JPS5854798B2 - ３↓−Ｏ↓−α↓−Ｄ↓−グルコピラノシルマルト−スの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、主な繰り返し単位が（３） −Ｇｌｃ −（
１−”４ ） −Ｇｌｃ−（１→４ ） −Ｇｌｃ−（
１−”）（但し、Ｇｌｃはα−Ｄ−グルコビラノース残
基を示す。

以後同様にＧｌｃと略称する。）の構造を有している新
規なα−グルカン（エルシナン）にα−アミラーゼを作
用させて３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトース
を生威し、採取することを特徴とした３−０−α−Ｄ−
グルコピラノシルマルトースの製法に関するものである
。

従来、オリゴ糖はその結合様式Ｉこ応じて甘味剤、医薬
品、酵素の検定用基質、あるいは種々の薬品中間体など
の用途に大量に使用されてきた。

しかし、現在純度よく、か°つ効率的に製造する方法が
知られているオリゴ糖は限られており、例えば砂糖、乳
糖、マルトース、マルトトリオースなどにすぎなかった
。

特殊な結合様式を持つ３−０−α−Ｄ−グルコピラノシ
ルマルトースは、Ｓ、Ａ、Ｂａｒｋｅｒ らによってＪ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ５ｏ
ｃｉｅｔｙ（１９５７年）の第２４４８〜２４５４頁な
どに報告されているように、従来はアスペルギルスニガ
ー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ）から調製
されるニゲランに酸を加えて部分加水分解し、得られる
糖混合物から精製分離されていた。

この製造法では、原料のニゲランを大量に供給すること
が困難であるばかりでなく、ニゲランからの製品収率も
低いので、この３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマル
トースを大量に安価に供給することは極めて困難なこと
であった。

本発明者は、この３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマ
ルトースを大量に、効率よく製造する方法について鋭意
研究した。

その結果、主としてマルトトリオース残基が繰り返しα
−１，３結合することによって構成される直鎖状のα−
グルカン（エルシナン）に、酵素特にα−アミラーゼを
作用させることにより３−０−α−Ｄ−グルコピラノシ
ルマルトースが得られ、これを精製分離し採取すること
によって、容易に高収率に３−０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルマルトースを製造し得ることを見いだし本発明を
完成した。

なお、本明細書に記載する係は、特記したもの以外は重
量饅を示す。

本発明に用いられるα−グルカン（エルシナン）は、砂
糖、グルコース、マルトース、果糖、水飴等の糖類の１
種又は２種以上を含有する栄養培地に、エルシノエ（Ｅ
ｌｓｉｎｏｅ）属に属する微生物を植菌し、約２０〜３
０℃で３〜７日間培養して得られる粘性の高い培養液か
ら分離、回収されるα−グルカンで、発明者はこれをエ
ルシナンと命名した。

このエルシナンは、次のような性質から全く新しいα−
グルカンであることが認められる。

Ｏ均一性：超遠心法および電気泳動で均一Ｏ元素分析：
実測値 Ｃ＝ ４３．７％、Ｈ＝６．１６％、Ｎ＜０．
１係、灰分＜０．０１係 計算値 Ｃ＝４４．４係、Ｈ二６．１７％０比旋光度：
〔α）１）＋１７５〜２８０°（１＝１．ｃ二１．６．
０．５Ｎ−ＮａＯＨ） Ｏ溶解性：水、０． Ｉ Ｎ−ＮａＯＨ，９０％蟻酸、
ホルムアミド、およびメチルスルホキシドには易溶。

メタノール、エタノール、アセトン、クロロホルムおよ
び酢酸エチル等の有機溶媒には不溶。

Ｏ物 性：白色、無味、無臭 Ｏ呈色反応：アントロン−硫酸反応で緑色システィン−
硫酸反応で黄色 エルソンーモルガン反応で無色 ヨード反応は陰性 Ｏ赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤法で測定した赤外
線吸収スペクトルは第１図の通りである。

この図で８４０ｃｒｒＬ−１附近の吸収はα−結合に特
有な吸収である。

０構戒糖：ＩＮ−硫酸、ＩＮ−塩酸、ＩＮ−トリクロル
酢酸で加水分解して得た糖は、ペーパークロマトグラフ
ィー、ガスクロマトグラフィー液体クロマトグラフィー
およびグルコースオキシダーゼ・パーオキシダーゼ法に
よる分析結果からＤ−グルコースであることが伴明した
。

