JP7633699B2 - Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１６年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３６３，８８８号明細書からの優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。上述のＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年７月１９日に作成され、０２８１９３－９２５０－ＷＯ００配列表．ｔｘｔと称し、サイズは４６，０５６バイトである。

政府の権利の陳述
本発明は、ＮＩＨおよびＡｒｍｙ／ＭＲＭＣによりそれぞれ授与された連邦政府補助金（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｇｒａｎｔ）番号：ＡＲ０６９０８５およびＭＤ１４００７１の下で政府の支援を受けて行なわれた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。

本開示は、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ １）由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）に基づくシステムおよびウイルス送達システムを使用する遺伝子発現の改変、遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野に関する。

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、ヒト細胞のゲノム修飾のために改変されており、そうしたものとして、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムがある。多種の微生物が、ＤＮＡ編集またはＲＮＡ編集システムを有することが明らかにされている。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９は、ゲノムＤＮＡにより平滑末端二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こし、これは、修復部位に小さな挿入および欠失（インデル）を残す非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはテンプレートの存在下の相同組換え修復によって修復される。これらのインデルを用いて、遺伝子をノックアウトする、スプライスアクセプターを除去する、または遺伝子調節エレメントを切断することができる。

遺伝する遺伝性疾患は、米国において子供に破壊的な影響を及ぼす。これらの疾患は現在、治療法がなく、症状を緩和する試みによってのみ管理され得る。数十年にわたり、遺伝子治療の分野では、この疾患の治療法が約束されている。しかしながら、治療用遺伝子の細胞および患者への安全且つ効率的な送達に関する技術的な障害により、このアプローチは制限されている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、機能するジストロフィンの喪失に起因して、筋肉疲労、歩行の喪失および典型的には生後３０年での死亡を臨床的な特徴とする致命的な遺伝性疾患である。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中での遺伝的なまたは自発的な変異な結果である。ＤＭＤを引き起こすほとんどの変異はエクソンの欠失の結果であり、翻訳読み枠を枠外に押し出す。

ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節に関与するタンパク質複合体の重要な構成要素である。ＤＭＤ患者は概して、小児期には自身を身体的に支える能力を失い、十代にはますます弱まり、二十代には死亡する。ＤＭＤのための現在の実験的遺伝子治療戦略は、一過性の遺伝子送達媒体の反復投与を必要とする、または外来遺伝子物質のゲノムＤＮＡへの永続的な組込みに依存する。これらの方法は両方とも、安全性に深刻な懸念を有する。さらに、これらの戦略は、大きく且つ複雑なジストロフィン遺伝子配列を送達することができないことにより制限されている。ジストロフィン遺伝子中に変異を有する患者を直すまたは処置するための、より正確で効率的な遺伝子編集ツールが必要とされている。

本発明は、ジストロフィン遺伝子を標的とし、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を対象とする。

本発明は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、少なくとも１つの本明細書に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物を対象とする。

本発明は、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡと第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物を対象とし、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは各々、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ここで、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子を標的とする。

本発明は、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡまたは上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを対象とする。

本発明は、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、または上記で説明した単離ポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。

本発明は、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および（ｃ）ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするベクターを対象とし、ここで、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含む。

本発明は、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、または上記で説明したベクターを含む細胞を対象とする。

本発明は、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクター、または上記で説明した細胞を含むキットを対象とする。

本発明は、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントを欠失させるための組成物を対象とし、この組成物は、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを含み、ここで、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれがヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１のイントロンおよび第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される。

本発明は、上記で説明した組成物を含む細胞を対象とする。

本発明は、対象中で変異ジストロフィン遺伝子を編集するゲノム用の修飾アデノ随伴ウイルスベクターであって、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む修飾アデノ随伴ウイルスベクターを対象とする。

本発明は、細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法を対象とし、この方法は、細胞に、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクター、上記で説明した組成物、または上記で説明した修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む。

本発明は、対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法を対象とし、この方法は、対象に、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクター、上記で説明した組成物、または上記で説明した修飾アデノ随伴ウイルスベクターを含むゲノム編集組成物を投与することを含む。

本発明は、変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法を対象とし、この方法は、対象に、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、上記で説明したＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、上記で説明した単離ポリヌクレオチド、上記で説明したベクター、上記で説明した組成物、または上記で説明した修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む。

本発明は、細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、この細胞に、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含む方法を対象とし、ここで、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失されて、細胞中の変異ジストロフィン遺伝子を修正する。

本発明は、変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法を対象とし、この方法は、対象に、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含む方法を対象とし、ここで、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失されて、対象を処置する。

本発明は、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１ａ）遺伝子のエンハンサーを標的とし、配列番号６５～７０の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を対象とする。

本発明は、細胞中でＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサーを破壊する方法を対象とし、この方法は、細胞に、上記で説明した少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを投与することを含む。

本開示のいくつかの実施形態に従う、ＤＭＤおよびＳＣＡ／βサラセミアなどの遺伝性疾患のための３つの治療法におけるＣｐｆ１の使用を示す概略図である。 本開示のいくつかの実施形態に従い、エクソン４４、４６および５１が検出可能な活性を有する標的ｇＲＮＡであることを明らかにするブロットを示す。 本開示の１つの実施形態に従い、エクソン５１欠失を標的とする４２のガイドＲＮＡ対がスクリーニングされることを明らかにするブロットを示す。 ＳａＣａｓ９およびＬｂＣｐｆ１が、患者由来の筋芽細胞において発現されることを示す。 患者由来の筋芽細胞中のＳａＣａｓ９またはＬｂＣｐｆ１によって引き起こされたゲノム欠失を示す。 エクソン５１欠失を標的とするＳａＣａｓ９またはＬｂＣｐｆ１が、転写物からエクソンを除去することを示す。 エクソン全体を通してサーベイヤー（ｓｕｒｖｅｙｏｒ）ヌクレアーゼ活性を明らかにするＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡの集団を示す。

本開示は、一部において、疾患を治療するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療への適用を提供する。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓエフェクターエンドヌクレアーゼであるＣｐｆ１は、中でも、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）およびラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）をはじめとする、原核生物の適応免疫に関与しており、単一ＲＮＡ誘導型アプローチを通してヒト細胞中で遺伝子編集活性を呈示する。本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づくシステムを、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、鎌状赤血球貧血（ＳＣＡ）およびβサラセミアなどの遺伝性疾患の治療に使用することができる方法を提供する。

本開示の一態様に従って、第１の方法は、スプライス受容体ノックアウトを含む。Ｃｐｆ１は、比較的大きなインデルフットプリントを生成し、これは、スプライス受容体の破壊および転写物からの標的エクソンの除去を効率的にする（図１Ａを参照）。図１Ａに示すように、Ｃｐｆ１は、ＤＮＡから５塩基対スタッガード二本鎖切断（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して修復され得る）を引き起こし、比較的大きな挿入もしくは欠失（インデル）フットプリント、次いで、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を産生する。これは、修復が、比較的大きなインデルフットプリントを残し、スプライス受容体およびエンハンサーなどの遺伝子エレメントのノックアウトをより効率的にし得るため、スプライス受容体のより強力な破壊、さらには標的エクソンの除去を可能にする。Ｃｐｆ１はまた、標的にすることができるゲノム領域の多様性を高める個別のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）も有する。Ｃｐｆ１は、ＴＴＴＮを認識するのに対し、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＮＧＧを認識し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９は、ＮＮＧＲＲＴを認識する。さらに、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、したがって、ｃｒＲＮＡだけが必要とされ、従って、小ガイドＲＮＡも使用する。

本開示の別の態様は、適合オーバーハング欠失を含む方法を提供する。Ｃｐｆ１は、オーバーハングを適合させて、遺伝子エレメントを除去することにより遺伝子欠失を促進することができる（図１Ｂを参照）。図１Ｂに示すように、Ｃｐｆ１は、第２の二本鎖切断と適合し得る５塩基対オーバーハングを産生する。多重Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡを適合オーバーハングと一緒に提供して、シームレス遺伝子欠失を促進することができる。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９を用いた以前の研究は、約６７％の遺伝子欠失が、１つのガイドＲＮＡ対に対してシームレスであることを証明している。例えば、目的の遺伝子領域（例えば、ジストロフィンにおけるエクソン５１）周辺のＣｐｆ１を多重化することにより産生された適合オーバーハングは、シームレス欠失を促進することができる。ＮＨＥＪの後、突然変異遺伝子の読み枠を回復することができる遺伝子欠失が達成される。オーバーハングを適合させることにより、非常に正確なライゲーションを促進することができる。

本開示のまた別の態様は、エンハンサー破壊を含む方法を提供する。Ｃｐｆ１は、エンハンサーおよび他の遺伝子調節エレメントの破壊をより確実にする比較的大きなインデルフットプリントを産生することができる（図１Ｃを参照）。図１Ｃに示すように、Ｃｐｆ１により産生された比較的大きなインデルフットプリントは、エンハンサー機能を調べる目的でエンハンサーを破壊するために、またはＳＣＡなどの疾患の治療法の候補として活用することもできる。

例えば、本開示は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の治療を目的としてジストロフィン遺伝子の単一および複数のエクソンの標的化遺伝子除去のためのＣｐｆ１の改変を説明する。これは、単一のエクソン除去のための突然変異多発点におけるスプライス受容体の標的化突然変異誘発、または単一もしくは複数のエクソンの遺伝子欠失によって達成される。標的化エクソン除去によって、ジストロフィンの読み枠が回復されて、筋肉機能および患者表現型の改善をもたらすことができる。また、疾患の処置に対する治療的アプローチとして遺伝子エンハンサーを標的にすることもでき、特に、鎌状赤血球貧血（ＳＣＡ）またはβサラセミアの治療法としてＢＣＬ１１ａエンハンサー領域またはγグロビンプロモーターを標的とすることができる。ＤＭＤ患者由来の細胞において機能性のジストロフィンの発現を回復するために、開示されるＣｐｆ１ ｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づくシステムと一緒に使用して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１周辺のイントロン領域などの遺伝子領域を標的として、この領域に遺伝子欠失を引き起こすことができる。

また、本明細書で説明されているのは、ジストロフィン遺伝子を標的とすべく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムおよび複数のｇＲＮＡを送達するための遺伝子コンストラクト、組成物および方法でもある。本開示の主題はまた、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を骨格筋に送達する方法も提供する。このベクターはＡＡＶ（例えば改変ＡＡＶベクター）であることができる。本開示の主題は、効果的で効率的であり且つゲノム改変の成功を容易にする、骨格筋へのこのクラスの治療剤の活性型を送達する方法を説明し、さらには、治療用途のためにヒトゲノムを書き直す手段および基礎科学用途のための標的モデル種を提供する。

このセクションおよび本明細書での開示全体で使用するセクションの表題は、単に構成を目的とするだけであり、限定することを意図するものではない。

１．定義
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に説明されているが、本明細書で説明されたものと類似のまたは等価の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。

