PL194932B1

PL194932B1 - Nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego, sposób ich wytwarzania, środek farmaceutyczny i zastosowanie nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego

Info

Publication number: PL194932B1
Application number: PL324549A
Authority: PL
Inventors: Stefan Müllner; Bernd Kirschbaum; Wilfried Schwab
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland
Priority date: 1997-01-28
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2007-07-31
Also published as: TR199800117A3; US5977151A; KR100572808B1; HK1009813A1; DE59806965D1; CZ24998A3; DK0859000T3; PT859000E; EP0859000A1; BR9800501A; JPH10231279A; KR19980070841A; US6265588B1; AR010399A1; DE19702988A1; CN1189491A; HU9800147D0; CZ296122B6; MX9800757A; AU5274898A

Abstract

1. Nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 w którym R 1 oznacza grupe o wzorze 2 lub 3 R 2 oznacza grupe o wzorze -O-(CH 2) n-CH=CH 2, w którym n oznacza liczbe 1, 2 lub 3, albo grupe o wzorze 4 w którym R 3 oznacza atom chlorowca lub grupe aminowa, a R 4 oznacza atom wodoru; i/lub ich fizjologicznie zgodne sole. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego, sposób ich wytwarzania, środek farmaceutyczny i zastosowanie nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego. Nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego są użyteczne jako antygeny wywarzające przeciwciała oraz w procesach diagnozowania i oczyszczania.

Znane są pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego wykazujące działanie hamujące procesy zapalne, immunosupresyjne lub przeciwproliferacyjne (EP 0013376, EP 0217206, EP 0527736). Możliwe jest analityczne oznaczanie tych związków w surowicy zwierząt i ludzi za pomocą znanych metod chromatograficznych.

Wadą tych metod chromatograficznych jest wysoki koszt aparatury, wymagające wysiłku przygotowanie próbek i niewielka przepustowość aparatury do wykonywania oznaczeń.

Immunologiczne sposoby oznaczania i analizy są szybką i niezawodną alternatywą metody chromatograficznej. Decydujące dla przeprowadzenia takiego alternatywnego sposobu jest uzyskanie odpowiedniego przeciwciała.

Celem wynalazku jest dostarczenie związków przez modyfikację pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego, nadających się do uzyskiwania przeciwciał, dających się sprzęgać z polimerami i nadających się do zastosowania jako znaczniki w testach radioimmunologicznych.

Stwierdzono, że do rozwiązania tego problemu nadają się związki o ogólnym wzorze 1, w których z aromatycznym pierścieniem części anilinowej jest związana jedna lub większa liczba grup funkcyjnych, które same lub przez mostek sprzęgają się kowalencyjnie z polimerem.

Zatem przedmiotem wynalazku są nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1

R² oznacza grupę o wzorze -O-(CH2)n-CH=CH2, w którym n oznacza liczbę 1,2 lub 3, albo grupę o wzorze 4

w którym R³ oznacza atom chlorowca lub grupę aminową, a R⁴ oznacza atom wodoru; i/lub ich fizjologicznie zgodne sole.

Korzystne są związki o ogólnym wzorze 1, w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 lub 3; ^r2 oznacza ^gru^pę o wzorze -^O-^CH2-^CH=^CH ^lu^b -^nh-^c(^o)-^ch(^r3)(R⁴), w ^któr^ym ^r3 oznacza atom bromu lub grupę aminową, a r4 oznacza atom wodoru.

PL 194 932 B1

Grupa R² we wzorze 1 może znajdować się w pierścieniu fenylowym w pozycji meta, orto lub para w stosunku do grupy NH, przy czym korzystne są związki o ogólnym wzorze 1, w którym grupa r2 znajduje się w pierścieniu fenylowym w pozycji para w stosunku do grupy NH.

Szczególnie korzystne są związki o ogólnym wzorze 1, wybrane z grupy obejmującej (4-alliloksyfenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego, trifluorooctan (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego, chlorowodorek (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego, (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego i (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego.

Związki o wzorze 1 mogą istnieć ewentualnie jako izomery optyczne, diasteroizomery, racematy lub jako ich mieszaniny.

Odpowiednimi fizjologiczne zgodnymi solami związków o wzorze 1 są np. sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych, sole amonowe włącznie z solami amoniowymi zasad organicznych oraz sole protonowanych reszt aminokwasów.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania określonych powyżej nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli polegający na tym, że

ą) związek o ogólnym wzorze 5

w którym R⁶ oznacza hydroksyl, atom chloru lub atom bromu, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorze 6

w którym R⁷ oznacza OH, z wytworzeniem związku o poniższym wzorze

w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 podaną odnośnie wzoru 1, a r2 oznacza OH, następnie powyższy związek poddaje się reakcji z nienasyconym halogenkiem alkilu, w którym grupa alkilowa zawiera 3, 4 lub 5 atomów węgla, z wytworzeniem odpowiedniego związku o ogólnym wzorze 1, w którym r2 oznacza grupę o wzorze -O-(CH2)n-CH=CH2, w którym n oznacza liczbę 1,2 lub 3;

PL 194 932 B1

w którym R⁷ oznacza -NH₂, z wytworzeniem związku o poniższym wzorze

w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 podaną odnośnie wzoru 1, a R² oznacza -NH₂, tak otrzymany związek poddaje się reakcji z halogenkiem kwasu karboksylowego, korzystnie bromkiem bromoacetylu, z wytworzeniem związku o ogólnym wzorze 1, w którym r2 oznacza grupę o wzorze 4

w którym R³ oznacza atom chlorowca, a R⁴ oznacza atom wodoru; albo

c) aromatyczną diaminę, korzystnie p-fenylenodiaminę, poddaje się reakcji z glicyną z zabezpieczoną grupą aminową, z wytworzeniem związku o wzorze 6, w którym r7 oznacza grupę o wzorze 4, w którym r3 oznacza zabezpieczoną grupę aminową, a r4 oznacza atom wodoru, po czym przeprowadza się go tak jak w sposobie a) w odpowiedni związek o ogólnym wzorze 1; albo

d) usuwa się grupę zabezpieczającą ze związku wytworzonego sposobem c); albo

e) wytworzony sposobami a) - c) związek o ogólnym wzorze 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze 2, przeprowadza się w związek o ogólnym wzorze 1, w którym R1 oznacza grupę o wzorze 3

f) związzk o ooginym wzzrzz 1 wytworzzny sppsot)bmi a) -e) albb wyyoręęnia się w ppstaai wolnej, albo w przypadku obecności grup kwasowych lub zasadowych ewentualnie przeprowadza się w fizjologicznie zgodne sole.

PL 194 932 B1

W powyższych etapach np. kwas izoksazolo-4-karboksylowy (R⁶ oznacza -OH) można przeprowadzić sposobem znanym z literatury w chlorek kwasowy, np. za pomocą chlorku tionylu lub tlenochlorku fosforu w aprotonowym rozpuszczalniku (np. toluenie, tetrahydrofuranie (THF) lub w chlorowanym węglowodorze), po czym poddać go reakcji z aminą aromatyczną, ewentualnie odpowiednio podstawioną, w obecności organicznej zasady, np. trzeciorzędowej aminy (np. trietyloaminy lub N-etylomorfoliny), w polarnym aprotonowym rozpuszczalniku, np. w THF lub chlorowanym węglowodorze.

