JP2000283983A - ヒト免疫グロブリンｇ測定用試薬及びヒト免疫グロブリンｇの検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 検体中のヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬、
及びこれを用いて疾患、特に膠原病を容易に診断するた
めのヒト免疫グロブリンＧの検出方法を提供する。 【解決手段】 Datura stramonium 由来のレクチンを有
効成分として含有する免疫グロブリンＧ測定用試薬、及
び被検試料に、Datura stramonium 由来のレクチンを有
効成分として含有する免疫グロブリンＧ測定用試薬を反
応させ、ヒト免疫グロブリンＧに結合したレクチンを検
出することを特徴とするヒト免疫グロブリンＧの検出方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト免疫グロブリ
ンＧ（以下、ＩｇＧと記載する。）をその糖鎖を利用し
て測定する試薬及び方法に関する。更に詳しくは、本発
明は、ＩｇＧの糖鎖を、Datura stramonium 由来のレク
チン（Datura stramonium agglutinin又はDatura stram
onium lectin：以下、これらをまとめてＤＳＡと略記す
る。）を用いて、糖鎖工学的に測定するＩｇＧ測定用試
薬及び該試薬を用いたＩｇＧの検出方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】（１）ＩｇＧの糖鎖構造 生体の感染防御機能を司る分子の一つであるＩｇＧは、
分子量約１５０，０００の糖蛋白質であり、近年、その
Ｆｃフラグメント（以下、Ｆｃ断片と記載する。）の糖
鎖構造が解明された［ザ・ジャ−ナル・オブ・イムノロ
ジ−（The Journal of Immunology)、第１２９巻、第２
０１６ぺ−ジ、１９８２年。バイオケミストリ−(Bioch
emistry)、第２６巻、第１１３７ペ−ジ、１９８７
年］。また、この糖鎖にはいくつかの亜型があることも
知られている［アナリティカル・ケミストリ−(Analyti
cal Chemistry)、第１６３巻、第４８９ぺ−ジ、１９８
７年］が、血清中のＩｇＧの大部分を占める主要な構造
は、次の式（Ｉ）に示すとおりである。

【０００３】

【化１】

【０００４】式（Ｉ）において、Galはガラクトース、G
lcNAcは、N-アセチルグルコサミン、Manはマンノース、
Fucはフコースを表す(以下同様)。特にこの糖鎖構造
は、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis：以下、
ＲＡと略記する。)患者の血清について詳細に研究さ
れ、その結果ＲＡ患者血清中のＩｇＧは、健常人のＩｇ
Ｇと比較してガラクトースの含有量が著しく減少してい
ることが見い出された［ネイチャ−(Nature)、第３１６
巻、第４５２ぺ−ジ、１９８５年］。更に、この事実に
基づいてＲＡ患者の血清ＩｇＧの糖鎖のガラクトース欠
損という構造異常を把握することにより、ＲＡのマーカ
ーとして使用し得ることが判明した［クリニカル・イム
ノロジ−(Clinical Immunology) 、第１７巻、第９７７
ペ−ジ、１９８５年］。この事実に基づいて、既に幾つ
かのリウマチ診断薬が開発されているが、これらについ
ては後記する。また、前記以外のＩｇＧ分子の糖鎖異常
については、ミエロ−マ患者から採取した血清ＩｇＧ
と、健常人から採取した血清ＩｇＧとを比較検討した前
記報告［バイオケミストリ−(Biochemistry)、第２６
巻、第１１３７ペ−ジ、１９８７年］において、ミエロ
−マ患者ＩｇＧでは分枝構造のフコ−スの欠損、糖末端
に存在するガラクト−ス及びそれに続くＮ−アセチルグ
ルコサミンの欠損が見い出されたと記載されているが、
これ以外には未だ報告が皆無である。

【０００５】（２）ＩｇＧの糖鎖におけるガラクトース
欠損をマーカーとするＲＡ診断薬 次に、ＲＡ患者の血清ＩｇＧの糖鎖におけるガラクトー
ス欠損を把握することをＲＡのマーカーとして使用する
目的で開発された幾つかのリウマチ診断薬について説明
する。その一つは、ヒト血清中のＩｇＧのガラクト−ス
量をＦｃ断片を削除した抗ヒトＩｇＧとガラクト−スに
特異的に結合するレクチンであるRicinus communis agg
lutinin １２０（以下、ＲＣＡ１２０と略記する。）で
サンドイッチして測定する方法（特開平５−８７８１４
号公報）である。この方法においては、ＲＣＡ１２０を
使用している点、及びヒトＩｇＧをトラップする物質
が、Ｆｃ断片を削除した抗ヒトＩｇＧに限定されている
が、Ｆｃ断片の削除は操作が煩雑であり、かつ費用も要
する点において不都合がある。また、この方法において
は、ＲＡ患者の血清中のＩｇＧはガラクト−スを欠損し
ているものが多いので、健常人の血清中のＩｇＧはＲＣ
Ａ１２０との反応性が高いが、ＲＡ患者では反応性が低
く測定される。

