JPH01104183A - Ｃ−１０２７物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、制癌性抗生物質Ｃ−１０２７物質に関する。

従来の技術 本発明のＣ−１０２７物質は、文献未記載の新規化合物
でおる。

発明が解決しようとする同　点 本発明の目的は、抗腫瘍作用を有する制癌性抗生物質と
して有用な新規物質を提供することにある。

５題点を解決するための手Ｐ 上記目的は、下記性質を有するＣ−１０２７物質により
達成される。

Ｏ性状：白色粉末状形態を有する。

０溶解性：水に易溶であるが、メタノール、エタノール
、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒には溶けない。

Ｏ紫外部吸収スペクトル：水溶液中、０．０１Ｎ塩酸溶
液中及び０．０１Ｎ水駿化ナトリウム溶液中で測定した
紫外部吸収スペクトルは、第１図にそれぞれ曲線（１）
、（２）及び（３）として示す通りであり、該図より中
・酸性水溶液中では２７０〜２７５ｎｍ及び３５０〜３
６０ｎｍに、アルカリ性水溶液中では２７０〜２７５０
ｍ及び３４０〜３４５１ｍに吸収極大を示すことが判る
。

Ｏ赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠として測定し
た結果は、第２図に示す通りで必り、３３００．１６４
０．１５３０ｃｍ”に主な吸収が認められる。

○融点：明確な融点、分解点を示さず、発泡しつつ徐々
に褐変・炭化し、２６０°Ｃで完全に炭化する。

０￥色反応：ニンヒドリン、ビューレット、フを一すン
ーロウリイ反応に陽性で、アンスロン、アニリン−フタ
ル酸反応に陰性でめる。

０等電点：ｌ１３．５〜３．７である。

０塩基性、酸性、中性の区別二Ｍ性を呈する。

０元素分析：炭素４５．２２％、水素６．６５％、窒素
１４．０３％である。

０分子量：ＴＳＫゲルＧ−２０００ＳＷ　（東洋曹達社
製）を用いた高速ゲル濾過クロマトグラフィー及びＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により算出され
る分子ｍは約１５０００である。

一・アミノ酸構成二６Ｎ塩酸に溶解後、１１０℃、２０
時間加水分解して測定した結果は下記第１表の通りでお
り、構成アミノ酸として、アスパラギン酸、スレオニン
、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニ
ン、シスチン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロ
シン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン、アルギ
ニンが検出される。但し、シスチンはＳ−スルホシステ
ィンとして、トリプトファンは水酸化ナトリウムによる
アルカリ加水分解による分析値として示す。

第１表 ＯＮ末端アミノ酸：ＤＮＰ法、ＤＮＳ法によりＮ末端と
してアラニンが検出される。

本発明のＣ−１０２７物質は、微生物の培養により得る
ことができる。即ら、本物質は、Ｃ−１０２７物質の生
産能力を有する菌株（以下Ｃ−１０２７物質生産菌と称
する）を適当な条件下で培養することによって、培養液
から採取することができる。

本物質の製造に用い得るＣ−’１０２７物質生産菌ニハ
、ストレプトミセス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
に属する菌株が包含される。その−例としては、ストレ
プトミセス　セトニイ　Ｃ−１０２７（３ｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　５ｅｔｏｎｉ　ｉ　Ｃ−１０２７＞を例示
できる。この菌株は、本発明者らが中華人民共和国雲南
省の土壌から新たに分離したストレプトミセス属に属す
る菌株であり、通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に、微生物の表示「３ｔｒａｉｎ　Ｃ−１０２７Ｊ
　、受託番号「微工研条寄第１２９９号Ｊ　　（ＦＥＲ
Ｍ　　ＢＰ−１２９９＞として寄託されている。その菌
学的性質は次の通りでおる。

（ａ）形態 胞子形成菌糸の分校法：単純分枝 胞子形成の形態：直鎖状〜波状 胞子の数：１５個以上 胞子の表面構造：平滑 胞子の形二円筒状 胞子の大きざ：０．５〜０．６μｍｘ０．７〜０．８μ
ｍ 鞭毛胞子の有無：無 胞子のうの有無：無 胞子柄の着生位置：気菌糸 菌核形成性の有無：無 （ｂ）各種培地における生育状態 各種培地における生育状態は、第２表に示す通りである
。

