JPH06217769A - 糖分解酵素の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 糖分解酵素の効率的な分離、製造方法を提供
する。 【構成】 バクテロイデス・フラギリスの培養菌体抽出
液を担体と接触させて糖分解酵素を担体に吸着させた
後、溶出液の濃度を段階的に高めて糖分解酵素を担体か
ら順次溶出させる。 【効果】 種々の糖分解酵素を一度の操作で効率良く、
しかも簡便に分離、製造することができる。また、種々
の糖分解酵素を大量に製造することができるので、高価
な酵素であるシアリダーゼやフコシダーゼを安価に提供
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バクテロイデス・フラ
ギリスが菌体内に生産する種々の糖分解酵素を効率的に
分離、製造する方法に関する。詳しくは、クロマトグラ
フの手法により、バクテロイデス・フラギリスの培養菌
体抽出液から、段階的に糖分解酵素を分離、製造する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、糖分解酵素は、バクテリア、動
物、また植物と種々の起源から得られることが知られて
いる。例えば、α−Ｄ−グルコシダーゼは酵母類から、
β−Ｄ−グルコシダーゼはアーモンドなどから、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼは大腸菌やジャックマメなどから、
β−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼはウシ肝臓など
から、β−Ｄ−Ｎアセチルガラクトサミニダーゼはホラ
貝やアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属に属す
る微生物などから、α−Ｌ−フコシダーゼはホラ貝やフ
ザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙ
ｓｐｏｒｕｍ）などから、シアリダーゼは連鎖球菌など
のバクテリア類から、それぞれ分離、精製されており、
市販もされている。

【０００３】近年、生体を構成している物質の中でも、
特に糖鎖を含む化合物の構造と機能が注目されてきてお
り、このような糖鎖含有化合物の構造解析や生理機能の
解明において、これらの糖分解酵素は、糖鎖を切るハサ
ミとして、今後、需要が増大することが予想されてい
る。ところが、これらの糖分解酵素を分離、精製するに
当たっては、酵素を抽出した後に、数段階にも及ぶクロ
マトグラフ処理が必要であり、工程として非常に煩雑で
あった。また、単一の生産系から一度に多種類の糖分解
酵素を得る方法についても知られていないのが現状であ
る。

【０００４】また、シアル酸やフコースは、糖鎖の非還
元末端に存在しており、糖鎖を構成する糖の中でも、そ
の機能の重要性が注目されている物質である。そして、
これらの糖の機能を解明するためには、糖鎖からシアル
酸やフコースを意図的に遊離させることが必要であり、
これらのことができる酵素、すなわちシアリダーゼやフ
コシダーゼが必要となってくる。しかし、これらのシア
リダーゼやフコシダーゼを一度に効率的に生産する方法
は知られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
ような状況に鑑み、効率的に種々の糖分解酵素を製造す
る方法を確立すべく鋭意研究を重ねたところ、腸内細菌
の一種であるバクテロイデス・フラギリスが種々の糖分
解酵素を一度に、かつ比較的多量に生産することを見出
し、さらに、このバクテロイデス・フラギリスの培養菌
体抽出液をクロマトグラフ処理することにより、種々の
糖分解酵素を順次、分離、製造できることを見出し、本
発明を完成するに至った。したがって、本発明は、シア
リダーゼやフコシダーゼを含む種々の糖分解酵素を生産
するバクテロイデス・フラギリスから効率的に種々の糖
分解酵素を製造する方法を提供することを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、種々の糖分解
酵素を生産する微生物であるバクテロイデス・フラギリ
スを培養し、その培養菌体抽出液から、単一のクロマト
グラフ処理により、一度に、α−Ｄ−グルコシダーゼ、
β−Ｄ−グルコシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−Ｎアセチルグルコ
サミニダーゼ、β−Ｄ−Ｎアセチルガラクトサミニダー
ゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ及びシアリダーゼの８種の糖
分解酵素を効率的に分離、製造する方法である。

