JP2003210164A

JP2003210164A - カプサイシン分解合成酵素及びその生産方法

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Publication number: JP2003210164A
Application number: JP2002008934A
Authority: JP
Inventors: Kazuhiro Nakanishi; 一弘中西; Takaaki Sakiyama; 高明崎山; Tsunakatsu Imamura; 維克今村
Original assignee: Okayama University NUC
Current assignee: Okayama University NUC
Priority date: 2002-01-17
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2003-07-29
Anticipated expiration: 2022-01-17
Also published as: JP3951008B2; US20030157670A1

Abstract

(57)【要約】【課題】大量生産が容易で、なおかつ高収率で、安定
したカプサイシン類を合成するのに有用な酵素、及び当
該酵素を用いたカプサイシン類の生産方法を提供するこ
とにある。【解決手段】本発明のカプサイシン類分解合成酵素
は、下記(1)〜(3)の理化学的性質を有する。(1)作用及
び基質特異性カプサイシンの分解反応及び／又は合成
反応を触媒する。(2)至適温度の範囲 55℃近傍であ
る。(3)至適pHの範囲 7〜8である。また、本発明のカ
プサイシン分解合成酵素の生産方法は、Streptomyces属
に属し、カプサイシン類分解合成酵素を生産する能力を
有する微生物を培養し、その培養液から前記カプサイシ
ン分解合成酵素を採取することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な酵素、当該
酵素を生産する能力を有する微生物、当該酵素の生産方
法、及び当該酵素を利用した有用物質の合成方法に関
し、特にカプサイシンの分解又は合成反応を触媒する酵
素、当該酵素を生産する能力を有する微生物、当該酵素
の生産方法、及び当該酵素を利用したカプサイシン類の
合成方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カプサイシンは唐辛子（Capsicum annuu
m）の辛味主成分の一種であり、食欲増進や鎮痛作用な
どの有用な生理活性を有している。このようにカプサイ
シンは種々の生理活性を示し、機能性食品素材や医薬品
原料の分野においても有用であることから、現在世界的
な注目を集めている。

【０００３】このようなカプサイシン及びカプサイシン
類縁体は、たとえば、有機合成化学的方法により合成す
ることができる。

【０００４】また、酵素を利用した合成法として、バニ
リルアミンとトリグリセドにリパーゼを作用させてカプ
サイシン類の酵素的合成に成功した例も知られている。

【０００５】さらに、ラット肝アセトン粉末を用いてカ
プサイシン類を合成できることも知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記有
機合成化学的方法によれば、使用する試薬類が食品加工
用として認められていないため、食品素材の製造方法と
して利用することができないという欠点を有する。ま
た、上述の酵素を利用した合成法や、ラット肝アセトン
粉末を用いた方法においては、前者では20％以下、後者
では2日間でも収率が８〜28％であり、共に合成収率が
低いという欠点を有する。その上、後者においては、本
酵素標品は、ラット肝臓を原料とするため工業用途向け
の大量生産が困難である。したがって、大量生産が容易
で、なおかつ高収率で、安定したカプサイシン類を合成
し得る方法が望まれていた。

【０００７】そこで、本発明の目的は、大量生産が容易
で、なおかつ高収率で、安定したカプサイシン類を合成
するのに有用な酵素、当該酵素の生産方法、当該酵素を
生産する能力を有する微生物、当該酵素を用いたカプサ
イシン類の合成方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、発明者らは、カプサイシン類を特異的に加水分解及
び合成する能力に優れた酵素を求めて種々の微生物につ
いて検討した結果、本発明の酵素及び当該酵素の生産方
法を見出すに至った。

【０００９】本発明のカプサイシン分解合成酵素は、下
記(1)〜(3)の理化学的性質を有することを特徴とする。
(1)作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応及び
／又は合成反応を触媒する。(2)至適温度の範囲 55℃
近傍である。(3)至適pHの範囲7〜8である。

【００１０】本発明のカプサイシン分解合成酵素の好ま
しい実施態様において、カプサイシン分解合成酵素が、
Streptomyces属に属する微生物由来であることを特徴と
する。

