JPH06500074A - 抗菌性ポリペプチドおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗菌性ポリペプチドおよびその製法 抗菌性ポリペプチド、例えばラクチンは単子葉または双子葉植物から単離できる ［Ｒａｍｓｈａｗ、　Ｊ、ＡｊＪ、　（１９８２）　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ刀@Ｉ　。

Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　Ｎｅ ｗ　５ｅｒｉｅｓ、　（Ｂｏｕｌｔｅｒ、　Ｄ、　ａｎｄ　oａｒｔｈｉｅｒ。

Ｂ、　ｅｄｓ、）　Ｖｏｌ、　１４　Ａ、　２２９−２７９頁、　Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ、　Ｂｅｒｌｉｎｌ。更に、チオニンの生合成が病原菌類による植物の感染 を通じて誘発されることが観察された。これ故にこのタンパク質は抗菌活性を持 つと見られる［Ｂｏｈ１ｍａ曲、Ｈｌ等（１９８９）　ＥＭＢＯＪ。

７、１５５９−１５６５．　Ｂｒ０ｅｋａｅｒｔ、　Ｗ、Ｆ、等（１９８９）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．１１００−１１０２）。

抗菌性ポリペプチドは同様に微生物から単離された。アスペルギルスギガンテウ ス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）の発酵用培養液において１ 例えば類似のタンパク質が検出されたが、しかしそれは本発明のタンパク質と比 較して凡そリジン残基２つが短縮されたアミノ酸配列を持っている（Ｏｌｓｏｎ 、　Ｂ、Ｍ、　＆　Ｇｏｅｒｎｅｒ、　Ｇ、Ｌ。

（１９６５）　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３．３１４−３２１）。

我々は現在アスベルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎ ｔｅｕｓ）から抗菌作用を持つポリペプチドを単離し、そしてその配列を同定で きた。

本願の主請求のペプチドに関するヌクレオチド配列は、　Ｗｎｅｎｄｔ等により 公表されている（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．　Ｓ、　３９８７ ．　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１９９０）。

我々はこれ以外に上記本願の主請求のポリペプチドに対してコード化する形質発 現によって、植物上の植物病原菌類の増殖を植物上で強力に抑制できることを見 出した。

本発明は以下に関するニ アミノ酸配列、　Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ− Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ| Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ− Ａｌａ（Ｉｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−kｙｓ− Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ− Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＧＩｙ|Ｌｙｓ− ウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）を培養し、そしてポリペ プチドを単離することを特徴とする。

殺菌剤としてのこのポリペプチドの使用。

アスベルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ） の抗菌性ペプチドの形質を発現する植物細胞。

請求の範囲ｌに記載の細胞を持つ植物。

請求の範囲１に記載の植物細胞から増殖させた植物、植物の組織または再生物質 。

植物細胞の増殖方法は、植物細胞中でアスベルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）から抗菌性ポリペプチドの形質を発現させ ることを特徴とする。

以下に本発明を特に好適な実施形態で詳細に説明する。これ以外にも本発明は請 求の範囲の内容によって特定される。

本発明のポリペプチドを、アスベルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌ ｕｓｇｉｇａｎｔｅｕｓ）によって好気坪培養で合成させる。特に好適な炭素源 としては、同化し得る炭化水素物およびフルクトース、ラクトースまたはマンニ トールのような糖アルコール、並びに炭化水素含有天然物が適している。特に好 適な窒素含有栄養素としては２次の物質が考慮に値する二アミノ酸、ペプチドお よびタンパク質並びにペプトンまたはトリプトンのようなそれらの分解産物、更 に抽出物例えばトウモロコシ、小麦、Ｌ大豆またはワタ植物の種子の粉砕物、ア ルコール製造の際の蒸留残留物、肉粉または酵母エキス、しかしまたアンモニウ ム塩および硝酸塩。これ以外にも、この栄養液は例えばアルカリ金属またはアル カリ土類金属、鉄、亜鉛およびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩あるいはリン 酸塩を追加の無機塩として含有することができる。

本発明によるポリペプチド化合物の形成は、特に０．５〜２％の肉エキス、０゜ ５〜２％のペプトン、０．５〜４％のデンプン並びに０．１〜１％の食塩を各々 全栄養液重量を基準として含む栄養液中で行うのが良好である。

この発酵を例えばフラスコまたは発酵槽において振盪または攪拌しながら、場合 により空気または酸素を通気させなから好気的に行う。これは約１８〜３５°Ｃ 。

特に約２５〜３０°Ｃの温度範囲で行うことができる。上記条件下で微生物を静 止期になるまで約７０〜８０時間培養する。

数段階で、即ち、先ず第一に培養媒体中で一種または複数の初期培養物を増殖さ せ１次にこれを本来の生成物媒体−生培養物−に１例えば１：ｌＯの量比て接種 する。この初期培養物を例えばスポロゾイトを形成した菌糸体を培養液中で接種 し、そして約４８〜７２時間増殖させて得る。この菌株を７日間９例えば麦芽− 寒天の固体状または液状の培地上で増殖させる間に、このスポロゾイト形成の菌 糸体を得ることができる。