【０００７】ここで、本発明において用いる種々の糖分
解酵素を生産する菌株の菌学的性質について、次の通り
示す。 （ａ）形態 ＢＧ寒天培地に嫌気培養後、生育した菌について以下を
観察した。 菌形 ：桿菌 鞭毛 ：なし グラム染色 ：陰性 芽胞 ：形成しない

【０００８】（ｂ）生理的性質 （１）ＰＹＧ培地を基本培地として用い、以下の性状を
検討した。 胆汁培地での生育 ：発育促進 硫化水素産生 ：あり インドール産生 ：なし 硝酸塩還元 ：なし ゼラチンの液化 ：なし デンプンの加水分解 ：あり エクスリンの加水分解 ：あり

【０００９】（２）ＰＹＧ培地を基本培地として用い、
糖の分解性を判定した。 Ｌ−アラビノース ：なし Ｄ−キシロース ：あり Ｄ−ラムノース ：なし リボース ：なし グルコース ：あり マンノース ：あり フラクトース ：あり ガラクトース ：あり シュークロース ：あり マルトース ：あり セロビオース ：なし ラクトース ：あり トレハロース ：なし メリビオース ：あり ラフィノース ：あり メレチトース ：なし デンプン ：あり グリコーゲン ：あり イヌリン ：あり グリセロール ：なし マンニトール ：なし ソルビトール ：なし エリトリトール ：なし イノシトール ：なし エスクリン ：不明 サリシン ：なし アミグダリン ：なし

【００１０】上記の菌学的性質に基づき、Ｂｅｒｇｅ
ｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ 第１巻（１９８４年発行）
を参照して分類したところ、この菌株は、バクテロイデ
ス・フラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉ
ｌｉｓ）と同定された。なお、この菌株は、Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＳＢＴ ３１８２株
として、工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第１２３５２号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３５２）の番号で
寄託されている。

【００１１】本発明において、バクテロイデス・フラギ
リスを培養するには、通常の栄養培地を使用でき、炭素
源、窒素源、無機塩類などを適当に含有するものであれ
ば、天然培地、合成培地のいずれでも用いることができ
る。栄養培地中の炭素源としては、グルコース、フラク
トース、シュークロース、マルトース、マンノース、デ
ンプン、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類など、あるい
は天然の栄養源であるペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、麦芽エキス、牛心臓や牛脳の浸出液、牛血液粉末な
どを用いることができる。また、栄養培地中の窒素源と
しては、アンモニア水、硫安、硝安、塩安、尿素など、
あるいは窒素を含有する有機物質であるペプトン、ＮＺ
−アミン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイ
ン加水分解物、フィッシュミール、大豆消化物などを用
いることができる。さらに、栄養培地中の無機塩類とし
ては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化
カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸第一
鉄、塩化ナトリウム、炭酸カルシウムなどを用いること
ができる。このような培地で、２５〜３７℃、１〜２日
間静置培養を行うことにより、バクテロイデス・フラギ
リスの菌体内に糖分解酵素が生成、蓄積される。

【００１２】培養終了後、バクテロイデス・フラギリス
の菌体を遠心分離などの処理で捕集し、適当な緩衝液で
菌体を２〜３回洗浄した後、菌体を破砕する。菌体を破
砕するための処理方法としては、超音波処理、ポッター
型テフロンホモジナイザー処理、フレンチプレス処理、
高張液−低張液処理などを用いることができる。そし
て、この菌体破砕液を遠心分離し、その上清を糖分解酵
素の粗酵素液として、以下の分離、製造工程に供する。

