JPH01112158A - 抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は免疫学的な測定試薬の製造方法に関し、更に詳
しくは抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子の製造
方法に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

従来、担体粒子に物理吸着あるいは共有結合の形成によ
り抗体または抗原などの免疫学的活性物質固定化担体粒
子（以下固定化担体粒子と略す）と血清や尿等の被検体
中の対応する抗原または抗体との間における抗原抗体反
応による凝集反応あるいは凝集阻止反応を観察すること
により、被検体中の対応する抗原または抗体を測定する
免疫学的測定方法が知られている。上記固定化担体粒子
を用いる測定方法は被検体中に含まれる微量成分を迅速
に、高精度でかつ簡便に測定できるため広く利用されて
いる。

古くは上記固定化担体粒子と被検体とを反応板上で混合
し、抗原抗体反応に基づく凝集もしくは凝集阻止反応を
行ない凝集像を肉眼で判定して被検体中の対応する抗原
又は抗体を定性的に測定していた。近年上記凝集反応物
を光学的に測定する事により被検体中の抗原又は抗体を
定量的に測定することが可能となった。

この様な固定化担体粒子を用いた免疫学的測定方法にお
いて最も重要な事は、固定化担体粒子の粒子径の均一性
である。

抗体又は抗原を固定化する際に担体粒子と混合する過程
において以下の現象が起こる。

すなわち、抗体又は抗原がある担体粒子の表面に固定化
されていく過程で、粒子表面には未だ未固定の部分が残
っていて、固定化された抗体又は抗原はさらに担体粒子
表面に吸着あるいは共有結合が可能であるため、他の担
体粒子の未固定の部分が接触すると、担体粒子の凝集が
起こる。この様に担体粒子同志か凝集する固定化条件下
では均一な粒子径を示す固定化担体粒子を得ることがで
きず粒子径に分布が生じる。粒子径の分布が広がると特
に定量的な測定方法において定量性が損われるのみなら
ず、定性的な測定方法においても凝集の有無の差が減少
し判定が困難となる。

さらにはかかる固定化条件下で同一の凝集粒子径の分布
を持つ固定化担体粒子を再現よく製造することが困難と
なる。

従来固定化する方法としては担体粒子の懸濁液に、抗体
又は抗原の溶液を加え直ちに攪拌混合する方法が行なわ
れていた。この方法においては抗体又は抗原の添加量を
担体粒子の固定化可能な表面積に比較して多く使用し、
混合時に各担体粒子表面をすみやかに抗体又は抗原に覆
い、上記担体粒子同志の凝集反応を抑制する必要がある
。さらには短時間内に攪拌混合する必要がある為に、固
定化の量を増加すると混合が不充分となり得られる固定
化担体粒子の凝集が増加するので、大量に製造する場合
は固定化を何度も繰り返す操作が必要となる。

上記とは逆に抗体又は抗原の溶液に担体粒子の懸濁液を
添加する方法では、先に添加された粒子が多くの抗体又
は抗原を固定化し、添加が進むと溶液中の未固定の抗体
又は抗原量が減少して、添加終了直前の担体粒子は凝集
粒子を形成しやすくなる欠点を有する。従つて、この方
法では添加を一層迅速に行なう必要がある。以上の如〈
従来の抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子の製造
方法においては、固定化担体粒子が凝集粒子を形成しや
すい問題があった。この為、従来法は大量生産に不適当
で、又、製造ことに得られる試薬の特性を一定に保つ事
が困難であった。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者らは固定化時の不溶性担体粒子の凝集を抑制し
、一定性能の免疫学的測定試薬を大量に得る方法を鋭意
研究して来た。

その結果、本発明者らは詳しくは後述するが抗体又は抗
原を固定化した不溶性担体粒子を製造するに際し、供給
口を複数個有し取出口を唯一有する混合器を用い、該不
溶性担体粒子と抗体又は抗原とをそれぞれ別個の供給口
から供給し両者を混合後取出口から採取する方法により
固定化時の不溶性担体粒子の凝集が抑制でき、一定性能
の免疫学的測定試薬を大量製造しうる事を見出した。

そして、この製造方法によれば実験室的な試験管スケー
ルで得た固定化条件が、そのまま工業的規模での大量生
産時の固定化条件として利用できるメリットがあること
を見出し本発明を完成させ、ここに提案するに至った。

即ち、本発明は、抗体又は抗原を固定化した不溶性担体
粒子を製造するに際し、供給口を複数個有し取出口を唯
一有する混合器を用い、該不溶性担体粒子と抗体又は抗
原とをそれぞれ別個の供給口から供給し、両者を混合後
取出口から採取することを特徴とする抗体又は抗原を固
定化した不溶性担体粒子の製造方法である。

