JPH07509571A - 受容体複合体がｇｐ１３０を含むホルモンのスーパーアゴニスト，アンタゴニスト，及びスーパーアンタゴニストを選択するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 受容体複合体がＧＰ　ｌ　３０を含むホルモンのスーパーアゴニスト・、アンタ ゴニスト、及びスーパーアンタゴニストを選択するための方法部位２はｇｐ１３ ０に結合するという仮説を導くことが可能である。

築によって可能となる。野性型のホルモンに関して特異的受容体（スーパーアゴ ニストまたはスーパーアンタゴニスト）に対してより大きな親和性をもっている 変異株は、野性型と変異版の両者において該ホルモンを担っている、例えばＭ２ Ｓのような線状のファージのライブラリーを構築することによって得られる。

例えば、本明細において採用されたＩＬ−６、およびＷＯ９２／２１０２９に採 用されたものとの間の３次元モデルの間の差は、部位２の構成成分としてのへワ ックスＡとＣにおける異なる残基の仮定へと導かれる。

ヒトインターロイキン６の分子のモデル形成は、以下のように行われる。科学文 献における利用できるデータから、ヒトインターロイキン６が、それらの３次元 の芯を形成している４つのヘリックスをもつクラスのサイトカインに属するとい うことが知られているので、ヒトインターロイキン６のアミノ酸シーケンスが解 析され、ヘリックス形成の確率が最高である４つの領域を確認した。続く手段に おいて、インターロイキン６の分子中の４つのへワックスの領域をコンピュータ ー化した相互作用のグラフインク単位においてモデル化した。開始にあたり、該 ４つのヘリックスの方向性は、成長ホルモン、またはマクロファージ−顆粒球コ ロニー刺戟因子のようなホルモン類に見られる方向性と同様であるかもしれない と仮定した。４つのへワックスの間の空間中における疎水性アミノ酸のパッケー ジングを最適化するために、ヘリックスの相対的位置に対する調節が行なわれた 。続いて、４つのへワックスを結合するループのモデルが作られた。

このインターロイキン６の３次元モデルによって、ヒトインターロイキン６とそ の２つの受容体、すなわち、低親和性受容体ｇｐ８０（部位ｌ）とｇｌ）１３０ シグナルトランスダクシヨン（部位２）に対する高親和性受容体部位の間の相互 作用が確認できるようになった。該２つの部位を確認するために、以下の手順が 用いられた。ノーケンスの比較から、造血性受容体の１つのファミリーは、それ らがサイトカイン認識領域として知られている領域を共有しているという事実に よって、すへてのメンバーが関連していることが知られている。このシーケンス の類似性は、また、２つのインターロイキン６の受容体、ｇｐａｏとｇｌ）１３ ０を含む種々の受容体の相当する部分においての高確率の構造的類似性も示唆さ れる。これらの受容体に結合するサイトカインが、すべて４つのヘリックスマト リックスである同様な構造をもっている（または有すると予告される）という構 造は、これらのサイトカインとそれらの受容体の間のサイトカイン認識領域によ って、生物学的に活性な複合体において、相互作用は極めて類似しているという 仮定を強く支持する。

これらの化合物（成長ホルモンと該成長ホルモンのための２量体受容体の細胞外 領域）の１つの三次元的構造が、Ｘ−線結晶学によって決定されたことを考える と、ヒトインターロイキン６の我々のモデルにより、これらのサイトカインとそ れらの２つの受容体、ｇｐａｏ　（部位ｌ）とｇｐ１３０（部位２）の間の強力 な相互作用を確認することが可能になる。成長ホルモンが関与する複合体と比較 すると、また、機能的に重要なアミノ酸が、２つのホルモンの表面上の同様な位 置にあると仮定することによった。

その複合体が、ｇｌ）１３０を含む免疫系のホルモンに対するアゴニスト、アン タゴニストおよびスーパーアンタゴニストの産生の方法論を提供する必要が、イ ンターロイキン６の場合を参照して説明される。

周知の如く、記載によれば、インターロイキン６は、ヘリ力ルサイトカインのク ラスに属する１８４のアミノ酸からなるポリペプチドである。インターロイキン ６は、種々のタイプの細胞によって産生される多機能性サイトカインである。

それは、例えば、免疫系における細胞、肝細胞、腎臓細胞、造血性スタミナ細胞 、ケラチノサイト、およびニューロンのような種々の細胞に対する分化、および 成長因子として作用する。

インターロイキン６のスーパーアゴニストの産生によって、多数の重篤な疾患の 治療において、野性のインターロイキン６で必要となるよりも低い治療用量の作 用でこと足りるようになる。事実、インターロイキン６は、乳がん、白血病、感 染症、または骨髄を産生ずる細胞の障害に関連した疾患の治療において、重要か つ有望な適用を有している。

他方、ヒトインターロイキン６のアンタゴニスト、またはスーパーアンタゴニス トの産生によって、慢性自己免疫疾患、骨髄腫／形質細胞腫、閉経後の骨粗私症 、およびがんの悪液質のようなその過剰な産生を特徴とする多数の疾患において 、ヒトインターロイキン６の阻害ができるようになるであろう。

本発明による細胞生理学を調節している機序を活性化する膜分子ｇｐ１３０を使 用してのホルモンのスーパーアゴニスト、アンタゴニスト、またはスーパーアン タゴニストの選択のための方法論は、以下の操作からなる。

−成長ホルモンのアミノ酸シーケンスを該ホルモンと比較する；−成長ホルモン の受容体のアミノ酸シーケンスを、問題の成長ホルモン２つの受容体、すなわち 、ホルモン−特異的受容体とｇｐ１３０のシーケンスを比較する； 一上述の比較に基づいて、成長ホルモン受容体と問題の２つのホルモン受容体の シーケンスの間の機能的類似性に基づいた受容体複合体の三次元のモデルを作成 し、そして、 −それぞれ特異的受容体との相互作用の部位の一部であり、モしてｇｌ）１３０ との相互作用の部位の一部である野性のタイプの残基を同定する。

問題のホルモンは、インターロイキン６　（ＩＬ−６）　、オンコスタチンＭ（ ０５Ｍ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、線毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、お よびインターロイキン１１　（ＩＬ−１１）からなる群から選ぶことができる。