Alternatywnie, można wytworzyć amid bezpośrednio z kwasu karboksylowego z użyciem znanych z chemii peptydów reagentów stosowanych w reakcji kondensacji, np. dicykloheksylokarbodiimidu. Ten drugi wariant jest szczególnie przydatny w przypadku aromatycznych amin z dodatkowymi grupami aminowymi lub alkoholowymi.

W etapie a) grupę hydroksylową wprowadzoną do części anilinowej poddaje się przekształceniu, a mianowicie przeprowadza się reakcję z nienasyconym chlorowcoalkilem, np. chlorowcoallilem lub chlorowcopropargilem, korzystnie bromkiem allilu, w polarnym aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak tetrahydrofuran (THF), aceton lub chlorowane węglowodory, prowadzącą w podobnych warunkach do powstania eteru allilowego lub propargilowego, przy czym przy stosowaniu acetonu jako rozpuszczalnika i węglanu potasu jako zasady następuje jednocześnie opisane w etapie e) otwarcie pierścienia części izoksazolowej (grupa we wzorze 2).

W etapie b) grupę aminową poddaje się reakcji z halogenkiem kwasu karboksylowego, np. bromkiem bromoacetylu, w obecności zasady organicznej, takiej jak trzeciorzędowa amina aromatyczna (np. trietyloamina lub N-etylomorfolina) w polarnym aprotonowym rozpuszczalniku, takim jak THF lub chlorowany węglowodór.

W etapie c) aromatyczną diaminę, np. p-fenylenodiaminę, w reakcji z aminokwasem z zabezpieczoną grupą aminową, np. N-Boc-glicyną, przy stosowaniu środków kondensujących, np. dicykloheksylokarbodiimidu, przeprowadza się w monoamid, następnie wytwarza się anilinę, tak jak to opisano w etapie a), i na zakończenie usuwa się wprowadzoną grupę zabezpieczającą grupę aminową, w standardowych warunkach znanych z chemii peptydów (etap d).

W etapie e) przeprowadza się indukowane zasadami otwarcie pierścienia izoksazolowego w związku wytworzonym sposobami a) - d), przy czym korzystnie stosuje się wodno-organiczną mieszaninę rozpuszczalników, np. THF-woda lub etanol-woda, w obecności nadmiaru zasady organicznej lub nieorganicznej, np. NaOH, roztworu amoniaku lub węglanu potasu.

Jeśli związki o ogólnym wzorze 1 występują w postaci diastereoizomerów lub enancjomerów, a w wyniku syntezy otrzymuje się ich mieszaninę, rozdzielenie jej na czyste stereoizomery można osiągnąć albo za pomocą chromatografii na ewentualnie chiralnym nośniku, albo przez frakcjonowaną krystalizację diasteroizomerycznych soli utworzonych z substancjami pomocniczymi, jakimi są optycznie czynne zasady lub kwasy, o ile racemiczne związki o wzorze 1 są zdolne do tworzenia soli. W zasadniczo taki sam sposób można racemiczne związki o wzorze 1 zawierające grupę zasadową, taką jak grupa aminowa, przeprowadzić w czyste enancjomery za pomocą optycznie czynnych kwasów, takich jak kwas (+)-kamforo-10-sulfonowy, kwas D- i L-winowy, kwas D- i L-mlekowy lub kwas (+) i (-) migdałowy.

Wynalazek dotyczy również środka farmaceutycznego zawierającego substancje czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik oraz ewentualnie substancje pomocnicze, którego cechą jest to, że jako substancję czynną zawiera określoną powyżej nową pochodną izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 lub jej fizjologicznie zgodną sól.

Wynalazek dotyczy również zastosowania określonych powyżej nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 do wytwarzania środka farmaceutycznego do profilaktyki i/lub leczenia chorób nowotworowych, stanów zapalnych i chorób autoimmunologicznych.

Ponadto wynalazek dotyczy nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 7

w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 lub 3

PL 194 932 B1

L oznacza ugrupowanie mostkowe -NH-C(O)-CH (R⁴) (R³), w którym R³ oznacza wiązanie kowalencyjne, a r4 oznacza atom wodoru; a X oznacza ugrupowanie karboksymetylodekstranu lub polimeru metakrylanowego.

Grupa „L-X w pierścieniu fenylowym w związkach o wzorze 7 może znajdować się w położeniu meta, orto lub para w stosunku do grupy NH, przy czym korzystnie grupa „L-X znajduje się w położeniu para w stosunku do grupy NH.

Korzystne są związki o wzorze 7, w których z karboksymetylodekstranem lub polimerem metakrylanowym sprzęgnięty jest związek 1, taki jak (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego lub (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego.

Ogólne metody sprzęgania związków o ogólnym wzorze 1 z ciałem stałym opisano np. w B1 Aapplication Handbook, wydanie 1994, fig. 4-1, (Merk AB, Uppsala, Szwecja).

Pojęcie „ciało stałe oznacza nierozpuszczalną substancję stałą, która może być w postaci rozdrobnionej lub w postaciach o kształtach geometrycznych, takich jak rurki, kulki lub płytki do mikromiareczkowania.

Jako ciało stałe w związkach o wzorze 7 szczególnie przydatne jest ®BIA core CM5-Chip, także w postaci fazy nieruchomej w chromatograficznych badaniach i rozdzielaniach, jak również w płytkach do mikromiareczkowania.

Związki o wzorze 7 przydatne są do wykrywania specyficznie wiążących się białek w ekstraktach komórkowych, surowicy, krwi lub płynach maziowych, do oczyszczania białek, modyfikacji płytek do mikromiareczkowania lub do wytwarzania materiału chromatograficznego, a zwłaszcza materiału do chromatografii powinowactwa. Białka nadające się do oczyszczania bezpośrednio oddziaływują ze związkami o wzorze 1, związanymi z polimerem lub ciałem stałym. Związki te można również stosować w diagnostyce.

Zatem wynalazek dotyczy również zastosowania opisanych powyżej nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 7 do oczyszczania białek lub do wytwarzania materiału chromatograficznego, a zwłaszcza materiału do chromatografii powinowactwa.

Środki farmaceutyczne według wynalazku można podawać dożylnie, pozajelitowo, miejscowo, doodbytniczo lub doustnie.

Środki farmaceutyczne według wynalazku są użyteczne w profilaktyce i/lub leczeniu przede wszystkim chorób nowotworowych, stanów zapalnych i chorób autoimmunologicznych.

Należą do nich np. choroby reumatyczne, ostre i przewlekłe zapalenia mięśni, stawów lub przewodu żołądkowo-jelitowego, choroby dróg oddechowych na tle alergicznym, łuszczyca lub choroby autoimmunologiczne, np. układowy liszaj rumieniowaty (SLE), cukrzyca typu II, miastenia ciężka rzekomoporaźna, zespół Sjogrena, grzybica skóry, twardzina skóry lub stwardnienie rozsiane (MS). Do chorób nowotworowych należą np. rak płuc, białaczka, mięsak Kaposiego, rak jajnika, mięsaki, oponiak, rak jelit, rak węzłów chłonnych, nowotwór mózgu, rak piersi, rak żołądka, rak trzustki, rak prostaty lub rak skóry.

Środek farmaceutyczny według wynalazku wytwarza się zgodnie ze sposobem polegającym na tym, że związek o ogólnym wzorze 1 formuje się razem z farmaceutycznie odpowiednim i fizjologicznie dopuszczanym nośnikiem oraz ewentualne razem z odpowiednimi substancjami czynnymi, dodatkowymi lub pomocniczymi we właściwą postać do podawania odpowiednią do podawania pacjentom.

