JP3207155B2

JP3207155B2 - Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質

Info

Publication number: JP3207155B2
Application number: JP10317898A
Authority: JP
Inventors: オー．ラルストンロバート; マーカスフランク; ビー．スーディアムケント; エイ．ジャーバスバーバラ; エイ．ホールジョン
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1990-11-08
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 2001-09-10
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: DE69131882T2; DK0842947T3; SK285623B6; NO931680L; PT102022A; WO1992008734A1; AU9026791A; PT99466A; CA2203443C; EP0556292A4; CA2095521C; GR3032771T3; EP0842947B2; EP0842947A2; RO115446B1; PT102022B; NO304380B1; NO304381B1; EP0842947B1; FI107803B

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、組換えタンパク質
の発現およびウイルス学の一般的分野に関する。さらに
詳細には、本発明は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染の診
断、治療、および予防に有用な糖タンパク質、ならびに
このような糖タンパク質の生産方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】非A型、非B型肝炎（NANBH）は、ウイル
スによって誘発されると考えられている伝染性疾患（あ
るいは疾患のファミリー）であり、A型肝炎ウイルス（H
AV）、B型肝炎ウイルス（HBV）、デルタ肝炎ウイルス
（HDV）、サイトメガロウイルス（CMV）、あるいはエプ
スタインバーウイルス（EBV）に起因する肝疾患など
の、他の形態のウイルス関連肝疾患とは区別されてい
る。伝染病学的証拠によりNANBHには３つの型があるこ
とが示されている。すなわち、水に起因する伝染型；血
液あるいは針に関連する型；および、散発的に発生する
集団獲得型。多くの原因因子は未知である。しかし最
近、新種ウイルスであるC型肝炎ウイルス（HCV）が、血
液に起因するNANBH（BB-NANBH）の主要原因（もし唯一
の原因でなければ）として同定された。例えば、PCT WO
89/046699を参照のこと。C型肝炎は、アメリカ合衆国、
ヨーロッパおよび日本を含む多くの国あるいは地域で、
輸血関連肝炎の主要形態であるようだ。さらに、HCV に
関連する肝細胞癌の誘発の証拠も存在する。従って、HC
V感染の効果的な予防法および治療法の必要性が存在す
る。

【０００３】HCVキャリア、およびHCVに汚染された血液
あるいは血液製剤をスクリーニングおよび同定するため
の鋭敏で特異的な方法の要求が高まっている。輸血後肝
炎（PTH）が、輸血患者の約10%に発生し、この場合の90
%まではHCVに起因する。この疾患の主要な問題は、慢性
肝障害の常習的な進行である（25−55%）。

【０００４】患者の世話、ならびに血液および血液製剤
による、あるいは患者との密接な接触によるHCVの伝染
の予防には、HCVに関連する核酸、抗原および抗体の検
出のための信頼し得る診断ならびに予後手段が必要とさ
れる。さらに、この疾患を予防および／あるいは治療す
るための有効なワクチンおよび免疫治療的治療剤の必要
性が存在する。

【０００５】HCVは、他の感染性ウイルスに比較して非
常に低率で感染個体の血液中に存在するようであり、こ
のことはこのウイルスの検出を非常に困難にしている。
このウイルスが低率で存在することが、おそらく、長い
間NANB型肝炎の原因因子が検出されなかった主な理由で
ある。現在ではクローン化されてはいるが、いまだに培
養および増殖は困難である。従って、診断／治療／予防
用のHCVタンパク質を生産する組換え法の必要性が強
い。

【０００６】このように、HCVワクチンが非常に必要で
ある。しかし、細胞系におけるHCVの培養には、非常な
困難がある。したがって、組織／細胞の継代培養により
弱毒化ウイルス株を産生することは不可能であった。

【０００７】

【課題を解決するための手段】２種のHCVタンパク質、E
1およびE2は、組換え系において発現されるときには、
膜結合のアシアロ糖タンパク質であるようであることが
発見された。糖タンパク質は通常、哺乳類中ではマンノ
ース末端形態ではなく、さらに他の炭水化物で修飾され
ていて、マンノース末端化形態は、一般的には単に一過
的なものであるので、このことは予想外のことである。
E1およびE2の場合（われわれの系において発現されると
き）には、アシアロ糖タンパク質は、最終形態であるよ
うだ。E1（エンベロープタンパク質１）は、HCVゲノム
の推定E1領域から翻訳される分子量約35kDの糖タンパク
質である。E2（エンベロープタンパク質２）は、HCVフ
ラビウイルスモデルに基づく、HCVゲノムの推定NS1（非
構造タンパク質１）から翻訳される、分子量約72kDの糖
タンパク質である。ウイルス性糖タンパク質は、しばし
ば高免疫原性であるので、E1およびE2は、イムノアッセ
イおよび治療／予防ワクチンに使用されるのにまさに適
したものである。

【０００８】E1およびE2がシアル化されていないことの
発見は重要である。タンパク質の特定の形態は、細胞が
組換え発現用の適当な宿主として働き得るように指令す
る。E. coliなどの原核生物は、タンパク質をグリコシ
ル化せず、そして一般的には、抗原としての使用のため
に糖タンパク質を産生するのには適していない。その理
由は、糖タンパク質はしばしば、タンパク質の完全な抗
原性、可溶性、ならびに安定性に対して重要であるから
である。酵母ならびに真菌のなどの下等真核生物は、タ
ンパク質をグリコシル化するが、一般には、末端シアル
酸を付加して炭水化物複合体になし得ない。従って、酵
母由来のタンパク質は、抗原としての、それらの天然
（組換え体ではない）のタンパク質とは区別され得る。
組換えタンパク質のグリコシル化は野生ウイルスタンパ
ク質のグリコシル化に非常に類似しているので、哺乳動
物細胞での発現は、産生物の抗原性が重要である応用に
好ましい。

【０００９】HCVウイルスが、肝細胞上に見い出される
アシアロ糖タンパク質レセプター、あるいは肝内皮細胞
およびマクロファージ（特に、クッペル（Kupffer）細
胞）上に見い出されるマンノースレセプターを介する感
染中に、宿主細胞への入口を得ることができるという新
たな証拠が示された。驚くべきことに、天然のE1および
E2塊は、末端シアル酸残基を有さず、コアグリコシル化
のみなされることが発見された。さらに少画分が末端N-
アセチルグルコサミンを含む。従って、本発明の目的
は、全末端シアル酸残基あるいは実質的に全てのシアル
酸残基を欠く、HCVエンベロープ糖タンパク質を提供す
ることである。

【００１０】本発明の他の局面は、例えば、分泌または
放出を促進する抗生物質を使用しての酵母での発現、あ
るいは哺乳動物細胞における発現による、末端シアル酸
付加を阻害する条件下でアシアロE1あるいはE2を産生す
る方法である。

【００１１】本発明のもう一つの局面は、末端マンノー
ス残基あるいは末端N-アセチルグルコサミン残基に結合
する、レクチンに対する親和性によるE1あるいはE2の精
製法である。

