JPH0121909B2 - - Google Patents
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- JPH0121909B2 JPH0121909B2 JP56069246A JP6924681A JPH0121909B2 JP H0121909 B2 JPH0121909 B2 JP H0121909B2 JP 56069246 A JP56069246 A JP 56069246A JP 6924681 A JP6924681 A JP 6924681A JP H0121909 B2 JPH0121909 B2 JP H0121909B2
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Description
本発明は単核血球の表面にオンコフイータルア
ンテイジエンが存在するかどうかを決定する方法
および装置、特に試薬の生活力をチエツクする手
段と試験の信頼性を与えるために特殊な陽性対照
を使用する抗原−抗体タイプの免疫測定方法の改
良に関するものである。 米国特許第4116776号には人間の胎盤ホルモン
（hCG）がリンパ球上に存在するかどうかを決定
する方法が開示されている。この方法はガンの検
査としての男性および妊娠していない女性のhCG
の検出方法を改良したものである。その特許の発
明者は血清中のhCGの有無を検査するための従来
のラジオイムノアツセイテストに言及し、宿主の
リンパ細胞が悪性の腫瘍細胞によつて分沁された
hCGを集めてそのhCGと結合することを発見した
と言つており、そしてその特許の試験は従来の血
清試験に比べて感度が高いことを特徴とするもの
であると述べている。その特許の方法において
は、前記リンパ球に結合したhCG分子からシアリ
ン酸残滓を除去した後、そのリンパ球をhCGのサ
ブユニツトに特異的な標識した抗血清にさらし、
平衡に達した後にその標識、例えば螢光、放射活
性、の量を測定することによつてhCGの濃度を測
定する。既知の健康人の血液、同じ標識につけら
れた選択された非特異的抗血清等の陰性対照が、
その方法では通常用いられる。 米国特許第3988115号にはあるリガンドに結合
することのできるリンパ球の量を決定する試験が
開示されている。その試験はそのリガンドに特異
的なレセプターを有するリンパ球と相互に作用
し、その特異的なレセプターを有するリンパ球の
みの増生を刺激するリガンドに基づくものであ
る。そのリガンドに特異的なレセプターを有する
リンパ球の量を検出するのに標識したリガンドが
使用される。この試験の長所は血流中に多量の抗
体が存在する前でも使用できることであると上記
特許には記載されている。ゲルビーズに吸収され
た抗体等の所定のリガンド結合活性を有する粒子
あるいは正常人の血液が対照として使用される。 ロツコフ（Rockoff）等の「Sensitive and
Covenient Quantitation of Antibody Binding
to Cellular Antigens Using Glutaraldehyde
Preserved Cells」（Journal of Immunological
Methods、26、369、1979）にはグルタルアルデ
ヒド固定した標的細胞を使用してガンに特異的な
抗体を検出し、定量する方法が記載されている。
対照は正常血清と液体培地である。 トマシジユニヤ（Tomasi、Jr.）の
「Structure and Functions of Alpha−fetop−
rotein」（Ann Rev.Med.、1977、28：453）に
は、所謂「ガンにかかり易い家族」の末梢単核血
球の表面にはアルフア胎児蛋白質（AFP、オン
コフイータル（oncofetal）アンテイジエンの一
種）の発生率が高いことが記載されている。本発
明者の得た情報によれば、トマシジユニヤは螢光
免疫測定法によつて、抗AFP抗体の単特異性フ
ラグメントを化学的にフルオレセインに結合さ
せ、それを患者のリンパ球とともに培養した後、
顕微鏡下で陽性細胞を計数した。 ノートン（Naughton）等の「Localization of
the β Chain of Human Chorionic
Gonadotropin on Human Tumor Cells and
Placental Cells」（Cancer Research、35、1887
（1975））には酵素標識したhCG抗体を使用して人
間の腫瘍細胞の表面上にhCGを位置させたことが
記載されている。 もう１つのオンコフイータル蛋白であるフエリ
チンは潜勢腫瘍マーカーであることが知られてい
る。マーカス（Marcus）等の「Serum Ferritin
Levels in Patients with Breast Cancer」
（Clin.Res.、23、447（1975））には二重抗体ラジ
オイムノアツセイ法によつて血清フエリチンを測
定したことが記載されている。これに対してモロ
ツ（Moroz）等のより最近の論文によれば、よ
り特異的な悪性腫瘍マーカーはフエリチンを担つ
たリンパ球の存在である。（「Lymphocytes
Bearing Surface Ferritin in Patient with
Hodgkin′s Disease and Breast Cancer」−The
New England Journal of Medicine、
correspondence、276、No.20、1172（1977）およ
び「Ferritin−Bearing Lymphocytes and Ｔ−
cell Levels in Peripheral Blood of Patients
with Breast Cancer」−Cancer Immunol.
Immunother.、３、101（1977）参照）モロツ等は
フエリチンを担つた細胞を決定するのに細胞傷害
テストを用いた。すなわち患者のリンパ球に抗体
を加えた後、補体を加えて表面に抗体を持たない
細胞を破壊し、死んだ細胞によつては排除されな
いようなタイプの標準的な色素を用いて死んだ細
胞の数を決定した。 本発明は末梢血液リンパ球上の少なくとも１種
のオンコフイータルアンテイジエンを検出するこ
とのできる血液テスト方法を提供することを目的
とするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球上のフエリチ
ンを検出するための血液テスト方法を提供するこ
とを目的とするものである。 さらに本発明は少なくとも１つのフエリチン等
のオンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血
液リンパ球の部分母集団を定量する方法を提供す
ることを目的とするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球上のオンコフ
イータルアンテイジエンの有無を定量的乃至半定
量的方法で決定することができ、かつそのテスト
の有効性を確認するのにリンパ球に付着せしめら
れたオンコフイータルアンテイジエンからなる陽
性対照を使用するようにした標識式の改良された
免疫測定方法を提供することを目的とするもので
ある。 さらに本発明は少なくともある種のガンを早期
発見乃至予知することのできる標識式の免疫測定
方法を提供することを目的とするものである。 また本発明は上記のような方法を実施するため
の装置すなわち試験キツトを提供することを目的
とするものである。 本発明者は末梢血液単核細胞（peripheral
blood mononuclear cell）、例えばリンパ球上の
少なくとも１つのオンコフイータルアンテイジエ
ンを次のような方法によつて半定量的乃至定量的
に検出できることを発見した。 (A) 患者の末梢血液単核細胞の一定量をそのオン
コフイータルアンテイジエンに対する標識した
抗体と混合し、同じ細胞サンプルの次の一定量
を、詰抗的結合阻害量の精製したヒトのオンコ
フイータルアンテイジエンを加えた標識した抗
体と混合する。 (B) 次に、既知の抗原−陽性の末梢血液単核タイ
プの細胞を前記患者の細胞サンプルの替りに使
用して、(A)と同じ操作をする。次に以下に詳述
するような計算を行なう。 定量を行なう場合には、４番目の試薬、すなわ
ちオンコフイータルアンテイジエンに固定された
抗体を前記標識した抗体および精製した抗原とと
もに使用して一連の標準曲線を作成する。 本発明の一実施例においては前記オンコフイー
タルアンテイジエンはヒトフエリチンであり、抗
体はもちろん抗ヒトフエリチンであり、放射活性
ヨウ素、例えばI125で標識するのが望ましい。 本発明はさらに本発明の方法に使用される試薬
を別々に収容した試薬キツトをも提供するもので
ある。 以下本発明を更に詳細に説明する。 過去数年に亘つてオンコフイータルアンテイジ
エンを検出し、定量しようとする生化学的な研究
が多くなされるようになつてきた。オンコフイー
タルアンテイジエンは通常は胎児内もしくは、正
常な妊婦内にhCGが存在するようにある非悪性の
生理学的条件にある成人内にのみ多量に存在す
る。しかしながらガンにかかつているかもしくは
ガンの素因を有する成人にもオンコフイータルア
ンテイジエンが存在することが次第に明らかにな
つて来た。ここで問題となるのは上記以外の生理
学的条件下にある成人にも上述のようにオンコフ
イータルアンテイジエンが存在することである。
例えば消化管の炎症性疾病にかかつている妊娠し
ていない女性の血清中にはhCGが存在するし、急
性肝炎、慢性肝臓症害等の患者の血清中にはアル
フア胎児蛋白質が存在する。最近の研究によつて
血清オンコフイータルアンテイジエンと末梢血液
単核細胞に結合したオンコフイータルアンテイジ
エンの区別がつくようになつたことがある論文に
記載されている。その論文によれば、悪性の状態
にあるか、あるいはその素因を有する状態にある
と血清中にではなく末梢血液単核細胞の表面に多
量のオンコフイータルアンテイジエンが発見され
る。さらに、その論文は、オンコフイータルアン
テイジエンを担う末梢血液単核細胞の部分母集団
はオンコフイータルアンテイジエンの血清レベル
とは無関係であり、悪性の素因の存在に関係する
ことを強く主張している。 多くの研究者が人の正常か否かと、フエリチン
の関係に注目している。フエリチンは分子量約
450000の鉄を貯蔵する蛋白である。フエリチンは
実際には複数のサブユニツトからなつている。す
なわち分子量約18000の複数のイソフエリチンが
非共有結合によつて互いに結合したものである。
少なくともそのうちの幾つかのイソフエリチンを
互いに分離することは等電点を利用すれば可能で
ある。等電点が約4.3〜5.0であるイソフエリチン
は特に面白そうである。アルパート（Alpert）
等の「Carcino−Foetal Human Liver
Ferritins」（Nature、242、194（３月16日、
1973））を参照されたい。 α−２−Ｈ−グロブリンは胎児の肝臓内に主に
発見される酸性イソフエリチンであり、１種のオ
ンコフイータルアンテイジエンであるが、肝臓腫
瘍、奇形腫等の種々の悪性疾病を有する成人内に
も発見される。免疫学的には、正常なヒトフエリ
チンからまだ区別されていないイソフエリチンが
多い。しかしながら、免疫学的な抗体産生技法を
使用すれば上記α−２−Ｈ−グロブリン、5.1〜
5.6の等電点を有するイソフエリチン等の特定の
イソフエリチンに対する抗体は産生することがで
きると考えられる。 上述のような当然起きる生理学的現象、すなわ
ち、かなり広い濃度範囲に亘つて正常の血清中に
フエリチンが存在ししかも現在のところ異なるイ
ソフエリチンを免疫学的に区別することができ
ず、さらに非悪性の貧血のような非悪性の疾病状
態にあると血清フエリチンレベルが上昇すること
を考え合わせると血清フエリチンレベルを診断の
基準とすることは困難である。ある研究で悪性の
疾病にかかつている患者をテストしたところその
約70％の血清フエリチンレベルが上昇していた。
さらに、初期の乳がん患者においては血清フエリ
チンレベルは正常な血清のフエリチンレベルとオ
ーバーラツプしているが、再発性あるいは転移性
の乳がんにかかつている女性は血清フエリチンレ
ベルが極めて高いという報告もある。ヤコブ
（Jacobs）等の「Serum Ferritin Concentration
in Ｅ arly Breast Cancer」（Br.J.Cancer、34
(3)、286（1976））、「Serum Ferritin
Concentration in Untreated Hodgkin′s
Disease」（同書34(3)、162（1976）、サーシノン
（Sarcinone）等の「Increased Ferritin
Synthesis and Release by Hodgkin′s Disease
in Peripheral Blood Lymphocytes」（Int.J.