さらに、メチル化、過沃素酸酸化、完全スミス分解、お
よび緩和スミス分解などの化学的手段でエルシナンを試
験した結果、本発明のエルシナンは今までに知られてい
なかった全く新しい構造を有する新規なグルカンである
ことを認めた。

即ち、（１）比旋光度が［α］Ｄ＋１７５〜２８０°と
高い値を示すこと、および赤外線吸収スペクトルが８４
０ＣｒｆＬ−１附近に吸収を示すことから、エルシナン
を構成するすべてのグルコース残基、もしくはほとんど
のグルコース残基は、α−結合をしている。

（２） ａ −メチル化したエルシナンの加水分解物を
ガスクロマトグラフィーおよびマススペクトルの手段で
同定し、定量した結果は、主成分として２．４．６−ト
リー〇−メチルーＤ−グルコース（約３０％）、２．３
．６−トリー〇−メチルーＤ−グルコース（約６８％）
が得られたほか、ごくわずかの２，４−ジーＯ−メチル
ーＤ−グルコース（約１係）と２．３．４．６−チトラ
ーＯ−メチルーＤ−グルコース（約ｌ係）を確認した。

ｂ、エルシナンを過沃素酸で完全に酸化すると、構成す
るグルコース残基１個当り過沃素酸の０．８モルを消費
し、同時に蟻酸が０．０７モル生生成ることを確認した
。

Ｃ，エルシナンの完全スミス分解したものをペーパーク
ロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィーおよび液体
クロマトグラフィー等によって同定し、定量した結果は
、６８〜７０条のＤ−エリトリトール、２９〜３０％の
Ｄ−グルコース、および微量のグリセロールを確認した
。

以上の事実から、エルシナン中のグルコース残基は、α
−１，４結合とα−１，３結合を主とした直鎖状の構造
で連なっており、α−１，４結合の数とα−１，３結合
の数との比は２．０〜２．３：１．０であることが認め
られる。

また、場合によっては、両隣のグルコース残基と１位と
３位とで結合しているグルコース残基のうち、わずかで
はあるが、その６位からさらにα−１，６結合で分岐す
るものがある。

しかし、その量はグルコース残基７０個にせいぜい１個
の割合にすぎなかった。

（３）緩和スミス分解生成物をペーパークロマトグラフ
ィーおよびガスクロマトグラフィーにより分析した結果
、Ｄ−エリトリトールと、２−０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルーＤ−エリトリトール（この存在は一方に隣接す
るグルコース残基と３位で結合しているグルコース残基
が、他方に隣接するグルコース残基とα−１，４グルコ
シド結合していることを示す。

）とが得られ、そのモル比は１．０−１．３ ： １．
０であった。

このほかに非還元性末端のグルコース残基に由来する極
わずかのグリセロールも検出した。

（４）希酸で部分分解すると、生成物中にマルトトリオ
ース、微量のマルトラオース、α−１，４のおよびα−
１，３結合を含む三糖類、四糖類などが確認された。

上述の（１） 、 ｆ２） 、 （３） 、 （４）の
結果を総合的に判断すると、本発明のエルシナンは、は
とんど分枝を有しないα−１，３結合およびα−１，４
結合から構成される多糖類であって、その主要構造はα
−１，４結合した約３個のグルコース残基がα−１，３
結合で繰り返し結合して連なっている。

換言すれば、エルシナンは主としてマルトトリオース残
基がα−１，３結合で連なった直鎖状の構造を有してい
る。

なお、前述の（２） 、 （３） 、 （４）の結果か
ら主な繰り返し単位は、マルトトリオース残基であるが
、その他＊＊にわずかにマルトテトラオース残基も含ま
れている。

即ち、エルシナンは主な繰り返し単位に、〔３）−Ｇｌ
ｃ−（１−”４）−Ｇｌｃ−（１→４）−Ｇｌｃ−（１
→〕の構造を有する新規なグルカンである。

エルシナンの主要構造をさらにくわしく示すと次の通り
である。

エルシナンの平均分子量は、エルシナンが化学的方法に
よっても、生化学的方法によっても製造できること、お
よびエルシナンが塩酸や硫酸等で容易に加水分解される
こと等から約５，０００〜約１０．０００，０００の範
囲で自由に調節することができる。