本発明において、抗体又は抗原を不溶性担体粒子に固定
化する。

上記固定化される抗体又は抗原は特に限定的ではなく、
公知のものが使用できる。好適に使用できる代表的なも
のを例示すれは、例えばヒトアルブミン、抗ヒトアルブ
ミン抗体。

ヒトイムノグロブリンＧ（ヒトＩｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ
抗体、ヒトイムノグロブリンＡ（ヒトＩ　ｇ　Ａ）　ｅ
抗ヒトＩｇＡ抗体、ヒトイムノグロブリンＭ（ヒトＩ　
ｇ　Ｍ　）　＋　抗ヒトエｇＭ抗体、ヒトイムノグロブ
リンＥ（ヒトエｇＥ＞、抗ヒトＩｇＥ抗体、ヒトＣ−反
応性蛋白質（ヒトＣＲＰ）、抗ヒトＣＲＰ抗体。

アルファフェトプロティン（ＡＦＰ）、抗ＡＦＰ抗体、
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、抗ＣＥＡ抗体、ヒト繊毛性ゴ
ナドトロピン（ＨＣＧ）。

抗ＨＣＧ抗体、インシュリン、抗インシュリン抗体、Ｂ
型肝炎表面抗原（ＨＢｓ）、抗ＨＢ８抗体、補体ＣＩｇ
、抗ｃｒｇ抗体、補体Ｃ３＋抗Ｃ３抗体、補体Ｃ４１抗
Ｃ４抗体。

フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、　抗ＦＤＰ抗体
、変性ヒトγ−グロブリン、リウマチ因子等である。

不溶性担体粒子としては固定化、保存、及び測定を行な
う時に用いられる液体媒体に実質的に不溶性の不溶性担
体粒子であり、詳しくは後述するが平均粒子径１０μｍ
程度以下の微粒子が好適に用いられる。

これらの粒子はすでに抗原抗体反応に使用されるものが
種々知られていて、本発明にあってもこれらの公知の微
粒子が特に限定されず使用できる。特に好適に使用され
るものを例示すると例えば、ポリスチレン、スチレン−
ブタジェン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体
、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチ
レングリコールジメタクリレート共重合体の様な乳化重
合により得られる有機高分子ラテックス等の有機高分子
物質の微粒子、あるいはシリカ、シリカ−アルミナ、ア
ルミナの様な無機酸化物又は該無機酸化物等にシランカ
ップリング処理等の操作で官能基を導入した無機粒子さ
らにはヒトＯ型赤血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒
子等である。

上記不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が大き
い場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大きいが凝集
反応速度が遅く、粒子径が小さいとブラウン運動性が活
発で凝集反応速度は速いが一次粒子径が小さいために凝
集反応にともなう粒子径の変化量が小さい。

この為に凝集反応に用いられる不溶性担体粒子の平均粒
子径は１０μｍ程度以下、好ましくは０．０５〜５０μ
ｍの不溶性担体粒子が好適に用いられる。

被検体中の抗原又は抗体を光学的測定方法で定量する場
合、測定に用いる光線の波長は反応の進行にともなう透
過光又は散乱光の変化が比較的大きく感度に優れ、かつ
検体中に通常共存する乳ビ、ヘモグロビン、ビリルビン
等の干渉が比較的少ない４００〜１１０００ｎ好ましく
は５００〜９５０　ｎｍの範囲の波長が好適に使用され
る。光学的に測定する場合は使用する光線の波長を勘案
して使用する粒子径を選べば良く、平均粒子径００５〜
０．５μｍの不溶性担体粒子が特に好適に使用される。

本発明において、抗体又は抗原を不溶性担体位子に固定
化する方法は、物理的吸着、化学的共有結合の形成のい
ずれでも良いが、物理的吸着能が比較的高い蛋白質例え
ば抗体や高分子量蛋白質の固定化には物理的吸着が好適
に用いられる。一方、物理的吸着能に劣る親水性の高い
蛋白質、及び低分子量抗原等を固定化する場合、又は脱
着を避けたい場合には化学的共有結合の形成を行なうと
良い。化学的共有結合についてはすでに多くの方法が提
案されており、固定化する抗体の特性に合わせ公知の方
法から固定化方法を選択すると良い。

一般には分散媒中で抗体又は抗原を、必要に応じて架橋
剤の存在下に不溶性担体粒子と混合すれば良い。架橋剤
としてはグルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド壌酸塩等の公
知のものが使用できる。