Odpowiednimi stałymi lub ciekłymi galenowymi postaciami preparatów są np. granulaty, proszki, drażetki, tabletki, (mikro)kapsułki, czopki, syropy, soki, zawiesiny, emulsje, krople lub roztwory do zastrzyków, jak również preparaty o przedłużonym uwalnianiu substancji czynnych, do wytwarzania których stosuje znane środki pomocnicze, takie jak nośniki, środki rozsadzające, wiążące, powlekające, spęczniające, poślizgowe lub smarujące, smakowe, słodzące i środki ułatwiające rozpuszczanie.

PL 194 932 B1

Jako często stosowane substancje pomocnicze należy wymienić np. talk, skrobię, węglan magnezu, ditlenek tytanu, laktozę, mannit i inne cukry, laktoproteinę, żelatynę, celulozę i jej pochodne, oleje zwierzęce i roślinne, takie jak tran z wątroby ryb, olej słonecznikowy, olej z orzeszków ziemnych, olej sezamowy, polietylenoglikole i rozpuszczalniki, takie jak sterylna woda i jedno- lub wielowodorotlenowe alkohole, np. gliceryna.

Preparaty farmaceutyczne korzystnie wytwarza się w jednostkach dawkowanych do podawania pacjentom, przy czym każda jednostka zawiera określoną dawkę związku o wzorze 1 według wynalazku. W przypadku stałych postaci dawkowanych, takich jak tabletki, kapsułki, drażetki lub czopki, dawka ta może wynosić do około 1000 mg, korzystnie około 50 do 300 mg, a w przypadku roztworów do zastrzyków w postaci ampułek wynosi do około 300 mg, korzystnie około 10 do 100 mg. Przy leczeniu osobników dorosłych o wadze około 70 kg dawka dzienna dla ludzi i zwierząt przy podawaniu doustnym wynosi, w zależności od skuteczności związku o wzorze 1, od około 50 do 3000 mg substancji czynnej, korzystnie około 150 do 1000 mg, a przy podawaniu dożylnym od około 50 do 1000 mg, korzystnie 100 do 300 mg. Ewentualnie można jednak podawać także wyższe lub niższe dawki dzienne. Dawkę można podawać zarówno jednorazowo, jak również w kilku mniejszych dawkach lub w kilku podzielonych dawkach podawanych w określonych odstępach czasu.

P r z y k ł a d 1. (4-(2-Bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

Etap a). (4-Aminofenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

10,1 g (0,08 mola) kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego i 8,65 g (0,08 mola) p-fenylenodiaminy rozpuszczono w 300 ml tetrahydrofuranu i dodano 18,05 g (0,088 mola) dicykloheksylokarbodiimidu. Po 5 godzinach odsączono wytrącony osad, zatężono fazę organiczną i produkt poddano chromatografii ma żelu krzemionkowym, stosując mieszaninę octanu etylu i eteru naftowego z dodatkiem 1% kwasu octowego. Następnie produkt wykrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność: 6,8 g octanu o temperaturze topnienia 123 - 128°C.

Etap b) (4-(2-Bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

Do roztworu 2,17 g (0,01 mola) produktu z etapu a) i 1,9 g (0,016 mola) N-etylomorfoliny w 50 ml tetrahydrofuranu na łaźni z lodem wkroplono roztwór 2,4 g (0,012 mola) bromku bromoacetylu, po czym roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 godzin. Po dodaniu 5 ml wody, mieszaninę reakcyjną zakwaszono 1N HCl do pH 2, produkt wyekstrahowano octanem etylu, a fazę organiczną przemyto wodą, wysuszono i zatężono. Produkt wykrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność: 2,0 g, temperatura topnienia 179°C.

¹H^-NMR^{: (}DMSO^-d₆ ^{) :} 2^,7 (s, 3H), 4^,05 (s, 2H), 7^,5^-7^,75 (m, 4H), 9^,1 (s, 1H), 10^,1 i 10^,45 (w każdym przypadku sb, 1H).

P r z y k ł a d 2. (4-(2-Bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego

W 10 ml tetrahydrofuranu rozpuszczono 0,5 g (0,0015 mola) produktu z przykładu 1 i chłodząc lodem dodano do tego roztworu 2 ml 1N wodnego roztworu NaOH. Przebieg reakcji kontrolowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i po jej zakończeniu (około 60-90 min) wytrącono produkt reakcji, zakwaszając roztwór 2,25 ml 1N kwasu chlorowodorowego i dodając 100 ml wody. Wytrącony osad odsączono, przemyto wodą, zmieszano z niewielką ilością octanu etylu i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.

Wydajność 0,28 g, temperatura topnienia powyżej 210°C.

¹H^-NMR^{: (}DMSO^-d⁶) ^: 2^,28 (s, 3H), 4^,04 (s, 2H), 7^,4^-7^,7 (m, 4H), 8^,5^-10 ⁽sb 1H), 10^,4 ⁽sb 2H).

P r z y k ł a d 3. Chlorowodorek (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

Etap a) 2-t-Butoksykarbonyloaminoacetyloamino-p-fenylenodiamina

W 300 ml bezwodnego tetrahydrofuranu (THF) rozpuszczono 8,65 g (0,08 mola) p-fenylodiaminy razem z 15,3 g (0,088 mola) N-Boc-glicyny i porcjami dodano 18,05 g (0,088 mola) dicykloheksylokarbodiimidu. Po 5 godzinach odsączono wytrącony osad, roztwór zatężono i produkt oczyszczono chromatograficznie na żelu krzemionkowym, stosując mieszaninę octanu etylu, metanolu i kwasu octowego. Następnie produkt wykrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność 13,5 g, temperatura topnienia 144°C.

PL 194 932 B1

Etap b) Chlorek kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

Do 127,1 g (1,0 mola) kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego rozpuszczono w 1 l toluenu wkroplono 129,8 g (1,1 mola) chlorku tienylu i mieszaninę ogrzewano w 60°C przez 6 godzin. Objętość mieszaniny reakcyjnej zmniejszono pod obniżonym ciśnieniem w przybliżeniu o połowę i bezpośrednio zastosowano ten roztwór toluenowy w dalszych reakcjach.

Etap c) (4-(2-t-Butoksykarbonyloaminoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

W 100 ml THF rozpuszczono 13,5 g (0,05 mola) produktu z etapu a) razem z 7,6 ml (0,06 mola) N-etylomorfoliny i wkroplono w 0°C 30 ml (0,06 mola) roztworu z etapu b). Roztwór mieszano przez 5 godzin w temperaturze pokojowej, po czym poddano go hydrolizie wodnym roztworem kwasu cytrynowego, wyekstrahowano produkt octanem etylu, a ekstrakt przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem sodu i zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 12 g, temperatura topnienia 139°C.

Etap d) Chlorowodorek (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

W 180 ml dichlorometanu rozpuszczono 6 g (0,017 mola) produktu z etapu c) i dodano 18 ml kwasu trifluorooctowego. Roztwór mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, zatężono i produkt przeprowadzono w chlorowodorek, poprzez rozpuszczenie w etanolu, dodanie nadmiaru etanolowego roztworu HCl, zatężenie i zmieszanie pozostałości z octanem etylu.

Wydajność 2,5 g, temperatura topnienia 210°C.

¹H^-NMR: ⁽DMSO^-d₆ ⁾: 2^,7 (s, 3H), 3^,7^-3^,9 (m, 2H), 7^,6 i 7^,72 ^(w każd^ym ^pr^zypadk^u 2H, AA'BB'^),8,25 (sb, 2H), 9,3, 10,2 i 10,75 (w każdym przypadku s, 1H).

