JPH01112979A - シェードモナスｋｗｉ−５６菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野ン 本発明に耐熱性リパーゼを生産するシュードモナス属の
細菌に関するものである。

（従来技術） リパーゼハトリグリセリドを基質とし、脂肪酸とグリセ
リンに加水分解する酵素である。また、反応水中の水分
含量全減少させると脂肪酸とアルコールよりエステルを
合成する反応も知られている。

現在、リパーゼの工業的利用が盛んに試みられておＶ％
に脂肪酸生産プロセスへのリパーゼの導入が期待されて
いる。

すなわち、工業的に油脂を分解し、脂肪酸を生産させる
プロセスは、現在、高温、高湿下での化学的加水分解法
によって行われている。しかし、酵素反応を導入する事
により、常温、常圧下で反応を進ませることができるた
め、化学的加水分解法では分解されることが多かった不
飽和脂肪酸も分解することなく得ることができるととも
に大量のエネルギー消費を節約できる。また、酵素反応
の基質特異性を利用し、エステル交換反応を用いて、価
格の安価な油脂を原料とし、希少な油脂を改良すること
も可能である。

しかし、脂肪酸生産の主な原料である牛脂、豚脂は、主
に長鎖の飽和脂肪酸より構成されており、常温では固体
である。このために油脂を融点以上の温度で反応させる
か、有機溶剤の添加により液状化したのち反応させなけ
れはならない。よって脂肪酸生産用に使用されるリパー
ゼは、耐熱性を持ち、しかも高温下で最適反応性を持つ
ものかまたは、有機溶剤に対し耐性を持ち、その存在下
で反応を進められるものでなくてはならない、このよう
なリパーゼの検索は盛んに行われてきたが、工業的レベ
ルでその需要に適した酵素は、現在まで得られていない
。

耐熱性リパーゼという点においては、特にシュードモナ
ス属細菌がこれらのリパーゼを生産しうろことが報告さ
れている。

すなわち、シュードモナス・メフイティカ・パリュタス
・　リボリティ力（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｐｈ
ｉｔ　−ｃａ　Ｖａｒ、　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａ）が生
産する、作用最適温度７０℃、６０℃１４時間の熱処理
においても失活をおこさないリパーゼ（特公昭５Ｏ−２
５５５３）、シュードモナス、フラジ−（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）が生産する、作用最適温度７
５〜８０℃、７０℃２０分間の熱処理によっても９５−
以上の活性を保持するリパーゼ（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ
　ｃｈｅｍ、　４１ｉ３５Ｂ〜１３５８）、シュードモ
ナス、フルオレセンス・バイオタイプＩ　（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　）が生産する
、作用最適温度６°７℃、６０℃２０時間の熱処理によ
っても８６．９　％の活性を保持するリパーゼ（時開１
１＠５７−５８８８５）などの報告が知られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、上記の細菌が生産するリパーゼだけでている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、耐熱性を持つリパーゼを生産する微生物
を広く自然界より探索した結果、神奈川県厚木市の土壌
より分離したシュードモナス属に属するＫＷＩ−５６菌
株が、極めて高い耐熱性を持ち、７０〜８０℃に最適反
応温度を持つリパーゼ金生産する事を見い出した。

本発明の菌株の菌学的性質を以下に示す。この菌学的性
質の検討には、「微生物の分類と同定」（長谷用武治著
、学会出版センター）、［医学細菌同定の手びきＪ　（
Ｓ、Ｔ、Ｃｏｗａｎ著、坂崎利−訳、近代出版）、「新
細菌培地学講座」（坂崎利−著近代出版）に記載された
方法、培地組成を用いた。

ａ）形態 ■細胞の形及び大きさ：長さ２．２〜３．０ミクロン、
幅０．５〜０．７ミクロンの桿菌 ■細胞の双形性：単独または短連鎖 ■運動性：るり、１本の極鞭毛を持つ ■胞子；なし ■ダラム染色：陰性 ■抗酸性：なし ｂ）生育状態 ■肉汁寒天平板培養二円形、とつ円状、表面は滑らかで
光沢がある。わずかに黄色を帯びた白色。