抗体又は抗原を不溶性担体粒子に固定化する際の分散媒
は特に限定的ではなく公知のものが使用されるが、上記
の架橋剤を使用する場合には分散媒中の成分が架橋剤と
反応しない分散媒を用いる必要がある。好適に使用され
る分散媒としてはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、
トリス−塩酸緩衝液、塩化アンモニウム−アンモニア緩
衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液が好適に使用される。固
定化する際の不溶性担体粒子の分散媒中の濃度は特に限
定されるものではないが、一般には抗体又は抗原と混合
された時点で０．０５５重量％上、好ましくは０．２〜
２０重量％となる様に選ぶのが好適である。抗体又は抗
原の濃度も特に限定されるものではないが、一般には不
溶性担体粒子と混合された時点で０．０００５重量％以
上、好ましくは０．００２〜０．２重量％となる様に選
ぶのが好適である。不溶性担体粒子と抗体又は抗原の濃
度比は不溶性担体粒子の粒子径、固定化可能な表面積の
割合及び抗体又は抗原の種類、並びに固定化する為に混
合する際の不溶性担体粒子の分散液と抗体又は抗原溶解
液との液量等を種々勘案して決定すれば良い。

本発明においては、供給口を複数個有し取出口を唯一有
する混合器を用いる。すなわち少くとも２個の供給口を
有し、不溶性担体粒子の分散液及び抗体又は抗原の溶解
液とを各々独立して供給できる構造を有し、かつ取出口
を唯一有して、上記両液を混合後排出しつる構造となっ
ている事が必須である。上記の機能を有する混合器とし
て例えば、Ｙ字状に管を組み合わせた混合器、及び１字
状に管を組み合わせた混合器が挙げられる。本発明の混
合器においては混合部の断面積を考慮すると一層効果的
である。混合部の断面積があまりに広いと異なる液が充
分混合されず本発明による混合器の効果が発揮でき；が
たくなる。

このため、本発明による混合器の混合部における断面積
は５ｃ１１！程度以下とするのが良い。

本発明において混合部の断面積とは、上記Ｙ字管及び１
字管の場合、第１図及び第２図の８１．８２に示す位置
の断面積である。さらに好ましくは断面積Ｓ１．Ｓ２を
各々０．２−以下として混合器を設計すれば良い。

第３図には本発明の一態様として２重管構造を有する混
合器の管径に垂直な方向の断面を示した。上記混合器は
内管４と外管５より成り、内管４の一端が供給口２とな
り例えば不溶性担体粒子の分散液を供給する。一方、例
えば抗体の溶解液を内管４と外管５との間隙に供給する
。このため外管５の一部を封じ供給口】を設ければ良い
。外管５の他端には取出口３を設ける。この際、第３図
に示した如く管径を小さくしても良い。

上記混合器について混合部の断面積は上記混合器の管径
に水平な方向の断面を示した第４図における８１．８２
に相当する。

また、１本の管の中間に取出口用の穴を設け、両端を供
給口とした混合器でも良い。

さらには供給口を３個以上設け、うち２個の供給口は不
溶性担体及び抗体又は抗原の溶解液の供給に用いる。残
りの供給口より例えば架橋剤の溶解液又は固定化担体粒
子の希釈用の緩衝液等を供給しても良い。

本発明における混合器は、その混合部にじゃま板等の混
合を促進する構造を持たせても良い。

本発明において、液の供給速度は限定的ではない。又、
異なる液を２つの供給口より断続的に供給しても本発明
の効果が得られる。

−船釣には、混合部の断面積を小さくし液の供給速度を
速くすることにより、異なる液が充分混合されるため、
固定化担体粒子の凝集の発生が抑制される。

本発明において、混合器に液を供給する方法としては例
えば混合器と各液の入った注射器とをゴム管等で各々接
続し、液を圧入すればよい。また混合後の固定化担体粒
子を取り出す方法としては取出口よりゴム管等で受器に
導けば良い。受器側を減圧に保持した場合は、供給側か
ら圧入する必要はなく自動的に供給、混合が可能となる
。

本発明において、混合器の材質は特に限定はされないが
、使用する液に溶解する成分を含む材質は好ましくない
。好適に使用できる代表的なものを例示すれば、例えば
、ポリスチレン、ポリエチレン、ボリプ四ピレン、ポリ
カーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタ
レート、ポリメタクリル酸メチル、テフロン等の合成樹
脂、シリコンゴム。

