JPH10231279A - イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体および薬剤および診断剤としてのそれらの使用 - Google Patents

イソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体および薬剤および診断剤としてのそれらの使用

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JPH10231279A JP10013922A JP1392298A JPH10231279A JP H10231279 A JPH10231279 A JP H10231279A JP 10013922 A JP10013922 A JP 10013922A JP 1392298 A JP1392298 A JP 1392298A JP H10231279 A JPH10231279 A JP H10231279A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 次の式 【化１】 〔式中、Ｒ1は、式IIまたはIII 【化２】 の基である〕で示されるイソオキサゾールおよびクロト
ンアミド誘導体化合物および次の式 【化３】 で示される化合物の提供。 【解決手段】 本化合物は、対応するアニリン誘導体と
イソオキサゾール誘導体との反応によって得られ、炎
症、癌性疾患または自己免疫疾患の治療用の薬剤などを
製造するのに適している。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、新規なイソオキサゾールおよび
クロトンアミド誘導体、これらの化合物の製法および薬
剤としてのこれらの化合物の使用、および抗体の生成の
ための抗原としてのこれらの化合物の使用および診断お
よび精製方法におけるこれらの化合物の使用に関するも
のである。抗炎症作用、免疫抑制作用または抗増殖作用
を有するイソオキサゾールおよびクロトンアミド誘導体
は、これまでに開示されている（ＥＰ ０ ０１３ ３７
６;ＥＰ ０ ２１７ ２０６；ＥＰ ０ ５２７ ７３
６）。動物およびヒトの血清におけるこれらの化合物の
分析的測定は、普通のクロマトグラフィー方法の助けに
より可能である。これらのクロマトグラフィー方法の不
利点は、装置、複雑な試料製造工程および低い試料処理
量の点において経費がかかることである。免疫学的測定
および分析方法は、クロマトグラフィー方法に代る急速
なそして確実な方法である。適当な抗体の生成は、これ
らの方法を実施するのに、重大である。
【０００２】本発明は、イソオキサゾールおよびクロト
ンアミド誘導体の変性によって、抗体生成に適し、重合
体に結合することができそして放射免疫測定法における
トレーサーとして用いうる化合物として利用しようとす
るものである。式Ｉの化合物は、アニリン部分の芳香族
環上に、それ自体でまたはスペーサー官能を経て重合体
に共有的に結合することのできる１個または２個以上の
官能基がある場合に、この目的を達成するのに適してい
るということが見出された。
【０００３】それ故に、本発明は式Ｉ
【化８】 の化合物および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許
容し得る塩および（または）式Ｉの任意の立体異性形態
の化合物に関するものである。
【０００４】上記式において、Ｒ1は、式IIまたはIII
【化９】 の基であり、そしてＲ2は、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−Ｃ
Ｈ＝ＣＨ2（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｂ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは
整数１、２または３でありそしてハロゲンは弗素、塩
素、臭素または沃素である） (ｃ) 式Ｖ
【化１０】 （式中、Ｒ3は、（１）ハロゲンまたは（２）ＮＨ2であ
り、そしてＲ4は、（１）水素原子または（２）アミノ
酸の基である）の基、または(ｄ) −ＮＨ2である。
【０００５】式Ｉの好ましい化合物は、Ｒ1が、式IIま
たはIIIの基であり、そしてＲ2が、(ａ) −Ｏ−(Ｃ
Ｈ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは整数２であり、そ
してハロゲンは臭素または沃素である）、(ｂ) −Ｏ−
ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2または(ｃ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ
(Ｒ3)(Ｒ4)（式中、Ｒ3は臭素、−ＮＨ2または塩素であ
りそしてＲ4は水素原子である）である化合物である。
【０００６】式Ｉの特に好ましい化合物は、２−シアノ
−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸（４−アリ
ルオキシフェニル）アミド、２−シアノ−３−ヒドロキ
シブト−２−エンカルボン酸（４−（３−ヨードプロポ
キシ）フェニル）アミド、２−シアノ−３−ヒドロキシ
ブト−２−エンカルボン酸（４−（２−アミノアセチル
アミノ）フェニル）アミド、５−メチルイソオキサゾー
ル−４−カルボン酸（４−（２−アミノアセチルアミ
ノ）フェニル）アミド、２−シアノ−３−ヒドロキシブ
ト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチルア
ミノ）フェニル）アミドまたは５−メチルイソオキサゾ
ール−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミ
ノ）フェニル）アミドのような化合物である。
【０００７】式Ｉにおける基Ｒ2は、フェニル環上の
“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、
好ましくはパラ−位にあることができる。式Ｉの化合物
は、場合によっては、光学的異性体、ジアステレオマ
ー、ラセミ体またはこれらの混合物として存在すること
ができる。“アミノ酸”なる用語は、以下の化合物の立
体異性形態、例えばＤおよびＬ形態を意味するものとし
て理解されるべきである：アスパラギン、バリン、アル
ギニン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、
トリプトファン、β−アラニン、リジン、プロリン、グ
リシン、γ−アミノブチレート、Ｎε−アセチルリジ
ン、Ｎδ−アセチルオルニチン、Ｎγ−アセチルジアミ
ノブチレート、Ｎα−アセチルジアミノブチレート、ヒ
スチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェ
ニルアラニン、セリン、システイン、トレオニン、アラ
ニンおよびチロシン。Ｌ−アミノ酸が好ましい。アミノ
酸残基Ｇｌｙが特に好ましい。
【０００８】アミノ酸残基は、相当するアミノ酸から誘
導される。アミノ酸に対する簡単な表示法は、一般的な
慣用の表示法にしたがう。基（Ｒ4）は、それぞれのア
ミノ酸の側鎖を示す。式Ｉの化合物の適当な生理学的に
許容し得る塩は、例えば有機アンモニウム塩基の塩を包
含するアルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニ
ウム塩およびプロトン化アミノ酸残基の塩である。
【０００９】本発明は、また (ａ) 式VI
【化１１】 （式中、Ｒ6は、基ＯＨ、ＣｌまたはＢｒである）の化
合物を、式VII
【化１２】 （式中、Ｒ7は、(１) −ＮＨ2、(２) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)