用語「含む」、「含まれる」、「有すること」、「有する」、「することができる」、「含有する」、およびこれらの異形は、本明細書で使用する場合、追加の作用または構造可能性を排除しない、制約のない移り変わる語句、用語、または単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈によって他に明確に指示しない限り、複数の指示内容が含まれる。本開示はまた、明確に説明してもしなくても、本明細書で提供される実施形態または要素を「含む」、「～からなる」、および「本質的に～からなる」、他の実施形態を意図する。

本明細書の数値範囲の列挙については、それぞれその間にある数が、同じ程度の正確性で、明確に意図される。例えば、６～９の範囲については、６および９に加えて、数値７および８が意図され、範囲６．０～７．０については、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明確に意図される。

本明細書で使用する場合、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定される特定の値に関して許容される誤差範囲内を意味し、この誤差範囲は、この値がどのようにして測定されるかまたは決定されるか（即ち、測定システムの限界）によってある程度決まるだろう。例えば、「約」は、当分野での慣習に従って、３または３超の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％の範囲を意味し得、好ましくは最大１０％の範囲を意味し得、より好ましくは最大５％の範囲を意味し得、より好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁内を意味し得、好ましくは５倍以内を意味し得、より好ましくは２倍以内を意味し得る。

本明細書で互換的に使用される「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、ヒトおよびいくつかの他の霊長類の種を感染させる、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する、小さいウイルスを指す。ＡＡＶは、現在、疾患を引き起こすことが知られておらず、したがって、ウイルスは、非常に穏やかな免疫応答を引き起こす。

本明細書で使用される「結合領域」は、ヌクレアーゼによって認識および結合される、ヌクレアーゼ標的領域内の領域を指す。

本明細書において互換的に使用される「心筋（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ）」または「心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ）」は、心臓の壁および組織学的基礎で見られる一種の不随意性の横紋筋（心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ））を意味する。心筋は、心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）で作られている。心筋細胞は骨格筋細胞上の条線と同様の条線を示すが、多核骨格筋とは異なり唯一の固有の核を含む。特定の実施形態では、「心筋状態」は、心筋に関連する状態（例えば、心筋症、心不全、不整脈および炎症性心疾患）を指す。

本明細書で使用される「コード配列」または「コードする核酸」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される個人または哺乳類の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、コドン最適化することができる。

本明細書で使用される「相補体」または「相補的」は、核酸が、核酸分子のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体の間に、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えばＡ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を生じることができることを意味する。「相補性」は、互いに逆平行に整列させた時に各位置のポリヌクレオチド塩基が相補的となるような、２つの核酸配列間に共有される性質を指す。

本明細書で使用される「修正すること」、「ゲノム編集すること」、および「修復すること」は、切り詰め型タンパク質をコードするまたはタンパク質をまったくコードしない変異遺伝子を、完全長の機能性または部分的に完全長の機能性タンパク質発現が得られるように変化させることを指す。変異遺伝子を修正することまたは修復することは、変異を有する遺伝子の領域を置き換えること、または変異遺伝子全体を、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ）（ＨＤＲ）などの修復機構を用いて、変異を有しない遺伝子のコピーと置き換えることを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、遺伝子内の二本鎖切断をもたらし、次いでこの遺伝子を非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を使用して修復することによって、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位、または異所性スプライス供与部位をもたらすフレームシフト変異を修復することを含むことができる。ＮＨＥＪは、修復中に少なくとも１つの塩基対を付加または欠失させることができ、これは、適切な読み枠を修復するおよび未成熟終止コドンを除去することができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、異所性スプライス受容部位またはスプライスドナー配列を破壊することを含むことができる。変異遺伝子を修正することまたは修復することはまた、２つのヌクレアーゼ標的部位間のＤＮＡを除去することによって、適切な読み枠を修復するために、同じＤＮＡ鎖上での２種のヌクレアーゼの同時作用によって、非必須遺伝子セグメントを欠失させることと、ＮＨＥＪによってＤＮＡ切断を修復することとを含むことができる。

本明細書で互換的に使用される「Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ」または「Ｃｐｆ１」は、Ｃａｓ９より小さく、且つより単純なエンドヌクレアーゼであるクラス２ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの単一ＲＮＡ－誘導型エンドヌクレアーゼを指す。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、５’ＴリッチＰＡＭに対して遠位の５－ヌクレオチドスタッガード切断として標的化および切断する。

本明細書で互換的に使用される「ドナーＤＮＡ」、「ドナー鋳型」、および「修復鋳型」は、対象となる遺伝子の少なくとも一部分を含む二本鎖ＤＮＡ断片または分子を指す。ドナーＤＮＡは、完全に機能性のタンパク質または部分的に機能性のタンパク質をコードすることができる。

本明細書で互換的に使用される「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」または「ＤＭＤ」は、筋変性および最終的に死をもたらす、劣性遺伝の致死的なＸ連鎖性障害を指す。ＤＭＤは、一般的な遺伝性の単一遺伝子性疾患であり、男性の３５００人に１人に発症する。ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子のナンセンスまたはフレームシフト変異をもたらす、遺伝性変異または自然突然変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、ジストロフィン遺伝子において読み枠を破壊して早期翻訳終結を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者は、一般的に、小児期に自分自身の身体を支える能力を失い、１０代の間に次第に筋力が低下するようになり、２０代で死亡する。

本明細書で使用される「ジストロフィン」は、筋線維の細胞骨格を細胞膜を通して周囲の細胞外基質に連結するタンパク質複合体の一部である、棒状の細胞質タンパク質を指す。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節を担う細胞膜のジストログリカン複合体に、構造安定性を提供する。本明細書で互換的に使用されるジストロフィン遺伝子または「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１の２．２メガ塩基である。一次転写物は、約２，４００ｋｂであり、成熟したｍＲＮＡは、約１４ｋｂである。７９エクソンが、３５００超のアミノ酸であるタンパク質をコードする。

本明細書で使用される「エクソン５１」は、ジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１は、ＤＭＤ患者では、フレーム破壊欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングについての臨床試験において標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンについての臨床試験は、最近、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維を伴う、４８週にわたる有意な機能性の利益を報告した。エクソン５１の変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。

本明細書で互換的に使用される「フレームシフト」または「フレームシフト変異」は、１つ以上のポリヌクレオチドの付加または欠失がｍＲＮＡ内のコドンの読み枠のずれをもたらす、遺伝子変異の種類を指す。読み枠のずれは、ミスセンス変異または未成熟終止コドンなどの、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変更をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される「機能性」および「完全に機能性」は、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能性遺伝子」は、機能性タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡに転写される遺伝子を指す。

本明細書で使用される「遺伝子コンストラクト」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個人の細胞における発現を誘導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含めた調節エレメントに作動可能に連結された開始および停止シグナルが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「発現可能な形態」は、個人の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されることとなるような、タンパク質をコードするコード配列に、作動可能に連結された必須の調節エレメントを含有する遺伝子コンストラクトを指す。

本明細書で使用される「遺伝性疾患」は、ゲノム内の１つ以上の異常によって、部分的にまたは完全に、直接的にまたは間接的に引き起こされる疾患、特に、生まれつき存在する状態を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、限定はされないが、ＤＭＤ、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性の障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、βサラセミアなどの地中海貧血症、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得る。

本明細書で互換的に使用される「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、大抵は細胞周期のＧ２およびＳ期において、ＤＮＡの相同の断片が核内に存在する場合に、二本鎖ＤＮＡ損傷を修復するための、細胞における機構を指す。ＨＤＲは、修復を誘導するためのドナーＤＮＡ鋳型を使用し、また、ゲノムに対する特定の配列変化（全遺伝子の標的とされる付加を含めて）を作り出すために使用することができる。ドナー鋳型が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムと共に提供される場合、細胞機構は、相同組換えによって切断を修復することとなり、これは、ＤＮＡ切断の存在下で、数桁増強される。相同のＤＮＡ断片が存在しない場合、代わりに非相同末端結合が起こり得る。

本明細書で使用される「ゲノム編集」は、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは修復することを含むことができる。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含むことができる。ゲノム編集は、対象となる遺伝子を変化させることによって、疾患を治療する、または筋肉修復を増強するために使用することができる。

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況で本明細書で使用される「同一な」または「同一性」は、これらの配列が、特定の領域にわたって同一である、特定の割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適に整列させ、これらの２つの配列を特定の領域にわたって比較し、両方の配列において同一な残基が存在する位置の数を決定してマッチ位置の数を出し、マッチ位置の数を、特定の領域における位置の総数で割り、結果に１００をかけて、配列同一性の割合を出すことによって算出することができる。２つの配列が異なる長さのものである、または整列によって１つ以上の粘着末端が生じて比較の特定の領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は、等しいとみなすことができる。同一性は、手作業で、またはＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって実施することができる。

本明細書で互換的に使用される「変異遺伝子」または「変異した遺伝子」は、検出可能な変異を受けている遺伝子を指す。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達および発現に影響を与える、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けている。本明細書で使用される「破壊された遺伝子」は、未成熟終止コドンをもたらす変異を有する、変異遺伝子を指す。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較すると切り詰め型である。

本明細書で使用される「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」は、相同の鋳型を必要とせずに、切断末端を直接的に連結することによって、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによる、鋳型に依存しないＤＮＡ末端の再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する、確率的な、誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされる遺伝子配列を意図的に破壊する、欠失させる、または読み枠を変更するために使用することができる。ＮＨＥＪは、一般的に、修復を誘導するための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同のＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、しばしば、二本鎖切断の末端の単鎖オーバーハング中に存在する。このオーバーハングが完璧に適合する場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復し、一方で、ポリヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、これは、オーバーハングが適合しない場合にははるかに一般的である。

本明細書で使用される「正常遺伝子」は、遺伝材料の喪失、獲得、または交換などの変化を受けていない遺伝子を指す。正常遺伝子は、正常な遺伝子伝達および遺伝子発現を受ける。

本明細書で使用される「ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ」は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断した後に開始されるＮＨＥＪを指す。

本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合によって共に連結された、少なくとも２つのポリヌクレオチドを意味する。単鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、描写した単鎖の相補鎖も包含する。所与の核酸と同一の目的のために、核酸の多くのバリアントを使用することができる。したがって、核酸は実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリッド形成することができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。

核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るし、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含有することもできる。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここでは、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含めた塩基の組み合わせを含有することができる。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得ることができる。

本明細書で使用される「作動可能に連結された」は、遺伝子の発現が、遺伝子と空間的に連結されたプロモーターの制御下であることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置することができる。プロモーターと遺伝子との距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてプロモーターが制御するプロモーターと遺伝子との距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で公知であるように、この距離のバリエーションは、プロモーター機能の喪失を伴わずに適応させることができる。

本明細書で使用される「部分的に機能性」は、変異遺伝子によってコードされ、かつ、機能性タンパク質よりも低い生物活性を有するが、非機能性タンパク質よりも高い生物活性を有する、タンパク質を説明する。

本明細書で互換的に使用される「未成熟終止コドン」または「アウトオブフレーム終止コドン」は、野生型遺伝子には通常見られない位置での終止コドンをもたらす、ＤＮＡの配列内のナンセンス変異を指す。未成熟終止コドンは、完全長型のタンパク質と比較して切断されているまたは短いタンパク質をもたらす可能性がある。