インターロイキン６のスーパーアゴニストの選択のためには、本発明による方法 論には以下のさらなる操作が含まれる。

−線状のファージのタンパク質との融合産物の形において存在する以下のインタ ーロイキン６の野性型の変異を含む一連のファージライブラリーの産生Ｇｌｕ　 ４２．Ｇｌｕ　５１．Ｓｅｒ　５２．Ｓｅｒ　５３．Ｌｙｓ　５４゜Ｇｌｕ　５ ５．Ａｓｎ　６３．Ｌｙｓ　６６、Ｍｅｔ　６７、Ａｌａ　６８゜Ｇｌｕ　６９ ．Ｌｙｓ　７０．Ａｓｐ　７１．Ｐｈｅ　１７０．Ｇｌｎ　１７５゜Ｓｅｒ　１ ７６、ｓｅｒ　１７７、Ｌｅｕ　１８１．ＧＩｎ　１８３；−各ファージが変異 株のインターロイキン６シーケンスを有するファージライブラリーの生成。

一インターロイキン６変異体を発現するファージの混合集団から野生型インター ロイキンのそれよりも大きな特異的受容体に対する親和性のそれを選択し、そし て、 −選ばれたファージの粒子から抽出されたＤＮＡをシーケンソングすることによ って受容体に結合する最善のアミノ酸シーケンス（単数または複数）を同定する 。

この場合においては、Ｍ２Ｓのタンパク質Ｐ−１１１との融合産物として存在す る該野性型残基の変異体を含む一連のファージライブラリーを産生ずることがで きる。

本発明によるインターロイキンのアンタゴニストを選択するための方法論は、上 に示した操作とともに、以下の操作を含む；−ｐｇ１３０　（Ａｒｇ　３０．Ｔ ｙｒ　３１．Ｇｌｙ　３５．Ｓｅｒ　３７゜Ａｌａ　３８．Ｓｅｒ　１１８．Ｌ ｙｓ　１２０．Ｖａｌ　１２１．Ｇｉｎ　１２４、Ｐｈｅ　１２５．Ｇｌｎ　１ ２７．Ｌｙｓ　１２８およびＬｙｓ　１２９）との相互作用の部位の一部を形成 することが請求項１において、既存の分子生物学的技術をもって同定された残基 の突然変異。

−その特異的受容体への親和性が変らず、生物活性の減少、または喪失を示す変 異体を同定するために、上述のように産生された変異株の生物活性と特異的イン ターロイキン６受容体に対する親和性を評価する；そして、−上述のインターロ イキン６の変異体を、野性型インターロイキン６の生物活性に対するアンタゴニ ストとして評価する。

インターロイキン６のスーパーアンタゴニストの選択の場合には、上に示したよ うにアンタゴニストの活性の原因となるアミノ酸のシーケンスの変異とインター ロイキン６に対する特異的な受容体の親和性の増加の原因となるアミノ酸の変異 とを組合せる。

インターロイキン６のアンタゴニスト、または、スーパーアンタゴニストを選抜 するための方法論においては、上のように同定された変異誘発は、ポリメラーゼ 連鎖反応、プライマー伸長法、オリゴヌクレオチド支配、突然変異誘発、および これらの組合せから選ばれた分子生物学的技術を使用して遂行することができ本 発明は、インターロイキン６のアゴニスト、アンタゴニスト、またはスーパーア ンタゴニストを選択するための方法論に限られない。反対に、膜分子ｇｐ１３０ を使用して、細胞生理学を調節するホルモンの上述の選抜の方法論を使用して得 られるアゴニスト、アンタゴニスト、およびスーパーアゴニストに拡張される。

この時点までに、本発明の主題の一般的記述が与えられた。本発明の特異的態様 の詳細な記述の助けをかりて、目的、特徴、利益、およびその適用の方法をより よく理解させる目的で具体例を与えよう。

図１は、ｈＩＬ−６のアンタゴニストの選択に使用されたｐＨｅｎΔｈｌＬ−６ の構築とファスミジック粒子の形成を示す（“ベクターの構築”の例１を参照） 。

図２は、変異体ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／ＧＩｕ３５Ｐｈｅ／５ｅｒｆ　１８ Ａｒｇ／Ｖａ　Ｉ　１２１Ａｓｐのアンタゴニスト活性を、濃度増加とともに示 している。

寄託 制限酵素５ａｌＩの認識部位がら制限酵素Ｎｏｔｌの認識部位までの野生型のヒ トインターロイキン−６−をコードしているヌクレオチドシーケンスを含むプラ スミドｐＨｅｎΔｈｌＬ−６を使用して形質転換されたＥ、　Ｃｏ１１　Ｋｌ　 ２バクテリアが、寄託番号ＮＣＩＭＢ４０５６３で、１０／６／１９９３１：、 ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ 　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｌｔｄ　（ＮＣＩ@ＭＢ）　＋ Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫに寄託された。

豊エ インターロイキン６のアゴニストの選択のための本発明による方法論の適用ｌ） ベクターの構築 戦略は、ｈｌＬ−６全領域の後にファージＭ１３のタンパク質ｐｉ１１の最後の １５７個のアミノ酸、そして前部には、ペリブラスマ空間への合成タンパク質を ベクターするＰｅ１Ｂのシーケンスを構築することにある。

Ｉシブリッド遺伝子の発現は、プロモーター１ａｃ　Ｚによって駆動される。構 築は、ベクターｐＨｅｎΔｅの関係において作られ、ｐＨｅｎΔｈ　Ｉ　Ｌ−６ と名付けられる（同封の図のみを参照のこと）。このプラスミドは、また、ファ ージの複製の起点を含む。このプラスミドを含む細菌細胞に、Ｍ１３ＫＯ７のよ うな“ヘルパー”として知られるバクテリオファージが感染するならば、単一の 線状のコピーがプラスミドによって産生される。そして、丁度真のファージゲノ ムのようにファージのタンパク質でコードされる。プラスミドを含むこれらのフ ァージ粒子は、ファスミドとして知られている。正常な９１１１分子とともに、 それらは、ｈｌＬ−６−ｐｉｌｌ融合分子も含んでいる。したがって、ｈｌＬ− ６の分子とそのアミノ酸シーケンスをコードしている遺伝子は、同じユニット内 に含まれている。突然変異体の分子の場合は、選択過程から得られたファージの 表面に露出した分子のアミノ酸シーケンスを、単にファスミドＤＮＡをシーケン シングすることによって決定することが可能となる。

ｐＨｅｎ　ｈｌＬ−６の構築物のさらなる特徴は、ＩＬ−６遺伝子とｐ　Ｉ１１ 遺伝子の間に翻訳終了コドンが存在することである。ハイブリッドタンパク質の 産生は、この終了コドンを抑制することができるバクテリアの菌株中で行うこと ができる。逆に、非抑制菌株を使用すれば、直接にペリプラズムスペース中に単 独のｈＩＬ−６の産生ができる。

以下の実験は、ｐＨｅｎ　ｈｌＬ−６を使用することにより、ファージ上に露出 した広大な範囲の変異インターロイキン６の中から増幅選択サイクルによって、 該受容体に対して最大の親和性を有するものを、５ｈｒＩＬ−６Ｒを使用して精 製することができることを示している。