【０００６】これに対し、糖鎖末端のガラクト−スの欠
損により、前記式（I)に示すとおりその次に存在するＮ
−アセチルグルコサミンが外部に露出していることか
ら、糖鎖末端のガラクト−ス及びＮ−アセチルグルコミ
ンを同時に検出し、その量を比較する方法も開発された
（特許第２７０１９０８号公報）。この方法において
は、ＩｇＧを変性させ、糖鎖末端のガラクト−スをAbru
s precatorius 由来のレクチン又はＲＣＡ１２０を用い
て測定し、Ｎ−アセチルグルコサミンをBandeireasimpl
icifolia、Datura sramonium又はLycopersicon esculen
tum由来のレクチンを用いて測定する方法が開示されて
いる。更に、この方法においては、血液試料からＩｇＧ
画分を公知の方法により分離し、分離したＩｇＧを測定
前に熱、化学的な還元又は尿素のいずれかにより変性さ
せ、これを固相に吸着させ、その糖鎖末端を前記レクチ
ンを用いて測定する。この方法において使用可能なレク
チンとしてＤＳＡを例示しているが、その目的は糖鎖末
端にガラクト−スが存在しない場合のＮ−アセチルグル
コサミンの測定のためである。従って、この方法におい
ては、検体から予めＩｇＧを分離し、かつ変性させ、更
に最低でも２種類のレクチンを用いて測定しなければな
らないので、操作が煩雑であり、かつ測定に要する時間
が長いという欠点があった。

【０００７】その後、土屋ら［ザ・ジャ−ナル・オブ・
イムノロジ−(The Journal of Immunology）、第５１
巻、第１１３７ペ−ジ、１９９３年］が、血清中のＩｇ
Ｇの糖鎖末端のＮ−アセチルグルコサミンのみを検出す
ることを目的とした方法を発表し、この方法において
は、ＩｇＧを予め分離変性させずに測定が可能であると
報告している。この方法においては、血清中のＩｇＧを
トラップする物質としてプロテインＧを使用し、レクチ
ンとしてはPsathyrella velutina由来のレクチン（以
下、ＰＶＬと略記する。）を使用している。即ち、酵素
免疫定量法(enzyme-linked immunosorbent assay:ELIS
A)用のプレ−トにプロテインＧを吸着させ、このプロテ
インＧと検体中のＩｇＧとを反応させ、結合したＩｇＧ
の糖鎖末端をＰＶＬで検出する方法である。更に、この
方法を改良した方法（特開平１０−１２３１３２号公
報）として、ＩｇＧをレクチンでトラップし、これを抗
ヒトＩｇＧで検出するサンドイッチ法が開示されてい
る。この方法においては、レクチンは主にPsathyrella
velutina由来のレクチンを使用しているが、その他にも
Triticum vulgaris、Datura stramoniun、Lycopersicon
esculentum、Soianumtuberosum、Labuunum alpinum、O
ryzae sativa、Phytolacca americana、又はUlex europ
aeusII由来のレクチンが使用可能であるとして例示され
ている。前記土屋らの報告及び特開平１０−１２３１３
２号公報の方法においては、レクチンは、いずれも末端
ガラクトース残基が欠損した場合に露出されるＮ−アセ
チルグルコサミンを検出する目的で使用されているの
で、ＲＣＡ１２０を用いてガラクト−スを検出していた
場合とは異なり、健常人では反応性が低下し、ＲＡ患者
では反応性が高く測定される。

【０００８】（３）ＤＳＡの反応特性 一方、ＤＳＡは通常Ｎ−アセチルグルコサミン結合レク
チンとして分類されている（日本生化学会編、「続生化
学実験講座４：複合糖質研究法Ｉ」、第３４ペ−ジ、東
京化学同人、１９８５年）。従って、従来ＤＳＡはＩｇ
ＧとＮ−アセチルグルコサミンを介して結合するものと
考えられていた。しかしながら、最近の知見によれば、
ＤＳＡはＮ−アセチルラクトサミンとも反応することが
明らかにされている［ヒストケミストリ−(Histochemis
try)、第９２巻、第５１５ペ−ジ、１９８９年、及び日
本眼科学会誌、第９９巻、第９９５ペ−ジ、１９９５
年］。即ち、Ｎ−アセチルラクトサミンは、ガラクト−
スを欠損していない健常人のＩｇＧ糖鎖末端の構造なの
である。ＤＳＡを使用している前記特許第２７０１９０
８号公報及び特開平１０−１２３１３２号公報記載の方
法において、それぞれ実際に使用しているレクチンは、
前者ではBandeirea simplicifolia由来のレクチンであ
り、後者ではPsathyrellavelutina由来のレクチンであ
る。しかしながら、これらの方法において各々例示され
ているＤＳＡを含むその他のレクチンについては、実際
に測定を行っておらず、その反応性の確認も行われてい
ないので、これらの方法において、期待されているよう
に糖鎖末端にガラクト−スを欠いたＩｇＧと反応し、ガ
ラクト−スの欠損を検出できるか否かは多いに疑問であ
り、特にＤＳＡに関してはむしろＲＣＡ１２０と同様に
ガラクト−スを欠損していない糖鎖を検出する可能性も
高いものと推定される。

