JPH0122898B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電極表面に固定された酵素又は微生
物を有する生物電気化学センサーとその製造法に
関するものであり、更に詳しくは、貴金属線から
なる分離型電極の電極表面を、酵素又は生きた微
生物を水不溶性高分子膜で包括した固定化酵素膜
又は固定化微生物膜で多孔質膜を介して被覆一体
化したことを特徴とする生物電気化学センサーと
その製造法に関するものである。

近時生物の持つ反応特異性と電気化学デバイス
を組み合せた生物電気化学センサーの開発が行な
われ、特に医療分野に於て、その基質選択性、微
量反応性等から、臨床検査手法の変革を可能にす
るものとして注目されている。

そして、既にアンペロメトリー、ポテンシオメ
トリーの両電極反応を基本とする酵素電極による
生体成分定量法、さらにバイオアツセイ法を応用
した微生物電極による微量成分定量法の提案がな
されている。

しかしながら、従来提案されている酵素固定化
方法あるいは微生物固定化方法（以下両者併せて
固定化方法と略す）では、被固定化物の継続的溶
出、失活、立体構造の変化、比活性が低い、基質
通過が困難等々の欠点があり、固定方法によつて
は分子量の制限によつて固定化できないものもあ
り、その発展が停滞している。又一方、従来の生
物電気化学センサーは、電極表面に予め別に形成
した酵素あるいは微生物の固定化膜を被覆するも
のであり、その取扱い及びセンサーの微小化に大
きな妨げとなり、これも生物電気化学センサーの
発展を阻害していた。又電極表面に酵素あるいは
微生物を固定化した膜を被覆した生物電気化学セ
ンサーは生体反応により生成または消費した物質
を電気化学的に検知するものであるが、被測定物
質によつては検知物質の電極反応に影響を及ぼす
干渉物質、例えば酵素電極反応の場合、Fe⁺⁺⁺イ
オン等の存在によつて精度が著しく低下し、その
対策が煩雑であるが故に、折角の生物電気化学セ
ンサーの実用が進まない等の問題点も有してい
た。

本発明者らは、これらの阻害要因を一気に解消
して、生物電気化学センサーの実用を進めるべく
鋭意検討した結果本発明に到達したものである。

即ち本発明の要旨とするところは、貴金属線か
らなる分離型電極の電極表面に直接高分子多孔質
膜が被覆され、該多孔質膜表面に直接固定化酵素
膜又は固定化微生物膜が被覆されてなり、電極、
高分子多孔質膜、固定化酵素膜又は固定化微生物
膜が一体構造をなしている生物電気化学センサー
であり、さらにその製造方法として、予め高分子
多孔質膜で被覆した貴金属線からなる分離型電極
の電極表面を、酵素又は微生物を含有した氷塊と
水不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒との混合
物で被覆した後、該有機溶媒を除去する生物電気
化学センサーの製造法である。

以下本発明を詳しく説明する。

図面は本発明のセンサーの具体例であり、高分
子多孔質膜１と固定化酵素膜又は固定化微生物膜
４（以下固定化酵素膜等と略す）が絶縁体２で被
覆された貴金属よりなる分離型電極３へ一体構造
をもつて被覆されている。

即ち、従来の固定化酵素膜を用いた電極は、た
とえば特開昭54−102193号明細書第２図に示され
ているごとく、高分子多孔質膜や固定化酵素膜を
一旦別途成形し、この膜を電極表面に被覆すると
いう方法がとられている。

このような方法による場合、電極が白金線のよ
うな細いものである場合、被覆時に膜が破れたり
して非常な困難を伴なう。一方本発明の電極で
は、酵素の固定化と電極への固定化酵素膜の被覆
が製造時に一体化して行なわれるため、非常に微
小な電極表面にも被覆が可能であり、さらに製造
条件の適当な選択により、被覆膜の厚みや多孔度
を任意に選択出来る。さらにこのように電極へ一
体固定化されたものは、測定時に固定化酵素膜の
脱落が起りにくく外部溶液への浸漬による使用は
もちろん、生体組織内へ挿入して測定する場合、
安全に使用出来るものである。