−ＣＨ2−ＮＨ−保護基（式中、保護基は、アミン保護
基、特にＢｏｃである）、(３) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ
2−ハロゲンまたは(４) −ＯＨである）の化合物と反
応させて、Ｒ1が式IIの基でありそしてＲ2が、−Ｎ
Ｈ2、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基、−ＯＨま
たは−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンである式Ｉの化
合物を得、または (ｂ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された
化合物を、アルキルハライドまたはジハロアルカン（ア
ルキル部分は２、３または４個の炭素原子を有す）と反
応させて式Ｉの相当する化合物を得、または (ｃ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された
化合物を、不飽和アルキルハライド（アルキル部分は
３、４または５個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉ
の相当する化合物を得、または (ｄ) Ｒ7が−ＮＨ2である方法（ａ）により製造された
化合物を、臭化ブロモアセチルのようなカルボン酸ハラ
イドと反応させて、Ｒ2が式Ｖの基であり、Ｒ3がハロゲ
ンでありそしてＲ4が水素原子である式Ｉの化合物を
得、または (ｅ) ｐ−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミン
をアミノ基が保護されたアミノ酸と反応させてＲ7が式
Ｖの基であり、Ｒ3が−ＮＨ2でありそしてＲ4が保護さ
れたアミノ酸である式VIIの化合物を得、そしてそれか
ら方法(ａ)におけるように反応させて式Ｉの相当する化
合物を得、または (ｆ) 方法（ａ）または（ｅ）により製造された式Ｉの
化合物における保護基を除去し、または (ｇ) Ｒ1が式IIの基である方法（ａ）〜（ｆ）により
製造された式Ｉの化合物をＲ1が式IIIの基である式Ｉの
化合物に変換し、または (ｈ) 方法（ａ）〜（ｇ）により製造された式Ｉの化合
物を遊離形態で単離するかまたは酸性または塩基性基が
存在するときに、場合によってそれを生理学的に許容し
得る塩に変換することからなる式Ｉの化合物および（ま
たは）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る塩および
（または）式Ｉの任意の立体異性形態の製法に関するも
のである。
【００１０】(ａ)による方法工程においては、例えばイ
ソオキサゾール−４−カルボン酸（Ｒ6は−ＯＨであ
る）を、文献から知られている方法によって、例えば非
プロトン性溶剤（例えばトルエン、テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）または塩素化炭化水素）中で塩化チオニルま
たはオキシ塩化燐によって酸クロライドに変換しそして
それから、それを、双極性の非プロトン性溶剤、例えば
ＴＨＦまたは塩素化炭化水素中で、有機塩基、例えば第
３級アミン（例えばトリエチルアミンまたはＮ−エチル
モルホリン）を添加して、適当な方法で、場合によって
は置換されている芳香族アミンと反応させることができ
る。このようにする代わりに、アミド形成は、ペプチド
化学から知られている縮合試薬、例えばジシクロヘキシ
ルカルボジイミドを添加して、カルボン酸から直接実施
することもできる。第二の変形方法は、さらにアミノま
たはアルコール基を有する芳香族アミンに対して特に適
している。
【００１１】方法工程（ｂ）または（ｃ）においては、
アニリン部分により導入されたヒドロキシ基は(１) そ
れを、有機または無機塩基、例えば炭酸カリウムを添加
して、アルキルハライドまたはジハロアルカン、例えば
１,３−ジヨードプロパンと反応させて相当する置換さ
れた芳香脂肪族エーテルを得る（後者の場合において
は、二量化は、生成物中においてアルキルハライド官能
が固定相に対する生成物の結合のために残留するような
適当に大過剰のアルキル化試薬または溶剤としてのその
使用によって避けることができる）か、または(２) そ
れを、同様な条件下において双極性の非プロトン性溶
剤、例えばテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトンま
たは塩素化炭化水素中で、不飽和アルキルハライド、例
えばハロゲン化アリルまたはハロゲン化プロパルギルと
反応させてアリルまたはプロパルギルエーテルを得る
（同時的に溶剤としてアセトンおよび塩基として炭酸カ
リウムを使用する場合は、（ｇ）に記載したイソオキサ
ゾール部分（式IIの基）の開環が起こる）ことによっ
て、さらに官能化される。
【００１２】方法工程（ｄ）においては、ＴＨＦまたは
塩素化炭化水素のような双極性の非プロトン性溶剤にお
いて有機塩基、例えば第３級アミン（例えばトリエチル
アミンまたはＮ−エチルモルホリン）を添加して、アミ
ノ基をカルボン酸ハライド、例えば臭化ブロモアセチル
と反応させる。方法工程（ｅ）においては、縮合剤、例
えばジシクロヘキシルカルボジイミドを使用し、アミノ
基において保護されたアミノ酸、例えばＮ−Ｂｏｃ−グ
リシンを使用して、芳香族ジアミン、例えばｏ−フェニ
レンジアミンを、制御された方法でモノアミドに変換
し、それからアニリド形成を方法工程（ａ）に記載した
ように実施しそして最後にアミン保護基をペプチド化学
から知られている標準条件下で除去する（方法工程
（ｆ））。方法工程（ｇ）においては、（ａ）〜（ｆ）
において製造された化合物は、イソオキサゾール部分の
塩基−誘発開環反応に付される。反応は、好ましくは、
過剰の有機または無機塩基、例えばＮａＯＨ、アンモニ
ア溶液または炭酸カリウムを使用して、水性／有機溶剤
混合物、例えばＴＨＦ／水またはエタノール／水中で実
施される。
【００１３】一般式Ｉの化合物がジアステレオ異性形態
またはエナンチオマー形態で存在しそして選択された合
成においてその混合物として得られる場合は、純粋な立
体異性体への分離は、任意のキラル支持物質上のクロマ
トグラフィーによって実施される、または、式Ｉのラセ
ミ化合物が塩形成することができる場合は、補助剤とし
て光学的に活性な塩基または酸を使用して形成されたジ
アステレオマー塩の分別結晶によって活性な異性体に分
離することができる。原則的に同一の方法において、ア
ミノ基のような塩基性基を含有する式Ｉのラセミ化合物
は、光学的に活性な酸、例えば（＋）−樟脳−１０−ス
ルホン酸、Ｄ−およびＬ−酒石酸、Ｄ−およびＬ−乳酸
または（＋）および（−）−マンデル酸を使用して純粋
なエナンチオマーに変換することができる。
【００１４】本発明は、また、医薬的に適当なそして生
理学的に許容し得る賦形剤、添加剤および（または）活
性化合物および補助剤に加えて、式Ｉの少なくとも１種
の化合物および（または）式Ｉの化合物の立体異性形態
および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許容し得る
塩の有効量を含有する薬剤に関するものである。本発明
による薬剤は、静脈内的に、非経口的に、局処的に、直
腸的にまたは経口的に投与することができる。本発明に
よる薬剤は、好ましくは、癌性疾患、炎症および自己免
疫疾患の予防および（または）治療に適している。これ
らは、例えばリウマチ性疾患、筋肉、関節または胃腸管
の急性および慢性炎症、アレルギー気道疾患、乾癬また
は自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）、II型糖尿病、重症筋無力症、シェーグレン症候
群、皮膚筋炎、硬化性皮膚炎または多発性硬化症（Ｍ
Ｓ）を包含する。癌性疾患は、例えば肺癌、白血病、カ
ポシー肉腫、卵巣癌、肉腫、髄膜腫、腸癌、リンパ節の