ウレタンゴム等の合成ゴム、ガラス、及びステンレス、
アルミ等の金属等である。

上記混合器と接続する管及び注射器等の材質も同様のも
のを使用すれば良い。

なお混合器の供給口、取出口、混合部等の形状及び寸法
は、混合する不溶性担体、及び抗体又は抗原の種類、濃
度、供給量１等を勘案し決定すれば良い。

〔作用及び効果〕

本発明の混合器は不溶性担体分散液と抗体又抗原の溶解
液とをそれぞれ別個の供給口から供給し、両者を混合後
、取出口から採取することを特徴とする。

本発明による抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子
の製造方法と従来法とを比較すると、本発明による製造
方法により得られる固定化担体粒子は凝集が少なく、か
つくり返し製造ごとに得られる固定化担体粒子の特性が
均一で、かつ大量に製造出来、工業的に極めて有効な方
法である。この原因につき本発明者らは、混合器内の両
液の合流部分において上記２液の混合が極めて短時間の
うちに均一に混合される為と考えろ。これに対し上記２
液のうちの一方に他方の液を添加する従来の方法は、本
発明の方法と比較して２液が均一混合するのに多くの時
間を必要とし、結果として不溶性担体粒子への抗体又は
抗原の固定化状態が粒子ことに不均一となり、粒子表面
が抗体又は抗原で充分筒われない粒子が発生しやすくな
る。この粒子は抗体又は抗原をさらに固定化できる為に
、他の粒子上に固定化した抗体又は抗原を固定化し、結
果として凝集粒子を発生しやすくする。

さらには、くり返し同一の混合状態を再現する事が困難
であり、製造ごとに固定化担体粒子の特性が変動しやす
くなる。

〔実施例〕

以下、実施例によりさらに本発明の詳細な説明するが本
発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１ （＆）　　変性ヒトγ−グロブリン固定化ラテックス分
散液の調製平均粒子径０．１３１μｍのポリスチレンラ
テックス粒子（担体粒子）を０．０５Ｍグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液ＰＨ８，５（以下緩衝液Ａ）で希釈
し、ラテックス濃度が１重量％の分散液を調製１〜だ。

次いで、ヒト血清から塩析処理により分画したヒトγ−
グロブリンを、生理食塩水及び水に対して透析した後、
さらに緩衝液Ａに対して透析した。得られたヒトγ−グ
ロブリン溶液を緩衝液Ａで希釈して蛋白濃度を１０■／
−に調製した。次いで、ヒトγ−グロブリン溶液を６０
℃、３０分加熱し、変性ヒトγ−グロブリン溶液を得た
。

混合器として、内径２ｕのガラス管をＴ字型に連結した
Ｔ字管（８１，Ｓ２はおよそ０．０３ｄ）を製作した。

ガラス製注射器で上記ラテックス分散液を１ｍの目盛り
の位置まで採取し、シリコンゴム製のチューブを用いて
該丁字管の一端に連結した。同様に変性ヒトγ−グロブ
リン溶液１−をガラス製注射器で採取し、該丁字管の他
の一端に接続した。接続位置は、ラテックス分散液及び
変性ヒトγ−グロブリン溶液の供給口の間の角度が１８
００取出口と各々の供給口との間の角度が９０゜となる
様に配置した。なお、注射器の先端からＴ字管の混合部
までの距離は各々２゜ｎとした。ラテックス分散液及び
変性ヒトγ−グロブリン溶液を以下の■〜■の条件で混
合器に等量供給した。

■　１−ずつを−括供給した。

■　０．５−ずつ２回に分割して供給した。

■　０．２−ずつ５回に分割して供給した。

■　ｏ、ｏｓｄｆつ２０回に分割して供給した。

いずれの条件においても特に攪拌や混合は行なわなかっ
た。取出口にプラスチック製の遠心チューブを置き、得
られた反応物を採取した。次いで、遠心分離し上清を除
去した後、沈澱にウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略
す）を０．０５重量％の濃度で添加した緩衝液Ａを加え
再分散し、さらに緩衝液Ａを加えてラテックス濃度を０
．０５重ｉｔ％に調製し、変性ヒトγ−グロブリン固定
化ラテックス分散液（免疫学的測定試薬）を得た。

（１）、ｌ　　吸光度の測定 光路長１０襲の光学セルを用い、波長 ６００　ｒｌｎにおける測定試薬の吸光度な測定した。

前記各種変性ヒトγ−グロブリン固定化ラテックス分散
液の吸光度は、条件■の場合０．６９．条件■の場合０
７０１条件■の場合０．７０．条件■の場合０．７１を
示し、混合条件が変わっても得られる吸光度の変化は認
められなかった。尚、原料に用いたラテックスを緩衝液
Ａで０．０５重量％に希釈した分散液は吸光度０．６０
を示した。ところで、吸光度０．７０を粒子径に換算す
るとおよそ０．１４μｍに相当する。

