JPH0511788B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は、抗原又は抗体濃度の測定方法に関す
る。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 従来、不溶性担体粒子に物理吸着あるいは共有
結合の形成により抗体又は抗原を固定化し、該担
体粒子に固定化された抗体又は抗原に抗原又は抗
体を反応させ、その反応の進行に伴う反応混合物
の吸光度の増加すなわち透過率の減少からその抗
原抗体反応の速度を測定し、あるいは反応の終結
時点の反応混合物の抗体の吸光度又は透過率と、
反応開始前の抗原又は抗体の吸光度又は透過率と
の差を測定し、さらにその速度あるいは反応開始
前と反応終結時点との吸光度又は透過率の差から
被検体中の抗原又は抗体の濃度を定量する方法が
知られている。 そして、この方法によれば、抗原又は抗体の濃
度を高い精度で、迅速に定量しうる利点を有す
る。しかし、以下のような欠点が存在する。例え
ば、不溶性担体粒子に抗体を固定化した場合、抗
原分子数が抗体分子数に比較して少ない領域で
は、抗原抗体反応物が抗原分子数のの増加に比例
して増加し、抗原分子数が抗体分子数より過剰の
領域では、余剰の抗原が本来ならば凝集に寄与し
うる抗体分子を中和し、抗原分子数の増加に対し
て、逆に抗原抗体反応物が減少する。前者は一般
に抗原（抗体）過少領域と呼ばれ、後者は一般に
抗原（抗体）過剰領域と呼ばれる。この現象によ
り、一般に一つの抗原抗体反応物濃度に対して、
複数の抗原又は抗体濃度が対応する。ここで抗体
と抗原を入れ替えても同一現象がみられる。 臨床検査に於ては、上記抗原過剰領域に属する
被検液は一般にその出現頻度は小さいが抗原過剰
領域に属する被検液を誤まつて抗原過少領域のも
のと評価した場合は、臨床上重大な過失となる。
さらには、このような誤まりが発生する測定方法
は臨床上の有意性が乏しいものとなる。 従来、このような誤まりの発生を防ぐために、
同一の被検液に対して希釈率を変えた２以上の希
釈率について測定を行う方法、又は測定終了後に
さらに抗原又は抗体を添加し、抗原抗体反応物濃
度を測定し、抗原又は抗体の添加により抗原抗体
反応物濃度が変化しない場合に被検液が抗原過剰
領域又は抗体過剰領域に属すると判断する方法等
が提案されている。いずれの方法に於いても同一
被検液に対して複数回の測定が必要である。 しかるに、短時間に多数の被検液を測定しうる
自動測定機が近年出現するに及び、単一測定操作
内に抗原過剰領域又は抗体過剰領域に属するか否
か判別しうる測定方法の開発が望まれてきた。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは、自動測定機による短時間に多数
の被検液を測定しうるに好適な測定方法を確立す
る目的で鋭意研究してきた。 その結果、本発明者らは、例えば第１図に示す
如く、抗体を固定化したポリスチレンラテツクス
懸濁液に抗原過少領域に属する抗原濃度を持つ血
清及び抗原過剰領域に属する抗原濃度を持つ血清
の２種の被検液を各々添加し、２秒攪拌の後、５
秒後と60秒後との一定時間に対する吸光度の差を
測定したところ両被検液の示す吸光度の差が一致
した。すなわちこの現象は一つの抗原抗体反応物
濃度に対し複数の抗原濃度が対応していることを
示す。従つて、上記同様の測定方法を利用した未
知濃度の被検液中の抗原又は抗体濃度が１回の測
定で抗原（抗体）過剰領域か抗原（抗体）過少領
域かを決定し得ず、実用上問題があることを示
す。本発明者らは、上記被検液添加後、経時時間
