JPH028271B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は親水性ラテツクス粒子を含む診断薬に
関する。 特に迅速かつ簡単に実施し、かつしばしば裸眼
で観察することができるために免疫学で多くの診
断測定の範囲内で利用される抗原抗体複合物の凝
集反応には免疫学的に活性な物質、例えば抗体の
キヤリヤとして疎水性ラテツクス粒子が長い間使
用されている。この疎水性ラテツクス粒子は大て
いはポリスチレンホモポリマーまたはコポリマ
ー、例えばスチレン／ブタジエンコポリマーまた
はアクリルニトリル／ブタジエン／スチレンコポ
リマー（ABS）から成り、かつエマルジヨン重
合により製造される。 長い間知られているエマルジヨン重合では、一
般に４成分が添加される：水に難溶性のモノマー
または数種の水に難溶性のモノマーの混合物、
水、乳化剤および水溶性開始剤。モノマーは乳化
剤によつて小滴の形状に液化され、その際多数の
乳化剤分子の会合によつて中でも一部は空の、か
つ一部はモノマー分子によつて満たされた大きな
ミセルが形成される。後者はモノマーの“可溶
性”として示される。水溶性開始剤は、水相の各
モノマー分子の重合、またモノマーで満たされた
ミセルで並びにモノマー滴で重合を開始もしくは
活性化することのできるラジカルを形成する。し
かし実際には重合は膨潤したミセルで起る、それ
というのも一方でミセル中のモノマー濃度が周囲
における個々の溶けたモノマー分子の濃度よりも
著しく大きく、また他方でミセルの活性化の確率
がモノマー滴の数に比べてミセルの数が多いため
にきわめて高いからである。充填ミセルの直径は
重合中にミセルが最終的に球状のラテツクス粒子
に移行するまで増大する。活性化されないミセル
の乳化剤分子および消費されたモノマー滴の表面
からの乳化剤分子はラテツクス粒子の表面をおお
い、かつ生成するポリマー分散液の安定化に役立
つ。 例えば界面活性剤または湿潤剤であつてよい乳
化剤またはエマルジヨン安定剤の添加下に公知方
法により製造されるラテツクスは次の欠点を持つ
ており、これらの欠点は特に免疫学的に活性な物
質のキヤリヤとしての使用および連続的な溶液測
定系での使用を妨げる： １ ラテツクス粒子の疎水性表面に所望の免疫学
的に活性な物質、例えば抗体の他に非特異的に
多数の他の血清成分が結合する； ２ 共有結合によらず吸着的にのみ結合せる免疫
学的に活性な物質は診断試験の経過の中で測定
中に再び分離する場合がある； ３ エマルジヨン重合で乳化剤または安定剤とし
て使用される界面活性剤が水溶液中に拡散して
生物学的に活性なたん白質の構造を、したがつ
て活性を破壊する場合がある； ４ 安定化作用を有する界面活性剤を除く際にラ
テツクス懸濁液が凝集し、かつ遠心分離の際に
も安定性がこわれる。その際生成する沈澱物は
再懸濁されて前の状態にするのがきわめて困難
かまたはもはや可能ではない。 これらの欠点を回避するために既に種々の提案
がなされたが、これらは常に前記の問題の一部の
みを解決し得たにぎなかつた。 カルボキシル化ABS−コポリマーおよびカル
ボキシル化スチレン／ブタジエンコポリマーから
成る、粒度0.01〜0.9μｍの疎水性ラテツクス粒子
が西ドイツ国特許公告第2203377号公報から公知
であり、これらは血清学的に不活性のキヤリヤと
して生物学的に活性なたん白質に対して使用さ
れ、その際たん白質はキヤリヤに、ラテツクス中
に導入されたカルボキシル基を介してアミド結合
の形成下に共有結合される。 西ドイツ国特許公開第2812845号公報からABS
−コポリマーから成る、粒度0.05〜1μｍの疎水性
ラテツクスが公知であり、この場合にもラテツク
スはカルボキシル基で変性され、かつ反応性側鎖
と縮合しており、そのために免疫学的に活性な物
質も共有結合できる。 この公知の疎水性ラテツクスによつて前記の第
２の問題は解決されるが他のすべての欠点は相変
わらず存在する。 したがつて疎水性ラテツクスの代わりに親水性
ゲルを免疫学的に活性な物質のキヤリヤとして使
用することも試みられた。親水性ゲルは吸着性を
全くまたはきわめて僅かしか持たず、他方たん白
質のかかるゲルへの共有結合は公知であるので、
その製法および粒度に基づいて“ラテツクス”と
示してもよい“マイクロゲル”が提案された。か
かる親水性ラテツクスは例えば米国特許第
4138383号明細書から公知である。該ラテツクス
は0.35μｍよりも小さな直径を有する球形粒子か
ら成り、ラジカルによつて開始される水性エマル
ジヨン重合の条件下に製造され、その際モノマー
としてアクリルアミド、アクリル酸、メタクリル
酸またはアクリレートが使用される。乳化剤とし
ては例えば金属石けんが使用される。こうして得
られる親水性マイクロゲルに生物学的および／ま
たは免疫学的に活性な物質が自体公知の方法でカ
ルボジイミド−ブリツジまたはグルタルジアルデ
ヒド−ブリツジを介して共有結合する。これによ
つて前記の第１と第２の問題が解決されるが、第
３と第４の問題は解決されない。それというのも
エマルジヨン重合は相変らず乳化剤または安定剤
の添加下に実施しなければならないからである。 本発明の課題は、前記の４つの欠点すべてを回
避することのできる親水性ラテツクスを含有する
診断薬を見い出すことである。したがつて本発明
の課題は、特に生物学的および／または免疫学的
に活性な物質を共有結合することができ、生物学
的に活性なたん白質の構造、したがつて活性を損
なわず、その安定性が遠心分離の際にこわれず、
かつ凝集し、かつ引続き再び容易に懸濁させるこ
とのできる親水性ラテツクス粒子を含有する診断
薬を見出すことである。 この課題は本発明によれば水に難溶性のモノマ
ーのホモポリマーまたはコポリマーから成る親水
性ラテツクス粒子を含有する診断薬によつて解決
される。該親水性ラテツクス粒子は水溶性の、ラ
ジカルを形成する開始剤の存在で、しかし乳化
剤、安定剤または湿潤剤を添加せずにエマルジヨ
ン重合によつて製造可能であり、かつホモポリマ
ーの場合にモノマーが、もしくはコポリマーの場
合にモノマー類の一部が分子中に少なくとも１個
の重合可能なＣ＝Ｃ−二重結合を有するエポキシ
ドである。 意想外にも冒頭で引用された公知技術にも記述
されている、当業界で長い間支配的であつた思想
に反して乳化剤、安定剤または湿潤剤の添加がエ
マルジヨン重合の実施にまつたく必要ではないこ
とが示された。したがつて、乳化剤として使用さ
れる金属石けんまたは界面活性剤はラテツクス粒
子から拡散し、かつラテツクス粒子に共有結合せ
るたん白質の生物学的活性を損ないまたは完全に
破壊したために従来は無条件に必要であつた、ポ
リマーのラテツクス粒子からの大ていはきわめて
困難かつ煩雑な乳化剤の除去が省略される。 少なくとも１個の重合可能な二重結合を含むグ
リシジル化合物をモノマーとして使用するのがき
わめて有利であると示された。該化合物の構造は
重合性の二重結合中に疎水性部分およびエポキシ
ド基、オキシラン環中に同時に親水性部分を有す
る。生成するラテツクス懸濁液は乳化剤、安定剤
または湿潤剤の不在にもかかわらず凝集しない。
ラテツクス懸濁液の安定化は遠心分離の際にもこ
わされない。末端エポキシド基は種々の反応（加
水分解、アンモノリシス、アミノリシス、縮合）
をきわめて受け易いのでエポキシド基は単分散系
に分散したラテツクス球体の表面を該エポキシド
基が水相方向に配向されるようにおおつているに
ちがいない。 モノマーとしては有利にグリシジルメタクリレ