癌、脳腫瘍、乳癌、胃癌、膵臓の癌、前立腺の癌または
皮膚癌を包含する。
【００１５】本発明は、また、本発明による薬剤を製造
する方法に関するものでありそしてこの方法は、医薬的
に適当なそして生理学的に許容し得る賦形剤および適当
である場合はさらに適当な活性化合物、添加剤または補
助剤を使用して、式Ｉの少なくとも１種の化合物を適当
な投与形態にすることからなる。適当な固体または液体
の医薬製剤形態は、例えば顆粒、粉末、被覆錠剤、錠
剤、（ミクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、
懸濁液、エマルジョン、滴下剤または注射用溶液および
活性化合物を持続的に放出する製剤である。これらの製
剤においては、慣用的な補助剤、例えば賦形剤、崩壊
剤、結合剤、被覆剤、膨潤剤、滑走剤または滑沢剤、風
味料、甘味料および可溶化剤が使用される。しばしば使
用される補助剤は、例えばタルク、澱粉、炭酸マグネシ
ウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび
他の糖、乳汁蛋白質、ゼラチン、セルロースおよびその
誘導体、動物および植物油、例えばタラ肝油、ヒマワ
リ、落花生またはゴマ油、ポリエチレングリコールおよ
び溶剤、例えば滅菌水および一価または多価アルコー
ル、例えばグリセロールである。
【００１６】医薬製剤は、好ましくは、活性成分とし
て、本発明による式Ｉの化合物のある投与量を含有する
投与単位で製造されそして投与される。錠剤、カプセ
ル、被覆錠剤または坐剤のような固体の投与単位の場合
においては、この投与量は約１０００mgまで、好ましく
は約５０〜３００mgであり、そしてアンプル形態の注射
用溶液の場合においては、この投与量は約３００mgま
で、好ましくは約１０〜１００mgである。ヒトおよび動
物の場合における体重約７０kgの成人患者の治療に対し
ては（式Ｉの化合物の効能によって）、経口的投与の場
合においては活性化合物約５０〜３０００mg、好ましく
は約１５０〜１０００mgの一日当りの投与量そして静脈
内投与の場合においては、約５０〜１０００mg、好まし
くは１００〜３００mgの一日当りの投与量が適用され
る。しかしながら、ある状況下においては、より高いま
たより低い投与量もまた適している。一日当りの投与量
は、個々の投与単位またはさもなければいくつかのより
小さい投与単位の形態の１回の投与によってまたは特定
の間隔における小分けされた投与量の多数回の投与によ
って投与することができる。さらに、本発明は、場合に
よっては重合体または固体に架橋員を経て結合される式
Ｉの化合物に関するものである。
【００１７】これらは、式IV
【化１３】 〔式中、Ｒ1は、式IIまたはIII
【化１４】 の基であり、Ｌは、(ａ) −Ｏ−、(ｂ) −ＮＲ5−
（式中、Ｒ5は水素原子である）、(ｃ) −Ｏ−(ＣＨ2)
n−ＣＨ2−（式中、ｎは整数１、２または３である）、
(ｄ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ−(Ｒ4)(Ｒ3)（式中、Ｒ3
は（ａ）共有結合または（ｂ）−ＮＨ−でありそしてＲ
4は（ａ）水素原子または（ｂ）アミノ酸の基であ
る）、または(ｅ) −ＮＨ−(ＣＨ2)m−Ｓ−（式中、ｍ
は１〜１２の整数である）の基であるスペーサーを有す
る（ａ）〜（ｄ）に定義した架橋員Ｌからの架橋員であ
り、そしてＸは、重合体または固体である〕の化合物で
ある。
【００１８】式IVにおける基“Ｌ−Ｘ”は、フェニル環
上の“ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−
位、好ましくはパラ−位にあることができる。“重合
体”なる用語は、例えばポリスチレン、ポリプロピレ
ン、ポリビニルクロライド、ラテックス、ポリサッカラ
イド、セファロース、蛋白質、脂質、シリケートまたは
核酸からなる群からの合成または天然の重合体を意味す
るものとして理解されるべきである。重合体は、場合に
よっては、これらが式Ｉの化合物に結合することができ
るために、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ2および−ＣＯ
−からなる群からの１個または２個以上の官能基を具備
していなければならない。式Ｉの化合物を固体に結合す
る一般的方法は、例えばBI Application Handbook, Ed.
1994, Figure 4.1, (Merk AB, Uppsala Sweden）に記
載されている。“固体”なる用語は、微粒子であること
ができるまたは管、ビーズまたはミクロタイタープレー
トのような幾何学的態様で存在することのできる不溶性
物体を示す。
【００１９】式IVの好ましい化合物は、式Ｉの化合物が
固体または重合体に結合される場合の化合物である。式
IVの特に好ましい化合物は、５−メチルイソオキサゾー
ル−４−カルボン酸（４−（２−ブロモアセチルアミ
ノ）フェニル）アミドまたは２−シアノ−３−ヒドロキ
シブト−２−エンカルボン酸（４−（２−ブロモアセチ
ルアミノ）フェニル）アミドのような式Ｉの化合物が固
体または重合体に結合される場合の化合物である。式IV
の化合物は、また、細胞抽出液、血清、血液または滑液
からの特異的−結合蛋白質の発見に対して、蛋白質の精
製に対して、ミクロタイタープレートの変性に対してま
たはクロマトグラフィー物質、特にアフィニティークロ
マトグラフィー物質の製造に対して適している。精製に
適した蛋白質は、重合体または固体に結合した式Ｉの化
合物と直接相互作用する。化合物は、また診断に使用す
るのに適している。式IVの化合物の場合において特に適
した固体は、(R)ＢＩＡコアー ＣＭ５チップまたはクロ
マトグラフィー検査または分離に対する固定相そしてま
たミクロタイタープレートである。
【００２０】実施例１ ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−
（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド 工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸（４−アミノフェニル）アミド ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸１０.１
ｇ（０.０８モル）およびｐ−フェニレンジアミン８.６
５ｇ（０.０８モル）を、テトラヒドロフラン３００ml
に溶解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.
０５ｇ（０.０８８モル）を加える。５時間後に、沈降
した沈殿を、吸引濾去し、有機相を濃縮しそして生成物
を、１％の氷酢酸を添加した酢酸エチル／石油エーテル
を使用してシリカゲル上でクロマトグラフィー処理しそ
してそれから、酢酸エチル／石油エーテルから結晶化す
る。収量：融点１２３℃〜１２８℃の酢酸塩６.８ｇ。 工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミ
ド 工程(ａ)からの生成物２.１７ｇ（０.０１モル）を、は
じめに、Ｎ−エチルモルホリン１.９ｇ（０.０１６モ
ル）と一緒に、テトラヒドロフラン５０mlに導入しそし
て、氷浴中において、臭化ブロモアセチル２.４ｇ（０.
０１２モル）の溶液を滴加しそしてそれから、混合物を
さらに、室温で５時間撹拌する。水５mlの添加後、それ
を１Ｎ ＨＣｌを使用してpH２に酸性化し、生成物を酢
酸エチルで抽出しそして有機相を水で洗浄し、乾燥しそ
して濃縮する。生成物を、酢酸エチル／石油エーテルか
ら結晶化する。収量：２.０ｇ。融点１７９℃。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 4.05(s, 2H), 7.5-7.