P r z y k ł a d 4. Trifluorooctan (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego

W mieszaninie 20 ml 1N ługu sodowego i 2 ml etanolu rozpuszczono 6 g (0,017 mola) produktu z przykładu 3, etap c) i w temperaturze pokojowej mieszano do całkowitego otwarcia pierścienia (około 3 godziny). Po zakwaszeniu wodnym roztworem kwasu cytrynowego wytrącił się produkt zabezpieczony grupą Boc, który odsączono przez odessanie i wysuszono (temperatura topnienia 189°C, wydajność 5,5 g). Ten produkt pośredni w ilości 5 g rozpuszczono w dichlorometanie, podziałano nań kwasem trifluorooctowym w sposób analogiczny jak w przykładzie 3'' d) i wykrystalizowano produkt w postaci trifluorooctanu z etanolu za pomocą octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność 5,0, temperatura topnienia 209°C.

¹H^-NMR^{: (}DMSO^-d^6): 2^,15 (s, 3H), 3^,7^-3^,85 (m, 2H), 7^,49 (s, 4H), 8^,1 ⁽sb 3H), 10^,3 i 11,2 (w każdym przypadku sb, 1H).

P r z y k ł a d 5. (4-(3-Jodopropoksy)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego

Etap a) (4-(3-jodopropoksy)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego

W 57 ml (0,5 mola) 1,3-dijodopropanu rozpuszczono 6,5 g (0,03 mola) (4-hydroksyfenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego i intensywnie mieszając dodano 26,2 g (0,19 mola) drobno zmielonego węglanu potasu. Reakcja zakończyła się po około 4 godzinach. Dalsza obróbka obejmowała filtrację, zatężanie i chromatografię na żelu krzemionkowym, przy użyciu mieszaniny 1:1 octanu etylu i eteru naftowego, z dodatkiem 1% kwasu octowego. Wydajność 6,7 g.

Etap b) (4-(3-Jodopropoksy)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego.

5,5 g produktu z etapu a) poddano obróbce w 200 ml około 1N metanolowego roztworu amoniaku do całkowitego otwarcia pierścienia, po czym mieszaninę reakcyjną zatężono, podziałano na nią rozcieńczonym kwasem octowym i poddano chromatografii stosując mieszaninę octanu etylu i eteru naftowego, z dodatkiem 1% kwasu octowego, a następnie wykrystalizowano produkt z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność 2,3 g, temperatura topnienia 149°C.

¹H^-NMR^{: (}DMSO^-d^6): 2^,1^-2^,4 (m, 2H i s^, 3H ^prz^y 2^,3 ppm), 3.4 i 4^,02 ^(w każd^ym ^pr^zypadk^u t, 2H) 6,92 i 7,42 (w każdym przypadku 2H, AA'BB'), 7,2-8,5 (ssb, 1H), 10,2 (s, 1H).

P r z y k ł a d 6. (4-Aliloksyfenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego

W acetonie rozpuszczono 1,5 g (0,0068 mola) (4-hydroksyfenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego, dodano 5,8 ml (0,068 mola) bromku allilu i intensywnie mieszając dodano 9,3 g (0,068 mola) drobno zmielonego węglanu potasu, po czym mieszaninę mieszano przez noc w temperaturze pokojowej.

PL 194 932 B1

Mieszaninę reakcyjną przesączono, przesącz zatężono, pozostałość rozpuszczono w wodzie i przekrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego.

Wydajność 0,8 g, temperatura topnienia 162 - 164°C.

¹H^-NMR: (DMSO^-d₆): 2^,3 (s, 3H)^, 4^,45^-4^,63 (m, 2H)^, 5^,15^-5^,33 (m, 2H)^, 5^,9^-6^,2 (m, 1^ 6^,95 i 7,42 (w każdym przypadku 2H, AA'BB'), 10,0 (sb, 1H), 12,5-14,5 (ssb, 1H).

Badania farmakologiczne

Skuteczność związków o wzorze 1 badano in vitro za pomocą testu proliferacji w hodowlach komórkowych.

P r z y k ł a d 7. Próba proliferacji

Pożywkę Clicks-/RPMI 1640 (50:50) z L-glutaminą bez NaHCO3 w postaci proszku na 10 litrów (Seromed, Biochrom, Berlin, Niemcy) rozpuszczono w 9 litrach dwukrotnie destylowanej wody i roztwór sterylnie przesączono do butelek po 900 ml.

Pożywka do przemywania

900 ml pożywki podstawowej zbuforowano 9,5 ml 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 5 ml HEPES (kwasu N-2-hydroksyetylo-piperazyno-N-2-etanosulfonowego) (Gibco, Eggenstein, Niemcy).

Pożywka użytkowa

900 ml pożywki podstawowej plus 19 ml roztworu NaHCO3 (7,5%; 10 ml roztworu HEPES i 10 ml roztworu L-glutaminy (200 mM).

Jako pożywkę dla proliferacji limfocytów pobudzanej mitogenami stosowano pożywkę użytkową, wzbogaconą 1% płodową surowicą cielęcą (FCS), zdezaktywowaną termicznie (30 minut, 56°C).

Pożywka dla komórek nowotworowych

Przy hodowli komórek nowotworowych i komórek hybrydom stosowano pożywkę użytkową zawierającą 5% FCS.

Pożywka dla hodowli komórek

Przy hodowli linii komórkowych mieszano 900 ml pożywki użytkowej z 10% FCS, 10 ml roztworu NEA (non-essential amino acids) (Gibco), 10 ml roztworu pirogronianu sodu (100 mM, Gibco) i 5 ml 10²M merkaptoetanolu.

Pozyskiwanie i obróbka komórek śledziony dla proliferacji limfocytów wzbudzanej mitogenami

Myszy uśmiercono przez przemieszczenie kręgów szyjnych i sterylnie pobrano śledzionę. Na sterylnym sicie o numerze oczek 80 „mesh rozdrobniono śledziony i razem z pożywką użytkową ostrożnie przepuszczono do płytki Petriego za pomocą tłoczka strzykawki (10 ml) z tworzywa sztucznego. W celu usunięcia erytrocytów z zawiesiny komórek śledziony, mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej około 1 minuty w hipotonicznym roztworze 0,17M chlorku amonu, wstrząsając ją od czasu do czasu. Erytrocyty ulegają przy tym lizie, podczas gdy żywotność i reaktywność limfocytów nie zmienia się. Po odwirowaniu (7 minut/340 g) lizat odrzuca się, komórki dwukrotnie przemywa i wykorzystuje następnie w testach.

Proliferacja limfocytów pobudzana mitogenami x 10⁵ poddanych takiej obróbce komórek śledziony pobranych z samic mysz NMRI, razem z różnymi mitogenami i badanym preparatem (związkiem o wzorze 1) w 200 ml pożywki dodano za pomocą pipetki do każdego wgłębienia płytki do mikromiareczkowania. Stosowano następujące stężenia mitogenów i preparatów:

Konkanawalina A [Serva]: 0,5-0,25-0,12 mg/ml

Lipopolisacharyd [Calbiochem]: 1,0-0,5-0,1 mg/ml

Fitohemaglutynina [Gibco]: 0,5-0,25-0,12% roztwó roodstawowy

Mitogen szkarłatki [Gibco] związek 1 lub 2: 50, 25, 10, 7,5, 5, 2,5, 1,0,5, 0,1 mmola.