Cancer、20、339（1977））および新津等の
「Radioimmunoassay of Serum Ferritin in
Patients with Malignancy」（Ann.N.Y.Acad.
Sci、259、450（1975））を参照されたい。 モロツ等の研究の一部を前述したが、モロツ等
はさらに、フエリチン蛋白成分がホジキン氏リン
パ様組織腫においてＴリンパ球の遮断物質として
作用し、それによつてそのような細胞がヒツジ赤
血球と自発的にロゼツトを形成するのを抑えるこ
とを発見した。モロツ等の「Ferritin on the
Surface of Lymphocytes in Hodgkin′s
Disease Patients−ａ Possible Blocking
Substance Removed by Levamisole」（Clin.
Exp.Immunol.、29、30（1977））を参照された
い。これによつて乳がんの徴候としてのフエリチ
ンを担うリンパ球を前述の細胞傷害テストによつ
て定量しようとする研究が導かれたのかも知れな
い。この細胞傷害テストの著しい欠点の１つは患
者の細胞に使用された各試薬の効果を別々に評価
しなければならないということである。 本発明のフエリチンを担うリンパ球の検出定量
方法は迅速でかつ侵入性がない。本発明のテスト
方法はオンコフイータルアンテイジエンの検出に
実験的に使用できるだけでなく、乳がん等のガン
の発見および治療効果を評価するのに使用するこ
とができる。 次に本発明に使用される試薬について説明す
る。 (1) 標識した抗ヒトフエリチン抗体 以下に述べる実験において使用されたフエリ
チン抗体は単特異的ヒトフエリチン抗体であ
る。より特異性の強い抗体、すなわちイソフエ
リチン特異的抗体も、以下に述べる標識したヒ
トフエリチン抗体の調製方法において正常なヒ
トフエリチンの替りに少なくとも１種のイソフ
エリチンすなわち等電的に決定された範囲のイ
ソフエリチンで置換することによつて調製する
ことができる。 標準的な免疫学的な方法を用いてラビツトと
ヒトフエリチンで免疫する。次のような親和性
精製方法によつて単特異的抗体を産生すること
ができる。等価の方法は当業者には容易に分か
るであろう。 粒子サイズ200〜400メツシユのアリルアミン
の制御孔（1350Å）ガラスをグルタルアルデヒ
ド（ガラス１ｇ当たり５ml）で活性化する。そ
のガラスを洗つて未反応のグルタルアルデヒド
を除去した後、ガラス１ｇ当たり１mgのヒトフ
エリチンをその活性化したガラスと室温で約２
時間静かに混合する。次に1Mの塩化ナトリウ
ムと0.1Mのグリシンで続けて洗い、さらに
0.1Mのリン酸塩緩衝液で３〜５回洗う。その
アリルアミンガラスは公知の方法によつて容易
に調製することができる。例えば「Weetall、
Science、166、615（1969）」を参照されたい。 次にそのフエリチンの結合したガラスをその
ガラス１ｇ当たり約１mlのフエリチン抗血清と
静かに混合する。22℃で一晩培養した後0.1M
の炭酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム
（PH8.0）、0.1Mの酢酸ナトリウムおよび0.15M
の塩化ナトリウム（PH5.0）で続けて洗い、さ
らに1Mの塩酸でPH4.4に調節した蒸留水で２度
洗う。PH2.2に調節した蒸留水で単特異的抗体
を溶出させる。そのスラリーを0.3Mのリン酸
ナトリウム内に過し、その液を限外過に
よつて濃縮する。抗体は0.02％のアジ化物を含
む0.1Mリン酸ナトリウム溶液内に貯蔵するこ
とができる。その抗体は放射活性標識、酵素標
識、螢光標識等従来のどのような標識とも結合
させることができるが、ここではこの単特異的
ヒトフエリチン抗体はNaI125によつて放射活性
標識した。 (2) フエリチン陽性単核細胞 この試薬は上記(1)の試薬の安定性をモニター
し、本発明の方法の有効性を確認するために陽
性の定性対照として使用される。 この試薬を調製するのに使用される単核細胞
としては、自然のヒトリンパ球では起りがちな
フエリチンレベルの変動を避けるために培養増
殖したリンパ球を使用するのが普通である。こ
こでは、急性リンパ母細胞性白血病細胞
（CCL−119、ATCC）を使用したが、ネズミ
リンパ球（CCL−86またはCCL−126ライン）
等の他の培養されたリンパ球を使用することが
できるし、また適切な篩分けができれば正常な
実験材料の末梢血液リンパ球でも使用すること
ができる。このような単核細胞はすなわち末梢
血液単核タイプの細胞である。このような細胞
は天然の末梢血液単核細胞と似た表面膜特性を
示しさえすれば、天然の末梢血液単核細胞であ
る必要はない。 この実験では、その陽性定性対照試薬細胞は
10％の牛の胎児の血清（FCS、Grand Island
Biological Co.（ニユーヨーク州グランドアイ
ランド）製）で補足したRPMI−1640培養基
（同上）内で増殖した急性リンパ母細胞性白血
病細胞（CCL−119）を使用して調製した。こ
の細胞は撹拌培養法を使用した連続培養によつ
て増殖させることができ、大量生産に適してい
る。そのCCL−119を200〜300xｇ15分間遠心
沈澱させて採集し、リン酸緩衝食塩水（PBS、
0.01Mリン酸塩、0.15M塩化ナトリウム、PH
7.4）で２度洗つた。その細胞を２〜３×107
個／mlとなるようにPBS内で再構成した。充
分な量のグルタルアルデヒドの25％（ｗ／ｗ）
溶液を加えて最終的なグルタルアルデヒド濃度
が約１％となるようにした。この濃度より高い
密度で活性化すると広範囲に亘る細胞凝集が起
きる。その細胞を22℃で30分間連続的にゆすり
ながら培養した後、遠心沈澱によつて採集して
洗つた。精製したヒトフエリチン（カリフオル
ニア州サンルースオビスポのJBL Chemical
Company製）をPBSで希釈し、200〜300μｇ／
mlの濃度とし、その細胞ペレツトに充分加えて
細胞濃度が２〜３×107個／mlとなるようにし
た。 その細胞22℃で30分間ゆすりながら培養し、
さらに16〜18時間４℃で培養した。その細胞を
前述のようにして洗い、１％の牛の血清アルブ
ミン（BSA）と0.2％のアジ化ナトリウムを含
むPBS内に懸濁させた。誘導された細胞の最
初の集団から平均回収率は40〜50％であつた。
この細胞を４℃で保存し、40日間にI125で標識
したヒトフエリチン抗体の特異的結合によつて
評価したところ活性の減少は10％のみであつ
た。 ラビツトの抗ヒトフエリチン血清と、フルオ
レセインに結合させた山羊の抗ラビツト血清を
使用して間接免疫螢光法によつてその細胞を評
価したところ43％の細胞が螢光を示した。これ
に対して、フエリチンに結合されていない
CCL−119すなわち牛の血清アルブミンに結合
されたCCL−119は螢光を示さなかつた。この
陽性定性対照細胞は正常なラビツト血清ととも
に培養したときには螢光を示さなかつた。また
この細胞上のフエリチンの量は約25〜40nｇ／
2.5×105個であつた。 (3) 精製したヒトフエリチン この試薬は市販されており、半定量的テスト
モードおよび定量的テストモードの両方に使用
される。半定量的モードでは特異的標識抗体結
合を評価するために、患者のリンパ球上に存在
するフエリチンへの標識したフエリチン抗体の
結合を詰抗的に遮断するように高濃度で使用さ
れる。また定量的モードではリンパ球に結合し
たフエリチンの絶対値を決定するための標準曲
線を得るためにイムノラジオメトリツクアツセ
イ（IRMA）との関連において種々の濃度で使
用される。 (4) 固定されたヒトフエリチン抗血清 この試薬はリンパ球に結合したフエリチンの
値を外挿法によつて推定するための標準曲線を
得るために上記試薬１および３との関連におい
て使用され、制御孔ガラスのような基体に共有
結合したヒトフエリチン抗血清からなつてい
る。 以下に述べるテストではこの試薬は粒子サイ
ズ1μ、気孔サイズ550Åのアリルアミンの制御
孔ガラスを使用して調製した。 このガラスをまず2Nの塩酸と亜硝酸ナトリ
ウム０℃で活性化した。20分後にそのガラスを
蒸留水で充分洗つた。次にそのガラス１ｇ当た
り１mlの保存ヒトフエリチン抗血清を加えた。
PHを8.4に調整し、４℃で一晩反応させた。そ
の固定された抗体をPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液
内で充分洗い、0.1％のBSAを含むPH7.0の
0.01Mリン酸緩衝液内に最終濃度20mg（ガラ
ス）／mlで４℃で保存した。 以下本発明の方法を実施するための上記各試薬
を使用したテストモードについて詳細に説明す
る。一般に、上記試薬１、２、３（標識したヒト
フエリチン抗体、フエリチン陽性リンパ球および
精製したヒトフエリチン）は半定量的測定を行な
うのに使用され、また４つ目の固定されたヒトフ
エリチン抗血清を含む全ての上記試薬はリンパ球
に結合したフエリチンの定量に使用される。 定量的テスト、半定量的テストのいずれが必要
であるにしても、テスト成分は患者の末梢血液単
核細胞、特にリンパ球のサンプルである。注意深
く分析すれば患者の全ての白血球のサンプル（例
えば炎症性痂皮）も使用できると思われるが、こ
こでは第１のステツプとして末梢血液単核細胞の
他の血液成分から分離する方が良い。その末梢血
液単核細胞と他の血液成分との分離は公知の方法
によつて行なうことができる。例えば単核細胞セ
パレーターを使用すればよい。ルーダラー
（Luderer）等の「Rapid、Quantitatine Human
Lymphocyte Separation and Purification in
ａ Closed System」（Molecular Immunol.、
16、621（1979）あるいはボヤム（Boyum）の