【０００９】また、ＤＳＡがＮ−アセチルラクトサミン
と反応するので、ＲＣＡ１２０のように健常人ＩｇＧに
強い反応性を示すか否かについては、実際にＤＳＡを用
いて実験しなければ判定できないのである。なぜなら
ば、いわゆるレクチン全体の特性として、厳密な糖結合
特異性が明かにされているものは少なく、十分研究され
ているレクチンであっても、未知の特異性が存在してい
る場合がある（谷口直之ら監修、「細胞工学別冊 実験
プロトコールシリーズ：グライコバイオロジー実験プロ
トコール−糖蛋白質・糖脂質・プロテオグリカン−」、
第２２ペ−ジ、秀潤社、１９９６年)ことも示唆されて
いるからである。また、複数の反応基を同時に有する糖
鎖と反応させる場合、その反応性には優先順位が生じる
こともあり得るのである。実際にＤＳＡを用いて糖蛋白
質の糖鎖を測定した例として、例えば、血清中のトラン
スフェリンの糖鎖をAleuria aurantia由来レクチン及び
ＤＳＡを用いて測定し、肝癌の診断薬としている例（特
許第２６３０４３６号公報）、ヒト絨毛性腺刺激ホルモ
ンの糖鎖をＤＳＡを用いて測定して絨毛癌を診断する方
法（特開昭６３−２２３５６０号公報）等がある。これ
らの方法において明らかにされている糖鎖異常のトラン
スフェリン及びヒト絨毛性腺刺激ホルモンは、糖鎖末端
のＮ−アセチルグルコサミンを介してＤＳＡと結合して
いるのではなく、次の式(II）及び式(III)に示す部位に
おいてＤＳＡと結合していると考えられているが、健常
人血清中のＩｇＧ糖鎖にこれらの部位は存在しない。

【００１０】

【化２】

【００１１】

【化３】

【００１２】式（II)及び式（III)において、Ｒは水素
又は糖を表す（以下同様）。また、ＤＳＡをクロマトグ
ラフィ−用担体に結合させ、これを用いて糖鎖の結合性
を測定することから、次の式（IV)乃至式（VII)に示す
糖鎖部位と結合することが知られている(谷口直之ら監
修、「細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ：グラ
イコバイオロジー実験プロトコール−糖蛋白質・糖脂質
・プロテオグリカン−」、第２０ペ−ジ、秀潤社、１９
９６年)が、これらの構造もＩｇＧ糖鎖には存在しな
い。

【００１３】

【化４】

【００１４】

【化５】

【００１５】

【化６】

【００１６】

【化７】

【００１７】更に、ＤＳＡがＩｇＧの糖鎖と結合するか
否かさえも、実際には測定されて報告された例は皆無で
ある。従って、ＤＳＡがＩｇＧの糖鎖と反応するのか否
か、反応するとすれば、Ｎ−アセチルラクトサミン若し
くはＮ−アセチルグルコサミンのいずれと反応するの
か、両者を介して反応するのか、又はこれまでに知られ
ていない部位で反応するのか等、全てが現在明らかにさ
れていない。

【００１８】（４）膠原病 一方、血清中のＩｇＧにおいてガラクト−スが顕著に欠
損していることが認められるＲＡは、膠原病と呼ばれる
疾患群の一つであり、これに類似した疾患は多数存在す
る。膠原病は、１９４２年にクレンペラー(Klemperer)
により提唱された臨床形態学的概念であり、結合組織の
系統的疾患であって、全身の膠原繊維にフィブリノイド
変性という共通の病変が認められる疾患群の総称であ
る。特に、全身性エリテマトーデス(systemic lupus er
ythematosus ：以下、ＳＬＥと略記する。）、強皮症(p
rogressive systemic sclerosis ：以下、ＰＳＳと略記
する。)、皮膚筋炎(dermatomyositis：以下、ＤＭと略
記する。)、ＲＡ、リウマチ熱(rheumatic fever：以
下、ＲＦと略記する。)、結節性多発（性）動脈炎(Poly
arteritis nodosa：以下、ＰＮと略記する。)の６疾患
が古典的膠原病と呼ばれている。のちに皮膚筋炎は、多
発性筋炎(Polymyositis：以下、ＰＭと略記する。）と
共にＰＭ／ＤＭとしてまとめられることが多くなった。

【００１９】これらの疾患うち、ＲＦは溶連菌感染症で
発症することが明らかにされ、膠原病から除外されてい
る。残る５疾患のうちＰＮを除くＳＬＥ、ＰＳＳ、ＰＭ
／ＤＭ及びＲＡの４疾患においては、高γ−グロブリン
血症、抗核抗体等の各種自己抗体が検出され、免疫異常
を伴って発症する共通点があり、相互に重複して発症す
ることも希ではない。このように重複現象が認めるられ
る疾患には、混合性結合組織病(mixed connective tiss
ue disease：以下、ＭＣＴＤと略記する。）、及び重複
症候群(overlap syndrome)がある。また、

【外１】 、ウェゲナー肉芽腫症、過敏性血管炎、ベーチェット
病、血栓性血小板減少性紫斑病等は、その病態及び病像
が膠原病に類似することから膠原病周辺疾患、又は膠原
病近縁疾患と呼ばれている。これらの疾患により出現す
る臨床症状は、疾患特異的な臨床症状も存在するが、い
くつかの疾患に共通する症状も多い。疾患特異的な症状
としては、例えばＳＬＥの蝶型紅斑及び腎障害、ＰＳＳ
の皮膚硬化及び食道の拡張等がその代表的なものであ
り、これらの臨床症状が確認されるならば診断は容易で
あるが、問題は、このような疾患特異的な症状が常に出
現するとは限らないことである。特に疾患の早期若しく
は軽症例ではこれらの症状を示さないか、又は不明瞭で
あることも珍しくはない(柏崎禎夫ら編、「ＮＩＭ Lec
tures：免疫・アレルギー・リウマチ病学」、第９２ペ
−ジ及び第１７３ペ−ジ、医学書院、１９９５年)。そ
のためこれら膠原病の診断には種々の方法が研究されて
おり、その一例として前記のＲＡ患者に認められるガラ
クトース欠損というＩｇＧの糖鎖構造異常が見い出さ
れ、この測定方法が確立されたが、ＲＡには他に類似し
た疾患が多いにもかかわらず、ＲＡ以外の膠原病疾患に
おけるＩｇＧの糖鎖構造について、健常人との差異があ
るか否かの検討は、詳細に行われていなかった。

