JP4163776B2 - イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体および薬剤および診断剤としてのそれらの使用 - Google Patents
イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体および薬剤および診断剤としてのそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
本発明は、新規なイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体、これらの化合物の製法および薬剤としてのこれらの化合物の使用、および抗体の生成のための抗原としてのこれらの化合物の使用および診断および精製方法におけるこれらの化合物の使用に関するものである。
抗炎症作用、免疫抑制作用または抗増殖作用を有するイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体は、これまでに開示されている（ＥＰ ０ ０１３ ３７６;ＥＰ ０ ２１７ ２０６；ＥＰ ０ ５２７ ７３６）。動物およびヒトの血清におけるこれらの化合物の分析的測定は、普通のクロマトグラフィー方法の助けにより可能である。これらのクロマトグラフィー方法の不利点は、装置、複雑な試料製造工程および低い試料処理量の点において経費がかかることである。
免疫学的測定および分析方法は、クロマトグラフィー方法に代る急速なそして確実な方法である。適当な抗体の生成は、これらの方法を実施するのに、重大である。
【０００２】
本発明は、イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の変性によって、抗体生成に適し、重合体に結合することができそして放射免疫測定法におけるトレーサーとして用いうる化合物として利用しようとするものである。
式Ｉの化合物は、アニリン部分の芳香族環上に、それ自体でまたはスペーサー官能を経て重合体に共有的に結合することのできる１個または２個以上の官能基がある場合に、この目的を達成するのに適しているということが見出された。
【０００３】
それ故に、本発明は式Ｉ
【化８】
の化合物および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩および（または）式Ｉの任意の立体異性形態の化合物に関するものである。
【０００４】
上記式において、
Ｒ1は、式IIまたはIII
【化９】
の基であり、そして
Ｒ2は、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ2（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｂ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは整数１、２または３でありそしてハロゲンは弗素、塩素、臭素または沃素である）
(ｃ) 式Ｖ
【化１０】
（式中、Ｒ3は、（１）ハロゲンまたは（２）ＮＨ2であり、そしてＲ4は、（１）水素原子または（２）アミノ酸の基である）の基、または
(ｄ) −ＮＨ2である。
【０００５】
式Ｉの好ましい化合物は、
Ｒ1が、式IIまたはIIIの基であり、そして
Ｒ2が、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは整数２であり、そしてハロゲンは臭素または沃素である）、
(ｂ) −Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2または
(ｃ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ(Ｒ3)(Ｒ4)（式中、Ｒ3は臭素、−ＮＨ2または塩素でありそしてＲ4は水素原子である）
である化合物である。
【０００６】
式Ｉの特に好ましい化合物は、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−アリルオキシフェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド、
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドまたは
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
のような化合物である。
【０００７】
式Ｉにおける基Ｒ2は、フェニル環上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、好ましくはパラ−位にあることができる。
式Ｉの化合物は、場合によっては、光学的異性体、ジアステレオマー、ラセミ体またはこれらの混合物として存在することができる。“アミノ酸”なる用語は、以下の化合物の立体異性形態、例えばＤおよびＬ形態を意味するものとして理解されるべきである：アスパラギン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トリプトファン、β−アラニン、リジン、プロリン、グリシン、γ−アミノブチレート、Ｎε−アセチルリジン、Ｎδ−アセチルオルニチン、Ｎγ−アセチルジアミノブチレート、Ｎα−アセチルジアミノブチレート、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン、トレオニン、アラニンおよびチロシン。Ｌ−アミノ酸が好ましい。アミノ酸残基Ｇｌｙが特に好ましい。
【０００８】
アミノ酸残基は、相当するアミノ酸から誘導される。アミノ酸に対する簡単な表示法は、一般的な慣用の表示法にしたがう。基（Ｒ4）は、それぞれのアミノ酸の側鎖を示す。
式Ｉの化合物の適当な生理学的に許容し得る塩は、例えば有機アンモニウム塩基の塩を包含するアルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩およびプロトン化アミノ酸残基の塩である。
【０００９】
本発明は、また
(ａ) 式VI
【化１１】
（式中、Ｒ6は、基ＯＨ、ＣｌまたはＢｒである）の化合物を、式VII
【化１２】
（式中、Ｒ7は、
(１) −ＮＨ2、
(２) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基（式中、保護基は、アミン保護基、特にＢｏｃである）、
(３) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンまたは
(４) −ＯＨである）の化合物と反応させて、Ｒ1が式IIの基でありそしてＲ2が、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基、−ＯＨまたは−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンである式Ｉの化合物を得、または
(ｂ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された化合物を、アルキルハライドまたはジハロアルカン（アルキル部分は２、３または４個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｃ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された化合物を、不飽和アルキルハライド（アルキル部分は３、４または５個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｄ) Ｒ7が−ＮＨ2である方法（ａ）により製造された化合物を、臭化ブロモアセチルのようなカルボン酸ハライドと反応させて、Ｒ2が式Ｖの基であり、Ｒ3がハロゲンでありそしてＲ4が水素原子である式Ｉの化合物を得、または
(ｅ) ｐ−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミンをアミノ基が保護されたアミノ酸と反応させてＲ7が式Ｖの基であり、Ｒ3が−ＮＨ2でありそしてＲ4が保護されたアミノ酸である式VIIの化合物を得、そしてそれから方法(ａ)におけるように反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｆ) 方法（ａ）または（ｅ）により製造された式Ｉの化合物における保護基を除去し、または
(ｇ) Ｒ1が式IIの基である方法（ａ）〜（ｆ）により製造された式Ｉの化合物をＲ1が式IIIの基である式Ｉの化合物に変換し、または
(ｈ) 方法（ａ）〜（ｇ）により製造された式Ｉの化合物を遊離形態で単離するかまたは酸性または塩基性基が存在するときに、場合によってそれを生理学的に許容し得る塩に変換することからなる式Ｉの化合物および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩および（または）式Ｉの任意の立体異性形態の製法に関するものである。
【００１０】
(ａ)による方法工程においては、例えばイソオキサゾール−４−カルボン酸（Ｒ6は−ＯＨである）を、文献から知られている方法によって、例えば非プロトン性溶剤（例えばトルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）または塩素化炭化水素）中で塩化チオニルまたはオキシ塩化燐によって酸クロライドに変換しそしてそれから、それを、双極性の非プロトン性溶剤、例えばＴＨＦまたは塩素化炭化水素中で、有機塩基、例えば第３級アミン（例えばトリエチルアミンまたはＮ−エチルモルホリン）を添加して、適当な方法で、場合によっては置換されている芳香族アミンと反応させることができる。このようにする代わりに、アミド形成は、ペプチド化学から知られている縮合試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを添加して、カルボン酸から直接実施することもできる。第二の変形方法は、さらにアミノまたはアルコール基を有する芳香族アミンに対して特に適している。
【００１１】
方法工程（ｂ）または（ｃ）においては、アニリン部分により導入されたヒドロキシ基は
(１) それを、有機または無機塩基、例えば炭酸カリウムを添加して、アルキルハライドまたはジハロアルカン、例えば１,３−ジヨードプロパンと反応させて相当する置換された芳香脂肪族エーテルを得る（後者の場合においては、二量化は、生成物中においてアルキルハライド官能が固定相に対する生成物の結合のために残留するような適当に大過剰のアルキル化試薬または溶剤としてのその使用によって避けることができる）か、または
(２) それを、同様な条件下において双極性の非プロトン性溶剤、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトンまたは塩素化炭化水素中で、不飽和アルキルハライド、例えばハロゲン化アリルまたはハロゲン化プロパルギルと反応させてアリルまたはプロパルギルエーテルを得る（同時的に溶剤としてアセトンおよび塩基として炭酸カリウムを使用する場合は、（ｇ）に記載したイソオキサゾール部分（式IIの基）の開環が起こる）
ことによって、さらに官能化される。
【００１２】
方法工程（ｄ）においては、ＴＨＦまたは塩素化炭化水素のような双極性の非プロトン性溶剤において有機塩基、例えば第３級アミン（例えばトリエチルアミンまたはＮ−エチルモルホリン）を添加して、アミノ基をカルボン酸ハライド、例えば臭化ブロモアセチルと反応させる。
方法工程（ｅ）においては、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを使用し、アミノ基において保護されたアミノ酸、例えばＮ−Ｂｏｃ−グリシンを使用して、芳香族ジアミン、例えばｏ−フェニレンジアミンを、制御された方法でモノアミドに変換し、それからアニリド形成を方法工程（ａ）に記載したように実施しそして最後にアミン保護基をペプチド化学から知られている標準条件下で除去する（方法工程（ｆ））。
方法工程（ｇ）においては、（ａ）〜（ｆ）において製造された化合物は、イソオキサゾール部分の塩基−誘発開環反応に付される。反応は、好ましくは、過剰の有機または無機塩基、例えばＮａＯＨ、アンモニア溶液または炭酸カリウムを使用して、水性／有機溶剤混合物、例えばＴＨＦ／水またはエタノール／水中で実施される。
【００１３】
一般式Ｉの化合物がジアステレオ異性形態またはエナンチオマー形態で存在しそして選択された合成においてその混合物として得られる場合は、純粋な立体異性体への分離は、任意のキラル支持物質上のクロマトグラフィーによって実施される、または、式Ｉのラセミ化合物が塩形成することができる場合は、補助剤として光学的に活性な塩基または酸を使用して形成されたジアステレオマー塩の分別結晶によって活性な異性体に分離することができる。原則的に同一の方法において、アミノ基のような塩基性基を含有する式Ｉのラセミ化合物は、光学的に活性な酸、例えば（＋）−樟脳−１０−スルホン酸、Ｄ−およびＬ−酒石酸、Ｄ−およびＬ−乳酸または（＋）および（−）−マンデル酸を使用して純粋なエナンチオマーに変換することができる。
【００１４】
本発明は、また、医薬的に適当なそして生理学的に許容し得る賦形剤、添加剤および（または）活性化合物および補助剤に加えて、式Ｉの少なくとも１種の化合物および（または）式Ｉの化合物の立体異性形態および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩の有効量を含有する薬剤に関するものである。本発明による薬剤は、静脈内的に、非経口的に、局処的に、直腸的にまたは経口的に投与することができる。
本発明による薬剤は、好ましくは、癌性疾患、炎症および自己免疫疾患の予防および（または）治療に適している。