ート、グリシジルアクリレート、グリシジルビニ
ルエーテル、グリシジルビニルフタレートおよび
３，４−エポキシブト(1)エンが使用される。その
際これらのモノマーの１種を専ら使用し、その結
果、生成する親水性ラテツクス粒子はホモポリマ
ーであるが、これらのモノマーの混合物を共重合
してもよい。 エポキシド基の含量を制御するために前記のグ
リシジル化合物１種または数種と一緒に他のモノ
マー、例えばスチレン、ジエン、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、アルキル−、ヒドロキシ
アルキル−およびアミノアルキルアクリレート、
アルキル−、ヒドロキシアルキル−およびアミノ
アルキルメタクリレート、ビニルエーテル、ビニ
ルエステル、Ｎ−ビニルピロリドン等も共重合す
ることができる。 着色料または螢光性化合物、例えばフルオレセ
インのモノマーの重合性誘導体の存在で重合して
もよい。このようにしてヒトまたは動物の組織で
抗原もしくは抗体を検出するために好適である着
色した、もしくは螢光性のラテツクス粒子が得ら
れる。この検出方法は組織学で組織断片を製造す
るのに特に好適である。モノマーの重合性誘導体
としては有利に着色料もしくは螢光性化合物が使
用され、この中に自体公知の方法でメタクリル基
もしくはアクリル基が導入される。 生成するラテツクス粒子の水に対する難溶性を
高めるためにエマルジヨン重合中に常用の架橋
剤、例えばアルキレン−またはヒドロキシアルキ
レンジアクリレート、アルキレン−またはヒドロ
キシアルキレンジメタクリレート、アルキレンビ
スアクリルアミドまたはアルキレンビスアクリル
メタクリルアミド、ジビニルベンゼン等を添加し
てもよい。 開始剤としてエマルジヨン重合で常用の水溶性
開始剤を使用することができる。有利にペルオキ
ソジスルフエート、ペルオキソボレート、過酸化
水素または好適なレドツクス系が使用される。 水に難溶性のモノマー１種または数種を乳化剤
不含のエマルジヨン重合により親水性ラテツクス
粒子を製造するための方法は空中酸素もしくは遊
離の酸素に対して敏感である。したがつて酸素を
すべてのポリマー成分および容器から十分な煮
沸、不溶性ガス雰囲気下における蒸溜または窒
素、アルゴンまたは他の不活性ガスの導通により
きわめて慎重に除去しなければならない。 乳化剤不含のエマルジヨン重合は有利に水相対
モノマー相の浴比を容量に関して８：１〜16：１
で実施する。 水相に溶けた開始剤の濃度は有利に0.5〜1.5
ｇ／であり、かつモノマー相中のエポキシドの
濃度は有利に１〜100重量％である。 エマルジヨン重合は有利に温度０〜80℃で実施
する。温度は選択された開始剤に依存する。ペル
オキソ二硫酸カリウムの使用の際には有利に60〜
70℃で作業する。同様に反応時間は開始剤の選択
に依存し、５〜40時間である。 親水性ラテツクス粒子は厳密に球形で、単分散
系で分散され、かつ直径0.15〜1.5μｍの互いにほ
ぼ同じ大きさの粒子である。 親水性ラテツクス粒子はエマルジヨン重合終了
後尚重合されないモノマーの残分を含んでいる場
合があり、この残分は水蒸気蒸溜または透析によ
り除去することができる。この場合にも遠心分離
によりラテツクス粒子を安定性をこわさずに沈降
させることができ、その結果引続き再分散するこ
とができる、親水性ラテツクス粒子の特に有利な
性質は保持される。このようにして本発明による
ラテツクスは数度の遠心分離およびデカンテーシ
ヨンによつて簡単に精製することができる。 ラテツクスの末端の遊離エポキシド基は種々の
化学物質に対して高反応性であり、したがつて容
易に加水分解でき、過ヨウ素酸塩もしくは過ヨウ
素酸を用いて酸化してアルデヒド基にし、アンモ
ニア、第１アミン、ジアミンまたはヒドラジンと
反応させて第１または第２アミノ基にし、または
他の公知の反応を用いて変性することができる。
ラテツクスのエマルジヨンは乳化剤を欠いている
にもかかわらずエポキシド基の変性が所望により
エマルジヨン重合の間も実施し得るほど高い安定
性を有し、そのために既に重合反応から表面が例
えば第１アミノ基で変性されたラテツクスが生成
する。次いで変性された、または誘導体化された
エポキシド基は、キヤリヤとして作用する親水性
ラテツクス粒子に共有結合される生物学的におよ
び／または免疫学的に活性なたん白質との“結合
（Kupplung）”に使用される。 前記の課題は親水性ラテツクス粒子を生物学的
および／または免疫学的に活性な物質の血清学的
に不活性なキヤリヤとして、例えばペプチド、た
ん白質、酵素、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体
および微生物のキヤリヤとして使用することによ
り解決される。 本発明の目的はキヤリヤとして親水性ラテツク
ス粒子およびこのキヤリヤに直接または“ブリツ
ジ”としての結合剤を介して共有結合する、生物
学的および／または免疫学的に活性な前記の物質
を含む診断薬である。 本発明による診断薬は同位元素標識免疫定量法
（RIA）、酵素免疫定量法（EIA）およびいわゆる
ELISA（酵素結合免疫吸着定量法）で使用するの
に特に好適である。 例 １（参考） ペルオキソ二硫酸カリウム（K2S2O8）0.08ｇ
を蒸溜水80mlに溶かし、かつ３分間窒素を導通さ
せることにより空中酸素を排除する。同時にグリ
シジルメタクリレート10mlから同様に空中酸素を
除く。２成分をガラス反応器に入れ、かつ更に10
分間窒素で処理する。次いで反応器を閉じ、かつ
反応を温度65℃で不断に撹拌下に６時間実施す
る。この期間の後変換率は98％である。反応生成
物は直径0.44μｍの球形の、単分散系に分配され
るポリグリシジルメタクリレート粒子から成るラ
テツクスである。 例 ２（参考） 例１と同様にしてK2S2O80.08ｇを溶かした蒸
溜水160mlおよびグリシジルメタクレート15重量
％とスチレン85重量％の混合物10mlを別個に酸素
を排除し、かつ温度65℃で不断に撹拌下に６時間
互いに反応させる。変換率は71.6％である。重合
しない残量モノマーを水蒸気蒸溜により除く。生
じる単分散系コポリマーのラテツクス粒子は直径
0.22μｍを有する。 例 ３（参考） 例１と同様にして、蒸溜水100ml中の
K2S2O80.1ｇの溶液およびグリシジルメタクリレ
ート15重量％と酢酸ビニル85重量％の混合物10ml
を互いに反応させる。変換率は80％である。残量
モノマーを水蒸気蒸溜により除く。生成するラテ
ツクスは直径0.16μｍの単分散系、球形粒子であ
る。 こうして製造されたラテツクス100mlを0.1M−
NaOH溶液100mlと混合し、かつ温度約25℃で24
時間放置する。加水分解中および後もラテツクス
の安定性は保持される。エマルジヨンを遠心分離
し、上澄みをデカンテーシヨンし、かつ固体相を
再び水中に分散させる。遠心分離および再分散を
２度繰返す。生じる中性エマルジヨンを（Ｍ−
H2SO4でPH３にし、かつ過ヨウ素酸をエポキシ
ド基と当量で加える。酸化は25℃で約24時間行な
う。引続き未反応低分子物質を透析によつて除
く。安定なエマルジヨンの変性ラテツクス粒子は
アルデヒド基2.8重量％または0.97ミリモル／ｇ
を含有する。 例 ４（参考） 例１のようにして蒸溜水100ml中のK2S2O80.1
ｇの溶液およびグリシジルメタクリレート15重量
％とイソプレン85重量％の混合物10mlを温度65℃