に対する吸光度の変化を詳細に検討したところ、
被検液添加後、５秒と10秒後、10秒と15秒後の２
ケの特定時間に対する吸光度の差の比を求める
と、両被検液の該差の比の値が大きく異なること
を見出した。さらに種々の抗原濃度を示す血清に
つき各々複数回測定し、該吸光度の差の比の再現
性を検討したところ、前記吸光度の差の比を利用
することにより、極めて容易に被検液中の抗原又
は抗体濃度の定量が出来ることを確認し、本発明
を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、不溶性担体粒子に抗体又
は抗原を固定化し、該担体粒子に固定化された抗
体又は抗原に既知濃度の抗原又は抗体を反応さ
せ、反応開始後の経時的変化した時点で光を照射
し、上記反応に於ける２以上の特定時間に対する
光の吸光度又は透過率の差の比を求め、該比と抗
原又は抗体濃度との間の対応曲線を求め、次いで
未知濃度の試料について２以上の特定時間に対す
る光の吸光度又は透過率の差の比を求め、上記対
応曲線により該比に相当する濃度を決定すること
を特徴とする抗原又は抗体濃度の測定方法であ
る。 本発明で用いる不溶性担体粒子は、使用条件下
に実質的に不溶性であれば有機高分子体，無機化
合物の区別なく使用出来る。またその形状も特に
限定されるものではないが、一般に好適に使用さ
れるものを例示すると、平均粒子径が1.0μｍ程度
以下、好ましくは0.05〜0.4μｍの不溶性担体粒子
である。該不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定
化し、次いで被検液中の抗原又は抗体を反応さ
せ、例えば400〜1000mm、好ましくは500〜950mm
の範囲の波長の光線を用いて、反応開始後の２以
上の特定時間に対する上記反応物の吸光度又は透
過率の差を測定し、この差の比を求めることによ
り被検液中の抗原又は抗体の濃度を測定すること
ができる。 上記方法に於ける被検液中の抗原又は抗体は、
そのいずれかが含まれる場合が一般的であるが、
該抗原と抗体との混合物であつても十分に対応出
来る。 上記測定に用いる光線は、反応の進行に対する
吸光度又は透過率が比較的大きく感度に優れ、か
つ、被検液中に通常共存する乳ビ，ヘモグロビ
ン，ビリルビン等の干渉が比較的少ない上記波長
域が好適である。 不溶性担体粒子の粒子径については、粒子径が
大きい場合、凝集にともなう粒子径の変化量は大
きいが凝集反応速度は遅くなる傾向があり、粒子
径が小さいとブラウン運動性が活発で凝集反応速
度は速いが、一次粒子径が小さいために凝集反応
にともなう粒子径の変化量は小さくなる傾向があ
る。 上記理由により、上記粒子径と測定波長とを適
宜組み合せて実施すると好適である。 不溶性担体粒子としては、前記の如く、測定を
行う時に用いられる液体媒体に実質的に不溶性
で、例えば上記平均粒子径を有するポリスチレ
ン，スチレン−ブタジエン共重合体，スチレン−
メタクリル酸共重合体，ポリグリシジルメタクリ
レート，アクロレイン−エチレングリコールジメ
タクリレート共重合体のような乳化重合により得
られる有機高分子ラテツクス等の有機高分子物質
の微粒子あるいはシリカ，シリカ−アルミナ，ア
ルミナのような無機酸化物又は無機酸化物等にシ
ランカツプリング処理等の操作で官能基を導入し
た無機粒子等が用いられる。 本発明に於いて、抗体又は抗原は特に限定的で
なく公知のものが使用できる。一般に好適に使用
されるものの代表的なものを例示すれば、例え
ば、変性ガンマグロブリン，抗核因子，ヒトアル
ブミン，抗ヒトアルブミン抗体，イムノグロブリ