エリザプレート中のウェルを、ｈｌＬ−６プラスミド、またはＭ１３ＫＯ７でコ ートし、５ｈｒＩＬ−６Ｒ（可溶性ヒト組換え体ＩＬ−６Ｒ）と反応させた。

反応後洗浄した後、アルカリホスファターゼと結合した特異的モノクローナル抗 体を使用して、受容体の存在が示された。得られたシグナルは、ｈｌＬ−６フア スミドの場合により大きく、使用された受容体の量が増加するにつれて増加する 。

ｈＩＬ−６フアスミド粒子にＭ１３ＫＯ７の粒子を１：ｌＯＯの比率で混合した 。この混合物を５ｈｒｌＬ−６Ｒでコートしたポリエチレンのボールとインキュ ベートした。中性のｐＨて繰返し洗浄した後、ボールはｐＨ４，２において厳密 に洗浄し続いてｐＨ３，６で溶出した。その結果の溶出液中のｈｌＬ−６フアス ミド＋Ｍ１３に０７の比率を測定した。その比率は、１：１０となり、Ｋ１３Ｋ Ｏ７に関して、結果として、ｈｌＬ−６フ７スミドが１０倍の富化を示す。

天然板と比較して、受容体に対してより高い（１７６Ａｒｇ）、またはより低い （１７９Ａｌａ）親和性をもったｈｌＬ−６の突然変異体をそれらの表面にもつ ファージ粒子が産生された。これらの粒子を１＝１の比率で混合した。その混合 物を固相中（ポイントｂにおいて記述されたように）の受容体とインキュベート した。ｐｉ（３，６の溶出液において、２つのタイプの粒子の間の比率は１５： ｌで１７６Ａｒｇに有利であった。

上に列記した種々のタイプの粒子の等量を別々に受容体でコートしたボールとイ ンキュベートした。通常の一連の洗浄の後、粒子の数は、ｐＨ３，６の溶出液に 回収され、各タイプのファージについて定量した。ファスミドｈｌＬ−６につい て回収された粒子の値を１とすれば、１７６Ａｒｇについては３が得られ、１７ ９ＡＩａについては０．２、Ｍ１３ＫＯ７については、０．１８が得られる。こ れらの値は、ファージの表面に露出していないＩＬ−６の分子の相対的親和性を 反映している。事実、１７６Ａｒｇは、天然分子のそれよりも３倍強い相対親和 性で受容体と結合することが知られているが、それに対して、１７９Ａｌａに場 合では、受容体に対する親和性はほぼＯにまで減少する（事実、この突然変異体 についてのファスミド受容体に対する結合に関しては、Ｍ１３ＫＯ７のように挙 動する）。

このグループの実験は、本発明による方法を使用して、受容体に対する最大の親 和性を有する変異体を、ファージに露出した変異体の混合物から選ぶことが可能 であることを示した。

厚侭 プラスミドＰｈｅｎΔｈｌＬ−６がすべての突然変異誘発反応のためのテンプレ ートとして使用された。このプラスミドｐＨＥＮＩの誘導体であり、バクテリオ ファージＭ１３のｐＨ＋タンパク質のカルボキシ−末端部分（コドン２５０がら Ｃ０ＯＨ末端）の領域の上流にあるヒトＩＬ−６（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１）を コードする領域を含んでいる：この２つのコーディング愕域はリーディングフレ ーム中にあり、アンバーＵＡＧ終結コドンによって分離されている。このコドン は、それらのゲノム中に組込まれたサプレッサー５ｕｐＥの遺伝子をもっている バクテリアの株において抑制することができる。ヒトＩＬ−６をコートする領域 もペプチドＰｅ１Ｂの下流のリーディングフレームにあり、分泌のためのシグナ ルンーケンス、および全体の遺伝子が、プロモーターＬａｃＺの制御下にある。

最後に、制限酵素５ａｃＩのための単一部位が、それらの同一性を変化させるこ となしにｈＩＬ−６の２０−２１−２２のアミノ酸をコードしているヌクレオチ ドシーケンス中に導入され、そして等しく、同様にそれらを変えることなく制限 酵素Ｂｆｒｌのための単一部位が、ｈＩＬ−６の３８−３９−４０のアミノ酸を コードしている領域中に導入された。

ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）戦略を使用して、ヒトインターロイキン６をコ ードしている領域中に選ばれたコドン内に突然変異を発生させた。下流のプライ マーは、ｈｌＬ−６ｃＤＮＡの位置４２６−４５７　（アンチセンスフィラメン ト）に相当する３２個のヌクレオチドブライマーである（成熟ポリペプチドの最 初のコドンの最初のヌクレオチドをｌとする）。プライマーハイブリッド形成部 位は、ｃＤＮＡに天然に存在している制限酵素ＸｂａＩについての認識部位の下 流にある。上流の突然変異性プライマーは、ＩＬ−６３１Ｄ／３５ＰＣＲであり 、７０のヌクレオチドブライマーであり、そのシーケンスは、ＳＥＱ　ＩＤＮ０ ：２である。

プライ？−ＩＬ−６３１Ｄ／３５ＰＣＲは、ｈｌＬ−６ｃＤＮＡの５５の位置か ら１２４の位置（センスフィラメント）まで広がり、アミノ酸３１　（野性型チ ロシン）と３５（野生型グリシン）をコードしているコドンの変性を起す。４０ ３対のＤＮＡフラグメントは、標準ＰＣＲ増幅プロトコールによれば増幅される 。増幅は３５サイクルで遂行される。各サイクルは、テンプレートの変性のため に９４℃で２分、オリゴヌクレオチドの／％／ｌ’ブリッド形成のために５０℃ で２分間、そして鎖の伸張のために７２℃で３分間のインキュベーションからな る。

増幅したフラグメントは、Ｓａｃ　ＩとＸｂａｌで消化され、２％アガロースゲ ルを使用して精製した。ＰＣＨによって発生され、２つの酵素によって消化され たフラグメントは同じ２つの酵素によって消化されたベクターｐＨｅｎ　ｈｌＬ −６に連結し、０．８％アガロースゲル上で精製し、野生型のシーケンスを置換 した。

続く表１は、ヒト肝がん細胞における生物活性、および野生型インターロイキン ６とその突然異体についての受容体ｇｐ８０に対する結合を示す。突然変異は星 印で示しである。