これらは、例えばリウマチ性疾患、筋肉、関節または胃腸管の急性および慢性炎症、アレルギー気道疾患、乾癬または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、II型糖尿病、重症筋無力症、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、硬化性皮膚炎または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する。癌性疾患は、例えば肺癌、白血病、カポシー肉腫、卵巣癌、肉腫、髄膜腫、腸癌、リンパ節の癌、脳腫瘍、乳癌、胃癌、膵臓の癌、前立腺の癌または皮膚癌を包含する。
【００１５】
本発明は、また、本発明による薬剤を製造する方法に関するものでありそしてこの方法は、医薬的に適当なそして生理学的に許容し得る賦形剤および適当である場合はさらに適当な活性化合物、添加剤または補助剤を使用して、式Ｉの少なくとも１種の化合物を適当な投与形態にすることからなる。
適当な固体または液体の医薬製剤形態は、例えば顆粒、粉末、被覆錠剤、錠剤、（ミクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、エマルジョン、滴下剤または注射用溶液および活性化合物を持続的に放出する製剤である。これらの製剤においては、慣用的な補助剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑走剤または滑沢剤、風味料、甘味料および可溶化剤が使用される。しばしば使用される補助剤は、例えばタルク、澱粉、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、乳汁蛋白質、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、例えばタラ肝油、ヒマワリ、落花生またはゴマ油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水および一価または多価アルコール、例えばグリセロールである。
【００１６】
医薬製剤は、好ましくは、活性成分として、本発明による式Ｉの化合物のある投与量を含有する投与単位で製造されそして投与される。錠剤、カプセル、被覆錠剤または坐剤のような固体の投与単位の場合においては、この投与量は約１０００mgまで、好ましくは約５０〜３００mgであり、そしてアンプル形態の注射用溶液の場合においては、この投与量は約３００mgまで、好ましくは約１０〜１００mgである。ヒトおよび動物の場合における体重約７０kgの成人患者の治療に対しては（式Ｉの化合物の効能によって）、経口的投与の場合においては活性化合物約５０〜３０００mg、好ましくは約１５０〜１０００mgの一日当りの投与量そして静脈内投与の場合においては、約５０〜１０００mg、好ましくは１００〜３００mgの一日当りの投与量が適用される。しかしながら、ある状況下においては、より高いまたより低い投与量もまた適している。一日当りの投与量は、個々の投与単位またはさもなければいくつかのより小さい投与単位の形態の１回の投与によってまたは特定の間隔における小分けされた投与量の多数回の投与によって投与することができる。
さらに、本発明は、場合によっては重合体または固体に架橋員を経て結合される式Ｉの化合物に関するものである。
【００１７】
これらは、式IV
【化１３】
〔式中、Ｒ1は、式IIまたはIII
【化１４】
の基であり、
Ｌは、
(ａ) −Ｏ−、
(ｂ) −ＮＲ5−（式中、Ｒ5は水素原子である）、
(ｃ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ2−（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｄ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ−(Ｒ4)(Ｒ3)（式中、Ｒ3は（ａ）共有結合または（ｂ）−ＮＨ−でありそしてＲ4は（ａ）水素原子または（ｂ）アミノ酸の基である）、または
(ｅ) −ＮＨ−(ＣＨ2)m−Ｓ−（式中、ｍは１〜１２の整数である）の基であるスペーサーを有する（ａ）〜（ｄ）に定義した架橋員Ｌからの架橋員であり、そして
Ｘは、重合体または固体である〕
の化合物である。
【００１８】
式IVにおける基“Ｌ−Ｘ”は、フェニル環上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、好ましくはパラ−位にあることができる。“重合体”なる用語は、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、ラテックス、ポリサッカライド、セファロース、蛋白質、脂質、シリケートまたは核酸からなる群からの合成または天然の重合体を意味するものとして理解されるべきである。重合体は、場合によっては、これらが式Ｉの化合物に結合することができるために、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2および−ＣＯ−からなる群からの１個または２個以上の官能基を具備していなければならない。式Ｉの化合物を固体に結合する一般的方法は、例えばBI Application Handbook, Ed. 1994, Figure 4.1, (Merk AB, Uppsala Sweden）に記載されている。“固体”なる用語は、微粒子であることができるまたは管、ビーズまたはミクロタイタープレートのような幾何学的態様で存在することのできる不溶性物体を示す。
【００１９】
式IVの好ましい化合物は、式Ｉの化合物が固体または重合体に結合される場合の化合物である。式IVの特に好ましい化合物は、５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドまたは２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドのような式Ｉの化合物が固体または重合体に結合される場合の化合物である。
式IVの化合物は、また、細胞抽出液、血清、血液または滑液からの特異的−結合蛋白質の発見に対して、蛋白質の精製に対して、ミクロタイタープレートの変性に対してまたはクロマトグラフィー物質、特にアフィニティークロマトグラフィー物質の製造に対して適している。精製に適した蛋白質は、重合体または固体に結合した式Ｉの化合物と直接相互作用する。化合物は、また診断に使用するのに適している。
式IVの化合物の場合において特に適した固体は、(R)ＢＩＡコアー ＣＭ５チップまたはクロマトグラフィー検査または分離に対する固定相そしてまたミクロタイタープレートである。
【００２０】
実施例１
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−アミノフェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸１０.１ｇ（０.０８モル）およびｐ−フェニレンジアミン８.６５ｇ（０.０８モル）を、テトラヒドロフラン３００mlに溶解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.０５ｇ（０.０８８モル）を加える。５時間後に、沈降した沈殿を、吸引濾去し、有機相を濃縮しそして生成物を、１％の氷酢酸を添加した酢酸エチル／石油エーテルを使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理しそしてそれから、酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：融点１２３℃〜１２８℃の酢酸塩６.８ｇ。
工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
工程(ａ)からの生成物２.１７ｇ（０.０１モル）を、はじめに、Ｎ−エチルモルホリン１.９ｇ（０.０１６モル）と一緒に、テトラヒドロフラン５０mlに導入しそして、氷浴中において、臭化ブロモアセチル２.４ｇ（０.０１２モル）の溶液を滴加しそしてそれから、混合物をさらに、室温で５時間撹拌する。水５mlの添加後、それを１Ｎ ＨＣｌを使用してpH２に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出しそして有機相を水で洗浄し、乾燥しそして濃縮する。生成物を、酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：２.０ｇ。融点１７９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 4.05(s, 2H), 7.5-7.75(m, 4H), 9.1(s, 1H), 10.1および10.45(それぞれの場合においてsb, 1H)。
【００２１】
実施例２
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
実施例１からの生成物０.５ｇ（０.００１５モル）を、テトラヒドロフラン１０mlに溶解しそして１Ｎ水性ＮａＯＨ ２mlを、氷冷下で加える。反応をＴＬＣにより監視しそして完了後（約６０〜９０分後）に、生成物を１Ｎ水性塩酸２.２５mlによる酸性化および水１００mlの添加によって、沈殿させ、濾過し、撹拌しながら水で洗浄し、それから小量の酢酸エチルで洗浄しそして減圧下で乾燥する。収量：０.２８ｇ。融点２１０℃より高い。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.28(s, 3H), 4.04(s, 2H), 7.4-7.7(m, 4H), 8.5-10(sb, 1H), 10.4(sb, 2H)。
【００２２】
実施例３
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド塩酸塩
工程(ａ) ２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチルアミノ−ｐ−フェニレンジアミン
ｐ−フェニレンジアミン８.６５ｇ（０.０８モル）を、Ｎ−Ｂｏｃ−グリシン１５.３ｇ（０.０８８モル）と一緒に無水のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００mlに溶解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.０５ｇ（０.０８８ｇモル）を小量ずつ加える。５時間後に、沈降した沈殿を吸引濾去し、濾液を濃縮しそして生成物を、酢酸エチル／メタノール／酢酸を使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理することにより精製しそしてそれから酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。
収量１３.５ｇ。融点１４４℃。
工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボニルクロライド
はじめに、５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸１２７.１ｇ（１.０モル）を、トルエン１Ｌに導入し、塩化チオニル１２９.８ｇ（１.１モル）を滴加しそしてそれから、混合物を８０℃で６時間加熱する。容量を減圧下で約１／２に濃縮しそしてトルエン溶液を、さらに反応のために直接使用する。
工程(ｃ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチルアミノ）フェニル）アミド
はじめに、工程(ａ)からの生成物１３.５ｇ（０.０５モル）を、Ｎ−エチルモルホリン７.６ml（０.０６モル）と一緒に、ＴＨＦ １００mlに導入しそして工程(ｂ)からの溶液３０ml（０.０６モルに相当する）を０℃で滴加する。混合物を室温でさらに５時間撹拌し、水性クエン酸で加水分解しそして生成物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥しそして減圧下で濃縮する。収量：１２ｇ。融点１３９℃。
工程(ｄ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド塩酸塩
工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モル）を、ジクロロメタン１８０mlに溶解しそしてトリフルオロ酢酸１８mlを加える。混合物を室温で１時間撹拌しそして濃縮しそして生成物をエタノールに溶解し、過剰のエタノール性ＨＣｌを加え、濃縮しそして残留物を酢酸エチルと一緒に撹拌することにより洗浄することによって、塩酸塩に変換する。収量：２.５ｇ。融点２１０℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 3.7-3.9(m, 2H), 7.6および7.72(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 8.25(sb, 2H), 9.3, 10.2および10.75(それぞれの場合においてs, 1H)。
【００２３】
実施例４
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミドトリフルオロ酢酸塩
実施例３の工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モル）を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０ml／エタノール２mlに溶解しそして混合物を、室温で開環が完了するまで（約３時間）撹拌する。水性クエン酸で酸性にすることによって、Ｂｏｃ−保護された生成物を固体の形態で得そして吸引濾過しそして乾燥する（融点１８９℃。収量５.５ｇ）。この中間体生成物５ｇを、実施例３(ｄ)と同様にしてジクロロメタン中においてトリフルオロ酢酸で処理しそして生成物を、酢酸エチルおよび石油エーテルを使用してトリフルオロ酢酸塩としてエタノールから結晶化する。収量：５.０ｇ。融点２０９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.15(s, 3H), 3.7-3.85(m, 2H), 7.49(s, 4H), 8.1(sb, 3H), 10.3および11.2(それぞれの場合においてsb, 1H)。