【００１１】本発明のカプサイシンの分解合成酵素の好
ましい実施態様において、Streptomyces属に属する微生
物が、Streptomyces mobaraensis IFO 13819又はStrept
omysces luteoreticuli IFO 13422であることを特徴と
する。

【００１２】本発明の微生物は、下記(1)〜(3)の理化学
的性質を有するカプサイシン分解合成酵素の生産能を有
するStreptomyces属に属することを特徴とする。(1)作
用及び基質特異性カプサイシンの分解反応又は合成反
応を触媒する。(2)至適温度の範囲 55℃近傍である。
(3)至適pHの範囲 7〜8である。

【００１３】本発明のカプサイシン分解合成酵素の生産
方法は、Streptomyces属に属し、カプサイシン分解合成
酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、その培養
液から前記カプサイシン分解合成酵素を採取することを
特徴とする。

【００１４】本発明のカプサイシン分解合成酵素の生産
方法の好ましい実施態様において、前記微生物が、Stre
ptomyces mobaraensis IFO 13819又はStreptomysces lu
teoreticuli IFO 13422であることを特徴とする。

【００１５】本発明のカプサイシン又はカプサイシン類
縁体を合成する方法は、請求項1項に記載の酵素の存在
下、バニリルアミンと脂肪酸とを反応させることを特徴
とする。

【００１６】本発明のカプサイシン又はカプサイシン類
縁体を合成する方法の好ましい実施態様において、コバ
ルトイオンの存在下で反応させることを特徴とする。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明のカプサイシン分解合成酵
素は、カプサイシンのみならずカプサイシン類縁体の加
水分解、及び合成反応を触媒する作用を有する酵素を広
く意味するものである。カプサイシン分解合成酵素は、
下記(1)〜(3)の理化学的性質を有する。すなわち、(1)
作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応又は合成
反応を触媒する。(2)至適温度の範囲 55℃近傍であ
る。(3)至適pHの範囲 7〜8である。また、本発明の分
解合成酵素の分子量は、およそ45kDa〜60kDaの間にあ
る。電気泳動によって単一のバンドが得られることか
ら、単量体であると考えられる。

【００１８】このような本発明のカプサイシン分解合成
酵素は、好ましくは、Streptomyces属に属する微生物由
来のものである。より好ましくは、本酵素は、Streptom
yces属に属する微生物のうち、Streptomyces mobaraens
is IFO 13819又はStreptomysces luteoreticuli IFO 13
422由来である。

【００１９】また、本発明のカプサイシン分解合成酵素
は、好ましくは、コバルトイオンの存在下で、酵素活性
が促進する。このような酵素活性の高い酵素を利用すれ
ば、後述するようなカプサイシン又はカプサイシン類縁
体の高効率な合成に有益である。

【００２０】本発明のカプサイシン又はカプサイシン類
縁体を合成する方法は、上述の本発明の分解合成酵素を
用いる。具体的には、当該分解合成酵素の存在下、バニ
リルアミンと脂肪酸とを反応させる。反応式を以下に示
す。

【００２１】

【化１】なお、上記式において、一例としてバニリルアミンを用
いたが、脂肪酸と反応させて目的とするカプサイシン類
縁体を得るのに、バニリルアミンに類似する種々の類似
アミン化合物を用いることができる。同様に、脂肪酸と
しては、特に限定されず、目的とするカプサイシン類縁
体に応じて、種々の脂肪酸を用いることができる。例え
ば、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン
酸、パルミチン酸、ステアリン酸等を挙げることができ
る。

【００２２】パルミチン酸より高い炭素数の脂肪酸を用
いる場合には、溶媒の種類によっては、溶媒に溶解しな
いことも生じるので、適宜溶媒を選択して反応させるこ
とができる。また、この場合、酸素濃度を高めたり、コ
バルトイオンを添加して反応を促進させることも可能で
ある。

【００２３】本発明の微生物は、下記(1)〜(3)の理化学
的性質を有するカプサイシン分解合成酵素の生産能を有
するStreptomyces属に属する。(1)作用及び基質特異性
カプサイシンの分解反応又は合成反応を触媒する。
(2)至適温度の範囲 55℃近傍である。(3)至適pHの範囲
7〜8である。

【００２４】Streptomyces 属に属する微生物の菌学的
性質としては、真正法線菌に属し、菌糸状の状態で生育
するグラム陽性（グラム染色性が陽性）の偏性好気性菌
であることが挙げられる。