で24時間反応させる。変換率は76％である。引続
き残量モノマーを水蒸気蒸溜により除く、その際
直径0.25μｍの安定な、単分散系に分散する球形
のラテツクス粒子が生じる。 引続きこのエマルジヨン100mlにアンモニア水
溶液（25％）100mlを加え、かつ室温で24時間放
置し、その際エポキシド基がアンモノリシスによ
つてアミノ基に変わる。引続き反応生成物を過ヨ
ウ素酸で処理し、その際アルデヒド基4.5重量％
または1.55ミリモル／ｇを含有するラテツクスが
生じる。 例 ５（参考） 例１のようにして水1.5中のK2S2O81.5ｇの溶
液およびグリシジルメタクリレート15mlを別個に
酸素を除き、かつ互いに反応させる。更に酸素不
含のグリシジルメタクリレート120mlを酸素排除
下に６時間の間反応容器に連続的に滴下する。次
いで更に30分間重合を続ける。変換率は85％であ
り、かつ生成する粒子は直径1.1μｍを有する。 例 ６（参考） 例１のようにしてグリシジルメタクリレート１
重量％とスチレン99重量％の混合物10mlおよび蒸
溜水100ml中のK2S2O80.1ｇの溶液を65℃で22時
間重合し、その際直径0.5μｍの親水性ラテツクス
粒子が生成する。変換率は90％である。 例 ７（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlを
2N−苛性ソーダ液５mlとともに一夜にわたつて
室温で撹拌し、次いで５時間水に対して透析す
る。残溜する懸濁液を過ヨウ素酸ナトリウム100
mgの添加によりPH３に調節し、かつ一夜にわたつ
て室温で撹拌し、次いで４時間蒸溜水に対して透
析する。 例 ８（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlを
濃アンモニア溶液10mlとともに室温で20時間撹拌
し、かつ流水に対して48時間透析する。得られる
懸濁液を遠心分離する。乾燥物質の窒素含量は約
１％であり、これは各約10のエポキシド単位のア
ミノ化に相当し、しかし表面の優れた反応では確
実により高い誘導体化度に相当する。遠心分離さ
れた固体物質を0.1N−苛性ソーダ液20mlで吸収
する。これに撹拌下にジメチルホルムアミド６ml
に溶かしたコハク酸ヒドロキシサクシンイミドエ
ステル−アミドアセトアルデヒド−アセタール
1.5ｇを滴下する。生成する懸濁液を更に３時間
撹拌し、次いで1N−塩酸でPH３にし、かつ流れ
る蒸溜水に対して12時間透析する。 例 ９（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlに
Na2S・9H2O0.5ｇを加え、かつ室温で２日撹拌
する。引続き懸濁液の臭いがなくなるまで流れる
蒸溜水に対して透析し、次いで懸濁液を遠心分離
する。乾燥物質はイオウ約２％を有し、これは約
10のエポキシド単位の誘導体化に相当し、表面で
の優れた反応では確実により高い誘導体化度に相
当する。 遠心分離された生成物にジメチルホルムアミド
６mlに溶かした６−マレインイミドヘキサン酸ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル１ｇを加え、室
温で３時間撹拌し、次いで流れる蒸溜水に対して
12時間透析する。 例 10 ラテツクス−γ−グロブリンコンジユゲート
（Konjugat）の形成 γ−グロブリン溶液１ml（たん白質56.6mg含
有）に (a) 例１により製造されたラテツクス懸濁液 (b) 例７により誘導体化されたラテツクス懸濁液 (c) 例８により誘導体化された 〃 (d) 例９により誘導体化された 〃 各20mlを加え、かつ室温で12時間透析する。残留
する懸濁液を遠心分離する。引続き上澄み液中の
遊離のたん白質を測定する。実測値からラテツク
ス粒子に結合された割合を計算することができ
る。それによれば バツチ(a)はγ−グロブリン ８mgを結合して含有、 〃 (b)は 〃 43mgを結合して含有、 〃 (c)は 〃 15mgを結合して含有、 〃 (d)は 〃 19mgを結合して含有。 例 11 ラテツクス−IgG−コンジユゲート 例10のようにしてIgG−溶液および種々のラテ
ツクス懸濁液からラテツクス−IgGコンジユゲー
トを製造する。抗体複合体形成によつてラテツク
ス粒子にIgG−分子が積載されていることが検出
される。 以下本発明による親水性ラテツクス粒子の使用
例として、詳細にはヒツジの抗T4−血清からの
T4−抗体を用いてチロキシン（T4）を免疫定量
するための、および二重抗体−分離法を用いて血
清中のヒトチレオトロピン（TSH）を定量する
ための２つの診断薬を記載する。 例 12 ヒツジの抗T4−血清に対するキヤリヤとして
のホモポリグリシジルメタクリレートラテツク
ス粒子の使用：T4−ELISAを行なうための診
断薬 チロキシン（T4）をELISAを用いて定量する
ために先ずヒツジの抗T4−血清からのT4−抗体
を本発明による親水性ホモポリグリシジルメタク
リレートラテツクス粒子に、該粒子を例７〜９の
いずれかによつて誘導体化し、かつ例10および11
と同様にしてT4−抗体と反応させることによつ
て共有結合させる。こうして得られるソリツド−
フエース（Solid−Face）−抗体は試験のための
第１試薬である。第２試薬としてT4を自体公知
の方法で好適な酵素、例えばペルオキシダーゼ
（POD）またはβ−ガラクトシダーゼ（β−Gal）
で標識する、すなわち結合して酵素コンジユゲー
トにする。酵素としてこの例ではβ−Galを使用
する。第３試薬は未知量のT4を含有する試料で
あり、かつ第４試薬は酵素コンジユゲートのβ−
Galの常用の基質であり、詳細にはこの例ではト
リス−HCl−緩衝液（PH7.3）中のニトロフエニ
ル−β−ガラクトシドである。 試験の原理は次の３つの反応経過に基づく： １ 一方の親水性ラテツクス粒子に共有結合せる
T4−抗体と他方の酵素標識T4（“酵素コンジユ
ゲート”）と試料中に含まれる遊離のT4との間
の免疫反応。この反応ではソリツド−フエース
−抗体、酵素コンジユゲートおよび試料のT4
の間に競合的結合が起こる。 ２ Ｂ／Ｆ−分離（Ｂ＝結合、Ｆ＝遊離）。これ
は結合した酵素コンジユゲート(B)と結合しない
酵素コンジユゲート(F)の分離である。この分離
は有利に遠心分離または例えば水または好適な
緩衝液に対する透析によつて達成される。 ３ 酵素コンジユゲートと常用の、使用される酵
素に関して特異的な基質との間に進行し、かつ
比色法または他の公知方法で追跡することので
きる酵素検出反応。酵素活性は上澄み液（遊離
部分）中でかまたは再懸濁された沈澱物（結合
部分）中で測定することができる。 試験実施 前記のようにして製造されたラテツクス−抗
T4懸濁液を水または緩衝液中で比１：1000で希
釈する。この懸濁液0.5mlに種々の既知量のT4−
含量を有するT4−血清標世溶液100μおよびT4
−β−Gal−コンジユゲート溶液100μを加え
る。反応混合物を室温で30分恒温保持する。恒温
保持の間１バツチを不断に振盪し、かつ同じT4
−標準含量を有する１バツチを単に放置した。次
いでそれぞれ懸濁液を遠心分離し、かつＦ−相が
存在する上澄み液を分離した。Ｂ−相、すなわち
ソリツド−フエース抗体に結合したT4−β−Gal
コンジユゲートは沈澱物中に存在する。酵素活性
を測定するためにこれを ｐ−ニトロフエニル−β−ガラクトシド（シグマ
