JPS6332480A - 微生物による新規な酵素ａの製造法 - Google Patents
微生物による新規な酵素ａの製造法Info
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- JPS6332480A JPS6332480A JP61177345A JP17734586A JPS6332480A JP S6332480 A JPS6332480 A JP S6332480A JP 61177345 A JP61177345 A JP 61177345A JP 17734586 A JP17734586 A JP 17734586A JP S6332480 A JPS6332480 A JP S6332480A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
左旋性のマンデルｆｉ（（−）−マンデル酸）はエフェ
ドリンやセファロスポリン系の抗性物質各種の医薬品の
製造原料として知られている６本発明はベンゾイルギ酸
を還元して前記の左旋性のマンデル酸生成に関与する新
規な酵素の製造法に関するものである。
ドリンやセファロスポリン系の抗性物質各種の医薬品の
製造原料として知られている６本発明はベンゾイルギ酸
を還元して前記の左旋性のマンデル酸生成に関与する新
規な酵素の製造法に関するものである。
左旋性のマンデル酸の製造法としては、ラセミ体の分別
結晶による光学分割法、クロマトグラフィーによる光学
分割法、有機化学的な不斉合成法等が知られているが、
これらの方法は、操作が煩雑であるとか、収率が低い、
生成物の光学純度が低い等の欠点を有している。
結晶による光学分割法、クロマトグラフィーによる光学
分割法、有機化学的な不斉合成法等が知られているが、
これらの方法は、操作が煩雑であるとか、収率が低い、
生成物の光学純度が低い等の欠点を有している。
一方、左旋性のマンデル酸を得るために、ベンゾイルギ
酸を微生物菌体を用いて不斉還元する方法（特開昭５７
−１９８０９６号公報）も知られている。この方法によ
れば、前記の公知方法の欠点は除去されるものの、微生
物のプロテアーゼによる自己消化のための活性低下が避
けられず、また菌体内成分や培地成分による製品の汚染
・純度低下の問題等が残る。また、脱水素酵素としては
、ラクトバシルス翼細菌の産生ずるＤ−２−ヒドロキシ
イソカプロン酸脱水素酵素が知られているが、この酵素
がベンゾイルギ酸を還元するかどうかは知られていない
。
酸を微生物菌体を用いて不斉還元する方法（特開昭５７
−１９８０９６号公報）も知られている。この方法によ
れば、前記の公知方法の欠点は除去されるものの、微生
物のプロテアーゼによる自己消化のための活性低下が避
けられず、また菌体内成分や培地成分による製品の汚染
・純度低下の問題等が残る。また、脱水素酵素としては
、ラクトバシルス翼細菌の産生ずるＤ−２−ヒドロキシ
イソカプロン酸脱水素酵素が知られているが、この酵素
がベンゾイルギ酸を還元するかどうかは知られていない
。
そこで、本発明者らはベンゾイルギ酸還元能を有するＤ
−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素生産能を有
する微生物を自然界及び市販微牛物止り広く求めたとこ
ろ、ストレプトコックス属に属する微生物が本酵素を産
生ずることを見出し、この知見に基づき本発明を完成さ
せたものである。
−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素生産能を有
する微生物を自然界及び市販微牛物止り広く求めたとこ
ろ、ストレプトコックス属に属する微生物が本酵素を産
生ずることを見出し、この知見に基づき本発明を完成さ
せたものである。
すなわち、本発明はストレプトコックス属に属し、新規
な酵素Ａ（ベンゾイルギ酸還元能を有するＤ−２−ヒド
ロキシイソカプロン酸脱水素酵素）生産能を有する微生
物を培養し、培養体から新規な該酵素Ａを採取するもの
である。
な酵素Ａ（ベンゾイルギ酸還元能を有するＤ−２−ヒド
ロキシイソカプロン酸脱水素酵素）生産能を有する微生