（Ｃ）生理的性質 １）生育温度範囲：２７〜３０’Ｃの温度範囲で良好に
生育するが、４０℃以上の温度では生育しない ２）ゼラチンの液化（グルコース・ペプトンゼラチン培
地、２７℃）：陽性 ３）ミルクの凝固（３７℃）：陽性 ４）ミルクのペプトン化（３７℃）：陽性５）メラミン
様色素の生成： チロシン寒天（ＩＳＰ−７培地）上、ペプトン・酵母エ
キス・鉄基天上及びトリプトン・イースト・ブロス（Ｉ
ＳＰ−１培地）中で陰性６）硫化水素の産生：陽性 ７）スターチの加水分解（ＩＳＰ−４培地）：陽性７）
硝酸塩の還元：陽性 ８）セルロースの分解性：陰性 （ｄ）炭素源の利用性（ブリードハム・ゴトリーブ寒天
培地、ｌ５Ｐ−９培地） ！−−７ラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース
、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニトー
ル、スターチ、マルトース、グリセリンを利用してよく
生育し、シュークロース、イノシトール、ラフィノース
は利用しない。

（ｅ）菌体組成 ベラカー（ＢｅＣｋｅｒ　）らの方法［アプライドミク
ロバイオロジー（ＡｐＤｌ、Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．）
。

１ユ、４２１〜４２３　（１９６４）１により分析した
結果、ＬＬ−型のジアミノピメリン酸が検出された。

以上の菌学的性質、特に基土菌糸より多数の胞子の連鎖
を有する気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸がＬＬ−
型であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成しない性質より、
水Ｃ−１０２７株はストレプトミセス属に属する菌株で
おることが明らかでおる。

また、之等の性状より既知の菌株を検索すると、ストレ
プトミセス・セトニイ（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＳ
ｅｔＯｎｉｉ　　：　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｏｆ’　Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌＯＱＶ、　１９巻、
４８１頁、１９６９年）が最も近縁の種として挙げられ
る。従って、本Ｃ−１０２７株をストレプトミセス・セ
トニイｌ５Ｐ５３９５株と比較検討した結果、両者は基
土菌糸の色がわずかに異なるのみで、他はかなりよく一
致していることが確認された。よって、木様をストレプ
トミセス・セトニイと同定し、これをストレプトミセス
・セトニイＣ−１０２Ｃ−１０２７（Ｓｔｒｅｐｔｏ　
５ｅｔｏｎｉｉ　Ｃ−１０２７＞と命名した。

本発明のＣ−１０２７物質は、例えば上記Ｃ−１０２７
株又はその変異株等のストレプトミセス属に属する各種
のＣ−１０２７物質生産菌を適当な培地で培養すること
により製造できる。

上記微生物の培養は、原則的に一般微生物の培養に準じ
るものであり、通常液体培養による循還培養法、通気撹
拌培養法等の好気的条件下で行なわれるのが好適である
。

培養に用いられる培地としては、Ｃ−１０２７物質生産
菌が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各
種の合成培地、半合成培地、天然培地等をいずれも用い
ることができる。培地組成としては炭素源としてのグル
コース、シュークロース、フラクトース、グリセリン、
デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・ステイープ・リカ
ー、有機酸等を単独又は組合せて用い得る。窒素源とし
てはファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素等の有機窒素源
、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を
単独又は組合せて用い得る。また培地には、ナトリウム
塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その伯の
重金属塩等も必要に応じて適宜添加使用され得る。

尚、培養中発泡の著しい時は、例えば大豆油、亜麻仁油
等の植物油、オクタデカノール、テトラデカノール、ヘ
プタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化
合物等の消泡剤を適宜培地中に添加することもできる。