社） 450mg／ 塩化ナトリウム 100ミリモル 塩化マグネシウム 10ミリモル トリス緩衝剤／HCl 10ミリモル メルカプトエタノール 0.4v／ｖ％ から成る、PH7.3の過剰の基質溶液に加え、かつ
公知方法で波長405nｍで吸光度を測定する。外
部の機械的な混合をしない場合に懸濁状態で保持
されるラテツクス粒子が約11％減少したシグナル
を与えることが示された。 このようにしてT4−検量曲線を測定した後、
引続き同様にしてT4−標準血清100μの代わり
に未知量のT4含量の試料それぞれ100μを使用
し、かつ再懸濁後のＢ−相の吸光度を基質溶液中
で測定することにより定量を行なつた。 親水性ラテツクス粒子が抗体および抗原のキヤ
リヤとしてきわめて好適であり、かつそれらの免
疫反応性の損なわないことが認めれた。したがつ
て親水性ラテツクス粒子はソリツド−フエース−
酵素免疫試験でキヤリヤとして有利に使用するこ
とができる。更に緩衝剤条件にある親水性ラテツ
クス粒子が長期間にわたつて懸濁状態を保持し、
したがつて粒子の密度がほぼ１に等しいことが認
められた。その上に本発明による親水性ラテツク
ス粒子は免疫反応性を損なわずに良好に遠心分離
可能であり、かつ再懸濁可能である。 例 13 ヒトチレオトロピン（TSH）を定量するため
の酵素免疫定量（EIA） ヒト血清中のTSHの測定は甲状腺疾病の診断
で著しく重要である。基礎TSH濃度の著しい上
昇で１次甲状腺機能減弱が認められる。その他血
清中のTSH基礎値0.5〜3μU／mlがTRH（刺激ホ
ルモン放出因子）で刺激後に上昇しない場合に甲
状腺機能減弱は確実にあり得ない。それに対して
TSH値が少なくとも2.5μU／ml、しかし25μU／
ml以下で上昇する場合には甲状腺物質代謝は高い
確率で損なわれていない。25μU／mlを僅かに上
回つた基礎値の上昇は潜在的な症状発現前の甲状
腺機能減弱を推測することができる。既にTSH
の酵素免疫定量は公知である〔“クリニカ・ヒミ
カ・アクタ（Clinica Chemica Acta）”、第67
巻、263〜268頁（1976年）；“エンツイーメ・ラベ
ルド・イムノアツセイ・オブ・ホルモンズ・アン
ド・ドラツグス（enzyme labelled
immunoassay of hormones and drugs”、327〜
337頁。S.B.Pal、Walter de Gruyter、ベルリン
およびN.Y.（1978年）；“アナリユーチカル・ビオ
ケミストリ（Analytical Biochemistry）”第96
巻、419〜425頁（1979年）〕。しかしこれらの公知
の測定法はきわめて長い恒温保持時間（５日ま
で）を必要とし、鋭敏ではなく（TSH5μU／ml）
または高価な測定装置（螢光測定装置または発光
測定装置）と前提とし、その際その他にバツチを
混合するための装置が必要である。 本発明による親水性ラテツクス粒子の使用は２
1/2日にすぎない全恒温保持時間で二重抗体分離
技術によるTSHの測光法による測定を可能にす
る。その際第２の抗体が本発明による親水性ラテ
ツクス粒子に共有結合される。次いで結合された
酵素活性をＢ／Ｆ−分離により測定する。ラテツ
クス粒子は水の密度よりも著しくは高くない密度
を有しているので、ラテツクス粒子は酵素反応の
間も懸濁状態であり、これにより常用の場合が省
略される。抗体の高い負荷可能性のために可能で
あるきわめて希釈されたラテツクス粒子を使用す
る場合には酵素反応終了後の粒子の遠心分離も省
略される、それというのも懸濁液を通過して測光
できるからである。 免疫学的試験方法で一般に使用されるラテツク
スとは異なり抗体を負荷された、本発明による親
水性ポリグリシジルメタクリレート粒子は遠心分
離後容易に再懸濁させることができる。同じ理由
から酵素で標識された抗原のきわめて小さあ非特
異的吸着が示される（第１抗体の不在での結合さ
れた活性）。 試験実施 TSH−標準（TSH不含血清中の国際参照調剤
MRC68／38）0.2mlを１：150000で水または好適
な緩衝溶液で希釈した、自体公知の、例えばモル
モツトの抗TSH−抗血清0.1mlとともに恒温保持
する。12時間後グルコースオキシダーゼ（GOD）
に共有結合せるTSH（TSH約1.5×10-9ｇに相当）
から成る酵素コンジユゲートの溶液0.1mlを第１
工程の混合物にピペツトで添加する。この混合物
に更に12時間後ラテツクス懸濁液0.1mlをピペツ
トで添加する。該懸濁液はメタクリレートラテツ
クス0.1〜１mg／mlを含有し、その際例11に記載
されているように乾燥ラテツクス粒子1000mgにつ
き、モルモツト−IgGに対するヤギの抗血清から
得られた免疫グロブリンフラクシヨンのたん白質
５〜150mgを加え、かつそうして親水性ラテツク
ス粒子に共有結合された。１時間後遠心分離し、
かつラテツクス粒子の沈澱物を好適な緩衝溶液１
mlで洗う、それによりラテツクス粒子は再懸濁さ
れる。引続き改めて数度遠心分離し、かつ洗浄す
る。上澄み液を棄てる。 各バツチにGODの基質溶液１mlをピペツトで
入れ、かつ短時間振盪する。その後少なくとも２
時間ラテツクス粒子は均一に懸濁されたままであ
る。次いで懸濁液を目盛りクベツトに入れ、かつ
405nｍで吸光度を測定する。各吸光度から基質
盲検値L1を引く。L1は、抗TSH−抗血清とTSH
−GODとの混合物に添加された前記のラテツク
ス懸濁液と同じ物質を負荷されたラテツクス粒子
を含む基質溶液１mlの吸光度である。 こうして求められた吸光度を種々のTSH標準
濃度に関して記録する。この検量曲線を用いて臨
床試料中の未知含量のTSHの濃度を測定した吸
光度に基づいて読み取る。 好適な緩衝溶液として有利にEDTA0.005モル、
ウシ血清アルブミン0.1％並びにNaCl0.15モルを
含む0.04M−ホスフエート溶液（PH7.4）を使用
する。 GOD−基質溶液として有利にグルコース５
ｇ／100ml、２，2′−アジノ−ジ−〔３−エチル−
ベンズチアゾロン−スルホン酸(6)〕（ABTS）
100mg／100ml、ペルオキシダーゼ（POD）５
mg／100ml、0.05M−ホスフエート緩衝液（PH
5.6）を含む水溶液を使用する。 比較のために３つの血清試料のTSH含量を前
記EIA(A)並びに公知の二重抗体−RIA(B)で測定し
た。次表に示す通りそれぞれ測定値は良く一致す
る： (A) (B) 血清１ 11.2μU／ml 12.5μU／ml ２ 7.3μU／ml 7.1μU／ml 血清３ 3.8μU／ml 4.5μU／ml 前記のTSH−測定からも、本発明による親水
性ラテツクス粒子が生物学的および／または免疫
学的に活性な物質、特に抗体のキヤリヤとしてき
わめて好適であることが得られる。 非特異的結合の測定 TSH標準試料を前記の試験実施の項目で記載
されたようにして処理し（試料Ｃ）、かつほとん
ど試料Ｃと同じ反応にかけられた同様の試料（試
料Ｄ）と比較する。抗TSH−抗血清のみは省い
た。試料ＣとＤの懸濁液で測定された吸光度の比
較は非特異的結合が1.5％よりも小さいことを示
す。 【表】
関する。 特に迅速かつ簡単に実施し、かつしばしば裸眼
で観察することができるために免疫学で多くの診
断測定の範囲内で利用される抗原抗体複合物の凝
集反応には免疫学的に活性な物質、例えば抗体の
キヤリヤとして疎水性ラテツクス粒子が長い間使
用されている。この疎水性ラテツクス粒子は大て
いはポリスチレンホモポリマーまたはコポリマ
ー、例えばスチレン／ブタジエンコポリマーまた
はアクリルニトリル／ブタジエン／スチレンコポ
リマー（ABS）から成り、かつエマルジヨン重
合により製造される。 長い間知られているエマルジヨン重合では、一
般に４成分が添加される：水に難溶性のモノマー
または数種の水に難溶性のモノマーの混合物、
水、乳化剤および水溶性開始剤。モノマーは乳化
剤によつて小滴の形状に液化され、その際多数の
乳化剤分子の会合によつて中でも一部は空の、か
つ一部はモノマー分子によつて満たされた大きな
ミセルが形成される。後者はモノマーの“可溶
性”として示される。水溶性開始剤は、水相の各
モノマー分子の重合、またモノマーで満たされた
ミセルで並びにモノマー滴で重合を開始もしくは
活性化することのできるラジカルを形成する。し
かし実際には重合は膨潤したミセルで起る、それ
というのも一方でミセル中のモノマー濃度が周囲
における個々の溶けたモノマー分子の濃度よりも
著しく大きく、また他方でミセルの活性化の確率
がモノマー滴の数に比べてミセルの数が多いため
にきわめて高いからである。充填ミセルの直径は
重合中にミセルが最終的に球状のラテツクス粒子
に移行するまで増大する。活性化されないミセル
の乳化剤分子および消費されたモノマー滴の表面
からの乳化剤分子はラテツクス粒子の表面をおお
い、かつ生成するポリマー分散液の安定化に役立
つ。 例えば界面活性剤または湿潤剤であつてよい乳
化剤またはエマルジヨン安定剤の添加下に公知方
法により製造されるラテツクスは次の欠点を持つ
ており、これらの欠点は特に免疫学的に活性な物
質のキヤリヤとしての使用および連続的な溶液測
定系での使用を妨げる： １ ラテツクス粒子の疎水性表面に所望の免疫学
的に活性な物質、例えば抗体の他に非特異的に
多数の他の血清成分が結合する； ２ 共有結合によらず吸着的にのみ結合せる免疫
学的に活性な物質は診断試験の経過の中で測定
中に再び分離する場合がある； ３ エマルジヨン重合で乳化剤または安定剤とし
て使用される界面活性剤が水溶液中に拡散して
生物学的に活性なたん白質の構造を、したがつ
て活性を破壊する場合がある； ４ 安定化作用を有する界面活性剤を除く際にラ
テツクス懸濁液が凝集し、かつ遠心分離の際に
も安定性がこわれる。その際生成する沈澱物は
再懸濁されて前の状態にするのがきわめて困難
かまたはもはや可能ではない。 これらの欠点を回避するために既に種々の提案
がなされたが、これらは常に前記の問題の一部の
みを解決し得たにぎなかつた。 カルボキシル化ABS−コポリマーおよびカル
ボキシル化スチレン／ブタジエンコポリマーから
成る、粒度0.01〜0.9μｍの疎水性ラテツクス粒子
が西ドイツ国特許公告第2203377号公報から公知
であり、これらは血清学的に不活性のキヤリヤと
して生物学的に活性なたん白質に対して使用さ
れ、その際たん白質はキヤリヤに、ラテツクス中
に導入されたカルボキシル基を介してアミド結合
の形成下に共有結合される。 西ドイツ国特許公開第2812845号公報からABS
−コポリマーから成る、粒度0.05〜1μｍの疎水性
ラテツクスが公知であり、この場合にもラテツク
スはカルボキシル基で変性され、かつ反応性側鎖
と縮合しており、そのために免疫学的に活性な物
質も共有結合できる。 この公知の疎水性ラテツクスによつて前記の第
２の問題は解決されるが他のすべての欠点は相変
わらず存在する。 したがつて疎水性ラテツクスの代わりに親水性
ゲルを免疫学的に活性な物質のキヤリヤとして使
用することも試みられた。親水性ゲルは吸着性を
全くまたはきわめて僅かしか持たず、他方たん白
質のかかるゲルへの共有結合は公知であるので、
その製法および粒度に基づいて“ラテツクス”と
示してもよい“マイクロゲル”が提案された。か
かる親水性ラテツクスは例えば米国特許第
4138383号明細書から公知である。該ラテツクス
は0.35μｍよりも小さな直径を有する球形粒子か
ら成り、ラジカルによつて開始される水性エマル
ジヨン重合の条件下に製造され、その際モノマー
としてアクリルアミド、アクリル酸、メタクリル
酸またはアクリレートが使用される。乳化剤とし
ては例えば金属石けんが使用される。こうして得
られる親水性マイクロゲルに生物学的および／ま
たは免疫学的に活性な物質が自体公知の方法でカ
ルボジイミド−ブリツジまたはグルタルジアルデ
ヒド−ブリツジを介して共有結合する。これによ
つて前記の第１と第２の問題が解決されるが、第
３と第４の問題は解決されない。それというのも
エマルジヨン重合は相変らず乳化剤または安定剤
の添加下に実施しなければならないからである。 本発明の課題は、前記の４つの欠点すべてを回
避することのできる親水性ラテツクスを含有する
診断薬を見い出すことである。したがつて本発明
の課題は、特に生物学的および／または免疫学的
に活性な物質を共有結合することができ、生物学
的に活性なたん白質の構造、したがつて活性を損
なわず、その安定性が遠心分離の際にこわれず、
かつ凝集し、かつ引続き再び容易に懸濁させるこ
とのできる親水性ラテツクス粒子を含有する診断
薬を見出すことである。 この課題は本発明によれば水に難溶性のモノマ
ーのホモポリマーまたはコポリマーから成る親水
性ラテツクス粒子を含有する診断薬によつて解決
される。該親水性ラテツクス粒子は水溶性の、ラ
ジカルを形成する開始剤の存在で、しかし乳化
剤、安定剤または湿潤剤を添加せずにエマルジヨ
ン重合によつて製造可能であり、かつホモポリマ
ーの場合にモノマーが、もしくはコポリマーの場
合にモノマー類の一部が分子中に少なくとも１個
の重合可能なＣ＝Ｃ−二重結合を有するエポキシ
ドである。 意想外にも冒頭で引用された公知技術にも記述
されている、当業界で長い間支配的であつた思想
に反して乳化剤、安定剤または湿潤剤の添加がエ
マルジヨン重合の実施にまつたく必要ではないこ
とが示された。したがつて、乳化剤として使用さ
れる金属石けんまたは界面活性剤はラテツクス粒
子から拡散し、かつラテツクス粒子に共有結合せ
るたん白質の生物学的活性を損ないまたは完全に
破壊したために従来は無条件に必要であつた、ポ
リマーのラテツクス粒子からの大ていはきわめて
困難かつ煩雑な乳化剤の除去が省略される。 少なくとも１個の重合可能な二重結合を含むグ
リシジル化合物をモノマーとして使用するのがき
わめて有利であると示された。該化合物の構造は
重合性の二重結合中に疎水性部分およびエポキシ
ド基、オキシラン環中に同時に親水性部分を有す
る。生成するラテツクス懸濁液は乳化剤、安定剤
または湿潤剤の不在にもかかわらず凝集しない。
ラテツクス懸濁液の安定化は遠心分離の際にもこ
わされない。末端エポキシド基は種々の反応（加
水分解、アンモノリシス、アミノリシス、縮合）
をきわめて受け易いのでエポキシド基は単分散系
に分散したラテツクス球体の表面を該エポキシド
基が水相方向に配向されるようにおおつているに
ちがいない。 モノマーとしては有利にグリシジルメタクリレ
ート、グリシジルアクリレート、グリシジルビニ
ルエーテル、グリシジルビニルフタレートおよび
３，４−エポキシブト(1)エンが使用される。その
際これらのモノマーの１種を専ら使用し、その結
果、生成する親水性ラテツクス粒子はホモポリマ
ーであるが、これらのモノマーの混合物を共重合
してもよい。 エポキシド基の含量を制御するために前記のグ
リシジル化合物１種または数種と一緒に他のモノ
マー、例えばスチレン、ジエン、アクリルアミ
ド、メタクリルアミド、アルキル−、ヒドロキシ
アルキル−およびアミノアルキルアクリレート、
アルキル−、ヒドロキシアルキル−およびアミノ
アルキルメタクリレート、ビニルエーテル、ビニ
ルエステル、Ｎ−ビニルピロリドン等も共重合す
ることができる。 着色料または螢光性化合物、例えばフルオレセ
インのモノマーの重合性誘導体の存在で重合して
もよい。このようにしてヒトまたは動物の組織で
抗原もしくは抗体を検出するために好適である着
色した、もしくは螢光性のラテツクス粒子が得ら
れる。この検出方法は組織学で組織断片を製造す
るのに特に好適である。モノマーの重合性誘導体
としては有利に着色料もしくは螢光性化合物が使
用され、この中に自体公知の方法でメタクリル基
もしくはアクリル基が導入される。 生成するラテツクス粒子の水に対する難溶性を
高めるためにエマルジヨン重合中に常用の架橋
剤、例えばアルキレン−またはヒドロキシアルキ
レンジアクリレート、アルキレン−またはヒドロ
キシアルキレンジメタクリレート、アルキレンビ
スアクリルアミドまたはアルキレンビスアクリル
メタクリルアミド、ジビニルベンゼン等を添加し
てもよい。 開始剤としてエマルジヨン重合で常用の水溶性
開始剤を使用することができる。有利にペルオキ
ソジスルフエート、ペルオキソボレート、過酸化
水素または好適なレドツクス系が使用される。 水に難溶性のモノマー１種または数種を乳化剤
不含のエマルジヨン重合により親水性ラテツクス
粒子を製造するための方法は空中酸素もしくは遊
離の酸素に対して敏感である。したがつて酸素を
すべてのポリマー成分および容器から十分な煮
沸、不溶性ガス雰囲気下における蒸溜または窒
素、アルゴンまたは他の不活性ガスの導通により
きわめて慎重に除去しなければならない。 乳化剤不含のエマルジヨン重合は有利に水相対
モノマー相の浴比を容量に関して８：１〜16：１
で実施する。 水相に溶けた開始剤の濃度は有利に0.5〜1.5
ｇ／であり、かつモノマー相中のエポキシドの
濃度は有利に１〜100重量％である。 エマルジヨン重合は有利に温度０〜80℃で実施
する。温度は選択された開始剤に依存する。ペル
オキソ二硫酸カリウムの使用の際には有利に60〜
70℃で作業する。同様に反応時間は開始剤の選択
に依存し、５〜40時間である。 親水性ラテツクス粒子は厳密に球形で、単分散
系で分散され、かつ直径0.15〜1.5μｍの互いにほ
ぼ同じ大きさの粒子である。 親水性ラテツクス粒子はエマルジヨン重合終了
後尚重合されないモノマーの残分を含んでいる場
合があり、この残分は水蒸気蒸溜または透析によ
り除去することができる。この場合にも遠心分離
によりラテツクス粒子を安定性をこわさずに沈降
させることができ、その結果引続き再分散するこ
とができる、親水性ラテツクス粒子の特に有利な
性質は保持される。このようにして本発明による
ラテツクスは数度の遠心分離およびデカンテーシ
ヨンによつて簡単に精製することができる。 ラテツクスの末端の遊離エポキシド基は種々の
化学物質に対して高反応性であり、したがつて容
易に加水分解でき、過ヨウ素酸塩もしくは過ヨウ
素酸を用いて酸化してアルデヒド基にし、アンモ
ニア、第１アミン、ジアミンまたはヒドラジンと
反応させて第１または第２アミノ基にし、または
他の公知の反応を用いて変性することができる。
ラテツクスのエマルジヨンは乳化剤を欠いている
にもかかわらずエポキシド基の変性が所望により
エマルジヨン重合の間も実施し得るほど高い安定
性を有し、そのために既に重合反応から表面が例
えば第１アミノ基で変性されたラテツクスが生成
する。次いで変性された、または誘導体化された
エポキシド基は、キヤリヤとして作用する親水性
ラテツクス粒子に共有結合される生物学的におよ
び／または免疫学的に活性なたん白質との“結合
（Kupplung）”に使用される。 前記の課題は親水性ラテツクス粒子を生物学的
および／または免疫学的に活性な物質の血清学的
に不活性なキヤリヤとして、例えばペプチド、た
ん白質、酵素、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体
および微生物のキヤリヤとして使用することによ
り解決される。 本発明の目的はキヤリヤとして親水性ラテツク
ス粒子およびこのキヤリヤに直接または“ブリツ
ジ”としての結合剤を介して共有結合する、生物
学的および／または免疫学的に活性な前記の物質
を含む診断薬である。 本発明による診断薬は同位元素標識免疫定量法
（RIA）、酵素免疫定量法（EIA）およびいわゆる
ELISA（酵素結合免疫吸着定量法）で使用するの
に特に好適である。 例 １（参考） ペルオキソ二硫酸カリウム（K2S2O8）0.08ｇ
を蒸溜水80mlに溶かし、かつ３分間窒素を導通さ
せることにより空中酸素を排除する。同時にグリ
シジルメタクリレート10mlから同様に空中酸素を
除く。２成分をガラス反応器に入れ、かつ更に10
分間窒素で処理する。次いで反応器を閉じ、かつ
反応を温度65℃で不断に撹拌下に６時間実施す
る。この期間の後変換率は98％である。反応生成
物は直径0.44μｍの球形の、単分散系に分配され
るポリグリシジルメタクリレート粒子から成るラ
テツクスである。 例 ２（参考） 例１と同様にしてK2S2O80.08ｇを溶かした蒸
溜水160mlおよびグリシジルメタクレート15重量
％とスチレン85重量％の混合物10mlを別個に酸素
を排除し、かつ温度65℃で不断に撹拌下に６時間
互いに反応させる。変換率は71.6％である。重合
しない残量モノマーを水蒸気蒸溜により除く。生
じる単分散系コポリマーのラテツクス粒子は直径
0.22μｍを有する。 例 ３（参考） 例１と同様にして、蒸溜水100ml中の
K2S2O80.1ｇの溶液およびグリシジルメタクリレ
ート15重量％と酢酸ビニル85重量％の混合物10ml
を互いに反応させる。変換率は80％である。残量
モノマーを水蒸気蒸溜により除く。生成するラテ
ツクスは直径0.16μｍの単分散系、球形粒子であ
る。 こうして製造されたラテツクス100mlを0.1M−
NaOH溶液100mlと混合し、かつ温度約25℃で24
時間放置する。加水分解中および後もラテツクス
の安定性は保持される。エマルジヨンを遠心分離
し、上澄みをデカンテーシヨンし、かつ固体相を
再び水中に分散させる。遠心分離および再分散を
２度繰返す。生じる中性エマルジヨンを（Ｍ−
H2SO4でPH３にし、かつ過ヨウ素酸をエポキシ
ド基と当量で加える。酸化は25℃で約24時間行な
う。引続き未反応低分子物質を透析によつて除
く。安定なエマルジヨンの変性ラテツクス粒子は
アルデヒド基2.8重量％または0.97ミリモル／ｇ
を含有する。 例 ４（参考） 例１のようにして蒸溜水100ml中のK2S2O80.1
ｇの溶液およびグリシジルメタクリレート15重量
％とイソプレン85重量％の混合物10mlを温度65℃
で24時間反応させる。変換率は76％である。引続
き残量モノマーを水蒸気蒸溜により除く、その際
直径0.25μｍの安定な、単分散系に分散する球形
のラテツクス粒子が生じる。 引続きこのエマルジヨン100mlにアンモニア水
溶液（25％）100mlを加え、かつ室温で24時間放
置し、その際エポキシド基がアンモノリシスによ
つてアミノ基に変わる。引続き反応生成物を過ヨ
ウ素酸で処理し、その際アルデヒド基4.5重量％
または1.55ミリモル／ｇを含有するラテツクスが
生じる。 例 ５（参考） 例１のようにして水1.5中のK2S2O81.5ｇの溶
液およびグリシジルメタクリレート15mlを別個に
酸素を除き、かつ互いに反応させる。更に酸素不