【００２４】
実施例５
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒドロキシフェニル）アミド６.５ｇ（０.０３モル）を、１,３−ジヨードプロン５７ml（０.５モル）に溶解しそして細かに粉砕された炭酸カリウム２６.２ｇ（０.１９モル）をはげしい撹拌下で加える。反応は約４時間後に完了する。濾過、濃縮および１％の氷酢酸を添加した酢酸エチル／石油エーテル（１：１）を使用したシリカゲル上のクロマトグラフィー処理によって処理を実施する。収量：６.７ｇ。
工程(ｂ) ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
工程(ａ)からの生成物５.５ｇを、約１Ｎのメタノール性アンモニア溶液２００ml中で、開環が完了するまで処理し、混合物を濃縮し、残留物を稀酢酸にとりそして１％の氷酢酸を加えた酢酸エチル／石油エーテルを使用してクロマトグラフィー処理し、それから酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：２.３ｇ。融点１４９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.1-2.4 2.3ppmで(m, 2Hおよびs, 3H), 3.4および4.02(それぞれの場合においてt, 2H), 6.92および7.42(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 7.2-8.5(ssb, 1H), 10.2(s, 1H)。
【００２５】
実施例６
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−アリルオキシフェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒドロキシフェニル）アミド１.５ｇ（０.００６８モル）を、アセトンに溶解し、臭化アリル５.８ml（０.０６８モル）およびはげしい撹拌下で細かに粉砕された炭酸カリウム９.３ｇ（０.０６８モル）を加え、それから混合物を室温で一夜撹拌する。それを濾過し、濾液を濃縮しそして残留物を水にとりそして酢酸エチル／石油エーテルから再結晶する。収量：０.８ｇ。融点１６２℃〜１６４℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.3(s, 3H), 4.45-4.63(m, 2H), 5.15-5.38(m, 2H), 5.9-6.2(m, 1H), 6.95および7.42(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 10.0(sb, 1H), 12.5-14.5(ssb, 1H)。
【００２６】
薬理学的試験
試験管内増殖における細胞培養を、式Ｉの化合物に対する活性度試験として使用する。
実施例７
増殖試験
１０Ｌ用の粉末形態のＬ−グルタミンを含有しそしてＮａＨＣＯ3を含有していないClicks／ＲＰＭＩ １６４０培地（５０：５０）（Seromed, Biochrom, Berlin, FRG）を、二重−蒸溜水９Ｌに溶解しそしてそれぞれのびんが９００mlを含有するように、びん中に滅菌−濾過する。
洗浄培地
基培地９００mlを、７.５％の強度の炭酸水素ナトリウム溶液９.５mlおよびＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）（Gibco, Eggenstein, FRG）５mlで緩衝化する。
使用培地
基培地９００ml＋ＮａＨＣＯ3溶液（７.５％；ＨＥＰＥＳ溶液１０mlおよびＬ−グルタミン溶液（２００mM）１０ml）。
【００２７】
マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対して使用された培地は、１％の加熱−不活性化（３０分、５６℃）したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で強化された使用培地である。
腫瘍細胞培地
腫瘍細胞およびハイブリドーマ細胞を保持するために、５％のＦＣＳを含有する使用培地を製造する。
細胞系に対する培養培地
細胞系を保持するために、１０％のＦＣＳを含有する使用培地９００ml、ＮＥＡ（非必須アミノ酸）溶液（Gibco）１０ml、ピルビン酸ナトリウム溶液（１００mM、Gibco）１０mlおよび１０-2Ｍのメルカプトエタノール５mlを混合する。
マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対する脾臓細胞の獲得および処理
マウスを、頸部脱臼によって殺しそして脾臓を滅菌条件下で取り出す。脾臓は、８０メッシュのメッシュ幅を有する滅菌ふるい上で切裂きそしてプラスチック注射器（１０ml）のプランジャを使用して、注意深く使用培地を含有するペトリ皿に排出する。脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去するために、混合物を低張０.１７Ｍ塩化アンモニウム溶液中で時折振盪しながら室温で約１分培養する。赤血球はこの過程において溶解するが、リンパ球の生命力および反応性は影響されない。遠心分離（７分／３４０ｇ）後、溶解産物を捨てそして細胞を２回洗浄しそしてそれからそれぞれの試験培地にとる。
マイトジエン−誘発リンパ球増殖
雌のＮＭＲＩマウスからの５×１０5の処理した脾臓細胞を、種々なマイトジエンおよび調製物（式Ｉの化合物）と一緒に、平底ミクロタイタープレート中の１個の穴当り２００μlの試験培地にピペットで導入する。次のマイトジエンおよび調製物濃度を使用する。
コンカナバリンＡ〔Serva〕： 0.5-0.25-0.12 μg／ml
リポポリサッカライド〔Calbiochem〕： 1.0-0.5-0.1 μg／ml
フィトヘマグルチニン〔Gibco〕： 0.5-0.25-0.12％ 原液
アメリカヤマゴボウ(pokeweed)マイトジエン〔Gibco〕化合物１または２:
50、25、10、7.5、5、2.5、1、0.5、0.1 μモル
【００２８】
正のコントロールは、マイトジエンを添加しそして調製物を使用しないグループとして定義される。負のコントロールは、調製物を使用しそしてマイトジエンを添加しない培地における細胞である。それぞれのマイトジエン濃度は、すべての調製物濃度を使用して４回試験した。３７℃／５％ ＣＯ2で４８時間培養した後、０.２５μＣ／穴（９.２５×１０3Ｂｑ）の活性を有する２５μl／穴のトリチウム−チミジン（Amersham）を細胞に加える。さらに、１６時間の同じ条件下における培養を行なう。試験バッチを評価するために、細胞を細胞収穫器（Flow Laboratories）によって濾紙上に収穫する。取り込まれないチミジンは、別の廃棄びん中に集める。濾紙を乾燥し、パンチアウトしそしてシンチレーター（Rotiszint 22, Roth）２mlと一緒にシンチレーション容器に加え、それからこれをさらに２時間４℃に冷却する。細胞により取り込まれた放射能をβ−計数装置（Packard, Tricarb-460C）中で測定する。
増殖試験に対する腫瘍細胞および細胞系の製造
試験に使用した腫瘍細胞または細胞系は、対数増殖期の原溶液からとり、洗浄培地で２回洗浄しそして適当な培地に懸濁した。
増殖試験の実施および評価
増殖試験は、丸底ミクロタイタープレートにおいて実施した。式Ｉの化合物およびインターロイキンを、それぞれ５０μl／穴の適当な培地に溶解しそして２００μl／穴の最終容量が得られるようにして細胞数計測（５×１０5）を１００μl／穴で調節する。すべての試験において値は４回測定する。調製物を使用せずそして生長因子を使用しない細胞は負のコントロールとして定義される。そして調製物を使用せずそして生長因子を使用した細胞は、正のコントロールに対する値を与える。負のコントロールの値を測定したすべての値から引きそして正のコントロール−負のコントロールの差を１００％とする。
【００２９】
ミクロタイタープレートを３７℃／５％ ＣＯ2で７２時間培養しそして増殖率を、マイトジエン−誘発リンパ球増殖におけるように測定する。
細胞系は、菌株収集機関であるアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。
表１は、５０％の阻止が起こる濃度を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
実施例８
(R)BIAcore CM5 マトリックスに対して実施例２による化合物を結合する方法
出発物質は、カルボキシメチルデキストラン界面を有するPharmacia BiosensorからのＣＭ５チップである。カップリング工程は、すべて５μl／分の流速で実施する。工程はすべて、ランニング緩衝液としてpH７.４のヘペス緩衝食塩水（ＨＢＳ）を使用して、２５℃で実施する。
第１工程：チップ表面を活性化するための０.０５Ｍ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）および０.２Ｍ ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の１：１混合物。
第２工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の４０mMのシスタミンジ塩酸塩溶液３５μl。
第３工程：占有されていないマトリックス構造を飽和するためのpH８.５のエタノールアミン塩酸塩３５μl。
第４工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の０.１Ｍ ジチオスレイトール３５μl。
第５工程：pH７.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の実施例２による化合物（１０mg／ml）を含有する溶液３５μl。
【００３２】
実施例９
分析に対して使用したBIAcore法
分析は、実質的にCurrent Biology（Vol. ３，No. 12, 1993, 913-915頁）に記載されているようにして実施した。
システム：相当するソフトウエアーを有する(R)BIAcore 2000（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）
チップ：CM5 センサーチップ（Pharmacia Biosensor AB）、
コーティング：実施例８による
ランニング（Running）
緩衝液：HBS緩衝液、BIA保証された（Pharmacia Biosensor AB）
流速：１０μl／分
注入：分析される試料５０μl当り５分の会合段階
リンシング（Rinsing）
時間：１８０秒３分の解離段階
再生：０.０５％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して２×１５秒
“共鳴単位（Resonance Units）”なる用語は、結合した蛋白質に比例する定量的単位である。
【００３３】
調査したデヒドロゲナーゼの相対的結合強度を、定義された蛋白質濃度において、相互に比較した。１μＭの蛋白質濃度において、ジヒドロオロト酸ＤＨの結合がもっとも強く、次いで乳酸ＤＨ、グリセルアルデヒドリン酸ＤＨおよびピルビン酸キナーゼがそれにつづく。
【００３４】
実施例１０
アフィニティークロマトグラフィー
式Ｉによる化合物をその反応性臭素基を経て支持マトリックスに結合させる。使用した支持物質は、Fractogel(R) EMD-SH（Merck KGaA, Darmstadt）である。DE 43 10 964に記載されているような標準プロトコールによって、共有結合を実施する。得られたゲルを、Superformance(R)（１cm×５cm）カラム（Merck KGaA）に充填しそして高速液体クロマトグラフィー装置に接続する。
可溶性細胞蛋白質の取得
菌株ＲＡＷ ２６４.７（ＡＴＣＣ菌株収集）を、全面生長に達するまで４８時間培養しそして冷たい４℃のＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して培地を除去しそして細胞をＰＢＳ緩衝液に移しそして２００ｇで１０分遠心分離する。細胞処理は４℃で実施する。細胞ペレットを２０mMトリス塩基、２mM ＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏおよび１mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる緩衝液Ａに再懸濁する。細胞−内因性プロテアーゼによる蛋白質分解を阻止するために、種々なプロテアーゼ阻害剤の混合物を加える。それから混合物を、ガラスポッター中で均質化する。それから懸濁液を、４℃で２２,０００ｇで３０分遠心分離して可溶性蛋白質を得る。
【００３５】
上澄液は直ちにアフィニティークロマトグラフィーに対して再使用する。上澄液の一部を参照として保持しそして残りの部分をアフィニティーカラムにポンプ注入する。
ＨＰＬＣ
イタリーのミラノのKontron Instrumentsからの装置を、アフィニティークロマトグラフィーに対して使用する。このシステムは、Autosampler ４６５、ＨＰＬＣポンプ４２２および４２２Ｓ、高−圧混合バルブＭ８００、Bestaモーターバルブおよびダイオードアレイ検出器４４０からなる。データ記録および分析は、Data System 450-MT2／DAD系を使用して実施する。細胞上澄液は、水で３０mlの容量にうすめそして１ml／分の流速で注入する。クロマトグラフィーの完了まで、フラクションとして漏出液を集めそして４℃で貯蔵する。