本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または促進することが可能である、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに促進するための、かつ／または、空間的発現および／または同じものの時間的発現を変更するための、１つ以上の特異的な転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含めた起源から得ることができる。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織、または器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、原体、金属イオン、または誘発物質などの外部刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的または変動的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。

本明細書で使用される「骨格筋」は、体性神経系の制御下にあり、かつ腱として公知のコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の種類を指す。骨格筋は、時として口語的に「筋線維（ｍｕｓｃｌｅ ｆｉｂｅｒ）」と呼ばれる、筋細胞（ｍｙｏｃｙｔｅ）として公知の個々の成分、または「筋肉細胞（ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）」で構成されている。筋細胞は、筋形成として公知のプロセスにおいて、発達性の筋芽細胞（筋肉細胞をもたらす、ある種類の胚性前駆細胞）の融合体から形成される。これらの長い円柱形の多核細胞は、筋線維（ｍｙｏｆｉｂｅｒ）とも呼ばれる。

本明細書で使用される「骨格筋状態」は、筋ジストロフィー、老化、筋変性、創傷治癒、および筋力低下または筋萎縮症などの、骨格筋に関連する状態を指す。

本明細書で互換的に使用される「対象」および「患者」は、限定はされないが、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル、チンパンジーなどのサル）、およびヒト）を含めた、あらゆる脊椎動物を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。

「標的遺伝子」は、本明細書で使用される場合、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする任意のポリヌクレオチド配列を指す。標的遺伝子は、遺伝性疾患に関与する変異遺伝子であってよい。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子またはヒトＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子である。特定の実施形態では、標的遺伝子は、変異ヒトジストロフィン遺伝子である。

「標的領域」は、本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが結合して開裂するように設計されている標的遺伝子の領域を指す。

本明細書で使用される「導入遺伝子」は、ある生物から単離されており、別の生物に導入される、遺伝子配列を含有する遺伝子または遺伝材料を指す。ＤＮＡのこの非天然セグメントは、トランスジェニック生物におけるＲＮＡまたはタンパク質を産生する能力を保持することもできるし、トランスジェニック生物の遺伝暗号の正常な機能を変えることもできる。導入遺伝子の導入は、生物の表現型を変化させる可能性を有する。

核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参考ポリヌクレオチド配列の一部もしくは断片；（ｉｉ）参考ポリヌクレオチド配列の相補体、もしくはその一部；（ｉｉｉ）参考核酸と実質的に同一である核酸、もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で参考核酸とハイブリッド形成する核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列を意味する。

ペプチドまたはポリペプチドに関する「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持する。バリアントは、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参考タンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味することができる。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、同様の性質（例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布）の別のアミノ酸と置き換えることは、微小な変化を一般的に伴うものと当技術分野で認識されている。これらの微小な変化は、当技術分野で理解されている通り、アミノ酸の疎水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｉｎｄｅｘ）を考慮することによって、ある程度特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水性指標は、その疎水性および電荷の考慮に基づいている。同様の疎水性指標のアミノ酸が置換されてもまだ、タンパク質機能を保持できることが、当技術分野で公知である。一態様では、±２の疎水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドという状況でのアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性の算出を可能にする。互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸での置換を実施することができる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値はどちらも、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。この知見と一致して、生体機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさ、および他の性質によって明らかにされる、アミノ酸、特にそのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することが理解されよう。

本明細書で使用される「ベクター」は、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。例えば、ベクターは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（例えば、配列番号３６～１１９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列を含むＣｐｆ１ ｇＲＮＡ）またはその相補体をコードし得る。

本明細書で別に定義されない限り、本開示に関して使用される科学および技術用語は、当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有するものとする。例えば、本明細書に記載した細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される、あらゆる学術用語、およびこれらの技術は、周知でありかつ当技術分野で普通に使用されるものである。用語の意味および範囲は、明確であるべきである；しかし、いずれかの潜在的あいまい性の場合には、本明細書で提供する定義が、あらゆる辞書または外部の定義よりも先行する。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数の用語には、複数形が含まれるものとし、複数の用語には、単数形が含まれるものとする。

２．ＣＲＩＳＰＲ系
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）に特異的であるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする。「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「ＣＲＩＳＰＲ」は、本明細書で互換的に使用される場合、配列決定された細菌の約４０％および配列決定された古細菌の９０％のゲノムに見出される複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。ＣＲＩＳＰＲ系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入ファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ノンコーディングＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来ＤＮＡの短いセグメントは、ゲノムのＣＲＩＳＰＲリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。

３つのクラスのＣＲＩＳＰＲ系（Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型エフェクター系）が公知である。ＩＩ型エフェクター系は、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼなどの単一のエフェクター酵素を使用して、４つの連続的ステップで、標的ＤＮＡ二本鎖破壊を行って、ｄｓＤＮＡを切断する。複合体として作用する複数の異なるエフェクターを必要とするＩ型およびＩＩＩ型エフェクター系と比較して、ＩＩ型エフェクター系は、真核細胞などの代替状況において機能することができる。正しいＰＡＭがプロトスペーサーの５’末端にも存在すれば、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの切断を媒介する。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の活性は、３つの段階：改変、ｃｒＲＮＡの形成、および干渉を有する。改変の段階で、Ｃａｓ１およびＣａｓ２タンパク質が、ＤＮＡの小さな断片のＣＲＩＳＰＲ配列への改変を促進する。ｃｒＲＮＡの形成中に、プレ－ｃｒ－ＲＮＡのプロセシングが起こり、Ｃａｓタンパク質、すなわち、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを誘導する成熟ｃｒＲＮＡを産生する。干渉の段階で：Ｃｐｆ１は、ｃｒＲＮＡに結合して、二元複合体を形成し、標的ＤＮＡ配列を同定し、切断する。

この系では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、合成により再構成されたＣｐｆ１「ガイドＲＮＡ」（「Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡ」）によってゲノム標的部位に向けられる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、一方の鎖を他方より長くして、平滑末端を生成するＣａｓ９とは異なり、「粘着」末端、例えば、４～５ヌクレオチド長の粘着末端を生み出す。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼはまた、Ｃａｓ９と比較して、ＰＡＭからより遠い標的ＤＮＡも切断する。

標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）は、細胞の分化、もしくは遺伝子の活性化が所望され得る任意の他のプロセスに関与し得る、または変異（例えば、フレームシフト変異もしくはナンセンス変異）を有し得る。この標的遺伝子が、未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を生じる変異を有する場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを、この未成熟終止コドン、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位の上流または下流のポリヌクレオチド配列を認識してこの配列に結合するように設計することができる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づくシステムを使用して、スプライス受容体およびスプライス供与体を標的として未成熟終止コドンのスキッピングを誘導することにより、または破壊された読み枠を回復させることにより正常な遺伝子スプライシングを破壊することもできる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、ゲノムのタンパク質コード領域へのオフターゲット変化を媒介する場合もあるし媒介しない場合もある。

本明細書には、ゲノム編集および遺伝性疾患の処置に使用するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの独自の能力は、２種以上のＣｐｆ１ ｇＲＮＡを伴う単一のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを同時発現することによって、複数の異なるゲノム遺伝子座を同時に標的とする直接的な能力である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、遺伝性疾患、老化、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含めた、あらゆる遺伝子を標的にするように設計することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むことができる。特定の実施形態では、システムは２種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡを含む。

ａ．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを含むことができる。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、核酸を開裂するエンドヌクレアーゼである。Ｃａｓ９が、ＰＡＭ部位の上流で平滑末端３ヌクレオチドを生成するのに対し、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、スタッガード式に切断し、ＰＡＭから１８～２３塩基離れた５ヌクレオチドの５’オーバーハングを生成する。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、以下のものが挙げられるが、これらに限定されないあらゆる細菌または古細菌の種に由来し得る：野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテーラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７ １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）またはポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（「ＬｂＣｐｆ１」）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（「ＡｓＣｐｆ１」）に由来するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、以下に示すヒト化ＡｓＣｐｆ１配列（配列番号１２４）を含み得る：

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、以下に示すヒト化ＬｂＣｐｆ１配列（配列番号１２５）を含み得る：

Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、１種または複数種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡと相互作用することができ、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡと共同して、標的ドメイン、および特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが標的核酸と相互作用して、これを切断する能力は、ＰＡＭ配列に依存する。ＰＡＭ配列は、標的核酸内の配列である。特定の実施形態では、標的核酸の切断は、ＰＡＭ配列の上流で起こる。様々な細菌種由来のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、様々な配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のＰＡＭを認識する。

特定の実施形態では、ベクターは、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のＰＡＭを認識する少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（「ＬｂＣｐｆ１」）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（「ＡｓＣｐｆ１」）由来のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼである。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、配列番号１２４または配列番号１２５のポリヌクレオチド配列によりコードされる。

Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、合成核酸配列であってよい。例えば、合成核酸分子は、化学的に修飾することができる。合成核酸配列は、コドン最適化されることができ、例えば、少なくとも１つの非一般的コドンまたはあまり一般的ではないコドンが一般的コドンで置換されている。例えば、合成核酸は、例えば、本明細書に記載の哺乳動物発現系における発現のために最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を指令することができる。

これに加え、または代わって、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする核酸は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、当技術分野で公知である。

ｂ．Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、例えば、１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、２種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、３種のｇＲＮＡ、などを含む。このｇＲＮＡにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムのターゲティングが達成される。このＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、所望のＤＮＡ標的に対するターゲティング特異性を付与するプロトスペーサーをコードする配列を交換することにより、あらゆる所望のＤＮＡ配列を標的とすることができる。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書で互換的に使用される場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが標的とする標的遺伝子（例えば、ジストロフィン遺伝子）の領域を指す。この標的配列またはプロトスペーサーに先行して、このプロトスペーサーの５’末端にＰＡＭ配列が存在する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）であってもよい。

いくつかの実施形態では、プロトスペーサーは、約１７ｂｐ～約２３ｂｐであってよい。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、プロトスペーサーに対応するポリヌクレオチド配列またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、約１７ｂｐ～約２３ｂｐのプロトスペーサーを含み得る。いくつかの実施形態では、約１７ｂｐ～約２３ｂｐのプロトスペーサーは、連続的である。

いくつかの実施形態では、標的領域は、配列番号１～３５のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、配列番号１～３５のいずれか１つの断片、またはその相補体を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～１１９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、配列番号３６～１１９のいずれか１つの断片、またはその相補体を含み得る。いくつかの実施形態では、配列番号３６～１１９のいずれか１つの断片は、約１７ｂｐ～約２３ｂｐ長である。いくつかの実施形態では、断片中約１７ｂｐ～約２３ｂｐは、連続的である。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡを含み得、これらのｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的とする。これらの標的ＤＮＡ配列は、重複していてもよい。本開示の遺伝子コンストラクト（例えば、ＡＡＶベクター）によりコードされるＣｐｆ１ ｇＲＮＡの数は、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも２個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも３個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも６個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも７個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも９個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１１個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１２個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１３個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１６個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１７個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも２０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも２５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも３０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも３５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、または少なくとも５０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡであってよい。本開示のベクターによりコードされるＣｐｆ１ ｇＲＮＡの数は、少なくとも１個Ｃｐｆ１のｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも４個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも５０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも４０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも３０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２５個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも２０個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、少なくとも８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１６個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、または８個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡ～少なくとも１２個の異なるＣｐｆ１ ｇＲＮＡであってよい。特定の実施形態では、この遺伝子コンストラクト（例えばＡＡＶベクター）は、１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（即ち、第１のｇＲＮＡ）と任意選択でＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとをコードする。特定の実施形態では、第１の遺伝子コンストラクト（例えば、第１のＡＡＶベクター）は、１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（即ち、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ）と任意選択でＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとをコードし、第２の遺伝子コンストラクト（例えば、第２のＡＡＶベクター）は、１個のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（即ち、第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ）と任意選択でＣｐｆ１エンドヌクレアーゼとをコードする。