【００２０】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、ヒトＩ
ｇＧの糖鎖については、ＲＡ患者におけるガラクトース
の欠損という異常現象が詳細に研究されたが、ＲＡ以外
の疾患についてはほとんど研究されていない。また、Ｉ
ｇＧの糖鎖についてもガラクト−スの欠損を把握するこ
とを目的とした測定は行われているが、それ以外の構造
の差異を測定する方法については、従来確立されていな
い。更に、従来ＩｇＧの糖鎖においてガラクト−スの欠
損により糖鎖末端に露出されるＮ−アセチルグルコサミ
ンを検出すると思われていたＤＳＡが、実際にＩｇＧと
反応するのか否かさえも明らかではなく、しかもＤＳＡ
がＮ−アセチルラクトサミンとも反応することが明らか
になった現在では、ＩｇＧと結合するのであればどの部
位を介して結合するのかも明らかではない。前記従来技
術に鑑みて本発明者らは、鋭意研究を行った結果、Ｉｇ
ＧについてＤＳＡとの反応性を確認し、実際にＤＳＡが
健常人のＩｇＧと反応性の高いことを見い出した。ま
た、このＤＳＡとＩｇＧとの反応は、ガラクト−スの欠
損とはなんら関係が無く、更に既に明らかになっている
ＲＣＡ１２０とＩｇＧとの反応性とは異なるものである
ことを見い出し、これらの発見に基づいて本発明を完成
した。本発明の目的は、検体中のＩｇＧを測定するため
の試薬及び試薬キットを提供することである。本発明の
他の目的は、疾患、特に膠原病を容易に診断するために
用いられるヒト免疫グロブリンＧの検出方法を提供する
ことである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第一の発明（以下、第一発明と記載する。）は、Da
tura stramonium 由来のレクチンを有効成分として含有
する免疫グロブリンＧ測定用試薬であり、Datura stram
onium 由来のレクチンが、Datura stramoniumagglutini
n又はDatura stramonium lectinであること、該試薬
が、疾病の診断に使用されること、及び疾病が、膠原病
であることを望ましい態様としてもいる。また前記ヒト
免疫グロブリンＧ測定用試薬と、不溶化担体と、該担体
に固定化してヒト免疫グロブリンＧを捕捉する捕捉物質
とを含むヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬キット、更に
標識化レクチンを検出する検出物質を含むヒト免疫グロ
ブリンＧ測定用試薬キットをも提供する。前記課題を解
決する本発明の第二の発明（以下、第二発明と記載す
る。）は、検体に含有されるヒト免疫グロブリンＧと、
Datura stramonium 由来のレクチンを有効成分として含
有する免疫グロブリンＧ測定用試薬とを反応させ、前記
ヒト免疫グロブリンＧに結合した前記レクチンを検出す
ることを特徴とするヒト免疫グロブリンＧの検出方法で
ある。第二発明において、検体に含有されるヒト免疫グ
ロブリンＧを、不溶化担体に固定化し、この固定化ヒト
免疫グロブリンＧを、Datura stramonium 由来の標識化
レクチンを有効成分として含有するヒト免疫グロブリン
Ｇ測定用試薬と反応させ、結合した前記レクチンの標識
に起因したシグナルを検出する構成とすることも一つの
態様である。

【００２２】

【発明の実施の形態】次に本発明について詳細に説明す
るが、最初に第一発明について説明する。本発明者ら
は、前記のとおりＩｇＧの糖鎖について各種レクチンを
用いて検討を行った結果、ＤＳＡが必ずしもガラクト−
スを欠損したＩｇＧと優先的に反応しない事実を発見し
た。この事実については実際の試験例を後記するが、市
販のＩｇＧを酵素を用いて人為的、かつ段階的にガラク
ト−スを欠損させた試料を用いて反応性を確認した結
果、ガラクト−スが欠損している試料であっても、特段
にＤＳＡとの反応性が増加する現象は認められなかっ
た。従って、ＤＳＡは、従来技術である特許第２７０１
９０８号公報及び特開平１０−１２３１３２号公報記載
の方法に例示されているように、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンを介してＩｇＧと結合しないことが判明した。ま
た、健常人血清中のＩｇＧと、ＲＡ患者血清中のＩｇＧ
とについてＤＳＡを用いた測定を行った結果、後記する
実施例から明らかなとおり、特開平１０−１２３１３２
号公報記載の方法においてＰＶＬを用いて測定され、Ｄ
ＳＡでも期待された健常人で反応性が低く、ＲＡ患者で
反応性が高くなるという現象は認められず、逆に健常人
では反応性が高く、ＲＡ患者では反応性が低下した。こ
の健常人ＩｇＧでは高く、ＲＡ患者では低いという反応
性は、特開平５−８７８１４号公報におけるＲＣＡ１２
０を用いて測定された反応性と同様であるが、ＤＳＡは
人為的にガラクト−スを欠損させたＩｇＧとは反応しな
かったことから、ＤＳＡとＲＣＡ１２０はＩｇＧと結合
する部位が異なるものと推定される。以上の知見から、
本発明者らは、検体中のＩｇＧを固相に固定化させ、Ｄ
ＳＡを反応させることを目的として、利用し得る幾つか
の方法について種々の検討を行ない発明を完成するに至
った。