物を培養し、培養体から新規な該酵素Ａを採取するもの
である。
本酵素Ａは、次式で示されるベンゾイルギ酸の還元反応
を触媒して左旋性のマンデル酸を生成させ得るものであ
る。この場合１反応系には、還元型のニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が還元剤として
用いられ、このものは、反応後、酸化型のもの（ＮＡＤ
ａに変り、脱水素によって生じる電子の受容体としての
作用を示す。
を触媒して左旋性のマンデル酸を生成させ得るものであ
る。この場合１反応系には、還元型のニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）が還元剤として
用いられ、このものは、反応後、酸化型のもの（ＮＡＤ
ａに変り、脱水素によって生じる電子の受容体としての
作用を示す。
ベンゾイルギ酸 （Ｒ）−（−）−マンデル
酸この反応は可逆反応であり、本酵素Ａは反応の型から
言えば、（−）−マンデル酸脱水素酵素と称されるべき
ものである。従来、その名称の酵素は知らているが（Ｇ
ｅｒ、 ０ｆｆｅｎ、 ２２１３１３４； Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、。
酸この反応は可逆反応であり、本酵素Ａは反応の型から
言えば、（−）−マンデル酸脱水素酵素と称されるべき
ものである。従来、その名称の酵素は知らているが（Ｇ
ｅｒ、 ０ｆｆｅｎ、 ２２１３１３４； Ｊ、 Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ、。
１０１、７８６（１９７０）； Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ
、、 ２０９３７９（１９８３））それらは脱水素作用
によって生ずる電子の受容体としてＮＡＤ＋を使用する
ものではない。また、本発明の酵素Ａは、ベンゾイルギ
酸以外にもα−ケトイソカプロン酸など各種のα−ケト
酸をＮＡＤＨを用いて還元する作用を示す。
、、 ２０９３７９（１９８３））それらは脱水素作用
によって生ずる電子の受容体としてＮＡＤ＋を使用する
ものではない。また、本発明の酵素Ａは、ベンゾイルギ
酸以外にもα−ケトイソカプロン酸など各種のα−ケト
酸をＮＡＤＨを用いて還元する作用を示す。
本発明の酵素Ａを製造するためには、まず、ストレプト
コックス属細菌を培養するが、培地としては、本属細菌
の培養に通常用いられているものを使用すればよい１例
えば、２％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％
ペプトン、及び０．３％肉エキスを含む栄養培地（特開
昭５７−１９８０９６）、 ＭＲ５培坤（微生物研究法
懇談会編、微生物学実験法、Ｐ、４３５．講談社、 １
９７５年）、トマトジュース培地（同上書。
コックス属細菌を培養するが、培地としては、本属細菌
の培養に通常用いられているものを使用すればよい１例
えば、２％グルコース、０．５％酵母エキス、０．３％
ペプトン、及び０．３％肉エキスを含む栄養培地（特開
昭５７−１９８０９６）、 ＭＲ５培坤（微生物研究法
懇談会編、微生物学実験法、Ｐ、４３５．講談社、 １
９７５年）、トマトジュース培地（同上書。
Ｐ４３５）などが使用できる。培養温度は２５〜５０℃
の範囲で選べるが酵素生産量の点からは３０℃付近が最
適である。振どう培養と静置培養のいずれもが適用でき
るが、酵素生産量の点からは前者の方が好ましい。酵素
生産量の時間的変化は増殖のそれとほぼ平行しており、
静止期において菌体生産量が最高になった時に酵素生産
量も最高となる。条件によって違うが、培養開始後だい
たい１０〜１２時間で対数増殖期が終り、１５〜２５時
間で静止期となる。
の範囲で選べるが酵素生産量の点からは３０℃付近が最
適である。振どう培養と静置培養のいずれもが適用でき
るが、酵素生産量の点からは前者の方が好ましい。酵素
生産量の時間的変化は増殖のそれとほぼ平行しており、
静止期において菌体生産量が最高になった時に酵素生産
量も最高となる。条件によって違うが、培養開始後だい
たい１０〜１２時間で対数増殖期が終り、１５〜２５時
