JPH01165390A

JPH01165390A - ジデオキシイノシンの精製法

Info

Publication number: JPH01165390A
Application number: JP62324531A
Authority: JP
Inventors: Toshiya Tanabe; 田辺　俊哉; Masaru Otani; 勝大谷; Toshihide Yugawa; 湯川　利秀
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1987-12-22
Filing date: 1987-12-22
Publication date: 1989-06-29
Anticipated expiration: 2009-11-16
Also published as: JPH0691830B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、微生物又は酵素の作用により生産された２２
３／−ジデオキシイノシン（以下、ＤＤＩと略す、）の
新規精製法に関するものでろる。

ＤＤＩは抗ウイルス剤等医薬品として使用されるもので
らる。

〔従来の技術〕

従来のＤＤＩの製造方法としては、ヌクレオシド類の２
′位めるいは３′位の脱酸素反応が行われている（　Ｃ
ｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、　、　２２．１２８（
１９７４）　）が、以下のような理由により、報告例は
少ない。

■　反応に先立ち保護基を導入しなければならないこと
。

■　２′位、３′位は立体障害が大きく反応が起きＫく
いこと。

又　２′，３′−ジデオキシアデノシン（以下、　ＤＤ
Ａと略す、）を原料として、酵素を利用したデアミネー
シ、ンによる方法も報告されている（Ｂｉｏａｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｓ、　Ａｃｔｓ、、　５６６（２）　、　２
５９（１９７９））、しかし、このＤＤＡも上記の理由
により製造が困難な為、デアミネージョンによる方法の
報告例も少ない。

この為、単離精製法についても、わずかに実験室レベル
で液体又は薄層クロマトグラフィーによる分取の繰シ返
し精製が実施されている程度で、工業的に利用できる精
製方法は未だ確立していなかった。

２′，３′−ジデオキシウリジン（以下、ＤＤＵと略す
。）又は、２，３−ジデオキシリゲースー１−リン酸を
基質として微生物又は酵素の作用により生産された酵素
反応液中には、目的生成物であるＤＤＩの他に、未反応
基質のＤＤＵとヒポキサンチン（以下、Ｈ７ｐと略す。

）、基質分解物のウラシル（以下、Ｕｒａと略す、）及
び若干の副生核酸類が含まれている。

この反応液中から効率良く、高純度のＤＤＩを取得する
為には、一般的に知られている濃縮晶析等の手段だけの
処理では不適当であった。その理由は、濃縮晶析等の際
、Ｕｒａ　＋　Ｈｙｐ等の不純物は目的物質であるＤＤ
Ｉよシも溶解度が低い為、ＤＤＩ結晶中に不純物として
混入し、精製を困難にしているからである。

また、ＤＤＩは散性もしくは中性条件下において加水分
解を受け、２，３−ジデオキシＩＪ　、ｙ−ス残基とヒ
ポキサンチン残基とが容易に切断されるため、酸を必要
とするイオン交換樹脂処理による分離精製も困難であっ
た。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記の欠点を解消するよりなりＤＩの工業上優れた精製
方法、即ち、簡便かつ低コストで精製できる方法の開発
が望まれていた。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記問題点を解決すぺく、鋭意検討した
結果、未精製のＤＤＩを含有する溶液を、例えば、除菌
、除蛋白、脱色処理した後、非極性多孔質樹脂で処理す
ることによ、１５ＤＤＩをＵｒａ、Ｈｙｐ等の不純物か
ら分離でき、好ましくは晶析分離工程を組合わせること
によｆｉ　ＤＤＵ等の不純物から分離できることを見出
し、これらの発見に基づいて本発明を完成するに到った
。

即ち、本発明は、微生物又は酵素の作用により生産され
、又はそれ由来の未精製ＤＤＩを精製するに際し、　Ｄ
ＤＩを非極性多孔質樹脂に吸着せしめる処理法、好まし
くはこれと晶析法とを組み合わせることを特徴とするＤ
ＤＩの精製方法である。

本発明の出発物質は未精製のＤＤＩであればよく純度の
程度は問わない。微生物又は酵素の作用により、例えば
、２，３−ジデオキシリゲース残基とヒポキサンチン残
基を結合せしめた反応溶液やその中間処理物が採用され
る。

微生物としては、エシェリヒア属、フラボバクテリウム
属、セラチア属、エンテロパｌ＃−Ｒ、エルビニア属、
シトロバクター属、コリネバクテリウム属、ハフニア属
、クルイヘラ属、サルモネラ属、又は、キサントモナス
属等ＤＤＩを生産できるものであればよい。又、酵素は
、上記微生物が有しているもの、その他同−機能を有す
るものであれば特に制限されない。