【００２３】本発明において、検体中のＩｇＧを固相に
固定化させるために、ＩｇＧをトラップする物質（捕捉
物質）としては、プロテインＡ、プロテインＧ等を例示
することができる。また、他の動物種に免疫することに
より得られる抗ヒトＩｇＧ抗体についても糖鎖を除去
し、後に用いるレクチンとの反応を惹起しないよう処理
すれば利用が可能であり、この他にも後記するＤＳＡと
の反応を妨げること無くＩｇＧを特異的にトラップでき
るものであればそれを利用することができる。これらＩ
ｇＧをトラップする物質としてのプロテインＧ等は、市
販のものを用いることが可能であり、不溶化担体に化学
的又は物理的に固定化することができる。不溶化担体と
してはポリスチレン、ガラス等を用いたマイクロプレー
ト、ビーズ、チューブ等を例示することができる。ま
た、セルロース、その他の材質からなるメンブレン等も
利用可能である。

【００２４】本発明に使用するＩｇＧを検出するレクチ
ンとしては、ＤＳＡを使用することが望ましい。このレ
クチンは市販のものを用いることが可能であり、またこ
のレクチンは、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、Ｈ
ＲＰと略記する。）等の酵素、ビオチン、蛍光色素、金
コロイド、ラテックス粒子等で標識されたものが望まし
い。標識レクチンは市販されているものを使用すること
が可能であるが、公知の方法(例えば、石川栄治著、
「超高感度酵素免疫測定法」、第１１７７ペ−ジ、学会
出版センタ−、１９９３年等)を用いて標識を行なうこ
ともできる。

【００２５】標識に起因したシグナルは、吸光度法（比
色法)、蛍光法、発光法、直接肉眼による観察等により
検出することが可能であり、例えば、吸光度法による場
合には、シグナルの経時的変化を測定する方法及び一定
時間後のシグナルを測定する方法がある。更に具体的に
は、この標識に起因したシグナルを検出するには、例え
ば標識がＨＲＰである場合には、ＨＲＰに対する基質で
ある２，２´−アジノジ−（３−４エチルベンズチアゾ
リン−６−スルホン酸）（以下、ＡＢＴＳと略記す
る。）等を一定時間反応させ、その反応を２％シュウ酸
等を用いて停止させ、吸光値を測定する等の方法があ
り、この場合、ＡＢＴＳ等は市販のキットを使用するこ
とが可能である。またビオチンで標識を行った場合は、
ＨＲＰ等の酵素を標識したアビジン又はストレプトアビ
ジンを更に反応させ、アビジン又はストレプトアビジン
により標識された酵素を、前記のＡＢＴＳ等の基質を用
いて検出する。また、シグナルが蛍光色素である場合に
は、蛍光色素を認識できる市販の機器を用いて検出を行
うことができる。また、シグナルが金コロイド又はラテ
ックスの場合は、濁度を市販の粒度分布計等の機器を用
いて測定することも可能であり、肉眼で観察することに
よっても検出が可能である。

【００２６】本発明において、前記Datura stramonium
由来のレクチン、特に標識化レクチンと、不溶化担体
と、該担体に固定化してＩｇＧを捕捉する捕捉物質とを
含むＩｇＧ測定用試薬キットを構成することができる。
更に標識化レクチンを検出する検出物質を含むＩｇＧ測
定用試薬キットとすることができる。これらの測定用試
薬キットに用いられる、標識化レクチン、不溶化担体、
固定化物質、検出物質としては、前記のものを用いるこ
とができる。

【００２７】次に、第二発明について説明する。第二発
明の検出方法に使用する検体としては、ヒト血液、血
清、血漿、尿、又はＩｇＧを産出する細胞の培養上清
等、ＩｇＧを含有する液体試料であれば、いずれであっ
てもよい。これらの検体を凍結乾燥した粉体試料であっ
ても、濃度が判明していれば、生理的食塩水等に再溶解
し、液状化することにより測定が可能である。しかしな
がら、例えば血液そのものを使用する場合等、固形成分
の混在する試料については、事前に遠心分離、膜等によ
る分離を行い、赤血球等の固形成分を除去する必要があ
る。前記ＩｇＧをトラップする物質（例えば、プロテイ
ンＧ等）とレクチンとを用いた検体中の糖鎖異常ＩｇＧ
の測定は、次のとおり実施する。即ち、担体にＩｇＧを
トラップする物質（捕捉物質、例えば、プロテインＧ
等）を固定化し、この捕捉物質に検体（又は必要に応じ
て希釈した検体）を反応させ、捕捉物質と結合したＩｇ
Ｇ（Ｂ：結合型）を、結合しない遊離のＩｇＧ（Ｆ：遊
離型）から分離（Ｂ／Ｆ分離）し、のち標識したレクチ
ンを反応させる。これを再度Ｂ／Ｆ分離し、標識のシグ
ナルを適宜な手段により検出する。