Ficoll−Hypaque法（Scand.J.Immunol.、５（増
刊５）、９（1976））を参照されたい。遠心沈澱等
の公知の方法による洗浄、および血球計算器乃至
自動血球カウンターによる計数によつて細胞数を
規格化することで本発明の方法の準備段階が終了
する。必らず必要なものではないが、末梢単核細
胞のリンパ球フラクシヨンを公知の方法で得てテ
ストサンプルとして使用することもできる。 半定量的モードにおいては、前記リンパ球の一
定量を標識した抗ヒトフエリチン抗体の一定量と
混合する。このとき一定量の緩衝液も混合するの
が望ましい。別に、その患者のリンパ球、標識し
た抗ヒトフエリチン抗体および一定量の精製した
ヒトフエリチン（これは緩衝液の替りにもなる。）
混合して通常の詰抗的テスト結合参照とする。こ
れはヒトフエリチンが標識した抗体のテスト細胞
へのどのような特異的結合も詰抗的にペレツトを
計数する。特異的結合として報告される半定量の
結果は、「加えた過剰のヒトフエリチン」の非存
在下でのcpm（１分間当りの計数）結合を、測定
系に加えられたI125で標識した抗体の総量のcpm
から加えられた過剰のヒトフエリチンの存在下で
の細胞へのcpm結合を引いたもので割つた値から
過剰の可溶性ヒトフエリチンの存在下での細胞へ
のcpm（１分間当りの計数）結合を引くことによ
つて決定される。その「加えられた過剰のヒトフ
エリチン」とは標識した抗体の細胞への特異的結
合を完全に遮断するように測定系に加えられた可
溶性フエリチンの総量として定義される。 一般に、特異的結合は少なくとも２つの異なる
細胞濃度で評価される。結果は特定細胞数当りの
末梢血液リンパ球へのcpmあるいは結合率で報告
される。遮断するような高濃度で加えられるから
である。第２段階は（第２段階といつててももち
ろん上記テストの前でも後でもまた同時にでも差
し支えないが）上記２つの操作をテスト細胞の替
りにフエリチン陽性リンパ球を使用して行ない、
測定系の機能性と標識した抗体の安定性をモニタ
ーすることである。それ以上のチエツクが必要で
ある場合には任意のステツプとして、フエリチン
陽性リンパ球の替りに対照陰性細胞を使用して第
２段階と同じ操作をしてもよい。その対照陰性細
胞としては牛の血清アルブミンを担うCCL−119
リンパ球のような、標識した抗体と反応しない蛋
白を担うものを使用する。 適当な培養期間の後、前記細胞を洗つて遠心分
離する。上澄を回収してペレツト化した細胞の結
合標識を評価する。I125で標識した抗体を使用す
る場合にはγ線スペクトロメーター内で定量的測
定においては患者のリンパ球と定性対照リンパ球
の測定を上述と同様にして行ない、さらにヒトフ
エリチンを量を増しながら一定濃度の固定された
抗ヒトフエリチン抗血清（IMA）とともに培養
して標準曲線を作成する。この系ではIMAをま
ず緩衝液のみと混合するか、あるいは種々の濃度
のヒトフエリチンと混合する。テスト細胞を分析
するのに使用したのと同じ最終的な時間間隔まで
一定時間間隔で標識した抗体を加えて培養を続け
る。そのIMAを緩衝液で洗つて、遠心沈澱によ
つてペレツト化する。上澄をデカントして、ペレ
ツトの放射線活性を評価する。各ヒトフエリチン
濃度について特異的結合を、緩衝液のみが存在す
るときのIMAへのcpm結合を、次第に量を増し
た「加えたヒトフエリチン」における加えた抗体
の総cpmとcpm結合の両方から引く以外は上記と
同様にして決定する。片対数方眼紙の直線目盛に
特異的結合をとり、対数目盛に加えたフエリチン
の量をとつてプロツトして標準曲線を作成する。
患者の細胞による特異的結合を対数目盛に外挿す
ることによつて患者の末梢血液リンパ球に結合し
たフエリチンの定量がなされる。今のところで
は、その標準曲線は患者のテストに使用したのと
同じヒトフエリチンを使用して患者のテストの都
度作成する方が良いと思われる。規格化と貯蔵寿
命すなわち安定性が改良されれば、標準曲線の作
成はそんなに頻繁に行なわなくてよくなるであろ
う。もちろん、アイソトープを使用する場合には
その都度標準曲線を作成しなければならない。 もちろん上記各モードにおいて、試薬とテスト
結果を確認するためフエリチン陽性リンパ球を使
用した前記第２段階の測定で得られた結果を使用
して同じ計算がなされる。 後に詳細に説明するように、ここで説明したテ
スト方法はガンの早期発見および治療効果をモニ
ターする有効な手段として使用することができ
る。正常な健康人の場合には、精製したヒトフエ
リチンが存在する場合と存在しない場合の結合標
識の測定値には殆ど差がないか、あつても小さい
が、初期の（病初以前の）ガンあるいは進行した
ガンの患者の末梢血液リンパ球の場合にはヒトフ
エリチンが存在しない系内の結合標識が増加す
る。 次に、前述した試薬を使用した測定方法を例を
挙げて更に詳細に説明する。 凝血を抑止された血液見本から前述のボヤムの
方法によつてリンパ球を分離した。このときリン
酸塩で緩衝した生理的食塩水でその見本を１：２
で希釈し、その血液をフイコル−ハイパツク
（Ficoll−Hypaque）溶液上に層をなすように静
かに注いだ。次に400×ｇで30分間遠心沈澱させ
たところリンパ球が明確な界面を持つて帯状をな
した。それをパスツールピペツトで取り出し、緩
やかな遠心沈澱（200×ｇ、10分間）によつて
PBS内で２度洗つた。さらに、それを１×107
個／mlの濃度で0.1％のBSAと0.02％のアジ化ナ
トリウムを含むPBS乃至RPMI培養基内に懸濁さ
せた。対照陽性細胞（フエリチンを担うリンパ
球）もこの濃度で懸濁させた。 各細胞濃度においてテストする各見本に４本の
12×75mmのプラスチツク試験管を割り当てた。４
℃の水浴の中で反応を開始させた。各試験管に
100μの細胞を加えた。各組の最初の２本の試
験管にはさらに100μのPBS−BSA−アジ化物
溶液を加え、残りの２本の試験管には10〜50μ
ｇ／mlの濃度で（過剰のHF）PBS−BSA−アジ
化物溶液に加えられたヒトフエリチン100μを
注いだ。この濃度は３×106個の陽性対照細胞へ
のI125標識の抗体の特異的結合を遮断するのに充
分であつた。100μのI125標識抗体（50000〜
100000opm）を加えた後、その試験管をシエーカ
ー浴に移して４℃で一晩（16〜18時間）培養して
結合を平衡に達しさせた。培養の後、３mlの
PBSで細胞を洗い、3000rpmで15分間遠心沈澱さ
せた。上澄をアスピレートして、細胞ペレツトの
結合放射活性を計数した。このようにして得た特
異的結合の反復試験によつて得た値を平均した。 ヒトフエリチンのほぼ完全な結合遮断作用によ
つてテスト細胞に結合したフエリチンに対する標
識フエリチン抗体の特異性が確立されるととも
に、細胞表面への非特異的吸着が低レベルに保た
れる。 次に本発明の測定方法の極めて高い感度につい
て説明する。 リンパ球上のフエリチンを測定し得る感度の下
限をヒトフエリチンの濃度を増しながら、一定濃
度の放射線標識したフエリチン抗体と2.5×105の
陽性対照細胞（明確な量のフエリチンを担つた
CCL−119）を使用して詰抗結合によつて決定し
た。検出の下限は２〜2.5×19-9ｇ、あるいは4.4
〜5.5×10-6ナノモルであることが分かつた。こ
の下限は放射線標識したフエリチン抗体の陽性対
照細胞への特異的結合を再現可能に禁止し得るヒ
トフエリチンの最少量に基づくものである。 陰性細胞の集団内のフエリチンを担う細胞の検
出可能な最少の数を最終細胞数2.5×105個となる
ように陰性細胞と混合した対照陽性細胞を使用し
て研究した。この細胞密度において、12500個の
細胞が５％特異的結合の識別レベルで検出するこ
とができた。前記定量データから見ると、これは
検出の下限であるフエリチンの絶対値約2nｇに
対応している。したがつて細胞数１×106の集団
の場合には1.25％の陽性細胞が検出し得ると考え
られる。文献によればリンパ球の総数のうち16.6
％がフエリチン陽性細胞であるとすると乳がんの
徴候があるとされているから（モロツ等の
「Cancer Immunol.Immunother.」、３、101
（1977））これは極めて素晴らしい値である。 次に定量的な測定において標準曲線を作成する
一般的な方法を説明する。 複数の全く同じ12×75mmの試験管に保存IMA
（ガラス20mg／ml）から取り出してPBS−BSA−
アジ化物溶液で予め１：10で希釈したヒトフエリ
チン抗血清IMA100μを加える。各セツトの試
験管に100μの緩衝液を単独で加えるか、ヒト
フエリチンを緩衝液で種々の量に希釈したものを
加える。この測定は４℃の水浴内で開始する。次
にその試験管をシエーカー浴内で30分間22℃に保
つ。この時間の終りに放射線標識したフエリチン
抗体（100μ）IMAを入つた各試験管に加え、
更に30分間保温を続ける。その試験管を陽性対照
見本と同じ方法で洗つて遠心沈澱させる。対照見
本の場合とは異なり、放射線標識した抗体は測定
の開始時には加えず30分後に加える。これによつ
て標識した抗血清を加える前にヒトフエリチンが
IMA抗血清と平衡に達することができる。しか
しながら培養時間が適当であれば標識した抗体を
同時に加えることもできる。 種々の濃度に希釈した陽性対照細胞に対する特
異的結合を標準曲線から外挿することによつてフ
エリチン結合の絶対量を決定することができる。 第１表は本発明の半定量モードの測定方法によ
つて多数の患者をテストした結果を示すものであ
る。正確度および患者の種類は他の診断方法例え
ば生体組織検査によつて決定した。
ンテイジエンが存在するかどうかを決定する方法
および装置、特に試薬の生活力をチエツクする手
段と試験の信頼性を与えるために特殊な陽性対照
を使用する抗原−抗体タイプの免疫測定方法の改
良に関するものである。 米国特許第4116776号には人間の胎盤ホルモン