この発酵過程は薄層クロマトグラフィー、生物学的活性テスト、または免疫学的 方法によって、培養のｐＨ値または菌糸体体積により監視できる。

培養媒体からのポリペプチドの単離は、生成物の化学的、物理的および生物学的 特性を考慮しながら公知の方法で実施する。このポリペプチドは培養液中に存在 する。

この培養液を菌糸体から分離し２次に陽イオン交換体でクロマト分析を実施する 。透析および濃縮の後に、ゲルろ過を特に寒天／アクリルアミド・コポリマーで 実施する。ポリペプチドの配列分析のために必要なその次の完全精製は、疎水相 互作用を持つカラム上の直線的勾配を用いるＨＰＬＣ法によって実施することが できる。

このアミノ酸配列を解析するためにペプチドの酵素による消化をそれ自体公知の 方法で実施した後に、上記アミノ酸配列の結果が得られる。この酵素に関する特 徴は熱安定性にある。１００℃、２０分以上の加熱後でも活性の損失を示さない 。

このタンパク質は特に植物病原菌類に対する殺菌剤として使用できる。本発明は 、これ故に本発明のタンパク質の含有量によって特徴付けられる植物上の植物病 原菌類を抑制または減殺するだめの組成物にも関する。植物病原菌類は防御的お よび治療的作用を効率よく克服することができる。本請求の化合物の多様な作用 は９例えばピリクラリアオリザエ（Ｐｉｒｉｃｕｌａｒｉａ　ｏｒｙｚａｅ）、 ヴエントウリアイナエクヴアリス（Ｖｅｎｔｕｒｉａ　１ｎａｅｑｕａｌｉｓ） 、セルコスポーラベティコーラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｒａ）、 真うどん粉病菌類、フザリウム病菌類、プラスモバーラヴイテイコーラ（Ｐｌａ ｓｍｏｐａｒａ　ｖｉｔｉｃｏｌａ）、ブセウドペロノスポーラクベンシス（Ｐ ｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ　ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、種々のサビ菌類およ びブセウドセルコスボレラへルポトリコイデス（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏ ｒｅｌｌａ　ｈｅｒｐｏｔｒｉｃｈｏｉｄｅｓ）のように経済的に重要な異種の 植物病原菌類の多くを包含する。特にベンゾイミダゾール−およびジカルボキシ ミド感受性および耐性の灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）菌株 を含む。

本発明の化合物は、それに加えて工業領域での使用についても、特に工業製品お よび食料品または飼料のための合成保存料として適している。

本発明の対象は、また上記化合物以外に適当な調合助剤を含む組成物に関する。

この個々の調合タイプは、当業者に既知であり１例えば以下に記載されている： Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ−Ｋｏｃｈｌｅｒ、　”Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｉｅ”、第７巻、　Ｃ，Ｈａｎｓｅｒ　ＶｅｒｌａｇＭｕｎｃｈｅｎ、第 ４版１９８６：　ｖａｎ　Ｆａｌｋｅｎｂｅｒｇ、　”Ｐｅ５ｔｉｃｉｄｅｓ　 Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ直ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ　Ｎ、　Ｙ、　、第２版１ ９７２−７３；　Ｋ、　Ｍａｒｔｅｎｓ、　”５ｐｒａｙ　Ｄｒｙｉｎｇ　Ｈａ ｎｄｂｏｏｋ”、第R 版１９７９．　Ｇ、　Ｇｏｏｄｗｉｎ　Ｌｔｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ　ａ不活性物質 、界面活性剤、溶剤およびその他の添加剤のように必要な調合助剤も同様に公知 であり１例えば以下に記載されている：Ｗａｔｋｉｎｓ、　’Ｈａｎｄｂｏｏｋ 　ｏｆ　Ｉｎ５ｅｃｔｉｃｉｄｅ　Ｄｕｓｔ　Ｄｉｌｕｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃａ ｒｒｉｅｒｓ″、第Q版。

Ｄａｒｌａｎｄ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｃａｌｄｗｅｌｌ　Ｎ、Ｊ、　：　Ｈ，ｖ、０ １ｐｈｅｎ、　”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｃ１ａ凵@ＣｏｌｌｏｉＣ ｏｌｌｏｉｄＣｈｅ”、第２版、　Ｊ、　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎ、Ｙ 、　：　Ｍａｒｓｃｈｅｎ、　”５ｏｌｖｅｎｔｓ　Ｇｕｉр■f 、第２版：　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、　Ｎ、Ｙ、　１９５０：　ＭｃＣｕｔ ｃｈｅｏｎ’ｓ　”Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　ａｎｄＥｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　Ａ ｎｎｕａｌ”、　ＭＣＰｕｂｌ、　Ｃｏｒｐ、、　Ｒｉｄｇｅｗｏｏｄ　Ｎ、Ｊ 、　：　５ｉｓｌｅｙ　ａｎｄ@Ｗｏｏｄ、　” Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｃｔｉｖｅ　Ａｇｅｎｔ ｓ’、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｕｂｌ、　Ｃｏ、Ｉｎｃ、、　Ｎ、x。

１９６４；　５ｃｈｏｎｆｅｌｄｔ、　”Ｇｒｅｎｚｆｌａｃｈｅｎａｋｔｉｖ ｅ　Ａｔｈｙｌｅｎｏｘｉｄａｄｄｕｋｔｅ”、　ＷｉｓｓB Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌ、、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９７６；　Ｗｉｎｎ ａｃｋｅｒ−Ｋｕｈｌｅｒ、　−ＣｈｅｍｉｓｃｈｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ” 、第７巻、　Ｃ，Ｈａｎｓｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｍｔ＋ｎｃｈｅｎ、第４版１９ ８６゜この調合を基礎として他の殺虫効果を持つ物質、化学肥料および／あるい は生長調整剤を用いる結合物も８例えば完成調合の形でまたはタンクミ・ンクス として製造できる。