（Ｃ）免疫学的測定試薬の評価 免疫学的活性物質として変性ヒトγ−グロブリン（抗原
）を固定化した前記試薬は、リウマチ因子（抗体）の検
出試薬として用いることができる。

この検出試薬１滴と各種のリウマチ因子陽性血清又は陰
性血清１滴とをガラス板上で混合し、１０分後にラテッ
クス粒子の凝集状態を肉眼で判定した。結果を第１表に
示した。

本発明による測定試薬においては供給条件による試薬特
性の差異が認められなかった。

又、陰性血清に対してはいずれの試薬も←）を示し非特
異的凝集反応を起こさなかった。

比較例１ （＆）　　変性ヒトγ−グロブリン固定化ラテックス分
散液の調製 実施例１と同一のラテックス分散液１ｄをガラス製試験
管に採取した。実施例１と同一の変性ヒトγ−グロブリ
ン溶液をガラス製注射器で採取し、ラテックス分散液に
対し以下の（１〕〜（４）の条件で添加した。

（１）１−を−括添加した。

（２３０，５−ずつ２回に分割して添加した。

（３）　　Ｑ、２ｍスつ５回に分割して添加した。

（４）　　０．０５　ｌＶｌ！ずつ２０回に分割して添
加した。

分割して添加する場合は添加ごとに試験管の内容物を試
験管ミキサーで混合した。。

次Ｌ％で遠心分子Ｉ１１を上清を除去した後、実流側１
と同様にして０．０５重量％の変性ヒトγ−グロブリン
固定化うテックス分散液を調製した。

（ｂ）　　吸光度の測定 得られた変性ヒトγ−グロブリン固定化うテックス分散
液の吸光度を実施例１と同様に測定した。吸光度は添加
条件により大きく変化し、条件（１）で得られた分散液
では０７５、条件（２）では０．８１．条件Ｏ）では１
．２０゜条件（４）では１．７８と分割回数が増加する
にともない吸光度が増加した。

なお、吸光度１７Ｂを粒子径に換算するとおよそ０．２
４μｍに相当し、実施例１と比較して固定化時に凝集粒
子が発生しやすい事を示した。

（Ｑ）　　免疫学的測定試薬の評価 実施例１と同様に上記試薬を評価した。

得られた結果を第２表に示した。

第２表から明らかな如く、本発明による混合器を使用し
ない場合は、添加条件により得られる試薬の特性が大き
く変化した。添加の分割回数が最も多い条件（４）で得
た試薬は陰性血清に対しても凝集し、臨床上好ましくな
い非特異凝集を示したものと考えられた。

上記のごとく、本発明による混合器を用いて担体粒子に
免疫活性物質を添加した場合は、供給条件による試薬特
性の差異が認められなかった。これに対し混合器を用い
ずに担体粒子に免疫活性物質を添加した場合は添加条件
により試薬特性が大きく変化した。

さらに実施例１の供給条件■及び比較例１の添加条件（
１）の方法で、各々１０回試薬を調製した。得られた試
薬の吸光度の平均値で、標準偏差値を除して得た変動係
数は実施例１の場合１．５％であり、比較例１の場合５
．８％となった。比較例１の場合、添加する変性ヒトγ
−グロブリンの添加条件及び添加された後の拡散を試薬
調製ことに完全に再現する事が極めて困難であることを
示した。

実施例２ （ＩＬ）　　抗ヒ）ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液
の調製 ヒトＣ−反応性蛋白質（以下ヒ）ＣＲＰ）をヤギに免疫
して得た抗ヒ）ＣＲＰ血清から塩析処理により抗と）Ｃ
ＲＰ抗体を分画した。

次いで、抗ヒトＣＲＰ抗体を０．０５Ｍ塩化アンモニウ
ム−アンモニア緩衝液（以下緩衝液Ｂ）で希釈して、蛋
白濃度が２１１ｇ／−の抗ヒ）ＣＲＰ抗体溶液を調製し
た。

緩衝液Ａに代えて緩衝液Ｂを、変性ヒトγ−グ四プリン
に変えて抗ヒトＣＲＰ抗体を用い、実施例１の供給条件
■〜■に代えて以下の■及び■の供給条件を用いる以外
は実施例１と同様にして抗ヒ）ＣＲＰ抗体感作ラテック
ス分散液を調製した。なお混合器は実施例１と同一の混
合器を用いた。