（hCG）がリンパ球上に存在するかどうかを決定
する方法が開示されている。この方法はガンの検
査としての男性および妊娠していない女性のhCG
の検出方法を改良したものである。その特許の発
明者は血清中のhCGの有無を検査するための従来
のラジオイムノアツセイテストに言及し、宿主の
リンパ細胞が悪性の腫瘍細胞によつて分沁された
hCGを集めてそのhCGと結合することを発見した
と言つており、そしてその特許の試験は従来の血
清試験に比べて感度が高いことを特徴とするもの
であると述べている。その特許の方法において
は、前記リンパ球に結合したhCG分子からシアリ
ン酸残滓を除去した後、そのリンパ球をhCGのサ
ブユニツトに特異的な標識した抗血清にさらし、
平衡に達した後にその標識、例えば螢光、放射活
性、の量を測定することによつてhCGの濃度を測
定する。既知の健康人の血液、同じ標識につけら
れた選択された非特異的抗血清等の陰性対照が、
その方法では通常用いられる。 米国特許第3988115号にはあるリガンドに結合
することのできるリンパ球の量を決定する試験が
開示されている。その試験はそのリガンドに特異
的なレセプターを有するリンパ球と相互に作用
し、その特異的なレセプターを有するリンパ球の
みの増生を刺激するリガンドに基づくものであ
る。そのリガンドに特異的なレセプターを有する
リンパ球の量を検出するのに標識したリガンドが
使用される。この試験の長所は血流中に多量の抗
体が存在する前でも使用できることであると上記
特許には記載されている。ゲルビーズに吸収され
た抗体等の所定のリガンド結合活性を有する粒子
あるいは正常人の血液が対照として使用される。 ロツコフ（Rockoff）等の「Sensitive and
Covenient Quantitation of Antibody Binding
to Cellular Antigens Using Glutaraldehyde
Preserved Cells」（Journal of Immunological
Methods、26、369、1979）にはグルタルアルデ
ヒド固定した標的細胞を使用してガンに特異的な
抗体を検出し、定量する方法が記載されている。
対照は正常血清と液体培地である。 トマシジユニヤ（Tomasi、Jr.）の
「Structure and Functions of Alpha−fetop−
rotein」（Ann Rev.Med.、1977、28：453）に
は、所謂「ガンにかかり易い家族」の末梢単核血
球の表面にはアルフア胎児蛋白質（AFP、オン
コフイータル（oncofetal）アンテイジエンの一
種）の発生率が高いことが記載されている。本発
明者の得た情報によれば、トマシジユニヤは螢光
免疫測定法によつて、抗AFP抗体の単特異性フ
ラグメントを化学的にフルオレセインに結合さ
せ、それを患者のリンパ球とともに培養した後、
顕微鏡下で陽性細胞を計数した。 ノートン（Naughton）等の「Localization of
the β Chain of Human Chorionic
Gonadotropin on Human Tumor Cells and
Placental Cells」（Cancer Research、35、1887
（1975））には酵素標識したhCG抗体を使用して人
間の腫瘍細胞の表面上にhCGを位置させたことが
記載されている。 もう１つのオンコフイータル蛋白であるフエリ
チンは潜勢腫瘍マーカーであることが知られてい
る。マーカス（Marcus）等の「Serum Ferritin
Levels in Patients with Breast Cancer」
（Clin.Res.、23、447（1975））には二重抗体ラジ
オイムノアツセイ法によつて血清フエリチンを測
定したことが記載されている。これに対してモロ
ツ（Moroz）等のより最近の論文によれば、よ
り特異的な悪性腫瘍マーカーはフエリチンを担つ
たリンパ球の存在である。（「Lymphocytes
Bearing Surface Ferritin in Patient with
Hodgkin′s Disease and Breast Cancer」−The
New England Journal of Medicine、
correspondence、276、No.20、1172（1977）およ
び「Ferritin−Bearing Lymphocytes and Ｔ−
cell Levels in Peripheral Blood of Patients
with Breast Cancer」−Cancer Immunol.
Immunother.、３、101（1977）参照）モロツ等は
フエリチンを担つた細胞を決定するのに細胞傷害
テストを用いた。すなわち患者のリンパ球に抗体
を加えた後、補体を加えて表面に抗体を持たない
細胞を破壊し、死んだ細胞によつては排除されな
いようなタイプの標準的な色素を用いて死んだ細
胞の数を決定した。 本発明は末梢血液リンパ球上の少なくとも１種
のオンコフイータルアンテイジエンを検出するこ
とのできる血液テスト方法を提供することを目的
とするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球上のフエリチ
ンを検出するための血液テスト方法を提供するこ
とを目的とするものである。 さらに本発明は少なくとも１つのフエリチン等
のオンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血
液リンパ球の部分母集団を定量する方法を提供す
ることを目的とするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球上のオンコフ
イータルアンテイジエンの有無を定量的乃至半定
量的方法で決定することができ、かつそのテスト
の有効性を確認するのにリンパ球に付着せしめら
れたオンコフイータルアンテイジエンからなる陽
性対照を使用するようにした標識式の改良された
免疫測定方法を提供することを目的とするもので
ある。 さらに本発明は少なくともある種のガンを早期
発見乃至予知することのできる標識式の免疫測定
方法を提供することを目的とするものである。 また本発明は上記のような方法を実施するため
の装置すなわち試験キツトを提供することを目的
とするものである。 本発明者は末梢血液単核細胞（peripheral
blood mononuclear cell）、例えばリンパ球上の
少なくとも１つのオンコフイータルアンテイジエ
ンを次のような方法によつて半定量的乃至定量的
に検出できることを発見した。 (A) 患者の末梢血液単核細胞の一定量をそのオン
コフイータルアンテイジエンに対する標識した
抗体と混合し、同じ細胞サンプルの次の一定量
を、詰抗的結合阻害量の精製したヒトのオンコ
フイータルアンテイジエンを加えた標識した抗
体と混合する。 (B) 次に、既知の抗原−陽性の末梢血液単核タイ
プの細胞を前記患者の細胞サンプルの替りに使
用して、(A)と同じ操作をする。次に以下に詳述
するような計算を行なう。 定量を行なう場合には、４番目の試薬、すなわ
ちオンコフイータルアンテイジエンに固定された
抗体を前記標識した抗体および精製した抗原とと
もに使用して一連の標準曲線を作成する。 本発明の一実施例においては前記オンコフイー
タルアンテイジエンはヒトフエリチンであり、抗
体はもちろん抗ヒトフエリチンであり、放射活性
ヨウ素、例えばI125で標識するのが望ましい。 本発明はさらに本発明の方法に使用される試薬
を別々に収容した試薬キツトをも提供するもので
ある。 以下本発明を更に詳細に説明する。 過去数年に亘つてオンコフイータルアンテイジ
エンを検出し、定量しようとする生化学的な研究
が多くなされるようになつてきた。オンコフイー
タルアンテイジエンは通常は胎児内もしくは、正
常な妊婦内にhCGが存在するようにある非悪性の
生理学的条件にある成人内にのみ多量に存在す
る。しかしながらガンにかかつているかもしくは
ガンの素因を有する成人にもオンコフイータルア
ンテイジエンが存在することが次第に明らかにな
つて来た。ここで問題となるのは上記以外の生理
学的条件下にある成人にも上述のようにオンコフ
イータルアンテイジエンが存在することである。
例えば消化管の炎症性疾病にかかつている妊娠し
ていない女性の血清中にはhCGが存在するし、急
性肝炎、慢性肝臓症害等の患者の血清中にはアル
フア胎児蛋白質が存在する。最近の研究によつて
血清オンコフイータルアンテイジエンと末梢血液
単核細胞に結合したオンコフイータルアンテイジ
エンの区別がつくようになつたことがある論文に
記載されている。その論文によれば、悪性の状態
にあるか、あるいはその素因を有する状態にある
と血清中にではなく末梢血液単核細胞の表面に多
量のオンコフイータルアンテイジエンが発見され
る。さらに、その論文は、オンコフイータルアン
テイジエンを担う末梢血液単核細胞の部分母集団
はオンコフイータルアンテイジエンの血清レベル
とは無関係であり、悪性の素因の存在に関係する
ことを強く主張している。 多くの研究者が人の正常か否かと、フエリチン
の関係に注目している。フエリチンは分子量約
450000の鉄を貯蔵する蛋白である。フエリチンは
実際には複数のサブユニツトからなつている。す
なわち分子量約18000の複数のイソフエリチンが
非共有結合によつて互いに結合したものである。
少なくともそのうちの幾つかのイソフエリチンを
互いに分離することは等電点を利用すれば可能で
ある。等電点が約4.3〜5.0であるイソフエリチン
は特に面白そうである。アルパート（Alpert）
等の「Carcino−Foetal Human Liver
Ferritins」（Nature、242、194（３月16日、
1973））を参照されたい。 α−２−Ｈ−グロブリンは胎児の肝臓内に主に