本発明の一般式ｌの化合物と結合物を形成できる文献上公知の殺菌剤としては。

例えば以下の物質が挙げられるニ アニシジン、ベナラキシル、ベノダニル、ベノミル、ビナバクリル、ビテルタノ ール、プチオバート、キャブタホル、キャブタン、カルペンダジム、カルボキシ ン、Ｃ０Ｄ−９４２４０Ｆ、クロベンゾチアシン、クロルタロニル、シモキサニ ル、シブロコナゾール、シブロフラム、ジクロフルアニド、ジクロルポス。

ジクロブトラゾール、シェドフェンカルブ、ジフルコナゾール、ジメチリモル。

ジメトモルフ、ジニコナゾール、ジノカップ、ジチアノン、ドデモルフ、ドジン 。

ニジフェンホス、エチリモル、ニトリジアゾール、フエナリモル、フェンフラム 。

フエンピクロニル、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フェンチンアセテ ート、フェンチンヒドロキシド、フルアジラム、フル才ベンジミン、フルオリミ ド、フルシラゾール、フルトラニ、フルトリアホル、ホルベート、ホセチルアル ミニウム、フベリダゾール、フララキシル、フルメサイクロツクス、グアザチン 、ヘキサコナゾール、イマザリル、イブ口ベンホス、イプロジオン、イソブロチ オラン、オキシ塩化鋼、銅オキシン、酸化鋼のような銅化合物、マンコゼブ。

マネブ、メブロニル、メタラキシル、メタスルホカルブ、メトフロキサム、ミク ロブタニル、ナバム、ニドロタリドプロピル、ヌアリモル、オフラス、オキサシ キシル、オキシカルボキシン、ペンコナゾール、ベンジキュロン、ＰＰ　９６９ ゜プロベナゾール、プロピネブ、プロクロラズ、プロシミドン、プロチオカルブ 。

プロピコナゾール、プロチオカルブ、ビラカルボリド、ピリフエノツクス、ビロ キロン、ラベンザゾール、硫黄、テブコナゾール、チアベンダゾール、チ才ファ ナートメチル、チラム、ドルクロホス−メチル、トリルフルアニド、トリアジメ ホン、トリアジメノール、トリジクラゾール、トリデモルフ、トリプルミゾール 。

トリホリン、ヴインクロゾリン、ジネブ、ナトリウムドデシルスルホナート、ナ トリウム−ドデシルスルフアート、ナトリウム−Ｃ１３／Ｃ１５−アルコールエ ーテルスルホナート、ナトリウムーセトステアリルホスファートエステル、ジオ クチル−ナトリウム−スルホスキナート、ナトリウムイソプロピルナフタリンス ルホナート、ナトリウム−メチレン−ビスナフタリンスルホナート、セチル−ト リメチル−アンモニウムクロライド、長鎖状の第一、第二または第三アミンの塩 、アルコールプロピレンアミン、ラウリル−ピリミジニウムプロミド、エトキシ 化第４級脂肪アミン、アルキル−ジメチル−ベンジル−アンモニウムクロライド および１−ヒドロキシエチル−２−アルキル−イミダシリン。

上記結合物の成分は大部分が、　ＣＨ，ＲＷｏｒｔｈｉｎｇ、　Ｕ、Ｓ、Ｂ、　 Ｗａｌｋｅｒ、　ＴｈｅＰｅｓｔｉｃｉｄｅ　Ｍａｎｕａｌ、第７版（１９８３ ）、　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｃｏｕｎｃｉｌに記 載されている公知の作用物質である。

更に１本発明による作用物質は、前記殺虫剤、誘引物質、殺菌剤、殺ダニ剤。

殺線虫類剤または除草剤のような他の作用物質との混合状態において市販の調合 物並びにこの調合物から調整された使用形懸で存在することができる。殺虫剤と しては１例えばリン酸エステル、カルバマート、カルボン酸エステル、ホルムア ミジン、スズ化合物、微生物によって生成される物質およびその他が数えられる 。

特に混合成分として下記の物質が好適である：１、リン化合物群 アセファート、アザメチホス、アジンホス−エチル、アジンホス−メチル。

ブロモホス、ブロモホス−エチル、クロルフェンビンホス、クロルメホス。

クロルピリホス、クロルピリホス−メチル、デメトン、デメトンー８−メチル、 ダメトン−８−メチルスルホン、ジアリホス、ジアジノン、ジクロルポス、ジク ロルポス、０．　０−１．　２．　２．　２−テトラクロロエチルホスホチオア ート（ＳＤ　２０８　３０４）、ジメトアート、ジスルホトン、ＥＰＮ、ニチオ ン、エトプロホス、エトリムホス、ファンブール、フェナミンホス、フエニトリ オチオン、フェンスルホチオン、フェンチオン、ホノホス。

