JP3370090B2 - 抗菌性ポリペプチドおよびその製法 - Google Patents

抗菌性ポリペプチドおよびその製法

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Description

【発明の詳細な説明】 抗菌性ポリペプチド，例えばラクチンは単子葉または
双子葉植物から単離できる［Ramshaw,J.A.M.（1982）in
Nucleic Acids and Proteins in Plants I.Encycloped
ia of Plant Physiology,New Series,（Boulter,D.and
Parthier,B.eds.）Vol.14A,229−279頁,Springer,Berli
n］。更に，チオニンの生合成が病原菌類による植物の
感染を通じて誘発されることが観察された。これ故にこ
のタンパク質は抗菌活性を持つと見られる［Bohlmann,
H.等（1989）EMBO J.7,1559−1565,Broekaert,W.F.等
（1989）Science 245,1100−1102］。
抗菌性ポリペプチドは同様に微生物から単離された。
アスペルギルスギガンテウス（Aspergillus giganteu
s）の発酵用培養液において，例えば類似のタンパク質
が検出されたが，しかしそれは本発明のタンパク質と比
較して凡そリジン残基２つが短縮されたアミノ酸配列を
持っている（Olson,B.M.＆ Goerner,G.L.（1965）Appl.
Microbiol.13,314−321）。
我々は今やアスペルギルスギガンテウス（Aspergillu
s giganteus）から抗菌作用を持つポリペプチドを単離
し，そしてその配列を同定できた。
本願の主請求のペプチドに関するヌクレオチド配列
は,Wnendt等により公表されている（Nucl.Acids Res.1
8,S.3987,September 1990）。
我々はこれ以上に上記本願の主請求のポリペプチドに
対してコード化する形質発現によって，植物上の植物病
原菌類の増殖を植物上で強力に抑制できることを見出し
た。
本発明は以下に関する： アミノ酸配列,Ala−Thr−Tyr−Asn−Gly−Lys−Cys−
Tyr−Lys−Lys−Asp−Asn−Ile−Cys−Lys−Tyr−Lys−
Ala−Gln−Ser−Gly−Lys−Thr−Ala−Ile−Cys−Lys−
Cys−Tyr−Val−Lys−Lys−Cys−Pro−Arg−Asp−Gly−
Ala−Lys−Cys−Glu−Phe−Asp−Ser−Tyr−Lys−Gly−
Lys−Cys−Tyr−Cysからなる単離されたポリペプチド。
１）の下に特徴付けられるポリペプチドの製法は，ア
スペルギルスギガンテウス（Aspergillus giganteus）
を培養し，そしてポリペプチドを単離することを特徴と
する。
殺菌剤としてのこのポリペプチドの使用。
アスペルギルスギガンテウス（Aspergillus giganteu
s）の抗菌性ペプチドの形質を発現する植物細胞。
請求の範囲１に記載の細胞を持つ植物。
請求の範囲１に記載の植物細胞から増殖させた植物，
植物の組織または再生物質。
植物細胞の増殖方法は，植物細胞中でアスペルギルス
ギガンテウス（Aspergillus giganteus）から抗菌性ポ
リペプチドの形質を発現させることを特徴とする。
以下に本発明を特に好適な実施形態で詳細に説明す
る。これ以外にも本発明は請求の範囲の内容によって特
定される。
本発明のポリペプチドを，アスペルギルスギガンテウ
ス（Aspergillus giganteus）によって好気性培養で合
成させる。特に好適な炭素源としては，同化し得る炭水
化物およびフルクトース，ラクトースまたはマンニトー
ルのような糖アルコール，並びに炭水化物含有天然物が
適している。特に好適な窒素含有栄養素としては，次の
物質が考慮に値する：アミノ酸，ペプチドおよびタンパ
ク質並びにペプトンまたはトリプトンのようなそれらの
分解産物，更に抽出物例えばトウモロコシ，小麦，豆，
大豆またはワタ植物の種子の粉砕物，アルコール製造の
際の蒸留残留物，肉粉または酵母エキス，しかしまたア
ンモニウム塩および硝酸塩。これ以外にも，この栄養液
は例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属，鉄，亜