発見される酸性イソフエリチンであり、１種のオ
ンコフイータルアンテイジエンであるが、肝臓腫
瘍、奇形腫等の種々の悪性疾病を有する成人内に
も発見される。免疫学的には、正常なヒトフエリ
チンからまだ区別されていないイソフエリチンが
多い。しかしながら、免疫学的な抗体産生技法を
使用すれば上記α−２−Ｈ−グロブリン、5.1〜
5.6の等電点を有するイソフエリチン等の特定の
イソフエリチンに対する抗体は産生することがで
きると考えられる。 上述のような当然起きる生理学的現象、すなわ
ち、かなり広い濃度範囲に亘つて正常の血清中に
フエリチンが存在ししかも現在のところ異なるイ
ソフエリチンを免疫学的に区別することができ
ず、さらに非悪性の貧血のような非悪性の疾病状
態にあると血清フエリチンレベルが上昇すること
を考え合わせると血清フエリチンレベルを診断の
基準とすることは困難である。ある研究で悪性の
疾病にかかつている患者をテストしたところその
約70％の血清フエリチンレベルが上昇していた。
さらに、初期の乳がん患者においては血清フエリ
チンレベルは正常な血清のフエリチンレベルとオ
ーバーラツプしているが、再発性あるいは転移性
の乳がんにかかつている女性は血清フエリチンレ
ベルが極めて高いという報告もある。ヤコブ
（Jacobs）等の「Serum Ferritin Concentration
in Ｅ arly Breast Cancer」（Br.J.Cancer、34
(3)、286（1976））、「Serum Ferritin
Concentration in Untreated Hodgkin′s
Disease」（同書34(3)、162（1976）、サーシノン
（Sarcinone）等の「Increased Ferritin
Synthesis and Release by Hodgkin′s Disease
in Peripheral Blood Lymphocytes」（Int.J.
Cancer、20、339（1977））および新津等の
「Radioimmunoassay of Serum Ferritin in
Patients with Malignancy」（Ann.N.Y.Acad.
Sci、259、450（1975））を参照されたい。 モロツ等の研究の一部を前述したが、モロツ等
はさらに、フエリチン蛋白成分がホジキン氏リン
パ様組織腫においてＴリンパ球の遮断物質として
作用し、それによつてそのような細胞がヒツジ赤
血球と自発的にロゼツトを形成するのを抑えるこ
とを発見した。モロツ等の「Ferritin on the
Surface of Lymphocytes in Hodgkin′s
Disease Patients−ａ Possible Blocking
Substance Removed by Levamisole」（Clin.
Exp.Immunol.、29、30（1977））を参照された
い。これによつて乳がんの徴候としてのフエリチ
ンを担うリンパ球を前述の細胞傷害テストによつ
て定量しようとする研究が導かれたのかも知れな
い。この細胞傷害テストの著しい欠点の１つは患
者の細胞に使用された各試薬の効果を別々に評価
しなければならないということである。 本発明のフエリチンを担うリンパ球の検出定量
方法は迅速でかつ侵入性がない。本発明のテスト
方法はオンコフイータルアンテイジエンの検出に
実験的に使用できるだけでなく、乳がん等のガン
の発見および治療効果を評価するのに使用するこ
とができる。 次に本発明に使用される試薬について説明す
る。 (1) 標識した抗ヒトフエリチン抗体 以下に述べる実験において使用されたフエリ
チン抗体は単特異的ヒトフエリチン抗体であ
る。より特異性の強い抗体、すなわちイソフエ
リチン特異的抗体も、以下に述べる標識したヒ
トフエリチン抗体の調製方法において正常なヒ
トフエリチンの替りに少なくとも１種のイソフ
エリチンすなわち等電的に決定された範囲のイ
ソフエリチンで置換することによつて調製する
ことができる。 標準的な免疫学的な方法を用いてラビツトと
ヒトフエリチンで免疫する。次のような親和性
精製方法によつて単特異的抗体を産生すること
ができる。等価の方法は当業者には容易に分か
るであろう。 粒子サイズ200〜400メツシユのアリルアミン
の制御孔（1350Å）ガラスをグルタルアルデヒ
ド（ガラス１ｇ当たり５ml）で活性化する。そ
のガラスを洗つて未反応のグルタルアルデヒド
を除去した後、ガラス１ｇ当たり１mgのヒトフ
エリチンをその活性化したガラスと室温で約２
時間静かに混合する。次に1Mの塩化ナトリウ
ムと0.1Mのグリシンで続けて洗い、さらに
0.1Mのリン酸塩緩衝液で３〜５回洗う。その
アリルアミンガラスは公知の方法によつて容易
に調製することができる。例えば「Weetall、
Science、166、615（1969）」を参照されたい。 次にそのフエリチンの結合したガラスをその
ガラス１ｇ当たり約１mlのフエリチン抗血清と
静かに混合する。22℃で一晩培養した後0.1M
の炭酸ナトリウム、0.15Mの塩化ナトリウム
（PH8.0）、0.1Mの酢酸ナトリウムおよび0.15M
の塩化ナトリウム（PH5.0）で続けて洗い、さ
らに1Mの塩酸でPH4.4に調節した蒸留水で２度
洗う。PH2.2に調節した蒸留水で単特異的抗体
を溶出させる。そのスラリーを0.3Mのリン酸
ナトリウム内に過し、その液を限外過に
よつて濃縮する。抗体は0.02％のアジ化物を含
む0.1Mリン酸ナトリウム溶液内に貯蔵するこ
とができる。その抗体は放射活性標識、酵素標
識、螢光標識等従来のどのような標識とも結合
させることができるが、ここではこの単特異的
ヒトフエリチン抗体はNaI125によつて放射活性
標識した。 (2) フエリチン陽性単核細胞 この試薬は上記(1)の試薬の安定性をモニター
し、本発明の方法の有効性を確認するために陽
性の定性対照として使用される。 この試薬を調製するのに使用される単核細胞
としては、自然のヒトリンパ球では起りがちな
フエリチンレベルの変動を避けるために培養増
殖したリンパ球を使用するのが普通である。こ
こでは、急性リンパ母細胞性白血病細胞
（CCL−119、ATCC）を使用したが、ネズミ
リンパ球（CCL−86またはCCL−126ライン）
等の他の培養されたリンパ球を使用することが
できるし、また適切な篩分けができれば正常な
実験材料の末梢血液リンパ球でも使用すること
ができる。このような単核細胞はすなわち末梢
血液単核タイプの細胞である。このような細胞
は天然の末梢血液単核細胞と似た表面膜特性を
示しさえすれば、天然の末梢血液単核細胞であ
る必要はない。 この実験では、その陽性定性対照試薬細胞は
10％の牛の胎児の血清（FCS、Grand Island
Biological Co.（ニユーヨーク州グランドアイ
ランド）製）で補足したRPMI−1640培養基
（同上）内で増殖した急性リンパ母細胞性白血
病細胞（CCL−119）を使用して調製した。こ
の細胞は撹拌培養法を使用した連続培養によつ
て増殖させることができ、大量生産に適してい
る。そのCCL−119を200〜300xｇ15分間遠心
沈澱させて採集し、リン酸緩衝食塩水（PBS、
0.01Mリン酸塩、0.15M塩化ナトリウム、PH
7.4）で２度洗つた。その細胞を２〜３×107
個／mlとなるようにPBS内で再構成した。充
分な量のグルタルアルデヒドの25％（ｗ／ｗ）
溶液を加えて最終的なグルタルアルデヒド濃度
が約１％となるようにした。この濃度より高い
密度で活性化すると広範囲に亘る細胞凝集が起
きる。その細胞を22℃で30分間連続的にゆすり
ながら培養した後、遠心沈澱によつて採集して
洗つた。精製したヒトフエリチン（カリフオル
ニア州サンルースオビスポのJBL Chemical
Company製）をPBSで希釈し、200〜300μｇ／
mlの濃度とし、その細胞ペレツトに充分加えて
細胞濃度が２〜３×107個／mlとなるようにし
た。 その細胞22℃で30分間ゆすりながら培養し、
さらに16〜18時間４℃で培養した。その細胞を
前述のようにして洗い、１％の牛の血清アルブ
ミン（BSA）と0.2％のアジ化ナトリウムを含
むPBS内に懸濁させた。誘導された細胞の最
初の集団から平均回収率は40〜50％であつた。
この細胞を４℃で保存し、40日間にI125で標識
したヒトフエリチン抗体の特異的結合によつて
評価したところ活性の減少は10％のみであつ
た。 ラビツトの抗ヒトフエリチン血清と、フルオ
レセインに結合させた山羊の抗ラビツト血清を
使用して間接免疫螢光法によつてその細胞を評
価したところ43％の細胞が螢光を示した。これ
に対して、フエリチンに結合されていない
CCL−119すなわち牛の血清アルブミンに結合
されたCCL−119は螢光を示さなかつた。この
陽性定性対照細胞は正常なラビツト血清ととも
に培養したときには螢光を示さなかつた。また
この細胞上のフエリチンの量は約25〜40nｇ／
2.5×105個であつた。 (3) 精製したヒトフエリチン この試薬は市販されており、半定量的テスト
モードおよび定量的テストモードの両方に使用
される。半定量的モードでは特異的標識抗体結
合を評価するために、患者のリンパ球上に存在
するフエリチンへの標識したフエリチン抗体の
結合を詰抗的に遮断するように高濃度で使用さ
れる。また定量的モードではリンパ球に結合し
たフエリチンの絶対値を決定するための標準曲
線を得るためにイムノラジオメトリツクアツセ
イ（IRMA）との関連において種々の濃度で使
用される。 (4) 固定されたヒトフエリチン抗血清 この試薬はリンパ球に結合したフエリチンの
値を外挿法によつて推定するための標準曲線を
得るために上記試薬１および３との関連におい
て使用され、制御孔ガラスのような基体に共有
結合したヒトフエリチン抗血清からなつてい
る。 以下に述べるテストではこの試薬は粒子サイ