■ラテックス分散液及び抗ヒ）ＣＲＰ抗体溶液各２−ず
つを一括して供給した。

■ラテックス分散液及び抗ヒトＣＲＰ抗体溶液各５ｊｌ
／ずつを一括して供給した。

取出口より反応物を試験管にとり、３７℃に加温して２
時間静置した。次いで、各反応物２−をプラスチック製
の遠心チューブに移し遠心分離し、上清を除去した。得
られた沈澱に、ＢＳＡを２Ｑ／Ｍｌの濃度で含む緩衝液
Ｂを２縦加え再分散した。次いで３７℃に加温して２時
間静置した。この操作により、担体粒子表面で抗体が吸
着しなかった部分に上記ＢＳＡを吸着せしめて担体粒子
の非特異的な凝集を防止した。

次いで、１回目の遠心分離操作で残留した来吸着の抗体
及び余剰のＢＳＡを除去する目的で再び遠心分離を行な
い、上清を除去した。得られた沈澱に緩衝液Ｂを加え再
分散し、ラテックス濃度を０．０５重量％に調製し、抗
ヒ）ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液（免疫学的測定
試薬）を得た。

（ｂ）　　吸光度の測定 実施例１と同様にして、得られた固定化ラテックス分散
液の吸光度を測定した。得られた吸光度は条件［Ｆ］、
■ともに０，７５であった。なお、吸光度０．７５を粒
子径に換算するとおよそ０．１４μｍに相当し、後述す
る比較例に比して明らかに凝集粒子の発生が抑制された
。

（ｅ）　　免疫学的測定試薬の評価 免疫学的活性物質として抗ヒ）ＣＲＰ抗体を固定化した
上記試薬は、ヒ）ＣＲＰの定量試薬として用いることが
できる。

日立製作所製Ｕ−３２００型自記分光光度計の測光部に
、温度調節器及びマグネット式攪拌装置を取り付けた装
置により吸光度を測定した。光路長１０ｍのガラス製光
学セルに上記試薬２ｍｌを分注し、円筒状の攪拌子を入
れ、測光部に挿入し、３７℃に保温した。

次いで、該攪拌装置により該容器中の試薬を攪拌しつつ
、検体２０μｌを添加した。

添加と同時に吸光度の測定を開始した。吸光度の測定は
５８０　ｍｍの波長の光線を用いて行なった。なお、攪
拌は検体添加１０秒後に停止した。測定に用いた検体は
ヒ）ＣＲＰ濃度２４０諺９／ｄｌの精製ヒ）ＣＲＰ溶液
をヒトＣＲＰｔ［収処理して実質的にヒ）ＣＲＰを含ま
ない状態としたヒ）ＣＲＰ不含血清により希釈して、ヒ
トＣＲＰ濃度が１．０．ＺＯ。

３．０．４．０．５．０．６．０■／Ｌｉｌとなるよう
に調製した。

得られた吸光度のうち、検体添加１分後と２分後の吸光
度より１分間の吸光度の差すなわち吸光度の増加速度を
求めた。この結果を第３表に示す。

比較例２ 実施例２の混合器を用いる方法にかえて、抗ヒ）ＣＲＰ
抗体溶液を試験管にあらかじめ採取しておき、ガラス製
注射器でラテックス分散液を一括添加する以外は実施例
２と同様にして、抗ヒトＣＲＰ抗体固定化ラテックス分
散液を調製した。

ラテックス分散液の添加条件は以下の（５）。

（６）の条件によった。

（５）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液２−にラテックス分散液２
１を一括添加した。

（６）抗ヒトＣＲＰ抗体溶液５ｄにラテックス分散液５
−を−括添加した。

添加後試験管ミキサーで混合し、３７℃に加温して２時
間静置した。次いで、実施例２と同様に操作して抗ヒ）
ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液を得た。

（ｂ）　　吸光度の測定 実施例１と同様にして、得られた固定化ラテックス分散
液の吸光度を測定した。得られた吸光度は条件（５）で
Ｏ，ＳＯ，条件（６）で１．１０であった。吸光度０．
８０及び１．１０を粒子径に換算するとそれぞれおよそ
０．１５μｍ及び００１７μ扉に相当する。