【００２５】本発明のカプサイシン分解合成酵素の生産
性が高いという観点から、微生物としては、Streptomyc
es mobaraensis IFO 13819又はStreptomysces luteoret
iculi IFO 13422であることが好ましい。

【００２６】Streptomyces mobaraensis IFO 13819又は
Streptomysces luteoreticuli IFO13422は、大阪の財団
法人発酵研究所（IFO）より入手可能であり、IFO 1381
9、IFO 13422は、IFOの寄託番号を示す。

【００２７】なお、IFO13819は、他の微生物保存期間に
も同一菌株が寄託されており、理化学研究所微生物系統
保存施設（JCM）ではJCM4168、米国のAmerican Type Cu
lture Collection（ATCC）ではATCC29032、同じく米国N
ational Center for Agricultural Utilization Resear
ch（NRRL）ではNRRL B-3729である。また、IFO 13422
は、同一菌株がATCCではStreptomyces mobaraensis ATC
C 27446である。

【００２８】本発明のカプサイシン分解合成酵素の生産
方法は、Streptomyces属に属し、カプサイシン分解合成
酵素を生産する能力を有する微生物を、通常の方法で培
養し、その培養液から前記カプサイシン分解合成酵素を
採取すればよい。また、上記微生物の自然的又は人工的
変異株の培養物から、本発明の分解合成酵素を採取して
もよい。培養の形態としては、液体培養、固体培養等を
挙げることができ、いずれも適用可能である。工業的に
有利に培養するために、振盪培養、通気攪拌培養等を行
なっても良い。

【００２９】培地の栄養原としては、特に限定されるこ
とはなく、微生物の培養に通常用いられる炭素原、窒素
源等を挙げることができる。炭素源としては、酵母エキ
ス、グリセリン、グルコースなどを、または窒素源とし
ては、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等の
有機窒素化合物を挙げることができる。その他、無機塩
類、例えば、食塩、リン酸塩類、硫酸塩類、カリウム、
マグネシウム、カルシウム、亜鉛などの金属塩類を適宜
培地に加えても良い。培養温度、培養時間等の培養条件
について、使用する微生物の発育に適し、かつ本発明の
分解合成酵素の生産が最高になるような条件を適宜選択
する。例えば、培地のpHは、中性、好ましくは6.0〜8.
0、より好ましくは7.0近傍である。また、放線菌の生育
温度は一般的には28〜37℃である。これらの菌体の好ま
しい培養温度としては28〜32℃の範囲である。特に、IF
Oでは、以下に述べるStreptomyces mobaraensis IFO 13
819及びStreptomysces luteoreticuli IFO 13422の２つ
の菌株の培養温度として28℃を推奨している。

【００３０】このようにして得られた培養物から本発明
の分解合成酵素を得るには、代謝産物を採取するのに通
常用いられる方法を適宜利用することができる。例え
ば、当該分解合成酵素と不純物との溶解度の差を利用す
る方法、親和力を利用する方法、分子量の差を利用する
方法等を、単独又は組み合わせて、あるいは反復して使
用することができる。例えば、本発明の分解合成酵素
は、微生物の体外に分泌されるので、微生物の培養を行
ない、培溶液から濾過、あるいは遠心分離によって微生
物を取り除いた培養上清を得、この培養上清から硫酸ア
ンモニウムを用いた塩析、各種のイオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を組み合わせ
て本発明の分解合成酵素を精製すればよい。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明は、下記実施例に限定して解釈される
意図ではない。

【００３２】実施例１＜カプサイシン分解合成酵素の精製＞まず、カプサイシ
ン分解合成酵素が菌体内と菌体外のどちらに多く含まれ
ているかを調べた。菌体を超音波破砕して得た溶液と、
培養上清について活性測定したところ、菌体外の比活性
は培養日数と共に増加するが、菌体内の活性は培養6日
間で殆ど見られなくなった。よって、本菌株の産生する
カプサイシン分解合成酵素は効率よく菌体外に分泌され
ていると考えられる。

【００３３】ついで、カプサイシン加水分解酵素活性の
高いもの選別する目的で、種々のStreptomyces sp．に
ついてスクリーニングを行った。スクリーニング方法は
以下の通りである。

