JPH0121959B2

JPH0121959B2 -

Info

Publication number: JPH0121959B2
Application number: JP5207880A
Authority: JP
Inventors: Shuzo Sakai; Mikihiko Yoshida
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1980-04-19
Filing date: 1980-04-19
Publication date: 1989-04-24
Also published as: JPS56147801A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規プルラン誘導体であるα−グリ
コシルプルラン並びにその製造方法及び用途に関
するものである。

プルランは、B.J.CatleyによつてFEBS
LETTERS Vol.10、190〜193（1970年）に報告
されているように、オーレオバシデイウム・プル
ランス（Aureobasidium pullulans）によつて生
産されるグルカンであつて、その構造は、若干の
マルトテトラオース部分も存在するが主としてマ
ルトトリオースが両端でα−1.6結合を繰り返し
たポリマルトトリオースであつて、一般式で表わされる線状高分子である。

このプルランは、現在食品工業などに利用され
ているが、本発明者らは、プルランのより広範囲
な用途発見をめざして、生化学手法によりプルラ
ン誘導体の検索を続けてきた。その結果、新規プ
ルラン誘導体であるα−グリコシルプルランを見
いだし、本発明を完成した。

このプルラン誘導体は、次のような性質から新
規物質α−グリコシルプルランであることが認め
られる。

均一性：電気泳動で均一元素分析：実測値Ｃ＝44.1％、Ｈ＝6.18％、Ｎ
＜0.1％、灰分＜0.01％計算値Ｃ＝44.4％、Ｈ＝6.17％比旋光度：〔α〕²⁵ _D＋180゜〜230゜（ｌ＝１、ｃ＝4.0
、
H₂O）溶解性：水、0.1N−NaOH、90％蟻酸、ホルム
アミドおよびジメチルスルホキシドには易溶。

メタノール、エタノール、アセトン、クロロ
ホルムおよび酢酸エチルには不溶。

物性：白色、無味、無臭、水溶液は中性乃至微酸
性呈色反応：アントロン−硫酸反応で緑色システイン−硫酸反応で黄色ヨード反応は陰性または陽性紫外線吸収スペクトル：２％水溶液を使用して
220〜340nｍで測定したが特徴ある吸収は見ら
れない。

赤外線吸収スペクトル：第１図に示す通り構成糖：1N−硫酸、または1N−塩酸で加水分解
して得た糖は、ペーパークロマトグラフイー、
ガスクロマトグラフイー、液体クロマトグラフ
イーおよびグルコースオキシダーゼ・パーオキ
シダーゼ法による分析結果からＤ−グルコース
であることが判明した。

さらに、本プルラン誘導体を基質としてβ−ア
ミラーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどの
酵素を作用させることによつて、プルランの場合
に見られない次のような現象を見いだした。

(1) β−アミラーゼ（E.C.3.2.1.2）による分解プルランはβ−アミラーゼにより分解を受け
ないのに対して、本発明のプルラン誘導体はβ
−アミラーゼにより容易に分解され１〜50％の
マルトースを生成すると同時に未分解高分子物
を生成することがペーパークロマトグラフイー
による分析の結果判つた。

(2) プルラナーゼ（E.C.3.2.1.41）による分解プルランはプルラナーゼにより容易に分解を
受けて90％以上のマルトトリオースと若干のマ
ルトテトラオースを生成するのに対して、本発
明のプルラン誘導体はプルラナーゼにより容易
に分解を受けて90％未満のマルトトリオースを
生成する以外に、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオースなどのα−
1.4−グルコシド結合からなるマルトオリゴ糖
を生成することがペーパークロマトグラフイー
による分析の結果判つた。

(3) イソアミラーゼ（E.C.3.2.1.68）による分解プルランはイソアミラーゼにより極めて分解
を受けにくいのに対して、本発明のプルラン誘
導体は容易に分解されることがソモギー・ネル
ソン法による還元力の測定の結果判つた。この
分解生成物をペーパークロマトグラフイーで分
析したところ、プルラナーゼによる分解の場合
と同様にα−1.4−グルコシド結合からなるマ
ルトオリゴ糖混合物であつた。

以上の(1)(2)(3)の結果を総合的に判断すると、本
発明のプルラン誘導体は、プルランの繰り返し単
位であるマルトトリオースの非還元性末端側にＣ
−４がもとのままである部分と、新らたにグルコ
ース残基が１以上、通常１〜10の整数個α−1.4
−グルコシド結合している部分とを有しているα
−グリコシルプルランであることが理解される。

即ち、本発明のプルラン誘導体は、一般式（式中、m₁、n₁は０または１以上の整数、m₂、
n₂は１以上の整数を示し、n₁とn₂の和は20乃至
4000である。）で表わされるα−グリコシルプルランである。

本発明のα−グリコシルプルランは、例えばプ
ルランおよび澱粉質を含有する水溶液にシクロデ
キストリングルカノトランスフエラーゼ（E.
C.2.4.1.19）を作用させれば容易に生成される。