鉛およびマンガンの塩化物，炭酸塩，硫酸塩あるいはリ
ン酸塩を追加の無機塩として含有することができる。
本発明によるポリペプチド化合物の形成は，特に0.5
〜２％の肉エキス,0.5〜２％のペプトン,0.5〜４％のデ
ンプン並びに0.1〜１％の食塩を各々全栄養液重量を基
準として含む栄養液中で行うのが良好である。
この発酵を例えばフラスコまたは発酵槽において振盪
または攪拌しながら，場合により空気または酵素を通気
させながら好気的に行う。これは約18〜35℃，特に約25
〜30℃の温度範囲で行うことができる。上記条件下で微
生物を静止期になるまで約70〜80時間培養する。
数段階で，即ち，先ず第一に培養媒体中で一種または
複数の初期培養物を増殖させ，次にこれを本来の生成物
媒体−主培養物−に，例えば1:10の量比で接種する。こ
の初期培養物を例えばスポロゾイトを形成した菌糸体を
培養液中で接種し，そして約48〜72時間増殖させて得
る。この菌株を７日間，例えば麦芽−寒天の固体状また
は液状の培地上で増殖させる間に，このスポロゾイト形
成の菌糸体を得ることができる。
この発酵過程は薄層クロマトグラフィー，生物学的活
性テスト，または免疫学的方法によって，培養のpH値ま
たは菌糸体体積により監視できる。
培養媒体からのポリペプチドの単離は，生成物の化学
的，物理的および生物学的特性を考慮しながら公知の方
法で実施する。このポリペプチドは培養液中に存在す
る。
この培養液を菌糸体から分離し，次に陽イオン交換体
でクロマト分析を実施する。透析および濃縮の後に，ゲ
ルろ過を特に寒天／アクリルアミド・コポリマーで実施
する。ポリペプチドの配列分析のために必要なその次の
完全精製は，疎水相互作用を持つカラム上の直線的勾配
を用いるHPLC法によって実施することができる。
このアミノ酸配列を解析するためにペプチドの酵素に
よる消化をそれ自体公知の方法で実施した後に，上記ア
ミノ酸配列の結果が得られる。この酵素に関する特徴は
熱安定性にある。100℃,20分以上の加熱後でも活性の損
失を示さない。
このタンパク質は特に植物病原菌類に対する殺菌剤と
して使用できる。本発明は，これ故に本発明のタンパク
質の含有量によって特徴付けられる植物上の植物病原菌
類を抑制または滅殺するための組成物にも関する。植物
病原菌類は防御的および治療的作用を効率よく克服する
ことができる。本請求の化合物の多様な作用は，例えば
ピリクラリアオリザエ（Piricularia oryzae），ヴェン
トゥリアイナエクヴァリス（Venturia inaequalis），
セルコスポーラベティコーラ（Cercospora beticor
a），真うどん粉病菌類，フザリウム病菌類，プラスモ
パーラヴィティコーラ（Plasmopara viticola），プセ
ウドペロノスポーラクベンシス（Pseudoperonospora cu
bensis），種々のサビ菌類およびプセウドセルコスポレ
ラヘルポトリコイデス（Pseudocercosporella herpotri
choides）のように経済的に重要な異種の植物病原菌類
の多くを包含する。特にベンゾイミダゾール−およびジ
カルボキシミド感受性および耐性の灰色かび病菌（Botr
ytiscinerea）菌株を含む。
本発明の化合物は，それに加えて工業領域での使用に
ついても，特に工業製品および食料品または飼料のため
の合成保存料として適している。
本発明の対象は，また上記化合物以外に適当な調合助
剤を含む組成物に関する。
この個々の調合タイプは，当業者に既知であり，例え
ば以下に記載されている： Winnacker−Ｋchler,“Chemische Technologie",第
７巻,C.Hanser Verlag Mnchen,第４版1986;van Falke
nberg,“Pesticides Formulations",Marcel Dekker N.
Y.,第２版1972−73;K.Martens,“Spray Drying Handboo
k",第３版1979,G.Goodwin Ltd.London。
不活性物質，界面活性剤，溶剤およびその他の添加剤
のように必要な調合助剤も同様に公知であり，例えば以
下に記載されている： Watkins,“Handbook of Insecticide Dust Diluents
and Carries",第２版,Darland Books,Caldwell N.J.;H.