（ｃ）　　免疫学的測定試薬の評価 実施例２と同様にして上記試薬を評価した。得られた結
果を第４表に示した。

上記実施例２並びに比較例２の免疫学的測定試薬として
の評価の結果を図に示した。

図５は横軸が検体中のＣＲＰ　（抗原）濃度を示し、縦
軸は各試薬における吸光度増加速度を示す。実施例２の
条件Ｏ１■の結果を各々（○）及び（Δ）で示し、比較
例２の条件（５）、　（６）の結果を各々（・）及び（
ム）で示した。プロットした各点を直線で結び検量線を
得た。図中、直ｉ１は実施例２０条件■、■の検量線を
示し、直Ｍ２及び直線３は各々比較例２０条件（５）、
　（６）の検量線を示す。

第３表、第４表及び第５図から明らかな如く、本発明に
よる混合器を用いた場合、供給する液量により得られる
免疫学的測定試薬の特性は変化しないが、本発明による
混合器を用いない場合は固定化する液量により免疫学的
測定試薬の特性が大きく変化する。比較例で得た試薬の
場合、固定化する液量の増加にともない検量線の上限が
低下する傾向が認められた。又、上記の吸光度測定の結
果から固走化する液量が増加すると、固定化ラテックス
担体粒子の凝集度が増す傾向が認められた。

以上の結果より従来法においては、得られる試薬量を増
すためには、１回当りの固定化量を増す方法は好ましく
なく、固定化の回数を増す事が必要となる。一方本発明
による方法においては、１回当りの固定化量を増しても
同一性能の試薬が得られる特徴がある。

実施例３ （＆）　　抗ヒトＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液の
調製 混合器として内径２ｍのポリプロピレン製Ｙ字管（Ｓｌ
がおよそ０．０５ｍ’）を用い、２５１用ポリプロピレ
ン製注射器２ケとウレタンゴム製チューブで連結した。

注射器には、あらかじめ実施例２と同一の抗体溶液及び
ラテックス分散液を各々２５１ｊ！ずつ採取しておき、
−括して混合器に供給し、取出口より反応物５０ｄをプ
ラスチック製遠心チューブに取り、３７℃に加温して２
時間静置した。次いで、高速遠心時に起りやすい、担体
粒子の圧着を防止する目的でウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）０．０１．９を添加し、遠心分離を行なう。上清を
除去した後、沈澱にＢＳＡを２　ｍｇ　／　ｗｉｔ含む
緩衝液Ｂを５０−を加え再分散した。次いで、３７℃に
加温して２時間静置した。再び遠心分離を行ない上清を
除去した後、緩衝液Ｂを加え再分散し、ラテックス濃度
を０．０５重量％に調製した。

（＋））　　吸光度の測定 実施例１と同様にして、得られた固定化ラテックス分散
液の吸光度を測定したところ０．７６であり、実施例２
と一致した。

（Ｑ）　　免疫学的測定試薬の評価 実施例２と同一の方法で評価した。吸光度増加速度はＣ
ＲＰ濃度が０．　１．０．２０゜３．０．４．０．５．
０．６．０　（冨ｇ／ｄｌ）に対しそれぞれ０．３１，
６１，９３，１２３゜１５４、　　ｔｓｏ　　（１０−
３／１＋１１１）　　となり、実施例２と同一の試薬特
性を示した。

実施例４ （ａ）　　抗ヒ）ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液の
調製 混合器として内径１ｃｘのポリプロピレン製Ｙ字管（８
１がおよそ１．１ｃ＋ｉ）を用い、１１ｍ分液ロート２
ヶと連結した。分液ロートにはあらかじめ実施例２と同
一の抗体溶液及びラテックス分散液を各ｌｌずつ採取し
ておき、分液ロートに窒素で圧をかけながら一括して供
給した。得られた固定化ラテックス分散液を５Ｑｍ容量
のプラスチック製遠心チューブに分注し、実施例３と同
様にして抗ヒ）ＣＲＰ抗体固定化ラテックス分散液を得
た。

（ｂ）及び（ａ）吸光度の測定及び免疫学的測定試薬の
評価 実施例１と同様に吸光度を測定したところ得られた試薬
の吸光度は０．７６で実施例２及び３と一致した。

実施例２と同様に免疫学的測定試薬の評価を行なった。

吸光度増加速度はＣＲＰ濃度が０、　１．０．　ｚｏ、
　ａ、ｏ、　ｔｏ、　ｓ、ｏ、　６．０　（ｍｇ／＃）
に対しそれぞれ０，３０，６０，９２，１２１゜１５０
．１７８．　　（１０−３７ｍ）　　となり、実施例２
と同一の試薬特性を示した。