ンＧ（IgG），抗ヒトIgG抗体，イムノグロブリン
Ａ（IgA），抗ヒトIgA抗体，イムノグロブリンＭ
（IgM），抗ヒトIgM抗体，抗ヒトIgE抗体，スト
レプトリジンＯ，ストレプトキナーゼ，ヒアルロ
ニダーゼ，Ｃ−反応性蛋白（CRP），抗ヒトCRP
抗体，アルフアーフエトプロテイン（AFP），抗
ヒトAFP抗体，癌胎児性抗原（CEA），抗ヒト
CEA抗体，ヒト絨毛性ゴナドトロビン（HCG），
抗HCG抗体，抗エストロゲン抗体，抗インシユ
リン抗体，Ｂ型肝炎表面抗原（HBs），抗HBs抗
体，梅毒トレポネマ抗原，風疹抗原，インフルエ
ンザ抗原，補体C₁ｑ，抗C₁ｑ抗体，抗C₃抗体，
抗C₄抗体，抗トランスフエリン抗体，等である。 本発明に於いては、このような不溶性担体粒子
に測定対象の被検液中の抗原又は抗体と反応しう
る抗体又は抗原を固定化する。この場合の固定化
方法は物理的吸着，化学的共有結合の形成のいず
れでも良いが、物理的吸着能の高い蛋白例えば抗
体や高分子量蛋白の固定には物理的吸着が好適で
あり、物理的吸着能の低いホルモン類，ハプテン
類の固定化には化学的共有結合の形成が好適に用
いられる。固定化方法についてはすでに多くの方
法が提案されており、固定化する抗体又は抗原の
特性に合わせて適宜固定化方法を選択すると良
い。例えば分散媒体中で抗体又は抗原を必要に応
じて緩衝液又は架橋剤の存在下に不溶性担体粒子
を混合すればよい。 上記抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子
の分散媒は特に限定されないが、不溶性担体粒子
の保存中の安定性と、凝集反応時の反応の再現性
の観点からみて、グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液，トリス−塩酸緩衝液，リン酸緩衝液等の緩
衝液が好適に使用される。 上記抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子
濃度が反応時に0.005重量％以上、好ましくは
0.02〜0.20重量％となるように上記分散媒中に懸
濁し、抗体又は抗原を固定化した不溶性担体粒子
懸濁液を得る。 該懸濁液を用いた被検液中の抗原又は抗体濃度
の測定方法は、例えば以下の如く実施しうる。 まず、一定の平均粒子径を有する不溶性担体粒
子にある一定の抗体又は抗原を固定化し該懸濁液
を調製する。次いで被検液中に含まれる抗原又は
抗体と同一又はほぼ同一の抗原又は抗体を、被検
液の媒体と同一又はほぼ同一の媒体を用いて希釈
し、あるいは濃縮し、種々の既知濃度の標準被検
液を調製する。次いで一定条件下に於いて該懸濁
液と該標準被検液とを混合し、反応開始後の２以
上の特定時間に対する吸光度又は透過率を測定
し、その間の変化量すなわち差の比を算出する。
次に該差の比の値を例えば縦軸に、標準被検液中
の抗原又は抗体濃度を例えば横軸としたグラフに
プロツトすると、例えば第３図に示す被検液中の
抗原又は抗体濃度と該差の比の値との対応曲線が
得られる。次いで標準被検液中の抗原又は抗体と
同一又はほぼ同一の抗原又は抗体を含む濃度未知
の被検液につき、上記対応曲線を得た条件と同一
条件下で、かつ同様の方法で吸光度又は透過率の
差を測定して、その比の値を得、上記対応曲線と
対比することにより被検液中に含まれる抗原又は
抗体量を検知しうる。 本発明による方法によれば、同一濃度の被検液
に対する不溶性担体粒子に固定化した抗体又は抗
原濃度が、従来技術に比して1/10以下に低減する
ことが可能となる。逆に従来技術に於いて被検液