【００１３】本発明では、糖分解酵素の分離、製造に際
し、クロマトグラフ処理を行う。まず、上記のようにし
て得られた糖分解酵素の粗酵素液をイオン交換樹脂やヒ
ドロキシアパタイトなどの担体と接触させ、糖分解酵素
を担体に吸着させる。そして、溶出液の濃度を段階的に
高めることにより、糖分解酵素を順次溶出させることが
できる。例えば、担体としてヒドロキシアパタイトを用
いたカラムクロマトグラフィーで糖分解酵素の分離、製
造を行う場合、糖分解酵素の粗酵素液をヒドロキシアパ
タイトカラムに通液して酵素活性を吸着させた後、５ｍ
Ｍ程度のリン酸緩衝液で十分洗浄し、次いでリン酸緩衝
液の濃度を２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍ
Ｍ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭと段階的に高
めることにより糖分解酵素を順次カラムから溶出させる
ことができる。因みに、リン酸緩衝液濃度が２０ｍＭの
場合は、β−Ｄ−グルコシダーゼとβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼが、５０ｍＭの場合は、β−Ｄ−Ｎアセチルガラ
クトサミニダーゼが、１００ｍＭの場合は、β−Ｄ−Ｎ
アセチルグルコサミニダーゼが、１５０ｍＭの場合は、
シアリダーゼが、２００ｍＭの場合は、α−Ｌ−フコシ
ダーゼが、２５０ｍＭの場合は、α−Ｄ−グルコシダー
ゼが、３００ｍＭの場合は、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が、それぞれ溶出されてくる。なお、溶出画分中に２種
類以上の糖分解酵素が共存している場合は、必要に応じ
て、ゲル濾過などの手法を用い、分離精製を行えば良
い。次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

【００１４】

【実施例１】１％ペプトン、１％プロテオーゼペプト
ン、０．５％酵母エキス、０．１％肝臓エキス、０．３
％グルコース、０．２５％リン酸二水素ナトリウム、
０．３％食塩、０．５％可溶性デンプン及び０．０３％
Ｌ−システイン塩酸塩を含むｐＨ７．０の液体培地１ｌ
を１２１℃、１５分間滅菌した後、この液体培地にバク
テロイデス・フラギリス ＳＢＴ ３１８２株（微工研
菌寄第１２３５２号）の前培養液３０ｍｌを接種し、３
７℃、１５時間静置培養した。培養終了後、この培養液
から８，９００×ｇ、１０分間の遠心分離で菌体を捕集
し、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液８００ｍｌで菌体を２回
洗浄した後、菌体をｐＨ７．０のリン酸緩衝液１２０ｍ
ｌに懸濁して超音波処理（２Ａ、１０分間）を行い菌体
を破砕した。そして、この菌体破砕液から４５，０００
×ｇ、１０分間の遠心分離で糖分解酵素の粗酵素液とし
て上清１２５ｍｌを得た。

【００１５】この粗酵素液中に含まれる各糖分解酵素の
酵素活性は、α−Ｄ−グルコシダーゼ２９．７単位／ｍ
ｌ、β−Ｄ−グルコシダーゼ２１．４単位／ｍｌ、α−
Ｄ−ガラクトシダーゼ２８．４単位／ｍｌ、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ８．４単位／ｍｌ、β−Ｄ−Ｎアセチル
グルコサミニダーゼ３０．６単位／ｍｌ、β−Ｄ−Ｎア
セチルガラクトサミニダーゼ２４．２単位／ｍｌ、α−
Ｌ−フコシダーゼ３０．５単位／ｍｌ、シアリダーゼ２
９．９単位／ｍｌであった。

【００１６】なお、酵素活性の測定は、パラニトロフェ
ニル−α−Ｄ−グリコシド、パラニトロフェニル−β−
Ｄ−グリコシド、パラニトロフェニル−α−Ｄ−ガラク
トシド、パラニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド、
パラニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎアセチルグルコシド、
パラニトロフェニル−β−Ｄ−Ｎアセチルガラクトシ
ド、パラニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド及びパラニ
トロフェニル−α−Ｄ−シアル酸を各糖分解酵素の基質
として用い、酵素反応で遊離したパラニトロフェノール
の量を比色定量し、４０５ｎｍの吸収度を酵素活性の指
標とした。すなわち、ｐＨ７．０のリン酸緩衝液０．１
９ｍｌに５ｍＭに調製した各基質０．０１ｍｌを加え、
さらに、酵素液０．０５ｍｌを加え反応を開始し、３７
℃、２時間反応させた後、ｐＨ９．５の１Ｍホウ酸緩衝
液０．２ｍｌを加え、直ちに４０５ｎｍの吸収度を測定
した。そして、１分間に１μｍｏｌのパラニトロフェノ
ールを遊離させる酵素活性を１単位と定義した。