間で静止期となる。
従って、この時点で菌体を遠心分離等の操作によって収
穫する。酵素の抽出を行うまで菌体を一２０℃以下に凍
結保存しても数ケ月間は酵素活性の低下をきたさない。
穫する。酵素の抽出を行うまで菌体を一２０℃以下に凍
結保存しても数ケ月間は酵素活性の低下をきたさない。
菌体を破壊して酵素を抽出するためには、アルミナ磨砕
法や超音波処理法、ダイノミル法など通常の方法が用い
られる。この時に用いる緩衝液としてはｐＨ７，５以下
、ｐＨ４，５ぐらいまでの中性から微酸性の緩衝液で通
常用いられるものが使える。例えば、 １０−１００＋
ａＭのリン酸緩衝液やトリス／ＨＣＱ緩衝液などが挙げ
られる。注意すべき点はｐＨであり、ＰＨ８ないしはそ
れ以上でも酵素の抽出はできるが不安定となる。抽出操
作以降使用する緩衝液には２−メルカプトエタノールや
ジチオスレイトールなどのメルカプタン類を酵素の安定
化剤として添加しておくことが望ましい。その濃度は０
．１ｍＭ程度から１０ａ＋Ｎ程度の範囲で適当に選択す
る。これらの緩衝液に懸濁した状態で菌体を破壊し、不
溶物を遠心分離など適当な方法で除いて抽出酵素液を得
る。これをそのまま（−）−マンデル酸の製造に供する
こともできるが、必要な場合には、酵素の濃縮・精製を
行う。このためには、酵素蛋白質の精製に通常用いられ
ている方法を用いればよく、例えば、硫酸沈殿法、イオ
ン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマト
グラフィー法、ゲル濾過法、限外濾過法、又はこれらの
方法のいくつかを組合せて用いればよい。このようにし
て本酵素Ａは実施例において述べられる如く容易に電気
泳動的に均一に精製される。本酸素Ａの性質は次のよう
であった。
法や超音波処理法、ダイノミル法など通常の方法が用い
られる。この時に用いる緩衝液としてはｐＨ７，５以下
、ｐＨ４，５ぐらいまでの中性から微酸性の緩衝液で通
常用いられるものが使える。例えば、 １０−１００＋
ａＭのリン酸緩衝液やトリス／ＨＣＱ緩衝液などが挙げ
られる。注意すべき点はｐＨであり、ＰＨ８ないしはそ
れ以上でも酵素の抽出はできるが不安定となる。抽出操
作以降使用する緩衝液には２−メルカプトエタノールや
ジチオスレイトールなどのメルカプタン類を酵素の安定
化剤として添加しておくことが望ましい。その濃度は０
．１ｍＭ程度から１０ａ＋Ｎ程度の範囲で適当に選択す
る。これらの緩衝液に懸濁した状態で菌体を破壊し、不
溶物を遠心分離など適当な方法で除いて抽出酵素液を得
る。これをそのまま（−）−マンデル酸の製造に供する
こともできるが、必要な場合には、酵素の濃縮・精製を
行う。このためには、酵素蛋白質の精製に通常用いられ
ている方法を用いればよく、例えば、硫酸沈殿法、イオ
ン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマト
グラフィー法、ゲル濾過法、限外濾過法、又はこれらの
方法のいくつかを組合せて用いればよい。このようにし
て本酵素Ａは実施例において述べられる如く容易に電気
泳動的に均一に精製される。本酸素Ａの性質は次のよう
であった。
（１）活性測定法： ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
５）２．５ｍ１２．８３ａ＋Ｍベンゾイルギ′Ｎ！（ナ
トリウム塩）水溶液０．２ｍＭ、及び１０ｍｇ／ｍ Ｑ
ＮＡＤＨ水溶液０．０５ｍｆｌを混合して基質液を調
製し、３０℃に保温する。酵素Ａ溶液２０μ悲を添加・
混合し、３４０ｎｍにおける吸光度の時間変化を測定し
て初速度を求める。ブランクとしてはベンゾイルギ酸水
溶液の代りに水を用いて測定を行い、その時の吸光度の
変化速度を先の値から差し引く。初速度としてＮＡＤＨ
の１μｍｏｌを１分間に変化させる酵素量を１単位（Ｕ
）とする。
５）２．５ｍ１２．８３ａ＋Ｍベンゾイルギ′Ｎ！（ナ
トリウム塩）水溶液０．２ｍＭ、及び１０ｍｇ／ｍ Ｑ
ＮＡＤＨ水溶液０．０５ｍｆｌを混合して基質液を調
製し、３０℃に保温する。酵素Ａ溶液２０μ悲を添加・
混合し、３４０ｎｍにおける吸光度の時間変化を測定し
て初速度を求める。ブランクとしてはベンゾイルギ酸水