【００３６】
次の緩衝液を、蛋白質のグラジエント溶離に使用する：
ＰＢＳ緩衝液の組成：
ＮａＣｌ ８.００ｇ／Ｌ
ＫＣｌ ０.２０ｇ／Ｌ
ＫＨ2ＰＯ4 ０.２０ｇ／Ｌ
Ｎａ2ＨＰＯ4×７Ｈ2Ｏ ２.１６ｇ／Ｌ
【００３７】
表２において使用した緩衝液の組成：
蛋白質溶液を注入した後、表２によるグラジエントを、３ml／分の流速で開始する。
【００３８】
【表２】
フラクションを集め、４℃でＨ2Ｏに対して４８時間透析し（使用した透析膜の排除限界６０００−８０００Da）（アセトニトリルフラクションを除く）そしてそれから凍結乾燥する。
【００３９】
蛋白質測定
凍結乾燥後、蛋白質を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１mlに溶解しそして水で０.５％ＳＤＳにうすめる。この溶液のアリコートをとりそしてＢＣＡ試験（Pierce）を使用する蛋白質測定に使用する。蛋白質を蒸発し（UNIVASPO 150H, UniEquip Power Heater, Martinsried, Germany）そしてそれから、スクロース１０ｇ、０.２５Ｍトリス／１Ｍグリシン溶液９ml、１０％ＳＤＳ ７.８ml、ブロモフェノールブルー（０.１％）２.５ml、β−メルカプトエタノール４mlおよび水１.７mlからなる適当な容量の試料緩衝液にとる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１０〜１７％のポリアクリルアミド勾配を有するＳＤＳゲルを製造するために、次の溶液を製造する。
【表３】
重合は、１０％ＡＰＳ １００μlおよびＴＥＭＥＤ １２.５μlの添加によって開始する。捕集ゲルは、アクリルアミド（１０％、０.５％）３ml、水１.３６ml、０.５Ｍ トリス（pH６.８）１.４５ml、１０％ＳＤＳ ６０μl、１０％ＡＰＳ １０６μlおよびＴＥＭＥＤ ９μlから製造する。
分析用のゲルを製造するために、分取ゲル１００μｇに対して、トラック当り蛋白質１０μｇを負荷する。
分子量の測定は、蛋白質標準混合物と比較することによって実施する。
【００４０】
配列決定
分析用ゲル中の濃縮された蛋白質のバンドを示す蛋白質フラクションを、分取規模で分離しそして分離した蛋白質を、ＰＶＤＦ膜（Millipore）上にブロットすることによって固定化する。蛋白質をクマシーで染色することによって可視化しそしてそれから直接エドマン分解にうけしめる。クマシー染色ゲルに対する電気泳動後に、Ｎ−末端がブロックされた蛋白質を注意深く切り離しそして水で中性になるまで洗浄する。ゲルの小片を、一方のふるいが他方のふるいの背後に横たわっておりそして１００μｍおよび３２μｍのメッシュ幅を有する２枚のスチールふるいにより圧縮して均質化する。軟こう−様の物質を、UNIVAPO 150（UniEquip Power Heater, Martinsried, Germany）中で低残留湿気まで乾燥する。このようにして得られた蛋白質を、pH８.５の２５mMトリスＨＣｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる緩衝液中で、酵素エンドプロティナーゼ LysdC（Boehringer, Mannheim）（酵素対蛋白質の比約１：１０）を使用して３７℃で７時間インキュベートすることによってペプチドに開裂する。
【００４１】
得られたペプチドを、６０％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡのそれぞれ１mlを使用して３７℃で４時間２回溶離する。合した溶離液をＵＮＩＶＡＰＯ中で蒸発しそして得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーによって分離する。クロマトグラフィーは、Ａ：Ｈ2Ｏ中の０.１％のＴＦＡ〜Ｂ：アセトニトリル中の０.１％のＴＦＡの線状勾配（１％／分）を使用して、LiChroCART(R)125-2 Superspher(R)60カラム上で７０分実施する。
【００４２】
精製されたペプチドのアミノ酸配列は、４７７Ａガス−相セクエンサー（Applied Biosystems）上でエドマン分解原理によって実施する。ＰＴＨ−ＡＡの確認は、２６９nmで１２０Ａフェニルチオヒダントインアミノ酸アナライザー（Applied Biosystems）上で実施した。
ウエスターンブロット分析
蛋白質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した後に、未被覆面積を、pH７.４の５Ｌ中のＮａＣｌ ４５ｇ、トリス塩基３０.３ｇからなるＴＢＳ中の２.５％ニワトリアルブミン（Sigma）を使用して、２時間培養することによってブロックする。
第１の抗体を、ブロッキング緩衝液で適当な比においてうすめそして１時間培養する。それからブロットを、ＴＢＳおよび０.１％トゥイーン２０で５分間３回洗浄しそして第２のＰＯＤ−標識抗体を使用して１時間培養する。洗浄方法を反復しそして結合した抗体を、４−クロロ−１−ナフトール６０mg、メタノール２０ml、ＴＢＳ １００mlおよび過酸化水素（３０％）２００μlの溶液によって可視化する。
【００４３】
ＮａＣｌ（３）およびＡ７７１７２６ｂ（５）（表２参照）において得られた蛋白質を７〜１４個のアミノ酸−長ペプチドによって確認することは可能であった。２２kDa蛋白質の場合において、測定されたアミノ酸配列は、２つの蛋白質ＭＳＰ２３およびＮＫＥＦ−Ａにアサインすることができた。これに対する理由は、９３％の２つの蛋白質の高い配列ホモロジーにある。アフィニテークロマトグラフィーの塩基配列決定結果の表３に要約する通りである。
【００４４】
【表４】
表２によるフラクション番号は、フラクションカラムの（）内である。
【００４５】
確認された蛋白質の説明
フラクション（３）において濃縮された１８kDa蛋白質は、シクロフィリンＡとして確認された。シクロフィリンＡは、多数の免疫抑制化合物、例えばシクロスポリンＡの作用の機構に関与するペプチジルプロピル シス／トランス イソメラーゼの大きなファミリーに属する。
乳酸へのピルビン酸の反応を接触する嫌気性解糖の酵素である乳酸デヒドロゲナーゼが、さらにフラクション（３）において確認された。乳酸デヒドロゲナーゼは、少なくとも５種の異なるイソ酵素の形態で動物組織中に存在する。骨格筋に存在するイソ酵素は４つのＡ鎖を含有しており、心臓においては４つのＢ鎖が支配的である。本件の場合においては、乳酸デヒドロゲナーゼのＡ鎖からのペプチドが確認された。
熱ショック蛋白質ファミリーに属する２種の蛋白質がフラクション（５）において確認された。真核生物において支配的である熱ショック蛋白質ＨＳＰ７０は、多重遺伝子ファミリーの１員である。
【００４６】
熱ショック蛋白質ＨＳＰ９０は、普通の状態下においてさえも本質的に発現するサイトゾル蛋白質である。それは、相互に８６％の塩基配列ホモロジーを有する２種の分離した遺伝子生成物ＨＳＰ８４およびＨＳＰ８６からなる。
ＨＳＰ９０については、それがステロイドホルモン受容体と複合体を形成しそしてこの方法において、ある遺伝子の転写に介入することが知られている。
【００４７】
フラクション（５）においては、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼＭ2およびホスホグリセレートムターゼの解糖の３種の蛋白質が見出された。これらの３種の酵素は、低段階の解糖から誘導されそして多酵素複合体において自然の状態下で存在する。
【００４８】
またフラクション（５）における非常に強く濃縮されたバンドは、延長因子（ＥＦ−１α）として確認された。ＥＦ−１αは、重要な真核翻訳因子である。それはその機能において真核延長因子ＥＦ−Ｔｕに匹敵しそしてＧＴＰ−依存性方法における蛋白質生合成中、アミノアシル−ｔＲＮＡをサイトゾルからリボソーム上の受容体部位に転移する。
さらに、フラクション（５）において、アクチンを検出することができる。アクチンは殆んどすべての場所において存在しそして真核生成において大量に存在する蛋白質である。それは筋系および細胞骨格の主要な成分である。アクチン多重遺伝子ファミリーは、少なくとも４種の筋肉アクチン形態そしてまた、２種の細胞形質アクチン形態（β−およびγ−アクチン）をコードする。ここにおいて存在するアクチンは、細胞形質アクチン形態のγ−鎖である。
クエン酸サイクルのおよびリンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼもまた確認された。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、動物組織中において、サイトゾルおよびミトコンドリア異種形態で存在する。これらの両方のイソ酵素は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと協力して、サイトゾルとミトコンドリウムの間のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトルにおいて重要な役割を果たす。
【００４９】
フラクション（５）の２２kDa蛋白質は、塩基配列したペプチドフラグメントを基にして２種の蛋白質：骨芽細胞−特異的因子３（ＯＳＦ−３）としても知られているマクロファージ２３kDaストレス蛋白質（ＭＳＰ２３）および“ナチュラルキラー細胞強化因子−Ａ”（ＮＫＥＦ−Ａ）にアサインされる。活性化マクロファージは、Ｈ2Ｏ2およびＯ2のような反応性酸素化合物を産生する。これらは、それ自体この酸化性ストレスに抵抗するので、これらはこれら自体をこれらの反応性化合物から保護することのできる防御系を有していなければならない。ＮＫＥＦは、ナチュラルキラー細胞の活性を増加するヒトの赤血球からのサイトゾル蛋白質である。これらは、リンパ球でありそしてサイトキン刺激後、多数の腫瘍細胞を認識しそして破壊することができる。“ナチュラルキラー細胞強化因子”は、４４kDaの分子量を有しそして相互に８８％の良好な塩基配列ホモロジーを有している等しい大きさの２種のサブユニット（ＮＫＥＦ−ＡおよびＮＫＥＦ−Ｂ）からなる。
【００５０】
実施例１１
刺激されない、ＬＰＳ−刺激されたおよびＬＰＳ−刺激され、レフルノミド−処理されたＲＡＷ２６４.７サイトゾル抽出液の比較アフィニティークロマトグラフィー
リポポリサッカライドによるマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４.７の刺激は、炎症プロセスに対する試験管モデルとして使用した。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、グラム−陰性細菌の外部膜の必須の構造的成分でありそしてそれ自体、殆どすべての有機体の免疫細胞によって認識される。特にマクロファージは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６のような多数のサイトキンを合成するためにＬＰＳ−刺激によって活性化される。この刺激に付随する蛋白質パターンの可能な変化は、免疫調節化合物レフルノミドの同時的投与によって阻止しなければならない。
ＲＡＷ２６４.７細胞を、培地１ml当りＬＰＳ １０ngを使用して２４時間培養した。ＬＰＳ−刺激され、レフルノミド−処理された細胞の場合においては培養は、同時に６０μＭのＡ７７１７２６Ｂを使用して２４時間実施した。細胞を処理しそしてサイトゾル抽出液を、実施例１０により誘導されたFractogel(R)カラムの助けによって調査した。それからこれらの３種のバッチの化合物フラクションを分析グラジエントゲルに適用しそして相互に比較した。
すでにリンゴ酸デヒドロゲナーゼとして塩基配列により確認された３５kDa付近のバンドにおける増加が、特に明らかに明示される。ＬＰＳおよびＡ７７１７２６Ｂを使用した培養によって、強度が弱い傾向にある他の蛋白質と比較して、これらのバンドの強度は著しく増加される。
本発明は、新規なイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体、これらの化合物の製法および薬剤としてのこれらの化合物の使用、および抗体の生成のための抗原としてのこれらの化合物の使用および診断および精製方法におけるこれらの化合物の使用に関するものである。
抗炎症作用、免疫抑制作用または抗増殖作用を有するイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体は、これまでに開示されている（ＥＰ ０ ０１３ ３７６;ＥＰ ０ ２１７ ２０６；ＥＰ ０ ５２７ ７３６）。動物およびヒトの血清におけるこれらの化合物の分析的測定は、普通のクロマトグラフィー方法の助けにより可能である。これらのクロマトグラフィー方法の不利点は、装置、複雑な試料製造工程および低い試料処理量の点において経費がかかることである。
免疫学的測定および分析方法は、クロマトグラフィー方法に代る急速なそして確実な方法である。適当な抗体の生成は、これらの方法を実施するのに、重大である。
【０００２】
本発明は、イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体の変性によって、抗体生成に適し、重合体に結合することができそして放射免疫測定法におけるトレーサーとして用いうる化合物として利用しようとするものである。
式Ｉの化合物は、アニリン部分の芳香族環上に、それ自体でまたはスペーサー官能を経て重合体に共有的に結合することのできる１個または２個以上の官能基がある場合に、この目的を達成するのに適しているということが見出された。
【０００３】
それ故に、本発明は式Ｉ
【化８】
【０００４】
上記式において、
Ｒ1は、式IIまたはIII
【化９】