【００３４】培地は４％beef extract、２％polyPepton
等を用いて精製し、初期pH7.0、振盪速度120strokes／m
in、温度30℃で7日間培養を行った。活性については、
0.13mMカプサイシンを基質として、37℃でインキュベー
ト後にHPLC測定を行った。なお、酵素活性１Uは、1μmo
lのカプサイシンを37℃、1時間で加水分解するのに必要
な酵素量として定義した。その結果、S，mobaraensis I
FO 13819の活性が1.2（U／mL）、S．luteoreticuli IFO
13422の活性が1.0（U／mL）と相対的に高い活性を示し
た。ただし、S.luteoreticuliはATCCによる分類ではS.m
obaraensisに分類されている。

【００３５】これらの知見から、菌株としてS.mobaraen
sis IFO 13819を用いて、培養を行った。可溶性澱粉2.0
％、ポリペプトン2.0％、肉エキス4.0％、酵母エキス0.
2％、リン酸水素カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.1
％からなるpH７の液体培地にStreptomyces mobaraensis
IFO 13819の胞子懸濁液を接種し、30℃で7日間培養し
た。

【００３６】その後、酵素を培養上清に終濃度５０％に
なるように硫酸アンモニウムを加え、硫安沈澱を行っ
た。得られた沈澱をバッファーに溶解後、CM Sephadex
C-50で分画し、さらに二回ヒドロキシアパタイトカラム
クロマトグラフィーを用いて精製した。

【００３７】CM-Sephadex C-50カラムクロマトグラフィ
ーの溶出曲線を図3に示す。タンパク質濃度は、OD280
で、カプサイシン（CAP）加水分解活性は加水分解率で
表した。活性分画は、NaCl濃度400mM付近で溶出した。
この活性分画をヒドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィーで分画して活性分画を得た(図４(a))が、不純
なタンパク質の混在が認められたため、この活性分画を
再度ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーで
分画した。その結果、図4(b)に示すように、リン酸濃度
350mM付近で精製酵素を得た。

【００３８】このようにして、遠心除菌して当該酵素を
含む上清を得た。ついで、得られた上清についての活性
を調べた。その結果、上清0.6L中の当該酵素の総活性は
345U、比活性は0.061 Ｕ/mgであった。ここで、酵素活
性１Uは、37℃、1時間で１μmolのカプサイシンを加水
分解する酵素量であった。この上清に５０％飽和となる
ように硫酸アンモニウムを添加して沈澱画分を得た後、
陽イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタ
イトクロマトグラフィー(2回)を行なうことにより、比
活性は197.0 U/mgとなり(表1)、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動的に単一(分子量約60kDa)に精製された酵素
が得られた(図1)。

【００３９】

【表１】なお、この比活性はこれまでに報告されているカプサイ
シン分解活性を有する諸酵素に比べると非常に高い値で
あった。

【００４０】＜カプサイシン分解合成酵素の特性＞次
に、精製酵素の反応特性について検討した。種々の試薬
に対する安定性について調べた結果、精製された当該酵
素のカプサイシン加水分解活性はコバルトイオンにより
増加した(表２)。また、セリンプロテアーゼの阻害剤と
して知られるPMSF(フェニルメタンスルホニルフルオリ
ド)の添加により活性が阻害されることが示された。

【００４１】

【表２】また、カプサイシン分解合成酵素の至適pHは8付近であ
った(図2)。コバルトイオンを添加した場合と無添加の
場合について、各温度で一時間インキュベートした後の
残存活性を調べた。その結果を図3に示す。耐熱性に関
しては、およそ50℃まで安定であった(図3)。50℃以上
では、コバルトイオン添加時の方が、残存活性が高いこ
とが示された。このことから、コバルトイオンは本酵素
の活性促進に加え、安定性にも寄与している可能性が示
唆される。また、活性の温度依存性について検討したと
ころ、５５℃で最も高い反応性を示した(図５)。