含のグリシジルメタクリレート120mlを酸素排除
下に６時間の間反応容器に連続的に滴下する。次
いで更に30分間重合を続ける。変換率は85％であ
り、かつ生成する粒子は直径1.1μｍを有する。 例 ６（参考） 例１のようにしてグリシジルメタクリレート１
重量％とスチレン99重量％の混合物10mlおよび蒸
溜水100ml中のK2S2O80.1ｇの溶液を65℃で22時
間重合し、その際直径0.5μｍの親水性ラテツクス
粒子が生成する。変換率は90％である。 例 ７（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlを
2N−苛性ソーダ液５mlとともに一夜にわたつて
室温で撹拌し、次いで５時間水に対して透析す
る。残溜する懸濁液を過ヨウ素酸ナトリウム100
mgの添加によりPH３に調節し、かつ一夜にわたつ
て室温で撹拌し、次いで４時間蒸溜水に対して透
析する。 例 ８（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlを
濃アンモニア溶液10mlとともに室温で20時間撹拌
し、かつ流水に対して48時間透析する。得られる
懸濁液を遠心分離する。乾燥物質の窒素含量は約
１％であり、これは各約10のエポキシド単位のア
ミノ化に相当し、しかし表面の優れた反応では確
実により高い誘導体化度に相当する。遠心分離さ
れた固体物質を0.1N−苛性ソーダ液20mlで吸収
する。これに撹拌下にジメチルホルムアミド６ml
に溶かしたコハク酸ヒドロキシサクシンイミドエ
ステル−アミドアセトアルデヒド−アセタール
1.5ｇを滴下する。生成する懸濁液を更に３時間
撹拌し、次いで1N−塩酸でPH３にし、かつ流れ
る蒸溜水に対して12時間透析する。 例 ９（参考） 例１により製造されたラテツクス懸濁液20mlに
Na2S・9H2O0.5ｇを加え、かつ室温で２日撹拌
する。引続き懸濁液の臭いがなくなるまで流れる
蒸溜水に対して透析し、次いで懸濁液を遠心分離
する。乾燥物質はイオウ約２％を有し、これは約
10のエポキシド単位の誘導体化に相当し、表面で
の優れた反応では確実により高い誘導体化度に相
当する。 遠心分離された生成物にジメチルホルムアミド
６mlに溶かした６−マレインイミドヘキサン酸ヒ
ドロキシサクシンイミドエステル１ｇを加え、室
温で３時間撹拌し、次いで流れる蒸溜水に対して
12時間透析する。 例 10 ラテツクス−γ−グロブリンコンジユゲート
（Konjugat）の形成 γ−グロブリン溶液１ml（たん白質56.6mg含
有）に (a) 例１により製造されたラテツクス懸濁液 (b) 例７により誘導体化されたラテツクス懸濁液 (c) 例８により誘導体化された 〃 (d) 例９により誘導体化された 〃 各20mlを加え、かつ室温で12時間透析する。残留
する懸濁液を遠心分離する。引続き上澄み液中の
遊離のたん白質を測定する。実測値からラテツク
ス粒子に結合された割合を計算することができ
る。それによれば バツチ(a)はγ−グロブリン ８mgを結合して含有、 〃 (b)は 〃 43mgを結合して含有、 〃 (c)は 〃 15mgを結合して含有、 〃 (d)は 〃 19mgを結合して含有。 例 11 ラテツクス−IgG−コンジユゲート 例10のようにしてIgG−溶液および種々のラテ
ツクス懸濁液からラテツクス−IgGコンジユゲー
トを製造する。抗体複合体形成によつてラテツク
ス粒子にIgG−分子が積載されていることが検出
される。 以下本発明による親水性ラテツクス粒子の使用
例として、詳細にはヒツジの抗T4−血清からの
T4−抗体を用いてチロキシン（T4）を免疫定量
するための、および二重抗体−分離法を用いて血
清中のヒトチレオトロピン（TSH）を定量する
ための２つの診断薬を記載する。 例 12 ヒツジの抗T4−血清に対するキヤリヤとして
のホモポリグリシジルメタクリレートラテツク
ス粒子の使用：T4−ELISAを行なうための診
断薬 チロキシン（T4）をELISAを用いて定量する
ために先ずヒツジの抗T4−血清からのT4−抗体
を本発明による親水性ホモポリグリシジルメタク
リレートラテツクス粒子に、該粒子を例７〜９の
いずれかによつて誘導体化し、かつ例10および11
と同様にしてT4−抗体と反応させることによつ
て共有結合させる。こうして得られるソリツド−
フエース（Solid−Face）−抗体は試験のための
第１試薬である。第２試薬としてT4を自体公知
の方法で好適な酵素、例えばペルオキシダーゼ
（POD）またはβ−ガラクトシダーゼ（β−Gal）
で標識する、すなわち結合して酵素コンジユゲー
トにする。酵素としてこの例ではβ−Galを使用
する。第３試薬は未知量のT4を含有する試料で
あり、かつ第４試薬は酵素コンジユゲートのβ−
Galの常用の基質であり、詳細にはこの例ではト
リス−HCl−緩衝液（PH7.3）中のニトロフエニ
ル−β−ガラクトシドである。 試験の原理は次の３つの反応経過に基づく： １ 一方の親水性ラテツクス粒子に共有結合せる
T4−抗体と他方の酵素標識T4（“酵素コンジユ
ゲート”）と試料中に含まれる遊離のT4との間
の免疫反応。この反応ではソリツド−フエース
−抗体、酵素コンジユゲートおよび試料のT4
の間に競合的結合が起こる。 ２ Ｂ／Ｆ−分離（Ｂ＝結合、Ｆ＝遊離）。これ
は結合した酵素コンジユゲート(B)と結合しない
酵素コンジユゲート(F)の分離である。この分離
は有利に遠心分離または例えば水または好適な
緩衝液に対する透析によつて達成される。 ３ 酵素コンジユゲートと常用の、使用される酵
素に関して特異的な基質との間に進行し、かつ
比色法または他の公知方法で追跡することので
きる酵素検出反応。酵素活性は上澄み液（遊離
部分）中でかまたは再懸濁された沈澱物（結合
部分）中で測定することができる。 試験実施 前記のようにして製造されたラテツクス−抗
T4懸濁液を水または緩衝液中で比１：1000で希
釈する。この懸濁液0.5mlに種々の既知量のT4−
含量を有するT4−血清標世溶液100μおよびT4
−β−Gal−コンジユゲート溶液100μを加え
る。反応混合物を室温で30分恒温保持する。恒温
保持の間１バツチを不断に振盪し、かつ同じT4
−標準含量を有する１バツチを単に放置した。次
いでそれぞれ懸濁液を遠心分離し、かつＦ−相が
存在する上澄み液を分離した。Ｂ−相、すなわち
ソリツド−フエース抗体に結合したT4−β−Gal
コンジユゲートは沈澱物中に存在する。酵素活性
を測定するためにこれを ｐ−ニトロフエニル−β−ガラクトシド（シグマ
社） 450mg／ 塩化ナトリウム 100ミリモル 塩化マグネシウム 10ミリモル トリス緩衝剤／HCl 10ミリモル メルカプトエタノール 0.4v／ｖ％ から成る、PH7.3の過剰の基質溶液に加え、かつ
公知方法で波長405nｍで吸光度を測定する。外
部の機械的な混合をしない場合に懸濁状態で保持
されるラテツクス粒子が約11％減少したシグナル
を与えることが示された。 このようにしてT4−検量曲線を測定した後、
引続き同様にしてT4−標準血清100μの代わり
に未知量のT4含量の試料それぞれ100μを使用
し、かつ再懸濁後のＢ−相の吸光度を基質溶液中
で測定することにより定量を行なつた。 親水性ラテツクス粒子が抗体および抗原のキヤ
リヤとしてきわめて好適であり、かつそれらの免
疫反応性の損なわないことが認めれた。したがつ
て親水性ラテツクス粒子はソリツド−フエース−
酵素免疫試験でキヤリヤとして有利に使用するこ