75(m, 4H), 9.1(s, 1H),10.1および10.45(それぞれの場
合においてsb, 1H)。
【００２１】実施例２ ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸
（４−（２−ブロモアセチルアミノ）フェニル）アミド 実施例１からの生成物０.５ｇ（０.００１５モル）を、
テトラヒドロフラン１０mlに溶解しそして１Ｎ水性Ｎａ
ＯＨ ２mlを、氷冷下で加える。反応をＴＬＣにより監
視しそして完了後（約６０〜９０分後）に、生成物を１
Ｎ水性塩酸２.２５mlによる酸性化および水１００mlの
添加によって、沈殿させ、濾過し、撹拌しながら水で洗
浄し、それから小量の酢酸エチルで洗浄しそして減圧下
で乾燥する。収量：０.２８ｇ。融点２１０℃より高
い。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.28(s, 3H), 4.04(s, 2H), 7.4-
7.7(m, 4H), 8.5-10(sb,1H), 10.4(sb, 2H)。
【００２２】実施例３ ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−
（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド塩酸塩 工程(ａ) ２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチル
アミノ−ｐ−フェニレンジアミン ｐ−フェニレンジアミン８.６５ｇ（０.０８モル）を、
Ｎ−Ｂｏｃ−グリシン１５.３ｇ（０.０８８モル）と一
緒に無水のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）３００mlに溶
解しそしてジシクロヘキシルカルボジイミド１８.０５
ｇ（０.０８８ｇモル）を小量ずつ加える。５時間後
に、沈降した沈殿を吸引濾去し、濾液を濃縮しそして生
成物を、酢酸エチル／メタノール／酢酸を使用してシリ
カゲル上でクロマトグラフィー処理することにより精製
しそしてそれから酢酸エチル／石油エーテルから結晶化
する。収量１３.５ｇ。融点１４４℃。 工程(ｂ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボニ
ルクロライド はじめに、５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸１２７.１ｇ（１.０モル）を、トルエン１Ｌに導入
し、塩化チオニル１２９.８ｇ（１.１モル）を滴加しそ
してそれから、混合物を８０℃で６時間加熱する。容量
を減圧下で約１／２に濃縮しそしてトルエン溶液を、さ
らに反応のために直接使用する。 工程(ｃ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸（４−（２−第３ブトキシカルボニルアミノアセチル
アミノ）フェニル）アミド はじめに、工程(ａ)からの生成物１３.５ｇ（０.０５モ
ル）を、Ｎ−エチルモルホリン７.６ml（０.０６モル）
と一緒に、ＴＨＦ １００mlに導入しそして工程(ｂ)か
らの溶液３０ml（０.０６モルに相当する）を０℃で滴
加する。混合物を室温でさらに５時間撹拌し、水性クエ
ン酸で加水分解しそして生成物を酢酸エチルで抽出し、
水で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥しそして減圧下で
濃縮する。収量：１２ｇ。融点１３９℃。 工程(ｄ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミ
ド塩酸塩 工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モル）を、ジク
ロロメタン１８０mlに溶解しそしてトリフルオロ酢酸１
８mlを加える。混合物を室温で１時間撹拌しそして濃縮
しそして生成物をエタノールに溶解し、過剰のエタノー
ル性ＨＣｌを加え、濃縮しそして残留物を酢酸エチルと
一緒に撹拌することにより洗浄することによって、塩酸
塩に変換する。収量：２.５ｇ。融点２１０℃。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.7(s, 3H), 3.7-3.9(m, 2H), 7.6
および7.72(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 8.
25(sb, 2H), 9.3, 10.2および10.75(それぞれの場合に
おいてs, 1H)。
【００２３】実施例４ ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸
（４−（２−アミノアセチルアミノ）フェニル）アミド
トリフルオロ酢酸塩 実施例３の工程(ｃ)からの生成物６ｇ（０.０１７モ
ル）を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液２０ml／エタノール
２mlに溶解しそして混合物を、室温で開環が完了するま
で（約３時間）撹拌する。水性クエン酸で酸性にするこ
とによって、Ｂｏｃ−保護された生成物を固体の形態で
得そして吸引濾過しそして乾燥する（融点１８９℃。収
量５.５ｇ）。この中間体生成物５ｇを、実施例３(ｄ)
と同様にしてジクロロメタン中においてトリフルオロ酢
酸で処理しそして生成物を、酢酸エチルおよび石油エー
テルを使用してトリフルオロ酢酸塩としてエタノールか
ら結晶化する。収量：５.０ｇ。融点２０９℃。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.15(s, 3H), 3.7-3.85(m, 2H),
7.49(s, 4H), 8.1(sb, 3H), 10.3および11.2(それぞれ
の場合においてsb, 1H)。
【００２４】実施例５ ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸
（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド 工程(ａ) ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン
酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）アミド ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒ
ドロキシフェニル）アミド６.５ｇ（０.０３モル）を、
１,３−ジヨードプロン５７ml（０.５モル）に溶解しそ
して細かに粉砕された炭酸カリウム２６.２ｇ（０.１９
モル）をはげしい撹拌下で加える。反応は約４時間後に
完了する。濾過、濃縮および１％の氷酢酸を添加した酢
酸エチル／石油エーテル（１：１）を使用したシリカゲ
ル上のクロマトグラフィー処理によって処理を実施す
る。収量：６.７ｇ。 工程(ｂ) ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エン
カルボン酸（４−（３−ヨードプロポキシ）フェニル）
アミド 工程(ａ)からの生成物５.５ｇを、約１Ｎのメタノール
性アンモニア溶液２００ml中で、開環が完了するまで処
理し、混合物を濃縮し、残留物を稀酢酸にとりそして１
％の氷酢酸を加えた酢酸エチル／石油エーテルを使用し
てクロマトグラフィー処理し、それから酢酸エチル／石
油エーテルから結晶化する。収量：２.３ｇ。融点１４
９℃。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.1-2.4 2.3ppmで(m, 2Hおよびs,
3H), 3.4および4.02(それぞれの場合においてt, 2H),
6.92および7.42(それぞれの場合において2H, AA′B
B′), 7.2-8.5(ssb, 1H), 10.2(s, 1H)。
【００２５】実施例６ ２−シアノ−３−ヒドロキシブタ−２−エンカルボン酸
（４−アリルオキシフェニル）アミド ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−ヒ
ドロキシフェニル）アミド１.５ｇ（０.００６８モル）
を、アセトンに溶解し、臭化アリル５.８ml（０.０６８
モル）およびはげしい撹拌下で細かに粉砕された炭酸カ
リウム９.３ｇ（０.０６８モル）を加え、それから混合
物を室温で一夜撹拌する。それを濾過し、濾液を濃縮し
そして残留物を水にとりそして酢酸エチル／石油エーテ
ルから再結晶する。収量：０.８ｇ。融点１６２℃〜１
６４℃。1 H-NMR（DMSO-d6）：2.3(s, 3H), 4.45-4.63(m, 2H),
5.15-5.38(m, 2H), 5.9-6.2(m, 1H), 6.95および7.42
(それぞれの場合において2H, AA′BB′), 10.0(sb,1H),
12.5-14.5(ssb, 1H)。
【００２６】薬理学的試験 試験管内増殖における細胞培養を、式Ｉの化合物に対す
る活性度試験として使用する。 実施例７ 増殖試験 １０Ｌ用の粉末形態のＬ−グルタミンを含有しそしてＮ
ａＨＣＯ3を含有していないClicks／ＲＰＭＩ １６４０
培地（５０：５０）（Seromed, Biochrom, Berlin, FR
G）を、二重−蒸溜水９Ｌに溶解しそしてそれぞれのび
んが９００mlを含有するように、びん中に滅菌−濾過す
る。 洗浄培地 基培地９００mlを、７.５％の強度の炭酸水素ナトリウ
ム溶液９.５mlおよびＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）（Gibc
o, Eggenstein, FRG）５mlで緩衝化する。 使用培地 基培地９００ml＋ＮａＨＣＯ3溶液（７.５％；ＨＥＰＥ
Ｓ溶液１０mlおよびＬ−グルタミン溶液（２００mM）１
０ml）。
【００２７】マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対して
使用された培地は、１％の加熱−不活性化（３０分、５
６℃）したウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で強化された使用培
地である。 腫瘍細胞培地 腫瘍細胞およびハイブリドーマ細胞を保持するために、
５％のＦＣＳを含有する使用培地を製造する。 細胞系に対する培養培地 細胞系を保持するために、１０％のＦＣＳを含有する使
用培地９００ml、ＮＥＡ（非必須アミノ酸）溶液（Gibc
o）１０ml、ピルビン酸ナトリウム溶液（１００mM、Gib
co）１０mlおよび１０-2Ｍのメルカプトエタノール５ml
を混合する。 マイトジエン−誘発リンパ球増殖に対する脾臓細胞の獲
得および処理 マウスを、頸部脱臼によって殺しそして脾臓を滅菌条件
下で取り出す。脾臓は、８０メッシュのメッシュ幅を有
する滅菌ふるい上で切裂きそしてプラスチック注射器
（１０ml）のプランジャを使用して、注意深く使用培地
を含有するペトリ皿に排出する。脾臓細胞懸濁液から赤
血球を除去するために、混合物を低張０.１７Ｍ塩化ア
ンモニウム溶液中で時折振盪しながら室温で約１分培養
する。赤血球はこの過程において溶解するが、リンパ球
の生命力および反応性は影響されない。遠心分離（７分
／３４０ｇ）後、溶解産物を捨てそして細胞を２回洗浄
しそしてそれからそれぞれの試験培地にとる。 マイトジエン−誘発リンパ球増殖 雌のＮＭＲＩマウスからの５×１０5の処理した脾臓細
胞を、種々なマイトジエンおよび調製物（式Ｉの化合
物）と一緒に、平底ミクロタイタープレート中の１個の
穴当り２００μlの試験培地にピペットで導入する。次
のマイトジエンおよび調製物濃度を使用する。 コンカナバリンＡ〔Serva〕： 0.5-0.25-0.
12 μg／ml リポポリサッカライド〔Calbiochem〕： 1.0-0.5-0.1
μg／ml フィトヘマグルチニン〔Gibco〕： 0.5-0.25-0.
12％ 原液 アメリカヤマゴボウ(pokeweed)マイトジエン〔Gibco〕
化合物１または２:50、25、10、7.5、5、2.5、1、0.5、
0.1 μモル
【００２８】正のコントロールは、マイトジエンを添加
しそして調製物を使用しないグループとして定義され
る。負のコントロールは、調製物を使用しそしてマイト
ジエンを添加しない培地における細胞である。それぞれ
のマイトジエン濃度は、すべての調製物濃度を使用して
４回試験した。３７℃／５％ ＣＯ2で４８時間培養した
後、０.２５μＣ／穴（９.２５×１０3Ｂｑ）の活性を
有する２５μl／穴のトリチウム−チミジン（Amersha
m）を細胞に加える。さらに、１６時間の同じ条件下に
おける培養を行なう。試験バッチを評価するために、細
胞を細胞収穫器（FlowLaboratories）によって濾紙上に
収穫する。取り込まれないチミジンは、別の廃棄びん中
に集める。濾紙を乾燥し、パンチアウトしそしてシンチ
レーター（Rotiszint 22, Roth）２mlと一緒にシンチレ
ーション容器に加え、それからこれをさらに２時間４℃
に冷却する。細胞により取り込まれた放射能をβ−計数
装置（Packard, Tricarb-460C）中で測定する。 増殖試験に対する腫瘍細胞および細胞系の製造 試験に使用した腫瘍細胞または細胞系は、対数増殖期の
原溶液からとり、洗浄培地で２回洗浄しそして適当な培
地に懸濁した。 増殖試験の実施および評価 増殖試験は、丸底ミクロタイタープレートにおいて実施
した。式Ｉの化合物およびインターロイキンを、それぞ
れ５０μl／穴の適当な培地に溶解しそして２００μl／
穴の最終容量が得られるようにして細胞数計測（５×１
０5）を１００μl／穴で調節する。すべての試験におい
て値は４回測定する。調製物を使用せずそして生長因子
を使用しない細胞は負のコントロールとして定義され
る。そして調製物を使用せずそして生長因子を使用した
細胞は、正のコントロールに対する値を与える。負のコ
ントロールの値を測定したすべての値から引きそして正
のコントロール−負のコントロールの差を１００％とす
る。
【００２９】ミクロタイタープレートを３７℃／５％
ＣＯ2で７２時間培養しそして増殖率を、マイトジエン
−誘発リンパ球増殖におけるように測定する。細胞系
は、菌株収集機関であるアメリカンタイプカルチャーコ
レクション（ＡＴＣＣ）から得た。表１は、５０％の阻
止が起こる濃度を示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】実施例８(R) BIAcore CM5 マトリックスに対して実施例２による
化合物を結合する方法出発物質は、カルボキシメチルデ
キストラン界面を有するPharmacia BiosensorからのＣ
Ｍ５チップである。カップリング工程は、すべて５μl
／分の流速で実施する。工程はすべて、ランニング緩衝
液としてpH７.４のヘペス緩衝食塩水（ＨＢＳ）を使用
して、２５℃で実施する。 第１工程：チップ表面を活性化するための０.０５Ｍ Ｎ
ＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）および０.２Ｍ
ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ′−（ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド）の１：１混合物。 第２工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中
の４０mMのシスタミンジ塩酸塩溶液３５μl。 第３工程：占有されていないマトリックス構造を飽和す
るためのpH８.５のエタノールアミン塩酸塩３５μl。 第４工程：pH８.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中
の０.１Ｍ ジチオスレイトール３５μl。 第５工程：pH７.５の０.１Ｍ 硼酸ナトリウム緩衝液中
の実施例２による化合物（１０mg／ml）を含有する溶液
３５μl。
【００３２】実施例９ 分析に対して使用したBIAcore法 分析は、実質的にCurrent Biology（Vol. ３，No. 12,
1993, 913-915頁）に記載されているようにして実施し
た。 システム：相当するソフトウエアーを有する(R)BIAcore
2000（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden） チップ：CM5 センサーチップ（Pharmacia Biosensor A
B）、 コーティング：実施例８による ランニング（Running） 緩衝液：HBS緩衝液、BIA保証された（Pharmacia Biosen
sor AB） 流速：１０μl／分 注入：分析される試料５０μl当り５分の会合段階 リンシング（Rinsing） 時間：１８０秒３分の解離段階 再生：０.０５％のドデシル硫酸ナトリウムを使用して
２×１５秒 Ａ．種々な血清アルブミンの結合型 共鳴単位 牛 ５０ ヒト ２９４ ラット １０６１ マウス １５１ ニワトリ ８ ロバ ４８０ 羊 ３３１ “共鳴単位（Resonance Units）”なる用語は、結合し
た蛋白質に比例する定量的単位である。 Ｂ．種々なデヒドロゲナーゼの結合 酵 素 共鳴単位 グリセルアルデヒドリン酸 ＤＨ（２５nM） ６９ グリセルアルデヒドリン酸 ＤＨ（５０nM） １４８ グリセルアルデヒドリン酸 ＤＨ（１００nM） ２９７ グリセルアルデヒドリン酸 ＤＨ（２５０nM） ６０３ ジヒドロオロト酸 ＤＨ（５０nM） ２０３ ジヒドロオロト酸 ＤＨ（１００nM） ４２５ ジヒドロオロト酸 ＤＨ（２５０nM） １０６４ ピルビン酸キナーゼ（５０nM） ８５ ピルビン酸キナーゼ（１００nM） １８９ ピルビン酸キナーゼ（２５０nM） ５０５ ＤＨは、酵素呼称デヒドロゲナーゼを示す。
【００３３】調査したデヒドロゲナーゼの相対的結合強
度を、定義された蛋白質濃度において、相互に比較し
た。１μＭの蛋白質濃度において、ジヒドロオロト酸Ｄ
Ｈの結合がもっとも強く、次いで乳酸ＤＨ、グリセルア
ルデヒドリン酸ＤＨおよびピルビン酸キナーゼがそれに
つづく。
【００３４】実施例１０ アフィニティークロマトグラフィー 式Ｉによる化合物をその反応性臭素基を経て支持マトリ
ックスに結合させる。使用した支持物質は、Fractogel
(R) EMD-SH（Merck KGaA, Darmstadt）である。DE 43 1
0 964に記載されているような標準プロトコールによっ
て、共有結合を実施する。得られたゲルを、Superforma
nce(R)（１cm×５cm）カラム（Merck KGaA）に充填しそ
して高速液体クロマトグラフィー装置に接続する。 可溶性細胞蛋白質の取得 菌株ＲＡＷ ２６４.７（ＡＴＣＣ菌株収集）を、全面生
長に達するまで４８時間培養しそして冷たい４℃のＰＢ
Ｓ緩衝液で３回洗浄して培地を除去しそして細胞をＰＢ
Ｓ緩衝液に移しそして２００ｇで１０分遠心分離する。
細胞処理は４℃で実施する。細胞ペレットを２０mMトリ
ス塩基、２mM ＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏおよび１mMジチオス