Jako dodatnią grupę odniesienia uznano grupę z dodatkiem mitogenów bez preparatu, a jako ujemną grupę odniesienia uznano komórki w pożywce z preparatem bez dodatku mitogenów. Każde stężenie mitogenów testowano czterokrotnie ze wszystkimi stężeniami preparatów. Po 48 godzinach inkubacji w 37°C i przy 5% CO2 dodano do komórek 25 ml/wgłębienie ³H-tymidyny (Amersham) o aktywności 0,25 mCi/wgłębienie (9,25x103 Bq. Rozpoczynało to dalszą inkubację trwającą 16 godzin, w tych samych warunkach; Dla oceny testowanych próbek, komórki zbierano na bibule filtracyjnej w urządzeniu przeznaczonym do tego celu (Flow Laboratories), przy czym niewbudowaną tymidynę zbierano w specjalnej butelce na odpadki. Bibułę filtracyjną suszono, wykrawano i razem z 2 ml scyntylatora (Rotiszint 22, firmy Roth) wprowadzano do naczynia scyntylacyjnego, gdzie jeszcze przez 2 godziny chłodzono ją w 4°C. Radioreaktywność komórek z wbudowaną tymidyną mierzono w liczniku promieniowania beta (Tricarb-460c, firmy Packard).

PL 194 932 B1

Przygotowanie komórek nowotworowych i linii komórkowych do testu proliferacji

Stosowane w testach komórki nowotworowe lub linie komórkowe pobierano w logarytmicznej fazie wzrostu hodowli podstawowej, przemywano dwukrotnie pożywką do przemywania i wykorzystywano do wytworzenia zawiesiny w odpowiednim środowisku.

Przeprowadzenie testów proliferacji i ich ocena

Testy proliferacji prowadzono we wgłębieniach płytki do mikromiareczkowania. Związki o wzorze 1 i interleukiny rozpuszczano w 50 ml na wgłębienie odpowiedniej pożywki i nastawiano liczbę komórek (5x10⁵) w 100 ml na wgłębienie, tak że uzyskiwano końcową objętość 200 ml na wgłębienie. We wszystkich testach wartości te oznaczano czterokrotnie. Komórki bez preparatu i czynnika wzrostu definiowano jako ujemną grupę odniesienia, natomiast komórki bez preparatu, ale z czynnikiem wzrostu jako dodatnią grupę odniesienia. Od wszystkich wartości oznaczanych odejmowano wartość charakteryzującą ujemną grupę odniesienia, a różnicę pomiędzy wartością charakteryzującą dodatnią grupę odniesienia i ujemną grupę odniesienia uważano za 100%. Płytki do mikromiareczkowania inkubowano przez 72 godziny w 37°C i przy 5% CO2 i szybkość proliferacji oznaczano w taki sposób, jak w przypadku proliferacji limfocytów pobudzanej mitogenami.

Linie komórkowe pobierano ze zbioru podstawowego American Type Culture Collection (ATCC).

W tabeli 1 podano wartości stężenia, przy których następuje 50% hamowanie.

Tabel a 1

Związek o wzorze 1 z przykładu	Linia komórkowa
	A20.2.J (mM)	EL4 (mM)	K562(mM)
1	0,8	0,8	50
2	15,0	6,0	20
5	50,0	25,0	nie oznaczano

Przykład 8. Sposób wiązania związku z przykładu 2 z matrycą ®BIAcore CMS

Wyjściowym materiałem był CM5-Chip firmy Pharmacia Biosensor, mający na powierzchni karboksymetylodekstran (BIAapplication Handbook, 1994, Merk AB, Uppsala, Szwecja). Wszystkie etapy sprzęgania prowadzono przy szybkości przepływu 5 ml/minutę. Wszystkie etapy prowadzono w 25°C, z użyciem jako roztworu nośnego soli buforowanej buforem Hepes o pH 7,4 (HPS).

Etap 1: Aktywowanie powierzchni materiału Chip z użyciem 35 ml mieszaniny 0,05 M NHS (N-hyoksysukcynimidu) i 0,2 M EDC (N-etylo-N'-(dimetyloaminopropylo)karbodiimidu) w stosunku 1:1.

Etap 2: 35 ml 40 mM roztworu dichlorowodorku cystaminy w 0,1 M buforze, boranie sodu, o pH 8,5. Etap 3: 35 ml etanoloaminy o pH 8,5, wysycającej niezajęte struktury matrycy.

Etap 4: 35 ml 0,1 M ditiotreitolu w 0,1 M buforze boranu sodu, o pH 8,5.

Etap 5: 35 ml roztworu zawierającego związek z przykładu 2 (10 mg/ml) w 0,1 M buforze, boranie sodu, o pH 7,5.

P r z y k ł a d 9. Analizy z zastosowaniem metody ®BIAcore.

Analizy przeprowadzano zasadniczo tak jak opisano w Current Biology (tom 3, nr 12, str. 913-915). Układ: ®BIAcore 2000 z odpowiednim oprogramowaniem, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,

Szwecja

Chip: CMS Sensorchip, Pharmacia Biosensor AB Pokrycie: zgodnie z przykładem 8

Bufor nośny: bufor HBS z certyfikatem BIA, Pharmacia Biosensor AB.

Szybkość przepływu: 10 ml/minutę

Wstrzykiwanie: po 50 ml próbki przeznaczonej do analizy, 5 minutowa faza asocjacji Czas płukania: 180 s, 3 minutowa faza dysocjacji Regeneracja: 2 x 15 s, z 0,05% dodecylosulfononianem sodowym A) Wiązanie albumin różnych surowic

PL 194 932 B1

Rodzaj	Jednostki rezonansowe
Albumina surowicy bydlęcej	50
Albumina surowicy ludzkiej	294
Albumina surowicy szczurza	1061
Albumina surowicy mysiej	151
Albumina surowicy kurzej	8
Albumina surowicy oślej	480
Albumina surowicy owczej	331

Określenie „jednostki rezonansowe oznacza jednostki ilościowe proporcjonalne do ilości związanych białek. B) Wiązanie różnych dehydrogenaz

Enzym	Jednostki rezonansowe
DH glicerynoaldehydofosforanowa (25 nM)	69
DH glicerynoaldehydofosforanowa (50 nM)	148
DH glicerynoaldehydofosforanowa (100 nM)	297
DH glicerynoaldehydofosforanowa (250 nM)	603
DH dihydroorotanowa (50 nM)	203
DH dihydroorotanowa (100 nM)	425
DH dihydroorotanowa (250 nM)	1064
Kinaza pirogronianowa (50 nM)	85
Kinaza pirogronianowa (100 nM)	189
Kinaza pirogronianowa (250 nM)	505

W grupie enzymów DH oznacza dehydrogenazę.

Względna siła wiązania badanych dehydrogenaz może być między sobą porównana, przy określonym stężeniu białek. Przy stężeniu białek 1nm wiązanie DH dihydroorotanowej było najsilniejsze, a następnie siła wiązania malała w szeregu DH mleczanowa, DH glicerynoaldehydofosforanowa i kinaza pirogronianowa.