【００２８】標識に起因したシグナルは、前記のとおり
吸光度法（比色法)、蛍光法、発光法、直接肉眼による
観察等により検出することができる。第二発明の検出方
法により実際に健常人１０名、膠原病の患者（ＳＬＥ患
者２２名、ＰＳＳ患者４名、ＳｊＳ患者８名、ＭＣＴＤ
患者６名及びＲＡ患者９名）から血液を採取し、赤血球
等の固形成分を自然凝固させ、遠心分離して除去し、血
清画分の測定を行った結果、実施例２に示すとおり健常
人血清中のＩｇＧはレクチンとの反応性が高く、膠原病
の患者血清中のＩｇＧは、レクチンとの反応性が低いこ
とが判明した。次に試験例を示して本発明を詳細に説明
する。

【００２９】試験例１ この試験は、ＤＳＡが検出するＩｇＧの糖鎖部位と残存
ガラクト−スとの関係を調べるために行った。 １）試料の調製 健常人血清からのＩｇＧの精製 市販のプロテインＧセファロ−ス（ファルマシア社製）
をガラス製の耐圧性カラム（ミリポア社製）に充填し、
このカラムをリン酸緩衝化生理食塩水（phosphate buff
ered saline:以下、ＰＢＳと略記する。）により十分洗
浄し、のち、健康診断時にボランティアから採取し、プ
−ルした健常人血清５ｍｌを前記カラムに添加し、ＰＢ
Ｓ５０ｍｌにより十分洗浄し、非吸着画分を除去した。
次いで、カラムを酢酸緩衝液（ｐＨ３．５）５０ｍｌに
より洗浄し、吸着画分を回収し、回収した画分に直ちに
トリス緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し、溶液のｐＨをほ
ぼ中性に調整した。 段階的に残存ガラクトース量を調節したアガラクトシ
ルＩｇＧの調製 公知の方法（特許第２７２６５００号公報）により次の
とおり調製した。異なる２種類の市販凍結乾燥ＩｇＧ
（カッペル社製及びダコ社製。試料１及び試料２）及び
前記において精製したＩｇＧ（試料３）を０．１Ｍ酢
酸バッファー（ｐＨ５．０）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で
溶解し、この溶液各々１ｍｌにシアリダ−ゼ（生化学工
業社製）５００ｍＵを添加し、次のとおり処理した。前
記の各溶液を０．１Ｍクエン酸−リン酸バッファー（ｐ
Ｈ７．０）により、ｐＨを６．５に調整し、β−ガラク
トシダーゼ（生化学工業社製）を添加し、３７℃で４〜
１７時間反応させ、途中で反応を適宜停止させ、段階的
に残存ガラクトース量を調節した。次いで、反応を停止
させ、プロテインＧセファロースカラム（ファルマシア
社製）を用いて、各溶液に混在する酵素等の蛋白質を除
去し、前記３種の試料から表１に示すガラクトース残存
量の異なる試料を調製した。

【００３０】２）試験方法 前記の方法により調製した段階的に残存ガラクトース量
を調節したアガラクトシルＩｇＧを次のとおり測定して
試験した。ＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で溶解した組み
換えプロテインＧ（和光純薬工業社製）を、固相支持体
であるプラスチック性９６穴プレート（ヌンク社製）に
１００μｌ／ウェル注入し、３７℃で２時間放置し、プ
レートを界面活性剤を含有するＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ
に１％（重量。以下、特に断わりのない限り同じ。）の
濃度で溶解した牛血清アルブミン（bovine serum album
in：以下、ＢＳＡと略記する。シグマ社製）を１００μ
ｌ／ウェルの割合で注入し、３７℃で２時間放置した。
次いで、プレートを界面活性剤を含むＰＢＳで洗浄し、
ＰＢＳにより前記残存ガラクトース量の異なるアガラク
トシルＩｇＧを同一蛋白量濃度に希釈した検体を１００
μｌ／ウェルの割合で注入し、３７℃で２時間放置し
た。のち、界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗
浄し、ＰＢＳで、１，０００倍に希釈したビオチン化Ｄ
ＳＡ（豊年社製）を１００μｌ／ウェルの割合で注入
し、３７℃で１時間放置し、界面活性剤を含有するＰＢ
Ｓでプレートを洗浄し、ＰＢＳにより１，０００倍に希
釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ベクター社製）
を１００μｌ／ウェルの割合で注入し、室温で３０分間
放置し、界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗浄
した。これとは別に、ＡＢＴＳ基質キット（ケーピーエ
ル社製）を調製し、１００μｌ／ウェルの割合で注入
し、室温で３０分間放置し、２％シュウ酸により反応を
停止させ、エンザイム・イムノアッセイ用プレートリー
ダー（バイオラッド社製。Model3550 ：以下ＥＩＡプレ
ートリーダーと記載する。）により４１５ｎｍの吸収を
測定して試験した。

【００３１】３）試験結果 この試験の結果は、表１に示すとおりである。表１から
明らかなとおり、ガラクト−スを切断していないＩｇＧ
を測定したときの吸光値を１．００として、段階的にガ
ラクトースが残存しているＩｇＧを測定したときの吸光
値をこれに対する比として示したが、いずれの試料も
０．９５〜１．１４の範囲内であり、１．００前後の値
を示し、ＤＳＡが検出するＩｇＧの糖鎖部位は、ガラク
ト−スとは無関係であることが判明した。また、同時に
由来の異なる３種類のＩｇＧを用いて確認した結果から
明らかなとおり、前記の事実の普遍性及び再現性が確認
され、ＤＳＡがＩｇＧの測定に使用できることが判明し
た。