レイトール（ＤＴＴ）からなる緩衝液Ａに再懸濁する。
細胞−内因性プロテアーゼによる蛋白質分解を阻止する
ために、種々なプロテアーゼ阻害剤の混合物を加える。
それから混合物を、ガラスポッター中で均質化する。そ
れから懸濁液を、４℃で２２,０００ｇで３０分遠心分
離して可溶性蛋白質を得る。
【００３５】上澄液は直ちにアフィニティークロマトグ
ラフィーに対して再使用する。上澄液の一部を参照とし
て保持しそして残りの部分をアフィニティーカラムにポ
ンプ注入する。 ＨＰＬＣ イタリーのミラノのKontron Instrumentsからの装置
を、アフィニティークロマトグラフィーに対して使用す
る。このシステムは、Autosampler ４６５、ＨＰＬＣポ
ンプ４２２および４２２Ｓ、高−圧混合バルブＭ８０
０、Bestaモーターバルブおよびダイオードアレイ検出
器４４０からなる。データ記録および分析は、Data Sys
tem 450-MT2／DAD系を使用して実施する。細胞上澄液
は、水で３０mlの容量にうすめそして１ml／分の流速で
注入する。クロマトグラフィーの完了まで、フラクショ
ンとして漏出液を集めそして４℃で貯蔵する。
【００３６】次の緩衝液を、蛋白質のグラジエント溶離
に使用する： ＰＢＳ緩衝液の組成： ＮａＣｌ ８.００ｇ／Ｌ ＫＣｌ ０.２０ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０.２０ｇ／Ｌ Ｎａ2ＨＰＯ4×７Ｈ2Ｏ ２.１６ｇ／Ｌ
【００３７】表２において使用した緩衝液の組成： 緩衝液： 組成： １ PBS ２ PBS＋0.5Ｍ NaCl ３ PBS＋150mM A771726b(Ｎ−(４−トリフルオロメチルフェニル)− ２−シアノ−３−ヒドロキシクロトンアミドのナトリウム塩) ４ H2O ５ ６Ｍ尿素 ６ 60％のアセトニトリル＋0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA） 蛋白質溶液を注入した後、表２によるグラジエントを、
３ml／分の流速で開始する。
【００３８】
【表２】 フラクションを集め、４℃でＨ2Ｏに対して４８時間透
析し（使用した透析膜の排除限界６０００−８０００D
a）（アセトニトリルフラクションを除く）そしてそれ
から凍結乾燥する。
【００３９】蛋白質測定 凍結乾燥後、蛋白質を１％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）１mlに溶解しそして水で０.５％ＳＤＳにうすめ
る。この溶液のアリコートをとりそしてＢＣＡ試験（Pi
erce）を使用する蛋白質測定に使用する。蛋白質を蒸発
し（UNIVASPO 150H, UniEquip Power Heater, Martinsr
ied, Germany）そしてそれから、スクロース１０ｇ、
０.２５Ｍトリス／１Ｍグリシン溶液９ml、１０％ＳＤ
Ｓ ７.８ml、ブロモフェノールブルー（０.１％）２.５
ml、β−メルカプトエタノール４mlおよび水１.７mlか
らなる適当な容量の試料緩衝液にとる。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥ １０〜１７％のポリアクリルアミド勾配を有するＳＤＳ
ゲルを製造するために、次の溶液を製造する。
【表３】 重合は、１０％ＡＰＳ １００μlおよびＴＥＭＥＤ １
２.５μlの添加によって開始する。捕集ゲルは、アクリ
ルアミド（１０％、０.５％）３ml、水１.３６ml、０.
５Ｍ トリス（pH６.８）１.４５ml、１０％ＳＤＳ ６０
μl、１０％ＡＰＳ １０６μlおよびＴＥＭＥＤ ９μl
から製造する。分析用のゲルを製造するために、分取ゲ
ル１００μｇに対して、トラック当り蛋白質１０μｇを
負荷する。分子量の測定は、蛋白質標準混合物と比較す
ることによって実施する。
【００４０】配列決定 分析用ゲル中の濃縮された蛋白質のバンドを示す蛋白質
フラクションを、分取規模で分離しそして分離した蛋白
質を、ＰＶＤＦ膜（Millipore）上にブロットすること
によって固定化する。蛋白質をクマシーで染色すること
によって可視化しそしてそれから直接エドマン分解にう
けしめる。クマシー染色ゲルに対する電気泳動後に、Ｎ
−末端がブロックされた蛋白質を注意深く切り離しそし
て水で中性になるまで洗浄する。ゲルの小片を、一方の
ふるいが他方のふるいの背後に横たわっておりそして１
００μｍおよび３２μｍのメッシュ幅を有する２枚のス
チールふるいにより圧縮して均質化する。軟こう−様の
物質を、UNIVAPO 150（UniEquip Power Heater, Martin
sried, Germany）中で低残留湿気まで乾燥する。このよ
うにして得られた蛋白質を、pH８.５の２５mMトリスＨ
Ｃｌおよび１mM ＥＤＴＡからなる緩衝液中で、酵素エ
ンドプロティナーゼ LysdC（Boehringer, Mannheim）
（酵素対蛋白質の比約１：１０）を使用して３７℃で７
時間インキュベートすることによってペプチドに開裂す
る。
【００４１】得られたペプチドを、６０％アセトニトリ
ル、０.１％ＴＦＡのそれぞれ１mlを使用して３７℃で
４時間２回溶離する。合した溶離液をＵＮＩＶＡＰＯ中
で蒸発しそして得られたペプチドを、逆相クロマトグラ
フィーによって分離する。クロマトグラフィーは、Ａ：
Ｈ2Ｏ中の０.１％のＴＦＡ〜Ｂ：アセトニトリル中の
０.１％のＴＦＡの線状勾配（１％／分）を使用して、L
iChroCART(R)125-2 Superspher(R)60カラム上で７０分
実施する。
【００４２】精製されたペプチドのアミノ酸配列は、４
７７Ａガス−相セクエンサー（Applied Biosystems）上
でエドマン分解原理によって実施する。ＰＴＨ−ＡＡの
確認は、２６９nmで１２０Ａフェニルチオヒダントイン
アミノ酸アナライザー（Applied Biosystems）上で実施
した。 ウエスターンブロット分析 蛋白質をＳＤＳゲルからＰＶＤＦ膜（Millipore）に移
した後に、未被覆面積を、pH７.４の５Ｌ中のＮａＣｌ
４５ｇ、トリス塩基３０.３ｇからなるＴＢＳ中の２.５
％ニワトリアルブミン（Sigma）を使用して、２時間培
養することによってブロックする。第１の抗体を、ブロ
ッキング緩衝液で適当な比においてうすめそして１時間
培養する。それからブロットを、ＴＢＳおよび０.１％
トゥイーン２０で５分間３回洗浄しそして第２のＰＯＤ
−標識抗体を使用して１時間培養する。洗浄方法を反復
しそして結合した抗体を、４−クロロ−１−ナフトール
６０mg、メタノール２０ml、ＴＢＳ １００mlおよび過
酸化水素（３０％）２００μlの溶液によって可視化す
る。
【００４３】ＮａＣｌ（３）およびＡ７７１７２６ｂ
（５）（表２参照）において得られた蛋白質を７〜１４
個のアミノ酸−長ペプチドによって確認することは可能
であった。２２kDa蛋白質の場合において、測定された
アミノ酸配列は、２つの蛋白質ＭＳＰ２３およびＮＫＥ
Ｆ−Ａにアサインすることができた。これに対する理由
は、９３％の２つの蛋白質の高い配列ホモロジーにあ
る。アフィニテークロマトグラフィーの塩基配列決定結
果の表３に要約する通りである。
【００４４】
【表４】 表２によるフラクション番号は、フラクションカラムの
（）内である。
【００４５】確認された蛋白質の説明 フラクション（３）において濃縮された１８kDa蛋白質