表Ｉから分るように、突然変異体（Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３５Ｔｙｒ）、（ Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇ！ｙ３５Ｐｈｅ）、および（Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、Ｇｌｙ３ ５Ｌｅｕ、Ｇ］ｕ４２Ａｌａ）は、野生型インターロイキン６と比較したとき、 より低い生物活性を示す。すべての３つの場合において、残余の活性は野生型イ ンターロイキン６の２−５％である。この３つの変異体は、インターロイキン６ 受容体ｇｐ８０に結合するそれらの全能力を維持している。結論として、この３ つの変異体は、肝がん細胞においてシグナル伝達活性が減少しているということ である。換言すれば、それらは、野生型インターロイキン６のアンタゴニストで ある。とりわけ、変異株（Ｔｙｒ３１Ａｓｐ、ＧＩｙ３５Ｐｈｅ）は、ヒト肝が ん細胞の試験において、５０倍モルの過剰において使用されたとき、野性型のイ ンターロイキン６の活性を減少させることができるので、特別に効果的なアンタ ゴニストである。

先行例において記述されたプラスミドｐ　ＨＥ　ＮΔｈｌＬ−６を、すべての突 然異誘発反応に対するテンプレートとして使用した。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖 反応）戦略を使用してヒトインターロイキン６をコードする領域のために選ばれ たコドン内に突然変異を誘発させた。上のプライマーは、ｈ　Ｉ　Ｌ−６ｃＤＮ Ａ　（最初のヌクレオチドまたは成熟ポリペプチドの最初のコドンを１とする） の位置１−１９　（センスフィラメント）に相当する２９のヌクレオチドをもっ たプライマーであるＨＰ／］である。プライマーハイブリッド形成部位は、例２ において記載されたように、後者によってコードされるシーケンスを変化させる ことなしに、ｃＤＮＡに、人工的に導入された酵素５ａｅＩの認識部位の上流に ある。下流の突然変異誘発性プライマーは、その／−ケンスがＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ３である７２ヌクレオチドを有するプライマー、ＩＬ−６１１８ＲｃＬＦ／１ ’２１ＶＤである。

プライマー１−６　１１８ＲＣＬＦ／１２１ＶＤは、ｈＩＬ−６のｃＤＮＡの位 置３３４から位置４０５　（アンチセンスフィラメント）まで広がっており、ア ミン酸１１８（野性型セリン）と１２１　（野性型バリン）をコードするコドン を変性させる。４１５の塩基対の塩基が、標準ＰＣＲ増幅プロトコールにょるＰ ＣＲを使用して増幅される。増幅は、３５のサイクルで遂行される。各サイクル は、テンプレートの変性のために９４℃で２分間、オリゴヌクレオチドのハイブ リッド形成のために、５０℃で２分間、および鎖の伸長のために７２℃で３分間 の処理からなる。増幅されたフラグメントは、５ａｃｌとＸｂａｌで消化され、 ２％アガロースゲルを用いて精製される。ＰＣＲによって生成され、２つの酵素 によって消化されたフラグメントは、同じ２つの酵素で消化したベクターｐＨｅ ｎΔｈｌＬ−６へ連結され、０．８％アガロースゲル上で精製され、野性型シー ケンスを置換した。

以下の表には、野生型インターロイキン６と残基が示しであるように、突然変異 を受けた形についてのヒト肝がん細胞における生物活性と受容体に対する結合野 性型インターロイキン６とそのヘリックスＣ突然変異体１１８　１２１　生物活 性　受容体結合Ｓｅｒ　Ｖａｌ　１００％　１００％ Ａｒｇ　Ｖａｌ　６６％　８１％ Ｌｅｕ　Ａｓｐ　３６■４％　９２％ Ａｒｇ　Ａｓｐ　３．５−０．５％　６６■５％Ｓｅｒ　Ａｓｐ　５８■２３％ 　７８■２％突然変位体、ＩＬ−６Ｓｅｒｌ１８Ａｒｇ／Ｖａｌ１２１Ａｓｐは 、表■に記載の突然変異体ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／Ｇｌｙ３５Ｐｈｅと極め て類似した特徴をもっていることが分る。すなわち、それはインターロイキン６ の受容体と正常に結合するが、サイトカインの生物活性は約３０倍減少している 。

本発明による方法論を使用するインターロイキン６の一層強力なアンタゴニスト の生成と選択 この場合においては、例２において記述されたようにして得られたプラスミドｐ ＨＥＮΔｈＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／ＧＩｙ３５Ｐｈｅが、すべての突然変異 誘発反応についてのテンプレートとして使用された。

ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）戦略を使用して、ヒトインターロイキン６をコ ードする領域から選ばれたコドン内に突然変異を発生させた。上のプライマーは 、前の例に記載のＨＰ／ｌである。下の突然変異誘発プライマーは、やはり、前 の例に記載のｒＩ、−６１ｔ８ＲｃＬＦ／１２ｔＶＤである。４１５対の塩基の ＤＮＡのフラグメントが、標準ＰＣＲ増幅プロトコールによってＰＣＲを使用し て増幅された。増幅は、３５のサイクルで遂行された。各サイクルは、テンプレ ートの変性のために、９４℃で２分間、オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成 のために、５０℃で２分間、および鎖の伸長のために７２℃で３分間の処理がら なっていた。増幅されたフラグメントは、５ａｃｌとＸｂａｌとで消化し、２％ アガロースゲルを使用して精製した。ＰＣＲで生成され、２つの酵素で消化され たフラグメントは、同じ２つの酵素で消化したベクターｐＨｅｎ　ｈｌＬ−６に 連結され、０．８％アガロースゲル上で精製され、野性型のシーケンスを置換し た。

下記の表３には、野性型インターロイキン６と突然変異がその残基において示し であるその変異体についてのヒト肝がん細胞における生物活性と受容体に対する 結合が示しである。

表３ ゛　の　”　ムの　 Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　１００％　１００％Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ 　Ｖａｌ　１．４％　Ｎ、　Ｄ。

Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　５．４■１．１％　６６閣２％Ａｓｐ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　０％　６３■４％Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　０％ 　９７■１５％Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　八ｓｐ　Ｏ％　７６　■２６％Ｎ、　 Ｄ、　＝測定されなかった。

ヘリックスＡとへリックスＣ上にともに突然変異を含む変異体のうち３こは、ヒ ト肝がん細胞において生物活性の徴候はないが、受容体ｇｐａｏとの結合能力を 維持している。これらの３つのタンパク質のうち、変異体ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａ ｓｐ／ＧＩｙ３５Ｐｈｅ／Ｓｅｒｌ１８Ａｒｇ／Ｖａｌ１２１Ａｓｐが、ヒト肝 がん細胞における野生型インターロイキン６の生物活性での拮抗実験に選ばれた 。細胞は、変異体の増加濃度の存在下で、野生型インターロイキン６を、培地中 ４　ｎｇ／ｍｌで刺戟した。図２に示しであるように（その場合、野生型インタ ーロイキン６の生物活性は、任意の単位で表現されている）、変異体の増加濃度 は、どうやらヒト肝がん細胞の効果に完全に拮抗した。