Ｒ2は、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ＝ＣＨ2（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｂ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは整数１、２または３でありそしてハロゲンは弗素、塩素、臭素または沃素である）
(ｃ) 式Ｖ
【化１０】
(ｄ) −ＮＨ2である。
【０００５】
式Ｉの好ましい化合物は、
Ｒ1が、式IIまたはIIIの基であり、そして
Ｒ2が、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは整数２であり、そしてハロゲンは臭素または沃素である）、
(ｂ) −Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2または
(ｃ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ(Ｒ3)(Ｒ4)（式中、Ｒ3は臭素、−ＮＨ2または塩素でありそしてＲ4は水素原子である）
である化合物である。
【０００６】
式Ｉの特に好ましい化合物は、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−アリルオキシフェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド、
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドまたは
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
のような化合物である。
【０００７】
式Ｉにおける基Ｒ2は、フェニル環上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、好ましくはパラ−位にあることができる。
式Ｉの化合物は、場合によっては、光学的異性体、ジアステレオマー、ラセミ体またはこれらの混合物として存在することができる。“アミノ酸”なる用語は、以下の化合物の立体異性形態、例えばＤおよびＬ形態を意味するものとして理解されるべきである：アスパラギン、バリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、トリプトファン、β−アラニン、リジン、プロリン、グリシン、γ−アミノブチレート、Ｎε−アセチルリジン、Ｎδ−アセチルオルニチン、Ｎγ−アセチルジアミノブチレート、Ｎα−アセチルジアミノブチレート、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン、トレオニン、アラニンおよびチロシン。Ｌ−アミノ酸が好ましい。アミノ酸残基Ｇｌｙが特に好ましい。
【０００８】
アミノ酸残基は、相当するアミノ酸から誘導される。アミノ酸に対する簡単な表示法は、一般的な慣用の表示法にしたがう。基（Ｒ4）は、それぞれのアミノ酸の側鎖を示す。
式Ｉの化合物の適当な生理学的に許容し得る塩は、例えば有機アンモニウム塩基の塩を包含するアルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウム塩およびプロトン化アミノ酸残基の塩である。
【０００９】
本発明は、また
(ａ) 式VI
【化１１】
【化１２】
(１) −ＮＨ2、
(２) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基（式中、保護基は、アミン保護基、特にＢｏｃである）、
(３) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンまたは
(４) −ＯＨである）の化合物と反応させて、Ｒ1が式IIの基でありそしてＲ2が、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基、−ＯＨまたは−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンである式Ｉの化合物を得、または
(ｂ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された化合物を、アルキルハライドまたはジハロアルカン（アルキル部分は２、３または４個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｃ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された化合物を、不飽和アルキルハライド（アルキル部分は３、４または５個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｄ) Ｒ7が−ＮＨ2である方法（ａ）により製造された化合物を、臭化ブロモアセチルのようなカルボン酸ハライドと反応させて、Ｒ2が式Ｖの基であり、Ｒ3がハロゲンでありそしてＲ4が水素原子である式Ｉの化合物を得、または
(ｅ) ｐ−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミンをアミノ基が保護されたアミノ酸と反応させてＲ7が式Ｖの基であり、Ｒ3が−ＮＨ2でありそしてＲ4が保護されたアミノ酸である式VIIの化合物を得、そしてそれから方法(ａ)におけるように反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｆ) 方法（ａ）または（ｅ）により製造された式Ｉの化合物における保護基を除去し、または
(ｇ) Ｒ1が式IIの基である方法（ａ）〜（ｆ）により製造された式Ｉの化合物をＲ1が式IIIの基である式Ｉの化合物に変換し、または
(ｈ) 方法（ａ）〜（ｇ）により製造された式Ｉの化合物を遊離形態で単離するかまたは酸性または塩基性基が存在するときに、場合によってそれを生理学的に許容し得る塩に変換することからなる式Ｉの化合物および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩および（または）式Ｉの任意の立体異性形態の製法に関するものである。
【００１０】
(ａ)による方法工程においては、例えばイソオキサゾール−４−カルボン酸（Ｒ6は−ＯＨである）を、文献から知られている方法によって、例えば非プロトン性溶剤（例えばトルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）または塩素化炭化水素）中で塩化チオニルまたはオキシ塩化燐によって酸クロライドに変換しそしてそれから、それを、双極性の非プロトン性溶剤、例えばＴＨＦまたは塩素化炭化水素中で、有機塩基、例えば第３級アミン（例えばトリエチルアミンまたはＮ−エチルモルホリン）を添加して、適当な方法で、場合によっては置換されている芳香族アミンと反応させることができる。このようにする代わりに、アミド形成は、ペプチド化学から知られている縮合試薬、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを添加して、カルボン酸から直接実施することもできる。第二の変形方法は、さらにアミノまたはアルコール基を有する芳香族アミンに対して特に適している。
【００１１】
方法工程（ｂ）または（ｃ）においては、アニリン部分により導入されたヒドロキシ基は
(１) それを、有機または無機塩基、例えば炭酸カリウムを添加して、アルキルハライドまたはジハロアルカン、例えば１,３−ジヨードプロパンと反応させて相当する置換された芳香脂肪族エーテルを得る（後者の場合においては、二量化は、生成物中においてアルキルハライド官能が固定相に対する生成物の結合のために残留するような適当に大過剰のアルキル化試薬または溶剤としてのその使用によって避けることができる）か、または
(２) それを、同様な条件下において双極性の非プロトン性溶剤、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトンまたは塩素化炭化水素中で、不飽和アルキルハライド、例えばハロゲン化アリルまたはハロゲン化プロパルギルと反応させてアリルまたはプロパルギルエーテルを得る（同時的に溶剤としてアセトンおよび塩基として炭酸カリウムを使用する場合は、（ｇ）に記載したイソオキサゾール部分（式IIの基）の開環が起こる）
ことによって、さらに官能化される。
【００１２】
方法工程（ｄ）においては、ＴＨＦまたは塩素化炭化水素のような双極性の非プロトン性溶剤において有機塩基、例えば第３級アミン（例えばトリエチルアミンまたはＮ−エチルモルホリン）を添加して、アミノ基をカルボン酸ハライド、例えば臭化ブロモアセチルと反応させる。
方法工程（ｅ）においては、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドを使用し、アミノ基において保護されたアミノ酸、例えばＮ−Ｂｏｃ−グリシンを使用して、芳香族ジアミン、例えばｏ−フェニレンジアミンを、制御された方法でモノアミドに変換し、それからアニリド形成を方法工程（ａ）に記載したように実施しそして最後にアミン保護基をペプチド化学から知られている標準条件下で除去する（方法工程（ｆ））。
方法工程（ｇ）においては、（ａ）〜（ｆ）において製造された化合物は、イソオキサゾール部分の塩基−誘発開環反応に付される。反応は、好ましくは、過剰の有機または無機塩基、例えばＮａＯＨ、アンモニア溶液または炭酸カリウムを使用して、水性／有機溶剤混合物、例えばＴＨＦ／水またはエタノール／水中で実施される。
【００１３】
一般式Ｉの化合物がジアステレオ異性形態またはエナンチオマー形態で存在しそして選択された合成においてその混合物として得られる場合は、純粋な立体異性体への分離は、任意のキラル支持物質上のクロマトグラフィーによって実施される、または、式Ｉのラセミ化合物が塩形成することができる場合は、補助剤として光学的に活性な塩基または酸を使用して形成されたジアステレオマー塩の分別結晶によって活性な異性体に分離することができる。原則的に同一の方法において、アミノ基のような塩基性基を含有する式Ｉのラセミ化合物は、光学的に活性な酸、例えば（＋）−樟脳−１０−スルホン酸、Ｄ−およびＬ−酒石酸、Ｄ−およびＬ−乳酸または（＋）および（−）−マンデル酸を使用して純粋なエナンチオマーに変換することができる。
【００１４】
本発明は、また、医薬的に適当なそして生理学的に許容し得る賦形剤、添加剤および（または）活性化合物および補助剤に加えて、式Ｉの少なくとも１種の化合物および（または）式Ｉの化合物の立体異性形態および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩の有効量を含有する薬剤に関するものである。本発明による薬剤は、静脈内的に、非経口的に、局処的に、直腸的にまたは経口的に投与することができる。
本発明による薬剤は、好ましくは、癌性疾患、炎症および自己免疫疾患の予防および（または）治療に適している。
これらは、例えばリウマチ性疾患、筋肉、関節または胃腸管の急性および慢性炎症、アレルギー気道疾患、乾癬または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、II型糖尿病、重症筋無力症、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、硬化性皮膚炎または多発性硬化症（ＭＳ）を包含する。癌性疾患は、例えば肺癌、白血病、カポシー肉腫、卵巣癌、肉腫、髄膜腫、腸癌、リンパ節の癌、脳腫瘍、乳癌、胃癌、膵臓の癌、前立腺の癌または皮膚癌を包含する。
【００１５】
本発明は、また、本発明による薬剤を製造する方法に関するものでありそしてこの方法は、医薬的に適当なそして生理学的に許容し得る賦形剤および適当である場合はさらに適当な活性化合物、添加剤または補助剤を使用して、式Ｉの少なくとも１種の化合物を適当な投与形態にすることからなる。
適当な固体または液体の医薬製剤形態は、例えば顆粒、粉末、被覆錠剤、錠剤、（ミクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁液、エマルジョン、滴下剤または注射用溶液および活性化合物を持続的に放出する製剤である。これらの製剤においては、慣用的な補助剤、例えば賦形剤、崩壊剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑走剤または滑沢剤、風味料、甘味料および可溶化剤が使用される。しばしば使用される補助剤は、例えばタルク、澱粉、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、乳汁蛋白質、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体、動物および植物油、例えばタラ肝油、ヒマワリ、落花生またはゴマ油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水および一価または多価アルコール、例えばグリセロールである。
【００１６】
医薬製剤は、好ましくは、活性成分として、本発明による式Ｉの化合物のある投与量を含有する投与単位で製造されそして投与される。錠剤、カプセル、被覆錠剤または坐剤のような固体の投与単位の場合においては、この投与量は約１０００mgまで、好ましくは約５０〜３００mgであり、そしてアンプル形態の注射用溶液の場合においては、この投与量は約３００mgまで、好ましくは約１０〜１００mgである。ヒトおよび動物の場合における体重約７０kgの成人患者の治療に対しては（式Ｉの化合物の効能によって）、経口的投与の場合においては活性化合物約５０〜３０００mg、好ましくは約１５０〜１０００mgの一日当りの投与量そして静脈内投与の場合においては、約５０〜１０００mg、好ましくは１００〜３００mgの一日当りの投与量が適用される。しかしながら、ある状況下においては、より高いまたより低い投与量もまた適している。一日当りの投与量は、個々の投与単位またはさもなければいくつかのより小さい投与単位の形態の１回の投与によってまたは特定の間隔における小分けされた投与量の多数回の投与によって投与することができる。
