Brt. 1250 LISBOA
Claims (6)
1
ο Reivindicações 1. Metodologia para seleccionar superagonistas, antagonistas e superantagonistas da inter-leucina 6, utilizando a molécula membranar gp 130 para activar os mecanismos reguladores da fisiologia celular, a qual compreende as operações seguintes: - comparar as sequências de aminoácidos da hormona do crescimento com as sequências da referida interleucina 6; - comparar as sequências de aminoácidos do receptor da hormona do crescimento com as dos dois receptores da interleucina 6, ou seja, com o receptor específico da interleucina 6 e com o gp 130; - com base nas comparações anteriores, formular um modelo tridimensional do complexo receptor assente na semelhança funcional entre as sequências do receptor da hormona do crescimento e as dos dois receptores da interleucina 6 em questão; - identificar os resíduos da interleucina 6 de tipo natural que são uma parte do local de interacção com um receptor específico e os do local de interacção com a gp 130, res-pectivamente; - introduzir mutações nos locais de interacção da interleucina 6; - avaliar a actividade biológica dos mutantes.
2. Metodologia para seleccionar superagonistas da interleucina 6 de acordo com a reivindicação 1, a qual compreende as seguintes operações complementares: - produção de um conjunto de fagotecas (bancos de fagos) que contenham mutações dos seguintes resíduos de tipo natural da interleucina 6, presentes sob a forma de um produto de 2 fusão com as proteínas dos fagos filamentosos Glu 42, Glu 51, Ser 52, Ser 53, Lis 54, Glu 55, Asn 63, Lis 66, Met 67, Ala 68, Glu 69, Lis 70, Asp 71, Phe 170, Gin 175, Ser 176, Ser 177, Leu 181, Gin 183; - gerar uma fagoteca, em que cada fago possui uma sequência de interleucina 6 mutante; - seleccionar, entre a população de fagos que exprimem os mutantes de interleucina 6, aquele ou aqueles que possuam com o receptor específico uma afinidade superior à da interleucina de tipo natural; - identificar a melhor sequência ou as melhores sequências de aminoácidos que se ligam ao receptor, por sequenciação do ADN extraído das partículas de fagos seleccionados.
3. Metodologia para seleccionar superagonistas da interleucina 6 de acordo com a reivindicação 2, em que é produzido um conjunto de bancos de fagos contendo mutantes do referido resíduo de interleucina 6 de tipo natural presente enquanto produto de fusão com a proteína ρΠΙ do M13.
4. Metodologia para seleccionar antagonistas da interleucina 6 de acordo com a reivindicação 1, a qual compreende ainda as seguintes operações complementares: - mutacionar os resíduos identificados na reivindicação 1 para fazerem parte do local de interacção com a gp 130 (Arg 30, Tir 31, Gli 35, Ser 37, Ala 38, Ser 118, Lis 120, Vai 121, Gin 124, Phe 125, Gin 127, Lis 128 e Lis 129), utilizando para tal técnicas convencionais da biologia molecular; - avaliar a actividade biológica e a afinidade com o receptor específico da interleucina 6 dos mutantes produzidos conforme descrito supra, com a finalidade de identificar variantes da interleucina 6 cuja afinidade com o receptor específico esteja intacta e que revelem uma redução ou uma perda da actividade biológica; - avaliar as referidas variantes da interleucina 6 enquanto antagonistas da actividade biológica da interleucina 6 de tipo natural.
5. Metodologia para seleccionar superantagonistas da interleucina 6 de acordo com a reivindicação 1, mediante a combinação de variações de sequências de aminoácidos responsáveis pela actividade antagonista, as quais estão indicadas na reivindicação 4, com variações de aminoácidos responsáveis por uma maior afinidade do receptor específico com a interleucina 6.
6. Metodologia para seleccionar superantagonistas da interleucina 6 de acordo com a reivindicação 5, em que a mutagénese de resíduos identificados conforme enunciado antes é realizada utilizando uma técnica da biologia molecular escolhida entre o grupo que compreende a reacção em cadeia com polimerase, a amplificação do iniciador, a mutagénese dirigida com um oligonucleótido e suas combinações. Lisboa, 20 de Abril de 2000
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