表４には、アンタゴニストの濃度による（それぞれｎｇ／ｍｌ、野生型インター ロイキン６と比較して、モル過剰、およびｎｍｏｌ／ｆで表現された）野生型の インターロイキン６の生物活性の（百分率における）阻害のレベルを示しである 。

表４ ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ／Ｓｅｒｌ１８Ａｒｇ／Ｖａｌ１ ２１Ａｓｐ　野性型ＩＬ−６１６４ｘ　０．７ｎＭ　２３％ ６０　１５Ｘ　２．７ｎＭ　２８１１ １６４　４１ｘ　７．５ｎＭ　５０％ ５００　１２５　Ｋ　２２．７　ｎＭ　７５　％１０００　２５０　ｘ　４５． ５　ｎＭ　８２％２０００　５００　ｘ　９０．ＯｎＭ　９０％本発明に記載の 方法論を使用して、生成され、選択されたインターロイキン６アンタゴニストは 、ヒト骨髄腫細胞の成長を阻害する以前の例において、変異体の１つ、すなわち 、ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ／５ｅｒｆ　１８Ａｒｇ／Ｖａ ｌ１２１Ａｓｐは、インターロイキン６のヒト肝がん細胞に対する生物活性（イ ンターロイキン６によって誘発できるプロモーターによる転写の促進）を阻害す ることができた。本特許出願の導入部分において、インターロイキン６のアンタ ゴニスト、またはスーパーアンタゴニストの開発は、それらが種々の多発性、骨 髄性／形質細胞腫のようなインターロイキン６の過剰産生を特徴とする疾患にお けるインターロイキン６の活性を阻害するために使用することができたので、実 際的に応用されるであろうと述べられている。ここにおいて発明者らは、３つの 変異体、ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ／Ｓｅｒｌ１８Ａｒｇ／ 〜’ａ　Ｉ　１２１Ａｓｐ　（ＤＦＲＤ）、ＩＬ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／ＧＩｙ ３５Ｐｈｅ／５ｅｒｌ１８Ｐｈｅ／Ｖａ　Ｉ　１２１Ａｓｐ　（ＤＦＦＤ）、Ｉ Ｌ−６Ｔｙｒ３１Ａｓｐ／Ｇｌｙ３５Ｐｈｅ／Ｓｅｒ　１１８Ｌｅｕ／Ｖａ　ｌ 　１２１Ａｓｐ　（ＤＦＬＤ）が、末期疾患をもつ患者から新たに分離したＸＧ −１と呼ばれるヒト骨髄腫細胞系のインターロイキン６依存性成長を完全に阻害 することを示すことによって、さらなる例を提供する。ＸＧ−１骨髄細胞系の成 長は、新鮮な骨髄細胞について示されたものと同様に、外から加えたインターロ イキン６に厳密に依存している。したがって、この細胞系は、多発性骨髄腫疾患 （Ｊｏｕｒｄａｎ、　Ｍ、、　Ｚｈａｎｇ、　Ｘ−Ｇ、、　Ｐｏｒｔｉｅｒ、　 Ｉｔ。

Ｂｏｉｒｏｎ、　Ｊ、ｌｔ、　Ｂａｔａｉｌｌｅ、　Ｒ，およびＫｌｅｉｎ、　 Ｂ、　（１９９１）　Ｊ、　Ｉｍｕｎｏｌ、１４７゜４４０２−４４０７）のす ぐれたｉｎ　ｖｉｔｒｏのモデルと考えることができる。野性型のインターロイ キン６に対する変異体の拮抗を試験するために、ＸＧ−１骨髄腫細胞を、野生型 インターロイキン６の培地中濃度を０．１ナノグラム／ｍｌ（ｎｇｌｏｌｌ）と して、３つの変異体の各１つの増加濃度の存在下、９６−穴のミクロタイタープ レート中で、６０００細胞／ミクロウエルの集密度で培養した。培養７日後に、 細胞数をヘキソアミニダーゼレベルの比色定量によって評価した（Ｌａｎｄｅｇ ｒｅｎ、　Ｕ　（１９８４）　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６７ ．３７９−３８８）　ｏ以下の表５には３つのアンタゴニストの濃度（培地ｍｌ あたりの変異体のナノグラムで表現された）の関数としての野性型インターロイ キン６の活性の阻害を示しである。

青−且 ３つのアンタゴニストの濃度の関数としての野生型インター３．３　ｎｇ／ｍｌ 　６％　０％　０％１０　ｎｇ／ｍ１　１２％　７％　３％３０　ｎｇ／ｍｌ　 ２５％　１８％　１０％９０　ｎｇ／ｍｌ　４２％　３５％　３１％２７０　ｎ ｇ／ｍｌ　６４％　５９％　５３％８１０　ｎｇ／ｍ！　８４％　８４％　７１ ％２４３０　ｎｇ／ｍｌ　９０％　９０％　７６％表かられかるように、すべて の変異体は、ヒト骨髄腫に対するインターロイキン６の生物活性が特別に効果的 なアンタゴニストである。

圓旦 インターロイキン６の新規なスーパーアンタゴニストの選択のための本発明によ る方法論の適用 プライマー伸張分子生物学技術を使用して（線状ファージタンパク質との融合産 物の形において存在する野生型インターロイキン６の残基Ｇ１ｎ１７５．５ｅｒ １７７、Ｌｅｕ１８１、およびＬｅｕ１８３の変異を含む）、ファージライブラ リーを構築した。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、そのシーケンスが、Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４である６２このヌクレオチド　オリゴヌクレオチド、すな わち、■Ｌ−６ＱＳＬＱ　（ＡＳ）　である。プライマーＩＬ−６ＱＳＬＱ　（ ＡＳ）は、インターロイキン６ｃＤＮＡ（アンチセンスストランド）の５０７の 位置から終結コドンへと広がっていて、アミノ酸１７５（野性型Ｇｌｎ）、１７ ７（野性型５ｅｒ）、１８１　（野性型Ｌｅｕ）、および１８３（野性型引ｎ） をコードしているコドンの変性をもたらし、そして、それはまた、インターロイ キン６の終結コドンの下流に、Ｎｏｔｌ制限部位も導入する。そのシーケンスが ＩＤＮ０：５であるオリゴヌクレオチドＩＬ−６ＱＳＬＱ　ｐｒ、Ｂａｍが、プ ライマー伸長反応のためのプライマーとして使用された。オリゴヌクレオチドＩ Ｌ−６ＱＳＬＯｐｒ、Ｂａｍは、インターロイキン６ｃＤＮＡの５０３位から５ ２２位（センスストランド）へ広がり、そして、それは、ＢａｍＨＩ認識部位を ５′の９つのヌクレオチド内に含んでいる。２つのオリゴヌクレオチドはインタ ーロイキン６ｃＤＮＡの５０７位から５２２位まで互に相補性である。この２つ のオリゴヌクレオチドをｉｎ　ｖｉけ０でアニールし、アニールしたオリゴヌク レオチドを、Ｋｌｅｎｏｗ酵素を使用して遂行されたプライマー伸長反応の基質 として使用した。このようにして得られた２重螺旋ＤＮＡフラグメントは、次に ＢａｍＨＩ　（Ｂｇｌｌｌと両立する）とＮｏｔｌで消化され、野性型のシーケ ンスを突然変異したシーケンスで置換するためにＢｇｌｌｌ　（ＢａｍＨＩと両 立する）、およびＮｏｔＩで消化したプラスミドｐｈｅｎΔｈＩＬ−６中へ連結 した。連結産物はバクテリアに挿入され、約百万の独立した形質転換体（“トラ ンスホーマント”は組み換え体プラスミドを組み込んだバクテリウムに与えられ た定義である）を生じた。