さらに、本発明は、場合によっては重合体または固体に架橋員を経て結合される式Ｉの化合物に関するものである。
【００１７】
これらは、式IV
【化１３】
【化１４】
Ｌは、
(ａ) −Ｏ−、
(ｂ) −ＮＲ5−（式中、Ｒ5は水素原子である）、
(ｃ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ2−（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｄ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ−(Ｒ4)(Ｒ3)（式中、Ｒ3は（ａ）共有結合または（ｂ）−ＮＨ−でありそしてＲ4は（ａ）水素原子または（ｂ）アミノ酸の基である）、または
(ｅ) −ＮＨ−(ＣＨ2)m−Ｓ−（式中、ｍは１〜１２の整数である）の基であるスペーサーを有する（ａ）〜（ｄ）に定義した架橋員Ｌからの架橋員であり、そして
Ｘは、重合体または固体である〕
の化合物である。
【００１８】
式IVにおける基“Ｌ−Ｘ”は、フェニル環上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、好ましくはパラ−位にあることができる。“重合体”なる用語は、例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、ラテックス、ポリサッカライド、セファロース、蛋白質、脂質、シリケートまたは核酸からなる群からの合成または天然の重合体を意味するものとして理解されるべきである。重合体は、場合によっては、これらが式Ｉの化合物に結合することができるために、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2および−ＣＯ−からなる群からの１個または２個以上の官能基を具備していなければならない。式Ｉの化合物を固体に結合する一般的方法は、例えばBI Application Handbook, Ed. 1994, Figure 4.1, (Merk AB, Uppsala Sweden）に記載されている。“固体”なる用語は、微粒子であることができるまたは管、ビーズまたはミクロタイタープレートのような幾何学的態様で存在することのできる不溶性物体を示す。
【００１９】
式IVの好ましい化合物は、式Ｉの化合物が固体または重合体に結合される場合の化合物である。式IVの特に好ましい化合物は、５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドまたは２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミドのような式Ｉの化合物が固体または重合体に結合される場合の化合物である。
式IVの化合物は、また、細胞抽出液、血清、血液または滑液からの特異的−結合蛋白質の発見に対して、蛋白質の精製に対して、ミクロタイタープレートの変性に対してまたはクロマトグラフィー物質、特にアフィニティークロマトグラフィー物質の製造に対して適している。精製に適した蛋白質は、重合体または固体に結合した式Ｉの化合物と直接相互作用する。化合物は、また診断に使用するのに適している。
式IVの化合物の場合において特に適した固体は、(R)ＢＩＡコアー ＣＭ５チップまたはクロマトグラフィー検査または分離に対する固定相そしてまたミクロタイタープレートである。
【００２０】
実施例１
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−アミノフェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸１０.１ｇ（０.０８モル）およびｐ−フェニレンジアミン８.６５ｇ（０.０８モル）を、テトラヒドロフラン３００mlに溶解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.０５ｇ（０.０８８モル）を加える。５時間後に、沈降した沈殿を、吸引濾去し、有機相を濃縮しそして生成物を、１％の氷酢酸を添加した酢酸エチル／石油エーテルを使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理しそしてそれから、酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：融点１２３℃〜１２８℃の酢酸塩６.８ｇ。
工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
工程(ａ)からの生成物２.１７ｇ（０.０１モル）を、はじめに、Ｎ−エチルモルホリン１.９ｇ（０.０１６モル）と一緒に、テトラヒドロフラン５０mlに導入しそして、氷浴中において、臭化ブロモアセチル２.４ｇ（０.０１２モル）の溶液を滴加しそしてそれから、混合物をさらに、室温で５時間撹拌する。水５mlの添加後、それを１Ｎ ＨＣｌを使用してpH２に酸性化し、生成物を酢酸エチルで抽出しそして有機相を水で洗浄し、乾燥しそして濃縮する。生成物を、酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：２.０ｇ。融点１７９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 4.05(s, 2H), 7.5-7.75(m, 4H), 9.1(s, 1H), 10.1および10.45(それぞれの場合においてsb, 1H)。
【００２１】
実施例２
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド
実施例１からの生成物０.５ｇ（０.００１５モル）を、テトラヒドロフラン１０mlに溶解しそして１Ｎ水性ＮａＯＨ ２mlを、氷冷下で加える。反応をＴＬＣにより監視しそして完了後（約６０〜９０分後）に、生成物を１Ｎ水性塩酸２.２５mlによる酸性化および水１００mlの添加によって、沈殿させ、濾過し、撹拌しながら水で洗浄し、それから小量の酢酸エチルで洗浄しそして減圧下で乾燥する。収量：０.２８ｇ。融点２１０℃より高い。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.28(s, 3H), 4.04(s, 2H), 7.4-7.7(m, 4H), 8.5-10(sb, 1H), 10.4(sb, 2H)。
【００２２】
実施例３
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド塩酸塩
工程(ａ) ２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチルアミノ−ｐ−フェニレンジアミン
ｐ−フェニレンジアミン８.６５ｇ（０.０８モル）を、Ｎ−Ｂｏｃ−グリシン１５.３ｇ（０.０８８モル）と一緒に無水のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００mlに溶解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.０５ｇ（０.０８８ｇモル）を小量ずつ加える。５時間後に、沈降した沈殿を吸引濾去し、濾液を濃縮しそして生成物を、酢酸エチル／メタノール／酢酸を使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理することにより精製しそしてそれから酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。
収量１３.５ｇ。融点１４４℃。
工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボニルクロライド
はじめに、５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸１２７.１ｇ（１.０モル）を、トルエン１Ｌに導入し、塩化チオニル１２９.８ｇ（１.１モル）を滴加しそしてそれから、混合物を８０℃で６時間加熱する。容量を減圧下で約１／２に濃縮しそしてトルエン溶液を、さらに反応のために直接使用する。
工程(ｃ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチルアミノ）フェニル）アミド
はじめに、工程(ａ)からの生成物１３.５ｇ（０.０５モル）を、Ｎ−エチルモルホリン７.６ml（０.０６モル）と一緒に、ＴＨＦ １００mlに導入しそして工程(ｂ)からの溶液３０ml（０.０６モルに相当する）を０℃で滴加する。混合物を室温でさらに５時間撹拌し、水性クエン酸で加水分解しそして生成物を酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥しそして減圧下で濃縮する。収量：１２ｇ。融点１３９℃。
工程(ｄ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド塩酸塩
工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モル）を、ジクロロメタン１８０mlに溶解しそしてトリフルオロ酢酸１８mlを加える。混合物を室温で１時間撹拌しそして濃縮しそして生成物をエタノールに溶解し、過剰のエタノール性ＨＣｌを加え、濃縮しそして残留物を酢酸エチルと一緒に撹拌することにより洗浄することによって、塩酸塩に変換する。収量：２.５ｇ。融点２１０℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 3.7-3.9(m, 2H), 7.6および7.72(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 8.25(sb, 2H), 9.3, 10.2および10.75(それぞれの場合においてs, 1H)。
【００２３】
実施例４
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミドトリフルオロ酢酸塩
実施例３の工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モル）を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０ml／エタノール２mlに溶解しそして混合物を、室温で開環が完了するまで（約３時間）撹拌する。水性クエン酸で酸性にすることによって、Ｂｏｃ−保護された生成物を固体の形態で得そして吸引濾過しそして乾燥する（融点１８９℃。収量５.５ｇ）。この中間体生成物５ｇを、実施例３(ｄ)と同様にしてジクロロメタン中においてトリフルオロ酢酸で処理しそして生成物を、酢酸エチルおよび石油エーテルを使用してトリフルオロ酢酸塩としてエタノールから結晶化する。収量：５.０ｇ。融点２０９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.15(s, 3H), 3.7-3.85(m, 2H), 7.49(s, 4H), 8.1(sb, 3H), 10.3および11.2(それぞれの場合においてsb, 1H)。
【００２４】
実施例５
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒドロキシフェニル）アミド６.５ｇ（０.０３モル）を、１,３−ジヨードプロン５７ml（０.５モル）に溶解しそして細かに粉砕された炭酸カリウム２６.２ｇ（０.１９モル）をはげしい撹拌下で加える。反応は約４時間後に完了する。濾過、濃縮および１％の氷酢酸を添加した酢酸エチル／石油エーテル（１：１）を使用したシリカゲル上のクロマトグラフィー処理によって処理を実施する。収量：６.７ｇ。
工程(ｂ) ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド
工程(ａ)からの生成物５.５ｇを、約１Ｎのメタノール性アンモニア溶液２００ml中で、開環が完了するまで処理し、混合物を濃縮し、残留物を稀酢酸にとりそして１％の氷酢酸を加えた酢酸エチル／石油エーテルを使用してクロマトグラフィー処理し、それから酢酸エチル／石油エーテルから結晶化する。収量：２.３ｇ。融点１４９℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.1-2.4 2.3ppmで(m, 2Hおよびs, 3H), 3.4および4.02(それぞれの場合においてt, 2H), 6.92および7.42(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 7.2-8.5(ssb, 1H), 10.2(s, 1H)。
【００２５】
実施例６
２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸（４−アリルオキシフェニル）アミド
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒドロキシフェニル）アミド１.５ｇ（０.００６８モル）を、アセトンに溶解し、臭化アリル５.８ml（０.０６８モル）およびはげしい撹拌下で細かに粉砕された炭酸カリウム９.３ｇ（０.０６８モル）を加え、それから混合物を室温で一夜撹拌する。それを濾過し、濾液を濃縮しそして残留物を水にとりそして酢酸エチル／石油エーテルから再結晶する。収量：０.８ｇ。融点１６２℃〜１６４℃。
1H-NMR（DMSO-d6）：2.3(s, 3H), 4.45-4.63(m, 2H), 5.15-5.38(m, 2H), 5.9-6.2(m, 1H), 6.95および7.42(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 10.0(sb, 1H), 12.5-14.5(ssb, 1H)。
【００２６】
薬理学的試験