ホルモチオン、ヘプテノホス、イソゾホス、イソチオアート、イソキサチオン、 マラチオン、メタクリホス、メタミドホス、メチダチオン、サリチオン。

メビンホス、モノクロトホス、ナレド、オメトアート、オキシデメトンメチル、 パラチオン、パラチオン−メチル、フエントアート、ホラート、ホサロン、ホス ホラン、ホスメート、ホスファミドン、ホキシム、ピリミホスーエチル、ピリミ ホスーメチル、プロフェノホス、プロパホス、プロチオホス。

プロチオホス、ビラクロホス、ピリダペンチオン、キナルホス、スルプロホス、 テメホス、テルブホス、テトラクロルビンホス、チオメトン、トリアゾホス、ト リクロルホンおよびバミドチオン；２、カルバマート群 アルジカルブ、２−５ｅＣ−ブチルフェニルメチルカルバマー）　（ＢＰＭＣ） 。

カルバリル、カルボフラン、カルボスルフアン、クロエトカルブ、ベンフラカル ブ、エチオフェンカルブ、フラチオカルブ、イソプロカルブ、メトミル。

５−メチル−ｍ−クメニルブチリル（メチル）カルバマート、オキサミル。

プリミカルブ、プロボクスール、チオジカルブ、チオファノックス、エチル４． ６．９−トリアザ−４−ベンジル−６，１０−ジメチル−８−才キサー７−オ牛 ソー５．ＩＩ−ジチアー９−ドデセノアート（ＯＫ１３５）およびｌ−メチルチ オ（エチリデンアミノ）−Ｎ−メチル−Ｎ（モルホリノチオ）カルバマート（Ｕ Ｃ５１７１７）；３、　カルボン酸エステル群 アレスリン、アルファメスリン、５−ベンジル−３−フリルメチル−（Ｅ）−（ Ｉ　Ｒ）　−ｃｉｓ−２，２−ジメチル−３−（２−オキソチオラン−３−イリ デンメチル）−シクロプロパンカルボキシラート、ビオアレスリン、ビオアレス リン（（Ｓ）−シクロペンチル異性体）、ビオレスメスリン、ビフエナート、（ Ｒ３）−１−シアノ−１−（６−フェノキシ−２−ピリジル）−メチル−（ＩＲ Ｓ）−１−ランス−３−（４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル）−２゜２−ジメチル シクロプロパンカルボキシラー）（ＮＣＩ　８５１９３）、シクロブロスリン、 シフルスリン、ジハロスリン、ジベルストリン、ジフェノスリン、デルタメスリ ン、エムベンスリン、エスフェンバレラート、フェンフルスリン、フェンプロパ スリン、フェンバレラート、フルシスリナート。

フルメスリン、フルバリナー）（Ｄ−異性体）、ベルメスリン、フェオスリン（ （Ｒ）−異性体）、ｄ−プラレスリン、ピレスリン（天然物質）、レスメスリン 、テフルスリン、テトラメスリンおよびトラロメスリン。

５、　スズ化合物群 シヘキサチン、フェンブタチンオキシド６、その他 アバメクチン、バシルスツリンギイエンシス、ベンスルタブ、ビナパシル。

ブロモプロピラード、ブプロフェジン、カムフェクロル、キャルタブ、クロルベ ンジアラート、クロルフルアズロン、２−（４−クロルフェニル）、４゜５−ジ フェニルチオフェン（ＵＢ　ＩＴ　９３０’）　、クロフェンテジン、シクロプ ロパンカルボン酸（２−ナフチルメチル）−エステル（Ｒｏ１２−０４７０）、 シロマシン、Ｎ−（３，５−ジクロル−４−（１，１，２，３゜３．３−ヘキサ フルオロ−１−プロポキシ）フェニル）カルバモイル）−２−クロロベンゾカル ボキシミド−酸エチルエステル、ＤＤＴ、ジコホル、Ｎ−（Ｎ−（３，５−ジク ロロ−４−（１，１，２，２−テトラフルオロエトキシ）フェニルアミノ）−カ ルボニル）−２，６−シフルオロペンゾアミド（ＸＲＤ　４７３）、Ｎ−（２， ３−ジヒドロ−３−メチル−１，３−チアゾール−２−イリデン）２．４−キシ リジン、ジップトン、ジノキャブ、エンドスルファン、エトフェンブロックス、 　（４−エト牛シフエニノリ　（ジメチル）（３−（３−フェノキシフェニル） プロピル）シラン、　（４−エトキシフェニル）（３（４−フルオロ−３−フェ ノキシフェニル）プロピル）ジメチルシラン、フェノキシカルブ、２−フルオロ −５−（４−（４−エトキシフェニル）−４−メチル−１−ペンチル）ジフェニ ルエーテル（ＭＴＩ８００）、顆粒病−および核多角体病ウィルス、フェンチオ カルブ、フルベンゾイミン、フルシクロクロン、フルフェノクロン、ガンマ−Ｈ ＣＨ，ヘキシチアゾックス、ヒドラメチルノン（ＡＣ２１７３００）、イベルメ クチン、２−ニトロメチル−４，５−ジヒドロ−６Ｈ−チアジン（ＳＤ５２６１ ８）、２−ニトロメチル−３，４−ジヒドロチアゾール（ＳＤ３５６５１）、２ −二トロメチレン−１，２−チアシナン−３−イルカルバマルデヒド（ＷＬ　１ ０８　４７７）、プロパルギテ、テフルベンズロン、テトラジホン、テトラスル 、チシクラムおよびトリフルマロン。