P r z y k ł a d 10

Chromatografia powinowactwa

Związek z przykładu 1 sprzęgano z matrycą nośnikową przez jego reaktywny atom bromu. Jako materiał nośnikowy stosowano polimer metakrylanowy, Fractogel® EMD-SH (firma Merck KGaA, Darmstadt). Wiązanie kowalencyjne utworzono według standardowego sposobu postępowania zgodnie z DE 4310964. Otrzymanym żelem wypełniono kolumnę Superformance® o wymiarach 1cm x 5 cm (Merck KGaA) i połączono ją z aparaturą do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Otrzymywanie rozpuszczalnych białek komórkowych

Komórki RAW 264.7 (zbiór podstawowy ATCC) hodowano przez 48 godzin do osiągnięcia zrośnięcia się hodowli, przemyto je trzykrotnie buforem PBS w 4°C w celu usunięcia pożywki, komórki przeniesiono do buforu PBS i odwirowywano w ciągu 10 minut przy 200 g. Obróbkę komórek przeprowadzono w 4°C. Z peletki komórek ponownie wytworzono zawiesinę w buforze A, składającym się z 20 mM zasady Tris, 2 mM MgCh x 6H2O i 1 mM ditiotreitolu (DTT). Aby zapobiec proteolizie powodowanej przez proteazy komórkowe dodano mieszaniny różnych inhibitorów proteaz. Następnie zawiesinę zhomogenizowano w szklanym naczyniu.

W celu uzyskania rozpuszczalnych białek zawiesinę odwirowywano w 4°C przez 30 minut przy 22000 g.

Pozostałość natychmiast wykorzystywano do chromatografii powinowactwa. Połowę pozostałości pozostawiono do celów porównawczych, drugą połowę przepompowano do kolumny powinowactwa.

PL 194 932 B1

HPLC

W chromatografii powinowactwa stosowano aparaturę firmy Kontron Instruments, Mediolan, Włochy. Składa się ona z autosamplera 465, pompy HPLC 422 i 422S, wysokociśnieniowego zaworu mieszającego M800, zaworu silnikowego Besta i detektora diodowego 440.

Zapis danych i ocenę wyników dokonywano za pomocą Data System 450-MT2/DAD. Poddane obróbce komórki rozcieńczono wodą do objętości 30 ml i przepompowano strumieniem 1ml/minutę. Przebicie kolumny wychwytywano i tak samo jak poszczególne frakcje utrzymywano w 4°C do końca procesu chromatograficznego. Do elucji gradientowej stosowano następujący bufor:

Skład buforu PBS:

NaCl 8,00 g/l

KCl 10,20 g/l

KH2PO4 0,20 g/l

Na2HPO₄ x 7H2O 2,16 g/l

Skład buforów uwzględnionych w tabeli 2:

Bufor: Skład:

PBS

PBS + 0,5 M NaCl

PBS + 150 mM A 77 1726b (sól sodowaN-(4-trifluorometylofenylo)amidii kwasu jano-3-hydroksykrotonowego)

H2O

6 M mocznik

60% acetonitryl +0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA)

Po naniesieniu roztworu białek rozpoczęto elucję, stosując strumień 3 ml/minutę gradientu, określonego w tabeli 2.

Tabel a 2

Czas	Gradient	Frakcja
0-10	H2O(4)	1
10-15	Gradient na PBS(1)	2
15-20	PBS(1)
20-35	Gradient na PBS+0,5M NaCl(2)	3
35-40	PBS+0,5MNaCl(2)
40-50	Gradient na PBS(2)
50-55	PBS(1)	4
55-70	Gradient na PBS + preparat(3)	5
70-75	PBS + preparat(S)
75-90	H2O(4)	6
90-100	Mocznik (5)	7
100-110	H2O(4)	8
110-120	Acetonitryl (6)	9

Liczby w nawiasach określają stosowany bufor.

Frakcje zebrano, dializowano przez 48 godzin w wodzie w temperaturze 4°C (zdolność zatrzymywania cząstek stosowanych membran 6000 - 8000 Da) (oprócz frakcji acetonitrylowej), a następnie zliofilizowano.

Oznaczanie białek

Po liofilizacji białka rozpuszczono w 1 ml 1% dodecylosulfonianu sodowego (SDS) i wodą rozcieńczono do stężenia 0,5% SDS. Pobrano podwielokrotną próbkę tego roztworu i zużyto go do oznaPL 194 932 B1 czenia białek za pomocą testu BCA (Pierce). Białka zatężono (UNIVASPO 150H, UniEquip Power Heater, Martinsried, Niemcy), a następnie rozpuszczono w odpowiedniej objętości buforu do próbek, składającego się z 10 g sacharozy, 9 ml roztworu 0,25M Tris/1M glicyny, 7,8 ml 10% SDS, 2,5 ml błękitu bromofenolowego (0,1%), 4 ml b-merkaptoetanolu i 1,7 ml wody.

SDS-PAGE

Do wytwarzania żelu SDS z poliakryloamidowym gradientem 10-17% stosowano następujące roztwory:

A: B:

ml akryloamidu (30%, 0,5%) 8,5 ml akryloamidu (30%, 0,5%)

3,75 ml Tris (3M, pH 8,8) 3,75m I Tris (3M , pH8,8)

6,12 ml wody 3,275 ml gliceryny

0,15 ml SDS 0,15 ml SDS

Polimeryzację rozpoczynano dodatkiem 100 ml 10% APS i 12,5 ml TEMED. Żel zbiorczy wytworzono z 3 ml akryloamidu (10%, 0,5%), 1,36 ml wody, 1,45 ml 0,5M Tris (pH 6,8), 60 ml 10% SDS, 106 ml 10% APS i 9 ml TEMED.

Przy wytwarzaniu żelu analitycznego nakładano około 10 mg białka na pasmo żelu, przy wytwarzaniu żelu preparatywnego 100 mg.

Oznaczanie masy cząsteczkowej wykonywano przez porównanie ze standardowymi mieszaninami białek.

Sekwencjonowanie

Frakcje białek, które w żelu analitycznym tworzą pasma wzbogacone białkami, rozdzielano na skalę preparatywną i rozdzielone białka unieruchomiano na membranie PVDF (Millipore), techniką przenoszenia plam. Białka uwidoczniano zabarwieniem przez Coomassie i bezpośrednio po tym poddawano degradacji Edmana. Białka, których N-koniec był zablokowany, po elektroforezie starannie wycinano z żelu zabarwionego Coomassie i przemywano wodą do odczynu obojętnego. Kawałeczki żelu przeciskano przez dwa stalowe sita o średnicy otworów 100 mm i 32 mm ustawione jedno za drugim i przeciśnięty żel poddawano homogenizacji. Masę podobną do maści suszono w UNIVAPO 150H (UniEquip Power Heater, Martinsried, Niemcy) do uzyskania niewielkiej wilgotności resztkowej. Tak otrzymane białka rozszczepiano na peptydy przez 7 godzinną inkubację w 37°C z enzymem endoproteinazą LysdC (Boehringer Mannheim) (stosunek enzymu do białek około 1:10), w buforze składającym się z 25 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA.

Otrzymane peptydy dwukrotnie eluowano po 1 ml 60% acetonitrylu, 0,1% TFA, w 37°C przez 4 godziny. Połączone eluaty zatężono w UNIVAPO i otrzymane peptydy rozdzielono metodą chromatografii z odwróconymi fazami. Proces chromatograficzny przeprowadzono w ciągu 70 minut w kolumnie LiChroCART 125-2 Superspher® 60 z liniowym gradientem (1%/min) A: 0,1 TFA w H2O na B: 0,1% TFA w acetonitrylu.

Sekwencjonowanie aminokwasów oczyszczonych peptydów przeprowadzono na zasadzie degradacji Edmana w urządzeniu 477 A Gasphasen-Sequenzer (Applied Biosystems). Identyfikacji PTH-AS dokonywano w fenylotiohydantoinowym analizatorze aminokwasów 120A Phenylthiohydantoin Aminosaure Analysator (Applied Biosystems) przy 269 nm.