本発明に用いるＤＤＩ反応液は、不純物であるＤＤＵ　
ｅ　Ｈｙｐ　＋　Ｕｒａ　＊若干の副生成する核酸類の
うち、いずれを含有していてもよい、また、この溶液の
ＤＤＩＩＩ度は、ＤＤＩの溶解度以下であれば制限され
るものではな論。

次に、ここで用いる非極性多孔質樹脂は、例えハソの母
体が、スチレン−ジビエルベンゼン系の共重合体又は、
その誘導体例えばこれにハロゲン化し高比重化したポリ
マーである物質であれ、いずれも使用可能である。例え
ば、ダイヤイオンＢＰシリーズ、ＳＰシリーズ（以上、
三菱化成工業）。

ＸＡＤ−４（ｏ−ム−７：ｙド・ハース社）　、０Ｃ１
０３１（バイエル社）等が利用できるが、その他の非極
性多孔質樹脂であっても同等の性質を有するものであれ
ばいずれであっても良い。特に高比重化した５Ｐ２０７
　（三菱化成工業）が、ＤＤＩ含有溶液をフィードした
時に樹脂が浮上したりすることなく、操作性が良い点で
適している。

非極性多孔質樹脂とＤＤＩ含有溶液との接液方法は、パ
ッチ式とカラム式があるが、カラム式の方が操作上簡便
で好ましい。

カラムへの通液速度は、特に制限はなく、通常ＳＶ＝　
０．５〜４．０、好ましくは５ｖ＝１〜２程度カ！イ。

カラムにフィードするＤＤＩ含有溶液の体積負荷量は、
ＤＤＩ含有溶液の濃度によりて異なり、同時にＤＤＩの
樹脂負荷量（１１＃−Ｒ）は５〜４０１／ｌ−ｎ、好ま
しくは１０〜３０Ｉ！／ｉＲが分離性及び経済性の点で
適している。

カラムへの接液温度については、１０〜５０℃であれば
特に制限されない。この温度ではＤＤＩと溶液中の不純
物Ｈ）’ｐ＋　ＴＪｒａとの分離性の相違は殆んどない
。

又、ＤＤＩの安定性の点から、樹脂へのフィード液の−
はアルカリ側が良く、好ましくはｐ）１８．０〜１０．
０が良い。かつ、温度も５０℃以下が安定性の点からも
適している。

次に、カラムからのＤＤＩ溶離方法に関して記述する。

溶離剤は、低級脂肪族アルコール水溶液が適している。

例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、イソ７
’ｏピルアルコール等の水溶液である。溶離速度は、通
常の５Ｖ＝１〜２程度が良い。

笑際の非極性多孔質樹脂を用いた精製操作は次の様にす
ると良い。すなわち、当該樹脂を充填したカラムＫ　Ｄ
ＤＩ含有溶液を一定量フイード後、水神によｌ）　Ｕｒ
ｎと）Ｉｙｐを溶離する。次にアルコール水溶液を用い
てＤＤＩとＤＤＵを溶離する。

次に、当該ＤＤＩとＤＤＵを含む画分を濃縮して、ＤＤ
Ｉを晶析後、冷却することＫより、ＤＤＵとＤＤＩを分
離させ、高純度のＤＤＩを取得することができる。

晶析時の濃縮液の−は、アルカリ側、好ましくはｐＨ８
〜１０に保てばＤＤＩの分解が抑制され、晶析率を向上
させることが可能である。

ま九、必要ならば以上の処理法に加えて溶媒抽出法や液
体クロマトグラフィーの処理をしてもよい。

〔実施例〕以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１酵母エキス５００１Ｒ９／ｄｌ、ペプトン１０００即／
ｄｔ、悶エキス１０００１１１９／ｄｌおよびＮａＣｌ
２００１１９／ｄｌを含む培地（ｐＨ７，０）　５０１
ｎｌｔ−５００，ｄ容肩付フラスコに分注し殺菌した。

この培地に、ブイヨン寒天培地にて３０℃、１６時間前
培譬したエシェリヒアコリＡＴＣＣ１０７９８を１白金
耳ずつ接種し、３０℃にて１６時間振とり培養した。得
られた培賽液よシ菌体を遠心分離により分離した後、０
．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）で洗浄し、更
に遠心分離することによ）洗浄菌体をｍＭした。