実施例５ （＆）　　共有結合を形成する担体粒子の合成反応性の
高いエポキシ基を側鎖に有するグリシジルメタクリレー
ト（以下ＧＭＡ）９５１１、メタクリル酸（以下ＭＡ３
１゜エチレングリコールジメタクリレート（以下ＥＧＤ
Ｍ２．？）を水１．４！！、過硫酸カリ０．４．？とと
もに、７０℃水媒体中でソープフリー乳化重合を行ない
、平均粒子径０．２５μｍのラテックス粒子を得た。ラ
テックス粒子を透析等で精製した後、表面層のエポキシ
基とのみ反応するε−アミノカプロン醗との反応を行な
い、表面層のエポキシ基を定量したところ１．４　Ｘ　
１０−’ｍｏｌ／ｇ−ラテックスを示した。次いで、５
％ラテックス分散液５０耐とジエチレントリアミン２ｍ
　ｏ　ｌ　／　ｌの水溶液５０―とを混合後、透析等で
精製しアミノ化ラテックス粒子を得た。

窒素分析の結果４．５Ｘ１０−’ｍｏｌ／ＩＩ−ラテッ
クスの窒素が検出された。この窒素量から反応したジエ
チレントリアミン量を求めると表面層のエポキシ基濃度
の１．０７倍に相当した。

（１））　　共有結合の形成による免疫活性物質の固定
化 上記アミノ化ラテックス分散液を０．０１５ｍｏ１／ｌ
のリン醗緩衝液ＰＨ＝７．４（以下緩衝液Ｃと略す）で
希釈し、１重量％に調製した。グルタルアルデヒド水溶
液（７０重量％）を水で希釈して７　Ｘ　１０”−３ｍ
ｏｌ／ｌに調製した。正常ウサギ血清よりカラム処理等
で精製して得たウサギＩｇＧを緩衝液Ｃで希釈して１ａ
ｙ／−に調製した。内径２ｕのガラス管を十字型に組み
合せて混合器を製作した。次いで、ガラス製注射器３本
に上記で調製したアミノ化ラテックス分散液２５−、グ
ルタルアルデヒド水溶液２５−、ウサギＩｇＧ水溶液５
ｍ７！をそれぞれ採取した後、混合器と各注射器とをシ
リコンゴム管で連結した。

上記６液を６液ともに一定供給速度となる様にして１０
秒間で供給した。得られた固定化担体粒子分散安定で、
ウサギＩｇＧを６０Ｑ／９固定化していた。

比較例３ 実施例４で調製したアミノ化ラテックス分散液２５ゴな
ビーカーに取り、磁性攪拌子で攪拌しつつ、上記実施例
４で調製したグルタルアルデヒド水溶液２５−を１０秒
間にわたり一定速度で添加した。添加終了後、ラテック
ス粒子が凝集し沈澱を形成した。さらに、実施例４で調
製したウシＩｇＧ溶液を５ｍｌ添加したが、得られたウ
サギＩｇＧ固定化担体粒子は凝集塊を形成し、免疫学的
測定試薬として不適当であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の混合器の一態様であるＹ字状に管を
組み合わせた混合器の断面を示す。供給口１及び２と取
出口３より構成される。Ｓｌ、Ｓ２は混合部の図中に示
された位置の断面積を示す。 第２図は、本発明の混合器の１態様であるＴ字状に管を
組み合わせた混合器の断面を示す。供給口１及び２と取
出口３より構成される。Ｓｌ、８２は混合部の図中に示
された位置の断面積を示す。 第３図は、本発明の混合器の１態様である内管４と外管
５から成る２重管構造を有する混合器の垂直断面を示す
。供給口１及び２と取出口３より構成される。 第４図は、第３図に示した２重管のＡ１部における水平
断面を示し、８１．８２は混合部の図中に示された位置
の断面積を示す。 第５図は、横軸が被検体中のヒ）ＣＲＰｆ抗原）の濃度
を示し、縦軸は抗ヒ）ＣＲＰ抗体を固定化したラテック
ス分散液（免疫学的測定試薬）の凝集反応時における波
長５８０ｎｍの１分間の吸光度増加量、すなわち、吸光
度増加速度を示す。図中（０）及び（△）は本発明の混
合器を用いた実施態様の場合（実施例２）を示し、直線
１はその検量線を示す。 図（・）及び（ム）は混合器を用いない従来法を用いた
場合（比較例２）を示し、直線２及び３は各々の検量線
を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子を製造するに
   際し、供給口を複数個有し取出口を唯一有する混合器を
   用い、該不溶性担体粒子と抗体又は抗原とをそれぞれ別
   個の供給口から供給し両者を混合後取出口から採取する
   ことを特徴とする抗体又は抗原を固定化した不溶性担体
   粒子の製造方法