Analiza Western blot

Po przeniesieniu białek z żelu SDS na membranę PVDF (Millipore), niepokryte powierzchnie zablokowano przez 2 godzinną inkubację 2,5% białkiem kurzym (Sigma) w TBS, składającym się z 45 g NaCl, 30,3 g zasady Tris w 5 litrach, pH 7,4.

Pierwsze przeciwciało rozcieńczono w odpowiednim stosunku buforem blokującym i inkubowano przez 1 godzinę. Następnie plamkę trzykrotnie przemywano przez 5 minut TBS i 0,1% Tween 20 i inkubowano 1 godzinę z drugim znaczonym przeciwciałem POD. Proces przemywania powtórzono i unieruchomione przeciwciało uwidoczniono roztworem, składającym się z 60 mg 4-chloro-1-naftolu, 20 ml metanolu, 100 ml TBS i 200 ml nadtlenku wodoru (30%).

Białka, otrzymane w NaCl(3) i frakcji A771726b(5) (patrz tabela 2), mogły być identyfikowane na podstawie peptydów o długości siedmiu do czternastu aminokwasów. W przypadku białek o względnej masie cząsteczkowej 22 000 uzyskana sekwencja aminokwasów mogła być przypisana dwóm białkom MSP23 i NKEF-A.

Przyczyną tego jest wysoka zgodność sekwencji obu białek wynosząca 93%. Wyniki sekwencjonowania otrzymane za pomocą chromatografii powinowactwa podano w tabeli 3.

PL 194 932 B1

Tabel a 3

Frakcja	Białko	Sekwencja aminokwasów	Względna masa cząsteczkowa
NaCl (3)	DH mleczanowa łańcuch M (LDHA)	SADTLWGIQK	36498
Cyklofilina A	TAENFRALSTGEK	17971
A771726B (5)	HSP90-P (HSP84)	EQVANSAFVERVRK	83185
HSP70 (HSC73)	EIAEAYLGK	70871
Kinaza pirogronianowa M2	GPEIRTGLIK	57755
EFl-a	STTTGHLIYK	50164
Aktyna (łańcuch g)	EITALAPSTMKRGILTLK	41876
GAPDH	VIPELNGK	35679
DH jabłczanowa	ITPFEEKVVE-FV	35596
DH mleczanowa	NLRRVHP	36367
Mutaza fosfoglicerynianowa	PMQFLGDEETVRK	28635
MSP23/NKEF-A	ATAVMPDGQFK	22176

W nawiasach podano numer frakcji zgodnie z tabelą 2.

Opis zidentyfikowanych białek

Zatężone we frakcji (3) białko o względnej masie cząsteczkowej 18 000 zidentyfikowano jako cyklofilinę A. Cyklofilina A należy do dużej grupy peptydylopropylo-cis-trans-izomeraz, które biorą udział w immunosupresyjnym działaniu szeregu preparatów, np. cyklosporyny A.

Dodatkowo we frakcji (3) zidentyfikowano dehydrgenazę mleczanową, enzym beztlenowej glikozy, katalizujący reakcję pirogronianu do mleczanu. W tkankach zwierzęcych dehydrgenaza mleczanowa występuje co najmniej w pięciu różnych postaciach izoenzymowych. Enzym dominujący w mięśniach szkieletowych zawiera cztery łańcuchy A, a przeważający w sercu zawiera cztery łańcuchy B. W omawianym przypadku zidentyfikowano peptyd z łańcucha A dehydrogenzy mleczanowej.

We frakcji (5) zidentyfikowano dwa białka należące do grupy białek szoku termicznego. Dominujące w eukariotach białko szoku termicznego HSP70 należy do grupy multigenów.

Białko szoku termicznego HSP90 jest białkiem cytozolowym, które konstytutywnie (w sposób niekontrolowany) także w normalnych warunkach jest eksprymowane. Składa się ono z dwóch oddzielnych produktów genowych FSP84 i HSP86, które są wzajemnie zgodne pod względem sekwencji w 66%. HSP90 jest znany z tego, że tworzy kompleks z receptorami hormonów steroidowych i w ten sposób wpływa na transkrypcję określonych genów.

We frakcji (5) oprócz dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (GAPDH), kinazy pirogronianowej M2 i mutazy fosfoglicerynianowej znaleziono trzy białka glikolizy. Te trzy enzymy pochodzą z końcowej części glikolizy i w warunkach natywnych występują w kompleksie multienzymatycznym.

Pasmo, które również jest bardzo intensywne we frakcji (5), zidentyfikowano jako czynnik wydłużenia (EF-1a). EF-1a jest ważnym eukariotycznym czynnikiem translacyjnym. W swojej funkcji jest on porównywalny z prokariotycznym czynnikiem wydłużenia EF-Tu i podczas biosyntezy białek w procesie zależnym od GTP transportuje aminoacyl-tRNAs z cytozolu do jego miejsca akceptorowego na rybosomie.

Dodatkowo we frakcji (5) można było stwierdzić obecność aktyny. Aktyna jest białkiem występującym u eukariotów prawie wszędzie i w dużych ilościach. Jest głównym składnikiem układu mięśniowego i struktur podporowych komórek. Aktynowa grupa multigenów koduje co najmniej cztery postacie mięśniowych aktyn, jak również dwie cytoplazmatyczne postacie aktyny (b- i γ-aktyna). W opisanym tutaj przypadku chodzi o g-łańcuch cytoplazmatyczne j postaci aktyny.

PL 194 932 B1

Poza tym zidentyfikowano dehydrogenazę jabłczanową, będącą enzymem cyklu kwasu cytrynowego i jabłczanowo-asparaginianowego układu przenoszącego. Dehydrogenaza jabłczanową występuje w tkankach zwierzęcych w izoformach cytozolowej i mitochondrialnej. Oba izoenzymy razem z aminotransferazą asparaginianową odgrywają ważną rolę w jabłczanowo-asparaginianowym układzie przenoszącym pomiędzy cytozolem i mitochondrium.

Na podstawie sekwencjonowanego fragmentu peptydu, białku frakcji (5) o względnej masie cząsteczkowej 22000 przypisano dwa białka: białko stresowe makrofagów o masie 23000 (MSP23), znane także jako czynnik 3 specyficzny względem osteoblastów (OSF-3), oraz czynnik A wzmacniający komórki NK („natural kiler cell enhancing factor-A, NKEF-A). Zaktywowane makrofagi wytwarzają reaktywne związki tlenu, takie jak H2O2 i O2. Ponieważ same makrofagi wytrzymują ten stres oksydacyjny, muszą one posiadać skuteczny układ obronny, chroniący je przed tymi reaktywnymi związkami.

W przypadku NKEF chodzi o cytozolowe białko z ludzkich czerwonych krwinek, które wzmacnia aktywność komórek NK. Zaliczane są one do limfocytów i po wzbudzeniu cytokinami są w stanie rozpoznać i zniszczyć wiele komórek nowotworowych. Czynnik wzmacniający komórki NK ma względną masę cząsteczkową 44 000 i składa się z dwóch podjednostek o jednakowej wielkości (NKEF-A i NKEF-B), które mają dobrą wzajemną zgodność sekwencji wynoszącą 88%.