溶液の代りに水を用いて測定を行い、その時の吸光度の
変化速度を先の値から差し引く。初速度としてＮＡＤＨ
の１μｍｏｌを１分間に変化させる酵素量を１単位（Ｕ
）とする。
（２）精製酵素の比活性： ９１１［１／＋ａｇ・蛋白
質（３）分子量ニゲル濾過法を用いて測定して７２００
０±２０００゜ＳＯ３・ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて測定した場合には３４０００±２０００で
あった。従って本酵素Ａは分子量３４０００付近のサブ
ユニット２個からなる二量体蛋白であると考えられる。
質（３）分子量ニゲル濾過法を用いて測定して７２００
０±２０００゜ＳＯ３・ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法を用いて測定した場合には３４０００±２０００で
あった。従って本酵素Ａは分子量３４０００付近のサブ
ユニット２個からなる二量体蛋白であると考えられる。
（４）等電点： ４．９−５．０゜
（５）至適ＰＨ：ペンゾイルギ酸を基質とした場合はＰ
Ｈ４，５，逆反応として（−）−マンデル酸を基質とし
てＮＡＤ＋を補酵素として用いた場合はＰＨ９，２゜ （６）安定性に及ぼすＰＨの影響二種々の緩衝液を用い
て５５℃で１時間加熱した時の残存活性が７０％を越え
るｐＨ領域は６．２〜５．５゜同条件でｐＨ７，２以上
及びＰＨ４以下では完全に失活する。故に本酵素Ａはｐ
Ｈ６，５〜５．０の微酸性条件において安定である。
Ｈ４，５，逆反応として（−）−マンデル酸を基質とし
てＮＡＤ＋を補酵素として用いた場合はＰＨ９，２゜ （６）安定性に及ぼすＰＨの影響二種々の緩衝液を用い
て５５℃で１時間加熱した時の残存活性が７０％を越え
るｐＨ領域は６．２〜５．５゜同条件でｐＨ７，２以上
及びＰＨ４以下では完全に失活する。故に本酵素Ａはｐ
Ｈ６，５〜５．０の微酸性条件において安定である。
（７）加熱に対する安定性： ２ｍＭのメルカプトエタ
ノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）の
中で１時間加熱した時の残存活性は、５５℃で３５％、
５０℃で５０％、４５℃で８０％であった。次に１％の
牛血清アルブミンを安定化剤として共存させた時の結果
（残存活性）は５５℃で７０％、 ５０℃で８７％、４
５℃で９６％であった。
ノールを含む０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）の
中で１時間加熱した時の残存活性は、５５℃で３５％、
５０℃で５０％、４５℃で８０％であった。次に１％の
牛血清アルブミンを安定化剤として共存させた時の結果
（残存活性）は５５℃で７０％、 ５０℃で８７％、４
５℃で９６％であった。
（８）（−）−マンデル酸を製造するための実際の条件
を模した条件における安定性：ベンゾイルギ酸０．１Ｍ
、 ＮＡＤ １ｓ＋Ｍ、２−メルカプトエタノール２＋
ａＭ、牛血清アルブミン１％、ソルビン酸カリウム（防
腐剤）０．０２％を含む１５■阿リン酸緩衝液（ＰＨ６
，３）に溶かした状態で３０℃に保温した時の酵素Ａの
残存活性は、５８目に７３％、１０日８に５２％、１９
日８に４２％であった。
を模した条件における安定性：ベンゾイルギ酸０．１Ｍ
、 ＮＡＤ １ｓ＋Ｍ、２−メルカプトエタノール２＋
ａＭ、牛血清アルブミン１％、ソルビン酸カリウム（防
腐剤）０．０２％を含む１５■阿リン酸緩衝液（ＰＨ６
，３）に溶かした状態で３０℃に保温した時の酵素Ａの
残存活性は、５８目に７３％、１０日８に５２％、１９
日８に４２％であった。
（９）冷蔵保存時における安定性： ２ｍＭのメルカプ
トエタノールと３．２Ｍの硫安を含む１５＋ｉＭリン酸
緩衝液（ｐ）１６．３）の中で４℃において、１ケ月の
間はとんど失活しなかった。
トエタノールと３．２Ｍの硫安を含む１５＋ｉＭリン酸
緩衝液（ｐ）１６．３）の中で４℃において、１ケ月の
間はとんど失活しなかった。
（１０）ミカエリス定数： ０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，５）を用い３０℃で測った場合、ベンゾイルギ