植物の遺伝子発現のための全ての遺伝子工学的処理は、他に方法がなかったので ”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　Ｃｏ１ｄ、 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ、　１９８２）に記載されている方法に応じて 実施した。

用いた全酵素は、他になかったので、ビョーリンガー・マンハイム社（Ｆｉｒｍ ａＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から取り寄せた。化学薬品類はメ ルク社（Ｍｅｒｃｋ）　（ダルムシュタット）による。

抗菌性ペプチドのｃＤＮＡ配列をベクター中でクローニングするために。

１１１１　ＨＩおよびＪ”、ｒ／Ｔの制限酵素切断認識部位に結合させ得る末端 部に供給される。

クローニングベクターとしては、ｐＤＨ５１（Ｐｉｅｔｒｚａｋ等、　Ｎｕｃｌ 、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１４．　ｐ、　５８５７．１９８６）を用いた。

ベクターｐＤＨ５１は制限酵素Ｆｉｘ　ＨＩおよび、５’、ｙ／Ｉでプロモータ ーおよびターミネータ−の間に開かれる。ベクターｐＤＨ５１は、カリフラワー モザイクウィルスからの３５３の転写産物のプロモーターおよびターミネータ− 配列を含有するｐＵｃＩ８誘導体である。この配列は植物の転写機構から認識さ れており、そして植物においてその配列に結び付いた遺伝子の強力な連続的発現 に導く。

３５Ｓプロモーター以外に、それぞれ他の植物中で効果的なプロモーターを用い ることもてきる。

抗菌性ペプチドのＤＮＡは、ｌ？ｅｕｒＨ１および、５”ＪノＩの切断部位でプ ロモーター配列方向およびターミネータ−配列と逆方向になるようにベクターに クローニングする。

転写ユニット・プロモーター、遺伝子およびターミネータ−は、制限酵素！ｔｏ 　ＲＩでベクターから切断され、植物形質転換ベクターにクローニングされる。

植物形質転換ベクターとしては７例えば以下のベクターまたはその誘導体が用い られるニ ー　ｐ　ＯＣＡ　１８　（ＯｌｓｚｅｗｓｋＹ等、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、　１６．１０７６５頁、　１９８８）および −ｐ　ＰＣＶ　３１０（Ｋｏｎｃｚ　ａｎｄ　５ｃｈｅ１１．　ＭＧＧ　２０４ ．３８３頁、　１９８６）。

植物のゲノム中に挿入するために、アグロバクテリウムトゥメファシエンス（Ａ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｊｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｆ　プラスミドの重 要なボーダー配列を有するいずれの他の植物形質転換ベクターも同様に使用され 得る。

転写ユニットおよびベクターがｊＣθＲＴ−切断部位に付加した後に。

この構造体をアグロバクテリウム菌株ＭＰ　９０　ＲＫ（Ｋｏｎｃｚ　ａｎｄ　 ５ｃｈｅｌｌ、　ＭＧＧ　２０４゜３８３頁、　＋９８６）；またはＥＨＡ　１ ０１（Ｈｏｏｄ等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６８．１２９１頁。

１９８６）に接合する。

この接合方法は、　’Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｙｏｌｏｇｙ／Ｍａ ｎｕａｌ”　（Ｋｌｕｗｅｒ　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂ！１ｓｈｅｒ、　Ｄｏｒ ｄｒｅｃｈｔ、　１９８８）に記載されている。

タバコ−およびトマト植物は、リーフ・ディスク（ｌｉａｆ　ｄｉｓｃ）法（Ｈ ｏｒｓｃｈ等。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２７．１２２９．　（１９８５））で形質転換する。原則的 にはいずれの他の双子葉植物も形質転換できる。形質転換を行った胞子は抗生物 質カナマイシンに対して伝達された耐性に基づいて選択される。ＤＮＡ分析（サ ザン・プロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ））、　ＲＮＡ 分析（ノザン・プロッティング法（ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ））およ び特異抗体を用いるタンパク質分析（ウェスタン・プロッティング法（Ｗｅｓｔ ｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ））によって、抗菌性タンパク質の発現は形質転換を 行った栽培植物において調査される。

単子葉植物は、直接遺伝子を転写する方法でプロトプラストに形質転換される。

これらのプロトプラストは引き続きそのまま植物へ再分化される（　ＧｅｎｅＴ ｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎ　Ｃｅｒｉａｌｓ、　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　ｒ、、　Ｂｉｏ ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ　８．５３５頁、　１９９０）。

タンパク質を発現する植物は栽培室に移され、そして病原菌類を接種される。

この接種は、菌の種類によっては懸濁液の中の菌糸または分生子で行う。この植 物の接種のために用いるべき発芽時期並びに潜伏期間は植物または病原菌類に左 右される。

以下に本発明を実施例を基にして詳細に説明する。

実施例 １、　アスペルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅ ｕｓ）の培養ａ）　プロデューサー菌株の胞子懸濁液の製造：５００ｒｎＩの三 角フラスコ中で栄養液１００ｒｄ（肉エキス０．７５％、ペプトン１％、澱粉溶 液２％、ＮａＣ１０，５％）に菌株を接種し１回転振盪機を用いて２５°Ｃで、 ７２時間、１２０ｒｐｍで培養する。次に、上記混合物の培養媒体を含む５００ −の三角フラスコ中の培養液２０イを固形化するために２０ｇ／ｌの寒天に加え 、同時にこの溶液を配量し、そしてデカンテーションする。この培養を、１０− １４日間、２５℃で培養する。