v.Olphen,“Introduction to Clay Colloid Chemistr
y",第２版,J.Wiley ＆ Sons,N.Y.;Marschen,“Solvents
Guide",第２版;Interscience,N.Y.1950;McCutcheon's
“Detergents and Emulsifiers Annual",MC Publ.Cor
p.,Ridgewood N.J.;Sisley and Wood,“Encyclopedia o
f Surface Active Agents",Chem.Publ.Co.Inc.,N.Y.196
4;Schnfeldt,“Grenzflchenaktive thylenoxidad
dukte",Wiss.Verlagsgesell.,Stuttgart 1976;Winnacke
r−Ｋhler,“Chemische Technologie",第７巻,C.Hans
er Verlag Mnchen,第４版1986。
この調合を基礎として他の殺虫効果を持つ物質，化学
肥料および／あるいは生長調整剤を用いる結合物も，例
えば完成調合の形でまたはタンクミックスとして製造で
きる。
本発明の一般式１の化合物と結合物を形成できる文献
上公知の殺菌剤としては，例えば以下の物質が挙げられ
る： アニラジン，ベナラキシル，ベノダニル，ベノミル，
ビナパクリル，ビテルタノール，ブチオバート，キャプ
タホル，キャプタン，カルベンダジム，カルボキシン,C
GD−94240F,クロベンゾチアゾン，クロルタロニル，シ
モキサニル，シプロコナゾール，シプロフラム，ジクロ
フルアニド，ジクロメジン，ジクロブトラゾール，ジエ
トフェンカルブ，ジフルコナゾール，ジメチリモル，ジ
メトモルフ，ジニコナゾール，ジノカップ，ジチアノ
ン，ドデモルフ，ドジン，エジフェンホス，エチリモ
ル，エトリジアゾール，フェナリモル，フェンフラム，
フェンピクロニル，フェンピロピジン，フェンピロピモ
ルフ，フェンチンアセテート，フェンチンヒドロキシ
ド，フルアジラム，フルオベンジミン，フルオリミド，
フルジラゾール，フルトラニ，フルトリアホル，ホルペ
ート，ホセチルアルミニウム，フベリダゾール，フララ
キシル，フルメサイクロックス，グアザチン，ヘキサコ
ナゾール，イマザリル，イプロベンホス，イプロジオ
ン，イソプロチオラン，オキシ塩化銅，銅オキシン，酸
化銅のような銅化合物，マンコゼブ，マネブ，メプロニ
ル，メタラキシル，メタスルホカルプ，メトフロキサ
ム，ミクロブタニル，ナバム，ニトロタリドプロピル，
ヌアリモル，オフラス，オキサジキシル，オキシカルボ
キシン，ペンコナゾール，ペンシキュロン,PP 969,プロ
ベナゾール，プロビネブ，プロクロラズ，プロシミド
ン，プロパモカルプ，プロピコナゾール，プロチオカル
プ，ピラカルボリド，ピリフェノックス，ピロキロン，
ラベンザゾール，硫黄，テブコナゾール，チアベンダゾ
ール，チオファナートメチル，チラム，トルクロホス−
メチル，トリルフルアニド，トリアジメホン，トリアジ
メノール，トリシクラゾール，トリデモルフ，トリフル
ミゾール，トリホリン，ヴィンクロゾリン，ジネブ，ナ
トリウムドデシルスルホナート，ナトリウム−ドデシル
スルファート，ナトリウム−C13/C15−アルコールエー
テルスルホナート，ナトリウム−セトステアリルホスフ
ァートエステル，ジオクチル−ナトリウム−スルホスキ
ナート，ナトリウムイソプロピルナフタリンスルホナー
ト，ナトリウム−メチレン−ビスナフタリンスルホナー
ト，セチル−トリメチル−アンモニウムクロライド，長
鎖状の第一，第二または第三アミンの塩，アルコールプ
ロピレンアミン，ラウリル−ピリミジニウムブロミド，
エトキシ化第４級脂肪アミン，アルキル−ジメチル−ベ
ンジル−アンモニウムクロライドおよび１−ヒドロキシ
エチル−２−アルキル−イミダゾリン。
上記結合物の成分は大部分が,CH.R Worthing,U.S.B.W
alker,The Pesticide Manual,第７版（1983）,British
Crop Protection Councilに記載されている公知の作用
物質である。
更に，本発明による作用物質は，前記殺虫剤，誘引物
質，殺菌剤，殺ダニ剤，殺線虫類剤または除草剤のよう
な他の作用物質との混合状態において市販の調合物並び
にこの調合物から調整された使用形態で存在することが
できる。殺虫剤としては，例えばリン酸エステル，カル
バマート，カルボン酸エステル，ホルムアミジン，スズ
化合物，微生物によって生成される物質およびその他が
数えられる。特に混合成分として下記の物質が好適であ
る： 1. リン化合物群 アセファート，アザメチホス，アジンホス−エチル，
アジンホス−メチル，ブロモホス，ブロモホス−エチ