をあらかじめ希釈操作等を行い、被検液中の抗原
又は抗体濃度を低下させる必要のある測定項目に
於いては、本発明による方法によれば希釈倍数を
１／１０以下に低減でき、さらに場合によれば希釈操
作を行わず被検液中の抗原又は抗体濃度の測定が
可能となる。前者の場合は測定に用いる抗体又は
抗原量及び不溶性担体粒子の使用量が低減でき、
後者の場合は希釈操作による測定誤差の低減又は
排除できる。 本発明に於ける前記特定時間の設定については
以下の点を考慮して実施するのが好ましい。すな
わち、不溶性担体粒子に固定化した抗体又は抗原
の懸濁液に被検液を加え反応を開始した後、好ま
しくは該懸濁液と被検液とを一定条件下で攪拌
し、混合した後、さらに、２〜３秒経過し、実質
的に反応系が安定化した後の２以上の特定時間に
対して、反応物の吸光度又は透過率の変化量を測
定するのが好適である。 ここに於いて特定時間のうち少なくとも一方
は、実質的に反応系が安定化した時点すなわち攪
拌後２〜３秒経過した時点からとする場合に、該
被検液に於ける吸光度又は透過率の差の比の値が
該被検液中の抗原又は抗体濃度に対して鋭敏に対
応する傾向がある。従つて特定時間のうち少なく
とも一方は測光可能な限り反応の初期に設定する
ことが好ましい。なお、特定時間の間隔及び他の
特定時間の設定については、吸光度又は透過率の
変化量を勘案して、測定する抗原又は抗体ごとに
好適な条件を選択すれば良い。一般に好適に採用
される代表的な態様を説明すると下記のとおりで
ある。例えば、上記反応が開始後の基準経過時
（ａ秒後）から更に一定時間経過後（ｂ秒後）の
それぞれの吸光度又は透過率を測定し、その差
（△E₁）を算出し、更に上記とは別の基準経過時
（ｃ秒後）を設定し、これより一定時間経過後
（ｄ秒後）のそれぞれの吸光度又は透過率を測定
し、該基準時（ｃ秒後）との差（△E₂）を算出
する。この両者の比すなわち△E₁／△E₂を算出
し、各既知濃度に於ける該比の対応曲線を作成す
る。上記基準経過時（ｃ秒後）の設定は先きに吸
光度又は透過率を測定したｂ秒後とすることも出
来、この場合は最低３点の吸光度又は透過率の測
定で前記２つの特定時間に対する吸光度又は透過
率の差の比を求めることが出来る。 このようにして求めた上記比の値は、抗体又は
抗原濃度に応じた特定のものとなり、例えば第３
図に示すような検量線とすることが出来る。 次いで、未知濃度の被検液中の抗体又は抗原濃
度について、前記同様の２以上の特定時間に対す
る吸光度又は透過率の差の比を求めることによ
り、上記検量線から被検液中の抗体又は抗原の濃
度を決定できる。 （発明の効果） 本発明による抗原又は抗体濃度の測定方法は、
従来技術に於いて抗原過剰又は抗体過剰か否かの
判別は必要であつた被検液中の抗原又は抗体濃度
範囲に対し、抗原過剰又は抗体過剰か否かの繁雑
な判定操作を用いず被検液中の抗原又は抗体濃度
を一義的に決定でき、再検査の必要もない。 また、同一被検液に対する不溶性担体粒子に固
定化した抗体又は抗原濃度を従来技術に比較して
低下でき及び／または同一該固定化した抗原又は
抗体濃度に対し被検液の希釈操作にともなう測定
誤差の低減または排除が可能となる。 さらに、本発明による測定方法に於いては吸光
度又は透過率の測定は最低３回で実施できる。 従つて、本発明による抗原又は抗体濃度の測定
方法は、短時間に多数の被検液を処理する自動測
定の場合に特に有用であり、かつ、自動測定機に
対する制約も少なく、広く一般の自動測定機への
実施ができる。 （実施例） 以下、実施例により、さらに本発明を詳細に説
明する。 実施例 １ (1) Ｃ−反応性蛋白質測定試薬の調製 平均直径0.123μｍのポリスチレンラテツクス粒