３．ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム遺伝子コンストラクト
本発明は、ジストロフィン遺伝子（例えば、ヒトジストロフィン遺伝子）のゲノム編集、ゲノム改変または遺伝子発現の改変のための遺伝子コンストラクトを対象とする。遺伝子コンストラクトは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ適合性標的などのヒトジストロフィン遺伝子配列を標的とする少なくとも１つのＣｐｆ１ ｇＲＮＡを含む。開示されるｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムに含有させることができ、そうしたものとして、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを用いて、ジストロフィン遺伝子内の領域、例えば、ヒトジストロフィン遺伝子におけるエクソン５１などのエクソン周囲のイントロン領域、スプライス受容部位、および／またはエクソン領域を標的にして、この領域のゲノム欠失を引き起こし、ＤＭＤ患者由来の細胞において機能性のジストロフィンの発現を回復させるシステムがある。

ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子に対する遺伝子変異に起因する重度の筋肉消耗疾患である。ジストロフィンは、細胞膜を介して筋繊維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとをつなぐタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Ｘｐ２１で２．２ベガ塩基である。一次転写は約２，４００ｋｂを測定し、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９種のエクソンは、３５００個を超えるアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織には、わずかな量のジストロフィンしか含まれないが、このジストロフィンの異常な発現の欠如により、重度且つ不治の症状が発症する。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では不完全なジストロフィンおよび重度のジストロフィー表現型が産生される。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では、部分的に機能するジストロフィンタンパク質および非常に軽度のジストロフィー表現型がもたらされる。

ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中でナンセンス変異またはフレームシフト変異を引き起こす遺伝的なまたは自発的な変異の結果である。天然に存在する変異およびその結果は、ＤＭＤに関して比較的よく理解されている。変異は、典型的には、遺伝子の領域の欠失または重複であり、これによって、タンパク質がフレームから外れるため、完全に機能不全となる。ほぼ機能性のタンパク質を回復させるフレームの修正により８３％もの患者に単一のエクソンの除去を適用することができる。ＣＰＦ１は、ジストロフィンエクソンを標的とすることができ、これを用いて、スプライス受容体を標的にすることにより単一のエクソンをノックアウトするか、または遺伝子領域を欠失させて、単一もしくは複数のエクソンを除去することができる。

ロッドドメインに含まれるエクソン４５～５５領域（例えばエクソン５１）中で起こるインフレーム欠失により、高度に機能するジストロフィンタンパク質が産生され得、多くの保有者は無症状であるか軽度の症状を呈することが知られている。さらに、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的とする（例えばエクソン５１などのジストロフィン遺伝子のエクソンを標的とする）ことにより、理論的には患者の６０％超を処置することができる。ｍＲＮＡのスプライシングの最中に非必須エクソンをスキップさせて（例えば、エクソン５１をスキップさせて）、内部的には欠失しているが機能するジストロフィンタンパク質を産生することにより、ＤＭＤ患者の破壊されたジストロフィン読み枠を回復させる努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（例えば、エクソン５１の欠失）により、適切な読み枠が保持されるものの比較的軽度のベッカー型筋ジストロフィー（即ちＢＭＤ）が引き起こされる。ベッカー型筋ジストロフィー（即ちＢＭＤ）遺伝子型は、ジストロフィン遺伝子中に欠失が存在するという点でＤＭＤと類似する。しかしながら、この欠失は読み枠を無傷に保つ。そのため、内部的には切り詰められるが部分的に機能するジストロフィンタンパク質が作られる。ＢＭＤは幅広い表現型を有するが、多くの場合、ジストロフィンのエクソン４５～５５の間に欠失が存在する場合には、この表現型はＤＭＤと比べてはるかに軽度である。そのため、ＤＭＤ遺伝子型をＢＭＤ遺伝子型へと変更することは、ジストロフィンを修正するための一般的な戦略である。ジストロフィンを修正するための多くの戦略が存在し、これらの多くは、内因性ジストロフィンの読み枠の回復に依存する。これにより、疾患の遺伝子型がＤＭＤからベッカー型筋ジストロフィーへとシフトする。多くのＢＭＤ患者は、翻訳読み枠を維持する遺伝子内欠失を有し、より短いが大部分が機能するジストロフィンタンパク質が生じる。

特定の実施形態では、読み枠を回復させるためのエクソン５１の改変（例えば、例えばＮＨＥＪによるエクソン５１の欠失または排除）により、欠失変異を有するＤＭＤ対象等の表現型ＤＭＤ対象が改善される。特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１はジストロフィン遺伝子の５１番目のエクソンを指す。エクソン５１はＤＭＤ患者のフレーム破壊性欠失に頻繁に隣接しており、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピングの臨床試験で標的とされている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンの臨床試験では、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性繊維を伴い４８週にわたり有意な機能的利点が報告された。エクソン５１での変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集による永続的な修正に理想的に適している。

本開示のベクターは、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）中で欠失を生じさせることができる。特定の実施形態では、このベクターは、ジストロフィン遺伝子の標的位置に隣接する２つのイントロン（第１のイントロンおよび第２のイントロン）中で２つの二本鎖切断（第１の二本鎖切断および第２の二本鎖切断）を形成し、それにより、ジストロフィン遺伝子においてジストロフィン標的位置を含むセグメントが欠失されるように構成されている。「ジストロフィン標的位置」は、本明細書で説明したジストロフィンのエクソン標的位置またはジストロフィンのエクソン内標的位置であることができる。ジストロフィンのエクソン標的位置の欠失により、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している患者のジストロフィン配列が最適化され得、例えば、コードされるジストロフィンタンパク質の機能もしくは活性が増加され得る、または対象の疾患状態が改善される。特定の実施形態では、ジストロフィンのエクソン標的位置の排除により読み枠が回復される。このジストロフィンのエクソン標的位置は、ジストロフィン遺伝子の１つまたは複数のエクソンを含むことができる。特定の実施形態では、このジストロフィン標的位置は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１を含む。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）のエクソン５１での高効率の遺伝子編集を媒介することができる。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中でのジストロフィンタンパク質の発現を回復させる。エクソン５１は、ＤＭＤでのフレーム破壊性欠失に頻繁に隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写産物からのエクソン５１の除去を使用して、全ＤＭＤ患者の約１５％を処置することができる。このクラスのジストロフィン変異は、ＮＨＥＪに基づくゲノム編集およびＨＤＲによる永続的な修正に理想的に適している。本明細書で説明された遺伝子コンストラクト（例えばベクター）は、ヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン５１の標的型改変用に開発されている。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）はヒトＤＭＤ細胞中に遺伝子導入され、読み枠を修正するための効率的な遺伝子改変および遺伝子変換を媒介する。タンパク質の回復はフレーム回復と同時であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムで処理された細胞の大部分で検出される。

単一のまたは多重のｇＲＮＡを、エクソン５１での変異ホットスポットを標的とすることにより、またはおよびエクソン内の小さい挿入および欠失を導入することにより、またはエクソン５１の排除により、ジストロフィン読み枠を回復させるように設計することができる。本開示のベクターによる処理後、インビトロで、デュシェンヌ患者の筋肉細胞中においてジストロフィン発現を回復させることができる。遺伝的に修正された患者細胞の免疫不全マウスへの移植後に、ヒトジストロフィンをインビボで検出した。意義深いことに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの特有の多重遺伝子編集能力は、普遍的なまたは患者特異的な遺伝子編集アプローチにより患者の変異の最大６２％を修正し得る、この変異ホットスポット領域の大きな欠失を効率的に生じさせることを可能にする。いくつかの実施形態では、候補ｇＲＮＡを、ｓｕｒｖｅｙｏｒにより測定したオフターゲット活性、オンターゲット活性に基づいて、ならびにエクソンからの距離に基づいて、評価して選択する。

Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）の１領域を標的とし得る。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子のエクソン、イントロン、プロモーター領域、エンハンサー領域、スプライス受容部位、および／または転写領域の少なくとも１つを標的にすることができる。いくつかの実施形態では、標的領域は、配列番号１～２８の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５０を標的とする。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のイントロン５１を標的とする。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１を標的とする。Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、配列番号３６～６４、７１～１１９のいずれか１つの断片、またはその相補体を含み得る。

４．Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１ａ）遺伝子のゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム遺伝子コンストラクト
鎌状細胞貧血（ＳＣＡ）は、β－グロビン遺伝子の点突然変異に起因し、βサラセミアは、β－グロビン発現の喪失を招く他の突然変異に起因する。ＢＣＬ１１ａは、胚および胎児グロビン遺伝子を抑制する転写抑制因子である。ＢＣＬ１１ａの完全な喪失は、胚性致死であるが；ＢＣＬ１１ａの赤血球特異的エンハンサー領域を破壊することにより、転写抑制因子の存在量を低減し、胎児グロビンレベルを増加して、疾患の表現型を改善することができる。同様に、γ－グロビン（ＨＢＧ１／２）プロモーターに対する特定の突然変異は、転写抑制および遺伝性高胎児ヘモグロビン（ＨＰＦＨ）の消失をもたらす。Ｃｐｆ１により産生されるインデルフットプリントが大きいほど、ＢＣＬ１１ａのエンハンサー領域またはＨＢＧ１／２の抑制領域を効率的に破壊することができる。いくつかの実施形態では、ＢＣＬ１１ａのエンハンサー領域を破壊し、胎児グロビンレベルを増加すると共に、ＳＣＡの表現型を改善するように、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡを設計する。いくつかの実施形態では、エンハンサー領域は、配列番号２９～３５の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号６５～７０のいずれか１つのポリヌクレオチド配列、配列番号６５～７０のいずれか１つの断片、またはその相補体を含む。

５．ＤＮＡターゲティング組成物
本発明はまた、そのような遺伝子コンストラクトを含むＤＮＡターゲティング組成物も対象とする。このＤＮＡターゲティング組成物は、上記で説明したようにジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を標的とする少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（例えば、１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、２種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、３種のｇＲＮＡ、など）を含む。この少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除によりスプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。

特定の実施形態では、本開示のＤＮＡターゲティング組成物は、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡを含み、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～１１９に記載のポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つ、またはその相補体を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号６５～７０の少なくとも１つ、またはその相補体を含む。特定の実施形態では、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド配列を含む。