【００１２】本発明のもう一つの局面は、免疫原性組成
物であり、これは、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合
わせた、HCV E1およびE2からなる群より選択される組換
えアシアロ糖タンパク質を含む。所望で有れば、必要に
応じて、免疫学的アジュバントが含まれ得る。

【００１３】本発明のもう一つの局面は、イムノアッセ
イ試薬であり、これは適切な支持体と組み合わせた、HC
V E1およびE2からなる群より選択される組換えアシアロ
糖タンパク質を含む。本発明の他のイムノアッセイ試薬
は、適切な検出標識と組み合わせた、HCV E1およびE2か
らなる群より選択される組換えアシアロ糖タンパク質を
含む。

【００１４】本発明のもう一つの局面は、E1および／あ
るいはE2のダイマーおよび高次凝集体（higher-order-a
ggregates）に関する。本発明の１種はE2複合体であ
る。本発明の他の種は、E1:E2ヘテロダイマーである。

【００１５】本発明のもう一つの局面は、E1:E2凝集体
および薬学的に受容可能なキャリアを含むHCVワクチン
組成物である。

【００１６】本発明のもう一つの局面は、E1:E2複合体
の精製方法である。

【００１７】本発明のもう一つの局面は、以下の(a)、
(b)および(c)の工程を包含する、細胞培養物中でのHCV
の増殖の方法である：(a)マンノースレセプターおよび
アシアロ糖タンパク質レセプターからなる群より選択さ
れるレセプターを発現する細胞を供給する工程；(b)細
胞をHCVで感染させる工程；および(c)感染細胞を培養す
る工程。好ましくは、細胞は組換えレセプターを発現す
る。

【００１８】

【発明の実施の形態】

定義用語「アシアロ糖タンパク質」とは、実質的にシアル酸
成分を含まないグリコシル化タンパク質のことである。
アシアロ糖タンパク質は、組換え、あるいは、細胞培養
または天然源からの精製により調製され得る。まさに、
好ましいアシアロ糖タンパク質は、HCV、好ましくは糖
タンパク質E1およびE2、最も好ましくは組換えE1および
E2（rE1およびrE2）由来である。シアル酸残基の量が、
実質的に糖タンパク質の、GNAのなどのマンノース結合
タンパク質への結合を阻害しない量であれば、この定義
範囲内では、タンパク質は、シアル酸を「含まない」。
シアル化の程度は一般的には、全N結合炭水化物の約40
％未満がシアル酸であり、より好ましくは約30％未満で
あり、より好ましくは約20％未満であり、より好ましく
は約10％未満であり、より好ましくは約５％未満であ
り、最も好ましくは約２％未満である。

【００１９】本明細書に使用されている用語「E1」は、
HCVポリタンパク質の最初の400アミノ酸以内に発現され
るタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、とき
にはＥあるいはＳタンパク質と呼ばれる。これは、その
天然形態において、膜に強く結合されていることが見い
だされる、35kDの糖タンパク質である。ほとんどの天然
のHCV株では、E1タンパク質は、ウイルスポリタンパク
質中でＣ（コア）タンパク質の後にコードされる。E1タ
ンパク質は、ポリタンパク質全長の約192アミノ酸から
約383アミノ酸に広がる。本明細書に使用されている用
語「E1」には、天然E1と免疫学的に交差反応性であるア
ナログおよび先端切断型変異体もまた含まれる。

【００２０】本明細書に使用されている用語「E2」は、
HCVポリタンパク質の最初の900アミノ酸以内に発現され
るタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、とき
にはNS1タンパク質と呼ばれる。これは、その天然形態
において、膜に強く結合されていることが見いだされ
る、72kDの糖タンパク質である。ほとんどの天然のHCV
株では、E1タンパク質はE1タンパク質に続く。E2タンパ
ク質は、約384アミノ酸から約820アミノ酸に広がる。本
明細書に使用されている用語「E2」には、天然E2と免疫
学的に交差反応性であるアナログおよび先端切断型変異
体もまた含まれる。

【００２１】本明細書に使用されている用語「凝集体」
とは、１つより多いE1あるいはE2モノマーを含むE1およ
び／またはE2の複合体のことである。E1:E1ダイマー、E
2:E2ダイマーならびにE1:E2ヘテロダイマーは、すべて
この定義内の「凝集体」である。本発明の組成物はま
た、より大きい凝集体を含み得、800kDを越える分子量
を有し得る。

【００２２】本明細書に使用されている用語「粒子」と
は、電子顕微鏡により見える、少なくとも20 nmの直径
を有する、E1、E2、あるいはE1／E2凝集体のことであ
る。好ましい粒子は、電子顕微鏡によってみとめられ
る、だいたい円形形状で約40nmの直径を有する。

【００２３】本明細書中でタンパク質に適用されている
用語「精製された」とは、所望のタンパク質が、組成物
中の総タンパク質成分の少なくとも35％を含む組成物の
ことである。所望のタンパク質は、総タンパク質成分の
好ましくは少なくとも40％、さらに好ましくは少なくと
も約50％、さらに好ましくは約60％、さらに好ましくは
約70％、さらに好ましくは約80％、さらに好ましくは約
90％、および最も好ましくは約95％を構成する。この組
成物は、本明細書に使用されてる純度の決定に影響しな
い、炭水化物、塩、脂質、溶媒などの他の化合物を含み
得る。「単離された」HCVアシアロ糖タンパク質とは、
純度が少なくとも35％のHCVアシアロ糖タンパク質組成
物を意味する。

【００２４】本明細書に使用されている「マンノース結
合タンパク質」とは、レクチンあるいはマンノース末端
グリコシル化されたタンパク質（例えば、アシアロ糖タ
ンパク質）に特異的に結合する他のタンパク質のことを
意味し、これらの例には、マンノース結合レクチン、マ
ンノース末端グリコシルに特異的な抗体、マンノースレ
セプタータンパク質（R.A.B. Ezekowitzら、J Exp Med
(1990) 176:1785-94）、アシアロ糖タンパク質レセプタ
ータンパク質（H. Kurataら、J Biol Chem (1990) 265:
11295-98）、血清マンノース結合タンパク質（I. Schuf
feneckerら、Cytogenet Cell Genet (1991) 56:99-102;
K. Sastryら、J Immunol (1991) 147:692-97）、血清
アシアロ糖タンパク質結合タンパク質などが含まれる。
マンノース結合レクチンには、例えば、GNA、コンカナ
バリンＡ（ConA）ならびに同様の結合性を有する他のレ
クチンが含まれる。