試験管内増殖における細胞培養を、式Ｉの化合物に対する活性度試験として使用する。
実施例７
増殖試験
１０Ｌ用の粉末形態のＬ−グルタミンを含有しそしてＮａＨＣＯ3を含有していないClicks／ＲＰＭＩ １６４０培地（５０：５０）（Seromed, Biochrom, Berlin, FRG）を、二重−蒸溜水９Ｌに溶解しそしてそれぞれのびんが９００mlを含有するように、びん中に滅菌−濾過する。
洗浄培地
基培地９００mlを、７.５％の強度の炭酸水素ナトリウム溶液９.５mlおよびＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）（Gibco, Eggenstein, FRG）５mlで緩衝化する。
使用培地
基培地９００ml＋ＮａＨＣＯ3溶液（７.５％；ＨＥＰＥＳ溶液１０mlおよびＬ−グルタミン溶液（２００mM）１０ml）。
【００２７】
マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対して使用された培地は、１％の加熱−不活性化（３０分、５６℃）したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で強化された使用培地である。
腫瘍細胞培地
腫瘍細胞およびハイブリドーマ細胞を保持するために、５％のＦＣＳを含有する使用培地を製造する。
細胞系に対する培養培地
細胞系を保持するために、１０％のＦＣＳを含有する使用培地９００ml、ＮＥＡ（非必須アミノ酸）溶液（Gibco）１０ml、ピルビン酸ナトリウム溶液（１００mM、Gibco）１０mlおよび１０-2Ｍのメルカプトエタノール５mlを混合する。
マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対する脾臓細胞の獲得および処理
マウスを、頸部脱臼によって殺しそして脾臓を滅菌条件下で取り出す。脾臓は、８０メッシュのメッシュ幅を有する滅菌ふるい上で切裂きそしてプラスチック注射器（１０ml）のプランジャを使用して、注意深く使用培地を含有するペトリ皿に排出する。脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去するために、混合物を低張０.１７Ｍ塩化アンモニウム溶液中で時折振盪しながら室温で約１分培養する。赤血球はこの過程において溶解するが、リンパ球の生命力および反応性は影響されない。遠心分離（７分／３４０ｇ）後、溶解産物を捨てそして細胞を２回洗浄しそしてそれからそれぞれの試験培地にとる。
マイトジエン−誘発リンパ球増殖
雌のＮＭＲＩマウスからの５×１０5の処理した脾臓細胞を、種々なマイトジエンおよび調製物（式Ｉの化合物）と一緒に、平底ミクロタイタープレート中の１個の穴当り２００μlの試験培地にピペットで導入する。次のマイトジエンおよび調製物濃度を使用する。
コンカナバリンＡ〔Serva〕： 0.5-0.25-0.12 μg／ml
リポポリサッカライド〔Calbiochem〕： 1.0-0.5-0.1 μg／ml
フィトヘマグルチニン〔Gibco〕： 0.5-0.25-0.12％ 原液
アメリカヤマゴボウ(pokeweed)マイトジエン〔Gibco〕化合物１または２:
50、25、10、7.5、5、2.5、1、0.5、0.1 μモル
【００２８】
正のコントロールは、マイトジエンを添加しそして調製物を使用しないグループとして定義される。負のコントロールは、調製物を使用しそしてマイトジエンを添加しない培地における細胞である。それぞれのマイトジエン濃度は、すべての調製物濃度を使用して４回試験した。３７℃／５％ ＣＯ2で４８時間培養した後、０.２５μＣ／穴（９.２５×１０3Ｂｑ）の活性を有する２５μl／穴のトリチウム−チミジン（Amersham）を細胞に加える。さらに、１６時間の同じ条件下における培養を行なう。試験バッチを評価するために、細胞を細胞収穫器（Flow Laboratories）によって濾紙上に収穫する。取り込まれないチミジンは、別の廃棄びん中に集める。濾紙を乾燥し、パンチアウトしそしてシンチレーター（Rotiszint 22, Roth）２mlと一緒にシンチレーション容器に加え、それからこれをさらに２時間４℃に冷却する。細胞により取り込まれた放射能をβ−計数装置（Packard, Tricarb-460C）中で測定する。
増殖試験に対する腫瘍細胞および細胞系の製造
試験に使用した腫瘍細胞または細胞系は、対数増殖期の原溶液からとり、洗浄培地で２回洗浄しそして適当な培地に懸濁した。
増殖試験の実施および評価
増殖試験は、丸底ミクロタイタープレートにおいて実施した。式Ｉの化合物およびインターロイキンを、それぞれ５０μl／穴の適当な培地に溶解しそして２００μl／穴の最終容量が得られるようにして細胞数計測（５×１０5）を１００μl／穴で調節する。すべての試験において値は４回測定する。調製物を使用せずそして生長因子を使用しない細胞は負のコントロールとして定義される。そして調製物を使用せずそして生長因子を使用した細胞は、正のコントロールに対する値を与える。負のコントロールの値を測定したすべての値から引きそして正のコントロール−負のコントロールの差を１００％とする。
【００２９】
ミクロタイタープレートを３７℃／５％ ＣＯ2で７２時間培養しそして増殖率を、マイトジエン−誘発リンパ球増殖におけるように測定する。
細胞系は、菌株収集機関であるアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得た。
表１は、５０％の阻止が起こる濃度を示す。
【００３０】
【表１】
実施例８
(R)BIAcore CM5 マトリックスに対して実施例２による化合物を結合する方法
出発物質は、カルボキシメチルデキストラン界面を有するPharmacia BiosensorからのＣＭ５チップである。カップリング工程は、すべて５μl／分の流速で実施する。工程はすべて、ランニング緩衝液としてpH７.４のヘペス緩衝食塩水（ＨＢＳ）を使用して、２５℃で実施する。
第１工程：チップ表面を活性化するための０.０５Ｍ ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）および０.２Ｍ ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の１：１混合物。
第２工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の４０mMのシスタミンジ塩酸塩溶液３５μl。
第３工程：占有されていないマトリックス構造を飽和するためのpH８.５のエタノールアミン塩酸塩３５μl。
第４工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の０.１Ｍ ジチオスレイトール３５μl。
第５工程：pH７.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中の実施例２による化合物（１０mg／ml）を含有する溶液３５μl。
【００３２】
実施例９
分析に対して使用したBIAcore法
分析は、実質的にCurrent Biology（Vol. ３，No. 12, 1993, 913-915頁）に記載されているようにして実施した。
システム：相当するソフトウエアーを有する(R)BIAcore 2000（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）
チップ：CM5 センサーチップ（Pharmacia Biosensor AB）、
コーティング：実施例８による
ランニング（Running）
緩衝液：HBS緩衝液、BIA保証された（Pharmacia Biosensor AB）
流速：１０μl／分
注入：分析される試料５０μl当り５分の会合段階
リンシング（Rinsing）
時間：１８０秒３分の解離段階
再生：０.０５％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して２×１５秒
調査したデヒドロゲナーゼの相対的結合強度を、定義された蛋白質濃度において、相互に比較した。１μＭの蛋白質濃度において、ジヒドロオロト酸ＤＨの結合がもっとも強く、次いで乳酸ＤＨ、グリセルアルデヒドリン酸ＤＨおよびピルビン酸キナーゼがそれにつづく。
【００３４】
実施例１０
アフィニティークロマトグラフィー
式Ｉによる化合物をその反応性臭素基を経て支持マトリックスに結合させる。使用した支持物質は、Fractogel(R) EMD-SH（Merck KGaA, Darmstadt）である。DE 43 10 964に記載されているような標準プロトコールによって、共有結合を実施する。得られたゲルを、Superformance(R)（１cm×５cm）カラム（Merck KGaA）に充填しそして高速液体クロマトグラフィー装置に接続する。
可溶性細胞蛋白質の取得
菌株ＲＡＷ ２６４.７（ＡＴＣＣ菌株収集）を、全面生長に達するまで４８時間培養しそして冷たい４℃のＰＢＳ緩衝液で３回洗浄して培地を除去しそして細胞をＰＢＳ緩衝液に移しそして２００ｇで１０分遠心分離する。細胞処理は４℃で実施する。細胞ペレットを２０mMトリス塩基、２mM ＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏおよび１mMジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる緩衝液Ａに再懸濁する。細胞−内因性プロテアーゼによる蛋白質分解を阻止するために、種々なプロテアーゼ阻害剤の混合物を加える。それから混合物を、ガラスポッター中で均質化する。それから懸濁液を、４℃で２２,０００ｇで３０分遠心分離して可溶性蛋白質を得る。
【００３５】
上澄液は直ちにアフィニティークロマトグラフィーに対して再使用する。上澄液の一部を参照として保持しそして残りの部分をアフィニティーカラムにポンプ注入する。
ＨＰＬＣ
イタリーのミラノのKontron Instrumentsからの装置を、アフィニティークロマトグラフィーに対して使用する。このシステムは、Autosampler ４６５、ＨＰＬＣポンプ４２２および４２２Ｓ、高−圧混合バルブＭ８００、Bestaモーターバルブおよびダイオードアレイ検出器４４０からなる。データ記録および分析は、Data System 450-MT2／DAD系を使用して実施する。細胞上澄液は、水で３０mlの容量にうすめそして１ml／分の流速で注入する。クロマトグラフィーの完了まで、フラクションとして漏出液を集めそして４℃で貯蔵する。
【００３６】
次の緩衝液を、蛋白質のグラジエント溶離に使用する：
ＰＢＳ緩衝液の組成：
ＮａＣｌ ８.００ｇ／Ｌ
ＫＣｌ ０.２０ｇ／Ｌ
ＫＨ2ＰＯ4 ０.２０ｇ／Ｌ
Ｎａ2ＨＰＯ4×７Ｈ2Ｏ ２.１６ｇ／Ｌ
【００３７】
表２において使用した緩衝液の組成：
【００３８】
【表２】
【００３９】
蛋白質測定
凍結乾燥後、蛋白質を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１mlに溶解しそして水で０.５％ＳＤＳにうすめる。この溶液のアリコートをとりそしてＢＣＡ試験（Pierce）を使用する蛋白質測定に使用する。蛋白質を蒸発し（UNIVASPO 150H, UniEquip Power Heater, Martinsried, Germany）そしてそれから、スクロース１０ｇ、０.２５Ｍトリス／１Ｍグリシン溶液９ml、１０％ＳＤＳ ７.８ml、ブロモフェノールブルー（０.１％）２.５ml、β−メルカプトエタノール４mlおよび水１.７mlからなる適当な容量の試料緩衝液にとる。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１０〜１７％のポリアクリルアミド勾配を有するＳＤＳゲルを製造するために、次の溶液を製造する。
【表３】
分析用のゲルを製造するために、分取ゲル１００μｇに対して、トラック当り蛋白質１０μｇを負荷する。
分子量の測定は、蛋白質標準混合物と比較することによって実施する。
【００４０】
配列決定
分析用ゲル中の濃縮された蛋白質のバンドを示す蛋白質フラクションを、分取規模で分離しそして分離した蛋白質を、ＰＶＤＦ膜（Millipore）上にブロットすることによって固定化する。蛋白質をクマシーで染色することによって可視化しそしてそれから直接エドマン分解にうけしめる。クマシー染色ゲルに対する電気泳動後に、Ｎ−末端がブロックされた蛋白質を注意深く切り離しそして水で中性になるまで洗浄する。ゲルの小片を、一方のふるいが他方のふるいの背後に横たわっておりそして１００μｍおよび３２μｍのメッシュ幅を有する２枚のスチールふるいにより圧縮して均質化する。軟こう−様の物質を、UNIVAPO 150（UniEquip Power Heater, Martinsried, Germany）中で低残留湿気まで乾燥する。このようにして得られた蛋白質を、pH８.５の２５mMトリスＨＣｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる緩衝液中で、酵素エンドプロティナーゼ LysdC（Boehringer, Mannheim）（酵素対蛋白質の比約１：１０）を使用して３７℃で７時間インキュベートすることによってペプチドに開裂する。
【００４１】
得られたペプチドを、６０％アセトニトリル、０.１％ＴＦＡのそれぞれ１mlを使用して３７℃で４時間２回溶離する。合した溶離液をＵＮＩＶＡＰＯ中で蒸発しそして得られたペプチドを、逆相クロマトグラフィーによって分離する。クロマトグラフィーは、Ａ：Ｈ2Ｏ中の０.１％のＴＦＡ〜Ｂ：アセトニトリル中の０.１％のＴＦＡの線状勾配（１％／分）を使用して、LiChroCART(R)125-2 Superspher(R)60カラム上で７０分実施する。
【００４２】
精製されたペプチドのアミノ酸配列は、４７７Ａガス−相セクエンサー（Applied Biosystems）上でエドマン分解原理によって実施する。ＰＴＨ−ＡＡの確認は、２６９nmで１２０Ａフェニルチオヒダントインアミノ酸アナライザー（Applied Biosystems）上で実施した。