培地のｐＨは、やや酸性ないし中性付近とするのが好ま
しい。培養温度は、Ｃ−１０２７物質生産菌が良好に生
育する温度、通常約２０〜３７℃、特に好ましくは約２
７〜３０’Ｃ付近に保つのがよい。培養時間は、液体振
盪培養及び通気撹拌培養のいずれの場合も、一般に２〜
５日間程度とされる。上記培養によって目的とするＣ−
１０２７物質が生成蓄積される。勿論上述した各種の培
養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件等に応じ
て適宜変更でき、またそれぞれ応じて上記範囲から最適
条件を選択、調節できる。

上記培養により生産されるＣ−１０２７物質の単離は、
発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて実施でき、
例えば塩析、ハイドロフォービッククロマ１〜グラフイ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種手段を単
独又は任意の順序で組合せることにより実施できる。

より詳しくは、上記培養により生産されるＣ−１０２７
物質は主として培養液体（炉液）中に存在するので、常
法に従いまず濾過、遠心分離等を行なって、培養炉液と
菌体固形分とを分離し、得られる炉液に硫酸アンモニウ
ム等の公知の塩析剤を添加し塩析する。次いで、所望の
Ｃ−１０２７物質を含有する沈澱物を遠心分離するか、
珪藻土等の濾過助剤を添加して濾過する。上記操作の際
、沈澱物の回収を容易にするために、例えばＩａ酸酸第
銑鉄塩化第二鉄、硫酸アルミニウム等のＷｔ集剤を添加
使用することもできる。また上記凝集剤の添加笠により
、溶液のｐＨが大巾に変化する場合は、炭酸ナトリウム
、炭酸カリウム、リン酸−ナトリウム等の中和剤を凝集
剤の添加直前に添加してｐＨを５〜８に保持することも
できる。上記塩析は繰返し行なうこともできる。

上記操作により得られた沈澱物は、次いでこれを水又は
適当な緩衝液、例えばトリス−塩酸緩衝液、リン酸塩緩
衝液等に溶解させ、直接又はセロファン膜、限外濾過膜
等を用いて脱塩した後、更に精製することができる。こ
の精製は、例えばダウエックス１（ダウケミカル社製）
、アンバーライトＩＲＡ−４００（ローム・アンド・ハ
ース社製）等の強塩基性イオン交換樹脂、アンバーライ
トＩＲ−４５（ローム・アンド・ハース社製）、ＤＥＡ
Ｅ−セルロース等の弱塩基性イオン交換樹脂やハイフロ
ース−パーセル（ジョーンズ・マンビル・セールズ社製
）、ハイドロキシアパタイト等の公知の吸着剤に、目的
とするＣ−１０２７物質を含有する水溶液を通して、夾
雑物を吸着除去させ、次いで通過液をイオン交換セフ１
デツクス（ファルマシア社製）、イオン交換セルロース
等に付してＣ−１０２７物質を吸着させ、これを食塩等
の中性塩水溶液、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等
の適当な緩衝液で溶出させることにより行ない得る。上
記で得られるＣ−１０２７物質の水溶液は、これを限外
濾過等により濃縮後、セファデックスＧ−５０，セファ
デックスＧ−７５（いずれもファルマシア社製）等のゲ
ル濾過によって、更に精製できる。また、最終的に得ら
れる精製物に低分子の塩類が含まれる場合には、セファ
デックスＧ−２５（ファルマシア社製）を用いてクロマ
トグラフィーや限外濾過、透析等の通常の手段によりこ
れを除去することができる。尚、上記各種クロマトグラ
フィー操作は之等を繰返し行なうのが、夾雑物の除去に
、より有効である。

上記各種の精製操作及び之等の組合せにより得られる目
的のＣ−１０２７物質含有精製液は、凍結乾燥すること
ができ、これによりＣ−１０２７物質を白色粉末として
収得できる。

本発明のＣ−１０２７物質が単一物質でおることは、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル・ディスク電気泳動での
単一帯、セフ１デツクスＧ−５０（ファルマシア社製）
のカラムクロマトグラフィでの対称型の単一ピーク、Ｔ
ＳＫゲルＧ２０００ＳＷ（東洋曹達社製）を用いた高速
グル濾過クロマトグラフィーにおける単一ピーク、アン
ホライン（ＬＫＢ社製）を用いた等電点電気泳動におけ
る単一帯等によって証明される。