形質転換バクテリアは、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーバクテリオフアージを感染させ、 例１に記述したように、ファージライブラリー（ファスミドのライブラリー）を 生成させた。

そのライブラリーは、例１に記述されたように、５ｈｒｌＬ−６Ｒでコートされ たポリスチレンのポールとともにインキュベートすることによって選択を受けた 。次に、ｐＨ３，６で溶出されたファージ集団をバクテリア中で増幅した。５つ の選択−増幅のサイクルの後、無作為に選択されたファージを、突然変異誘発領 域についてシーケンスを決定した。相当する突然変異体インターロイキン６タン パク質は、適当なバクテリアの株のペリプラズムの空間に産生された（例１に記 述されたように）。そして、受容体結合とヒト肝がん細胞の両者について試験し た。下の表６には、本発明に対する方法論を使用することによって受容体結合と ヒト肝がん細胞に対する生物活性の両方を、増加した変異体の分子、すなわちイ ンターロイキン６のスーパーアゴニストを選択することが可能であることが示し 野性型インターロイキンとへリックスＤにおけるその変異体の受容体との結合の 性質と生物活性野性型　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　１００％　１００％ ファージ５−４　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　２４０％　１３０　％ファ ージ５−８　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　２４０％　１２０％ファージ５ −２　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　２６０％　１５０％ファージ４−８　 Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　１００％　Ｎ、Ｄ。

Ｎ、　Ｄ、・測定されず 本発明による方法論によって選択された変異体は、さらに強力なインターロイキ ン６のスーパーアゴニストの開発のための出発点として使用することができる。

これは、ファージ５−２中に同定された突然変異が、突然変異Ｓｅｒ１７６Ａｒ ｇと併発し、後者の突然変異は、これまでの技術によって受容体結合と生物活性 の両方を増加することが知られているこの例に示される。（６，１１，９２のイ タリア出願に基づく優先権を主張し、２．１１．９３に本出願者が行ったＰＣＴ 出願の国際公開Ｗ０９４／１１４０２を参照のこと）。３つの突然変異は、オリ ゴヌクレオチド支配突然変異によって、同じｃＤＮＡ上にグループされた。その シーケンスが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６であるオリゴヌクレオチド１７５　Ｉ／ １７６Ｒ／ｌ　８３Ａ　（Ｓ）はｐｈｅｎ　ｈＩＬ−６に存在するインターロイ キン６ｃＤＮＡの４９９位から終結コドン（センスストランド）へ広がり、終結 コドンの下流に酵素Ｎｏｔｌの認識部位をもっ７３このヌクレオチドの長さがあ る。そのシーケンスが、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアであるオリゴヌクレオチド１７ ５１／１７６Ｒ／１８３Ａ　（ＡＳ）は、ｐｈｅｎΔｈ　Ｉ　Ｌ−６に存在する インターロイキン６ｃＤＮＡの４９９位から、終結コドン（アンチセンスストラ ンド）へ広がり、終結コドンの上流に酵素Ｎｏｔｌの認識部位を有している７３ ヌクレオチドの長さがある。２つのオリゴヌクレオチドは、互に相補性であり、 それらは、ともに１７５位にアミノ酸イソロイシン、１７６位にアミノ酸セリン 、そして１８３位にアミノ酸アラニンをコードしている。この２つのオリゴヌク レオチドを、ｉｎ　ｖｉけ０でアニールし、このようにして得られた２重螺旋Ｄ ＮＡのフラグメントを野生型シーケンスを突然変異で置換するために、制限酵素 ＢｇｌｌｌとＮｏｔＩて消化し、同じ２つの酵素で消化したベクターｐｈｅｎΔ ｈｌＬ−６へ連結させた。３つの望ましい突然変異を担っている相当するインタ ーロイキン６の変異体を、適切なバクテリアの菌株（例１に記述のように）のペ リプラズマのスペース中に産生させた。そして受容体との結合とヒト肝がん細胞 に対する活性の両方について試験をした。以下の表７には、新しい三重変異体と その親株の２重変異体をともに受容体との結合の性質とヒト肝がん細胞に対する 生物活性が示しである。

表７ 野生型インターロイキン６とへリックスＤにおける２重および３重変異体の両者 の受容体との結合の性質と生物活性野生型　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　１００％ 　１００　％ファージ５−２　１１ｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　２６０％　１５０％３ 重変異体　１１ｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　４５０％　２６０％表７から分るように、 ＧＩｎ１７５１１ｅ／Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ／ＧＩｎ１８３Ａｌａの置換を担って いる変異体は、Ｇ１ｎ１７５１１ｅ／Ｇ１ｎ１８３Ａ１ａのみを担っている親株 の変異体よりもはるかに効果的なインターロイキン６のスーパーアゴニストであ る。

例フ インターロイキン６のスーパーアンタゴニストの選択のための本発明による方法 論の適用 受容体結合能を強く増加させる例６で確認された３つの突然変異、ＧＩｎ１７５ １１ｅ／Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ／ＧＩｎ１８３ＡＩａに、最強のアンタゴニストと して挙動を示す例４と５に記述されたＴｙｒ３１Ａｓｐ／ＧＩｙ３５Ｐｈｅ／Ｓ ｅｒｌ１８Ａｒｇ／Ｖａｌ１２１Ａｓｐ　４：＋の突然変異を、ＰＣＲ戦略によ って組合せた。ＳＡｎ　ｔ　１と呼ばれ、すべての７つの突然変異を含む相当す る変異体タンパク質を受容体結合とヒト肝がんと骨髄腫に対するアンタゴニスト 的挙動の両者について試験した。以下の表８には、インターロイキン６の生物活 性の５０％を阻害するのに必要な変異体の量とともに（ｍｌの培地あたりのナノ グラムの変異体）、５ＡｎｔｌとＤＦＲＤ　（ＳＡｎｔ　１が由来した変異体） の両者の受容体との結合の性質が示しである。（肝がん細胞は、１＋ｏｌの培地 あたりの４ナノグラムの野生型インターロイキンで促進された。一方、骨髄腫細 胞は、野生型インターロイキン６に感受性がより高かったために、培地のｍｌあ たり０．　１ナノグラムのインターロイキン６て促進された）。