ズ1μ、気孔サイズ550Åのアリルアミンの制御
孔ガラスを使用して調製した。 このガラスをまず2Nの塩酸と亜硝酸ナトリ
ウム０℃で活性化した。20分後にそのガラスを
蒸留水で充分洗つた。次にそのガラス１ｇ当た
り１mlの保存ヒトフエリチン抗血清を加えた。
PHを8.4に調整し、４℃で一晩反応させた。そ
の固定された抗体をPH7.0の0.1Mリン酸緩衝液
内で充分洗い、0.1％のBSAを含むPH7.0の
0.01Mリン酸緩衝液内に最終濃度20mg（ガラ
ス）／mlで４℃で保存した。 以下本発明の方法を実施するための上記各試薬
を使用したテストモードについて詳細に説明す
る。一般に、上記試薬１、２、３（標識したヒト
フエリチン抗体、フエリチン陽性リンパ球および
精製したヒトフエリチン）は半定量的測定を行な
うのに使用され、また４つ目の固定されたヒトフ
エリチン抗血清を含む全ての上記試薬はリンパ球
に結合したフエリチンの定量に使用される。 定量的テスト、半定量的テストのいずれが必要
であるにしても、テスト成分は患者の末梢血液単
核細胞、特にリンパ球のサンプルである。注意深
く分析すれば患者の全ての白血球のサンプル（例
えば炎症性痂皮）も使用できると思われるが、こ
こでは第１のステツプとして末梢血液単核細胞の
他の血液成分から分離する方が良い。その末梢血
液単核細胞と他の血液成分との分離は公知の方法
によつて行なうことができる。例えば単核細胞セ
パレーターを使用すればよい。ルーダラー
（Luderer）等の「Rapid、Quantitatine Human
Lymphocyte Separation and Purification in
ａ Closed System」（Molecular Immunol.、
16、621（1979）あるいはボヤム（Boyum）の
Ficoll−Hypaque法（Scand.J.Immunol.、５（増
刊５）、９（1976））を参照されたい。遠心沈澱等
の公知の方法による洗浄、および血球計算器乃至
自動血球カウンターによる計数によつて細胞数を
規格化することで本発明の方法の準備段階が終了
する。必らず必要なものではないが、末梢単核細
胞のリンパ球フラクシヨンを公知の方法で得てテ
ストサンプルとして使用することもできる。 半定量的モードにおいては、前記リンパ球の一
定量を標識した抗ヒトフエリチン抗体の一定量と
混合する。このとき一定量の緩衝液も混合するの
が望ましい。別に、その患者のリンパ球、標識し
た抗ヒトフエリチン抗体および一定量の精製した
ヒトフエリチン（これは緩衝液の替りにもなる。）
混合して通常の詰抗的テスト結合参照とする。こ
れはヒトフエリチンが標識した抗体のテスト細胞
へのどのような特異的結合も詰抗的にペレツトを
計数する。特異的結合として報告される半定量の
結果は、「加えた過剰のヒトフエリチン」の非存
在下でのcpm（１分間当りの計数）結合を、測定
系に加えられたI125で標識した抗体の総量のcpm
から加えられた過剰のヒトフエリチンの存在下で
の細胞へのcpm結合を引いたもので割つた値から
過剰の可溶性ヒトフエリチンの存在下での細胞へ
のcpm（１分間当りの計数）結合を引くことによ
つて決定される。その「加えられた過剰のヒトフ
エリチン」とは標識した抗体の細胞への特異的結
合を完全に遮断するように測定系に加えられた可
溶性フエリチンの総量として定義される。 一般に、特異的結合は少なくとも２つの異なる
細胞濃度で評価される。結果は特定細胞数当りの
末梢血液リンパ球へのcpmあるいは結合率で報告
される。遮断するような高濃度で加えられるから
である。第２段階は（第２段階といつててももち
ろん上記テストの前でも後でもまた同時にでも差
し支えないが）上記２つの操作をテスト細胞の替
りにフエリチン陽性リンパ球を使用して行ない、
測定系の機能性と標識した抗体の安定性をモニタ
ーすることである。それ以上のチエツクが必要で
ある場合には任意のステツプとして、フエリチン
陽性リンパ球の替りに対照陰性細胞を使用して第
２段階と同じ操作をしてもよい。その対照陰性細
胞としては牛の血清アルブミンを担うCCL−119
リンパ球のような、標識した抗体と反応しない蛋
白を担うものを使用する。 適当な培養期間の後、前記細胞を洗つて遠心分
離する。上澄を回収してペレツト化した細胞の結
合標識を評価する。I125で標識した抗体を使用す
る場合にはγ線スペクトロメーター内で定量的測
定においては患者のリンパ球と定性対照リンパ球
の測定を上述と同様にして行ない、さらにヒトフ
エリチンを量を増しながら一定濃度の固定された
抗ヒトフエリチン抗血清（IMA）とともに培養
して標準曲線を作成する。この系ではIMAをま
ず緩衝液のみと混合するか、あるいは種々の濃度
のヒトフエリチンと混合する。テスト細胞を分析
するのに使用したのと同じ最終的な時間間隔まで
一定時間間隔で標識した抗体を加えて培養を続け
る。そのIMAを緩衝液で洗つて、遠心沈澱によ
つてペレツト化する。上澄をデカントして、ペレ
ツトの放射線活性を評価する。各ヒトフエリチン
濃度について特異的結合を、緩衝液のみが存在す
るときのIMAへのcpm結合を、次第に量を増し
た「加えたヒトフエリチン」における加えた抗体
の総cpmとcpm結合の両方から引く以外は上記と
同様にして決定する。片対数方眼紙の直線目盛に
特異的結合をとり、対数目盛に加えたフエリチン
の量をとつてプロツトして標準曲線を作成する。
患者の細胞による特異的結合を対数目盛に外挿す
ることによつて患者の末梢血液リンパ球に結合し
たフエリチンの定量がなされる。今のところで
は、その標準曲線は患者のテストに使用したのと
同じヒトフエリチンを使用して患者のテストの都
度作成する方が良いと思われる。規格化と貯蔵寿
命すなわち安定性が改良されれば、標準曲線の作
成はそんなに頻繁に行なわなくてよくなるであろ
う。もちろん、アイソトープを使用する場合には
その都度標準曲線を作成しなければならない。 もちろん上記各モードにおいて、試薬とテスト
結果を確認するためフエリチン陽性リンパ球を使
用した前記第２段階の測定で得られた結果を使用
して同じ計算がなされる。 後に詳細に説明するように、ここで説明したテ
スト方法はガンの早期発見および治療効果をモニ
ターする有効な手段として使用することができ
る。正常な健康人の場合には、精製したヒトフエ
リチンが存在する場合と存在しない場合の結合標
識の測定値には殆ど差がないか、あつても小さい
が、初期の（病初以前の）ガンあるいは進行した
ガンの患者の末梢血液リンパ球の場合にはヒトフ
エリチンが存在しない系内の結合標識が増加す
る。 次に、前述した試薬を使用した測定方法を例を
挙げて更に詳細に説明する。 凝血を抑止された血液見本から前述のボヤムの
方法によつてリンパ球を分離した。このときリン
酸塩で緩衝した生理的食塩水でその見本を１：２
で希釈し、その血液をフイコル−ハイパツク
（Ficoll−Hypaque）溶液上に層をなすように静
かに注いだ。次に400×ｇで30分間遠心沈澱させ
たところリンパ球が明確な界面を持つて帯状をな
した。それをパスツールピペツトで取り出し、緩
やかな遠心沈澱（200×ｇ、10分間）によつて
PBS内で２度洗つた。さらに、それを１×107
個／mlの濃度で0.1％のBSAと0.02％のアジ化ナ
トリウムを含むPBS乃至RPMI培養基内に懸濁さ
せた。対照陽性細胞（フエリチンを担うリンパ
球）もこの濃度で懸濁させた。 各細胞濃度においてテストする各見本に４本の
12×75mmのプラスチツク試験管を割り当てた。４
℃の水浴の中で反応を開始させた。各試験管に
100μの細胞を加えた。各組の最初の２本の試
験管にはさらに100μのPBS−BSA−アジ化物
溶液を加え、残りの２本の試験管には10〜50μ
ｇ／mlの濃度で（過剰のHF）PBS−BSA−アジ
化物溶液に加えられたヒトフエリチン100μを
注いだ。この濃度は３×106個の陽性対照細胞へ
のI125標識の抗体の特異的結合を遮断するのに充
分であつた。100μのI125標識抗体（50000〜
100000opm）を加えた後、その試験管をシエーカ
ー浴に移して４℃で一晩（16〜18時間）培養して
結合を平衡に達しさせた。培養の後、３mlの
PBSで細胞を洗い、3000rpmで15分間遠心沈澱さ
せた。上澄をアスピレートして、細胞ペレツトの
結合放射活性を計数した。このようにして得た特
異的結合の反復試験によつて得た値を平均した。 ヒトフエリチンのほぼ完全な結合遮断作用によ
つてテスト細胞に結合したフエリチンに対する標
識フエリチン抗体の特異性が確立されるととも
に、細胞表面への非特異的吸着が低レベルに保た
れる。 次に本発明の測定方法の極めて高い感度につい
て説明する。 リンパ球上のフエリチンを測定し得る感度の下
限をヒトフエリチンの濃度を増しながら、一定濃
度の放射線標識したフエリチン抗体と2.5×105の
陽性対照細胞（明確な量のフエリチンを担つた
CCL−119）を使用して詰抗結合によつて決定し
た。検出の下限は２〜2.5×19-9ｇ、あるいは4.4
〜5.5×10-6ナノモルであることが分かつた。こ
の下限は放射線標識したフエリチン抗体の陽性対
照細胞への特異的結合を再現可能に禁止し得るヒ
トフエリチンの最少量に基づくものである。 陰性細胞の集団内のフエリチンを担う細胞の検
出可能な最少の数を最終細胞数2.5×105個となる
ように陰性細胞と混合した対照陽性細胞を使用し
て研究した。この細胞密度において、12500個の
細胞が５％特異的結合の識別レベルで検出するこ
とができた。前記定量データから見ると、これは
検出の下限であるフエリチンの絶対値約2nｇに
対応している。したがつて細胞数１×106の集団
の場合には1.25％の陽性細胞が検出し得ると考え
られる。文献によればリンパ球の総数のうち16.6
％がフエリチン陽性細胞であるとすると乳がんの
徴候があるとされているから（モロツ等の