このようにして調整したエルシナンの酵素分解性につい
て検討したところ、動植物、微生物起源のα−アミラー
ゼ（Ｂ、Ｃ，３，２，１，１）がエルシナンに作用して
、そのα−１，４結合を特異的に加水分解し、特殊な結
合様式を持つ３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルト
ースを極めて効率よく生成することを見いだしたのであ
る。

本発明において使用するα−アミラーゼとしては、エル
シナンから３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトー
スを生成するものであれば何れのものでもよく、例えば
ヒトの唾液、ブタの膵臓などの動物由来のα−アミラー
ゼ、麦芽などの植物由来のα−アミラーゼ、バチルス
ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）、
バチルスポリミキサ（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ ｐｏｌｙｍ
ｙｘａ）などの微生物由来のα−アミラーゼなどが挙げ
られる。

微生物由来のα−アミラーゼとしては、液化型のα−ア
ミラーゼよりも、糖化型のα−アミラーゼの方がエルシ
ナンによく作用するので好ましい。

なお、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、プルラナー
ゼ、イ゛ノアミラーゼは、エルシナンにほとんど作用し
ないか全く作用しなかった。

また、α−アミラーゼ標品は、粗酵素であっても本発明
の目的を達することができるが、目的物である３−０−
α−Ｄ−グルコピラノシルマルトースを分解するような
酵素、例えばα−グルコシダーゼなどを含まないものが
好ましい。

本発明の３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトース
は、次のようにして調整すればよい。

エルシナンの水溶液を、例えば濃度的Ｏ１１〜５係、Ｐ
Ｈ５〜１０．温度２０〜７０℃とし、これにエルシナン
の固形物１グラム当り約１ｏ〜ｉ、ｏ ｏ 。

単位のα−アミラーゼを加えて作用させる。

〔α−アミラーゼの活性測定〕

１多回溶性澱粉溶液５ｍｌと０．０１Ｍ塩化カルシウム
を含有するｐＨ５，５の０．１Ｍ酢酸緩衝液（但し、動
物からのα−アミラーゼの場合には、０．０１Ｍ塩化ナ
トリウムを含有するｐＨ６，９の０．１Ｍリン酸塩緩衝
液）４ｒｒｔｌとを試験管にとり、４０℃に予熱した後
、この混合液に適当に希釈した酵素液１ｍｌを加えて作
用させ、４０℃で３０分間に生じる還元糖の還元力をグ
ルコースとして定量し、１０ＩＩＩｇのグルコースを生
じる活性を１単位とした。

本発明による時は、α−アミラーゼの作用とともにエル
シナン水溶液は粘度が低下し、還元糖が増加してくる。

約５〜１００時間作用させた後、加熱するか、または適
当な薬剤を加えるなどして酵素を失活させて反応を終了
する。

得られた溶液は、そのまま濃縮し、またこれをさらに乾
燥することにより、固形物当り約５０〜９０％の純度を
有する３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトースの
シラツブ状、または粉末状粗製品が容易に得られる。

必要ならば、公知の精製方法、例えば活性炭による脱色
法、イオン交換樹脂による脱イオン法、アルコール、ア
セトンなどの有機沈澱剤による分別沈澱法、カラムクロ
マトグラフィーによる分画法など各種の精製方法を用い
て、さらに高純度の製品にすることもできる。

さらに必要ならば、アセチル誘導体にして結晶化し、こ
れを純化した後、希アルカリ、またはアルカリ性メタノ
ール中で脱アセチル化することにより、高度に純化した
３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトースを採取す
ることも可能である。

このようにして、３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマ
ルトースは、原料のエルシナンに対して、固形物当り約
４０〜９０％の高収率で採取することができるのである
。

このようにして精製された３−０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルマルトースの理化学的性質は、次の通りである。