酸については３．３ｍＭ、ＮＡＤＨについては３５μ阿
であった。
ｐＨ７，５）を用い３０℃で測った場合、ベンゾイルギ
酸については３．３ｍＭ、ＮＡＤＨについては３５μ阿
であった。
（１１）基質特異性：補酵素としてＮＡＤＰＩ（はＮＡ
Ｄ）ｌの代用にならない。本酵素Ａはベンゾイルギ酸以
外にも各種のα−ケト酸を還元する。代表的なものは次
の通りである（括弧の内の数値は、１０ｍＭの濃度で使
用した時の反応速度をベンゾイルギ酸による値を１ｏｏ
としての％である）：α−ケト酪酸（３）、α−ケトバ
レリアン酸（２３） 。
Ｄ）ｌの代用にならない。本酵素Ａはベンゾイルギ酸以
外にも各種のα−ケト酸を還元する。代表的なものは次
の通りである（括弧の内の数値は、１０ｍＭの濃度で使
用した時の反応速度をベンゾイルギ酸による値を１ｏｏ
としての％である）：α−ケト酪酸（３）、α−ケトバ
レリアン酸（２３） 。
α−ケトカプロン酸（２４）、 α−ケトイソバレリ
アン酸（６７）、α−ケトイソカプロンｆｉ（１３２）
、α−ケト−β−メチルバレリアンＭ （６３）、フェ
ニルピルビン酸（６０）、３−ブロムピルビン酸（１５
２） 、及び３−クロロピルビン酸（１７）。α−ケト
酸の中でもピルビン酸、オキザロ酢酸。
アン酸（６７）、α−ケトイソカプロンｆｉ（１３２）
、α−ケト−β−メチルバレリアンＭ （６３）、フェ
ニルピルビン酸（６０）、３−ブロムピルビン酸（１５
２） 、及び３−クロロピルビン酸（１７）。α−ケト
酸の中でもピルビン酸、オキザロ酢酸。
α−ケトグルタル酸などには全く活性を示さなかった。
（１２）反応の立体選択性：ベンゾイルギ酸とＮＡＤＨ
を基質にして生成するマンデル酸を抽出して旋光度を測
定し、またジアステレオメリック誘導体としてガスクロ
マトグラフィー法で光学純度を測定したところ、（Ｒ）
−（−）−マンデル酸が１００％の光学純度で生成して
いることが確認された。、一方逆反応としてＮＡＤ＋と
（−）−マンデル酸又は（＋）−マンデル酸（アルドリ
ッチ社製）を用いて活性を測定したところ、（−）−マ
ンデル酸は完全に酸化されたが、（＋）−マンデル酸は
ごくわずがしが反応しながった。
を基質にして生成するマンデル酸を抽出して旋光度を測
定し、またジアステレオメリック誘導体としてガスクロ
マトグラフィー法で光学純度を測定したところ、（Ｒ）
−（−）−マンデル酸が１００％の光学純度で生成して
いることが確認された。、一方逆反応としてＮＡＤ＋と
（−）−マンデル酸又は（＋）−マンデル酸（アルドリ
ッチ社製）を用いて活性を測定したところ、（−）−マ
ンデル酸は完全に酸化されたが、（＋）−マンデル酸は
ごくわずがしが反応しながった。
（１３）阻害剤：本−酵素Ａはいくつかの重金属イオン
によって活性を阻害される。代表的なものを次にかかげ
る（括弧内は０．１Ｍトリス／ＨＣＱ緩衝液ｐＨ７，５
を用いて測定した時の残存活性を金属イオン無添加時の
値を１００として％で示したものと、その時の金属イオ
ン濃度である）：Ｃｕ２” （９％、 １ｍＭ）、 Ｚ
ｎ”（０％、 １ｍＭ）、Ｎｉ”（５５％、１ｍＭ）、
Ｈｇ” （６％、０．１＋Ｍ）、Ｈｇ”（３１％、０．
１ｆｆｉＭ）、Ｃｄ“（２％、 １ｍＭ）、また本酵素
Ａは０．５ｍＭのＰ−クロロマーキュリ−ベンゾエート
によって完全に阻害され、１ｍＭのＮ−エチルマレイミ
ドによっても６０％阻害される。
によって活性を阻害される。代表的なものを次にかかげ
る（括弧内は０．１Ｍトリス／ＨＣＱ緩衝液ｐＨ７，５
を用いて測定した時の残存活性を金属イオン無添加時の
値を１００として％で示したものと、その時の金属イオ
ン濃度である）：Ｃｕ２” （９％、 １ｍＭ）、 Ｚ
ｎ”（０％、 １ｍＭ）、Ｎｉ”（５５％、１ｍＭ）、
Ｈｇ” （６％、０．１＋Ｍ）、Ｈｇ”（３１％、０．
１ｆｆｉＭ）、Ｃｄ“（２％、 １ｍＭ）、また本酵素
Ａは０．５ｍＭのＰ−クロロマーキュリ−ベンゾエート
によって完全に阻害され、１ｍＭのＮ−エチルマレイミ
ドによっても６０％阻害される。
このように、本酵素Ａはベンゾイルギ酸還元能を有する
点で新規であり、かつ酵素として高い比活性を有し、実
用的条件下において、簡１単に失活することはなく、モ
して左旋性のマンデル酸を光学純度１００％で生成する