「Cancer Immunol.Immunother.」、３、101
（1977））これは極めて素晴らしい値である。 次に定量的な測定において標準曲線を作成する
一般的な方法を説明する。 複数の全く同じ12×75mmの試験管に保存IMA
（ガラス20mg／ml）から取り出してPBS−BSA−
アジ化物溶液で予め１：10で希釈したヒトフエリ
チン抗血清IMA100μを加える。各セツトの試
験管に100μの緩衝液を単独で加えるか、ヒト
フエリチンを緩衝液で種々の量に希釈したものを
加える。この測定は４℃の水浴内で開始する。次
にその試験管をシエーカー浴内で30分間22℃に保
つ。この時間の終りに放射線標識したフエリチン
抗体（100μ）IMAを入つた各試験管に加え、
更に30分間保温を続ける。その試験管を陽性対照
見本と同じ方法で洗つて遠心沈澱させる。対照見
本の場合とは異なり、放射線標識した抗体は測定
の開始時には加えず30分後に加える。これによつ
て標識した抗血清を加える前にヒトフエリチンが
IMA抗血清と平衡に達することができる。しか
しながら培養時間が適当であれば標識した抗体を
同時に加えることもできる。 種々の濃度に希釈した陽性対照細胞に対する特
異的結合を標準曲線から外挿することによつてフ
エリチン結合の絶対量を決定することができる。 第１表は本発明の半定量モードの測定方法によ
つて多数の患者をテストした結果を示すものであ
る。正確度および患者の種類は他の診断方法例え
ば生体組織検査によつて決定した。
【表】
第１表から明らかなように本発明のテストは非
悪性の患者を見分け、また治療効果を見るのに適
している。 第２表は放射線標識（I125）した抗ヒトフエリ
チン抗体を使用し４℃で16〜18時間培養して半定
量テストを行なつたときのフエリチン陽性リンパ
球の実際的な平均値を示すものである。この第２
表の値は少数の患者に基づくものではあるが悪性
の状態と非悪性の状態の間の相対値を示してい
る。 第２表 １ 正常な女性における結合は0.4〜4.5％の範囲
にあり、平均２％であつた。これに対して50才
を超えた女性の場合はその値が大きかつた。 ２ 乳漏症、繊維腫瘍、繊維腺腫を含む良性乳ガ
ン患者の場合は平均1.6％であつた。この値は
充分正常な範囲にある。 ３ 乳房切除術を受け再発の徴のない女性または
放射線療法および化学療法を受けている女性の
場合は治療を受けていない転移性の女性患者
（平均７％）に比べて結合が減少した（平均2.5
％）。 ４ 乳ガンの手術を受ける前の女性の場合は結合
レベルが高かつた（6.5〜10％）。 なお、当業者には明らかなように本発明には
種々のバリエーシヨンがある。例えばグルタルア
ルデヒドの替りにシアナミド、ジイソシオシアネ
ート等の種々のカツプリング剤を使用することが
できるし、ガラスの替りに澱粉、ゲルビーズ等の
他の運動抑制基体を使用することができるし、上
記以外の標準曲線作成方法も使用できるし、また
フエリチンの替りに、アルフア胎児蛋白、ガン胚
抗原、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合
抗原（pancreatic associated antigen）、フエト
サルフオグリコプロテイン
（fetosulfoglycoprotein）等も対応する適当な抗
体とともに使用することができる。
悪性の患者を見分け、また治療効果を見るのに適
している。 第２表は放射線標識（I125）した抗ヒトフエリ
チン抗体を使用し４℃で16〜18時間培養して半定
量テストを行なつたときのフエリチン陽性リンパ
球の実際的な平均値を示すものである。この第２
表の値は少数の患者に基づくものではあるが悪性
の状態と非悪性の状態の間の相対値を示してい
る。 第２表 １ 正常な女性における結合は0.4〜4.5％の範囲
にあり、平均２％であつた。これに対して50才
を超えた女性の場合はその値が大きかつた。 ２ 乳漏症、繊維腫瘍、繊維腺腫を含む良性乳ガ
ン患者の場合は平均1.6％であつた。この値は
充分正常な範囲にある。 ３ 乳房切除術を受け再発の徴のない女性または
放射線療法および化学療法を受けている女性の
場合は治療を受けていない転移性の女性患者
（平均７％）に比べて結合が減少した（平均2.5
％）。 ４ 乳ガンの手術を受ける前の女性の場合は結合
レベルが高かつた（6.5〜10％）。 なお、当業者には明らかなように本発明には
種々のバリエーシヨンがある。例えばグルタルア
ルデヒドの替りにシアナミド、ジイソシオシアネ
ート等の種々のカツプリング剤を使用することが
できるし、ガラスの替りに澱粉、ゲルビーズ等の
他の運動抑制基体を使用することができるし、上
記以外の標準曲線作成方法も使用できるし、また
フエリチンの替りに、アルフア胎児蛋白、ガン胚
抗原、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合
抗原（pancreatic associated antigen）、フエト
サルフオグリコプロテイン
（fetosulfoglycoprotein）等も対応する適当な抗
体とともに使用することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルアン
テイジエンを検出する方法において、 白血球サンプル内に含まれる末梢血液単核細胞
の一定量を前記アンテイジエンに対する標識した
オンコフイータル抗体の一定量と混合し、前記細
胞に付着しなかつた前記抗体を除去し、前記細胞
に付着した前記抗体の相対量を前記標識を使用し
て決定する第１のテストを行なう工程、 前記末梢血液単核細胞の他の一定量を標識した
ヒトオンコフイータル抗体の一定量および詰抗的
に結合を禁止する量の前記オンコフイータルアン
テイジエンと混合し、前記細胞に付着しなかつた
前記抗体を除去し、その細胞に付着した前記抗体
の相対量を前記標識を使用して決定する第２のテ
ストを行なう工程、 前記第１、第２のテストによつて得られた値か
ら前記細胞によつて担われている前記アンテイジ
エンの相対量を決定する相対量決定工程、 前記末梢血液単核細胞の替りに既知の量の前記
オンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血液
単核タイプの細胞を使用して前記第１、第２のテ
ストの工程および相対量決定工程を行なう参照工
程、および 前記参照工程の結果から方法の妥当性および前
記標識した抗体試薬の有効性をチエツクするチエ
ツク工程、 からなることを特徴とする方法。 ２ 前記末梢血液単核細胞を前記白血球サンプル
から分離して使用することを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の方法。 ３ 前記オンコフイータルアンテイジエンがアル
フア胎児蛋白質、フエリチン、ガン胚抗原、ヒト
絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗原、
およびフエトサルフオグリコプロテインからなる
群から選択されることを特徴とする特許請求の範
囲第２項記載の方法。 ４ 前記オンコフイータルアンテイジエンがフエ
リチンであることを特徴とする特許請求の範囲第
３項記載の方法。 ５ 前記標識が放射活性標識、酵素標識および螢
光標識からなる群から選択されることを特徴とす
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ６ 前記末梢血液単核細胞がリンパ球であり、そ
のリンパ球を前記白血球サンプルから分離して使
用することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ７ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルアン
テイジエンを定量する方法において、 白血球サンプル内に含まれる末梢血液単核細胞
の一定量を前記アンテイジエンに対する標識した
オンコフイータル抗体の一定量と混合し、前記細
胞に付着しなかつた前記抗体を除去し、前記細胞
に付着した前記抗体の相対量を前記標識を使用し
て決定する第１のテストを行なう工程、 前記末梢血液単核細胞の他の一定量を標識した
ヒトオンコフイータル抗体の一定量および詰抗的
に結合を禁止する量の前記オンコフイータルアン
テイジエンと混合し、前記細胞に付着しなかつた
前記抗体を除去し、その細胞に付着した前記抗体
の相対量を前記標識を使用して決定する第２のテ
ストを行なう工程、 前記第１、第２のテストによつて得られた値か
ら前記細胞によつて担われている前記アンテイジ
エンの相対量を決定する相対量決定工程、 前記末梢血液単核細胞の替りに既知の量の前記
オンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血液
単核タイプの細胞を使用して前記第１、第２のテ
ストの工程および相対量決定工程を行なう参照工
程、 前記参照工程の結果から方法の妥当性および前
記標識した抗体試薬の有効性をチエツクするチエ
ツク工程、 前記アンテイジエンを所定の量の固定された抗
体および所定の量の標識した抗体と、量を次第に
増やしながら混合し、標準曲線を作成する標準曲
線作成工程、 前記標識を使用して各アンテイジエン濃度にお
ける特異的結合を決定する工程、および 前記相対量決定工程によつて得られた値を前記
標準曲線と比較してその値に対応したアンテイジ
エンの量を決定する工程、 からなることを特徴とする方法。 ８ 前記末梢血液単核細胞を前記白血球サンプル
から分離して使用することを特徴とする特許請求
の範囲第７項記載の方法。 ９ 前記オンコフイータルアンテイジエンがアル
フア胎児蛋白質、フエリチン、ガン胚抗原、ヒト
絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗原、