子をトリス−塩酸緩衝液（＝7.5）で希釈し、
ラテツクス濃度が１重量％の懸濁液を調製する。
次いでＣ−反応性蛋白質（以下、CRPと略す）
をヤギに免疫して得た抗CRP血清より塩析処理
により分画した抗CRPヤギIgG分画をトリス−塩
酸緩衝液（＝7.5）で希釈し、蛋白濃度２mg／
mlの溶液を調製する。上記ラテツクス懸濁液１容
に抗CRPヤギIgG分画の溶液１容を加え37℃で２
時間反応させる。さらにウシ血清アルブミンを最
終濃度で0.05重量％添加した後遠心分離し、上清
を除去した後沈でんをトリス−塩酸緩衝液（＝
7.5）に再分散し、ラテツクス濃度を0.08重量％
に調製し、CRP測定試薬を得た。 (2) 測定方法 日立製作所製Ｕ−3200型自記分光分析計の測光
部に、温度調節器及びマクネツト式攪拌装置を取
り付けた装置により吸光度を測定した。 光路長10mmのガラス製光学セルに円筒状の攪拌
子を入れ、次いで(1)で得たCRP測定用試薬2450μ
を分注し、測光部に挿入し、37℃に保温した。 次いで該攪拌装置によりCRP測定用試薬を攪
拌しつつ、被検液50μを添加した。 添加と同時に吸光度の測定を開始した。 吸光度の測定は、580mmの波長の光線を用いて
行つた。なお、攪拌は被検液添加後３秒で停止し
た。 (3) 既知試料の測定 CRP濃度22.4mg／dlの血清をトリス−塩酸緩衝
液（＝7.5）で希釈し、CRP濃度が0.41，1.24，
3.73，5.60，7.46，11.2，16.8mg／dlの被検液を得
た。一方、上記血清を濃縮し、CRP濃度が44.8，
89.6mg／dlの被検液を得た。 (2)の測定条件下で、上記９種の被検液及び
CRP濃度22.4mg／dlの血清、さらにトリス−塩酸
緩衝液（＝7.5）につき吸光度を各５回測定し
た。 得られた吸光度のうち、被検液添加後６秒後と
12秒後，18秒後，60秒後の吸光度より、２特定時
間の差の比として、被検液添加12秒後と６秒後の
吸光度差を、被検液添加18秒後と12秒後の吸光度
差で除した値を得た。一方、被検液添加60秒後の
吸光度より６秒後の吸光度を減じた値より一定時
間に対する吸光度の差を得た。この結果を第１表
に示した。

【表】

【表】 た変動係数を求めた。
(注２) CRPを含まないトリス−塩酸緩衝液である。
次に、第１表に示した一定時間に対する吸光度
の差の平均値を縦軸とし、添加被検液中のCRP
濃度を横軸として第２図に示す対応曲線を得た。
一方、２特定時間に対する吸光度の差の比の平均
値を縦軸とし、添加被検液中のCRP濃度を横軸
として第３図に示す本発明による対応曲線を得
た。 ここに於いて、誤差の比の値ｘとし、該CRP
濃度をｙとすると、CRP濃度3.73mg／dlから89.6
mg／dlの範囲に於ける該差の比の対応曲線は ｙ＝exP（4.059×_Oｇｘ＋2.697） （式１） でよく近似できた。一方、該差の対応曲線におい
てCRP濃度5.60mg／dl以下の濃度範囲について
は、該差の値をｘ，該CRP濃度をｇとすると ｙ＝exP（0.9553×_Oｇｘ＋2.585） （式２） でよく近似できた。（式１），（式２）に於ける₀
ｇは自然対数である。 一般にCRP強陽性患者血清中のCRP濃度は40
mg／dl以下であり、既知濃度被検液のうちCRP
最高濃度である89.6mg／dlは臨床上測定必要な範
囲の上限と考えられ、本発明による該差の比の対
応曲線を用いれば、CRP濃度3.73mg／dlから89.6
mg／dlの濃度範囲にわたる従来法では一義的に抗
原濃度の決定が不能であり抗原過剰領域に属する