■肉汁寒天斜面培養：糸状、生育は普通１表面は滑らか
で光沢がある。色素生成せず。わずかに黄色を帯びた白
色。

■肉汁液体培養：生育は普通、混濁、色素生成せず。

■肉汁ゼラチ／穿刺培養：生育は普通、液化。

■リドマスミルク：微アルカリ性、液化。

Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元：陽性。

■脱窒反応：陰性。

■ＭＲテスト：陰性。

■ｖｐテスト；陰性。

■インドールの生成：陰性。

■硫化水素の生成：わずかに陽性。

■デンプンの加水分解：陰性。

■クエン酸の利用：ユーザーの培地゛陽性。

！ クリステンセンの培地；陽性。

■無機窒素源の利用：硝酸す）　ＩＪウムは利用しない
が硫酸アンそニウムは利用する。

［相］色素の生＃：：シュードモナスＦアガー、シュー
ドモナスＰアガー（デイ７コ社製）、クリグラ−の培地
（指示薬は含まず）、ＴＳＩ寒天培地（指示薬は含まず
）において、色素の生成はみられない。

■ウレアーゼ：陽性。

■オキシダーゼ：陽性。

０タカ゛ラーゼ：陽性。

０生育の範囲 ｐｉ（：　４．５〜８．５で生育、＆５〜７．０で最適
。

温度：１５〜３７℃で生育。１０℃および４０℃で生育
はみられない。３３℃ 前後が最適。

［相］酸素に対する態度：好気性 ００−Ｆテスト：好気的に酸を生成。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖ショＩＪ、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット。

グリセリンからガスは発生しないが酸を生成する。デン
プンからはガスも糖も生成しない。

β ［相］ポリー＼−ヒドロキシ酪酸の蓄積：陽性。

■グロトカテキン酸の分解：オルト型。

■グルコン酸の酸化：陽性。

＠アルギニン脱炭＃ｌ：陰性。

■リジン脱炭酸：陽性。

■リパーゼの生産：陽性。

■炭素化合物の利用：　５ｔａｎｉｅｒらの方法による
。

グルコーヌ、ガラクトース、ラクトース。

アラビノース、マルトース、ソルビトールＬ−スレオニ
ン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−７リシン、イスリン、イタコ
ン醒、メタコン酸では生育せず。

以上の菌学的性質からバーシイのマニュアル、オブ、デ
ィタミネイティブ、バクテリオロジー第８版（Ｂｅｒｇ
ｅｙｓ’　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｖｅ　Ｂａｃｔｅ−ｒｉｏｌｏｇｙ　８　ｅｄ　）お
よび、バーシイのマニュアル。

オプ、システマティック、バクテリオロジー（Ｂｅ−ｒ
ｇｅｙｓ’　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉ
ｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）に基づき検索した結果
、シュードモナス、セパシアにほぼ一致した。しかし、
従来のシュードモナスセパシアに、４０℃において生育
可能であるが、本菌株は３７℃以下の温ｒ！ＪＬ）でな
ければ生育にできない。また、従来のシュードモナス、
セパシアは非螢光性の色素を生産するにもかかわらず、
本菌株では色素の生産を見ることはできない。

さらに、既知の耐熱性リパーゼを生産するシュードモナ
ス属細菌、すなわち前記のシュードモナス、メフィティ
カ、バリエタス、リボリティカ。

シュードモナス、フラジ−、シュードモナス・フルオレ
センス、バイオタイプＩと比較しても、少なくとも以下
の菌学的性質に関して差異がみられ以上の知見より、本
菌株はシュードモナス、セパシアと極めて近い分類学的
関係にありながらも新菌株であると判断し、シュードモ
ナス、ＫＷＩ−５６株と命名した。本菌株は昭和６２年
１０月１５日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託した。微生物受託番号は、微工研菌寄第９６
５９号（ＦＥＢＭ　Ｐ−９６５９）である。