【００２５】用語「GNAレクチン」とは、マンノース末
端糖タンパク質に結合する市販のレクチン、Galanthus
nivalusアグルチニンのことである。

【００２６】本明細書に使用されている「組換え」糖タ
ンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現される糖
タンパク質であり、糖タンパク質をコードする構造遺伝
子は、天然ではこの構造遺伝子に隣接していない調節配
列の制御下に発現されるか、あるいはその構造遺伝子は
改変されている。例えば、E1構造遺伝子が、酵母グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GA
PDH）プロモーターの機能性フラグメントの制御下に配
置されたベクターを形成し得る。酵母での使用に好まし
いプロモーターは、米国特許第4,880,734号に記載のハ
イブリッドADH2/GAPプロモーターであり、これは、アル
コールデヒドロゲナーゼ２由来の上流の活性化配列と組
み合わせてGAPDHプロモーターのフラグメントを利用す
る。構造遺伝子の改変には、縮重コドンでの別のコドン
の置換（例えば、宿主に好ましいコドンの使用、制限酵
素切断部位の削除あるいは形成、ヘアピン形成の制御の
ためになど）、ならびに異なるアミノ酸をコードする限
定数のコドンの置換、挿入あるいは欠損（天然アミノ酸
配列の、好ましくは約10％未満、より好ましくは約５％
未満が変えられるべきである）などが含まれる。同様
に、「組換え」レセプターとは、組換えポリヌクレオチ
ドから発現されたレセプタータンパク質のことであり、
レセプターをコードする構造遺伝子は、天然では構造遺
伝子に隣接しない調節遺伝子の制御下に発現されるか、
あるいはその構造遺伝子は改変されている。

【００２７】用語「単離されたポリペプチド」とは、他
のHCVウイルス成分、特にポリヌクレオチドを実質的に
含まないポリペプチドのことである。組成物中のポリペ
プチドの重量が、そのポリペプチドと他の成分と合わせ
た重量の少なくとも70％、より好ましくは約80％、さら
に好ましくは約90％、そして最も好ましくは95％あるい
はそれ以上である場合には、ポリペプチド組成物は、他
の成分を「実質的に含まない」。例えば、100μg/mLのE
1および3μg/mLのみの他のHCV成分（例えば、DNA、脂質
など）を含む組成物は、「他のHCVウイルス成分」を実
質的に含まず、従って、この定義の範囲内の単離ポリペ
プチドの組成物である。

【００２８】用語「分泌リーダー」とは、タンパク質の
N末端でコードされるときに、翻訳後に宿主細胞培養培
地中にそのタンパク質を分泌されるようにするポリペプ
チドのことである。分泌リーダーは、一般的に使用され
る宿主細胞に由来する。例えば、酵母での使用に適した
分泌リーダーには、Saccharomyces cerevisiaeα因子リ
ーダー（米国特許第4,870,008号を参照のこと）が含ま
れる。

【００２９】用語「下等真核生物」とは、酵母、真菌な
どの宿主細胞のことである。下等真核生物は、一般的に
（必ずというわけではないが）単細胞である。好ましい
下等真核生物は酵母であり、特にSaccharomyces、Schiz
osaccharomyces、Kluveromyces、Pichia、Hansenulaな
どの種である。Saccharomyces cerevisiae、S. carlsbe
rgensisおよびK. lactisは、最も一般的に使用される酵
母宿主ならびに便利な真菌宿主である。

【００３０】用語「高等真核生物」とは、哺乳類、は虫
類、昆虫類などの高等動物由来の宿主細胞のことであ
る。現に好ましい高等真核宿主細胞は、チャイニーズハ
ムスター（例えば、CHO）、サル（例えば、COS細胞）、
ヒトおよび昆虫（例えば、Spodoptera frugiperda）由
来である。宿主細胞は、懸濁あるいはフラスコ培養、組
織培養、器官培養などで供給され得る。

【００３１】用語「カルシウムモジュレーター」とは、
小胞体内にカルシウムイオンを隠ぺいあるいは結合し得
るか、あるいはカルシウム調節タンパク質（例えば、カ
ルシウムチャンネルタンパク質、カルシウムポンプな
ど）に作用することによりER内のカルシウムイオン濃度
に影響する化合物のことである。適切なカルシウムモジ
ュレーターには、例えば、サプシガルジン（thapsigarg
in）、EGTA（エチレングリコールビス[βーアミノエチル
エーテル]N,N,N',N'-テトラアセティックアッシド）が
含まれる。現に好ましいモジュレーターは、サプシガル
ジンである（例えば、O. Thastrupら、Proc Nat Acad S
ci USA(1990) 87:2466-70を参照のこと）。

【００３２】用語「免疫原性」とは、アジュバントの存
在あるいは非存在下で、単独あるいはキャリアと結合し
て、体液性および／または細胞性免疫応答をなす基質の
能力のことである。「中和」とは、感染性物質の感染性
を部分的に、あるいは完全に抑制する免疫応答のことで
ある。「ワクチン」とは、HCVに対する、一部あるいは
完全防御を誘起し得る、個体の治療に有用な免疫組成物
のことである。

【００３３】用語「生物学的液体」とは、血清、血漿、
唾液、胃分泌物、粘液などの器官から得られる流体のこ
とである。一般的には、生物学的液体は、HCV粒子の存
在に対してスクリーニングされる。ある種の生物学的流
体は、血液凝固因子（例えば、因子VIII:C）、血清アル
ブミン、成長ホルモンなどの他の産生物源として使用さ
れる。このような場合には、生物学的液体源がHCVのな
どのウイルスに汚染されていないことが重要である。

【００３４】一般的な方法 HCVゲノムのE1領域は、欧州特許第388,232号に「Ｅ」領
域として、そして一方E2は「NS1」として記載されてい
る。E1領域は、全長ウイルスポリタンパク質中の約192ー
383アミノ酸を有する。E2領域は、約384〜820アミノ酸
を有する。これらのタンパク質の原型の全配列（HCV-1
株）は、タンパク質の一般的なクローニングおよび発現
法と同様に、当該分野では入手可能である（欧州特許第
388、232号を参照のこと）。E1およびE2の両方は、HCVポ
リタンパク質の最初の850〜900アミノ酸をコードするポ
リヌクレオチドから発現され得る。ほとんどの真核宿主
細胞中では翻訳後のプロセッシングで、最初のポリタン
パク質が、Ｃ、E1およびE2に切断される。コーディング
領域の5'末端を切断して、産生されるＣタンパク質量を
減少し得る。

【００３５】アシアロ糖タンパク質の発現は、多くの方
法によりなされ得える。例えば、通常はグリコシル化タ
ンパク質にシアル酸残基を付加しない下等真核生物（酵
母など）中での発現が得れ得る。酵母発現系において
は、タンパク質が翻訳後に培養培地中に発現されるよう
に、S. cerevisiae α因子リーダーなどの分泌リーダー
を使用することが好ましい。さらに、pmr1などのグリコ
シル化欠損変異体を使用することが好ましい。なぜな
ら、これらの変異体は、コアグリコシル化のみ行い、か
なり高効率に異種タンパク質を分泌するからである（H.
K. Rudolphら、 Cell (1989) 58:133-45）。あるいは、
Pichia pastorisなどの他の種の酵母を使用し得る。こ
れは、哺乳類およびS. cerevisiaeに見られるコアグリ
コシル化様式に類似すると考えられている様式で、８〜
９マンノース残基を有する糖タンパク質を発現する。