本発明Ｃ−１０２７物質は、上記各種性質を有する点に
おいて特徴付けられると共に、以下の生物学的活性を有
する点においても特徴付けられる。

０抗菌活性 グラム陽性細菌の発育を強く阻害する。本発明Ｃ−１０
２７物質の抗菌活性（抗菌スペクトラム）を、ミュラー
ヒントン寒天培地を用いた系列２倍希釈法に従い測定し
た。得られた最小発育阻止濃度（）１．１．Ｃ，）を、
下記第３表に示す。

上記第３表から、本発明Ｃ−１０２７物質はグラム陽性
細菌を強く阻害することが判る。

０抗腫瘍活性 本発明Ｃ−１０２７物質の抗ｌ瘍活性を、次に示すよう
にマウス白血病に対する延命効果により判定した。即ち
、試験動物としてＢＡＬ／ＣとＤＢＡ／２の交配第一代
マウス（ＢＤＦｔマウス）を各群６匹用い、ＤＢＡ／２
マウス由来の白血病Ｐ３８８細胞の１００個を腹腔内移
植してＰ３８８！白血病担癌マウスを作成した。上記移
植の翌日より第１．５．９日目に生理食塩水に溶解した
Ｃ−１０２７物質を０．３３ｍＭｋｑ腹腔内投与腹腔上
記担癌マウスの生存日数を観察した。

また同様にして、Ｌ１２’ｌ’Ｏ白血病担癌マウスを作
成し、同様にＣ−１０２７物質の０．５ｍｑ／ｋａ＠−
腹腔内投与し、その生存日数を観察した。

得られた生存日数から下式に従い延命率を求めた。結果
を第４表に示す。

またマウスザルコーマ１８０　（Ｓａｒｃｏｍａｌ　８
０　）皮下移植系に対しても、本発明Ｃ−１０２７物質
は腫瘍増殖抑制効果が認められる。その試験管内ＫＢｉ
ｌｌ胞に対する殺細胞効果でのＥＤ５ｏ値（５０％有効
量）は、０．００１〜０．０００１μΩ／ｍｌと非常に
低い値を示す。

上記の通り、本発明Ｃ−１０２７物質は、微量で抗体腫
瘍作用を有する点において注目される。

また、本発明Ｃ−１０２７物質のｐＨ，温度及び光に対
する安定性を調べた結果は次の通りである。即ち、３７
℃の水溶液中、ｐ）−１４〜９では比較的安定であるが
、強酸、強アルカリでは急速に活性を失う。室温に放置
すれば徐々に活性が低下゛する。数十分間の紫外線照射
で活性は殆んど失われる。

夫−一簾−−舅 以下、本発明のＣ−１０２７物質の製造例を実施例とし
て挙げる。

なお、精製工程中の有効物質のｒＩｆｆ認は、Ｃ−１０
２７物質により増殖抑制作用のみられるスタフィロコッ
カス・アウレウス　２０９Ｐ（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ　　２０９　Ｐ　）　、ミク
ロコツカス・ルデウス　ＡＴＣＣ９３４１（Ｍｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　　１ｕｔｅｕｓ　　ＡＴＣＣ９３４１）
等の微生物を用いたバイオアッセイ法又はヒト鼻咽腔病
由来の株化培養細胞（ＫＢ細胞）に対する殺細胞効果を
調べることにより行なった。

実施例　１ グリセロール２．０％、デキストリン２．０％、ソイ１
〜ン１．０％、酵母エキス０．３％、硫酸アンモニウム
０．２％及び炭酸カルシウム０．２％よりなる培地（１
）Ｈ６，６＞１００鵬を、５００誰の三角フラスコに分
注し、滅菌１変、該培地にス［−レプトミセス　セトニ
イ　Ｃ−１０２７株（微工研条奇第１２９９号）の−白
金耳量を接種し、２７℃で４８時間回転振盪培養した（
毎分１８０回転、娠幅１０Ｃｍ）。次にグリセロール２
．０％、デキストリン２．０％、フィツシュミール１．
０％、プロテオースペブトン０．５％、硫酸アンモニウ
ム０．２％及び炭酸カルシウム０．２％よりなる培地（
ｐＨ６，８）を５００ｍＧの三角フラスコに１００１Ｔ
ＩＩ２ずつ分注し、滅菌後、上記の種菌を５％の割合で
加え、２７℃で、９６時間回転振盪培養した。