およびフエトサルフオグリコプロテインからなる
群から選択されることを特徴とする特許請求の範
囲第８項記載の方法。 １０ 前記オンコフイータルアンテイジエンがフ
エリチンであることを特徴とする特許請求の範囲
第９項記載の方法。 １１ 前記標識が放射活性標識、酵素標識および
螢光標識からなる群から選択されることを特徴と
する特許請求の範囲第８項記載の方法。 １２ 前記末梢血液単核細胞がリンパ球であり、
そのリンパ球を前記白血球サンプルから分離して
使用することを特徴とする特許請求の範囲第７項
記載の方法。 １３ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルア
ンテイジエンを検出するのに使用する装置におい
て、 前記オンコフイータルアンテイジエンに対する
標識したヒトオンコフイータル抗体からなる第１
の試薬、 前記オンコフイータルアンテイジエンからなる
第２の試薬、および 既知の量の前記オンコフイータルアンテイジエ
ンを担う末梢血液単核タイプの細胞からなる第３
の試薬、 を別々の試薬として備えており、白血球サンプル
の一定量が前記第１の試薬と混合され、該白血球
サンプルの他の一定量が前記第１および第２の試
薬と混合され、前記第３の試薬の一定量が前記第
１の試薬と混合され、前記第３の試薬の他の一定
量が前記第１および第２の試薬と混合され、次い
で、前記白血球サンプル中の末梢血液単核細胞に
より担われている前記アンテイジエンの相対量が
決定できるようになつていることを特徴とする装
置。 １４ 前記標識が放射活性標識、酵素標識、およ
び螢光標識からなる群から選択されることを特徴
とする特許請求の範囲第１３項記載の装置。 １５ 前記オンコフイータルアンテイジエンがア
ルフア胎児蛋白質、フエリチン、ガン胚抗原、ヒ
ト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗
原、およびフエトサルフオグリコプロテインから
なる群から選択されることを特徴とする特許請求
の範囲第１３項記載の装置。 １６ 前記末梢血液単核タイプの細胞が前記アン
テイジエンを担う培養されたリンパ球であること
を特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の装
置。 １７ 前記オンコフイータルアンテイジエンがフ
エリチンであり、前記末梢血液単核タイプの細胞
がフエリチンを担う培養されたリンパ球であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１３項記載の装
置。 １８ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルア
ンテイジエンを検出するのに使用する装置におい
て、 前記オンコフイータルアンテイジエンに対する
標識したヒトオンコフイータル抗体からなる第１
の試薬、 前記オンコフイータルアンテイジエンからなる
第２の試薬、および 既知の量の前記オンコフイータルアンテイジエ
ンを担う末梢血液単核タイプの細胞、および 基体上に固定された前記オンコフイータルアン
テイジエンに対するヒトオンコフイータル抗体か
らなる第４の試薬、 を別々の試薬として備えており、白血球サンプル
の一定量が前記第１の試薬と混合され、該白血球
サンプルの他の一定量が前記第１および第２の試
薬と混合され、前記第３の試薬の一定量が前記第
１の試薬と混合され、前記第３の試薬の他の一定
量が前記第１および第２の試薬と混合され、次い
で、前記白血球サンプル中の末梢血液単核細胞に
より担われている前記アンテイジエンの相対量が
決定され、前記第２の試薬を増加させながら所定
量の前記第１および第４の試薬と混合することに
よつて標準曲線が作成され、前記決定されたアン
テイジエンの相対量が前記標準曲線と比較できる
ようになつていることを特徴とする装置。 １９ 前記標識が放射活性標識、酵素標識、およ
び螢光標識からなる群から選択されることを特徴
とする特許請求の範囲第１８項記載の装置。 ２０ 前記オンコフイータルアンテイジエンがア
ルフア胎児蛋白質、フエリチン、ガン胚抗原、ヒ
ト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗
原、およびフエトサルフオグリコプロテインから
なる群から選択されることを特徴とする特許請求
の範囲第１８項記載の装置。 ２１ 前記末梢血液単核タイプの細胞が前記アン
テイジエンを担う培養されたリンパ球であること
を特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の装
置。 ２２ 前記オンコフイータルアンテイジエンがフ
エリチンであり、前記末梢血液単核タイプの細胞
がフエリチンを担う培養されたリンパ球であるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１８項記載の装
置。 ２３ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルア
ンテイジエンを検出するのに使用する方法におい
て、 白血球サンプル内に含まれる末梢血液単核細胞
の一定量を前記アンテイジエンに対する標識した
オンコフイータル抗体の一定量と混合し、前記細
胞に付着しなかつた前記抗体を除去し、前記細胞
に付着した前記抗体の相対量を前記標識を使用し
て決定する第１のテストを行なう工程、 前記末梢血液単核細胞の他の一定量を標識した
ヒトオンコフイータル抗体の一定量および詰抗的
に結合を禁止する量の前記オンコフイータルアン
テイジエンと混合し、前記細胞に付着しなかつた
前記抗体を除去し、その細胞に付着した前記抗体
の相対量を前記標識を使用して決定する第２のテ
ストを行なう工程、 前記第１、第２のテストによつて得られた値か
ら前記細胞によつて担われている前記アンテイジ
エンの相対量を決定する相対量決定工程、 前記末梢血液単核細胞の替りに既知の量の前記
オンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血液
単核タイプの細胞を使用して前記第１、第２のテ
ストの工程および相対量決定工程を行なう参照工
程、 前記参照工程の結果から方法の妥当性および前
記前記標識した抗体試薬の有効性をチエツクする
チエツク工程、および 前記末梢血液単核タイプの細胞の替りに前記オ
ンコフイータル抗体と反応しないことが知られて
いる蛋白物質を担う細胞を使用して前記第１のテ
ストの工程、第２のテストの工程、相対量決定工
程、参照工程、およびチエツク工程を繰り返す工
程、 からなることを特徴とする方法。 ２４ 末梢血液単核細胞上のオンコフイータルア
ンテイジエンを検出するのに使用する方法におい
て、 白血球サンプル内に含まれる末梢血液単核細胞
の一定量を前記アンテイジエンに対する標識した
オンコフイータル抗体の一定量と混合し、前記細
胞に付着しなかつた前記抗体を除去し、前記細胞
に付着した前記抗体の相対量を前記標識を使用し
て決定する第１のテストを行なう工程、 前記末梢血液単核細胞の他の一定量を標識した
ヒトオンコフイータル抗体の一定量および詰抗的
に結合を禁止する量の前記オンコフイータルアン
テイジエンと混合し、前記細胞に付着しなかつた
前記抗体を除去し、その細胞に付着した前記抗体
の相対量を前記標識を使用して決定する第２のテ
ストを行なう工程、 前記第１、第２のテストによつて得られた値か
ら前記細胞によつて担われている前記アンテイジ
エンの相対量を決定する相対量決定工程、 前記末梢血液単核細胞の替りに既知の量の前記
オンコフイータルアンテイジエンを担う末梢血液
単核タイプの細胞を使用して前記第１、第２のテ
ストの工程および相対量決定工程を行なう参照工
程、 前記参照工程の結果から方法の妥当性および前
記前記標識した抗体試薬の有効性をチエツクする
チエツク工程、 前記アンテイジエンを所定の量の固定された抗
体および所定の量の標識した抗体と、量を次第に
増やしながら混合し、標準曲線を作成する標準曲
線作成工程、 前記標識を使用して各アンテイジエン濃度にお
ける特異的結合を決定する工程、および 前記相対量決定工程によつて得られた値を前記
標準曲線と比較してその値に対応したアンテイジ
エンの量を決定する工程、 前記末梢血液単核タイプの細胞の替りに前記オ
ンコフイータル抗体と反応しないことが知られて
いる蛋白物質を担う細胞を使用して前記第１のテ
ストの工程、第２のテストの工程、相対量決定工
程、参照工程、チエツク工程、標準曲線作成工程
および前記特異的結合を決定する工程を繰り返す
工程、 からなることを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14792880A | 1980-05-08 | 1980-05-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS576364A JPS576364A (en) | 1982-01-13 |
| JPH0121909B2 true JPH0121909B2 (ja) | 1989-04-24 |
Family
ID=22523493
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6924681A Granted JPS576364A (en) | 1980-05-08 | 1981-05-08 | Immunologic inspection of oncofetal antigent and diagnostic method and kit utilizing thereof |
Country Status (5)
| Country | Link |
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