P r z y k ł a d 11

Porównawcza chromatografia powinowactwa niepobudzonych, pobudzonych LPS i pobudzonych LPS oraz potraktowanych leflunomidem cytozolowych ekstraktów RAW 264.7

Jako model in vitro procesów zapalnych stosowano pobudzanie linii komórkowej makrofagów RAW 264.7 za pomocą lipopolisacharydów. Lipopolisacharydy (LPS) są podstawowym strukturalnym składnikiem zewnętrznych błon bakterii Gram-ujemnych i jako takie są rozpoznawane przez immunologiczne komórki prawie wszystkich organizmów. W szczególności makrofagi są pobudzane przez LPS do syntezy licznych cytokin, takich jak TNF-a, IL-1 i LL-6. Potencjalnej zmianie wzorca białek, towarzyszącej temu pobudzeniu, powinno się zapobiec przez jednoczesne podanie leflunomidu - środka immunomodulującego.

Komórki RAW 264.7 inkubowano przez 24 godziny z 10 ng LPS na 1 ml bakteryjnej pożywki hodowlanej. Komórki pobudzane przez LPS i potraktowane leflunomidem jednocześnie inkubowano przez 24 godziny z 60 mM A 77 1726B. Komórki poddano obróbce i cytozolowe ekstrakty badano metodą chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny Fractogel®, podobnie jak w przykładzie 10. Frakcje preparatów o tych trzech składach naniesiono następnie na analityczny żel gradientowy i porównano je między sobą.

Szczególnie wyraźne było powiększenie się pasma o względnej masie cząsteczkowej 35 000, które poprzednio zidentyfikowano przez sekwencjonowanie jako dehydrogenaza jabłczanowa. Intensywność tego pasma wyraźnie się zwiększyła, w porównaniu do pozostałych pasm białek, których intensywność przy inkubacji z LPS i A 77 1726B była słabsza.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Noweppohodneizzkkaazlu i amidu kwasukrotonoweego orglnym wzzrzz 1 w którym R' oznacza grupę o wzorze 2 lub 3 0 OH 0 I II H₃Cx^^j-C— H₃Cr 0—N 2 lub CN 3;

PL 194 932 B1

R² oznacza grupę o wzorze -O-(CH2)n-CH=CH2, w którym n oznacza liczbę 1,2 lub 3, albo grupę o wzorze 4 w którym R³ oznacza atom chlorowca lub grupę aminową, a R⁴ oznacza atom wodoru; i/lub ich fizjologicznie zgodne sole.
2. Zwiąąee weeług zzstrz. 1, w którym R¹ oonaacz grupp o wzzrzz 2 I ub 3; R² oonaacz grupp o wzorze -^O-^CH^^CH=^{CH2 l}u^b -N^H-^C(^O)-^CH(^R3)(^R4)^, w ^któr^ym ^r3 oznacza atom ^bromu ^lu^{b g}ru^pęaminową, a r4 oznacza atom wodoru.
3. Zwiąązk weełup z^i^tr^. 1 allo 2, w Κ^^γιί grapa R² οί^ό^ się; w ρίθ^οίθηιυ 1enalc>wem w pozycji para w stosunku do grupy NH.
4. Zwiąąee weełup znstrz. 1, Zkór^m jeet 14-allllokksfeηaloramid Zwess Z-cyjana-3-hhyłzkksyut-2-enokarboksylowego, trifluorooctan (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego, chlorowodorek (4-(2-aminoacetyloamino)fenylo)amidu kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego, (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 2-cyjano-3-hydroksybut-2-enokarboksylowego lub (4-(2-bromoacetyloamino)fenylo)amid kwasu 5-metyloizoksazolo-4-karboksylowego.
5. Sppsóó wetwerzzsia naweyh gpohoonnyh izzkkaazlu i zmidu Zwwsu Ztztonaweeg z zo^ólnm wzorne 1 i/lub ich fizjologicznie zgodnych soli określonych w zastrz. 1, znamienny tym, że

a) związek o ogólnym wzorne 5 w którym R⁶ oznacza hydroksyl, atom chloru lub atom bromu, poddaje się reakcji ze związkiem o ogólnym wzorne 6 w którym R⁷ oznacza OH, z wytworzeniem związku o poniższym wzorne w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 podaną odnoOnie wzoru 1, a R² oznacza OH, następnie powyższy związek poddaje się reakcji z nienasyconym halogenkiem alkilu, w którym grupa alkilowa zawiera 3, 4 lub 5 atomów węgla, z wytworzeniem odpowiedniego związku o ogólnym wzorne 1, w którym r2 oznacza grupę o wzorze -O-(CH2)n-CH=CH2, w którym n oznacza liczbę 1,2 lub 3;

PL 194 932 B1

b) związekoogólnymwzorze5 w którym R⁶ oznacza hydroksyl, atom chloru lub atom bromu, poddaje się reakcji ze zwizzkiem o ogólnym wzorze 6 w którym R⁷ oznacza -NH₂, z wytworzeniem zwizzku o poniższym wzorze w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 podanz odnośnie wzoru 1, a R² oznacza -NH₂, tak otrzymany zwizzek poddaje się reakcji z halogenkiem kwasu karboksylowego, korzystnie bromkiem bromoacetylu, z wytworzeniem zwizzku o ogólnym wzorze 1, w którym r2 oznacza grupę o wzorze 4 w którym R³ oznacza atom chlorowca, a R⁴ oznacza atom wodoru; albo

c) aromatycznz diaminę, korzystnie p-fenylenodiaminę, poddaje się reakcji z glicynz z zabezpieczonz grupz aminowz, z wytworzeniem zwizzku o wzorze 6, w którym r7 oznacza grupę o wzorze 4, w którym r3 oznacza zabezpieczonz grupę aminowz, a R4 oznacza atom wodoru, po czym przeprowadza się go tak jak w sposobie a) w odpowiedni zwizzek o ogólnym wzorze 1; albo

d) usuwa się grupę zabezpieczającz ze związku wytworzonego sposobem c); albo

e) wytworzony sposobami a) - c) zwizzek o ogólnym wzorze 1, w którym Ri oznacza grupę o wzorze 2, przeprowadza się w zwizzek o ogólnym wzorze 1, w którym Ri oznacza grupę o wzorze 3

PL 194 932 B1

f) związek o ogólnym wzorze 1 wytworzony sposobami a) -e) albo wyodrębnia się w postaci wolnej, albo w przypadku obecności grup kwasowych lub zasadowych ewentualnie przeprowadza się w fizjologicznie zgodne sole.
6. Śrr^<^^lk farmaceutyczny zawierający substancję czynną i farmaceutycznie dopuszczalny nnośnik oraz ewentualnie substancje pomocnicze, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera nową pochodną izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 określoną w zastrz. 1 lub jej fizjologicznie zgodną sól.
7. Zastosowanie nowych pochodnych izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 1 określonych w zastrz. 1 do wytwarzania środka farmaceutycznego do profilaktyki i/lub leczenia chorób nowotworowych, stanów zapalnych i chorób autoimmunologicznych.
8. Nowe pochodne izoksazolu i amidu kwasu krotonowego o ogólnym wzorze 7 w którym R¹ oznacza grupę o wzorze 2 lub 3

L oznacza ugrupowanie mostkowe -NH-C(O)-CH(R⁴)(R³), w którym R³ oznacza wiązanie kowalencyjne, a R⁴ oznacza atom wodoru; a X oznacza ugrupowanie karboksymetylodekstranu lub polimeru metakrylanowego.
9. Zastosowanie nowyyh ppchoonyyh izzkkaazlu i amidu kwasu krotonoweeg o ooginym wzzrze 7 określonych w zastrz. 8 do oczyszczania białek lub do wytwarzania materiału chromatograficznego, a zwłaszcza materiału do chromatografii powinowactwa.