培益終了後、培養液（ｐＨ８，０＞１０Ｑを採取し、遠
心、濾過後、得られた培養炉液７．ＯＱを塩酸でＤＨ４
，０に調整し、硫酸アンモニウム３．５ｋｇを溶解後、
５℃で３時間撹拌した。析出したＣ−１０２７物質を含
む沈澱を遠心分離（５°Ｃ１３０００ｒ、ｐ、ｍ、、３
０分）して集めた。得られた沈澱物を４００−戒の脱イ
オン水に溶解させ、セロファン膜を用いて透析後、凍結
乾燥して、粗粉末５．３０を得た。

上記粗粉末２．０ｇを４００−の脱イオン水に溶解させ
、遠心分離（５°Ｃ％　３０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分
）により不溶物を除去した後、ＤＥＡＥ−セルロース（
和光純薬株式会社製）を充填したカラムに通して、活性
物質を吸着させた。脱イオン水４００１＋１１２で洗浄
後、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出させ、得られた
活性画分１１２鵬をセロファン膜を用いて冷脱イオン水
に対して透析し、透析内液を凍結乾燥した。

かくして得られた粗精製物２４５ｍ０を水に溶解させ、
セフ１デックスＧ−５０（ファルマシア社製）を充填し
たカラムに添加し、脱イオン水でクロマトグラフィーを
行ない、活性を示す両分８０鵬を凍結乾燥して白色粉末
１２０ｍｏを得た。これを再度水に溶解後、セフ１デッ
クスＧ−７５（ファルマシア社製）を充填したカラムを
用いて同様にしてクロマトグラフィーを行なった。活性
画分を集め、凍結乾燥して、目的とするＣ−１０２７甥
質の白色粉末６２ｍｇを得た。

得られたＣ−１０２７物質の諸性質及び生物学的特性は
前述した通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、水、０．０１Ｎ塩酸及び０．０１Ｎ水酸化ナ
トリウム水溶液中のそれぞれで測定したＣ−１０２７物
質の紫外部吸収スペクトルの結果を示す図であり、第２
図は臭化カリウム錠剤法で測定した同Ｃ−１０２７物質
の赤外部吸収スペクトルの結果を示す図である。 （以　上）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の性質を有するＣ−１０２７物質。 ・性状：白色粉末 ・溶解性：水に易溶であるが、メタノール、エタノール
   、アセトン、酢酸エチルには溶けない ・紫外部吸収スペクトル： 中・酸性水溶液中では２７０〜２７５ｎｍ及び３５０〜
   ３６０ｎｍに、アルカリ性水溶液中では２７０〜２７５
   ｎｍ及び３４０〜３４５ｎｍに吸収極大を示す ・赤外部吸収スペクトル： ３３００、１６４０、１５３０ｃｍ＾−＾１に大きな吸
   収を示す ・融点：明確な融点、分解点を示さず、発泡しつつ徐々
   に褐変・炭化し、２６０℃で完全に炭化する ・呈色反応：ニンヒドリン、ビューレット、フォーリン
   −ロウリィ反応に陽性で、アンスロン、アニリン−フタ
   ル酸反応に陰性である ・等電点：ＰＨ３．５〜３．７である ・塩基性、酸性、中性の区別：酸性を呈する・元素分析
   ：炭素４５．２２％、水素６．６５％、窒素１４．０３
   ％である ・分子量：ゲルろ過法及びＳＤＳ−ポリアクリルアミド
   ゲル電気泳動法により測定される分子量は、約１５００
   ０である ・アミノ酸構成：加水分解によって検出されるアミノ酸
   は、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、グルタミン
   酸、プロリン、グリシン、アラニン、シスチン、バリン
   、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニ
   ン、ヒスチジン、リジン、アルギニンである。 ・Ｎ末端アミノ酸：アラニンである。