ウエスターンブロット分析
蛋白質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（Millipore）に移した後に、未被覆面積を、pH７.４の５Ｌ中のＮａＣｌ ４５ｇ、トリス塩基３０.３ｇからなるＴＢＳ中の２.５％ニワトリアルブミン（Sigma）を使用して、２時間培養することによってブロックする。
第１の抗体を、ブロッキング緩衝液で適当な比においてうすめそして１時間培養する。それからブロットを、ＴＢＳおよび０.１％トゥイーン２０で５分間３回洗浄しそして第２のＰＯＤ−標識抗体を使用して１時間培養する。洗浄方法を反復しそして結合した抗体を、４−クロロ−１−ナフトール６０mg、メタノール２０ml、ＴＢＳ １００mlおよび過酸化水素（３０％）２００μlの溶液によって可視化する。
【００４３】
ＮａＣｌ（３）およびＡ７７１７２６ｂ（５）（表２参照）において得られた蛋白質を７〜１４個のアミノ酸−長ペプチドによって確認することは可能であった。２２kDa蛋白質の場合において、測定されたアミノ酸配列は、２つの蛋白質ＭＳＰ２３およびＮＫＥＦ−Ａにアサインすることができた。これに対する理由は、９３％の２つの蛋白質の高い配列ホモロジーにある。アフィニテークロマトグラフィーの塩基配列決定結果の表３に要約する通りである。
【００４４】
【表４】
【００４５】
確認された蛋白質の説明
フラクション（３）において濃縮された１８kDa蛋白質は、シクロフィリンＡとして確認された。シクロフィリンＡは、多数の免疫抑制化合物、例えばシクロスポリンＡの作用の機構に関与するペプチジルプロピル シス／トランス イソメラーゼの大きなファミリーに属する。
乳酸へのピルビン酸の反応を接触する嫌気性解糖の酵素である乳酸デヒドロゲナーゼが、さらにフラクション（３）において確認された。乳酸デヒドロゲナーゼは、少なくとも５種の異なるイソ酵素の形態で動物組織中に存在する。骨格筋に存在するイソ酵素は４つのＡ鎖を含有しており、心臓においては４つのＢ鎖が支配的である。本件の場合においては、乳酸デヒドロゲナーゼのＡ鎖からのペプチドが確認された。
熱ショック蛋白質ファミリーに属する２種の蛋白質がフラクション（５）において確認された。真核生物において支配的である熱ショック蛋白質ＨＳＰ７０は、多重遺伝子ファミリーの１員である。
【００４６】
熱ショック蛋白質ＨＳＰ９０は、普通の状態下においてさえも本質的に発現するサイトゾル蛋白質である。それは、相互に８６％の塩基配列ホモロジーを有する２種の分離した遺伝子生成物ＨＳＰ８４およびＨＳＰ８６からなる。
ＨＳＰ９０については、それがステロイドホルモン受容体と複合体を形成しそしてこの方法において、ある遺伝子の転写に介入することが知られている。
【００４７】
フラクション（５）においては、さらにグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼＭ2およびホスホグリセレートムターゼの解糖の３種の蛋白質が見出された。これらの３種の酵素は、低段階の解糖から誘導されそして多酵素複合体において自然の状態下で存在する。
【００４８】
またフラクション（５）における非常に強く濃縮されたバンドは、延長因子（ＥＦ−１α）として確認された。ＥＦ−１αは、重要な真核翻訳因子である。それはその機能において真核延長因子ＥＦ−Ｔｕに匹敵しそしてＧＴＰ−依存性方法における蛋白質生合成中、アミノアシル−ｔＲＮＡをサイトゾルからリボソーム上の受容体部位に転移する。
さらに、フラクション（５）において、アクチンを検出することができる。アクチンは殆んどすべての場所において存在しそして真核生成において大量に存在する蛋白質である。それは筋系および細胞骨格の主要な成分である。アクチン多重遺伝子ファミリーは、少なくとも４種の筋肉アクチン形態そしてまた、２種の細胞形質アクチン形態（β−およびγ−アクチン）をコードする。ここにおいて存在するアクチンは、細胞形質アクチン形態のγ−鎖である。
クエン酸サイクルのおよびリンゴ酸−アスパラギン酸シャトルの酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼもまた確認された。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、動物組織中において、サイトゾルおよびミトコンドリア異種形態で存在する。これらの両方のイソ酵素は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼと協力して、サイトゾルとミトコンドリウムの間のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトルにおいて重要な役割を果たす。
【００４９】
フラクション（５）の２２kDa蛋白質は、塩基配列したペプチドフラグメントを基にして２種の蛋白質：骨芽細胞−特異的因子３（ＯＳＦ−３）としても知られているマクロファージ２３kDaストレス蛋白質（ＭＳＰ２３）および“ナチュラルキラー細胞強化因子−Ａ”（ＮＫＥＦ−Ａ）にアサインされる。活性化マクロファージは、Ｈ2Ｏ2およびＯ2のような反応性酸素化合物を産生する。これらは、それ自体この酸化性ストレスに抵抗するので、これらはこれら自体をこれらの反応性化合物から保護することのできる防御系を有していなければならない。ＮＫＥＦは、ナチュラルキラー細胞の活性を増加するヒトの赤血球からのサイトゾル蛋白質である。これらは、リンパ球でありそしてサイトキン刺激後、多数の腫瘍細胞を認識しそして破壊することができる。“ナチュラルキラー細胞強化因子”は、４４kDaの分子量を有しそして相互に８８％の良好な塩基配列ホモロジーを有している等しい大きさの２種のサブユニット（ＮＫＥＦ−ＡおよびＮＫＥＦ−Ｂ）からなる。
【００５０】
実施例１１
刺激されない、ＬＰＳ−刺激されたおよびＬＰＳ−刺激され、レフルノミド−処理されたＲＡＷ２６４.７サイトゾル抽出液の比較アフィニティークロマトグラフィー
リポポリサッカライドによるマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４.７の刺激は、炎症プロセスに対する試験管モデルとして使用した。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）は、グラム−陰性細菌の外部膜の必須の構造的成分でありそしてそれ自体、殆どすべての有機体の免疫細胞によって認識される。特にマクロファージは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６のような多数のサイトキンを合成するためにＬＰＳ−刺激によって活性化される。この刺激に付随する蛋白質パターンの可能な変化は、免疫調節化合物レフルノミドの同時的投与によって阻止しなければならない。
ＲＡＷ２６４.７細胞を、培地１ml当りＬＰＳ １０ngを使用して２４時間培養した。ＬＰＳ−刺激され、レフルノミド−処理された細胞の場合においては培養は、同時に６０μＭのＡ７７１７２６Ｂを使用して２４時間実施した。細胞を処理しそしてサイトゾル抽出液を、実施例１０により誘導されたFractogel(R)カラムの助けによって調査した。それからこれらの３種のバッチの化合物フラクションを分析グラジエントゲルに適用しそして相互に比較した。
すでにリンゴ酸デヒドロゲナーゼとして塩基配列により確認された３５kDa付近のバンドにおける増加が、特に明らかに明示される。ＬＰＳおよびＡ７７１７２６Ｂを使用した培養によって、強度が弱い傾向にある他の蛋白質と比較して、これらのバンドの強度は著しく増加される。
Claims (10)
- 式Ｉ
上記式においてＲ1は、式IIまたはIII
(ａ) 式Ｖ
(ｂ) −ＮＨ2
である。 - Ｒ1が、式IIまたはIIIの基であり、そして
Ｒ2が、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ(Ｒ3)(Ｒ4)（式中、Ｒ3は臭素、−ＮＨ2または塩素でありそしてＲ4は水素原子である）である請求項１記載の式Ｉの化合物。 - 式Ｉにおける基Ｒ2が、フェニル環上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、好ましくはパラ−位にある請求項１または２記載の式Ｉの化合物。
- ２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）−フェニル）アミドトリフルオロ酢酸塩、
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）−フェニル）アミド塩基塩、
２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）−フェニル）アミド、または
５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）−フェニル）アミド
である請求項１記載の式Ｉの化合物。 - (ａ) 式VI
(１) −ＮＨ2、
(２) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基（式中、保護基は、アミン保護基である）、または
(３) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲン）
の化合物と反応させて、Ｒ1が式IIの基でありそしてＲ2が、−ＮＨ2、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンである式Ｉの化合物を得、または
(ｂ) （ａ）により製造された化合物を、臭化ブロモアセチルのようなカルボン酸ハライドと反応させて、Ｒ2が式Ｖの基であり、Ｒ3がハロゲンでありそしてＲ4が水素原子である式Ｉの化合物を得、または
(ｃ) ｐ−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミンをアミノ基が保護されたグリシンと反応させてＲ7が式Ｖの基であり、Ｒ3が−ＮＨ2でありそしてＲ4が水素である式VIIの化合物を得、そしてそれから方法（ａ）におけるように反応させて式Ｉの相当する化合物を得、または
(ｄ) 方法（ａ）または（ｃ）により製造された式Ｉの化合物における保護基を除去し、または
(ｅ) Ｒ1が式IIの基である方法（ａ）〜（ｄ）により製造された式Ｉの化合物をＲ1が式IIIの基である式Ｉの化合物に変換し、または
(ｆ) 方法（ａ）〜（ｅ）により製造された式Ｉの化合物を遊離形態で単離するかまたは酸性または塩基性基が存在するときには、場合によってそれを生理学的に許容し得る塩に変換し、または
(ｇ) その化学的構造のためにジアステレオ異性形態またはエナンチオマー形態で存在する方法（ａ）〜（ｆ）により製造された式Ｉの化合物を任意のキラル支持物質上のクロマトグラフィーによって純粋な立体異性体に分離しまたは塩形成することのできる式Ｉのラセミ化合物を、補助剤として光学的に活性な塩基または酸を使用して形成されたジアステレオマー塩の分別結晶によって分離しまたはアミノ基のような塩基性基を含有する式Ｉのラセミ化合物を、光学的に活性な酸、例えば（＋）−樟脳−１０−スルホン酸、Ｄ−およびＬ−酒石酸、Ｄ−およびＬ−乳酸または（＋）−および（−）−マンデル酸を使用して純粋なエナンチオマーに変換することからなる請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉの化合物の製法。 - 請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉの化合物（ただし、 R 2 は−ＮＨ−Ｃ ( Ｏ ) −ＣＨ ( Ｒ 3 )( Ｒ 4 ) であることを条件とする）および医薬的に許容し得る賦形剤からなる薬剤。
- 癌性疾患、炎症または自己免疫疾患の治療用の薬剤を製造するための請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉの化合物（ただし、 R 2 は−ＮＨ−Ｃ ( Ｏ ) −ＣＨ ( Ｒ 3 )( Ｒ 4 ) であることを条件とする）の使用。
- 式IV
Ｌは、
(ａ) −Ｏ−、
(ｂ) −ＮＲ5−（式中、Ｒ5は水素原子である）、
(ｃ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ2−（式中、ｎは整数１、２または３である）、または
(ｄ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ−(Ｒ4)(Ｒ3)（式中、Ｒ3は（ａ）共有結合または（ｂ）−ＮＨ−でありそしてＲ4 は水素原子である）
であり、そして
Ｘは、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニルクロライド、ラテックス、ポリサッカライド、セファロース、蛋白質、脂質、シリケートおよび核酸からなる群から選択される重合体、または管、ビーズおよびミクロタイタープレートからなる群から選択される固体である〕の化合物。 - 細胞抽出液、血清、血液または滑液からの特異的−結合蛋白質の発見のための、蛋白質の精製のための、ミクロタイタープレートの変性のためのまたはクロマトグラフィー物質の製造のための請求項８記載の式IV〔ただし、式中、 R 1 は式 III で表わされる基であり、Ｌは NH-C(O)-CH(R 4 )(R 3 ) （ R 3 は共有結合、 R 4 は水素である）であることを条件とする〕の化合物の使用。
- 診断剤の製造のための請求項８記載の式IVの化合物〔ただし、式中、 R 1 は式 III で表わされる基であり、Ｌは NH-C(O)-CH(R 4 )(R 3 ) （ R 3 は共有結合、 R 4 は水素である）であることを条件とする〕の使用。
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