この期間の後に発生したフラスコ中の胞子は市販の非イオン化界面活性剤の一滴 を含むイオンを除去した水５００−で洗われ、直ちに用いるか、または−２２℃ で保存する。

ｂ）　三角フラスコ中でプロデューサー菌株の培養物または初期培養物の製造： 上記混合物（ｐＨ６，５）の栄養液１００ｙｄを入れた５００ｒｎｌの三角フラ スコで、傾斜管上に取られた培養物を用いて、または０．　２ｍｌの胞子懸濁液 に接種し、振盪機を用いて１２Ｏｒｐｍで、そして２５℃で培養する。

約８０時間後に生成物最大量に達する（ｐＨ＝５．３）。収量は、約１〜２■／ ｌである。

２、　ポリペプチドの分離と精製 ポリペプチドを（Ｏｌｓｏｎ、　Ｂ、Ｍ、　＆　Ｇｏｅｒｎｅｒ、　Ｇ、Ｌ、　 （１９６５）　ＡｐＨ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１３、３１４−３２１）に基づいて処理する。この次の精製を０．１％のトリフ ルオロ酢酸と共に用いるアセトンニトリル（Ｖ／Ｖ）の５〜２０％の直線的勾配 を持つ０Ｄｓ−１２０Ｔ−カラム（０，４６Ｘ２５ａｎ）上でＨＰＬＣ法によっ て、２ｉ／ｍｉｎの流量率で実施する。

３、　ポリペプチドの特徴 ａ）　酵素による切断： 酵素による切断のために、６Ｍのグアニジンおよび２ｍＭのＥＤＴＡを添加する ＩＭのトリス−ＨＣｌ！バッファー（ｐＨ８）中でポリペプチドを３７°Ｃにて 、２時間培養し、そして０．１Ｍのジチオトリトールの添加によって、３７°Ｃ で、１２時間還元する。還元されたタンパク質を次に０゜１５Ｍのヨウ化アセト アミドで、３７℃にて、２０分間処理する。Ｓ−カルボキシアミドメチル化タン パク質を上記ＨＰＬＣ法によって不純物から分離し、そして次にＯ，ＩＭの重炭 酸アンモニウム塩バッファー（ｐＨ８）中で、キモトリプシン（ＥＣ３，４，２ １，１）で、３７℃にて、３０時間処理する。

タンパク質濃度は、１　：　５０　（ｗ／ｗ）の酵素二基質の比の下で１５０℃ ｇ／−である。

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ　８　プ ロテアーゼ（ＥＣ３、４，２１，１５）を用いる消化をＯ，ＩＭの重炭酸塩バッ ファー（ｐＨ８）中で。

１８時間、３７℃にて実施する。酵素：基質の比はその際１：３０（Ｗ／Ｗ）で ある。

リジルエンドペプチダーゼ（ＥＣ３，４，２１，５０）を用いる天然またはＳ− カルボキシメチル化したタンパク質の処理は、０．１Ｍのトリス−ＨＣ１バッフ ァー（ｐＨ９）を添加された８Ｍの尿素中で、３０分間、３７℃にて行う。これ は引き続きＯ，ＩＭのトリス−ＨＣｌ２　（ｐＨ８）中で、１２時間。

３７°Ｃにて、１　：　１００　（ｗ／ｗ）の酵素二基質の比に消化する。

カルボキシペプチダーゼＹ（ＥＣ３，４，１６，１）を用いるＳ−カルボキシア ミドメチル化タンパク質の消化は２５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ６゜５）中 で、３７°Ｃにて、４時間まで実施する。このとき酵素：基質の比は１　：　３ 　（ｗ／ｗ）である。

ｂ）　アミノ酸分析と配列決定 タンパク質およびその断片は６ＮのＨＣｌ中で、２２時間、１１０℃にて加水分 解される。アミノ酸配列の分析はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプ ロティンシーケンサ−（モデル４７０Ａ）を用いて実施される。

フェニルヒダントインのアミノ酸誘導体はＨＰＬＣ法（ＯＤＳ−１２０Ｔ、０． ４６Ｘ２５ａｎ）でＴｓｕｎａｓａｗａ、　Ｓ、等、　（１９８５）　Ｊ、　Ｂ ｉｏｃｈｅｍ。

（Ｔｏｋｙｏ）　９７．７０１−７０４に基づいて同定される。

フェニルヒダントインＣａｍ−Ｃｙｓは”Ｔｈｅｅｒａｓｌｉｐ、　Ｓ、等、　 （１９８９）。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．６６５５−６６５９”に記載の通りに 決定される。

Ｃ）　シスチンおよびシスティン断片の同定この分析はＥｌ１ｍａｎ’ｓ試薬（ ５，５°−ジチオビス＝（２ニトロベンゾ酸））を用いる反応によって、水素化 ナトリウムホウ素を用いる処理の前および後に、　−Ｈｅｎｓｃｈｅｎ、　Ａ、 　（１９８６）　ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎＭｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉ ｅｂｏｌｄ、　Ｂ、　Ｓａｌｎｉｋｏｗ、　Ｊ、　＆Ｅｒｄｍａｎｎ、　Ｖ、Ａ 、、　ｅｄｓ）　２４４−２５５頁、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂ ｅｒｌｉｎ”に応じて実施される。このタンパク質を水中で２．５％の水素化ナ トリウムホウ素の存在下または不存在下で、５０°Ｃにて、１時間培養した。こ れに引き続き０．３ＮのＨＣｆで３０分間処理して水素化ホウ素を阻害した後、 この試料を０．１１％のＥｌ１ｍａｎ’ｓ試薬て、０．０４Ｍのリン酸バッファ ー（ｐＨ８，１）中で５分間培養した。分光吸収は４１２ｎｍと測定された。