本発明のα−グリコシルプルランの平均分子量
は、通常約10000〜3000000であつて、この分子量
は原料として使用するプルランの平均分子量を調
節することにより調整することができる。また、
低分子のα−グリコシルプルランは、高分子のα
−グリコシルプルランを分解することによつても
調製することができる。

次に、本発明のα−グリコシルプルランの製造
方法について述べる。

基質としてのプルランは、平均分子量約10000
〜2000000のものが適しており、また澱粉質とし
ては、糊化澱粉、液化澱粉、ソリユブルスター
チ、D.E.1〜70の澱粉部分分解物、シクロデキス
トリンなどが適している。これらの基質濃度は、
約１〜20％のプルランおよび約１〜50％の澱粉質
が適している。

プルランと澱粉質との比は、約１：0.1〜１：
50の範囲が適している。

また、プルランからα−グリコシルプルランへ
の交換に使用される酵素としては、シクロデキス
トリングルカノトランスフエラーゼがあり、例
えば特開昭47−20373号公報、特開昭50−63189号
公報、特開昭50−88290号公報およびHans
Bender、Arch.Microbiol.Vol.111、271〜282
（1977年）などに示されているバチルス・マセラ
ンス、バチルス・メガテリウム、バチルス・サー
キユランス、バチルス・ポリミキサ、バチルス・
ステアロサーモフイラスなどのバチルス属、クレ
ブシーラ・ニユーモニアエなどのクレーブシーラ
属などの細菌によつて生産されるシクロデキスト
リングルカノトランスフエラーゼが好適であ
る。

反応条件としては、この酵素が作用してα−グ
リコシルプルランが生成すればよく、通常PH3.0
〜10.0、温度20〜80℃の範囲から選ばれる。反応
時間は、酵素の使用量と密接に関係しているが、
通常澱粉質グラム当り約0.1〜100単位の酵素が使
用され、0.1〜100時間程度反応させればよい。

本発明で言うシクロデキストリングルカノト
ランスフエラーゼの活性１単位とは、PH5.5、
0.02Mの酢酸緩衝液および0.002Mの塩化カルシ
ウムを含む0.3w／ｖ％のソリユブルスターチ溶
液５mlに適当に希釈した酵素液（ml当り約１〜２
単位）0.2mlを加え、40℃で10分間反応させた後、
その反応液0.5mlをとり、0.02N−硫酸水溶液15ml
に混合して反応を停止させ、さらにこの反応停止
液に0.1Nヨウ化カリウム溶液0.2mlを加えて発色
させ、次いで660nｍにおける吸光度を測定して、
40℃で10分間反応させることによりソリユブルス
ターチ15mgのヨウ素呈色を完全に消失させる酵素
量を言う。

このようにして反応生成したα−グリコシルプ
ルランは、通常反応液を加熱して酵素を失活させ
た後過し、この液にメタノール、エタノー
ル、イソプロパノール、アセトンなどの親水性有
機溶媒を約20〜70v／ｖ％になるように加えて生
ずる沈澱として採取される。必要ならば、さらに
活性炭、イオン交換樹脂により脱色、脱塩して精
製し、続いて濃縮、乾燥、粉末化することにより
白色粉末として製造される。

このα−グリコシルプルランは、プルランと同
様に易水溶性、必老化性、可食性グルカンであつ
て、食品工業のみならず、各種成形物の主原料、
結合剤、接着剤などとして広く利用できる。

また、このα−グリコシルプルランは、プルラ
ナーゼ、イソアミラーゼなどによつて分解され、
グルコース、マルトースをほとんど含有せず、マ
ルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオースなどのα−1.4
−グルコシド結合のみからなるオリゴ糖混合物が
得られる。このオリゴ糖混合物は低粘度、低甘味
の特徴を有する糖質甘味料として好適である。ま
た、このオリゴ糖混合物は、グルコース、マルト
ースをほとんど含まないため難醗酵性糖質として
も利用でき、例えばパン、ビスケツトなどの製造
時に配合しても酵母によつてほとんど消費され
ず、これら製品中で弾性賦与剤、保湿剤、老化防
止剤などとして利用できる。

次に、本発明の実施例を述べる。

実施例１ α−グリコシルプルランの製造 (1‐1) シクロデキストリングルカノトランスフ
エラーゼの調製特開昭50−63189号公報に示されているバ
チルス・ステアロサーモフイラス（Bacillus
stearothermophilus）FERM−ＰNo.2222を、
ソリユブルスターチ2w／ｖ％、硝酸アンモ
ニウム1w／ｖ％、リン酸２カリウム0.1w／
ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩0.05w／ｖ
％、コーンステイープリカー0.5w／ｖ％、
炭酸カルシウム1w／ｖ％と水からなる殺菌
した液体培地10に植菌し、50℃で３日間通
気撹拌培養した。

得られた培養液を遠心分離して、その上清
を硫安0.7飽和で塩析し、シクロデキストリ
ングルカノトランスフエラーゼ（E.
C.2.4.1.19）の活性約80000単位を有する酵素
標品を得た。

(1‐2) プルランからのα−グリコシルプルランの
調製プルラン（平均分子量100000）100ｇとマ
ルトデキストリン（D.E.30）500ｇとを水
2000mlに溶解した後、これに（１−１）で調
製したシクロデキストリングルカノトラン
スフエラーゼ標品2000単位を加え、PH5.5、
温度60℃に保つて20時間反応させた。