（作用及び効果） 本菌株を用いて耐熱性リパーゼを生産することができる
。培養条件は次のとおりである。

まず培地組成であるが、本菌株はオリーブ油等の油脂が
培地中に存在する時にのみ誘導的にリパーゼを生産する
。このため、炭素源としてはオリーブ油などの油脂を用
いるか、もしくはグリセリン、各鴇糖類などの本菌株が
資化しうる物質に、適当な量の油脂を添加させたものを
使用すればよい。窒素源には、硫酸アンモニウム、肉エ
キス。

ポリペプトン、大豆粉などが利用できる。さらに無機塩
として、カリウム、ナトリウム、リン酸。

マグネシウム、カルシウムなどの各塩類を添加する必要
がある。

以上述べた培地組成でｐＨ２７，ｏ・に調整し、３０℃
において、好気的に培養をおこなえば、培養開始後１日
〜２日間で培地中のリパーゼ生産量は最大となる。得ら
れた培養液は遠心分離によって菌体を除去した後、その
上澄液を酵素液として使用できる。また、上澄液を部分
精製の後に使用してもさしつかえない。すなわち、低温
下において上澄液に、冷却し几アセトンを最終濃度８０
％（ｖ／Ｖ）となるよう加え、その沈殿物を遠心分離な
どで回収する。さらにこの沈殿物を適当な緩衝液で溶解
し酵素液として使用すれはよい。

次に菌株が生産する耐熱性リパーゼの若干の性質を以下
に述べる。なお、リパーゼ活性の測定は山田−町田法（
日本農芸化学会誌、３６．８６０〜８６４．１９６２）
を用いた。すなわち、２％オリーブ油、ポリビニルアル
コールエマルジョンを基質として、３７℃において１分
間に１マイクロモルの脂肪酸を遊離せしめる酵素ｆｌｅ
１単位（以下Ｕと標示、）とした。

■作用 トリグリセソドを基質として脂肪酸とグリセリンまでに
加水分解する。

■作用最適温度 第１図に示す様に、作用最適温度は７０℃〜８０℃であ
る。

■耐熱性 第２図は酵素液を各温度下で１２時間熱処理したもので
ある。第３図は酵素液を６０℃の温度下で各時間熱処理
したものである。６０℃２４時間の熱処理で残存活性は
８５チ以上、７００１２時間の熱処理で２８−の残存活
性を示す。

次に実施例によって本発明の詳細な説明する、（実施例
） 肉エキス１％（ｗ、／ｗ）　、　、ｇリペプトン１％（
Ｗ／Ｗ）。

塩化ナトリウム０．５％（ｗ、’ｗ）　、オリーブ油１
％（Ｗ／Ｗ　）よりなる液体培地を水酸化ナトリウム水
溶液を用いてｐｉ（７，０に調節し、その５０−を５０
０−容の坂ロフラスコに加え、オートクレーブによって
加圧滅菌した。この培地にシュードモナスＫＷＩ−５６
株を植菌し、ロータリーシューカーを用いて３０度、１
５０回転毎分の条件下で５０時間の振盪培養をおこなっ
た。培養終了後の培養液のリパーゼ活性は３４．８　Ｕ
／ｍｎであった。さらに、この培養液から遠心分離によ
って菌体を除去しその上澄液を得た。上澄液のリパーゼ
活性は３ｏ、８Ｕ／ｄであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はシーートモナスＫＷＩ−５６株が生産するリパ
ーゼの作用最適過度を示す図である。各温度条件で２０
分間の活性測定反応をおこなった。 第２図ｆｌ　ｒ＝Ｊ　ＩＪパーゼの耐熱性を示す図であ
る。酵素液を各温度で１２時間熱処理し、残存活性を求
めた。第３図も同リパーゼの耐熱性を示す図である。酵
素液全６０℃の温度下で各時間熱処理し、残存活性を求
めた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属し、
   かつ耐熱性リパーゼ生産能を有するシュードモナスＫＷ
   Ｉ−５６菌株。