は、シクロフィリンＡとして確認された。シクロフィリ
ンＡは、多数の免疫抑制化合物、例えばシクロスポリン
Ａの作用の機構に関与するペプチジルプロピル シス／
トランス イソメラーゼの大きなファミリーに属する。
乳酸へのピルビン酸の反応を接触する嫌気性解糖の酵素
である乳酸デヒドロゲナーゼが、さらにフラクション
（３）において確認された。乳酸デヒドロゲナーゼは、
少なくとも５種の異なるイソ酵素の形態で動物組織中に
存在する。骨格筋に存在するイソ酵素は４つのＡ鎖を含
有しており、心臓においては４つのＢ鎖が支配的であ
る。本件の場合においては、乳酸デヒドロゲナーゼのＡ
鎖からのペプチドが確認された。熱ショック蛋白質ファ
ミリーに属する２種の蛋白質がフラクション（５）にお
いて確認された。真核生物において支配的である熱ショ
ック蛋白質ＨＳＰ７０は、多重遺伝子ファミリーの１員
である。
【００４６】熱ショック蛋白質ＨＳＰ９０は、普通の状
態下においてさえも本質的に発現するサイトゾル蛋白質
である。それは、相互に８６％の塩基配列ホモロジーを
有する２種の分離した遺伝子生成物ＨＳＰ８４およびＨ
ＳＰ８６からなる。ＨＳＰ９０については、それがステ
ロイドホルモン受容体と複合体を形成しそしてこの方法
において、ある遺伝子の転写に介入することが知られて
いる。
【００４７】フラクション（５）においては、さらにグ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡ
ＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼＭ2およびホスホグリセ
レートムターゼの解糖の３種の蛋白質が見出された。こ
れらの３種の酵素は、低段階の解糖から誘導されそして
多酵素複合体において自然の状態下で存在する。
【００４８】またフラクション（５）における非常に強
く濃縮されたバンドは、延長因子（ＥＦ−１α）として
確認された。ＥＦ−１αは、重要な真核翻訳因子であ
る。それはその機能において真核延長因子ＥＦ−Ｔｕに
匹敵しそしてＧＴＰ−依存性方法における蛋白質生合成
中、アミノアシル−ｔＲＮＡをサイトゾルからリボソー
ム上の受容体部位に転移する。さらに、フラクション
（５）において、アクチンを検出することができる。ア
クチンは殆んどすべての場所において存在しそして真核
生成において大量に存在する蛋白質である。それは筋系
および細胞骨格の主要な成分である。アクチン多重遺伝
子ファミリーは、少なくとも４種の筋肉アクチン形態そ
してまた、２種の細胞形質アクチン形態（β−およびγ
−アクチン）をコードする。ここにおいて存在するアク
チンは、細胞形質アクチン形態のγ−鎖である。クエン
酸サイクルのおよびリンゴ酸−アスパラギン酸シャトル
の酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼもまた確認され
た。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、動物組織中におい
て、サイトゾルおよびミトコンドリア異種形態で存在す
る。これらの両方のイソ酵素は、アスパラギン酸アミノ
トランスフェラーゼと協力して、サイトゾルとミトコン
ドリウムの間のリンゴ酸−アスパラギン酸シャトルにお
いて重要な役割を果たす。
【００４９】フラクション（５）の２２kDa蛋白質は、
塩基配列したペプチドフラグメントを基にして２種の蛋
白質：骨芽細胞−特異的因子３（ＯＳＦ−３）としても
知られているマクロファージ２３kDaストレス蛋白質
（ＭＳＰ２３）および“ナチュラルキラー細胞強化因子
−Ａ”（ＮＫＥＦ−Ａ）にアサインされる。活性化マク
ロファージは、Ｈ2Ｏ2およびＯ2のような反応性酸素化
合物を産生する。これらは、それ自体この酸化性ストレ
スに抵抗するので、これらはこれら自体をこれらの反応
性化合物から保護することのできる防御系を有していな
ければならない。ＮＫＥＦは、ナチュラルキラー細胞の
活性を増加するヒトの赤血球からのサイトゾル蛋白質で
ある。これらは、リンパ球でありそしてサイトキン刺激
後、多数の腫瘍細胞を認識しそして破壊することができ
る。“ナチュラルキラー細胞強化因子”は、４４kDaの
分子量を有しそして相互に８８％の良好な塩基配列ホモ
ロジーを有している等しい大きさの２種のサブユニット
（ＮＫＥＦ−ＡおよびＮＫＥＦ−Ｂ）からなる。
【００５０】実施例１１ 刺激されない、ＬＰＳ−刺激されたおよびＬＰＳ−刺激
され、レフルノミド−処理されたＲＡＷ２６４.７サイ
トゾル抽出液の比較アフィニティークロマトグラフィー リポポリサッカライドによるマクロファージ細胞系ＲＡ
Ｗ２６４.７の刺激は、炎症プロセスに対する試験管モ
デルとして使用した。リポポリサッカライド（ＬＰＳ）
は、グラム−陰性細菌の外部膜の必須の構造的成分であ
りそしてそれ自体、殆どすべての有機体の免疫細胞によ
って認識される。特にマクロファージは、ＴＮＦ−α、
ＩＬ−１およびＩＬ−６のような多数のサイトキンを合
成するためにＬＰＳ−刺激によって活性化される。この
刺激に付随する蛋白質パターンの可能な変化は、免疫調
節化合物レフルノミドの同時的投与によって阻止しなけ
ればならない。ＲＡＷ２６４.７細胞を、培地１ml当り
ＬＰＳ １０ngを使用して２４時間培養した。ＬＰＳ−
刺激され、レフルノミド−処理された細胞の場合におい
ては培養は、同時に６０μＭのＡ７７１７２６Ｂを使用
して２４時間実施した。細胞を処理しそしてサイトゾル
抽出液を、実施例１０により誘導されたFractogel(R)カ
ラムの助けによって調査した。それからこれらの３種の
バッチの化合物フラクションを分析グラジエントゲルに
適用しそして相互に比較した。すでにリンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼとして塩基配列により確認された３５kDa付近
のバンドにおける増加が、特に明らかに明示される。Ｌ
ＰＳおよびＡ７７１７２６Ｂを使用した培養によって、
強度が弱い傾向にある他の蛋白質と比較して、これらの
バンドの強度は著しく増加される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ Ｄ 30/88 30/88 Ｊ

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉ 【化１】 の化合物および（または）式Ｉの化合物の生理学的に許
    容し得る塩および（または）式Ｉの任意の立体異性形態
    の化合物。上記式においてＲ1は、式IIまたはIII 【化２】 の基であり、そしてＲ2は、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−Ｃ
    Ｈ＝ＣＨ2（式中、ｎは整数１、２または３である）、 (ｂ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式中、ｍは
    整数１、２または３でありそしてハロゲンは弗素、塩
    素、臭素または沃素である） (ｃ) 式Ｖ 【化３】 （式中、Ｒ3は、（１）ハロゲンまたは（２）ＮＨ2であ
    り、そしてＲ4は、（１）水素原子または（２）アミノ
    酸の基である）の基、または (ｄ) −ＮＨ2である。
  2. 【請求項２】 Ｒ1が、式IIまたはIIIの基であり、そし
    てＲ2が、(ａ) −Ｏ−(ＣＨ2)m−ＣＨ2−ハロゲン（式