【００３２】

【表１】

【００３３】以下に本発明を実施例により具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。 実施例１ 次の方法により第一発明のＩｇＧ定量用試薬を調製し
た。 （１）判定用プレートの調製 １）ＰＢＳに１μｇ／ｍｌの濃度で溶解した組み換えプ
ロテインＧ（和光純薬工業社製）を、固相支持体である
プラスチック性９６穴プレート（ヌンク社製）に１００
μｌ／ウェルの割合で注入し、３７℃で２時間放置し
た。 ２）界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し
た。 ３）ＰＢＳに１％の濃度で溶解したＢＳＡ（シグマ社
製）を１００μｌ／ウェルの割合で注入し、３７℃で２
時間放置した。 （２）ビオチン化ＤＳＡ溶液の調製 市販のビオチン化ＤＳＡ（豊年社製）をＰＢＳにより
１，０００倍に希釈した。 （３）ＨＲＰストレプトアビジン溶液の調製 市販のＨＲＰストレプトアビジン（ベクター社製）をＰ
ＢＳにより１，０００倍に希釈した。 （４）ＨＲＰに対する基質溶液の調製 市販のＡＢＴＳ基質キット（ケーピーエル社製）を用い
て使用直前に調製した。 （５）反応停止液の調製 シュウ酸（ナカライテスク社製）を脱イオン水に溶解
し、２％溶液を調製した。以上の各工程により、ＩｇＧ
定量用試薬を調製した。

【００３４】実施例２ 第二発明の検出方法を次のとおり実施した。 （１）血清試料の準備 １）健常人１０名、ＳＬＥ患者２２名、ＰＳＳ患者４
名、ＳｊＳ患者８名、ＭＣＴＤ患者６名及びＲＡ患者９
名から採取した血液を、プラスチック製の遠沈管内で固
形成分を自然凝固させた。 ２）遠心分離装置（ＴＯＭＹ社製。ＲＢ−１８ＩＶ型）
により３，０００ｒｐｍで３０分遠心して固形分と上清
とに分離し、上清のみを採取して血清試料とした。 （２）ＩｇＧ測定操作 次の操作により各試料のＩｇＧを測定した。 １）前記実施例１と同一の方法により調製した判定用プ
レ−トにＰＢＳにより適宜希釈した前記血清試料を１０
０μｌ／ウェルの割合で注入し、３７℃で２時間放置し
た。 ２）界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し
た。 ３）前記実施例１と同一の方法により調製したビオチン
化ＤＳＡ溶液を１００μｌ／ウェルの割合で注入し、３
７℃で１時間放置した。 ４）界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し
た。 ５）前記実施例１と同一の方法により調製したＨＲＰス
トレプトアビジン溶液を１００μｌ／ウェルの割合で注
入し、室温で３０分間放置した。 ６）界面活性剤を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し
た。 ７）前記実施例１と同一の方法により調製したＨＲＰに
対する基質溶液を、１００μｌ／ウェルの割合で注入
し、室温で３０分間放置した。 ８）前記実施例１と同一の方法により調製した反応停止
液により反応を停止させ、ＥＩＡプレートリーダー（バ
イオラッド社製。Model3550 ）により４１５ｎｍの吸収
を測定した。得られた結果は図１に示すとおりである。
図１は健常人及び各種疾患患者から採取した試料の吸光
値を示し、縦軸及び横軸は、それぞれ吸光値及び試料の
種類を示す。図１から明らかなとおり、健常人と比較し
て膠原病疾患患者についてはその吸光値が低いことが判
明した。この結果から、本発明の試薬を使用して膠原病
疾患の診断が可能である。

【００３５】実施例３ 次の方法により第一発明のＩｇＧ簡易測定用試薬を調製
した。 （１）ＤＳＡ金コロイドの調製 １）２０ｍｌのメスシリンダー（岩城ガラス社製）に、
２０ｍｌの金コロイド粒子懸濁液を添加し、更に８８μ
ｇのＤＳＡ（豊年社製）を添加した。 ２）伸張性フィルム（富士フィルム社製）によりメスシ
リンダーを密封し、十分攪拌し、室温で１０分間静置し
た。 ３）１０％の濃度に調整したＢＳＡ（シグマ社製）２ｍ
ｌを前記溶液に添加し、伸張性フィルム（富士フィルム
社製）により密封し、十分攪拌し、室温で１０分間静置
した。 ４）この溶液をプラスチック製の遠沈管に入れ、超遠心
分離装置（日立製作所製。７０Ｐ−７２型）により１
２，０００ｒｐｍで１時間遠心し、沈殿を回収した。 （２）プロテインＧメンブレンの調製 １）ＰＢＳにより１ｍｇ／ｍｌの濃度に調整した組み換
えプロテインＧ（和光純薬工業社製)を１．５μｌずつ
メンブレン（ミリポア社製）にプロットした。 ２）前記メンブレンを温風乾燥機（アドバンテック社
製。ＦＣ−４１０型）により十分乾燥させ、ＰＢＳに１
％の濃度で溶解したＢＳＡ（シグマ社製）に浸漬した。 ３）前記メンブレンを再度温風乾燥機（アドバンテック
社製。ＦＣ−４１０型）により十分に乾燥させ、１．４
ｃｍ×１．４ｃｍの大きさに切断した。 （３）反応カセットの組立て １）プラスチック製の受け板に吸収剤となる脱脂綿を敷
き、その上に１．４ｃｍ×１．４ｃｍの大きさに切断し
たろ紙（アドバンテック社製）を載置した。 ２）前記ろ紙の上に、更に前記（２）で調製したプロテ
インＧメンブレンを載置し、メンブレン部分が外部に露
出されるように丸い穴をあけたプラスチック製の蓋で被
蓋した。 以上の各工程により、第一発明のＩｇＧ簡易測定用試薬
を調製した。

【００３６】実施例４ 第二発明の検出方法を次のとおり実施した。 （１）血清試料の準備 １）前記実施例２と同様に健常人１０名、ＳＬＥ患者２
２名、ＰＳＳ患者４名、ＳｊＳ患者８名、ＭＣＴＤ患者
６名及びＲＡ患者９名から採取した血液を、プラスチッ
ク製の遠沈管内で固形成分を自然凝固させた。 ２）遠心分離装置（ＴＯＭＹ社製。ＲＢ−１８ＩＶ型）
により３，０００ｒｐｍで３０分遠心して固形分と上清
とに分離し、上清のみを採取して血清試料とした。 （２）ＩｇＧの測定操作 １）前記実施例３と同一の方法により調製した反応カセ
ットのメンブレン部分に、ＰＢＳで希釈した前記血清試
料２００μｌを滴下した。 ２）検体が確実に吸収されたことを確認し、前記実施例
３と同一の方法により調製したＤＳＡ金コロイド溶液２
０μｌを滴下した。 ３）前記金コロイドの溶液が確実に吸収されたことを確
認し、界面活性剤を含有するＰＢＳ２００μｌを用い
て、メンブレン表面を洗浄した。 ４）メンブレン表面を肉眼で観察した。 この結果は表２に示すとおりである。表２から明らかな
とおり、例えば、健常人の血清を検体とした場合は、そ
のＩｇＧはＤＳＡと反応するため、９割の試料に金コロ
イド標識ＤＳＡによるスポットが観察されたが、ＳＬＥ
患者、ＰＳＳ患者及びＭＣＴＤ患者の血清を検体とした
場合は、ＩｇＧはＤＳＡと反応しないので、金コロイド
標識ＤＳＡによるスポットは観察されなかった。また、
ＳｊＳ患者及びＲＡ患者の血清においては、それぞれ１
例に金コロイド標識ＤＳＡによるスポットは観察された
が、大部分の試料では、スポットが観察されなかった。
従って、この結果から明らかなとおり、本発明の試薬を
膠原病疾患の診断に使用し得ることが判明した。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明
は、Datura stramonium 由来のレクチンを有効成分とし
て含有するＩｇＧ測定用試薬と試薬キット、及びこの試
薬を用いたＩｇＧの検出方法であり、本発明により奏せ
られる効果は次のとおりである。 １）本発明は、ＤＳＡを用いてＩｇＧを測定する新規な
試薬を提供する。 ２）本発明の試薬を用いて検体中のＩｇＧ測定すること
により、膠原病の診断、特にＳＬＥ、ＰＳＳ、ＳｊＳ、
ＭＣＴＤ及びＲＡの診断、を簡便、迅速に行うことが可
能である。 ３）本発明の簡易測定用試薬を用いることにより、特別
な検査機器を用いることなく、容易に膠原病の診断を行
うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 健常人及び各種疾患患者から採取した試料の
吸光値を示すグラフである。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Datura stramonium 由来のレクチンを有
   効成分として含有するヒト免疫グロブリンＧ測定用試
   薬。
2. 【請求項２】 Datura stramonium 由来のレクチンが、
   Datura stramonium agglutinin又はDatura stramonium
   lectinである請求項１に記載のヒト免疫グロブリンＧ測
   定用試薬。
3. 【請求項３】 該試薬が、疾病の診断に使用される請求
   項１又は請求項２記載のヒト免疫グロブリンＧ測定用試
   薬。
4. 【請求項４】 疾病が、膠原病である請求項３に記載の
   ヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬。
5. 【請求項５】 Datura stramonium 由来のレクチンが標
   識化されたものである請求項１乃至４のいずれか１項記
   載のヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬。
6. 【請求項６】 請求項５記載のヒト免疫グロブリンＧ測
   定用試薬と、不溶化担体と、該担体に固定化してヒト免
   疫グロブリンＧを捕捉する捕捉物質とを含むヒト免疫グ
   ロブリンＧ測定用試薬キット。
7. 【請求項７】 標識化レクチンを検出する検出物質を更
   に含む請求項６記載のヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬
   キット。
8. 【請求項８】 検体に含有されるヒト免疫グロブリンＧ
   と、Datura stramonium由来のレクチンを有効成分とし
   て含有するヒト免疫グロブリンＧ測定用試薬とを反応さ
   せ、前記ヒト免疫グロブリンＧに結合した前記レクチン
   を検出することを特徴とするヒト免疫グロブリンＧの検
   出方法。
9. 【請求項９】 検体に含有されるヒト免疫グロブリンＧ
   を、不溶化担体に固定化し、この固定化ヒト免疫グロブ
   リンＧを、Datura stramonium 由来の標識化レクチンを
   有効成分として含有するヒト免疫グロブリンＧ測定用試
   薬と反応させ、結合した前記レクチンの標識に起因した
   シグナルを検出することを特徴とする請求項８記載のヒ
   ト免疫グロブリンＧの検出方法。