ル，クロルフェンビンホス，クロルメホス，クロルピリ
ホス，クロルピリホス−メチル，デメトン，デメトン−
Ｓ−メチル，デメトン−Ｓ−メチルスルホン，ジアリホ
ス，ジアジノン，ジクロルボス，ジクロトホス,0,0−1,
2,2,2−テトラクロロエチルホスホチオアート（SD 208
304），ジメトアート，ジスルホトン,EPN,エチオン，エ
トプロホス，エトリムホス，ファンプール，フェナミン
ホス，フェニトリオチオン，フェンスルホチオン，フェ
ンチオン，ホノホス，ホルモチオン，ヘプテノホス，イ
ソゾホス，イソチオアート，イソキサチオン，マラチオ
ン，メタクリホス，メタミドホス，メチダチオン，サリ
チオン，メビンホス，モノクロトホス，ナレド，オメト
アート，オキシデメトンメチル，パラチオン，パラチオ
ン−メチル，フェントアート，ホラート，ホサロン，ホ
スホラン，ホスメート，ホスファミドン，ホキシム，ピ
リミホス−エチル，ピリミホス−メチル，プロフェノホ
ス，プロパホス，プロエタムホス，プロチオホス，ピラ
クロホス，ピリダペンチオン，キナルホス，スルプロホ
ス，テメホス，テルブホス，テトラクロルビンホス，チ
オメトン，トリアゾホス，トリクロルホンおよびバミド
チオン； 2. カルバマート群 アルジカルブ,2−sec−ブチルフェニルメチルカルバ
マート（BPMC），カルバリル，カルボフラン，カルボス
ルファン，クロエトカルブ，ベンフラカルブ，エチオフ
ェンカルブ，フラチオカルブ，イソプロカルブ，メトミ
ル,5−メチル−ｍ−クメニルブチリル（メチル）カルバ
マート，オキサミル，プリミカルブ，プロポクスール，
チオジカルブ，チオファノックス，エチル4,6,9−トリ
アザ−４−ベンジル−6,10−ジメチル−８−オキサ−７
−オキソ−5,11−ジチア−９−ドデセノアート（OK 13
5）および１−メチルチオ（エチリデンアミノ）−Ｎ−
メチル−Ｎ（モルホリノチオ）カルバマート（UC 5171
7）； 3. カルボン酸エステル群 アレスリン，アルファメスリン,5−ベンジル−３−フ
リルメチル−（Ｅ）−（1R）−cis−2,2−ジメチル−３
−（２−オキソチオラン−３−イリデンメチル）−シク
ロプロパンカルボキシラート，ビオアレスリン，ビオア
レスリン（（Ｓ）−シクロペンチル異性体），ビオレス
メスリン，ビフェナート，（RS）−１−シアノ−１−
（６−フェノキシ−２−ピリジル）−メチル−（1RS）
−トランス−３−（４−tert−ブチルフェニル）−2,2
−ジメチルシクロプロパンカルボキシラート（NCI 8519
3），シクロプロスリン，シフルスリン，シハロスリ
ン，シペルストリン，シフェノスリン，デルタメスリ
ン，エムペンスリン，エスフェンバレラート，フェンフ
ルスリン，フェンプロパスリン，フェンバレラート，フ
ルシスリナート，フルメスリン，フルバリナート（Ｄ−
異性体），ペルメスリン，フェオスリン（（Ｒ）−異性
体）,d−プラレスリン，ピレスリン（天然物質），レス
メスリン，テフルスリン，テトラメスリンおよびトラロ
メスリン。
4. アミジン群 アミトラーズ，クロルジメホルム 5. スズ化合物群 シヘキサチン，フェンブタチンオキシド 6. その他 アバメクチン，バシルスツリンギィエンシス，ベンス
ルタプ，ビナパシル，ブロモプロピラート，ブプロフェ
ジン，カムフェクロル，キャルタプ，クロルベンジアラ
ート，クロルフルアズロン,2−（４−クロルフェニ
ル）、4,5−ジフェニルチオフェン（UBI−T 930），ク
ロフェンテジン，シクロプロパンカルボン酸（２−ナフ
チルメチル）−エステル（Ro 12−0470），シロマジン,
N−（3,5−ジクロル−４−（1,1,2,3,3,3−ヘキサフル
オロ−１−プロポキシ）フェニル）カルバモイル）−２
−クロロベンゾカルボキシミド−酸エチルエステル,DD
T,ジコホル,N−（Ｎ−（3,5−ジクロロ−４−（1,1,2,2
−テトラフルオロエトキシ）フェニルアミノ）−カルボ
ニル）−2,6−ジフルオロベンゾアミド（XRD 473）,N−
（2,3−ジヒドロ−３−メチル−1,3−チアゾール−２−
イリデン）2,4−キシリジン，ジノブトン，ジノキャ
プ，エンドスルファン，エトフェンプロックス，（４−
エトキシフェニル）（ジメチル）（３−（３−フェノキ
シフェニル）プロピル）シラン，（４−エトキシフェニ
ル）（３（４−フルオロ−３−フェノキシフェニル）プ
ロピル）ジメチルシラン，フェノキシカルブ,2−フルオ
ロ−５−（４−（４−エトキシフェニル）−４−メチル
−１−ペンチル）ジフェニルエーテル（MTI 800），顆
粒病−および核多角体病ウィルス，フェンチオカルブ，
フルベンゾイミン，フルシクロクロン，フルフェノクロ
ン，ガンマ−HCH,ヘキシチアゾックス，ヒドラメチルノ
ン（AC 217 300），イベルメクチン,2−ニトロメチル−