【００１７】

【実施例２】実施例１で得られた糖分解酵素の粗酵素液
１００ｍｌをヒドロキシアパタイトを充填したカラム
（１．６×１５ｃｍ）に通液した後、ｐＨ７．０の５ｍ
Ｍリン酸緩衝液９０ｍｌを通液してカラムを洗浄した。
次に、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０及
び３００ｍＭの各濃度に調整したｐＨ７．０のリン酸緩
衝液をそれぞれ９０ｍｌずつ段階的に通液して、吸着し
た糖分解酵素を順次溶出させた。なお、溶出流速は１．
５ｍｌ／分とした。

【００１８】このカラムクロマトグラフィーにより、そ
れぞれの蛋白質の溶出ピークを１０ｍｌづつ回収し、２
０ｍＭリン酸緩衝液の溶出ピーク１として１４８．５単
位／ｍｌのβ−Ｄ−グルコシダーゼと１０７．０単位／
ｍｌのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼが、５０ｍＭリン酸緩
衝液の溶出ピーク２として４１．５単位／ｍｌのβ−Ｄ
−Ｎアセチルガラクトサミニダーゼが、１００ｍＭリン
酸緩衝液の溶出ピーク３として４６．５単位／ｍｌのβ
−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニダーゼが、１５０ｍＭリ
ン酸緩衝液の溶出ピーク４として１１３．０単位／ｍｌ
のシアリダーゼが、２００ｍＭリン酸緩衝液の溶出ピー
ク５として８７．０単位／ｍｌのα−Ｌ−フコシダーゼ
が、２５０ｍＭリン酸緩衝液の溶出ピーク６として１４
９．５単位／ｍｌのα−Ｄ−グルコシダーゼが、３００
ｍＭリン酸緩衝液の溶出ピーク７として１１９．５単位
／ｍｌのα−Ｄ−ガラクトシダーゼが、それぞれ得られ
た。図１にリン酸緩衝液の塩濃度変化と蛋白質の溶出パ
ターンを示す。

【００１９】また、このカラムクロマトグラフィーによ
るそれぞれの酵素活性の回収率は、α−Ｄ−グルコシダ
ーゼ５０．３％、β−Ｄ−グルコシダーゼ６９．４％、
α−Ｄ−ガラクトシダーゼ８４．２％、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ１００％、β−Ｄ−Ｎアセチルグルコサミニ
ダーゼ１５．２％、β−Ｄ−Ｎアセチルガラクトサミニ
ダーゼ１７．１％、α−Ｌ−フコシダーゼ２８．５％、
シアリダーゼ３７．８％、であった。

【００２０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、種々の糖分解酵
素を一度の操作で、効率良く、しかも簡便に分離、製造
できる。また、糖鎖の構造解析に重要な役割を果たすシ
アリダーゼやフコシダーゼなどの糖分解酵素を大量に製
造することができるので、これらの酵素を安価に提供す
ることが可能となる。

【００２１】

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例２のカラムクロマトグラフィーにおける
リン酸緩衝液の塩濃度変化と蛋白質の溶出パターンであ
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バクテロイデス・フラギリス（Ｂａｃｔ
   ｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）の培養菌体抽出液
   を担体と接触させて糖分解酵素を担体に吸着させた後、
   溶出液の濃度を段階的に高めて糖分解酵素を担体から順
   次溶出させることを特徴とする糖分解酵素の製造法。
2. 【請求項２】 担体としてヒドロキシアパタイトを用
   い、溶出液としてリン酸緩衝液を用いる請求項１記載の
   糖分解酵素の製造法。
3. 【請求項３】 バクテロイデス・フラギリスが、Ｂａｃ
   ｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ ＳＢＴ ３１８２
   株（微工研菌寄第１２３５２号）である請求項１乃至２
   記載の糖分解酵素の製造法。