結果： 本発明のタンパク質は以下のアミノ酸配列を示す：Ａｌａ−Ｔｈｒ−ＴｙｒＡｓ ｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−［１ ｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−kｙｓ− Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｎ−５ｅｒＧ　１ｙ−Ｌｙｓ−ＴｈｒＡ　１ａ−１１ｅ−Ｃｙ ｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙ刀@−Ｃｙｓ−Ｐｒ ｏ− Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ− ３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ|Ｃｙｓ。

分析されたアミノ酸の分子量の総量は５．　７８８　Ｄａｌｔｏｎである。

４個のジスルフィド結合が以下のように同定される：Ｃｙｓ　７−Ｃｙｓ　３３ ．　Ｃｙｓ　１４−Ｃｙｓ　４０．　Ｃｙｓ　２６−Ｃｙｓ　２８およびＣｙｓ 　４９−Ｃｙｓ　５１Ｌ４　Ｃｙｓイｙｒ−Ｌｙｓ Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＬｙｓＬ９　Ｔｈｒ−Ａｌ ａ−［１ｅ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＣｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ ＬＩＯＡｓｐ−Ａｓｎ（ｌｅ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ４、　抗菌活性 抗菌活性は、　Ｒｏｅｔｈｅｒ　Ｗ、等、　Ｍｙｋｏｓｅｎ　２７　（１）　１ ４−２８．　（１９８４）に基づし１て実施される。この結果を以下の表１に表 す。

表１゜ ／’／７　ｙｉｌｒθでの菌類に対する本発明の抗菌性ポリペプチドの最小抑制 濃度（μｇ／、／） トリコフィトンメンタグロフィテス　１２５（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｍｅ ｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）トリコフィトンルブルム　６２．５ （Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｕｂｒｕｍ）ミクロスイルム力ニス　１５．２ （Ｍ４ｃｒｏｓｐｏｒｕｍ　ｃａｎｊｓ）カンディダアルビカン　＞＞　１２５ （Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎ） アスペルギルスニゲル　７．８１ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）アスペルギルステレウス　７．５ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒｅｕｓ）アスベルギルスフミガトゥス　７． ３ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）アスペルギルスギガンテウス 　７．８ （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）ベニシリウムカリロフィリウ ム　７．９（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｒｙｌｏｐｈｉｌｉｕｍ）フザリウ ムアクアドゥクトウム　７．２（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ａｑｕａｄｕｃｔｕｍ）フ ザリウムオキシスボルム　７．３ （Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｉｓｐｏ］ｕｍ）５、　１１合の実施例 ａ）　１０重量一部の活性物質および９０重量一部のタルクを不活性物質として 混合し、そしてハンマーミルで粉砕して微粉末を得る。

ｂ）　２５重量一部の活性物質、６５重量一部のカオリン含有水晶を不活性物質 として、１０重量一部のりゲニンスルホン酸カリウムおよび１重量一部のすレオ イルメチルタウリン酸ナトリウムを潤滑剤および分散剤として混合し、そしてピ ン打ち製粉機て粉砕して、水に容易に分散および湿潤できる粉末を得る。

Ｃ）　顆粒は、２〜１５重量一部の活性物質およびアタパルジャイト、顆粒状軽 石および／あるいは石英砂のような不活性の顆粒担持物質から製造される目的に 応じて３０％の固形物質含有量を持つ例ｂ）の湿潤性粉末の懸濁液を用いて、ア タパルジャイト顆粒の表面に噴霧、乾燥し、良くかき混ぜて使用する。この際湿 潤性の粉末の重量の割合は、約５％であり、そして不活性の担持物質のそれは、 製品粉末の約９５％である。

６、　生物学的実施例 約１４日生長したｒヘルツフレイアＪ　（Ｈｅｒｚ　Ｐｒｅｙａ）または「フラ ングスアッカーベルレＪ　（Ｆｒａｎｋ’　ｓ　Ａｃｋｅｒｐｅｒｌｅ）種のソ ラマメは本発明のポリペプチドで均一に湿らされた。スプレー・コーティングの 乾燥後に、植物は灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｊｎｅｒｅａ）の胞子恕 濁液（１５Ｍｉｏ、胞子／ｍｌ’）を用いて接種した（ＢＧＭ−およびジカルボ オキシイミド感受性菌株二表２゜ＢＧＭ−およびジカルボオキシイミド耐性菌株 ＝表３）。この植物をクリーンルームで、２０〜２２℃および相対湿度９９％に て更に培養した。この植物の感染が葉および葉柄の上に黒色斑点の形成で示され る。この実験の評価は接種後、約１週間で行われた。