4,5−ジヒドロ−6H−チアジン（SD 52618）,2−ニトロ
メチル−3,4−ジヒドロチアゾール（SD 35651）,2−ニ
トロメチレン−1,2−チアジナン−３−イルカルバマル
デヒド（WL 108 477），プロパルギテ，テフルベンズロ
ン，テトラジホン，テトラスル，チシクラムおよびトリ
フルマロン。
植物の遺伝子発現のための全ての遺伝子工学的処理
は，他に方法がなかったので“Molecular Cloning"（Ma
niatis等,Cold.Spring Harbour,1982）に記載されてい
る方法に応じて実施した。
用いた全酵素は，他になかったので，ビョーリンガー
・マンハイム社（Firma Boehringer Mannheim）から取
り寄せた。化学薬品類はメルク社（Merck）（ダルムシ
ュタット）による。
抗菌性ペプチドのcDNA配列をベクター中でクローニン
グするために,BamH IおよびSal Iの制限酵素切断認識部
位に結合させ得る末端部に供給される。
クローニングベクターとしては,pDH 51（Pietrzak等,
Nucl.Acids Res.14,p.5857,1986）を用いた。
ベクターpDH 51は制限酵素BamH IおよびSal Iでプロ
モーターおよびターミネーターの間に開かれる。ベクタ
ーpDH 51は，カリフラワーモザイクウィルスからの35S
の転写産物のプロモーターおよびターミネーター配列を
含有するpUC18誘導体である。この配列は植物の転写機
構から認識されており，そして植物においてその配列に
結び付いた遺伝子の強力な連続的発現に導く。
35Sプロモーター以外に，それぞれ他の植物中で効果
的なプロモーターを用いることもできる。
抗菌性ペプチドのDNAは,BamH IおよびSal Iの切断部
位でプロモーター配列方向およびターミネーター配列と
逆方向になるようにベクターにクローニングする。
転写ユニット：プロモーター，遺伝子およびターミネ
ーターは，制限酵素EcoR Iでベクターから切断され，植
物形質転換ベクターにクローニングされる。
植物形質転換ベクターとしては，例えば以下のベクタ
ーまたはその誘導体が用いられる： −pOCA 18（Olszewski等,Nucl,Acids Res.16,10765頁,1
988） および −pPCV 310（Koncz and Schell,MGG 204,383頁,198
6）。
植物のゲノム中に挿入するために，アグロバクテリウ
ム トゥメファシエンス（Agrobacterium tumefacien
s）のTiプラスミドの重要なボーダー配列を有するいず
れの他の植物形質転換ベクターも同様に使用され得る。
転写ユニットおよびベクターがEcoR I−切断部位に付
加した後に，この構造体をアグロバクテリウム菌株MP90
RK（Koncz and Schell,MGG 204,383頁,1986）；またはE
HA 101（Hood等,J.Bacteriol.168,1291頁,1986）に接合
する。
この接合方法は，“Plant Molecular Biology/Manua
l"（Kluwer Academic Publisher,Dordrecht,1988）に記
載されている。
タバコ−およびトマト植物は，リーフ・ディスク（li
af disc）法（Horsch等,Science 227,1229,（1985））
で形質転換する。原則的にはいずれの他の双子葉植物も
形質転換できる。形質転換を行った胞子は抗生物質カナ
マイシンに対して伝達された耐性に基づいて選択され
る。DNA分析（サザン・ブロッティング法（Southern Bl
otting））,RNA分析（ノザン・ブロッティング法（Nort
hern Blotting））および特異抗体を用いるタンパク質
分析（ウエスタン・ブロッティング法（Western Blotti
ng））によって，抗菌性タンパク質の発現は形質転換を
行った栽培植物において調査される。
単子葉植物は，プロトプラスト中に直接遺伝子を転写
する方法で形質転換される。これらのプロトプラストは
引き続きそのまま植物へ再分化される（Gene Transfer
in Cerials,Potrykus I.,Biotechnology 8,535頁,199
0）。
タンパク質を発現する植物は栽培室に移され，そして
病原菌類を接種される。この接種は，菌の種類によって
は懸濁液の中の菌糸または分生子で行う。この植物の接
種のために用いるべき発芽時期並びに潜伏期間は植物ま
たは病原菌類に左右される。
以下に本発明を実施例を基にして詳細に説明する。
実施例 1. アスペルギルスギガンテウス（Aspergillus gigant
eus）の培養 ａ） プロデューサー菌株の胞子懸濁液の製造： 500mの三角フラスコ中で栄養液100m（肉エキス0.