この反応液を95℃に10分間保つて酵素を失
活させた後過し、その得られた液にメタ
ノール2000mlを加え、生ずる沈澱部を上清と
分離して採取した。

この採取した沈澱部を水1000mlに溶解し、
次いでメタノールを終末50v／ｖ％になるよ
うに加え生ずる沈澱部を採取する方法を４回
繰り返して精製し、減圧乾燥した後粉末化す
ることによりα−グリコシルプルランの白色
粉末約110ｇを得た。

本品の粘度は5w／ｗ％、30℃で6.1cpであ
つた。また、比旋光度は〔α〕²⁵ _D＋198゜（ｌ＝
１、ｃ＝５％）であつた。

このα−グリコシルプルランの5w／ｖ％
水溶液を平板上に均一に流し乾燥することに
より無色透明なフイルム状成形物を得た。こ
のα−グリコシルプルランによるフイルム状
成形物の生成は、包装用フイルム原料、コー
テイング剤としての用途を可能にするもので
ある。

なお、このα−グリコシルプルランの
2w／ｖ％水溶液を、ポリプロピレン製平板
上に均一に流し、風乾して得たフイルムの赤
外線吸収スペクトルによる測定結果は第１図
に示す通りである。

実施例２ α−グリコシルプルランのプルラナーゼによる
分解実施例１の方法で得たｏ−グリコシルプルラン
の5w／ｖ％水溶液に市販のプルラナーゼをα−
グリコシルプルランに対しグラム当り500単位を
加え、PH6.0、温度50℃で分解が終了するまで20
時間反応させた。

その反応液を90℃に10分間保つて酵素を失活さ
せた後過した。得られた液を常法に従い活性
炭にて脱色し、次いでイオン交換樹脂（Ｈ型およ
びOH型）で脱塩して精製し、減圧濃縮すること
により水分20％のシラツプ状甘味料を収率固形物
当り95％で得た。

このシラツプ状甘味料の糖組成をペーパークロ
マトグラフイーで分析したところマルトトリオー
ス49％、マルトテトラオース22％、マルトペンタ
オース12％、マルトヘキサオース７％、マルトヘ
プタオース以上のマルトオリゴ糖10％であつた。

また、このシラツプ状甘味料は、α−1.4−グ
ルコシド結合のみからなるマルトオリゴ糖混合物
であることから、各種飲食物製造用の低粘度、低
甘味を有するボデー付与剤として、また保湿剤、
老化防止剤、照付与剤などとして好適に利用でき
る。

さらに、このシラツプ状甘味料にはグルコー
ス、マルトースが含まれていないので、難醗酵性
糖質としても有利に利用できる。

実施例３ α−グリコシルプルランのイソアミラーゼによ
る分解実施例１の方法で得たα−グリコシルプルラン
の5w／ｖ％水溶液に市販のイソアミラーゼをα
−グリコシルプルランに対しグラム当り10000単
位を加え、PH4.0、温度50℃で分解が終了するま
で30時間反応させた。

その反応液を実施例２と同様に精製し、減圧濃
縮した後、噴霧乾燥して白色粉末状甘味料を収率
固形物当り約90％で得た。この粉末甘味料の糖組
成は実施例２で得たシラツプと同様であつた。

次に、α−グリコシルプルランとプルランとの
イソアミラーゼによる作用性の比較を行つた。即
ち、実施例１の方法で得たα−グリコシルプルラ
ンを0.05M酢酸緩衝液（PH3.6）に1.5w／ｖ％に
なるよう溶解した溶液６mlに、市販のイソアミラ
ーゼ2500単位で含有する水溶液0.2mlを加え、温
度40℃で反応させた。この反応液１mlずつを経時
的にサンプリングして、反応液中に生成するオリ
ゴ糖の還元力をソモジー・ネルソン法（520nmで
の吸光度の増加量を測定）で測定した。その結果
は、第２図に示すように、本発明のα−グリコシ
ルプルランは、プルランに比較しイソアミラーゼ
により極めて作用を受け易すく、イソアミラーゼ
活性測定用基質として好適に利用し得ることが判
つた。

【図面の簡単な説明】

図において、第１図はα−グリコシルプルラン
の赤外線吸収スペクトルを示すグラフ、第２図は
α−グリコシルプルランのイソアミラーゼによる
分解の容易さを示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１一般式（式中、m₁、n₁は０または１以上の整数、m₂、
n₂は１以上の整数を示し、n₁とn₂の和は20乃至
4000である。）で表わされるα−グリコシルプルラン。２プルラン及び澱粉質を含有する水溶液にシク
ロデキストリングルカノトランスフエラーゼ活性
を有する酵素標品を作用させて生成する一般式（式中、m₁、n₁は０または１以上の整数、m₂、
n₂は１以上の整数を示し、n₁とn₂の和は20乃至
4000である。）で表わされるα−グリコシルプルランを採取する
ことを特徴とするα−グリコシルプルランの製造
方法。