【００３６】あるいは、哺乳類細胞中の発現を調整して
末端グリコシル化（シアル酸付加）をブロックし得る。
組換え構築物は、タンパク質が小胞体へ方向づけられる
ことを確実にするために、好ましくは分泌シグナルを含
む。ゴルジ体への移送は、E1およびE2自身でブロックさ
れるようである。哺乳類細胞でのE1あるいはE2の高レベ
ルの発現は、小胞体あるいはcisゴルジ体での全ての細
胞タンパク質の分泌を妨げるようである。さらに、グリ
コシル化欠損変異体を使用し得る。例えば、P.Stanley,
Ann Rev Genet (1984) 18:525-52を参照のこと。グリ
コシル化あるいは移送変異体が、シアル化を伴ってE1あ
るいはE2を発現する場合には、ノイラミニダーゼによる
処理によって末端シアル酸残基を除去し得る。

【００３７】収量は、小胞体内からのタンパク質の放出
を得るためのカルシウムモジュレーターの使用により増
加されるべきである。

【００３８】適切なモジュレーターには、サプシガルジ
ン、EGTA、ならびにA23817（例えば、O. Thastrupら、P
roc Nat Acad Sci USA (1990) 87:2466-70を参照のこ
と）が含まれる。例えば、組換えワクシニアウイルス
ベクターによるトランスフェクションにより、哺乳類細
胞（例えば、CHO、COSならびにヘラ（HeLa）細胞など）
の細胞内に多量のE1あるいはE2を発現させ得る。タンパ
ク質の発現および小胞体内の蓄積後、ER内容物の放出を
起こすのに十分な濃度のカルシウムモジュレーターに細
胞を曝す。次に、培養培地からタンパク質を回収し、培
地は次のサイクル用に取り替える。

【００３９】さらに、先端切断型のエンベロープタンパ
ク質を発現させるのが好都合である。E1およびE2の両方
は、高疎水性ドメインを有するようであり、これは明ら
かにタンパク質を小胞体内のとどめ、効率よい放出を妨
げる。従って、E1の170〜190アミノ酸、260〜290アミノ
酸あるいは330〜380アミノ酸（ポリタンパク質のはじめ
からの番号）の１つ以上の領域、並びにE2の660〜830ア
ミノ酸（例えば、欧州特許第388、232号の図20-1を参
照）の配列の部分を欠失することが望まれ得る。これら
の疎水性ドメインの少なくとも１つは、そのタンパク質
の抗原性に必須ではなく、不利な影響もなく欠失し得
る、トランスメンブラン領域を形成する。欠失に最も適
した領域は、通常専門家の技術による少数の欠失実験の
実施により決定し得る。E2の疎水性３'末端の欠失によ
り、発現されたE2部分の分泌の結果になる。このとき、
分泌されたタンパク質のシアル化をともなう。発現を得
るために種々の任意のベクターが使用され得る。酵母な
どの下等真核生物は、典型的には、カルシウムリン酸沈
澱法を用いてプラスミドにより形質転換されるか、ある
いは組換えウイルスにより形質転換される。ベクター
は、独立して宿主細胞内で複製され得るか、あるいは宿
主細胞ゲノムに組み込まれ得る。より高等な真核生物
は、プラスミドにより形質転換され得るが、典型的には
組換えウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルスに
感染される。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現
を停止させ得るので、ワクシニアが特に好ましい。まさ
に好ましい宿主細胞には、ヘラならびに形質細胞腫（pl
asmacytoma）細胞系が含まれる。この系では、宿主ER中
に主要なグリコシル化種としてE1およびE2が蓄積するこ
とを意味する。rE1およびrE2は、マンノース末端化され
ている主要な糖タンパク質であるので、末端マンノース
残基に結合するGalanthus nivalusアグルチニン（GNA）
などのレクチンを使用して細胞から容易に精製され得
る。

【００４０】マンノース末端糖タンパク質として天然に
発現されるタンパク質は、哺乳動物生理学上比較的まれ
である。ほとんどの場合において、哺乳動物の糖タンパ
ク質は、グリコシル化経路での一過的な中間産物として
のみマンノース末端化されている。組換え的に発現され
たHCVエンベロープタンパク質がマンノース末端グリコ
シル、あるいは（より低い程度の）N-アセチルグルコサ
ミンを有する事実は、HCVタンパク質および全ビリオン
（viron）が分離され、そして末端マンノースあるいはN
-アセチルグルコサミンに特異的なレクチンを用いて、
内因性タンパク質から部分的に精製され得ることを意味
する。組換えタンパク質は真正であり、成熟遊離ビリオ
ンに見いだされるエンベロープタンパク質、あるいは細
胞結合エンベロープタンパク質の形態と本質的に同じで
あると考えられている。従って、GNAなどのレクチン
を、マンノース末端タンパク質、ならびにWGA（コムギ
胚芽アグルチニン）およびN-アセチルグルコサミン末端
タンパク質の等価物に対して使用し得る。例えばワクチ
ンあるいはイムノアッセイに使用するために抗原を生成
するときの精製のために、E1およびE2を、細胞培養上清
および他の液体から分離するために、固相に結合させた
レクチンを使用し得る。

【００４１】あるいは、HCV感染が疑われる被検者から
の液体あるいは組織サンプルから、E1、E2あるいはHCV
ビリオンを分離するために適切なレクチンを供給し得
る。マンノース末端糖タンパク質は比較的まれであるの
で、このような方法は、実質的にバックグラウンドを減
少させて、試料中に存在するタンパク質を精製するのに
役立つ。レクチンに結合後、HCVタンパク質は抗HCV抗体
を用いて検出され得る。あるいは、全ビリオンが存在す
る場合には、HCVゲノムの保存領域（例えば、５'非コー
ディング領域）に特異的なPCR法または他の核酸増幅法
によりHCV核酸を検出し得る。この方法で、例えば、新
しい株が抗体の調製に使用される株と免疫学的交差反応
性でない場合には、抗原の変動あるいは変化に関わらず
HCVの異なる株の分離および特徴づけができる。特定の
レクチンによる、マンノース末端糖タンパク質特有の認
識を都合よく利用する多くの他の方法がある。例えば、
HCVビリオンあるいはタンパク質の夾雑が疑われる試料
を、ビオチンあるいはアビジン標識レクチンとインキュ
ベートして、タンパク質−レクチン複合体を沈澱させ得
る。さらに、治療上の使用のために、例えば、GNAに抗
ウイルス化合物を結合することにより、化合物をビリオ
ンに標的づけるために、レクチンのHCVタンパク質に対
する親和性を使用し得る。あるいは、血清または血漿か
らマンノース末端糖タンパク質を除去するために適切な
レクチンを使用して、HCV汚染の危険性を軽減あるいは
削除し得る。