特定の実施形態では、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される。

特定の実施形態では、ＤＮＡターゲティング組成物は、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のＰＡＭを認識する少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、このＤＮＡターゲティング組成物は、配列番号１２４または配列番号１２５に記載のポリヌクレオチド配列によりコードされるＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを含む。特定の実施形態では、ベクターは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中でそれぞれ第１および第２の二本鎖切断を形成し、それによりジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントを欠失させるように構成されている。

本開示のベクターの欠失効率は、欠失サイズ（即ち、このベクターにより欠失されるセグメントのサイズ）に関連することができる。特定の実施形態では、特異的欠失の長さまたはサイズは、標的とされる遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）中のＰＡＭ配列間の距離により決定される。特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のセグメントの特異的欠失（このセグメントの長さおよびこのセグメントが含む配列（例えばエクソン５１）に関して定義される）は、標的遺伝子（例えばジストロフィン遺伝子）内の特異的ＰＡＭ配列に隣接して作られた切断の結果である。

特定の実施形態では、この欠失サイズは約５０～約２，０００個の塩基対（ｂｐ）であり、例えば、約５０～約１９９９ｂｐ、約５０～約１９００ｂｐ、約５０～約１８００ｂｐ、約５０～約１７００ｂｐ、約５０～約１６５０ｂｐ、約５０～約１６００ｂｐ、約５０～約１５００ｂｐ、約５０～約１４００ｂｐ、約５０～約１３００ｂｐ、約５０～約１２００ｂｐ、約５０～約１１５０ｂｐ、約５０～約１１００ｂｐ、約５０～約１０００ｂｐ、約５０～約９００ｂｐ、約５０～約８５０ｂｐ、約５０～約８００ｂｐ、約５０～約７５０ｂｐ、約５０～約７００ｂｐ、約５０～約６００ｂｐ、約５０～約５００ｂｐ、約５０～約４００ｂｐ、約５０～約３５０ｂｐ、約５０～約３００ｂｐ、約５０～約２５０ｂｐ、約５０～約２００ｂｐ、約５０～約１５０ｂｐ、約５０～約１００ｂｐ、約１００～約１９９９ｂｐ、約１００～約１９００ｂｐ、約１００～約１８００ｂｐ、約１００～約１７００ｂｐ、約１００～約１６５０ｂｐ、約１００～約１６００ｂｐ、約１００～約１５００ｂｐ、約１００～約１４００ｂｐ、約１００～約１３００ｂｐ、約１００～約１２００ｂｐ、約１００～約１１５０ｂｐ、約１００～約１１００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約９００ｂｐ、約１００～約８５０ｂｐ、約１００～約８００ｂｐ、約１００～約７５０ｂｐ、約１００～約７００ｂｐ、約１００～約６００ｂｐ、約１００～約１０００ｂｐ、約１００～約４００ｂｐ、約１００～約３５０ｂｐ、約１００～約３００ｂｐ、約１００～約２５０ｂｐ、約１００～約２００ｂｐ、約１００～約１５０ｂｐ、約２００～約１９９９ｂｐ、約２００～約１９００ｂｐ、約２００～約１８００ｂｐ、約２００～約１７００ｂｐ、約２００～約１６５０ｂｐ、約２００～約１６００ｂｐ、約２００～約１５００ｂｐ、約２００～約１４００ｂｐ、約２００～約１３００ｂｐ、約２００～約１２００ｂｐ、約２００～約１１５０ｂｐ、約２００～約１１００ｂｐ、約２００～約１０００ｂｐ、約２００～約９００ｂｐ、約２００～約８５０ｂｐ、約２００～約８００ｂｐ、約２００～約７５０ｂｐ、約２００～約７００ｂｐ、約２００～約６００ｂｐ、約２００～約２０００ｂｐ、約２００～約４００ｂｐ、約２００～約３５０ｂｐ、約２００～約３００ｂｐ、約２００～約２５０ｂｐ、約３００～約１９９９ｂｐ、約３００～約１９００ｂｐ、約３００～約１８００ｂｐ、約３００～約１７００ｂｐ、約３００～約１６５０ｂｐ、約３００～約１６００ｂｐ、約３００～約１５００ｂｐ、約３００～約１４００ｂｐ、約３００～約１３００ｂｐ、約３００～約１２００ｂｐ、約３００～約１１５０ｂｐ、約３００～約１１００ｂｐ、約３００～約１０００ｂｐ、約３００～約９００ｂｐ、約３００～約８５０ｂｐ、約３００～約８００ｂｐ、約３００～約７５０ｂｐ、約３００～約７００ｂｐ、約３００～約６００ｂｐ、約３００～約３０００ｂｐ、約３００～約４００ｂｐまたは約３００～約３５０ｂｐである。特定の実施形態では、この欠失サイズは、約１１８個の塩基対、約２３３個の塩基対、約３２６個の塩基対、約７６６個の塩基対、約８０５個の塩基対または約１６１１個の塩基対であることができる。

６．筋肉中での遺伝子編集用組成物
本発明は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での標的遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはその組成物を対象とする。この組成物は、改変ＡＡＶベクターと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム（例えばＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ）をコードするポリヌクレオチド配列とを含む。この組成物は、活性型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達する。本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）を、遺伝性疾患および／または他の骨格筋もしくは心筋の状態（例えばＤＭＤ）に関与するジストロフィン遺伝子中での変異の影響の修正または低減で使用することができる。この組成物は、ドナーＤＮＡまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。この組成物を、ゲノム編集、ゲノム操作、ならびに遺伝性疾患および／または他の骨格筋もしくは心筋の状態に関与する遺伝子中での変異の影響の修正また低減で使用することができる。

ａ．ジストロフィンのターゲティング用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム
本明細書では、ジストロフィン遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが開示されている。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むことができる。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域または、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除により、スプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。

このＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号１～３５からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその相補体を標的とすることができる。例えば、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを操作して、ジストロフィン遺伝子のエクソン５１でのより高い効率の遺伝子編集を媒介させた。このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、ＤＭＤ患者由来の細胞中でジストロフィンタンパク質発現を回復させた。

ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター
この組成物はウイルス送達システムも含むことができる。特定の実施形態では、このベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。このＡＡＶベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小型ウイルスである。ＡＡＶベクターを使用して、様々なコンストラクト構造を使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを送達することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、別々ベクター上のまたは同一のベクター上のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよびＣｐｆ１ ｇＲＮＡ発現カセットを送達することができる。あるいは、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと最大２つのｇＲＮＡ発現カセットとの両方を、４．７ｋｂのパッケージング限度内で単一のＡＡＶベクター中で組み合わせることができる。

特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは改変ＡＡＶベクターである。この改変ＡＡＶベクターは、心筋および骨格筋の組織向性の増強を有することができる。この改変ＡＡＶベクターは、哺乳類の細胞中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの送達および発現を可能にすることができる。例えば、この改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであることができる（Ｐｉａｃｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：６３５－６４６）。この改変ＡＡＶベクターは、インビボで骨格筋および心筋にヌクレアーゼを送達することができる。この改変ＡＡＶベクターは、いくつかのカプシド型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９）のうちの１つまたは複数をベースとすることができる。この改変ＡＡＶベクターは、代替の筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型をベースとすることができ、例えば、全身送達および局所送達により骨格筋または心筋を効率的に遺伝子導入するＡＡＶ２／１ベクター、ＡＡＶ２／６ベクター、ＡＡＶ２／７ベクター、ＡＡＶ２／８ベクター、ＡＡＶ２／９ベクター、ＡＡＶ２．５ベクターおよびＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターをベースとすることができる（Ｓｅｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１２：１３９－１５１）。この改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ２ｉ８Ｇ９であることができる（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１３）２８８：２８８１４－２８８２３）。

７．筋肉中での遺伝子編集の方法
本開示は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集の方法を対象とする。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。このゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含むことができる。変異遺伝子を修正することは、この変異遺伝子を欠失させること、再編集することまたは置き換えることを含むことができる。変異異遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪまたはＨＤＲを含むことができる。

８．変異遺伝子を修正して対象を処置する方法
本開示の主題は、細胞中で変異遺伝子（例えば変異ジストロフィン遺伝子、例えば変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修正し、遺伝性疾患（例えばＤＭＤ）に罹患している対象を処置する方法を提供する。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞または対象に投与すること含むことができる。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用の本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物の使用により、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体またはこの変異を含む領域を置き換えることができる）と共に、完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質の発現を回復させることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを使用して、標的とされるゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが標的ＤＮＡ配列に結合し、それにより標的ＤＮＡの開裂が可能になる場合に生じる。このＤＮＡ開裂は天然のＤＮＡ修復機構を刺激し得、以下の２つの可能な修復経路のうちの１つをもたらす：相同組換え修復（ＨＤＲ）経路または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路。

本開示は、修復鋳型を伴わないＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムによる遺伝子編集を対象とし、この遺伝子編集により、読み枠を効率的に修正し、遺伝性疾患に関与する機能的タンパク質の発現を回復させることができる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を受け入れない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）の使用を含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの迅速且つ頑強なアセンブリを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位または異所性スプライス受容部位を生じる非必須コード領域中の変異により生じる遺伝性疾患の処置に効率的な遺伝子編集方法と統合する。

ａ．ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合
内因性の変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型なしのＮＨＥＪ介在性のＤＮＡ修復によるものであることができる。標的遺伝子ＲＮＡを標的とする一過性の方法とは対照的に、過渡的に発現されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子読み枠の修正により、それぞれ改変された細胞およびその後代の全てによって、永久に回復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。特定の実施形態では、ＮＨＥＪはヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪであり、このヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪは、特定の実施形態では、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼにより開始されて二本鎖ＤＮＡを切断するＮＨＥＪを指す。この方法は、骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集のために、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。

ヌクレアーゼ介在性のＮＨＥＪ遺伝子修正は、変異した標的遺伝子を修正し、ＨＤＲ経路に勝る、いくつかの潜在的利点を提供することができる。例えば、ＮＨＥＪは、非特異的挿入変異をもたらす可能性があるドナー鋳型を必要としない。ＨＤＲと対照的に、ＮＨＥＪは、細胞周期の全ての期において効率的に作動するので、循環と、有糸分裂後の細胞（筋線維など）との両方において効率的に利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドに基づくエクソンスキッピング、または終止コドンの薬物によって強いられるリードスルーに代わる、頑強な永続的な遺伝子修復を提供し、理論上はわずか１つの薬物治療しか必要としない可能性がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム、ならびにメガヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼを含めた他の遺伝子改変されたヌクレアーゼを使用する、ＮＨＥＪに基づく遺伝子修正は、本明細書に記載したプラスミド電気穿孔手法に加えて、細胞および遺伝子に基づく療法のための他の既存のエクスビボおよびインビボプラットフォームと組み合わせることができる。例えば、ｍＲＮＡに基づく遺伝子導入による、または、精製された細胞透過性タンパク質としてのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの送達は、挿入変異のいかなる可能性も回避するであろうＤＮＡフリーのゲノム編集手法を可能にすることができる。

ｂ．相同組換え修復
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト（ミニジストロフィン（「ｍｉｎｉｄｙｓ」）と呼ばれる）、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。