など優れた性質を持つ酵素である。
点で新規であり、かつ酵素として高い比活性を有し、実
用的条件下において、簡１単に失活することはなく、モ
して左旋性のマンデル酸を光学純度１００％で生成する
など優れた性質を持つ酵素である。
本発明における酵素Ａを用いてベンゾイルギ酸から（−
）−マンデル酸を製造する場合、還元剤しとて還元型の
補酵＠１ｓ−ｏ”ｎ’を必要とする。これは反応の結果
酸化型となったＮＡＤ＋をその場で再還元するようにし
て供給するのが最も経済的である。ＮＡＤ”からＮＡＤ
Ｈの再生には種々の方法があるが、ギ酸とギ酸脱水素酵
素を用いる方法、エタノールとアルコール脱水素酵素を
用いる方法、グルコースとグルコース脱水素酵素を用い
る方法などが本発明の酵素を用いる系に適用できる。
）−マンデル酸を製造する場合、還元剤しとて還元型の
補酵＠１ｓ−ｏ”ｎ’を必要とする。これは反応の結果
酸化型となったＮＡＤ＋をその場で再還元するようにし
て供給するのが最も経済的である。ＮＡＤ”からＮＡＤ
Ｈの再生には種々の方法があるが、ギ酸とギ酸脱水素酵
素を用いる方法、エタノールとアルコール脱水素酵素を
用いる方法、グルコースとグルコース脱水素酵素を用い
る方法などが本発明の酵素を用いる系に適用できる。
次に実施例において本発明を更に詳細に説明する。
実施例１
市販の缶入りトマトジュース（キッコー食品工業株式会
社製、デルモンテ印、１本当り１９５ｇ入り）の２本の
内容物を遠心分離にかけ（７０００ｒｐｍ）、不溶分を
除いた上清を蒸留水で２Ｑに希釈した。これにグルコー
ス２０ｇ、麦芽エキス２０ｇ、トリプトン２０ｇ、及び
硫酸コバルト（７水和物）２００！１ ｇを加えて溶解
させ、次いで２Ｎ Ｍａｉｌ（でｐｌ（を７．２に調整
した。
社製、デルモンテ印、１本当り１９５ｇ入り）の２本の
内容物を遠心分離にかけ（７０００ｒｐｍ）、不溶分を
除いた上清を蒸留水で２Ｑに希釈した。これにグルコー
ス２０ｇ、麦芽エキス２０ｇ、トリプトン２０ｇ、及び
硫酸コバルト（７水和物）２００！１ ｇを加えて溶解
させ、次いで２Ｎ Ｍａｉｌ（でｐｌ（を７．２に調整
した。
２台の１１２容ジャーファーメンタ−（丸菱理化器製モ
デルＭＯ−１５０）の゛それぞれに上記培地の８００＋
ａ Ｑとアデカノール（消泡剤）の４０μ党を入れ滅菌
処理を施した。それぞれのファーメンタ−に、ストレプ
トコックス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩＦｏ １２９６４）の前培養物
（１６ｍ１２、上記培地と同組成の培地を使用して１２
時間、３０℃で振どう培養したもの）を無菌的に接種し
た。３０℃に保ちつつ、空気吹込速度１０００ｍ Ｑ
／分、撹拌速度４５０ｒｐ＋ｉの条件で２２．５時間培
養した。遠心分離（７５００ｒｐｍ）によって菌体を集
め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗滌して、
湿潤重量６．８４ ｇの菌体を得た。これを２ｍＭのメ
ルカプトエタノールを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６，３）７０ｍ ｎに懸濁し、水冷下１８０すで１時間
超音波処理を施した。遠心分離（９５００ｒｐｍ）によ
って不溶分を除き、８２．７＋＋＋１２の粗酵素抽出液
を得た６酵素の濃度は７５．１０１０ Ｑ、蛋白濃度は
１１．２ｍｇ／ｍＱであった。従って全活性量は６２１
００．比活性は６．１Ｕ／ｌＩｇとなる。この酵素液の
８２．２ｍ Ｑ （６１７０’Ｕ）を５℃でアフイニテ
ィクロマトグラフィー用Ｍａｔｒｅｘ Ｒｅｄ Ａカラ
ム（ＩＸ９ａｎ、２＋ｎＭのメルカプトエタノールを含
む１５ａ＋Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，３で平衡化した）に
１時間あたり１２醜Ｅｌの流速で通液した。全量添加後
２ｍＭのメルカプトエタノールを含む１５ｍＭリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）の３２ａｕ Ｑでカラムを洗滌した
。次いでこの緩衝液（Ｐ）１７．０）と、その中に１０