か否かの判別が必要であつた濃度範囲に於いて一
義的に抗原濃度の決定ができる。なお、CRP濃
度33.7mg／dl未満の濃度範囲について従来法によ
る誤差の対応曲線を適用すれば、CRP低濃度域
の測定も実施できる。 すなわち、CRP濃度未知の被検液を測定する
に当たつては、(2)の測定方法に従つて測定し、
CRP濃度未知の被検液による該差の値及び誤差
の比の値を得る。次にCRP濃度3.73mg／dlに於け
る該差の値0.2651と上記被検液の該差の値を比較
し、上記被検液の誤差の値が0.2651以上であれ
ば、該差の比の値を（式１）に代入してCRP濃
度を得る。逆に上記被検液の該差の値が0.2651未
満であれば、該差の値を（式２）に代入して
CRP濃度を得る。 (4) 未知試料の測定 CRP濃度未知の血清を(2)の測定方法で測定し
たところ、該差の値0.5307と該差の比の値1.196
を得た。CRP濃度3.73mg／dlに於ける該差の値
0.2651より上記該差の値が大であるので、誤差の
比の値を（式１）に適応してCRP濃度30.7mg／dl
を得た。 次いで、上記血清をトリス−塩酸緩衝液（PH＝
7.5）で５倍及び10倍に希釈し、(2)の測定方法で
測定したところ、５倍希釈液については該差の値
0.4381と該差の比の値0.801を得、（式１）により
CRP濃度は6.03mg／dlと求まつた。10倍希釈液に
ついては該差の値0.2137と該差の比の値0.711を
得、（式２）によりCRP濃度は3.04mg／dlと求ま
つた。 さらに、５倍希釈液をヘキスト社製一元免疫拡
散法によるCRP定量試薬であるLCパルチゲン
CRPによりCRP濃度を測定したところ6.0mg／dl
を示し、本発明による方法により血清中の濃度が
広範囲に分布するCRPの測定に於いて、従来法
では一義的にCRP濃度の決定が不能であり、抗
原過剰領域に属するか否かの判別が必要であつた
CRPの濃度範囲に於いて一義的にCRP濃度の決
定が可能となつた。さらに、CRP低濃度域に従
来法を実施することにより、CRP濃度0.41mg／dl
すなわちCRP濃度の正常域付近からCRP濃度89.6
mg／dlすなわちCRP濃度の異常高値にかけて、
単一の測定操作でCRP濃度の測定が可能となつ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗体を固定化した不溶性粒子担体の懸
濁液に、対応する抗原を添加し、添加後の時間に
対する吸光度の変化量を示すグラフである。図
中、実線は抗原過少領域に属する被検液の場合
で、点線は抗原過剰領域に属する被検液の場合の
結果を示す。第２図は、横軸を被検液中の抗原濃
度とし縦軸を一定時間に対する吸光度の差として
プロツトした対応曲線を示す。第３図は、横軸を
被検液中の抗原濃度とし縦軸を２特定時間に対す
る吸光度の差の比としてプロツトした本発明によ
る対応曲線を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 不溶性担体粒子に抗体又は抗原を固定化し、
   該担体粒子に固定化された抗体又は抗原に既知濃
   度の抗原又は抗体を反応させ、反応開始後の経時
   的変化した時点で光を照射し、上記反応に於ける
   ２以上の特定時間に対する光の吸光度又は透過率
   の差の比を求め、該比と抗原又は抗体濃度との間
   の対応曲線を求め、次いで未知濃度の試料につい
   て２以上の特定時間に対する光の吸光度又は透過
   率の差の比を求め、上記対応曲線により該比に相
   当する濃度を決定することを特徴とする抗原又は
   抗体濃度の測定方法。