75％，ペプトン１％，澱粉溶液２％,NaCl0.5％）に菌株
を接種し，回転振盪機を用いて25℃で,72時間,120rpmで
培養する。次に，上記混合物の培養媒体を含む500mの
三角フラスコ中の培養液20mを固形化するために20g/
の寒天に加え，同時にこの溶液を配量し，そしてデカ
ンテーションする。この培養を,10〜14日間,25℃で培養
する。この期間の後に発生したフラスコ中の胞子は市販
の非イオン化界面活性剤の一滴を含むイオンを除去した
水500mで洗われ，直ちに用いるか，または−22℃で保
存する。
ｂ） 三角フラスコ中でプロデューサー菌株の培養物ま
たは初期培養物の製造： 上記混合物（pH6.5）の栄養液100mを入れた500m
の三角フラスコで，傾斜管上に取られた培養物を用い
て，または0.2mの胞子懸濁液に接種し，振盪機を用い
て120rpmで，そして25℃で培養する。約80時間後に生成
物最大量に達する（pH＝5.3）。収量は，約１〜2mg/
である。
2. ポリペプチドの分離と精製 ポリペプチドを（Olson,B.M.＆ Goerner,G.L.（196
5）Apll.Microbiol.13,314−321）に基づいて処理す
る。この次の精製を0.1％のトリフルオロ酢酸と共に用
いるアセトンニトリル（v/v）の５〜20％の直線的勾配
を持つODS−120T−カラム（0.46×25cm）上でHPLC法に
よって,2m/minの流量率で実施する。
3. ポリペプチドの特徴 ａ） 酵素による切断： 酵素による切断のために,6Mのグアニジンおよび2mMの
EDTAを添加する1Mのトリス−HClバッファー（pH8）中で
ポリペプチドを37℃にて,2時間培養し，そして0.1Mのジ
チオトリトールの添加によって,37℃で,12時間還元す
る。還元されたタンパク質を次に0.15Mのヨウ化アセト
アミドで,37℃にて,20分間処理する。Ｓ−カルボキシア
ミドメチル化タンパク質を上記HPLC法によって不純物か
ら分離し，そして次に0.1Mの重炭酸アンモニウム塩バッ
ファー（pH8）中で，キモトリプシン（EC 3.4.21.1）
で,37℃にて,30時間処理する。
タンパク質濃度は,1:50（w/w）の酵素：基質の比の下
で150μg/mである。
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｖ ８プ
ロテアーゼ（EC3.4.21.15）を用いる消化を0.1Mの重炭
酸塩バッファー（pH8）中で,18時間,37℃にて実施す
る。酵素：基質の比はその際1:30（w/w）である。
リジルエンドペプチダーゼ（EC 3.4.21.50）を用いる
天然またはＳ−カルボキシメチル化したタンパク質の処
理は,0.1Mのトリス−HClバッファー（pH9）を添加され
た8Mの尿素中で,30分間,37℃にて行う。これは引き続き
0.1Mのトリス−HCl（pH8）中で,12時間,37℃にて,1:100
（w/w）の酵素：基質の比に消化する。
カルボキシペプチダーゼＹ（EC 3.4.16.1）を用いるＳ
−カルボキシアミドメチル化タンパク質の消化は25mMの
リン酸バッファー（pH6.5）中で,37℃にて,4時間まで実
施する。このとき酵素：基質の比は1:3（w/w）である。
ｂ） アミノ酸分析と配列決定 タンパク質およびその断片は6NのHCl中で,22時間,110
℃にて加水分解される。アミノ酸配列の分析はApplied
Biosystems社のプロテインシーケンサー（モデル470
A）を用いて実施される。
フェニルヒダントインのアミノ酸誘導体はHPLC法（ODS
−120T,0.46×25cm）でTsunasawa,S.等，（1985）J.Bio
chem.（Tokyo）97,701−704に基づいて同定される。
フェニルヒダントインCam−Cysは“Theerasilp,S.
等，（1989）,J.Biol.Chem.264,6655−6659"に記載の通
りに決定される。
ｃ） シスチンおよびシステイン断片の同定 この分析はEllman's試薬（5,5'−ジチオビス−（２
ニトロベンゾ酸））を用いる反応によって，水素化ナト
リウムホウ素を用いる処理の前および後に，“Hensche
n,A.（1986）in Advanced Method in Protein Microseq
uence Analysis（Wittmann−Liebold,B,Salnikow,J.＆
Erdmann,V.A.,eds）244−255頁,Springer−Verlag,Berl
in"に応じて実施される。このタンパク質を水中で2.5％
の水素化ナトリウムホウ素の存在下または不存在下で,5
0℃にて,1時間培養した。これに引き続き0.3NのHClで30
分間処理して水素化ホウ素を阻害した後，この試料を0.
11％のEllman's試薬で,0.04Mのリン酸バッファー（pH8.