とができる。更に緩衝剤条件にある親水性ラテツ
クス粒子が長期間にわたつて懸濁状態を保持し、
したがつて粒子の密度がほぼ１に等しいことが認
められた。その上に本発明による親水性ラテツク
ス粒子は免疫反応性を損なわずに良好に遠心分離
可能であり、かつ再懸濁可能である。 例 13 ヒトチレオトロピン（TSH）を定量するため
の酵素免疫定量（EIA） ヒト血清中のTSHの測定は甲状腺疾病の診断
で著しく重要である。基礎TSH濃度の著しい上
昇で１次甲状腺機能減弱が認められる。その他血
清中のTSH基礎値0.5〜3μU／mlがTRH（刺激ホ
ルモン放出因子）で刺激後に上昇しない場合に甲
状腺機能減弱は確実にあり得ない。それに対して
TSH値が少なくとも2.5μU／ml、しかし25μU／
ml以下で上昇する場合には甲状腺物質代謝は高い
確率で損なわれていない。25μU／mlを僅かに上
回つた基礎値の上昇は潜在的な症状発現前の甲状
腺機能減弱を推測することができる。既にTSH
の酵素免疫定量は公知である〔“クリニカ・ヒミ
カ・アクタ（Clinica Chemica Acta）”、第67
巻、263〜268頁（1976年）；“エンツイーメ・ラベ
ルド・イムノアツセイ・オブ・ホルモンズ・アン
ド・ドラツグス（enzyme labelled
immunoassay of hormones and drugs”、327〜
337頁。S.B.Pal、Walter de Gruyter、ベルリン
およびN.Y.（1978年）；“アナリユーチカル・ビオ
ケミストリ（Analytical Biochemistry）”第96
巻、419〜425頁（1979年）〕。しかしこれらの公知
の測定法はきわめて長い恒温保持時間（５日ま
で）を必要とし、鋭敏ではなく（TSH5μU／ml）
または高価な測定装置（螢光測定装置または発光
測定装置）と前提とし、その際その他にバツチを
混合するための装置が必要である。 本発明による親水性ラテツクス粒子の使用は２
1/2日にすぎない全恒温保持時間で二重抗体分離
技術によるTSHの測光法による測定を可能にす
る。その際第２の抗体が本発明による親水性ラテ
ツクス粒子に共有結合される。次いで結合された
酵素活性をＢ／Ｆ−分離により測定する。ラテツ
クス粒子は水の密度よりも著しくは高くない密度
を有しているので、ラテツクス粒子は酵素反応の
間も懸濁状態であり、これにより常用の場合が省
略される。抗体の高い負荷可能性のために可能で
あるきわめて希釈されたラテツクス粒子を使用す
る場合には酵素反応終了後の粒子の遠心分離も省
略される、それというのも懸濁液を通過して測光
できるからである。 免疫学的試験方法で一般に使用されるラテツク
スとは異なり抗体を負荷された、本発明による親
水性ポリグリシジルメタクリレート粒子は遠心分
離後容易に再懸濁させることができる。同じ理由
から酵素で標識された抗原のきわめて小さあ非特
異的吸着が示される（第１抗体の不在での結合さ
れた活性）。 試験実施 TSH−標準（TSH不含血清中の国際参照調剤
MRC68／38）0.2mlを１：150000で水または好適
な緩衝溶液で希釈した、自体公知の、例えばモル
モツトの抗TSH−抗血清0.1mlとともに恒温保持
する。12時間後グルコースオキシダーゼ（GOD）
に共有結合せるTSH（TSH約1.5×10-9ｇに相当）
から成る酵素コンジユゲートの溶液0.1mlを第１
工程の混合物にピペツトで添加する。この混合物
に更に12時間後ラテツクス懸濁液0.1mlをピペツ
トで添加する。該懸濁液はメタクリレートラテツ
クス0.1〜１mg／mlを含有し、その際例11に記載
されているように乾燥ラテツクス粒子1000mgにつ
き、モルモツト−IgGに対するヤギの抗血清から
得られた免疫グロブリンフラクシヨンのたん白質
５〜150mgを加え、かつそうして親水性ラテツク
ス粒子に共有結合された。１時間後遠心分離し、
かつラテツクス粒子の沈澱物を好適な緩衝溶液１
mlで洗う、それによりラテツクス粒子は再懸濁さ
れる。引続き改めて数度遠心分離し、かつ洗浄す
る。上澄み液を棄てる。 各バツチにGODの基質溶液１mlをピペツトで
入れ、かつ短時間振盪する。その後少なくとも２
時間ラテツクス粒子は均一に懸濁されたままであ
る。次いで懸濁液を目盛りクベツトに入れ、かつ
405nｍで吸光度を測定する。各吸光度から基質
盲検値L1を引く。L1は、抗TSH−抗血清とTSH
−GODとの混合物に添加された前記のラテツク
ス懸濁液と同じ物質を負荷されたラテツクス粒子
を含む基質溶液１mlの吸光度である。 こうして求められた吸光度を種々のTSH標準
濃度に関して記録する。この検量曲線を用いて臨
床試料中の未知含量のTSHの濃度を測定した吸
光度に基づいて読み取る。 好適な緩衝溶液として有利にEDTA0.005モル、
ウシ血清アルブミン0.1％並びにNaCl0.15モルを
含む0.04M−ホスフエート溶液（PH7.4）を使用
する。 GOD−基質溶液として有利にグルコース５
ｇ／100ml、２，2′−アジノ−ジ−〔３−エチル−
ベンズチアゾロン−スルホン酸(6)〕（ABTS）
100mg／100ml、ペルオキシダーゼ（POD）５
mg／100ml、0.05M−ホスフエート緩衝液（PH
5.6）を含む水溶液を使用する。 比較のために３つの血清試料のTSH含量を前
記EIA(A)並びに公知の二重抗体−RIA(B)で測定し
た。次表に示す通りそれぞれ測定値は良く一致す
る： (A) (B) 血清１ 11.2μU／ml 12.5μU／ml ２ 7.3μU／ml 7.1μU／ml 血清３ 3.8μU／ml 4.5μU／ml 前記のTSH−測定からも、本発明による親水
性ラテツクス粒子が生物学的および／または免疫
学的に活性な物質、特に抗体のキヤリヤとしてき
わめて好適であることが得られる。 非特異的結合の測定 TSH標準試料を前記の試験実施の項目で記載
されたようにして処理し（試料Ｃ）、かつほとん
ど試料Ｃと同じ反応にかけられた同様の試料（試
料Ｄ）と比較する。抗TSH−抗血清のみは省い
た。試料ＣとＤの懸濁液で測定された吸光度の比
較は非特異的結合が1.5％よりも小さいことを示
す。 【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ キヤリヤとして水に難溶性のモノマーである
分子中に少なくとも１個の重合可能なＣ＝Ｃ−二
重結合を有するエポキシドのホモポリマーまたは
コポリマーから成る親水性ラテツクス粒子および
このキヤリヤに直接または“ブリツジ”としての
結合剤を介して共有結合せる生物学的にかつ／ま
たは免疫学的に活性な物質を含有するが、この
際、親水性ラテツクス粒子が水溶性のラジカル形
成性開始剤の存在で、しかし乳化剤、安定剤を添
加せずにエマルジヨン重合によつて製造可能であ
ることを特徴とする、診断薬。 ２ 生物学的にかつ／または免疫学的に活性な物
質としてペプチド、たん白質、酵素、ホルモン、
ビタミン、抗原、抗体または微生物を含有する、
特許請求の範囲第１項記載の診断薬。 ３ チロキシン測定のための診断薬として生物学
的にかつ／または免疫学的に活性な物質としてチ
ロキシン抗体を含有する、特許請求の範囲第２項
記載の診断薬。 ４ ヒトチレオトロピン測定の診断薬として生物
学的にかつ／または免疫学的に活性な物質として
ヒト−チレオトロピン抗体を含有する、特許請求
の範囲第２項記載の診断薬。
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