ｍＭのＮＡＤＨを含む緩衝液の３０℃ｍ Ｑづつを用い
て直線勾配溶出法によって吸着物を溶離した。流速は３
０分あたり５ｍＱとした。溶出開始後５ＩＩＱ目から２
５ｍ Ｑ目までの分画に活性の大部分が検出されたので
、これらの分画を合せた。総体積は２０．０＋ｗｆｌで
あった。酵素濃度は２０３０／ｍ ｎ、蛋白濃度は０．
７６ｍｇ／ｍｎであり、従って、総酵素活性は４０６０
Ｕ （回収率６６％）、比活性は２６７０／ｍ ｇ （
精製率４０倍）となる。次にＤＥＡＥ−セファローズを
充填したカラムを準備しくｌＸ２０ａｕ）、５℃におい
て２ｍＭのメルカプトエタノールを含む１５ｍＭ酢酸／
酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，２）で平衡化しておい
た。この方ラムに上記の酵素溶液の１９．５ｍＱ（３９
６００）を通した。流速は３０分あたり５ＩＩＩＱとし
た。
デルＭＯ−１５０）の゛それぞれに上記培地の８００＋
ａ Ｑとアデカノール（消泡剤）の４０μ党を入れ滅菌
処理を施した。それぞれのファーメンタ−に、ストレプ
トコックス・ファエカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩＦｏ １２９６４）の前培養物
（１６ｍ１２、上記培地と同組成の培地を使用して１２
時間、３０℃で振どう培養したもの）を無菌的に接種し
た。３０℃に保ちつつ、空気吹込速度１０００ｍ Ｑ
／分、撹拌速度４５０ｒｐ＋ｉの条件で２２．５時間培
養した。遠心分離（７５００ｒｐｍ）によって菌体を集
め、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で洗滌して、
湿潤重量６．８４ ｇの菌体を得た。これを２ｍＭのメ
ルカプトエタノールを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６，３）７０ｍ ｎに懸濁し、水冷下１８０すで１時間
超音波処理を施した。遠心分離（９５００ｒｐｍ）によ
って不溶分を除き、８２．７＋＋＋１２の粗酵素抽出液
を得た６酵素の濃度は７５．１０１０ Ｑ、蛋白濃度は
１１．２ｍｇ／ｍＱであった。従って全活性量は６２１
００．比活性は６．１Ｕ／ｌＩｇとなる。この酵素液の
８２．２ｍ Ｑ （６１７０’Ｕ）を５℃でアフイニテ
ィクロマトグラフィー用Ｍａｔｒｅｘ Ｒｅｄ Ａカラ
ム（ＩＸ９ａｎ、２＋ｎＭのメルカプトエタノールを含
む１５ａ＋Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，３で平衡化した）に
１時間あたり１２醜Ｅｌの流速で通液した。全量添加後
２ｍＭのメルカプトエタノールを含む１５ｍＭリン酸緩
衝液（ＰＨ７，０）の３２ａｕ Ｑでカラムを洗滌した
。次いでこの緩衝液（Ｐ）１７．０）と、その中に１０
ｍＭのＮＡＤＨを含む緩衝液の３０℃ｍ Ｑづつを用い
て直線勾配溶出法によって吸着物を溶離した。流速は３
０分あたり５ｍＱとした。溶出開始後５ＩＩＱ目から２
５ｍ Ｑ目までの分画に活性の大部分が検出されたので
、これらの分画を合せた。総体積は２０．０＋ｗｆｌで
あった。酵素濃度は２０３０／ｍ ｎ、蛋白濃度は０．
７６ｍｇ／ｍｎであり、従って、総酵素活性は４０６０
Ｕ （回収率６６％）、比活性は２６７０／ｍ ｇ （
精製率４０倍）となる。次にＤＥＡＥ−セファローズを
充填したカラムを準備しくｌＸ２０ａｕ）、５℃におい
て２ｍＭのメルカプトエタノールを含む１５ｍＭ酢酸／
酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，２）で平衡化しておい
た。この方ラムに上記の酵素溶液の１９．５ｍＱ（３９
６００）を通した。流速は３０分あたり５ＩＩＩＱとし
た。
次で上記の酢酸ｌ酢酸ナトリウム緩衝液でカラムを展開
した。展開を開始後３０ｍΩ目から４５１ｎＱ目ま１１
゛］ぐ１゛ での分画に活性の大部分が検出されたので、これらの分
画を合せた。総体積は１５．０ｍ党であった。
した。展開を開始後３０ｍΩ目から４５１ｎＱ目ま１１
゛］ぐ１゛ での分画に活性の大部分が検出されたので、これらの分