1）中で５分間培養した。分光吸収は412nmと測定され
た。
結果： 本発明のタンパク質は以下のアミノ酸配列を示す： Ala−Thr−Tyr−Asn−Gly−Lys−Cys−Tyr−Lys−Lys−
Asp−Asn−Ile−Cys−Lys−Tyr−Lys−Ala−Gln−Ser−
Gly−Lys−Thr−Ala−Ile−Cys−Lys−Cys−Tyr−Val−
Lys−Lys−Cys−Pro−Arg−Asp−Gly−Ala−Lys−Cys−
Glu−Phe−Asp−Ser−Tyr−Lys−Gly−Lys−Cys−Tyr−
Cys。
分析されたアミノ酸の分子量の総量は5,788Daltonであ
る。
４個のジスルフィド結合が以下のように同定される： 4. 抗菌活性 抗菌活性は,Roether W.等,Mykosen 27（１）14−28,
（1984）に基づいて実施される。この結果を以下の表１
に表す。
5. 調合の実施例 ａ） 10重量−部の活性物質および90重量−部のタルク
を不活性物質として混合し，そしてハンマーミルで粉砕
して微粉末を得る。
ｂ） 25重量−部の活性物質,65重量−部のカオリン含
有水晶を不活性物質として,10重量−部のリグニンスル
ホン酸カリウムおよび１重量−部のオレオイルメチルタ
ウリン酸ナトリウムを潤滑剤および分散剤として混合
し，そしてピン打ち製粉機で粉砕して，水に容易に分散
および湿潤できる粉末を得る。
ｃ） 顆粒は,2〜15重量−部の活性物質およびアタパル
ジャイト，顆粒状軽石および／あるいは石英砂のような
不活性の顆粒担持物質から製造される目的に応じて30％
の固形物質含有量を持つ例ｂ）の湿潤性粉末の懸濁液を
用いて，アタパルジャイト顆粒の表面に噴霧，乾燥し，
良くかき混ぜて使用する。この際湿潤性の粉枚の重量の
割合は，約５％であり，そして不活性の担持物質のそれ
は，製品粉末の約95％である。
6. 生物学的実施例 約14日生長した「ヘルツフレイア」（Herz Freya）ま
たは「フランク’スアンカーペルレ」（Frank's Ackerp
erle）種のソラマメは本発明のポリペプチドで均一に湿
らされた。スプレー・コーティングの乾燥後に，植物は
灰色かび病菌（Botrytis cinerea）の胞子懸濁液（1.5M
io.胞子/m）を用いて接種した（BCM−およびジカルボ
オキシイミド感受性菌株＝表2,BCM−およびジカルボオ
キシイミド耐性菌株＝表３）。この植物をクリーンルー
ムで,20〜22℃および相対湿度99％にて更に培養した。
この植物の感染が葉および葉柄の上に黒色斑点の形成で
示される。この実験の評価は接種後，約１週間で行われ
た。
試験物質の活性度を未処理で感染させた対照物に対し
てパーセントとして評価し，そして表２に再度表した。
7. 灰色かび病菌（Botrytis cinerea）を用いる遺伝子
転写のトマト植物の接種 野生種のトマト植物および同種の遺伝子転写の植物は
発芽の５〜６段階で灰色かび病菌（Botrytis cinerea）
の分生子を用いて接種され，そしてこの次に３〜４日,2
0℃および相対湿度99％にて維持した。その後，実験の
評価は視覚的評価によって行った；この際灰色かび病菌
（Botrytis cinerea）で病気になった遺伝子転写植物の
葉の表面（オリーブグレー色の斑点および萎縮兆候）を
野生種と比較して評価した。これら植物の感染の程度は
表１から明白である。
8. スクレロティニア スクレロティオルム（Scleroti
nia sclerotiorum）を用いる遺伝子転写植物の接種 野性種のタバコ植物および同種の遺伝子転写植物は発
芽の第４段階でスクレロティニア スクレロティオルム
（Sclerotinia sclerotiorum）の菌糸体を用いて接種
され，そして約25℃および相対湿度90％以上で約３日間
維持した。その後，スクレロティニア スクレロティオ
ルム（Sclerotinia asclerotiorum）で感染した遺伝子
転写の実験植物の葉の表面（ガラス状斑点，菌糸体層）
を野性種と比較して評価した。これら植物の感染の程度
は表２から明白である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (72)発明者 ヘーネル・ハインツ ドイツ連邦共和国、デー―6370 オーベ ルウルゼル ６、タウヌスストラーセ、 148 (72)発明者 ザクセ・ブルクハルト ドイツ連邦共和国、デー―6233 ケルク ハイム（タウヌス）、アン・デル・ツィ ーゲライ、30 (72)発明者 ブラウン・ペーター ドイツ連邦共和国、デー―6500 マイン ツ 32、プファーレル―ドルン―ストラ ーセ、13 (72)発明者 ヴィンク・ヨアヒム ドイツ連邦共和国、デー―6074 レーデ ルマルク、マクデブルガー・ストラー セ、14 (72)発明者 エッケス・ペーター ドイツ連邦共和国、デー―6233 ケルク ハイム（タウヌス）、アム・フラッハス ラント、18 (72)発明者 ローゲマン・ユルゲン ドイツ連邦共和国、デー―5000 ケルン 30、ダムプファッフェンウェーク、９ (72)発明者 シェル・ヨーゼフ ドイツ連邦共和国、デー―5000 ケルン 30、カール―フォン―リンネ―ウェー ク、10 (56)参考文献 特表 平２−502513（ＪＰ，Ａ) Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖ ｏｌ．13，Ｎｏ．３（1965），ｐ．314 −321 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．18，Ｎｏ．13（1990．Ｊ ｕｌ．）ｐ．3987 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ ｕｐｐｌ．14Ｅ（1990．Ｍａｒ．）ｐ. 276 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列からなる、単離された