ｃ．変異遺伝子を修正してＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを用いて対象を処置する方法
本開示はまた、修復鋳型またはドナーＤＮＡ（これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる）を用いる、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムが、ｇＲＮＡを使用して標的ＤＮＡ配列に結合し、それによって標的ＤＮＡの切断が可能になる場合にもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このＤＮＡ切断は、天然のＤＮＡ修復機構を刺激し、可能性のある２つの修復経路：相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路のうちの１つをもたらすことができる。例えば、ジストロフィン遺伝子に誘導されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、配列番号３６～６４、７１～１１９のいずれか１つの核酸配列、またはその相補体を有するＣｐｆ１ ｇＲＮＡを含むことができる。

本開示は、読み枠を効率的に修正し、かつ遺伝性疾患に関与する機能性タンパク質の発現を修復することができる、修復鋳型を伴わない、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。開示されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムおよび方法は、相同組換え修復またはヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に基づく修正手法（これらは、相同組換えまたは選択に基づく遺伝子修正を適用できない可能性がある、増殖が制限された初代細胞株における効率的な修正を可能にする）を使用することを含むことができる。この戦略は、活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの迅速かつ頑強なアセンブリを、フレームシフト、未成熟終止コドン、異所性スプライス供与部位、または異所性スプライス受容部位をもたらす非必須コード領域の変異によって引き起こされる遺伝性疾患の治療のための効率的な遺伝子編集方法と統合する。

本開示は、細胞における変異遺伝子を修正し、ＤＭＤなどの遺伝性疾患を患う対象を処置する方法を提供する。この方法は、上に記載した通りに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードするポリヌクレオチドまたはベクター、または前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの組成物を、細胞または対象に投与することを含むことができる。この方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを投与すること、例えば、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ、前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列、および／または少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ（ここで、ｇＲＮＡは、異なるＤＮＡ配列を標的にする）を投与することを含むことができる。これらの標的ＤＮＡ配列は、オーバーラップしていることが可能である。細胞に投与されるｇＲＮＡの数は、上に記載した通りの、少なくとも１種のｇＲＮＡ、少なくとも２種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも４種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも６種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも７種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも８種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも９種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも１５種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも２０種の異なるｇＲＮＡ、少なくとも３０種の異なるｇＲＮＡ、または少なくとも５０種の異なるｇＲＮＡであり得る。ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９のうちの少なくとも１つの核酸配列、またはその相補体を含むことができる。この方法は、相同組換え修復または非相同末端結合を含むことができる。

９．疾患を処置する方法
本開示は、必要とする対象を処置する方法を対象とする。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。特定の実施形態では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の静脈に投与することを含むことができる。特定の実施形態では、この対象は、変性または衰弱または遺伝性疾患を引き起こす骨格筋または心筋の状態に罹患している。例えば、この対象は、上記で説明したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。

ａ．デュシェンヌ型筋ジストロフィー
上記で説明した方法を使用して、ジストロフィン遺伝子を修正して前記変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質発現を回復させることができる。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者におけるＤＭＤの影響（例えば臨床症状／適応症）を低減する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてＤＭＤを処置する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてＤＭＤを予防する方法を提供する。いくつかの態様および実施形態では、本開示は、患者においてＤＭＤのさらなる悪化を予防する方法を提供する。

１０．コンストラクトおよびプラスミド
上記で説明した組成物は、本明細書で開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。この遺伝子コンストラクト（例えばプラスミド）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム（例えばＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび／またはＣｐｆ１ ｇＲＮＡのうちの少なくとも１つ）をコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、改変ＡＡＶベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書で開示したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列とを含むことができる。この遺伝子コンストラクト（例えばプラスミド）は、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、本明細書で開示した改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。

いくつかの実施形態では、遺伝子コンストラクトは、少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、このプロモーターは、第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。この遺伝子コンストラクトは、機能する染色体外分子として細胞中に存在することができる。この遺伝子コンストラクトは、線状ミニ染色体、例えばセントロメア、テロメアまたはプラスミドまたはコスミドであることができる。

遺伝子コンストラクトはまた、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、および組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた、組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、細胞内で生存する弱毒化した生きている微生物または組換え微生物ベクター中の遺伝材料の一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節エレメントを含むことができる。調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、終止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。

特定の実施形態では、この遺伝子コンストラクトは、ベクターである。このベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであってよく、これは、少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードし；このベクターは、哺乳動物の細胞中で少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡを発現させることができる。このベクターは、プラスミドであってよい。このベクターは、インビボでの遺伝子治療に使用することができる。このベクターは、組換えであってもよい。このベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする異種核酸を含んでもよい。このベクターは、プラスミドであってもよい。このベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を細胞にトランスフェクトするのに有用なものであってもよく、形質転換された宿主細胞を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの発現が起こる条件下で培養して維持する。

コード配列は、安定性および高レベルの発現のために最適化することができる。ある場合では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を低下させるように選択される。

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする異種の核酸を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムコード配列の上流であり得る開始コドン、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含むことができる。開始および停止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムコード配列と共に、フレーム内であり得る。ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニ―ウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、例えばヒトＵ６プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的なプロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例が米国特許出願公開第２００４０１７５７２７号明細書および同第２００４０１９２５９３号明細書で説明されており、これらの明細書の内容はその全体が本明細書に組み込まれる。筋肉特異的プロモーターの例として、Ｓｐｃ５－１２プロモーター（米国特許出願公開第２００４０１９２５９３号明細書で説明されており、この明細書はその全体が参照により本明細書に組み込まれる；Ｈａｋｉｍ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４００２；およびＬａｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．（２０１４）２３（１２）：３１８９－３１９９）、ＭＨＣＫ７プロモーター（Ｓａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００７）１５：３２０－３２９で説明されている）、ＣＫ８プロモーター（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１５）１０（４）：ｅ０１２４９１４で説明されている）、ならびにＣＫ８ｅプロモーター（Ｍｕｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０１４）１：１４０２５で説明されている）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよび／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼの発現がｔＲＮＡにより駆動される。

Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡおよび／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列の各々はそれぞれ、プロモーターに作動可能に連結され得る。Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡおよび／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼに作動可能に連結されているプロモーターは同一のプロモーターであってもよい。Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡおよび／またはＣｐｆ１エンドヌクレアーゼに作動可能に連結されているプロモーターは異なるプロモーターであってもよい。このプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターまたは調節性プロモーターであることができる。

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。

ベクターはまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システム、すなわち、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼコード配列、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡの、上流のエンハンサー、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを含むことができる。エンハンサーは、ＤＮＡ発現のために必須であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはウイルスエンハンサー、例えばＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、またはＥＢＶに由来するものなどであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参照によって完全に組み込まれる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、米国特許第５，９６２，４２８号明細書、および国際公開第９４／０１６７３７号パンフレットに記載されている。ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持するために、哺乳類の複製開始点を含むことができ、細胞において、ベクターの複数のコピーを産生することができる。ベクターはまた、調節配列を含むことができ、調節配列は、ベクターが投与される哺乳類またはヒト細胞における遺伝子発現のために十分に適合させることができる。ベクターはまた、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子および／またはハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択可能マーカーを含むことができる。

ベクターは、常用の技術、および容易に入手可能な出発材料によってタンパク質を産生するための、発現ベクターまたは系であり得る（参照によって完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９））。いくつかの実施形態では、このベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列を含むことができ、例えば、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列、および配列番号３６～１１９のうちの少なくとも１つの核酸配列またはその相補体を含む少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードする核酸配列を含むことができる。

１１．医薬組成物
本開示の主題は、上記で説明した遺伝子コンストラクトを含む組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、この医薬組成物は無菌であり、パイロジェンフリーであり且つ粒子状物質フリーである。等張性製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によって、等張性溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）が好ましい。安定剤としてゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、この製剤に血管収縮剤が添加される。

前記組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含むことができる。薬学的に許容し得る賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能性分子であり得る。薬学的に許容し得る賦形剤は、遺伝子導入促進剤（これには界面活性剤が含まれ得る）、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤であり得る。

遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。遺伝子導入促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集のための組成物中に、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。遺伝子導入促進剤はまた、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリルリピドＡを含めて）、ムラミルペプチド、キノン類似体、およびベシクル、例えばスクアレンおよびスクアレンを含むことができ、また、遺伝子コンストラクトと共に、ヒアルロン酸も使用することができる。いくつかの実施形態では、前記組成物をコードするＤＮＡベクターはまた、遺伝子導入促進剤、例えば脂質、リポソーム（レシチンリポソーム、または、当技術分野で公知の他のリポソームを含めて）、ＤＮＡ－リポソーム混合物としてのもの（例えば国際公開第０９３２４６４０号パンフレット参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の公知の遺伝子導入促進剤を含むことができる。好ましくは、遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めて）、または脂質である。

１２．送達の方法
本明細書で提供されるのは、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはその組成物を細胞に送達する方法である。この組成物の送達は、この細胞中で発現され且つこの細胞の表面に送達される核酸分子としてのこの組成物の遺伝子導入または電気穿孔であることができる。この核酸分子を、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＸｃｅｌｌデバイスまたはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂデバイスを使用して電気穿孔することができる。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水 製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）またはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）等のいくつかの異なる緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００等の遺伝子導入試薬を含むことができる。

本開示の遺伝子コンストラクトまたは組成物が組織に送達され、その結果として哺乳類の細胞中にベクターが送達されると、この遺伝子導入された細胞はＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを発現する。この遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳類に投与して、遺伝子発現を変更することができる、またはゲノムを再編集するもしくは変更することができる。例えば、この遺伝子コンストラクトまたは組成物を哺乳類に投与して、哺乳類中でジストロフィン遺伝子を修正することができる。この哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、ウシ科動物（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラットまたはニワトリであり得、好ましくはヒト、ウシ、ブタまたはニワトリであり得る。

Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子コンストラクト（例えばベクター）を、インビボでの電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、ならびに／または組換えベクターにより哺乳類に送達することができる。この組換えベクターを任意のウイルス型により送達することができる。このウイルス型は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび／または組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞に導入して、ジストロフィン遺伝子（例えばヒトジストロフィン遺伝子）を遺伝的に修正することができる。特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、ＤＭＤ患者由来の筋芽細胞に導入する。特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞に導入し、遺伝的に修正された繊維芽細胞をＭｙｏＤで処理して筋芽細胞への分化を誘導し得、この筋芽細胞を対象（例えば、対象の損傷を受けた筋肉）に移植して、修正されたジストロフィンタンパク質が機能することを検証し得る、および／または対象を処置し得る。この改変された細胞は、幹細胞（例えば、誘導された多能性幹細胞）、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中胚葉性血管芽細胞（ｍｅｓｏａｎｇｉｏｂｌａｓｔ）、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞であることもできる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムは、誘導された多能性幹細胞のニューロン分化または筋原性分化を引き起こすことができる。

１３．投与の経路
本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、様々な経路（例えば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせ）により対象に投与することができる。特定の実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、対象（例えばＤＭＤを罹患している対象）に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する。獣医学的使用の場合、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適している投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。この組成物を、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、または他の物理的方法（例えば電気穿孔（「ＥＰ」）、「水力学的方法」または超音波）により投与することができる。

本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）または組成物を、いくつかの技術（例えば、インビボでの電気穿孔を伴うおよび伴わないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム介在、ナノ粒子促進、組換えベクター（例えば組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルス関連ウイルス））により哺乳類に送達することができる。この組成物を骨格筋または心筋に注射することができる。例えば、この組成物は、前脛骨筋または尾に注射することができる。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、１）成体マウスへの尾静脈注射（全身）により、２）筋肉内注射により、例えば、成体マウスにおける筋肉（例えばＴＡまたは腓腹筋）への局所注射により、３）Ｐ２マウスへの腹腔内注射により、または４）Ｐ２マウスへの顔面静脈注射（全身）により投与する。

１４．細胞型
これらの送達方法および／または送達の経路のいずれかを無数の細胞型（例えば、ＤＭＤの細胞に基づく治療用に現在研究中の細胞型）と共に利用することができ、この細胞型として以下が挙げられるがこれらに限定されない：不死化筋芽細胞、例えば野生型およびＤＭＤ患者由来の株、例えばΔ４８－５０ ＤＭＤ、ＤＭＤ６５９４（ｄｅｌ４８－５０）、ＤＭＤ８０３６（ｄｅｌ４８－５０）、Ｃ２５Ｃ１４およびＤＭＤ－７７９６細胞株、原発性ＤＭＤ皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血性幹細胞、平滑筋細胞、およびＭｙｏＤ形質導入細胞もしくはＰａｘ７形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞。ヒト筋原性細胞の不死化を使用して、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローンを誘導することができる。細胞をエクスビボで改変して、遺伝的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み且つゲノムのタンパク質コード領域中に他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離して増殖させることができる。あるいは、非ウイルスまたは非組込みウイルスの遺伝子導入によるまたは精製タンパク質および細胞浸透モチーフを含むｇＲＮＡの直接送達によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づくシステムのインビボでの一時的な送達により、外因性ＤＮＡ組込みのリスクが最低限なまたはないインサイチュでの高度に特異的な修正が可能になり得る。

１５．キット
本明細書で提供されるのは、変異ジストロフィン遺伝子を修正するのに使用され得るキットである。このキットは、変異ジストロフィン遺伝子の修正用のＣｐｆ１ ｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムを使用するための説明書とを少なくとも含む。また、本明細書で提供されるのは、骨格筋中でのまたは心筋中でのジストロフィン遺伝子のゲノム編集に使用され得るキットでもある。このキットは、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含む。

キットに含まれる説明書は、包装材料に貼り付けることもできるし、パッケージ挿入物として含めることもできる。説明書は、一般的に、書面のまたは印刷された素材であるが、これに限定されない。こうした説明書を保管する、また、これらをエンドユーザーに伝えることが可能なあらゆる媒体が、本開示によって企図される。こうした媒体としては、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。

骨格筋中でのまたは心筋中での変異ジストロフィンの修正用のまたはジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト（例えばベクター）またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子のある領域に特異的に結合して切断する、上記で説明したＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを含む改変ベクターを含むことができる。変異ジストロフィン遺伝子中の特定の領域に特異的に結合してこの領域を標的とするために、上記で説明したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に基づく遺伝子編集システムをキットに含めることができる。このキットは、上記で説明したドナーＤＮＡ、別のｇＲＮＡまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。

キットは、さらに、任意選択で、開示される組成物の使用、または品質管理評価の促進に必要な試薬、例えば、標準、バッファー、希釈剤、塩、酵素、酵素補因子、基質、検出試薬などの１種または複数種の構成要素を含んでもよい。細胞の単離および／または処理のためのバッファーおよび溶液などの他の構成要素をキットに含めることができる。キットはさらに１つまたは複数の制御を含めることができる。キットの１種または複数種の構成要素を凍結乾燥させることができ、その場合、キットは、凍結乾燥成分の再構成に好適な試薬をさらに含み得る。

１６．実施例
本明細書で説明された本開示の方法の他の適切な改変および適応が容易に適用可能であり且つ認識可能であり、ならびに本開示または本明細書で開示された態様および実施形態の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して行なわれ得ることが当業者に容易に明らかであるだろう。これまで本開示を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより本開示がより明確に理解されるだろう。この実施例は、本開示のいくつかの態様および実施形態を説明することのみを単に意図しており、本開示の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は複数の態様を有し、以下の非限定的な実施例により説明される。

実施例１
ガイドＲＮＡ設計および材料調製
アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）由来のＣｐｆ１は、Ａｄｄｇｅｎｅ非営利プラスミド保管センターから取得した（Ｆｅｎｇ ＺｈａｎｇからのｐＹ０１０（ｐｃＤＮＡ３．１－ｈＡｓＣｐｆ１；「ＡｓＣＰＦ１プラスミド」）（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド♯６９９８２））。ＡｓＣＰＦ１プラスミドをケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換し、増幅した後、配列を確認した。Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ（Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡとしても知られる）は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校ゲノムブラウザ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ）プログラムを用いて、ジストロフィンにおいて優勢なエクソン変異上のスプライス部位およびＢＣＬ１１ａのエンハンサーを標的とするように設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からオリゴマーとして注文し、ＰＣＲで調製した後、以前記載されているように（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７１（２０１５））カラム精製した。

ガイドＲＮＡの確認。製造者の推奨事項に従い、２４ウェルプレート内でリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００を用いてＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）のトランスフェクションを実施した。各ウェルは、４００ｎｇのＡｓＣＰＦ１プラスミドと１００ｎｇのＵ６：：ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物を受けた。７２時間後、細胞を単離し、ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙカラム（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。以前記載されているように（Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ６：６２４４（２０１５）；Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６４９：２４７－２５６（２０１０））、目的のゲノム領域に隣接するプライマーを用いて、サーベイヤー（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ）ヌクレアーゼ消化（ＩＤＴ）および欠失ＰＣＲを実施した。消化されたＰＣＲ産物をＴＢＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に３０分間２００Ｖで電気泳動させ、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色してから、Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）上にイメージングした。欠失ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル中に３０分間１２０Ｖで電気泳動させ、ＥｔＢｒで染色してから、Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）（Ｂｉｏｒａｄ）上にイメージングした。

実施例２
ジストロフィンスプライス受容体ガイドＲＮＡ
スプライス受容体に可能な限り近接した切断領域を標的とすることにより、最上位の高度変異ジストロフィンエクソンを標的とする１５のガイドＲＮＡを設計したが、これは、利用可能なＰＡＭの存在によって達成された（表１）。可能であれば、複数のガイドＲＮＡが同じスプライス受容体を標的にするようにした。候補ガイドＲＮＡをインビトロでスクリーニングした。直ちに陽性結果を示したガイドＲＮＡには、エクソン４４、エクソン４６、エクソン５１を標的とするものが含まれる（図２Ａ～２Ｃ）。サーベイヤーヌクレアーゼ消化が、エクソン４４スプライス受容体（図２Ａ）、エクソン４６スプライス受容体（図２Ｂ）、およびエクソン５１の３’末端（図２Ｃ）を標的とするガイドＲＮＡにおいて検出された。図２Ｄは、エクソン５１のスプライス受容体およびエクソン５１の３’末端を標的とするガイドＲＮＡを用いて、遺伝子欠失を引き起こし得ることを明らかにし、これは、エクソン５１を標的とするガイドＲＮＡの活性を示している。

表１は、ジストロフィンエクソンを標的とするガイドＲＮＡの設計を示す。ＰＡＭ配列（ＴＴＴＮ）を下線で示す。センスガイドＲＮＡは、５’末端にＴＴＴＮを有する。アンチセンス鎖のガイドＲＮＡは、３’末端にＮＡＡＡ ＰＡＭを有する。

実施例３
エクソン５１の適合オーバーハング欠失
適合オーバーハング配列を有するガイドＲＮＡが、シームレス欠失を促進するか否かを決定するために、６つのガイドＲＮＡをイントロン５０内で設計し、７つのガイドＲＮＡをイントロン５１内で設計する（表２）ことにより、適合オーバーハング欠失を生じさせた。４２のユニークなｇＲＮＡ対（６×７）を、欠失活性、即ち、エクソン５１欠失のターゲティングについて試験およびスクリーニングした。このセットには、３つのオーバーハング適合対が含まれた（表２を参照）。７つの対が活性について確認された。図３は、エクソン５１の欠失を示す、より小さなバンドを示す代表的な画像である。これらの結果は、ジストロフィン遺伝子の最初のＣｐｆ１標的スプライス受容体破壊およびエクソン５１の欠失を証明するものである。

実施例４
患者由来の筋芽細胞におけるエクソン５１の標的欠失
エクソン４８～５０が欠失した（Δ４８～５０）患者由来の筋芽細胞を骨格筋増幅培地中に培養した。標準的実験室手順に従って電気穿孔を実施した。細胞を３日間培養し、患者由来筋芽細胞におけるタンパク質発現（図４）およびＳａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９）またはＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６由来のＣＰＦ１）により引き起こされたゲノム欠失（図５）について評価した。図４は、ＨＡ標識ＳａＣａｓ９およびＬｂＣｐｆ１のウエスタンブロットが、プラスミドトランスフェクションから７２時間後に、抽出タンパク質に発現を示すことを証明する。図５は、標的ゲノム領域にわたるＰＣＲが、ＳａＣａｓ９ ｇＲＮＡまたはＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡによるバルク処理筋芽細胞において、より小さいバンドを示すことを証明し、これは、エクソン５１および周辺イントロン部分の除去と一致する。

次に、筋芽細胞を分化させた後、ジストロフィン転写物発現およびエクソン５１の欠失について評価した（図６）。図６は、ＲＴ－ＰＣＲによって生じた小さいバンドにより示されるように、分化した筋芽細胞が、エクソン５１の存在しないジストロフィン転写物を発現したことを証明し、従って、エクソン５１を標的とするＳａＣａｓ９またはＬｂＣｐｆ１が、転写物からエクソン５１エクソンを除去したことを示している。

Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡの大きな集団をＨＥＫ２９３細胞において評価した（図７；Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ配列については表３を参照）。使用したエクソン５１または周辺イントロンを標的とするＣｐｆ１ ｃｒＲＮＡをすべて表３に列挙する。図７に示すように、ｃｒＲＮＡの集団で３日間処理したＨＥＫ２９３細胞は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）ヌクレアーゼアッセイにより、まちまちの活性を示した。Ｃｐｆ１ ｃｒＲＮＡ＃３８、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４９、５４、５５、５６、５９、６３、６４、および６５は、短いバンドにより示される最も高い活性を示した。

実施例５
ＢＣＬ１１ａエンハンサー標的化
鎌状細胞貧血（ＳＣＡ）における胎児グロビンレベルを増加する有力な候補を設計した。鎌状細胞貧血（ＳＣＡ）における胎児グロビンレベルを増加する有力な候補を生成する目的で、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域（表３）を標的とするように、Ｃｐｆ１のガイドＲＮＡを設計した。これらの試薬は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーを破壊するように設計した。これらの試薬はＳＣＡ細胞モデルで試験する。