試験物質の活性度を未処理で感染させた対照物に対してパーセントとして評価し 、そして表２に再度表した。

表２ 実施例による化合物　噴霧混合物ＩＩ！当たりの活性物質（ポリペプチド）■に 対する活性度％ 未処理で　Ｏ 感染させた植物 表３ 実施例による化合物　噴霧混合物１４７当たりの活性物質（ポリペプチド）■に 対する活性度％ 未処理で　Ｏ 感染させた植物 ７、　灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）を用いる遺伝子転写 のトマト植物の接種野性種のトマト植物および同種の遺伝子転写の植物は発芽の ５〜６段階で灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）の分生子を用 いて接種され、そしてこの次に３〜４Ｂ、２０°Ｃおよび相対湿度９９％にて維 持した。その後、実験の評価は視覚的評価によって行った；この際灰色かび病菌 （Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒｅａ）で病気になった遺伝子転写植物の葉の表 面（オリーブグレー色の斑点および萎縮兆候）を野性種と比較して評価した。こ れら植物の感染の程度は表１から明白である。

表４ トマト植物　感染した葉の表面の灰色かび病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ　ｃｉｎｅｒ ｅａ）−感染％ 野性種　９０〜ｌ０ＣＩ 遺伝子転写植物　３０〜６０ ８、スクレロティニスクレロティオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉ　ｓｃｌｅｒｏ ｔｉｏｒｕｍ）を用いる遺伝子転写植物の接種 野性種のタバコ植物および同種の遺伝子転写植物は発芽の第４段階でスクレロテ ィニスクレロティオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ） の菌糸体を用いて接種され、そして約２５℃および相対湿度９０％以上で約３日 間維持した。その後、スクレロティニスクレロティオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎ ｉｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）で感染した遺伝子転写の実験植物の葉の表面（ガ ラス状斑点、菌糸体層）を野性種と比較して評価した。これら植物の感染の程度 は表２から明白である。

表５ タバコ植物　感染した葉の表面のスクレロティニスクレロティオルム（Ｓｃｌｅ ｒｏｔｉｎｉ　ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）−感染％野性種　１００ 遺伝子転写植物　３０〜５５ 国際調査報告 １．１．７細−ｍ　ｍ　ＰＣＴ／び９１１０１Ｇ賛国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 ＺＮＡ　Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：６６） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＢＲ ，ＪＰ、ＵＳ （７２）発明者　ヘーネル・ハインツ ドイツ連邦共和国、デー−６３７０オーベルウルゼル　６、タウヌスストラーセ 、１４８（７２）発明者　ザクセ・プルクハルトドイツ連邦共和国、デー−６２ ３３ケルクハイム（タウヌス）、アン・デル・ツィーゲライ、３０ （７２）発明者　ブラウン・ベーター ドイツ連邦共和国、デー−６５００マイシン３２、プファーレルードルンースト ラーセ、１３ Ｉ （７２）発明者　ヴインク・ヨアヒム ドイツ連邦共和国、デー−６０７４レーデルマルク、マクデブルガー・ストラー セ、１４（７２）発明者　エラケス・ベーター ドイツ連邦共和国、デー−６２３３ケルクハイム（タウヌス）、アム・フラッハ スラント、１８ （７２）発明者　ローゲマン・ユルゲンドイツ連邦共和国、デー−５０００ケル ン３０、ダムプファッフェンウェーク・９（７２）発明者　シェル・ヨーゼフ ドイツ連邦共和国、デー−５０００ケルン３０、カールーフオン−リンネ−ウェ ーク、

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．下記アミノ酸配列を持つポリペプチド：【配列があります】
2. ２．アスペルギルウスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅ ｕｓ）の抗菌性ペプチドの形質を発現する植物細胞。
3. ３．請求の範囲第１項記載の細胞を持つ植物。
4. ４．請求の範囲第１項記載の植物細胞から増殖させた植物，植物の組織，または 再生物質を持つ植物。
5. ５．植物細胞の増殖方法において，アスペルギルスギガンテウス（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓｇｉｇａｎｔｅｕｓ）の抗菌性ポリペプチドの形質を植物細胞中で発 現させることを特徴とする上記方法。
6. ６．請求の範囲第１項記載のポリペプチドの製法において，アスペルギルスギガ ンテウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）を好ましくは１８〜 ３５℃の温度で培養し，そしてポリペプチドを単離することを特徴とする上記方 法。
7. ７．植物に寄生する植物病原菌類を抑制または滅菌するための組成物において， 請求の範囲第１項記載のポリペプチド，および場合により追加の殺虫剤，誘引物 質，滅菌剤，殺ダニ剤，殺線虫類剤または除草剤から成るその他の殺菌剤または 他の活性成分を含有することを特徴とする上記組成物。
8. ８．請求の範囲第７項に基づく組成物の製法において，請求の範囲第１項記載の ポリペプチドを単独でまたはその他の殺菌剤あるいは他の活性成分と混和して適 当な調整剤にすることを特徴とする上記方法。
9. ９．植物を植物病原菌類から防ぐための方法において，植物，植物の種子または 栽培地を請求の範囲第１項記載のポリペプチドの有効量を用いて，処理を好まし くは前，後または同時に他の殺菌剤または殺虫剤，誘引物質，滅菌剤，殺ダニ剤 ，殺線虫類剤あるいは除草剤で処理することを特徴とする上記方法。
10. １０．殺菌剤として請求の範囲第１項記載のポリペプチドの使用。
11. １１．植物病理学剤として請求の範囲第９項記載の使用。