    中、ｍは整数２であり、そしてハロゲンは臭素または沃
    素である）、 (ｂ) −Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2または(ｃ) −ＮＨ−
    Ｃ(Ｏ)−ＣＨ(Ｒ3)(Ｒ4)（式中、Ｒ3は臭素、−ＮＨ2ま
    たは塩素でありそしてＲ4は水素原子である）である請
    求項１記載の式Ｉの化合物。
  3. 【請求項３】 式Ｉにおける基Ｒ2が、フェニル環上の
    “ＮＨ”基に関してメタ−、オルト−またはパラ−位、
    好ましくはパラ−位にある請求項１または２記載の式Ｉ
    の化合物。
  4. 【請求項４】 ２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−
    エンカルボン酸（４−アリルオキシフェニル）アミド、 ２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸
    （４−（３−ヨードプロポキシ）−フェニル）アミド、 ２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸
    （４−（２−アミノアセチルアミノ）−フェニル）アミ
    ドトリフルオロ酢酸塩、 ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−
    （２−アミノアセチルアミノ）−フェニル）アミド塩基
    塩、 ２−シアノ−３−ヒドロキシブト−２−エンカルボン酸
    （４−（２−ブロモアセチルアミノ）−フェニル）アミ
    ド、または ５−メチルイソオキサゾール−４−カルボン酸（４−
    （２−ブロモアセチルアミノ）−フェニル）アミドであ
    る請求項１記載の式Ｉの化合物。
  5. 【請求項５】(ａ) 式VI 【化４】 （式中、Ｒ6は、基ＯＨ、ＣｌまたはＢｒである）の化
    合物を、式VII 【化５】 （式中、Ｒ7は(１) −ＮＨ2、(２) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−
    ＣＨ2−ＮＨ−保護基（式中、保護基は、アミン保護
    基、特にＢｏｃである）、(３) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ
    2−ハロゲン、または(４) −ＯＨである）の化合物と
    反応させて、Ｒ1が式IIの基でありそしてＲ2が、−ＮＨ
    2、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ＮＨ−保護基、−ＯＨまた
    は−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ2−ハロゲンである式Ｉの化合
    物を得、または (ｂ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された
    化合物を、アルキルハライドまたはジハロアルカン（ア
    ルキル部分は２、３または４個の炭素原子を有す）と反
    応させて式Ｉの相当する化合物を得、または (ｃ) Ｒ7が−ＯＨである方法（ａ）により製造された
    化合物を、不飽和アルキルハライド（アルキル部分は
    ３、４または５個の炭素原子を有す）と反応させて式Ｉ
    の相当する化合物を得、または (ｄ) Ｒ7が−ＮＨ2である方法（ａ）により製造された
    化合物を、臭化ブロモアセチルのようなカルボン酸ハラ
    イドと反応させて、Ｒ2が式Ｖの基であり、Ｒ3がハロゲ
    ンでありそしてＲ4が水素原子である式Ｉの化合物を
    得、または (ｅ) ｐ−フェニレンジアミンのような芳香族ジアミン
    をアミノ基が保護されたアミノ酸と反応させてＲ7が式
    Ｖの基であり、Ｒ3が−ＮＨ2でありそしてＲ4が保護さ
    れたアミノ酸である式VIIの化合物を得、そしてそれか
    ら方法（ａ）におけるように反応させて式Ｉの相当する
    化合物を得、または (ｆ) 方法（ａ）または（ｅ）により製造された式Ｉの
    化合物における保護基を除去し、または (ｇ) Ｒ1が式IIの基である方法（ａ）〜（ｆ）により
    製造された式Ｉの化合物をＲ1が式IIIの基である式Ｉの
    化合物に変換し、または (ｈ) 方法（ａ）〜（ｇ）により製造された式Ｉの化合
    物を遊離形態で単離するかまたは酸性または塩基性基が
    存在するときには、場合によってそれを生理学的に許容
    し得る塩に変換し、または (ｉ) その化学的構造のためにジアステレオ異性形態ま
    たはエナンチオマー形態で存在する方法（ａ）〜（ｈ）
    により製造された式Ｉの化合物を任意のキラル支持物質
    上のクロマトグラフィーによって純粋な立体異性体に分
    離しまたは塩形成することのできる式Ｉのラセミ化合物
    を、補助剤として光学的に活性な塩基または酸を使用し
    て形成されたジアステレオマー塩の分別結晶によって分
    離しまたはアミノ基のような塩基性基を含有する式Ｉの
    ラセミ化合物を、光学的に活性な酸、例えば（＋）−樟
    脳−１０−スルホン酸、Ｄ−およびＬ−酒石酸、Ｄ−お
    よびＬ−乳酸または（＋）−および（−）−マンデル酸
    を使用して純粋なエナンチオマーに変換することからな
    る請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉの化合物の製
    法。
  6. 【請求項６】 請求項１〜４の何れかの項記載の式Ｉの
    化合物および医薬的に許容し得る賦形剤からなる薬剤。
  7. 【請求項７】 癌性疾患、炎症または自己免疫疾患の治
    療用の薬剤を製造するための請求項１〜４の何れかの項
    記載の式Ｉの化合物の使用。
  8. 【請求項８】 式IV 【化６】 〔式中、Ｒ1は、式IIまたはIII 【化７】 の基であり、 Ｌは、 (ａ) −Ｏ−、 (ｂ) −ＮＲ5−（式中、Ｒ5は水素原子である）、 (ｃ) −Ｏ−(ＣＨ2)n−ＣＨ2−（式中、ｎは整数１、
    ２または３である）、 (ｄ) −ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ−(Ｒ4)(Ｒ3)（式中、Ｒ3
    は（ａ）共有結合または（ｂ）−ＮＨ−でありそしてＲ
    4は（ａ）水素原子または（ｂ）アミノ酸の基であ
    る）、または (ｅ) −ＮＨ−(ＣＨ2)m−Ｓ−（式中、ｍは１〜１２の
    整数である）の基であるスペーサーを有する（ａ）〜
    （ｄ）に定義した架橋員Ｌからの架橋員であり、そして
    Ｘは、重合体または固体である〕の化合物。
  9. 【請求項９】 細胞抽出液、血清、血液または滑液から
    の特異的−結合蛋白質の発見のための、蛋白質の精製の
    ための、ミクロタイタープレートの変性のためのまたは
    クロマトグラフィー物質、特にアフィニティークロマト
    グラフィー物質の製造のための請求項８記載の式IVの化
    合物の使用。
  10. 【請求項１０】 診断剤における請求項８記載の式IVの
    化合物の使用。
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