前述の詳細な説明および付随する実施例は、単に実例に過ぎず、本発明の範囲への制限と受け取るべきではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ定義されることが理解されよう。

開示された実施形態に対する様々な変更および改変は、当業者には明らかであろう。限定はされないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または使用の方法に関するものを含めた、こうした変更および改変を、その趣旨および範囲から逸脱せずに行うことができる。

完全性の理由から、本発明の種々の態様を、次の番号付けした条項で提示する。

第１項．ジストロフィン遺伝子を標的とし、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。

第２項．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、第１項に記載の少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物。

第３項．第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡと第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物であって、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは各々が、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、ここで、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、異なるポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、ジストロフィン遺伝子を標的とする、ＤＮＡターゲティング組成物。

第４項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、配列番号５４、配列番号５５、または配列番号５６に対応するポリヌクレオチド配列を含み、且つ前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、配列番号６２、配列番号６３、または配列番号６１に対応するポリヌクレオチド配列を含む、第３項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第５項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される、第３項または第４項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第６項．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをさらに含む、第３～５項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第７項．前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、第２項または第６項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第８項．前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテーラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７ １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）およびポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種に由来する、第７項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第９項．前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＡｓＣｐｆ１）に由来する、第６項～８項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第１０項．前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、配列番号１２４または配列番号１２５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、第６項～９項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。

第１１項．第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡまたは第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。

第１２項．第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、または第１０項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。

第１３項．Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、第１２項に記載のベクター。

第１４項．（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および（ｃ）ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する少なくとも１種のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするベクターであって、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、異なるポリヌクレオチド配列を含むベクター。

第１５項．前記ベクターが、前記ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２イントロンに第１および第２二本鎖を形成するように構成される、第１４項に記載のベクター。

第１６項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される、第１４項または第１５項に記載のベクター。

第１７項．前記ベクターが、ウイルスベクターである、第１２～１６項のいずれか一項に記載のベクター。

第１８項．前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、第１７項に記載のベクター。

第１９項．前記ベクターが、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および／または前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、第１２～１８項のいずれか一項に記載のベクター。

第２０項．前記組織特異的プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、第１９項に記載のベクター。

第２１項．第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、第１１項に記載の単離ポリヌクレオチド、または第１２～２０項のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

第２２項．第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、第１１項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１２～２０項のいずれか一項に記載のベクター、または第２１項に記載の細胞を含むキット。

第２３項．ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントを欠失させるための組成物であって、前記組成物が、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを含み、ここで、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、異なるポリヌクレオチド配列を含み、前記第１のベクターおよび前記第２のベクターは、それぞれが前記ヒトＤＭＤ遺伝子のエクソン５１に隣接する第１のイントロンおよび第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失される組成物。

第２４項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される、第２３項に記載の組成物。

第２５項．前記第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび前記第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、同じである、第２３項または第２４項に記載の組成物。

第２６項．前記第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび前記第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、異なる、第２３項または第２４項に記載の組成物。

第２７項．前記第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）および／またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＡｓＣｐｆ１）由来のＣＰＦ１エンドヌクレアーゼである、第２５項または第２６項に記載の組成物。

第２８項．前記第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼおよび／または前記第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼが、配列番号１２４または配列番号１２５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、第２５～２７項のいずれか一項に記載の組成物。

第２９項．前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターが、ウイルスベクターである、第２３～２８項のいずれか一項に記載の組成物。

第３０項．前記第１のベクターおよび／または前記第２のベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、第２９項に記載の組成物。

第３１項．前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、第３０項に記載の組成物。

第３２項．前記ジストロフィン遺伝子が、ヒトジストロフィン遺伝子である、第２３～３１項のいずれか一項に記載の組成物。

第３３項．薬剤に使用するための第２３～３２項のいずれか一項に記載の組成物。

第３４項．デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用するための第２３～３２項のいずれか一項に記載の組成物。

第３５項．第２３～３４項のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。

第３６項．対象中で変異ジストロフィン遺伝子を編集するゲノム用の修飾アデノ随伴ウイルスベクターであって、第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む修飾アデノ随伴ウイルスベクター。

第３７項．細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記方法は、細胞に、第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、第１１項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１２～２０項のいずれか一項に記載のベクター、第２３～３４項のいずれか一項に記載の組成物、または第３６項に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む方法。

第３８項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、第３７項に記載の方法。

第３９項．対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、前記方法は、前記対象に、第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、第１１項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１２～２０項のいずれか一項に記載のベクター、第２３～３４項のいずれか一項に記載の組成物、または第３６項に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを含むゲノム編集組成物を投与することを含む方法。

第４０項．前記ゲノム編集組成物が、前記対象に、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで投与される、第３９項に記載の方法。

第４１項．前記ゲノム編集が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、第３９項または第４０項に記載の方法。

第４２項．変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記方法は、前記対象に、第１項に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、第２～１０項のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、第１１項に記載の単離ポリヌクレオチド、第１２～２０項のいずれか一項に記載のベクター、第２３～３４項のいずれか一項に記載の組成物、または第３６項に記載の修飾アデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含む方法。

第４３項．細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記細胞に、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含み、ここで、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記ベクターは、それぞれが前記ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失されて、細胞中で前記変異ジストロフィンを修正する方法。

第４４項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される、第４３項に記載の方法。

第４５項．前記変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドン、破壊された読み枠、異所性スプライス受容体部位、または異所性スプライス供与体部位を含む、第４３項または第４４項に記載の方法。

第４６項．前記変異ジストロフィン遺伝子が、未成熟終止コドンおよび切断型遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む、第４５項に記載の方法。

第４７項．前記変異ジストロフィン遺伝子が、前記読み枠を破壊する１つまたは複数のエクソンの欠失を含む、第４３項または第４４項に記載の方法。

第４８項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容体部位の破壊もしくはスプライス供与体配列の破壊によるスプライシングの調節を含む、第４３～４７項のいずれか一項に記載の方法。

第４９項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、エクソン５１の欠失を含む、第４８項に記載の方法。

第５０項．前記変異ジストロフィン遺伝子の修正が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、第４３～４９項のいずれか一項に記載の方法。

第５１項．前記細胞が、筋芽細胞である、第４３～５０項のいずれか一項に記載の方法。

第５２項．前記細胞が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象に由来する、第４３～５１項のいずれか一項に記載の方法。

第５３項．変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記方法は、前記対象に、（ａ）第１のＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第１のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第１のベクター、および（ｂ）第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する第２のＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含む第２のベクターを投与することを含み、ここで、前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号３６～６４、７１～１１９の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含み、前記第１ベクターおよび前記第２のベクターは、それぞれが前記ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５１に隣接する第１および第２のイントロン中で第１および第２の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン５１を含むセグメントが欠失されて、前記対象を処置する方法。

第５４項．前記第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよび前記第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡが、（ｉ）配列番号５４に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６２に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；（ｉｉ）配列番号５５に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６３に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ；ならびに（ｉｉｉ）配列番号５６に記載のポリヌクレオチド配列を含む第１のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、および配列番号６１に記載のポリヌクレオチド配列を含む第２のＣｐｆ１ ｇＲＮＡからなる群から選択される、第５３項に記載の方法。

第５５項．前記対象が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している、第５３項または第５４項のいずれか一項に記載の方法。

第５６項．前記第１のベクターおよび第２のベクターが、前記対象に、筋肉内、静脈内、またはそれらの組み合わせで投与される、第５３～５５項のいずれか一項に記載の方法。

第５７項．前記Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１ａ）遺伝子のエンハンサーを標的とし、配列番号６５～７０の少なくとも１つに対応するポリヌクレオチド配列、またはその相補体を含むＣｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。

第５８項．細胞中でＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサーを破壊する方法であって、前記方法が、前記細胞に、第５７項に記載の少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡおよびＣｐｆ１エンドヌクレアーゼを投与することを含む方法。

Claims (28)

1. Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１ａ）遺伝子のエンハンサーを標的とし、配列番号６４～７０から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列、またはその相補体によりコードされる、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）。
2. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼと、請求項１に記載の少なくとも１種のＣｐｆ１ ｇＲＮＡとを含むＤＮＡターゲティング組成物。
3. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識する、請求項２に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
4. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）１、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテーラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＣ２０１７ １、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア・バクテリウム（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０、パルクバクテリア・バクテリウム（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７、スミセラ属（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＭＡ２０２０、カンジダツス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユウバクテリウム・エリゲンス（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）３、プレボテラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）およびポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）からなる群から選択される細菌種に由来する、請求項３に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
5. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＡｓＣｐｆ１）に由来する、請求項２～４のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
6. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、配列番号１２４または配列番号１２５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２～５のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物。
7. 請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡまたは請求項２～６のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
8. 請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、請求項２～６のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、または請求項７に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
9. Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項８に記載のベクター。
10. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項８又は９のいずれかに記載のベクター。
11. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記ベクターが、Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡおよび／または前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のベクター。
13. 前記組織特異的プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、請求項１２に記載のベクター。
14. 請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、請求項２～６のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項８～１３のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
15. 請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、請求項２～６のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド、請求項８～１３のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１４に記載の細胞を含むキット。
16. 細胞中でのＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサー破壊用組成物であって、前記組成物が、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列とを含むベクターを含み、
    ここで、前記Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、配列番号６４～７０の少なくとも１つを含むポリヌクレオチド配列、またはその相補体によりコードされる、組成物。
17. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、ラクノスピラセ・バクテリウム（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）またはアシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（ＡｓＣｐｆ１）由来のＣＰＦ１エンドヌクレアーゼである、請求項１６に記載の組成物。
18. 前記Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼが、配列番号１２４または配列番号１２５を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１６または１７のいずれかに記載の組成物。
19. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の組成物。
20. 前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１９に記載の組成物。
21. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ８ベクターまたはＡＡＶ９ベクターである、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記ＢＣＬ１１ａ遺伝子が、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の組成物。
23. 薬剤に使用するための請求項１６～２２のいずれか一項に記載の組成物。
24. 鎌状赤血球貧血の治療に使用するための請求項１６～２２のいずれか一項に記載の組成物。
25. 請求項１６～２４のいずれか一項に記載の組成物を含む細胞。
26. Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサー破壊用の修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチド配列と、ＴＴＴＡ（配列番号１２０）、ＴＴＴＧ（配列番号１２１）、ＴＴＴＣ（配列番号１２２）、またはＴＴＴＴ（配列番号１２３）のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識するＣｐｆ１エンドヌクレアーゼをコードする第２のポリヌクレオチド配列とを含む修飾アデノ随伴ウイルスベクター。
27. 請求項１に記載のＣｐｆ１ ｇＲＮＡ、または請求項２～６のいずれか一項に記載のＤＮＡターゲティング組成物をコードするポリヌクレオチド配列、または請求項７に記載の単離ポリヌクレオチド、または請求項８～１３のいずれか一項に記載のベクターを含む、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサー破壊用組成物。
28. Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ遺伝子のエンハンサー破壊が、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合または相同組換え修復を含む、請求項２７に記載の組成物。