Ｏ元素分析： 実測値Ｃ＝ ４９．３７％、Ｈ＝ ５．６０係、０＝４
５．０３多計算値Ｃ＝ ４９．６９係、Ｈ＝ ５．６３
％、０＝ ４４．６８条（ウンデカアセチル誘導体、化
学式Ｃ４０Ｈ５４ｏｚ７）Ｏ分子量：５０４ ｏ融点（ウンデカアセチル誘導体）： ９５〜９８°Ｃ（再結晶品） ０比旋光度：〔α）Ｄ＋１６４°（ｃ＝ １．１． Ｈ
２Ｏ）文献値は〔α）Ｄ＋１６９．５°（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ５ｏｃｉｅｔｙ（
１９５７年）Ｐ、２４４８〜２４５４） Ｑ紫外線吸収スペクトル：特徴的な吸収を示さず。

０赤外線吸収スペクトル：α−結合に特徴的な８４０（
１７７１”附近に吸収を示す。

０溶解性：水に易溶、エタノール、ブタノールに徴溶、
エーテル、クロロホルムに不溶 ０アントロン反応：陽性 ０銀鏡反応：陽性 Ｏ物性：水溶液は無色であり、微酸性もしくは中性。

粉末は白色０構戒：ウンデカメチル誘導体を酸で加水分
解して得た混合物をガスクロマトグラフィーで分析した
。

その結果、混合物は２．３．４．６−チトラー〇−メチ
ルグルコース、２．４．６−トリーＯ−メチルグルコー
ス、２，３．６−トリー〇−メチルグルコースがモル比
で１：１：１から戒っていることが判明した。

以上の結果から、エルシナンにα−アミラーゼを作用さ
せることによって生ずるグルコ三糖類は、３−０−α−
Ｄ−グルコピラノシルマルトース（〇−α−Ｄ−グルコ
ピラノシルー（１→３）−〇−α−Ｄ−グルコピラノシ
ルー（１→４）−り一グルコース）であり、その構造は
次の通りである。

このようにして得られた３−０−α−Ｄ−グルコピラノ
シルマルトースは、例えばα−１，３−クルコシダーゼ
の定量用基質や、酵素誘導剤などとして自由に利用でき
る。

次に本発明の原料であるエルシナンの製造を参考例とし
て例示する。

参考例 １ シュクロース５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ ｗ／ｖ係
、Ｎａ２ＨＰＯ，Ｏ，Ｏ−４２ｗ／ｖ％、ＫＨ２Ｐ０，
０．０１８ｗ／ｖ％、ポテト熱水抽出物の透析外液（培
地１１につき新鮮ポテト３０１の割合で使用した。

）および水とからなる液体培地を１２００で２０分間滅
菌した後、冷却し、始発−を６．８としてエルシノエ
ロイコスピーラＦＥＲＭ−Ｐ／１６３８７４を植菌し、
２４℃で５日間通気攪拌培養した。

この培養液を８５℃に１５分間保って殺菌した後、遠心
分離（５，００１で２０分間）して菌体を除去した。

この時に得た透明な上清に１．５倍容のエタノールを加
えると、白色羽毛状のまたはゴム状の沈澱物として粗製
のエルシナンが得られた。

この粗製のエルシナンを、水に溶解し、前記と同様に遠
心分離して不溶物を除去した後、その上清に再びエタノ
ールを加えて沈澱させた。

この操作を３回繰り返した後の沈澱物を凍結乾燥し、精
製エルシナンの白色粉末を、培地に用いたシュクロース
に対して約３０係の収率で得た。

この精製エルシナンの水溶液における粘度は３％、ａｏ
℃で４０７ｃｐであった。

この精製エルシナンの分子量分布をゲル沢過法で測定し
たところ、第２図に示すように約ｉ ｏ、ｏ ｏ ｏか
ら約１０，０００，０００以上にわたって分布している
ことがわかった。

参考例 ２ 澱粉部分加水分解物（Ｄ、Ｅ、３０の御ｊ３） ３ ｗ
／ｖ係、小麦胚芽０．３ ｗ／ｖ％、ＮＨ４Ｎ０３０．
１ ｗ／ｖ％、Ｋ ２ＨＰ０４０．１ ｖｉ／ｖ ％、
Ｍｇ Ｓ ０４ ・７Ｈ２００，０５ｗ／ｖ係、Ｋｃ
ｌ Ｏ，０５ｗ／ｖ％、Ｍｎ Ｓ ０４ ’ ４Ｈ２０
０，０００１ｗ／ｖ％および水とからなる液体培地を１
２・０℃で２０分間滅菌した後、冷却し、始発−を６．
０として、エルシノエ フォーセラティ（Ｅｌｓｉｎｏ
ｅｆａｗｃｅｔｔｉ） Ｉ ＦＯ８４１７を植菌し、２
８℃で４日間通気攪拌培養した。