表８ アンタゴニストの受容体結合能の関数としてのヒト肝がんと骨髄腫細胞に対する インターロイキン６の活性の阻害ＤＦＲＤ　９７％　＋６４　ｎｇ／ｍｌ　１３ ２　ｎｇ／ｍｌ　１９０　ｎｇ／ｍ１表８から分るように、例６　（Ｇｌｎ１７ ５１１ｅ／Ｓｅｒ１７６Ａｒｇ／Ｇ１ｎ１８３ＡＩｅ）に記述された３つの変異 の導入によって親変異体ＤＦＲＤの受容体との結合能を直ちに増加し、試験され たすべての細胞系に対するインターロイキン６の生物活性の５０％阻害に必要な アンタゴニストの量を著しく減少させ、したがって、極めて効果的なインターロ イキン６のスーパーアゴニストを発生した。

シーケンスのリスト 一般情報 （ｉ）　出願者：ｌ５ＴＩＴＵＴＯＤＩ　ＲＩＣＥＲＣＨＥ　ＤＩＢＩＯＬＯＧ ＩＡ　ＭＯＬＥＣＯＬＡＲＥ　Ｐ、ＡＮＧＥＬＥＴＴＩ　Ｓ、Ｐ。

Ａ。

（ｉｉ）　発明の名称：受容体複合体の一部としてＧＰ１３０を有するホルモン のためにスーパーアゴニスト、アンタゴニストならびにスーパーアンタゴニスト を選択する方法 （ｉｉｉ）シーケンスの数ニア （１ｖ）間合せ住所： （Ａ）名宛人　５ｏｃｉｅｔｌｉ　１ｔａｌｉａｎａ　ＢｒｅｖｅｔＬｉ（Ｂ） ストリート　Ｐｉａｚｚａ　ｄｉ　Ｐｉｅｔｒａ、　３９（Ｃ）市　ローマ （Ｄ）国、イタリ− （Ｅ）郵便番号：ｌ−００１８６ （ｖｉｉｉ）代理人情報 （Ａ）氏名：ＤＩ　ＣＥＲＢＯ，Ｍａｒｉｏ　（Ｄｒ、）（Ｃ）参照：　ＲＭｌ ｏ　９００７５重ＭＤＣ（ｉｘ）　遠距離通信情報 （Ａ）電話：　０６／６７８５９４１ （Ｂ）電話ファックス：　０６／６７９４６９２（Ｃ）テレックス：６１２２８ ７　ＲＯＰＡＴ（１）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のための情報（ｉ）シーケンスの 特徴 （八）長さ：５５５塩基対 （Ｂ）タイプ：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態：２重 （Ｄ）トポロジー二線形 （ｉ　ｉ）　分子のタイプ：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル：ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス：ｎＯ＋−’ （ｖ）　フラグメントタイプ：インターナル（ｖｉｉ）直接源 （八）合成：バクテリア中の産生 （ｉｘ）　さらなる特徴 （Ａ）名称：ＩＬ−６ｃＤＮＡ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２についての情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ＝７０塩基対 （Ｂ）タイプ：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態目本鎖 （ｐ）トポロジー二線形 （ｉｉ）　分子タイプ二合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル　ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス、ｎ。

（Ｖ）　フラグメントタイプ：インターナル（ｖｉｉ）直接源 （Ａ）合成；オリゴヌクレオチドシンセサイザー（ｉｘ）　さらなる特徴 （Ａ）名称：ＩＬ−６３１Ｄ３５ＰＣＲ（Ｃ）同定法：ポリアクリルアミドゲル （ｘｉ）　シーケンスの記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２（３）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ＋３についての情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ一７２ヌクレオチド （Ｂ）タイプ、ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｉｉ）　分子のタイプ　合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル、ｎ。

（１ｖ）アンチセンス：ｙｅｓ （Ｖ）　フラグメントタイプ：インターナル（ｖｉｉ）直接源・ （Ａ）合成：オリゴヌクレオチドシンセサイザー（ｉｘ）　さらなる特徴 （八）名称：ＩＬ−６１１８ＲＣＬＦ／１２１ＶＤ（Ｃ）同定法：ポリアクリル アミドゲル（ｘｉ）　ノーケンスの記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３ＣＧＣＡＴＣ ＴＡＧＡ　ＴＴＣＴＩＴＧＣＣＴ　ＴＩＴＴＣＴＧＣＡＧ　ＧＭＣＴＧＧＡＴＣ ＡＧＧＫＣｍＴＧ　ＴＧＹＺＣＡＴＣＴＧ　６O ＣＡＣＡＧＣＴＣＴＧ　ＧＣ７２ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４についての情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ：６２このヌクレオチド （Ｂ）タイプ；ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態−１本鎖 （Ｄ）トポロジー−線型 （ｉ　ｉ）　分子のタイプ：合成りＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセテイカル：ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス：ｙｅｓ （Ｖ）　フラグメントタイプ：カルボキシ−末端（ｖｉ　ｉ）直接源 （Ａ）合成：オリゴヌクレオチドシンセサイザー（ｉｘ）　さらなる特徴 （八）名称：ＩＬ−６ＱＳＬＱ（ＡＳ）（Ｃ）同定法：ポリアクリルアミドゲル （ｘｉ）　シーケンスの記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ についての情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ：２４のヌクレオチド （Ｂ）タイプ：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態、１本鎖 （Ｄ）トポロジー・線型 （１１）分子の型：合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル二〇〇 （ｉｖ）　アンチセンス　ｎ。

（Ｖ）　フラグメントタイプ・インターナル（ｖｉｉ）直接源 （Ａ）合成：オリゴヌクレオチドシンセサイザー（１ｘ）さらなる特徴 （Ａ）名称：ＩＬ−６ＱＳＬＱ　ｐｒ、Ｂａｍ（Ｃ）同定法：ポリアクリルアミ ドゲル（ｘｉ）　シーケンスの記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５ＣＧＣＧＧＡＴＣ ＣＴ　ＴＴＭＧＧＡＧＴｒ　ＣＣＴＧ　２４ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋６についての 情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さニア３のヌクレオチド （Ｂ）タイプ：ヌクレオチド （０鎖の状態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー・線型 （ｉｉ）　分子の型二合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル：ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス＝ｎ。

（Ｖ）　フラグメントタイプ：カルボキシ−末端（ｖｉｉ）直接源 （八）合成：オリゴヌクレオチドシンセサイザー（ｉｘ）　さらなる特徴 （Ａ）名称：１７５１／１６７Ｒ／１８３Ａ（Ｓ）（Ｃ）同定法：ポリアクリル アミドゲル（ｘｉ）　シーケンスの記述：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：６ＧＣＣＴＧＡ ＧＡＴＣＴＴＩＴＭＧＧＡＧ　ＴＴＣＣＴＧＡＴＣＣＧＴＡＧＣＣＴＧＡＧ　Ｇ ＧＣＴＣＴＴＣＧＧ　ＧＣＴＡＴＧＴＡＧＧ　U０ ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴ　ＧＧＣ７３ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアについての情報（ｉ）シーケンスの特徴 （Ａ）長さ＝７３のヌクレオチド （Ｂ）タイプ：ヌクレオチド （Ｃ）鎖の状態：１本鎖 （Ｄ）トポロジー：線型 （ｉ　ｉ）　分子の型二合成りＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセテイカル二〇〇 （ｉｖ）　アンチセンス：ｙｅｓ （Ｖ）　フラグメントタイプ：インターナル（ｖｉｉ）直接源 （Ａ）合成：オリゴヌクレオチドシンセサイザー（１ｘ）さらなる特徴 （Ａ）名称：　１７５１／１６７Ｒ／１８３八（Ａ　５）（Ｃ）同定法；ポリア クリルアミドゲル（ｘｉ）　シーケンスの記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋７ＧＣＣ ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＡＣＡＴ　ＡＧＣＣＣＧ八八Ｇ八　へへＣへＴＣ八 ＧＧＣへＡＣＧＧＡＴＣＡＧ　ＧＡＡＣＴＣＣＴＴＡ@６０ ＡＡＡＧＡＴＣＴＣＡ　ＧＧＣ７３ 浄ど（内′ｇに変更なし） ＦＩＧ、１ ｃｘｙｏｘｘｑ６ωαＯ 手続補正書（自発） Ｑ＠Ｆｒ−ｔｆＢｌ−８〜　７１”“１”°°薄薄明寄書請求の範囲及び要約書 目訳文の浄書（内容に変更なし）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）フロン トページの続き （７２）発明者　キルベルト、ゲナロ イタリア国アイ　−００１２４カサルパロッコ、ピアレ　ゴルギア　ディ　レオ ンチ二３３０／１９

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞生理を調節する機序を活性化するために、膜分子ｇｐ１３０を使用する ホルモンのスーパーアゴニスト、アンタゴニスト、ならびにスーパーアンタゴニ ストを選択する以下の操作からなる方法−成長ホルモンのアミノ酸シーケンスを 該ホルモンのシーケンスと比較する；−成長ホルモンの受容体のアミノ酸シーケ ンスをホルモン特異性受容体とｇｐ１３０である問題のホルモンの２つの受容体 のそれらと比較する；−上記の比較に基づいて、成長ホルモンの受容体のシーケ ンスと問題の２つのホルモン受容体の間の機能的類似性に根拠を置く受容体複合 体の３次元モデルを作り；そして −それぞれ特異的受容体との相互作用の部位、およびｇｐ１３０との相互作用の 部位の１部を形成する問題の野生型ホルモンの残基を同定する。
2. ２．問題のホルモンが、インターロイキン６（ＩＬ−６）、オンコスタチンＭ（ ＯＳＭ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、線毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、お よびインターロイキン１１（ＩＬ−１１）からなるグループから選ばれる請求項 １に記載の細胞生理を調節する機序を活性化するために、膜の分子ｇｐ１３０を 使用する１ホルモンのスーパーアゴニスト、アンタゴニスト、およびスーパーア ンタゴニストを選択するための方法。
3. ３．さらに、以下の付加的操作を含む請求項２に記載のインターロイキン６のス ーパーアゴニストを選択するための方法。 −線状のファージタンパク質との融合産物の形で存在するインターロイキン６の 以下の野生型残基の変異を含む 【配列があります】 −各ファージが、変異体インターロイキン６シーケンスを有しているファージラ イブラリーの生成； −インターロイキン６の変異体を発現するファージの混合集団から、特異的受容 体に対する親和性が野生型インターロイキンのそれより大きいファージを選択す ること；そして、 −選ばれたファージの粒子から抽出されたＤＮＡのシーケンシングによって、受 容体に結合する最善の単数、または複数のアミノ酸シーケンスを同定すること。
4. ４．Ｍ１３のタンパク質ＰＩＩＩの融合産物として存在する該野生型のインター ロイキン６の残基の変異体を含む一連のファージライブラリーが産生される請求 項３に記載のインターロイキン６のスーパーアゴニストを選択するための方法。
5. ５．請求項１および２に記載のインターロイキン６のアンタゴニストを選択する ためのさらに以下の付加的操作を含む方法：−既存の分子生物学的技術を使用し てのｇｐ１３０（【配列があります】およびＬｙｓ１２９）との相互作用の部位 の一部を形成する請求項１において同定された残基の突然変異−その特異的受容 体に対する親和性が元のままであり、生物活性の減少、または喪失を示すインタ ーロイキン６の変異体を同定するために、上記のように産生された変異体につい て、生物活性と特異的インターロイキン６受容体との親和性を評価すること；そ して、 −インターロイキン６の上記の変異体を、野生型インターロイキン６の生物活性 のアンタゴニストとして評価する。
6. ６．上に示されたように、アンタゴニスティック活性の原因となるアミノ酸シー ケンスの変異とインターロイキン６についての特異的親和性の増加の原因となる アミノ酸の変異を組合せることによる請求項２から５に記載のインターロイキン ６のスーパーアンタゴニストを選択するための方法。
7. ７．上記のように同定された残基の突然変異誘発を、ポリメラーゼ連鎖反応、プ ライマー伸張法、オリゴヌクレオチド支配突然変異誘発、およびそれらの組合せ のグループから選ばれた分子生物学の技術を用いて遂行される請求項６に記載の アンタゴニスト、またはスーパーアンタゴニストを選択する方法。
8. ８．細胞生理の調節の機序を活性化するための膜分子ｇｐ１３０を使用し、請求 項１から７に記載の方法論を使用して得ることができるアゴニスト（複数）、ア ンタゴニスト（複数）、およびスーパーアンタゴニスト（複数）。