【００４２】固定化マンノース結合タンパク質、特にCo
nAあるいはGNAなどのレクチンとのインキュベーション
により、粗細胞溶解物からE1および／またはE2アシアロ
糖タンパク質を単離するのがまさに好ましい。例えば、
細胞を低張緩衝液中で機械的に破砕して溶解し、その後
遠心分離して核溶解物を調製し、さらに遠心分離して粗
ミクロソーム膜画分を得る。次に、粗膜画分をトリトン
X-100、NP40などの界面活性剤を含む緩衝液に溶解す
る。この界面活性剤抽出物をさらに遠心分離して不溶性
粒子を沈降させ、得られた透明溶解物を、固定化マンノ
ース結合タンパク質、好ましくはアガロースあるいはセ
ファロース(「登録商標」)などに結合されたGNAを有す
るクラマトグラフィーカラム中で、結合に十分な時間の
間、典型的には16〜20時間インキュベートする。次に、
この懸濁物を、E1/E2が溶出液中に現れるまでカラムに
かけ、次に、結合に十分な時間の間、典型的には約12〜
24時間の間カラム中でインキュベートする。次に、結合
された物質を界面活性剤（トリトンX-100、NP40など）
を含む別の緩衝液で洗浄し、マンノースで溶出して、精
製アシアロ糖タンパク質を供給する。溶出に際しては、
タンパク質が溶出物中に現れはじめるまでのみ溶出する
ことが好ましく、その時点で溶出を停止し、そしてタン
パク質の溶出を進める前にカラムを2ー3時間平衡化させ
る。このことで、大きなタンパク質凝集体が徐々に離脱
する速度に対して十分な時間を与えると考えられる。E1
およびE2が天然形態（すなわち、膜結合ドメインの切断
なしに）でいっしょに発現される場合には、アシアロ糖
タンパク質の実質的な画分は、E1:E2凝集体として現れ
る。電子顕微鏡での試験では、この凝集体の有意部分
は、直径約40nmのだいたい球状の粒子であり、これは完
全なウイルスと予測される大きさである。これらの粒子
は、自己構成サブウイルス粒子（self-assemmbling sub
viral particles）であるようだ。これらの凝集体は、
真正HCVビリオン粒子に非常に類似した四次構造を示す
ことが予測され、従って、高免疫原性ワクチンとして作
用することが予測される。

【００４３】E1／E2複合体はさらに、例えば、Fractoge
l-DEAEあるいはDEAE-Sepharose(「登録商標」)の塩基性
媒体上でのゲルクロマトグラフィーにより精製され得
る。Fractogel-DEAEゲルクロマトグラフィーを使用し
て、純度約60〜80％のE1/E2複合体が得られる。さら
に、E1は０〜１のLys残基を有するので、リシンプロテ
アーゼ処理により精製され得る。複合体のリシンプロテ
アーゼ処理は、E2を破壊してE1を容易に分離する。

【００４４】HCVの組織特異性は、HCVエンベロープ糖タ
ンパク質がマンノース末端化されていることの観察と組
み合わせて、そのウイルスが宿主細胞への入口を得るた
めに、マンノースレセプターあるいはアシアロ糖タンパ
ク質レセプター（ASGR）を使用することを示唆する。マ
ンノースレセプターは、マクロファージおよび肝ジヌソ
イド細胞（sinusoidal cells)上に、一方、ASGRは実質
肝細胞（parenchymal hepatocytes）上に見られる。従
って、これらのレセプターの１つあるいは両方を発現す
る宿主細胞の使用により、HCVを培養することが可能で
ある。レセプターが維持される条件を用いて、天然にレ
セプターを発現する一次細胞培養物を使用するか、ある
いは、レセプター発現用のベクターで、ヘラ、CHO、COS
などの他の細胞系をトランスフェクトし得る。マンノー
スレセプターのクローニングならびにそのトランスフェ
クション、および線維芽細胞での発現は、M.E. Taylor
ら、JBiol Chem (1990) 265:12156-62に実証されてい
る。ASGRのクローニングおよび配列決定は、K. Drickam
erら、J Biol Chem (1984) 259:770-78ならびにM. Spie
ssら、Proc Nat Acad Sci USA (1985) 82:6465-69に、
ラットHTC細胞での、機能性ASGRのトランスフェクショ
ンおよび発現は、M. McPhaulおよびP. Berg, ProcNat A
cad Sci USA (1986) 83:8863-67ならびにM. McPhaulお
よびP. Berg, Mol Cell Biol (1987) 7:1841-47に記載
されている。従って、１つあるいは両方のレセプターを
適切な細胞系にトランスフェクトすることは可能であ
り、得られた細胞をHCVの培養での増殖のために宿主と
して使用することが可能である。このような培養でのHC
Vの継代により、生ワクチンとしての使用に適した弱毒
化株の開発がなされる。レセプターが維持される条件を
用いて、天然にレセプターを発現する一次細胞培養物を
使用するか、あるいは、レセプター発現用のベクター
で、ヘラ、CHO、COSなどの他の細胞系をトランスフェク
トし得る。マンノースレセプターのクローニングならび
にそのトランスフェクション、および線維芽細胞での発
現は、Taylorら、上記で示されており、一方、ラットHT
C細胞での機能性ASGRのトランスフェクションおよび発
現は、McPhaulら、上記に記載されている。１つあるい
は両方の組換えレセプターでトランスフェクトされた固
定化細胞系を使用するのが好ましい。

【００４５】免疫原性組成物は、当該分野に公知の方法
に従って調製され得る。この組成物は、ポリペプチド、
例えば、E1、E2、あるいはE1／E2粒子組成物の免疫原性
量を、通常は薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせ
て含有し、好ましくはさらにアジュバントを含有する。
「カクテル"cocktail"」が所望である場合には、例え
ば、E1にE2を加えた抗原など、HCVポリペプチドの組み
合わせ物を、効果を高めるためにともに混合し得る。E1
/E2凝集体のウイルス様粒子は、ことに有用なワクチン
抗原を提供すると考えられる。免疫原性組成物は、抗体
の産生を誘発するために、抗体原の提供あるいは動物内
に防御免疫性を誘導するために、動物に投与され得る。

【００４６】薬学的に受容可能なキャリアには、組成物
を受け入れる個体に対して、それ自身が有害な抗体産生
を誘発しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリ
アは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポ
リグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマ
ーなどの、大きな、徐々に代謝される高分子および不活
性ウイルス粒子である。このようなキャリアは、当業者
には公知である。

【００４７】組成物の効果を促進する好ましいアジュバ
ントには、限定はされないが、水酸化アルミニウム（al
um）、米国特許第4,606,918号に記載されているN-アセ
チル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thr-M
DP）、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグ
ルタミン（nor-MDP）、N-アセチルムラミル-L-アラニル
-D-イソグルタミニル-L-アラニン-２-(1'-2'-ジパルミ
トイル-sn-グリセロ-３-ヒドロキシホスホリルオキシ)-
エチルアミン（MTP-PE）およびRIBIが含まれ、これに
は、２％squalene／Tween(「登録商標」) 80乳液中に細
菌から抽出された３つの成分、モノホスホリルリピッド
Ａ、トレハロースジマイコレートおよび細胞壁組織（MP
L+TDM+CWS）が含まれる。さらに、Stimulon （Cambridg
e Bioscience, Worcester, MA）などのアジュバントが
使用され得る。そのうえに、完全フロイントアジュバン
ト（CFA）および不完全フロイントアジュバント（IFA）
が、ヒト以外の適用ならびに研究用に使用され得る。

【００４８】免疫原性組成物は、典型的には、水、生理
食塩水、グリセロール、エタノールなどの薬学的に受容
可能な賦形剤を含有する。さらに、加湿剤あるいは乳化
剤、pH緩衝剤などの補助物質がこのような賦形剤に含有
され得る。

【００４９】典型的には、免疫原性組成物は、注射し得
るように液体あるいは懸濁液のいずれかに調製され得、
注射前の液体賦形剤に、溶液または懸濁液にするのに適
した固形もまた調製され得る。この調製物はさらに、ア
ジュバントの効果を促進するために乳化あるいはリポソ
ーム中にカプセル化され得る。

【００５０】ワクチンとして使用される免疫原性組成物
は、免疫原性的に有効な量のHCVポリペプチド、および
必要に応じて上記の任意の成分を含有する。「免疫原性
的に有効な量」とは、単回投与量あるいは一連の投与量
の一部において、個体に投与される量が、上記定義のよ
うに、治療に有効であることを意味する。この量は、治
療される個体の健康および生理的条件、治療される個体
の分類学上の群（例えば、ヒト以外の霊長類、霊長類な
ど）、抗体を合成するための個体免疫系の能力、所望の
防御の程度、ワクチンの調剤、治療医の医学上の評価、
感染させるHCVの株、ならびに他の関連要因に依存して
変化する。この量は、比較的に広範囲にあるので、所定
の試験により決定されることが期待される。

【００５１】自己構成E1/E2凝集体はまた、ワクチンキ
ャリアとして働き、B型肝炎表面抗原と同様の様式で、
異種（非HCV）ハプテンを提供し得る（欧州特許第174,4
44号を参照のこと）。この使用においては、E1／E2凝集
体は、その凝集体に結合されたハプテンあるいは抗原に
対して免疫応答を刺激し得る免疫原性キャリアを提供す
る。抗原は、従来の化学的方法により結合されるか、あ
るいはE1および／またはE2をコードする遺伝子へ、その
タンパク質の親水性領域に相当する配置に、クローン化
され得る。免疫原性組成物は、典型的には皮下注射ある
いは筋肉内注射などによって、通常非経口的に投与され
る。さらに、他の投与形態に適した処方剤には、経口処
方剤あるいは坐薬が含まれる。投薬処置は、単回投与計
画あるいは複数回投与計画であり得る。ワクチンは、他
の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

【００５２】

【実施例】以下に示されている実施例は、当該分野の専
門家にさらに説明するために提供されていて、いかなる
方法においても限定することを意味していない。

【００５３】実施例１（クローニングおよび発現）（Ａ）ベクターを、欧州特許第318,216号および欧州特
許第388,232号に記載されているように、HCVゲノムの
５'部分を有するプラスミドから構築した。カセットHCV
(S/B)は、Met₁にあたる−63ヌクレオチドから始まる、M
et₁からLeu₉₀₆までのポリタンパク質の５'末端をコード
するStuI-BglII DNAフラグメントを有する。これには、
コアタンパク質（Ｃ）、E1タンパク質（またときにはＳ
と言う）、E2タンパク質（またときにはNS1と言う）、
ならびにNS2a領域の５'部分が含まれる。構築物の発現
に際しては、個々のＣ、E1およびE2タンパク質がタンパ
ク質分解プロセッシングにより産生される。

【００５４】カセットHCV(A/B)は、Met₁にあたる−６ヌ
クレオチドから始まる、Met₁からLeu₉₀₆までのポリタン
パク質の５'末端をコードするApaLI-BglII DNAフラグメ
ントを有する。これには、コアタンパク質（Ｃ）、E1タ
ンパク質（またときにはＳと言う）、E2タンパク質（ま
たときにはNS1と言う）、ならびにNS2a領域の５'部分が
含まれる。構築物の発現に際しては、個々のC、E1およ
びE2タンパク質がタンパク質分解プロセッシングにより
産生される。

【００５５】カセットC-E1(S/B)（StuI-BamHI部分）
は、Met₁からIle₃₄₀までの５'末端（遺伝子中のBamHI部
位）を有する。このカセットの発現で、Ｃおよび多少の
先端切断型のE1（E1'）が発現される。３'末端から切り
だされた部分は、トランスロケーションシグナルとして
作用すると考えられている疎水性領域である。

【００５６】カセットNS1(B/B)（BamHI-BglII部分）
は、E1の小さな３'部分（Met₃₆₄から）、全E2、ならび
にNS2a部分（Leu₉₀₆まで）を有する。この構築では、E1
フラグメントはトランスロケーションシグナルとして作
用する。

【００５７】カセットTPA-NS1は、ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター（tPA）リーダーを、E1の３'部分
のかわりにトランスロケーションシグナルとして使用す
る。このカセットは、Gly₄₀ ₆からGlu₆₆₁までのE2の先端
切断型を有し、ここでは疎水性３'末端は欠失されてい
る。

【００５８】各カセットを、T7およびインビトロにおけ
るウサギ網状赤血球発現による転写および翻訳のため
の、合成β-グロビン５'非コーディング配列をともなっ
たベクターpGEM3Zと、この配列を伴わないベクターとに
挿入した。組換えワクシニアウイルス（rVV）ベクター
を、Charkrabartyら、Mol Cell Biol (1985) 5:3403ー09
に記載されているように、そのカセットをプラスミドpS
C11（Dr. B. Moss, NIHから得た）に挿入し、その後ワ
クシニアウイルスと再度組み合わせて調製した。

【００５９】（Ｂ）かわりの発現ベクターを、Charkrab
artyら、Mol Cell Biol (1985) 5:3403-09に記載されて
いるように、pSC59（Dr. B. Moss, NIHから得た）のStu
I部位とSpeI部位との間にHCV(A/B)を挿入し、その後ワ
クシニアウイルスと再度組み合わせて構築した。

【００６０】（Ｃ）ヘラS3細胞を、500mLの滅菌遠心ボ
トル（JA-10ローター）中で、室温にて、2000rpm、7分
間遠心分離して回収した。ペレットを、別の培養培地
（Joklik改変MEM撹拌培地（Spinner medium）＋５％ウ
マ血清およびゲンタマイシン）（「撹拌培地」）中に最
終濃度2×10⁷細胞／mLに再懸濁した。音波処理した粗vv
/SC59-HCVウイルスのストックを、細胞あたり８pfuの複
数回感染で加え、混合物を37℃で30分間撹拌した。次
に、感染細胞を8Lの撹拌培地を入れた撹拌フラスコに移
し、37℃で３日間インキュベートした。

【００６１】次に、培養細胞を遠心分離して回収し、ペ
レットを緩衝液（10mM トリス-HCl、pH 9.0、152mL）に
再懸濁させた。次に、細胞を40mLのDounce Homogenizer
（50ストローク）によりホモジナイズし、核を遠心分離
（５分間、1600rpm、４℃、JA-20ローター）してペレッ
トにした。核ペレットをトリス緩衝液（24mL）に再懸濁
し、再度ホモジナイズしてペレットにし、全上清を集め
た。

【００６２】集めた溶解物を、10mLずつにわけ、カップ
ホルンソニケーター（cuphorn sonicator）で、中程度
の出力で、３×30分音波処理した。音波処理された溶解
物（15mL）を、SW28遠心チューブ中で、17mLのスクロー
スクッション（36％）に重ねて、４℃で80分間、13,500
rpmで遠心分離してウイルスをペレットにした。そのウ
イルスペレットを１mLのトリス緩衝液（１mM トリスHC
l、pH 9.0）に再懸濁し、−80℃で凍結した。

【００６３】実施例２（インビトロ産生物とインビボ産生物との比較）（Ａ）E1およびE2を、上記実施例１に記載のベクターを
用いて、インビトロおよびインビボの両方で発現させ、
³⁵S-Met標識した。BSC-40およびヘラ細胞を、インビボ
発現用にrVVベクターに感染させた。培地および細胞溶
解物を組換えタンパク質について試験した。産生物は、
ヒトHCV免疫血清により免疫沈降させ、一方、インビト
ロタンパク質は直接分析した。得られたタンパク質をSD
S-PAGEにより分析した。

【００６４】網状赤血球（reticulocyte）発現系（HCV
(S/B)あるいはHCV(A/B)を有するpGEM3Z）は、それぞれ
分子量18kD、35kDおよび72kDを有するＣ、E1およびE2を
産生した。BSC-40およびヘラ細胞の溶解物を、同じタン
パク質を提示するHCV(S/B)、HCV(A/B)あるいはC-E1(S/
B)を有するrVVでトランスフェトした。網状赤血球系は
効率のよいゴルジプロセッシングを供給せず、従ってシ
アル酸を供給しないので、インビトロおよびインビボ産
生物が等しい移動度を示す事実は、タンパク質がインビ
ボにおいてシアル化されていないことを示唆する。TPA-
NS1を有するrVVベクターは、E2の細胞外分泌を促し、こ
れはシアル化に一致する移動度の変化を示した。

【００６５】（Ｂ）HCV(S/B)を、インビトロで発現さ
せ、ビオチン化レクチンのパネルとインキュベートし
た。すなわち、GNA、SNA、PNA、WGAおよびConA。インキ
ュベーションの後、複合体をアビジン−アクリルビーズ
上に集めて、洗浄し、Laemmli試料緩衝液で溶出し、SDS
-PAGEで分析した。結果は、E1およびE2がGNAおよびConA
に結合したことを示した。このことはマンノースの存在
を示している。GNAは末端マンノース基に結合し、一
方、ConAはα結合マンノースに結合する。SNA、PNAおよ
びWGAに結合しないことは、タンパク質がシアル酸、ガ
ラクトース-N-アセチルガラクトサミン、あるいはN-ア
セチルグルコサミンを含まないことを示す。

【００６６】（Ｃ）放射標識E1およびE2を、HCV(S/B)
（vv/SC11-HCV）を有するrVVに感染させることによりBS
C-40中に産生し、ヒトHCV⁺免疫血清で免疫沈降させた。
免疫沈降させた物質の半分をノイラミニダーゼで一晩処
理して、すべてのシアル酸を除去した。処理後、処理お
よび未処理タンパク質をSDS-PAGEで分析した。移動度に
は有意な差は観察されなかった。このことはインビボで
はシアル化はされていないことを示す。

【００６７】（Ｄ）放射標識E1およびE2を、HCV(A/B)
（vv/SC59-HCV）を有するrVVに感染させることによりBS
C-40細胞中に産生し、コントロールとしてHCV配列を含
まないvv/SC11を用いて、ヒトHCV⁺血清で免疫沈降させ
るか、あるいはアクリルビーズに結合されたビオチン化
GNAレクチンにより沈澱させた。沈澱物をSDS-PAGEで分
析した。データは、E1およびE2が、vv/SC59-HCV感染細
胞中の主要なマンノース末端タンパク質種であることを
実証した。GNAは、E1およびE2を細胞培養培地から沈澱
させるのに、ヒト抗血清と同程度に有効である。25kDの
成分が観察されたが、これはワクシニア感染細胞に特異
的であるようだ。

【００６８】実施例３（レクチンを用いた精製）（Ａ）ヘラS3細胞に、精製高力価vv/SC59-HCVウイルス
のストックを、５pfu／細胞の感染多重度で接種し、混
合物を37℃で30分間撹拌した。次に、感染細胞を８Lの
撹拌培地を入れた撹拌フラスクコに移し、37℃で３日間
インキュベートした。再度、細胞を遠心分離により集め
て、氷上で低張緩衝液（20mM HEPES、10mMNaCl、１mM M
gCl₂、120mL）に再懸濁させた。次に、細胞をDounce Ho
mogenizer（50ストローク）でホモジナイズし、核を遠
心分離（５分間、1600rpm、４℃、JA-20ローター）して
ペレットにした。ペレットを集めて、48mLの低張緩衝液
に再懸濁し、再度ホモジナイズし、再度遠心分離し、再
度集めて、−80℃で凍結した。

【００６９】次に、凍結上清を解凍して、核溶解後のミ
クロソーム膜画分を、JA-20ローターでの13、500rpm、４
℃における20分間の遠心分離により単離した。上清を吸
引して除去した。

【００７０】ペレットを、96mLの界面活性剤緩衝液（20
mMトリス-HCl、100mM NaCl、１mM EDTA、１mM DDT、0.5
％トリトンX-100、pH 7.5）に取り出し、ホモジナイズ
（50ストローク）した。生成物を、13、500rpm、４℃に
おける20分間の遠心分離により透明にし、上清を集め
た。

【００７１】GNA-アガロースカラム（１cm×３cm、３mg
GNA/mLビーズ、６mLベッド容量、Vector Labs, Burlin
game, CA）を界面活性剤緩衝液で予め平衡化した。上清
試料を４℃で16〜20時間、流速１mL／分で繰り返し循環
（recirculation）によりカラムにかけた。次に、カラ
ムを界面活性剤緩衝液で洗浄した。

【００７２】精製E1/E2タンパク質を、流速0.5mL／分で
α-D-マンノシド（界面活性剤緩衝液中0.9M）により溶
出した。E1/E2が溶出液中に出現したとき溶出を停止
し、カラムを２〜３時間再度平衡化した。画分をウエス
タンブロットおよび銀染色により分析した。ピーク画分
を集め、UV照射して残存するワクシニアウイルスを不活
性化した。

【００７３】（Ｂ）GNA-アガロース精製のE1およびE2ア
シアロ糖タンパク質を20〜60％グリセロールグラジェン
トで沈澱させた。グラジェントにかけたものを分画し、
タンパク質をSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング
により分析した。ブロットをGNAでプローブしてE1およ
びE2を同定した。得られた結果により、E1:E2ヘテロダ
イマーの存在が示され、これは予測された速度で沈澱す
る（すなわち、110kDタンパク質の位置の特徴）。HCVエ
ンベロープタンパク質のより大きな凝集体もまた出現す
る。E2:E2ホモダイマーもまた出現した。分別したE1:E2
種もまた検出されたが、E2が、E1に比較してより大きな
種であって、重なって再出現したようであった。より大
きな凝集体は、チログロブリンマーカーより有意に速く
沈澱した。

【００７４】（Ｃ）GNA-アガロース精製のE1およびE12
を、１mM EDTAを含有する20〜60％グリセロールグラジ
ェントにより沈澱させた。画分を、β-メルカプトエタ
ノール（βME）の存在および不存在でSDS-PAGEにより分
析した。βMEの存在あるいは不存在でのE1およびE2の外
見上の量には、ほとんどあるいは全く相違は観察されな
かった。このことは、ヘテロダイマー間のジスルフィド
結合がないことを示す。

【００７５】（D）E1/E2複合体（純度約40%）を、Coult
er DM-4サブミクロン粒子分析機で分析した。20〜60nm
レンジで物質を検出した。

【００７６】（E）E1/E2複合体（純度約40％）を、ホス
ホタングステン酸によるネガティブ染色で電子顕微鏡に
より分析した。電子顕微鏡写真は、直径約40nmの球状形
の粒子の存在を示した。E1/E2複合体をHCV⁺ヒト免疫血
清とインキュベートし、次に、ネガティブ染色でEMによ
り分析をした。大きな凝集体を有する抗体複合体および
小さな粒子を観察した。

【００７７】実施例４（クロマトグラフフィーによる精製）（A）実施例３に記載のように調製したGNAレクチン精製
物質（0.5〜0.8mL）を10×緩衝液Ａ（20mM リス-Cl緩衝
液、pH 8.0、１mM EDTA）で希釈し、緩衝液Ａで平衡化
した、1.8×1.5cmのFractogel EMD DEAE-650（EM Separ
ations, Gibbstown, New Jersey, カタログ番号16883）
にかけた。E1/E2を含むタンパク質画分を、同じ緩衝液
で流速0.2mL／分で溶出し、１mLずつの画分を集めた。E
1およびE2を含む画分（SDS-PAGEで決定した）を集め
て、−80℃で凍結した。

【００７８】（Ｂ）上記パート（Ａ）で精製した物質
は、SDS-PAGEによる評価で、60〜80％の純度を有する。
推定E1およびE2のバンドの同定は、転移法（transfer t
echnique）を用いた後のN-末端配列分析により確認し
た。実際には、fractogel-DEAE精製のE1/E2物質を、Lae
mmli緩衝液（pH 6.8、0.06M トリス-Cl、2.3％ SDS、10
％グリセロール、0.72M β-メルカプトエタノール）を
加えて還元し、３分間煮沸した。次に、試料を10％ポリ
アクリルアミドゲルにのせた。SDS-PAGE後、タンパク質
を、0.2μmのポリビニリデンジフルオライド（PVDF）膜
（Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA）に移した。予
測される推定E1およびE2タンパク質のバンドをブロット
から切り出し、N-末端アミノ酸分析を行った。物質の調
製の間のアミノ末端のブロックを妨げることは特別には
しなかった。最初の15サイクルで、E1試料は、Tyr-Gln-
Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X-Asn-Aspの配
列を有し、一方、E2の配列は、Thr-HisーVal-Thr-Gly-X-
X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Pheであることを示した。
このアミノ酸配列のデータは、DNA配列に対して予測さ
れた配列と一致する。

【００７９】上記のfractogel-DEAEクロマトグラフィー
による精製E1/E2産物は、ゲル透過クロマトグラフィーB
ioSil TSK-4000 SWカラムの排除容積領域に、多量のE1
およびE2がともに溶出する事実によって明確にされるよ
うに、凝集されると考えられる。このことは、天然条件
下では、有意量のE1/E2複合体は、少なくとも800kDの分
子量を有することを示す。分子量約650kDのE1/E2物質も
また観察された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ケントビー．スーディアムアメリカ合衆国カリフォルニア 94602 オークランド，ハンペルストリート 1220 (72)発明者バーバラエイ．ジャーバスアメリカ合衆国カリフォルニア 94589 バレホ，シマロンコート 1001 (72)発明者ジョンエイ．ホールアメリカ合衆国カリフォルニア 94928 ローナートパーク，ラケットクラブサークル 725 (56)参考文献特表平２−500880（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／11089（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 19（1973），ｐ．391−395 ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ；．263，Ｎｏ．２（1988）, ｐ．728−734 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/18 G01N 33/576 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】 HCVのE1領域から発現され、そして該E1
領域のアミノ酸330〜380（HCVポリタンパク質のはじめ
からの番号）にわたる領域に見出される配列の一部に欠
失を含む、先端切断型アシアロ糖タンパク質を生成する
方法であって、 (i) HCVのE1領域から発現される先端切断型HCVアシア
ロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換され
た宿主細胞を、適切な培養培地で増殖する工程； (ii) 該構造遺伝子を、シアル化を阻害する条件下で発
現させる工程；および (iii) 該先端切断型HCVアシアロ糖タンパク質を、マン
ノース末端糖タンパク質に特異的なマンノース結合タン
パク質に接触させることにより、該先端切断型HCVアシ
アロ糖タンパク質を細胞培養物から単離する工程；を包含する、方法。
【請求項２】 HCVのE2領域から発現され、そして該E2
領域のアミノ酸660〜830（HCVポリタンパク質のはじめ
からの番号）にわたる領域に見出される配列の一部に欠
失を含む、先端切断型アシアロ糖タンパク質を生成する
方法であって、 (i) HCVのE2領域から発現される先端切断型HCVアシア
ロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換され
た宿主細胞を、適切な培養培地で増殖する工程；(ii) 該構造遺伝子を、シアル化を阻害する条件下で発
現させる工程；および (iii) 該先端切断型HCVアシアロ糖タンパク質を、マン
ノース末端糖タンパク質に特異的なマンノース結合タン
パク質に接触させることにより、該先端切断型HCVアシ
アロ糖タンパク質を細胞培養物から単離する工程；を包含する、方法。
【請求項３】前記宿主細胞が哺乳動物細胞に由来す
る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】前記シアル化を阻害する条件が、小胞体
からゴルジ体への糖タンパク質の移送を阻害するのに十
分な割合での前記先端切断型アシアロタンパク質の発現
を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記シアル化を阻害する条件が、前記宿主細胞の小胞体内でタンパク質の放出を引き起こ
すに十分な量のカルシウムモジュレーターの存在；を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】前記マンノース結合タンパク質が、コン
カナバリンＡ(ConA)およびGalanthus nivalusアグルチ
ニン(GNA)から選択されるレクチンである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】前記マンノース結合タンパク質が支持体
に固定されている、請求項１から６のいずれかに記載の
方法。
【請求項８】前記接触させる工程が、前記支持体に固
定されたマンノース結合タンパク質を有するカラム中
で、先端切断型HCVアシアロ糖タンパク質を含有する前
記細胞培養物を、少なくとも１時間の間インキュベート
することを包含し；そして前記単離する工程が、マンノ
ースで該先端切断型アシアロ糖タンパク質を溶出させる
ことを包含する、請求項７に記載の方法。