この培養液を参考例１と同様に処理して、精製したエル
シナン（白色粉末）を、培地に用いた澱粉部分加水分解
物に対して約７０係（固形物当り）の収率で得た。

このようにして得られたエルシナンは、以下に述べる実
施例に示すように、３−０−α−Ｄ−グルコピラノシル
マルトースを製造するのに自由に用いることができる。

実施例 １ エルシナン１重量部を０．００１Ｍの塩化ナトリウムを
含有するｐＨ６，９の０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝液１０
０重量部に溶解し、これに部分精製したヒト唾液のα−
アミラーゼをエルシナン固形物１グラム当り２００単位
の割合で加え、３７℃で７２時間作用させた結果、生成
された還元糖の還元力は、グルコースとして原料エルシ
ナンに対し約３０％であった。

得られた反応液をペーパークロマトグラフィーで分析し
たところ、３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトー
スが７５．０％、グルコースｚ８俤、マルトース１．８
％、グルコ四糖１３．０％およびグルコ五糖以上の高分
子物２．４多であった。

この反応液を、９０℃に１０分間保った後に濾過し、得
られるＦ液を活性炭カラムクラマドグラフィーにかけた
。

エタノール１０〜１２ ｖ ／ ｖ ％を含む水溶液で
溶出される画分を集め、減圧濃縮し次いで凍結乾燥した
。

さらに精製するために、これを少量の水に溶解させた後
、済過して不溶物を炉別した。

得られたＰ液を攪拌しつつ、これにエタノールを徐々に
加えて終末濃度８５ｖ／ｖ％とした。

生じた白色沈澱を採取し、減圧濃縮して３−０−α−Ｄ
−グルコピラノシルマルトースの無色透明なシラツブを
、原料エルシナンに対して固形物当り約４２％の収率で
採取することができた。

この製品は、極めて高純度であり、ペーパークロマトグ
ラフィーで単一のスポットを与え、その比旋光度は（α
、ＩＩ）＋１６４°（Ｃ＝ｔ、ｔ 、Ｈ２Ｏ）であった
。

実施例 ２ エルシナン１重量部を０．００１Ｍ塩化カルシウムを含
有するｐＨ５，５の０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液５０重量部
に溶解し；これに市販のバチルス ズブチリスのα−ア
ミラーゼ（糖化型）をエルシナン固型物１グラム当り１
００単位の割合で加え、５０℃で４０時間作用させた結
果、生成する還元糖の還元力は、グルコースとして原料
エルシナンに対して約３５俤であった。

得られた反応液をペーパークロマトグラフィーで定性分
析したところ、はとんどが３−０−α−Ｄ−グルコピラ
ノシルマルトースであって、これ以外に微量のグルコー
スとグルコ四糖のスポットを認めた。

この反応液を実施例１と同様に加熱してα−アミラーゼ
を失活させた後、濾過して得られるＦ液に０．００２重
量部の活性炭を加えて脱色し、次いでＨ型およびＯＨ型
イオン交換樹脂を用いて脱塩した。

得られた溶液を減圧濃縮し、乾燥して固形物当り約９５
優の純度を有する３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマ
ルトースの白色粉末を、原料エルシナンに対して固形物
当り約９０％の収率で採取することができた。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製したエルシナンの赤外線スペクトルを示す
グラフ。 第２図は精製したエルシナンのゲル濾過パターンによる
分子量の分布を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 主な繰り返し単位がＣ３） −Ｇｌｃ −（１−＝
   ４）−Ｇｌｃ−（１−＋４ ）−Ｇｌｃ−（１−））（
   但し、Ｇ ｌ ｃはα−Ｄ−グルコビラノース残基を示
   す。 ）の構造を有するα−グルカンにα−アミラーゼを作用
   させて３−０−α−Ｄ−グルコピラノシルマルトースを
   生成し、採取することを特徴とした３−Ｏ−一α−Ｄ−
   グルコピラノシルマルトースの製法。