このエシェリヒアコリＡＴＣＣ１０７９８の洗浄菌体を
、２０ｍＭのＤＤＵと２０ｍＭのＨｙｐとを含む１００
ｍＭのリン酸バッファ　−（Ｐ）（＝　７．０　）　１
１に、１４になるように添加し、５０℃、２４時間反応
させた。この結果、’ｌ０ｍ９／ｄｉのＤＤＩが生成し
ていた。

（回収率１５憾） α この溶液を遠心分離（７０００Ｇ、４０分ンで除菌後、
除菌液に活性炭（白すギ炭、太田薬品工業）を濾過（孔
径０．４５μｍフィルタ）した。ν液をｌＮＮａＯＨを
用ＡてｐＨ８に調整後、１００ゴまで濃縮し、非極性多
孔質吸着樹脂Ｓ、Ｐ２Ｏ７（三菱化成工業）６５Ｍｌ　
（力９　Ａ　＄ＸＬ　＝２０ｍＸ２１０ｍ）　Ｋ　５Ｖ
＝１でフィード後、水神を３００ｍ行った（ｓｖ＝２）
、（画分−１とする）。次に、２０４エチルアルコール
水溶液２６０４で溶離し７’ｊ（ＳＶ＝２）、（画分−
２とすル）シ樹脂処理時の温度はすべて３０℃で行った
。

それぞれの画分を、液体クロマトグラフィー分析で測定
したところ、画分−１にＵｒａとＨｙｐが検出され、回
収率はそれぞれ９９．９８４又、画分−２にはＤＤＩと
ＤＤＵがそれぞれ回収率９８憾、９５憾で含まれていた
。

この両分−２をＩ　Ｎ　ＮａＯＨで−＝８に調整後、濃
縮し、晶析によυ高純度のＤＤＥ結晶４１０ηを取得し
た。取得したＤＤＩの元素分析値は表−１のとおシであ
る。

表−１元素分析値　（壬）ＣＨＮ理論値　５０．８４　５．１２　２３．７２元素分析値
　　　５０．８６　　５．１２　　２３．９１実施例２実施例１と同様に処理し取得したＤＤＩ濃縮液１００ｄ
（ＤＤＩ７００ダ／ｄｔ）を非極性多孔質吸着樹脂５ｐ
２０７（三菱化成工業）６５ｍ（カラムφＸＬ＝２０ｔ
ｍｘ２１０＋ｕ）に５Ｖ＝１にフィード後、水神を２５
０４行った（ＳＶ＝２）、（画分−１とする）。次に、
１０幅イソプロピルアルコール水溶液２００−で溶離し
た（ＳＶ＝２）、（画分−２とする）。樹脂処理時の温
度はすべて３０℃で行った。

それぞれの画分を液体クロマトグラフィー分析で測定し
たところ、画分−１には、ＵｒａとＨ３’ｐが検出され
、回収率はそれぞれ９９．９７９６であシ、画分−２に
はＤＤＩとＤＤＵがそれぞれ回収率９８憾。

９５ｑｂで含まれていた。

この画分−２をｌＮＮａＯＨで−＝８に調整後濃縮し、
晶析により高純度のＤＤＩ結晶４４０ｍ９を取得した。

取得したＤＤＩの元素分析値は表−２のとおシである。

表−２Ｃ）ｌ　　　　　　　　Ｎ理論値　５０．８４　５．１２　２３．７２〔発明の効
果〕以上述べた如く１本発明によれば非極性多孔質樹脂処理
法、好ましくはこれと晶析法を組み合わせることにより
　ＤＤＥを効率的に分離精製できるので、工業化への道
が大いに期待されるものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）微生物又は酵素の作用により生産された２′，３
′−ジデオキシイノシンを精製するに際し、２′，３′
−ジデオキシイノシンを非極性多孔質樹脂に吸着せしめ
ることを特徴とする２′，３′−ジデオキシイノシンの
精製法。
（２）さらに晶析工程を組み合わせることを特徴とする
特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）２′，３′−ジデオキシイノシンの生産反応が２
，３−ジデオキシリボース残基とヒポキサンチン残基を
微生物又は酵素の作用により結合せしめるものである特
許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（４）被精製物が不純物として２′，３′−ジデオキシ
ウリジン、ヒポキサンチン及びウラシルの少なくとも一
種を含有することを特徴とする特許請求の範囲第（１）
項記載の方法。
（５）非極性多孔質樹脂がスチレン−ジビエルベンゼン
系の共重合体、又はその誘導体を含有するものである特
許請求の範囲第（１）項記載の方法。