    ポリペプチド： Ala−Thr−Tyr−Asn−Gly−Lys−Cys−Tyr−Lys−Lys−
    Asp−Asn−Ile−Cys−Lys−Tyr−Lys−Ala−Gln−Ser−
    Gly−Lys−Thr−Ala−Ile−Cys−Lys−Cys−Tyr−Val−
    Lys−Lys−Cys−Pro−Arg−Asp−Gly−Ala−Lys−Cys−
    Glu−Phe−Asp−Ser−Tyr−Lys−Gly−Lys−Cys−Tyr−
    Cys。
  2. 【請求項２】アスペルギルス ギガンテウス（Aspergil
    lus giganteus）を培養し、そして前記ポリペプチドを
    単離することを特徴とする、請求の範囲第１項記載のポ
    リペプチドの製造方法。
  3. 【請求項３】アスペルギルス ギガンテウスを18゜ない
    し35℃の温度で培養する、請求の範囲第２項記載の製造
    方法。
  4. 【請求項４】請求の範囲第１項記載のポリペプチドの抗
    菌的に有効な量を含む抗菌性組成物。
  5. 【請求項５】請求の範囲第１項記載のポリペプチドの抗
    菌的に有効な量を植物、植物種子または栽培地に適用す
    ることを特徴とする、望ましくない菌の駆除方法。
  6. 【請求項６】請求の範囲第１項記載のポリペプチドの抗
    菌的に有効な量を植物、植物種子または栽培地に適用す
    ることを特徴とする植物病原菌の生育を抑制する方法。
  7. 【請求項７】請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコ
    ードする遺伝子で形質転換された植物細胞であって、前
    記ポリペプチドを発現する植物細胞。
  8. 【請求項８】前記植物細胞がタバコまたはトマトの植物
    細胞である請求の範囲第７項記載の植物細胞。
  9. 【請求項９】請求の範囲第７項記載の細胞を含み、かつ
    植物病原菌に対して強化された抵抗性を有する植物であ
    って、この植物が双子葉植物であるか、またはプロトプ
    ラスト中に直接遺伝子を転写することによって形質転換
    されたコメ、トウモロコシまたはオーチャードグラスで
    ある前記植物。
  10. 【請求項１０】前記双子葉植物がタバコ植物またはトマ
    ト植物である、請求の範囲第９項記載の植物。
  11. 【請求項１１】下記のアミノ酸配列からなる抗菌性ポリ
    ペプチドをコード化する遺伝子を含むように植物細胞を
    形質転換し、そして前記ポリペプチドが発現されている
    植物を前記細胞から生育させることを特徴とする、菌か
    ら植物を保護する方法であって、前記植物が双子葉植物
    であるか、またはプロトプラスト中に直接遺伝子を転写
    することによって形質転換されたコメ、トウモロコシま
    たはオーチャードグラスである、前記方法。 Ala−Thr−Tyr−Asn−Gly−Lys−Cys−Tyr−Lys−Lys−
    Asp−Asn−Ile−Cys−Lys−Tyr−Lys−Ala−Gln−Ser−
    Gly−Lys−Thr−Ala−Ile−Cys−Lys−Cys−Tyr−Val−
    Lys−Lys−Cys−Pro−Arg−Asp−Gly−Ala−Lys−Cys−
    Glu−Phe−Asp−Ser−Tyr−Lys−Gly−Lys−Cys−Tyr−
    Cys
  12. 【請求項１２】前記双子葉植物がトマト植物またはタバ
    コ植物である、請求の範囲第11記載の方法。
  13. 【請求項１３】リーフ・ディスク法を用いて双子葉植物
    の形質転換を遂行する請求の範囲第11項記載の方法。
  14. 【請求項１４】形質転換がアグロバクテリウムを媒介と
    する形質転換である、請求の範囲第13項記載の方法。
  15. 【請求項１５】請求の範囲第７項記載の植物細胞から生
    育して、この植物細胞を含むことを特徴とする植物の再
    生物質であって、前記植物が双子葉植物であるか、また
    はプロトプラスト中に直接遺伝子を転写することによっ
    て形質転換されたコメ、トウモロコシまたはオーチャー
    ドグラスである前記再生物質。
  16. 【請求項１６】前記植物がタバコ植物またはトマト植物
    である請求の範囲第15項記載の再生物質。
  17. 【請求項１７】植物の細胞中に、請求の範囲第１項記載
    のタンパク質を発現させる遺伝子を含有していることを
    特徴とする、植物病原菌に対して強化された抵抗性を有
    する植物または植物の再生物質であって、前記植物が双
    子葉植物であるか、またはプロトプラスト中に直接遺伝
    子を転写することによって形質転換されたコメ、トウモ
    ロコシまたはオーチャードグラスである、前記植物また
    は再生物質。
  18. 【請求項１８】植物中で効果的なプロモーターの制御の
    下で、請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコード化
    する遺伝子。
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