【００４２】実施例２次に、本発明のカプサイシン分解合成酵素を用いて、カ
プサイシン類縁体の合成を試みた。

【００４３】当該酵素のカプサイシン類縁体合成能力を
示す例は、以下のとおりである。水／ｎ−へキサン二相
系(ヘキサン相容積／水相容積＝１９)で、全反応液量20
ml、水相(0.5mM CoCl₂含有100mMトリス−塩酸緩衝液)の
初期pH7.3、10mMバニリルアミン塩(終濃度)とラウリン
酸１００ｍM(終濃度)の条件下で、30Uの酵素を用いて攪
拌しながら、8日間反応を行なった。反応温度は、37℃
であった。

【００４４】比較例として、アミノアシラーゼを用い
た。へキサン相のHPLC分析を行ってカプサイシン誘導体
を定量した。表３に両酵素を用いた場合の種々の脂肪酸
を基質とした反応の結果を示す。

【００４５】

【表３】

【００４６】その結果、収率約28％でカプサイシン合成
が確認できた(図６)。また、バニリルアミンと各種飽和
脂肪酸とを基質とする合成反応活性に関しては、ラウリ
ン酸(C12)の場合が最も高く、比較的炭素鎖の長い脂肪
酸(パルミチン酸：C16)にも作用することが特徴であ
る。

【００４７】以上、具体例を挙げながら発明の実施の形
態に基づいて本発明を詳細に説明したが、本発明は上記
内容に限定されることを意図するものではなく、本発明
の要旨を逸脱しない限りにおいてあらゆる変更が可能で
あることは、当業者にとって明白であろう。

【００４８】

【発明の効果】本発明によれば、大量生産が容易で、な
おかつ高収率で、安定したカプサイシン類を合成するの
に有用な酵素、及び当該酵素を用いたカプサイシン類の
生産方法を提供し得るという有利な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例である精製酵素のSDS−PAG
Eの結果を示す図である。

【図２】酵素活性のpH依存性を示す図である。

【図３】本発明の一実施例である精製酵素の熱安定性
を示す図である。

【図４】ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
ィーの結果を示す図である。(ａ)が1回目、(ｂ)が2回目
を示す。

【図５】本発明の一実施例である精製酵素の酵素活性
に対する温度依存性を示す図である。

【図６】カプサイシン誘導体合成反応の経過を示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者今村維克岡山県岡山市法界院１−37 グランパルクＡ101 Ｆターム(参考） 4B018 MD18 ME01 MF12 4B050 CC01 DD02 EE10 FF08 FF12 LL05 4B064 AE01 BJ05 CA04 CB24 CD02 CD12 DA01 DA10 4B065 AA50 AC14 CA16 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の理化学的性質を有するカプサイシン
分解合成酵素。 (1)作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応及び
／又は合成反応を触媒する。 (2)至適温度の範囲 55℃近傍である。 (3)至適pHの範囲 7〜8である。
【請求項２】前記カプサイシン分解合成酵素が、Strept
omyces属に属する微生物由来であることを特徴とする請
求項1記載のカプサイシン分解合成酵素。
【請求項３】Streptomyces属に属する微生物が、Strept
omyces mobaraensis IFO 13819又はStreptomysces lute
oreticuli IFO 13422であることを特徴とする請求項2記
載のカプサイシン分解合成酵素。
【請求項４】Streptomyces属に属し、カプサイシン分解
合成酵素を生産する能力を有する微生物を培養し、その
培養液から前記カプサイシン分解合成酵素を採取するこ
とを特徴とするカプサイシン分解合成酵素の生産方法。
【請求項５】前記微生物が、Streptomyces mobaraensis
IFO 13819又はStreptomysces luteoreticuli IFO 1342
2である請求項４記載の方法。
【請求項６】下記の理化学的性質を有するカプサイシン
分解合成酵素の生産能を有するStreptomyces属に属する
微生物。 (1)作用及び基質特異性カプサイシンの分解反応及び
／又は合成反応を触媒する。 (2)至適温度の範囲 55℃近傍である。 (3)至適pHの範囲 7〜8である。
【請求項７】請求項1〜3項のいずれか1項に記載の酵素
の存在下、バニリルアミンと脂肪酸とを反応させること
を特徴とするカプサイシン又はカプサイシン類縁体を合
成する方法。
【請求項８】さらに、コバルトイオンの存在下で反応さ
せることを特徴とする請求項７記載の方法。