画を合せた。総体積は１５．０ｍ党であった。
分析の結果、酵素濃度は１７３υ／ｍＱ、蛋白濃度は０
．１９ｍｇ／ｍＱであり、従って、総酵素活性は２６０
０［Ｊ（回収率６６％、通算４４％）、比活性９１１０
／ｍ ｇ （精製率１３６倍）となる。このサンプルに
ついてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によづて蛋白
純度を調べたところ単一のバンドであった。
．１９ｍｇ／ｍＱであり、従って、総酵素活性は２６０
０［Ｊ（回収率６６％、通算４４％）、比活性９１１０
／ｍ ｇ （精製率１３６倍）となる。このサンプルに
ついてポリアクリルアミドゲル電気泳動法によづて蛋白
純度を調べたところ単一のバンドであった。
このようにして得られた本酵素Ａは、ＮＡＤＨを還元剤
としてベンゾイルギ酸を還元する際の触媒として作用し
、左旋性のマンデル酸を与え、また、本酵素Ａは種々の
α−ケト酸をＮＡＤＨにより還元する際の触媒としても
作用し、産業上極めて有用なものである。
としてベンゾイルギ酸を還元する際の触媒として作用し
、左旋性のマンデル酸を与え、また、本酵素Ａは種々の
α−ケト酸をＮＡＤＨにより還元する際の触媒としても
作用し、産業上極めて有用なものである。
Claims (1)
- （１）ストレプトコックス属に属し、新規な酵素Ａ（ベ
ンゾイルギ酸還元能を有するＤ−２−ヒドロキシイソカ
プロン酸脱水素酵素）生産能を有する微生物を培養し、
培養体から新規な酵素Ａ（ベンゾイルギ酸還元能を有す
るＤ−２−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素）を採
取することを特徴とする微生物による新規な酵素Ａの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61177345A JPS6332480A (ja) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | 微生物による新規な酵素ａの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61177345A JPS6332480A (ja) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | 微生物による新規な酵素ａの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6332480A true JPS6332480A (ja) | 1988-02-12 |
| JPH0234598B2 JPH0234598B2 (ja) | 1990-08-03 |
Family
ID=16029342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61177345A Granted JPS6332480A (ja) | 1986-07-28 | 1986-07-28 | 微生物による新規な酵素ａの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6332480A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5256552A (en) * | 1988-02-08 | 1993-10-26 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acid |
-
1986
- 1986-07-28 JP JP61177345A patent/JPS6332480A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5256552A (en) * | 1988-02-08 | 1993-10-26 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0234598B2 (ja) | 1990-08-03 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |