JP2000287681A - α−Ｌ−ラムノシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents
α−Ｌ−ラムノシダーゼおよびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 高濃度のグルコースおよびエタノール存在下
においても活性低下の少ない、グルコース耐性およびエ
タノール耐性を備えたα−Ｌ−ラムノシダーゼおよびそ
の製造方法の提供。 【解決手段】 ピシア属に属する微生物が生産する、以
下の理化学的性質を有するα−Ｌ−ラムノシダーゼ：
（１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを基質として作用させた場合、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する。（２）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分
間保持した場合、ｐＨ５．０〜７．０で安定した酵素活
性を示す。（３）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−α−
Ｌ−ラムノピラノシドを基質としてｐＨ６．５で３０℃
で１０分間反応させたときの至適温度は約４０℃であ
る。（４）エタノール耐性：２０容量％エタノール中に
おいて６７％の相対活性を示す。
においても活性低下の少ない、グルコース耐性およびエ
タノール耐性を備えたα−Ｌ−ラムノシダーゼおよびそ
の製造方法の提供。 【解決手段】 ピシア属に属する微生物が生産する、以
下の理化学的性質を有するα−Ｌ−ラムノシダーゼ：
（１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを基質として作用させた場合、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する。（２）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分
間保持した場合、ｐＨ５．０〜７．０で安定した酵素活
性を示す。（３）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−α−
Ｌ−ラムノピラノシドを基質としてｐＨ６．５で３０℃
で１０分間反応させたときの至適温度は約４０℃であ
る。（４）エタノール耐性：２０容量％エタノール中に
おいて６７％の相対活性を示す。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規なα−Ｌ−ラム
ノシダーゼ、その製造方法およびその酵素を生産する微
生物に関する。
ノシダーゼ、その製造方法およびその酵素を生産する微
生物に関する。
【０００２】
【従来の技術】ブドウに含まれる、リナロール（ｌｉｎ
ａｌｏｏｌ）、ゲラニオール（ｇｅｒａｎｉｏｌ）、ネ
ロール（ｎｅｒｏｌ）、シトロネロール（ｃｉｔｒｏｎ
ｅｌｏｌ）、α−テルピネオール（ｔｅｒｐｉｎｅｏ
ｌ）等のモノテルペン類は、ブドウやワインの香りに大
きく寄与している。これらのモノテルペン類は、芳香性
の遊離体としても含まれているが、その多くは、芳香性
を有しない配糖体として存在している。
ａｌｏｏｌ）、ゲラニオール（ｇｅｒａｎｉｏｌ）、ネ
ロール（ｎｅｒｏｌ）、シトロネロール（ｃｉｔｒｏｎ
ｅｌｏｌ）、α−テルピネオール（ｔｅｒｐｉｎｅｏ
ｌ）等のモノテルペン類は、ブドウやワインの香りに大
きく寄与している。これらのモノテルペン類は、芳香性
の遊離体としても含まれているが、その多くは、芳香性
を有しない配糖体として存在している。
【０００３】これらの配糖体の多くは、６−Ｏ−α−Ｌ
−アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（６
−Ｏ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、６−Ｏ−
α−Ｌ−ラムノピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド
（６−Ｏ−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、６−Ｏ
−β−Ｄ−アピオフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（６−Ｏ−β−Ｄ−ａｐｉｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）といったジ
グリコシド類であることが知られている。
−アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（６
−Ｏ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、６−Ｏ−
α−Ｌ−ラムノピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド
（６−Ｏ−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−
β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）、６−Ｏ
−β−Ｄ−アピオフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（６−Ｏ−β−Ｄ−ａｐｉｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−β
−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅｓ）といったジ
グリコシド類であることが知られている。
【０００４】これらのジグリコシド類を酵素的に加水分
解反応すると、芳香性のモノテルペン類が遊離してく
る。この加水分解反応は二段階で行われる。すなわち、
まず、Ｌ−ラムノシダーゼ（α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｉ
ｄａｓｅ）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（α−Ｌ
−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）、β−ア
ピオシダーゼ（β−ａｐｉｏｓｉｄａｓｅ）などにより
グリコシド結合が切断され、それぞれ対応するモノテル
ペニル−β−Ｄ−グルコシド（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｙ
ｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ）を生じる。次い
で、このモノテルペニル−β−Ｄ−グルコシドにβ−Ｄ
−グルコシダーゼ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）
が作用する。第一段階の反応を触媒する加水分解酵素の
うち、α−Ｌ−ラムノシダーゼは、α−Ｌ−ラムノース
（Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ）を含むポリサッカライドの非
還元末端のα−Ｌ−ラムノピラノシド残基を加水分解す
る酵素である。従って、α−Ｌ−ラムノシダーゼを、β
−Ｄ−グルコシダーゼなどと共に使用することにより、
ワイン醸造において芳香成分を増加させて、ワインの品
質を向上させることができる。
解反応すると、芳香性のモノテルペン類が遊離してく
る。この加水分解反応は二段階で行われる。すなわち、
まず、Ｌ−ラムノシダーゼ（α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｉ
ｄａｓｅ）、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ（α−Ｌ
−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）、β−ア
ピオシダーゼ（β−ａｐｉｏｓｉｄａｓｅ）などにより
グリコシド結合が切断され、それぞれ対応するモノテル
ペニル−β−Ｄ−グルコシド（ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｙ
ｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ）を生じる。次い
で、このモノテルペニル−β−Ｄ−グルコシドにβ−Ｄ
−グルコシダーゼ（β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）
が作用する。第一段階の反応を触媒する加水分解酵素の
うち、α−Ｌ−ラムノシダーゼは、α−Ｌ−ラムノース
（Ｌ−ｒｈａｍｎｏｓｅ）を含むポリサッカライドの非
還元末端のα−Ｌ−ラムノピラノシド残基を加水分解す
る酵素である。従って、α−Ｌ−ラムノシダーゼを、β
−Ｄ−グルコシダーゼなどと共に使用することにより、
ワイン醸造において芳香成分を増加させて、ワインの品
質を向上させることができる。
【０００５】しかしながら、ワイン醸造にこれらの酵素
を利用するにあたっては、多くの克服すべき問題があ
る。一つには、グルコースあるいはエタノールの存在下
でも酵素活性を有することが必要であることである。ま
た、一つには、バクテリア由来の酵素の場合、好まれざ
るバクテリア臭があること、カビ由来の菌体外分泌型の
粗酵素では、他の触媒活性のために、好まれざる副反応
が起こるという問題がある。これらバクテリアやカビ由
来のα−Ｌ−ラムノシダーゼについては報告があるが、
一方、酵母由来のものについての報告はない。厳密に言
えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のものが報告
されているが、その主たる触媒活性はβ−Ｄ−グルコシ
ダーゼであって、わずかにα−Ｌ−ラムノシダーゼ活性
も有するというものにすぎない。
を利用するにあたっては、多くの克服すべき問題があ
る。一つには、グルコースあるいはエタノールの存在下
でも酵素活性を有することが必要であることである。ま
た、一つには、バクテリア由来の酵素の場合、好まれざ
るバクテリア臭があること、カビ由来の菌体外分泌型の
粗酵素では、他の触媒活性のために、好まれざる副反応
が起こるという問題がある。これらバクテリアやカビ由
来のα−Ｌ−ラムノシダーゼについては報告があるが、
一方、酵母由来のものについての報告はない。厳密に言
えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のものが報告
されているが、その主たる触媒活性はβ−Ｄ−グルコシ
ダーゼであって、わずかにα−Ｌ−ラムノシダーゼ活性
も有するというものにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ワイン醸造に利用できる特性を備えた新規なα−Ｌ
−ラムノシダーゼ、その製造方法およびその酵素を生産
する微生物を提供することにある。
は、ワイン醸造に利用できる特性を備えた新規なα−Ｌ
−ラムノシダーゼ、その製造方法およびその酵素を生産
する微生物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ワイン醸
造に利用できる特性を備えたα−Ｌ−ラムノシダーゼを
産生し得る微生物を求め、特に今まで報告例の少ない酵
母を中心に探索を行なった結果、ピシア（Ｐｉｃｈｉ
ａ）属に属する一菌株が新規なα−Ｌ−ラムノシダーゼ
を生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、各種の分離源から単離した多くの微生物を
Ｌ−ラムノースを唯一の炭素源とする培地で培養後、菌
体を破砕し遠心上清画分について、後述する測定法でα
−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を測定し、目的とする微生物
を選択したものである。
造に利用できる特性を備えたα−Ｌ−ラムノシダーゼを
産生し得る微生物を求め、特に今まで報告例の少ない酵
母を中心に探索を行なった結果、ピシア（Ｐｉｃｈｉ
ａ）属に属する一菌株が新規なα−Ｌ−ラムノシダーゼ
を生産することを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、各種の分離源から単離した多くの微生物を
Ｌ−ラムノースを唯一の炭素源とする培地で培養後、菌
体を破砕し遠心上清画分について、後述する測定法でα
−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を測定し、目的とする微生物
を選択したものである。
【０００８】すなわち、本発明によれば、下記の性質を
有することを特徴とするα−Ｌ−ラムノシダーゼが提供
される。 （１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを基質として作用させた場合、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質として３０℃で１０分間反応させたと
きの至適ｐＨは５．０〜７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分間保持した場合、
ｐＨ５．０〜７．０で安定した酵素活性を示す。 （４）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質としてｐＨ６．５で３０℃で１０分間
反応させたときの至適温度は約４０℃である。 （５）熱安定性：ｐＨ６．５にて３０分間保持したと
き、２０℃まで安定した酵素活性を示し、それを超える
と次第に失活する。
有することを特徴とするα−Ｌ−ラムノシダーゼが提供
される。 （１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを基質として作用させた場合、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質として３０℃で１０分間反応させたと
きの至適ｐＨは５．０〜７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分間保持した場合、
ｐＨ５．０〜７．０で安定した酵素活性を示す。 （４）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質としてｐＨ６．５で３０℃で１０分間
反応させたときの至適温度は約４０℃である。 （５）熱安定性：ｐＨ６．５にて３０分間保持したと
き、２０℃まで安定した酵素活性を示し、それを超える
と次第に失活する。
【０００９】（６）阻害剤：ｐ−クロロ安息香酸水銀、
塩化第二水銀、塩化第二銅により阻害を受け、エチレン
ジアミン四酢酸、メルカプトエタノールでは殆ど阻害さ
れない。 （７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した分子量は約８８，０００ダルトンで
ある。 （８）等電点：等電点電気泳動法による等電点はｐＩ
４．９である。 （９）グルコース耐性：５００ｍＭグルコース中におい
て７６％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：２０容量％エタノール中にお
いて６７％の相対活性を示す。
塩化第二水銀、塩化第二銅により阻害を受け、エチレン
ジアミン四酢酸、メルカプトエタノールでは殆ど阻害さ
れない。 （７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した分子量は約８８，０００ダルトンで
ある。 （８）等電点：等電点電気泳動法による等電点はｐＩ
４．９である。 （９）グルコース耐性：５００ｍＭグルコース中におい
て７６％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：２０容量％エタノール中にお
いて６７％の相対活性を示す。
【００１０】また本発明のα−Ｌ−ラムノシダーゼの製
造方法は、ピシア（Ｐｈｉｃｉａ）属に属し、α−Ｌ−
ラムノシダーゼを生産する微生物を培養し、得られた培
養液からα−Ｌ−ラムノシダーゼを取得する方法であ
る。
造方法は、ピシア（Ｐｈｉｃｉａ）属に属し、α−Ｌ−
ラムノシダーゼを生産する微生物を培養し、得られた培
養液からα−Ｌ−ラムノシダーゼを取得する方法であ
る。
【００１１】本発明のα−Ｌ−ラムノシダーゼを生産す
る分離菌株の性質について以下に示す。 Ａ．形態的性質 １）乳白色のコロニーを形成する。 ２）出芽により無性増殖を行う。 ３）グルコース麦芽培地で１ないし４個の山高帽形の子
嚢胞子を形成する。
る分離菌株の性質について以下に示す。 Ａ．形態的性質 １）乳白色のコロニーを形成する。 ２）出芽により無性増殖を行う。 ３）グルコース麦芽培地で１ないし４個の山高帽形の子
嚢胞子を形成する。
【００１２】 Ｂ．生理的性質 １）発酵性 グルコース ＋ ガラクトース − マルトース − スクロース − トレハロース ＋ メリビオース − ラクトース − ２）資化性 グルコース ＋ ラクトース − ガラクトース − ラフィノース − ソルボース − リビトール ＋ リボース ＋ マンニトール ＋ キシロース ＋ イノシトール − ラムノース ＋ メタノール ＋ スクロース ＋ エタノール ＋ マルトース ＋ 硝酸塩 ＋ メリビオース − （＋：資化する， −：資化しない）
【００１３】以上の菌学的性質をもとに BARNETT & PAY
NE YARROW YEASTS:Characteristicsand identification
(Second edition)で検索し、この菌株をピシア・アン
グスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）に同定した。
また、上述の新規なα−Ｌ−ラムノシダーゼを生産する
点から、新規菌株であると判断した。従って本菌株をピ
シア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ
３４９と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した。寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７２１１であ
る。なお、本発明に用いる微生物は、前記ピシア・アン
グスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ３４９の
他、Ｐｉｃｈｉａ属に属する微生物で本発明のα−Ｌ−
ラムノシダーゼを生産する菌株であれば差し支えない。
NE YARROW YEASTS:Characteristicsand identification
(Second edition)で検索し、この菌株をピシア・アン
グスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）に同定した。
また、上述の新規なα−Ｌ−ラムノシダーゼを生産する
点から、新規菌株であると判断した。従って本菌株をピ
シア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ
３４９と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した。寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１７２１１であ
る。なお、本発明に用いる微生物は、前記ピシア・アン
グスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ３４９の
他、Ｐｉｃｈｉａ属に属する微生物で本発明のα−Ｌ−
ラムノシダーゼを生産する菌株であれば差し支えない。
【００１４】本発明において、α−Ｌ−ラムノシダーゼ
を生産する培地としては通常の微生物の培養に用いられ
るものでよく、使用される微生物が生育するものであれ
ば特に制限されない。炭素源としては、例えばスクロー
スなどを用いることができるが、多量のα−Ｌ−ラムノ
シダーゼを生産する点からＬ−ラムノースが特に望まし
い。窒素源としては、例えば、ペプトンがあげられる。
培地には炭素源、窒素源の他、無機塩例えば塩化ナトリ
ウムを添加することができる。培養温度は使用する微生
物が生育する温度であればよいが、生育の良好な２８℃
付近が好ましい。また使用する培地の初発ｐＨは４．０
付近が好ましい。培養時間は当該菌の生育とα−Ｌ−ラ
ムノシダーゼ生産に十分な時間続行されるが、通常４８
時間培養することによって培養液中にα−Ｌ−ラムノシ
ダーゼが蓄積される。
を生産する培地としては通常の微生物の培養に用いられ
るものでよく、使用される微生物が生育するものであれ
ば特に制限されない。炭素源としては、例えばスクロー
スなどを用いることができるが、多量のα−Ｌ−ラムノ
シダーゼを生産する点からＬ−ラムノースが特に望まし
い。窒素源としては、例えば、ペプトンがあげられる。
培地には炭素源、窒素源の他、無機塩例えば塩化ナトリ
ウムを添加することができる。培養温度は使用する微生
物が生育する温度であればよいが、生育の良好な２８℃
付近が好ましい。また使用する培地の初発ｐＨは４．０
付近が好ましい。培養時間は当該菌の生育とα−Ｌ−ラ
ムノシダーゼ生産に十分な時間続行されるが、通常４８
時間培養することによって培養液中にα−Ｌ−ラムノシ
ダーゼが蓄積される。
【００１５】培養後、ろ過または遠心分離またはろ過法
によって菌体を集め、溶菌酵素処理あるいは超音波処
理、フレンチプレス、ホモジナイザーなどの機械的破砕
処理により菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を
粗酵素液として用いる。粗酵素液はそのまま使用するこ
ともできるが、硫安塩析や溶媒沈殿法などの一般の酵素
の分離精製法に準じて分離精製することができる。ま
た、さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ク
ロマトグラフィーなどの通常の酵素の精製手段を適宜組
み合わせて活性純度の高い酵素標品を調製することもで
きる。粗酵素液から各種クロマトグラフィー法を組み合
わせて精製することにより得られた本発明酵素の性質は
以下の通りである。なお、以下において、酵素活性の測
定は次の方法により行った。
によって菌体を集め、溶菌酵素処理あるいは超音波処
理、フレンチプレス、ホモジナイザーなどの機械的破砕
処理により菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を
粗酵素液として用いる。粗酵素液はそのまま使用するこ
ともできるが、硫安塩析や溶媒沈殿法などの一般の酵素
の分離精製法に準じて分離精製することができる。ま
た、さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過ク
ロマトグラフィーなどの通常の酵素の精製手段を適宜組
み合わせて活性純度の高い酵素標品を調製することもで
きる。粗酵素液から各種クロマトグラフィー法を組み合
わせて精製することにより得られた本発明酵素の性質は
以下の通りである。なお、以下において、酵素活性の測
定は次の方法により行った。
【００１６】［酵素活性測定法］５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素サンプル溶液
０．２ｍｌに、同緩衝液に溶解した２ｍＭ ｐ−ニトロ
フェニル−α−Ｌ−ラムノピラノシド溶液０．２ｍｌを
混合し、３０℃で１０分間反応させる。その後、１Ｍ炭
酸ナトリウム１．６ｍｌを加えて反応を停止させ、４０
５ｎｍにおける吸光度を測定することにより遊離したｐ
−ニトロフェノールを定量する。また酵素活性を示す１
酵素単位（Ｕ）は、上記条件、すなわち３０℃、ｐＨ
６．５において、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドから１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノ
ールを生成させる酵素量として定義した。
ウム緩衝液（ｐＨ６．５）で希釈した酵素サンプル溶液
０．２ｍｌに、同緩衝液に溶解した２ｍＭ ｐ−ニトロ
フェニル−α−Ｌ−ラムノピラノシド溶液０．２ｍｌを
混合し、３０℃で１０分間反応させる。その後、１Ｍ炭
酸ナトリウム１．６ｍｌを加えて反応を停止させ、４０
５ｎｍにおける吸光度を測定することにより遊離したｐ
−ニトロフェノールを定量する。また酵素活性を示す１
酵素単位（Ｕ）は、上記条件、すなわち３０℃、ｐＨ
６．５において、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドから１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノ
ールを生成させる酵素量として定義した。
【００１７】（１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ
−ラムノピラノシドを基質として作用させた場合、ｐ−
ニトロフェノールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質とし、緩衝液として５０ｍＭクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜７．０）、５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、５０ｍＭグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用いる以外
は前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定した。そ
の結果は図１に示すとおりであり、反応至適ｐＨは６．
０〜７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ３．０〜７．０）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０〜９．０）、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ１０．０）の各緩衝液中で３０℃にて３
０分間保持した後、前記酵素活性測定法に従い、残存活
性を測定した。その結果は図１に示すとおりであり、安
定ｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．０である。 （４）至適温度：前記酵素活性測定法に従い、各種温度
において相対活性を測定した。その結果は図２に示すと
おりであり、至適温度は約４０℃である。 （５）熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
中で３０分間保持した後、前記酵素活性測定法に従い、
残存活性を測定した。その結果、本酵素は図２に示すよ
うに、２０℃まで安定した酵素活性を示し、それを超え
ると次第に失活する。
−ラムノピラノシドを基質として作用させた場合、ｐ−
ニトロフェノールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質とし、緩衝液として５０ｍＭクエン酸
−リン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜７．０）、５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．０）、５０ｍＭグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用いる以外
は前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定した。そ
の結果は図１に示すとおりであり、反応至適ｐＨは６．
０〜７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ３．０〜７．０）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
８．０〜９．０）、５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ１０．０）の各緩衝液中で３０℃にて３
０分間保持した後、前記酵素活性測定法に従い、残存活
性を測定した。その結果は図１に示すとおりであり、安
定ｐＨ範囲は、ｐＨ５．０〜７．０である。 （４）至適温度：前記酵素活性測定法に従い、各種温度
において相対活性を測定した。その結果は図２に示すと
おりであり、至適温度は約４０℃である。 （５）熱安定性：５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）
中で３０分間保持した後、前記酵素活性測定法に従い、
残存活性を測定した。その結果、本酵素は図２に示すよ
うに、２０℃まで安定した酵素活性を示し、それを超え
ると次第に失活する。
【００１８】（６）各種試薬の影響：各種試薬の本酵素
に対する影響を調べた。すなわち、表１に示す各種試薬
を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に１ｍＭとなる
ように溶解し、これに酵素溶液を混合し、３０℃におい
て１０分間保持した後の残存酵素活性を前記酵素活性測
定法に従って測定し表１の結果を得た。
に対する影響を調べた。すなわち、表１に示す各種試薬
を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に１ｍＭとなる
ように溶解し、これに酵素溶液を混合し、３０℃におい
て１０分間保持した後の残存酵素活性を前記酵素活性測
定法に従って測定し表１の結果を得た。
【表１】
【００１９】（７）分子量：精製した本酵素についてＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰｈａｓｔＳ
ｙｓｔｅｍ、ＰｈａｓｔＧｅｌ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕ
ｓ１２．５、ＰｈａｓｔＧｅｌ ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒ
ｓｔｒｉｐｓ（ファルマシア社製））を行い、測定し
た分子量は約８８，０００ダルトンである。分子量の標
準には、ｂ型ホスホリラーゼ（分子量９４，０００ダル
トン）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００ダル
トン）、卵白アルブミン（分子量４３，０００ダルト
ン）、カルボニックアンヒドロラーゼ（分子量３０，０
００ダルトン）、ダイズトリプシンインヒビター（分子
量２０，１００ダルトン）およびラクトアルブミン（分
子量１４，４００ダルトン）を用いた。 （８）等電点：精製した本酵素について等電点電気泳動
（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ
３−９（ファルマシア社製））を行い、測定した等電
点は、ｐＩ４．９である。等電点の標準には、馬ミオグ
ロビン（ａｃｉｄｉｃ：ｐＩ６．８５）、ヒトカルボニ
ックアンヒドロラーゼＢ（ｐＩ６．５５）、牛カルボニ
ックアンヒドロラーゼＢ（ｐＩ５．８５）、β−ラクト
グロブリンＡ（ｐＩ５．２０）、大豆トリプシンインヒ
ビター（ｐＩ４．５５）、アミログルコシダーゼ（ｐＩ
３．５０）を用いた。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰｈａｓｔＳ
ｙｓｔｅｍ、ＰｈａｓｔＧｅｌ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕ
ｓ１２．５、ＰｈａｓｔＧｅｌ ＳＤＳ ｂｕｆｆｅｒ
ｓｔｒｉｐｓ（ファルマシア社製））を行い、測定し
た分子量は約８８，０００ダルトンである。分子量の標
準には、ｂ型ホスホリラーゼ（分子量９４，０００ダル
トン）、ウシ血清アルブミン（分子量６７，０００ダル
トン）、卵白アルブミン（分子量４３，０００ダルト
ン）、カルボニックアンヒドロラーゼ（分子量３０，０
００ダルトン）、ダイズトリプシンインヒビター（分子
量２０，１００ダルトン）およびラクトアルブミン（分
子量１４，４００ダルトン）を用いた。 （８）等電点：精製した本酵素について等電点電気泳動
（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ、ＰｈａｓｔＧｅｌ ＩＥＦ
３−９（ファルマシア社製））を行い、測定した等電
点は、ｐＩ４．９である。等電点の標準には、馬ミオグ
ロビン（ａｃｉｄｉｃ：ｐＩ６．８５）、ヒトカルボニ
ックアンヒドロラーゼＢ（ｐＩ６．５５）、牛カルボニ
ックアンヒドロラーゼＢ（ｐＩ５．８５）、β−ラクト
グロブリンＡ（ｐＩ５．２０）、大豆トリプシンインヒ
ビター（ｐＩ４．５５）、アミログルコシダーゼ（ｐＩ
３．５０）を用いた。
【００２０】（９）グルコース耐性：０〜５００ｍＭ濃
度のグルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）中で、前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定
した。その結果は図３に示すとおりであり、５００ｍＭ
グルコースにおいても７６％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：０〜２０容量％濃度のエタノ
ールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で、
前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定した。その
結果は図４に示すとおりであり、１０容量％エタノール
中において８５％の相対活性を示し、２０容量％エタノ
ール中においても６７％の相対活性を示す。
度のグルコースを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）中で、前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定
した。その結果は図３に示すとおりであり、５００ｍＭ
グルコースにおいても７６％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：０〜２０容量％濃度のエタノ
ールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）中で、
前記酵素活性測定法に従い、相対活性を測定した。その
結果は図４に示すとおりであり、１０容量％エタノール
中において８５％の相対活性を示し、２０容量％エタノ
ール中においても６７％の相対活性を示す。
【００２１】
【実施例】次に本発明の実施例を挙げて本発明を詳しく
説明するが、以下に示す実施例は一例であって本発明の
技術的範囲を限定するものではない。 実施例１：菌株の培養およびα−Ｌ−ラムノシダーゼの
生産 Ｌ−ラムノース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキ
ス０．３％、麦芽エキス０．３％からなる培地を塩酸で
ｐＨ４．０に調整し、これを５００ｍｌ容の三角フラス
コ４０本に１００ｍｌずつ仕込み、１２０℃、１５分間
加圧滅菌した。これにピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉ
ａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ３４９株を接種し、２８℃、２
２０ｒｐｍにて２日間回転攪拌機上で培養した。得られ
た培養液４Ｌを遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）し
て菌体を集め、２０ｍＭ ビス／トリス緩衝液（ｐＨ
６．５）で２回洗浄した。これを同緩衝液に懸濁し、菌
体重量の２．５倍量のガラスビーズ（直径０．４５〜
０．５５ｍｍ）を加え、菌体を破砕した。遠心分離（１
０００×ｇ、１０分間）により菌体破砕物を除き、細胞
抽出液を得た。これを超遠心処理（１００，０００×
ｇ、９０分間）してミクロゾーム画分と上清画分に分離
した。これらの画分α−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を測定
すると、すべての活性が上清画分に存在していたので上
清画分を以下に述べる精製操作に供した。
説明するが、以下に示す実施例は一例であって本発明の
技術的範囲を限定するものではない。 実施例１：菌株の培養およびα−Ｌ−ラムノシダーゼの
生産 Ｌ−ラムノース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキ
ス０．３％、麦芽エキス０．３％からなる培地を塩酸で
ｐＨ４．０に調整し、これを５００ｍｌ容の三角フラス
コ４０本に１００ｍｌずつ仕込み、１２０℃、１５分間
加圧滅菌した。これにピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉ
ａ ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ３４９株を接種し、２８℃、２
２０ｒｐｍにて２日間回転攪拌機上で培養した。得られ
た培養液４Ｌを遠心分離（１０００×ｇ、１０分間）し
て菌体を集め、２０ｍＭ ビス／トリス緩衝液（ｐＨ
６．５）で２回洗浄した。これを同緩衝液に懸濁し、菌
体重量の２．５倍量のガラスビーズ（直径０．４５〜
０．５５ｍｍ）を加え、菌体を破砕した。遠心分離（１
０００×ｇ、１０分間）により菌体破砕物を除き、細胞
抽出液を得た。これを超遠心処理（１００，０００×
ｇ、９０分間）してミクロゾーム画分と上清画分に分離
した。これらの画分α−Ｌ−ラムノシダーゼ活性を測定
すると、すべての活性が上清画分に存在していたので上
清画分を以下に述べる精製操作に供した。
【００２２】実施例２：酵素の精製 以下に示す精製操作は、特に断らない限り、全て４℃に
て行った。 （１）硫酸アンモニウム沈殿 実施例１で得た上清画分６００ｍｌを硫酸アンモニウム
沈殿により精製した。３０％飽和から８０％飽和の画分
にて生じた沈殿を遠心分離（１，０００×ｇ、３０分
間）して集め、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、１
ｍＭ ＣａＣｌ2および０．００３ｍＭ ＮａＮ3を含む１
００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した。 （２）コンカナバリンＡ−セファロースカラムクロマト
グラフィー 透析した酵素溶液を予め同緩衝液で平衡化したコンカナ
バリンＡ−セファロースカラム（φ２．６×６．５ｃ
ｍ）に付した。目的の酵素は、本カラムに吸着しないの
で、同緩衝液で溶出した。活性画分を集め、限外ろ過装
置（ＰＭ−１０：Ａｍｉｃｏｎ社製）にて濃縮し、２０
ｍＭ ビス／トリス緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析
した。 （３）ＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ アガロースカラム
クロマトグラフィー 透析した酵素溶液を予め２０ｍＭ ビス／トリス緩衝液
（ｐＨ６．５）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ アガロースカラム（φ２．６×６．０ｃｍ）に付し
た。同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液を用いた塩化ナト
リウムリニアグラジエント（０〜０．３Ｍ）で溶出し
た。活性画分を集め、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）に対して透析した。
て行った。 （１）硫酸アンモニウム沈殿 実施例１で得た上清画分６００ｍｌを硫酸アンモニウム
沈殿により精製した。３０％飽和から８０％飽和の画分
にて生じた沈殿を遠心分離（１，０００×ｇ、３０分
間）して集め、１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｎＣｌ2、１
ｍＭ ＣａＣｌ2および０．００３ｍＭ ＮａＮ3を含む１
００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解
し、同緩衝液に対して透析した。 （２）コンカナバリンＡ−セファロースカラムクロマト
グラフィー 透析した酵素溶液を予め同緩衝液で平衡化したコンカナ
バリンＡ−セファロースカラム（φ２．６×６．５ｃ
ｍ）に付した。目的の酵素は、本カラムに吸着しないの
で、同緩衝液で溶出した。活性画分を集め、限外ろ過装
置（ＰＭ−１０：Ａｍｉｃｏｎ社製）にて濃縮し、２０
ｍＭ ビス／トリス緩衝液（ｐＨ６．５）に対して透析
した。 （３）ＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ アガロースカラム
クロマトグラフィー 透析した酵素溶液を予め２０ｍＭ ビス／トリス緩衝液
（ｐＨ６．５）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａ アガロースカラム（φ２．６×６．０ｃｍ）に付し
た。同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液を用いた塩化ナト
リウムリニアグラジエント（０〜０．３Ｍ）で溶出し
た。活性画分を集め、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ５．０）に対して透析した。
【００２３】（４）アラビノース−セファロース６Ｂア
フィニティーカラムクロマトグラフィー ラムノース−セファロース６Ｂアフィニティー担体は、
エポキシ活性化セファロース６Ｂ（ファルマシア・バイ
オテックＡＢ社製）を製造会社の推奨する方法に従い、
ラムノースを結合させ、調製した。前述したＤＥＡＥ
Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ アガロースカラムクロマトグラフィ
ーにより得られた酵素液を、予め５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したラムノース−セフ
ァロース６Ｂアフィニティーカラム（φ１．５×７．２
ｃｍ）に付し、同緩衝液で洗浄した。次に１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む同緩衝液で溶出し、活性画分を集め、蒸留水に
対して透析した。 （５）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー 透析した酵素溶液を、予め１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（φ１．
５×２．８ｃｍ）に付し、同緩衝液で十分洗浄し後、リ
ン酸ナトリウムリニアグラジエント（１０〜２００ｍ
Ｍ）で溶出し、活性画分を集めた。
フィニティーカラムクロマトグラフィー ラムノース−セファロース６Ｂアフィニティー担体は、
エポキシ活性化セファロース６Ｂ（ファルマシア・バイ
オテックＡＢ社製）を製造会社の推奨する方法に従い、
ラムノースを結合させ、調製した。前述したＤＥＡＥ
Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ アガロースカラムクロマトグラフィ
ーにより得られた酵素液を、予め５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５．０）で平衡化したラムノース−セフ
ァロース６Ｂアフィニティーカラム（φ１．５×７．２
ｃｍ）に付し、同緩衝液で洗浄した。次に１Ｍ ＮａＣ
ｌを含む同緩衝液で溶出し、活性画分を集め、蒸留水に
対して透析した。 （５）ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー 透析した酵素溶液を、予め１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（φ１．
５×２．８ｃｍ）に付し、同緩衝液で十分洗浄し後、リ
ン酸ナトリウムリニアグラジエント（１０〜２００ｍ
Ｍ）で溶出し、活性画分を集めた。
【００２４】以上の精製工程毎における酵素の活性を表
２に示す。なお、タンパク質は、牛血清アルブミンを標
準物質として用い、ブラドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄｍｅｔｈｏｄ）により定量した。
２に示す。なお、タンパク質は、牛血清アルブミンを標
準物質として用い、ブラドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄｍｅｔｈｏｄ）により定量した。
【表２】 rha-セファロース6B：ラムノース−セファロース6B
【００２５】実施例３：基質特異性 実施例２で得られた精製酵素を用い、表３に示す各種発
色基質の分解試験を行なった。なお、分解試験は前記酵
素活性測定の方法に準じて行ない、ｐ−ニトロフェノー
ルの生成により活性の有無を調べた。結果を表３に示
す。
色基質の分解試験を行なった。なお、分解試験は前記酵
素活性測定の方法に準じて行ない、ｐ−ニトロフェノー
ルの生成により活性の有無を調べた。結果を表３に示
す。
【表３】
【００２６】本酵素はｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラ
ムノピラノシドに作用し、ｐ−ニトロフェノールを遊離
するが、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノ
シド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドお
よびｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドにはほ
とんど作用せず、基質特異性の高い酵素であることがわ
かる。
ムノピラノシドに作用し、ｐ−ニトロフェノールを遊離
するが、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノ
シド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドお
よびｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロビオシドにはほ
とんど作用せず、基質特異性の高い酵素であることがわ
かる。
【００２７】実施例４：ブドウ果汁由来のグリコシド類
に対する作用 水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整したブドウ果汁
（マスカット オブ アレキサンドリア種）１０００ｍ
ｌを合成吸着樹脂カラム（φ２２ｍｍ×３５０ｍｍ、Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２：ローム・アンド・ハー
ス社製）に通した。これを蒸留水５００ｍｌで洗浄し、
水溶性化合物を除去した。さらにペンタン−エーテル
（１：１）１０００ｍｌを通し、フリーのテルペン類を
除去した後、メタノール１０００ｍｌにてグリコシド類
を溶出させた。この画分を３０℃、減圧下にて濃縮乾固
し、グリコシド類１００ｍｇを得た。実施例２で得られ
た精製酵素溶液２ｍｌ（０．５Ｕ、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．５））に上記グリコシド類１０
ｍｇを溶解し、３０℃にて２日間反応させた。遊離した
テルペン類を５ｍｌのペンタン−エーテル（１：１）で
２回抽出し、それを濃縮した後、キャピラリーガスクロ
マトグラフィーを用い下記の条件にて分析した。結果を
表４に示す。このように本発明の酵素は、ブドウ果汁の
グリコシド類を分解し、芳香成分を顕著に増加させる優
れた性質を有する。
に対する作用 水酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整したブドウ果汁
（マスカット オブ アレキサンドリア種）１０００ｍ
ｌを合成吸着樹脂カラム（φ２２ｍｍ×３５０ｍｍ、Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２：ローム・アンド・ハー
ス社製）に通した。これを蒸留水５００ｍｌで洗浄し、
水溶性化合物を除去した。さらにペンタン−エーテル
（１：１）１０００ｍｌを通し、フリーのテルペン類を
除去した後、メタノール１０００ｍｌにてグリコシド類
を溶出させた。この画分を３０℃、減圧下にて濃縮乾固
し、グリコシド類１００ｍｇを得た。実施例２で得られ
た精製酵素溶液２ｍｌ（０．５Ｕ、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ６．５））に上記グリコシド類１０
ｍｇを溶解し、３０℃にて２日間反応させた。遊離した
テルペン類を５ｍｌのペンタン−エーテル（１：１）で
２回抽出し、それを濃縮した後、キャピラリーガスクロ
マトグラフィーを用い下記の条件にて分析した。結果を
表４に示す。このように本発明の酵素は、ブドウ果汁の
グリコシド類を分解し、芳香成分を顕著に増加させる優
れた性質を有する。
【表４】
【００２８】（分析条件） 装置：Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ５９８０ カラム：ＤＢ−ＷＡＸキャピラリーカラム（φ０．２５
ｍｍ×３０ｍ：Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） 検出器：ＦＩＤ ヘリウム流速：２．０ｍｌ／分 温度プログラム：昇温７５℃→２２０℃（４℃／分）、
保持２２０℃（１５分） 試料注入部温度：２３０℃ 検出部温度：２２０℃ 内部標準：２−エチル−１−ヘキサノール サンプル量：２μＬ
ｍｍ×３０ｍ：Ｊ＆ＷＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製） 検出器：ＦＩＤ ヘリウム流速：２．０ｍｌ／分 温度プログラム：昇温７５℃→２２０℃（４℃／分）、
保持２２０℃（１５分） 試料注入部温度：２３０℃ 検出部温度：２２０℃ 内部標準：２−エチル−１−ヘキサノール サンプル量：２μＬ
【００２９】実施例５：天然のフラボノイドのラムノシ
ルグリコシドに対する作用 非還元末端にラムノシル基を有する、ナリンジン（ｎａ
ｒｉｇｉｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）、ヘスペリジン
（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）およびクエルシトリン（ｑｕ
ｅｒｃｉｔｒｉｎ）のラムノシルグリコシドの分解生成
物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーを用いて分析し
た。すなわち、実施例２で得られた精製酵素の溶液
（０．５Ｕ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．
５）０．５ｍｌに基質を５ｍｇ溶解させた反応溶液を３
０℃で一晩保持した。この試料を４．０μｌ、シリカゲ
ル薄層（ＤＣ−Ａｌｕｆｏｌｉｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅ
ｌ ６０：メルク社製）に付した。ラムノースおよびグ
ルコースを標準物質として用い、アセトニトリル−蒸留
水（５：１，Ｖ／Ｖ）混液を用いて展開した後、１０％
硫酸のエタノール溶液を噴霧し、１０５℃で５分間加熱
して糖類を検出した。
ルグリコシドに対する作用 非還元末端にラムノシル基を有する、ナリンジン（ｎａ
ｒｉｇｉｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）、ヘスペリジン
（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）およびクエルシトリン（ｑｕ
ｅｒｃｉｔｒｉｎ）のラムノシルグリコシドの分解生成
物をシリカゲル薄層クロマトグラフィーを用いて分析し
た。すなわち、実施例２で得られた精製酵素の溶液
（０．５Ｕ、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．
５）０．５ｍｌに基質を５ｍｇ溶解させた反応溶液を３
０℃で一晩保持した。この試料を４．０μｌ、シリカゲ
ル薄層（ＤＣ−Ａｌｕｆｏｌｉｅｎ Ｋｉｅｓｅｌｇｅ
ｌ ６０：メルク社製）に付した。ラムノースおよびグ
ルコースを標準物質として用い、アセトニトリル−蒸留
水（５：１，Ｖ／Ｖ）混液を用いて展開した後、１０％
硫酸のエタノール溶液を噴霧し、１０５℃で５分間加熱
して糖類を検出した。
【００３０】その結果、ナリンジン（ｎａｒｉｇｉ
ｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）およびヘスペリジン（ｈｅ
ｓｐｅｒｉｄｉｎ）のラムノシルグリコシドはα−Ｌ−
ラムノシダーゼによって分解をうけ、ラムノースが検出
された。一方、クエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉ
ｎ）のラムノシルグリコシドについてはラムノースは検
出されなかった。
ｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）およびヘスペリジン（ｈｅ
ｓｐｅｒｉｄｉｎ）のラムノシルグリコシドはα−Ｌ−
ラムノシダーゼによって分解をうけ、ラムノースが検出
された。一方、クエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉ
ｎ）のラムノシルグリコシドについてはラムノースは検
出されなかった。
【００３１】
【発明の効果】本発明酵素は、高濃度のグルコースおよ
び高濃度のエタノール存在下においても非常に優れた活
性を有しており、ワインの醸造に利用できる。すなわ
ち、本発明酵素をβ−Ｄ−グルコシダーゼなどと共に使
用することにより、ワイン醸造において芳香成分を増加
させて、ワインの品質を向上させることができる。一
方、バクテリア臭や夾雑酵素の働きによりワインの風味
に悪影響を与えることもない。また、本酵素の、天然の
フラボノイドのラムノシルグリコシドに対する基質特異
性の広さから、ブドウ果汁のみならず柑橘類の果汁にも
利用することができる。
び高濃度のエタノール存在下においても非常に優れた活
性を有しており、ワインの醸造に利用できる。すなわ
ち、本発明酵素をβ−Ｄ−グルコシダーゼなどと共に使
用することにより、ワイン醸造において芳香成分を増加
させて、ワインの品質を向上させることができる。一
方、バクテリア臭や夾雑酵素の働きによりワインの風味
に悪影響を与えることもない。また、本酵素の、天然の
フラボノイドのラムノシルグリコシドに対する基質特異
性の広さから、ブドウ果汁のみならず柑橘類の果汁にも
利用することができる。
【図１】 ピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇ
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの安定ｐＨ域および作用ｐＨ域を示すグラフである。
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの安定ｐＨ域および作用ｐＨ域を示すグラフである。
【図２】 ピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇ
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの安定温度域および作用温度域を示すグラフである。
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの安定温度域および作用温度域を示すグラフである。
【図３】 ピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇ
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの活性とグルコース濃度の関係を示すグラフである。
【図４】 ピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇ
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの活性とエタノール濃度の関係を示すグラフである。
ｕｓｔａ）Ｘ３４９株の生産するα−Ｌ−ラムノシダー
ゼの活性とエタノール濃度の関係を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:84）
Claims (4)
- 【請求項１】 下記の性質を有するα−Ｌ−ラムノシダ
ーゼ。 （１）作用：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノピラ
ノシドを基質として作用させた場合、ｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する。 （２）至適ｐＨ：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質として３０℃で１０分間反応させたと
きの至適ｐＨは６．０〜７．０付近にある。 （３）ｐＨ安定性：３０℃にて３０分間保持した場合、
ｐＨ５．０〜７．０で安定した酵素活性を示す。 （４）至適温度：ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−ラムノ
ピラノシドを基質としてｐＨ６．５で３０℃で１０分間
反応させたときの至適温度は約４０℃である。 （５）熱安定性：ｐＨ６．５にて３０分間保持したと
き、２０℃まで安定した酵素活性を示し、それを超える
と次第に失活する。 （６）阻害剤：ｐ−クロロ安息香酸水銀、塩化第二水
銀、塩化第二銅により阻害を受け、エチレンジアミン四
酢酸、メルカプトエタノールでは殆ど阻害されない。 （７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した分子量は約８８，０００ダルトンで
ある。 （８）等電点：等電点電気泳動法による等電点はｐＩ
４．９である。 （９）グルコース耐性：５００ｍＭグルコース中におい
て７６％の相対活性を示す。 （１０）エタノール耐性：２０容量％エタノール中にお
いて６７％の相対活性を示す。 - 【請求項２】 ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生
物を培養して得られる培養物から請求項１に記載のα−
Ｌ−ラムノシダーゼを採取することを特徴とするα−Ｌ
−ラムノシダーゼの製造方法。 - 【請求項３】 ピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生
物をラムノース（ｒｈａｍｎｏｓｅ）を含む培地で培養
して得られる培養物から請求項１に記載のα−Ｌ−ラム
ノシダーゼを採取することを特徴とするα−Ｌ−ラムノ
シダーゼの製造方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載のα−Ｌ−ラムノシダー
ゼ産生能を有するピシア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ
ａｎｇｕｓｔａ）Ｘ３４９株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７２１
１）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9958699A JP2000287681A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | α−Ｌ−ラムノシダーゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9958699A JP2000287681A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | α−Ｌ−ラムノシダーゼおよびその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000287681A true JP2000287681A (ja) | 2000-10-17 |
Family
ID=14251210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9958699A Pending JP2000287681A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | α−Ｌ−ラムノシダーゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000287681A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003087290A1 (ja) * | 2002-04-16 | 2005-08-18 | 天野エンザイム株式会社 | 葡萄を原料とする酒の風味改善用組成物 |
| CN107383259A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-24 | 扬州工业职业技术学院 | 一种新型纳米苯丙乳液及其在制备聚合物防水砂浆中的应用 |
| CN107383258A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-24 | 扬州工业职业技术学院 | 一种鼠李双糖酯改性的乳化剂及其在制备纳米苯丙乳液中的应用 |
| CN112210548A (zh) * | 2020-09-07 | 2021-01-12 | 佛山市汇腾生物技术有限公司 | 一种表达α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母及其制备方法和应用 |
| CN117187216A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-08 | 南京林业大学 | 一种耐热α-L-鼠李糖苷酶及其耐糖突变体和应用 |
-
1999
- 1999-04-07 JP JP9958699A patent/JP2000287681A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003087290A1 (ja) * | 2002-04-16 | 2005-08-18 | 天野エンザイム株式会社 | 葡萄を原料とする酒の風味改善用組成物 |
| CN107383259A (zh) * | 2017-08-21 | 2017-11-24 | 扬州工业职业技术学院 | 一种新型纳米苯丙乳液及其在制备聚合物防水砂浆中的应用 |
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