本発明のセンサーの第２の特徴は、図から明ら
かなように固定化酵素等を含まない高分子多孔質
膜１と酵素や微生物を内部に固定化した固定化酵
素膜等４の一体積層構造を有することである。

固定化酵素膜等と電極反応の組合せによる電気
化学分析法、例えば酵素電極に於ては基質と酵素
との反応によつて発生又は消費される。酸素、過
酸化水素、炭酸ガス、アンモニアガス、炭酸イオ
ン、水素イオン等の電極活性物質を定量検知する
ものであるが測定条件、例えばポーラログラフイ
によるアンペロメトリツク法に於て酸素を還元す
る電位に於て同時に還元されるFe⁺⁺⁺などの金属
イオンがあるとこれが干渉物質となつて測定を防
害する。

固定化酵素膜等は基質の通過が容易である一
方、これらの干渉物質をも通過させたり、あるい
はもう一つの測定精度阻害因子である測定系の波
動が電極表面に直接到達し易い為、測定精度は低
下する。

これらの干渉を除外する為に、薄膜の積層、補
正を目的とする複式電極システム等の提案もある
が、前者は薄膜の積層操作が難かしい、後者は回
路、装置が複雑になる等の欠点を有していた。

本発明は、前記の薄膜積層を改良する為に貴金
属線からなる分離型電極の電極先端に予め微細な
多孔質膜層を形成し、さらにその上に固定化酵素
膜等を形成一体化することにより、効果的かつ簡
便に測定精度の高いセンサーを提案するものであ
る。

本発明に云う高分子多孔質膜とは、孔径10Å〜
5μｍ、好ましくは20Å〜3μｍ、さらに好ましく
は50Å〜1μｍの孔を有するものである。また高
分子多孔質膜自身を表面に孔径の小さい緻密層と
内部を孔径の大きい多孔質を持たせた非対称膜、
多層膜とすることによつて基質および電極反応物
質の移動速度を調製出来る。この場合、緻密層の
孔径は20Å〜1μｍの範囲に、内部多孔質膜の孔
径を1μｍ以上にコントロールしたものが良い。

即ち、本発明の生物電気化学センサーが最も有
効に使用される生体情報即ち血液、組織液の成分
容量を想定した場合、コロイド状と考えられる血
液、組織液の無荷圧下での膜内への浸透のために
は20Å以上、好ましくは50Å以上の孔径が必要で
あり、これ以下では乾燥状態の電極を組織又は血
流中に挿入した場合、安定した応答が得られる迄
に時間がかかる。一方孔径が3μより大になると、
組織あるいは血流の動きに応じて孔中での液の運
動が起るようになり測定の安定性に欠けるように
なり、又干渉物質による影響を受け易くなる。

高分子多孔質膜の孔径は電極表面から膜厚の方
向に沿つて、順次小さくなるように分布させると
より効果的である。一方高分子多孔質膜の空孔体
積率は、大なる程電極の感度はよく、これは膜の
物理的強度との相関に於て決定される。

多孔質膜を形成する素材としては、セルロー
ス、セルロースアセテート、コロジオン膜（硝酸
セルロース）、ポリアミドヒドラジド、ポリビニ
ルアルコール、ポリヒドロキシエチルメタクリレ
ート等の親水性素材あるいはポリカーボネート、
エチレンオキシドブロツクポリマー、ポリスチレ
ン、ナイロン６、ポリエステル等の疎水性ポリマ
ーで溶媒、膨潤剤による溶解、膨潤が容易なもの
があげられ特に孔径のコントロールのし易さ、膜
の強度、後述の固定化酵素膜等の形成溶媒との関
係等を勘案して決定される。

多孔質膜の厚さは、孔径によつて増減すること
が好ましく、孔径が小なる場合程薄くする必要が
あるが大略10〜100μであることが好ましい。

この多孔質膜に続いて、固定化酵素膜等が一体
形成される。固定化酵素膜等の製法は、公知の方
法が適用出来るが、被固定化物である酵素や微生
物が失活しないように注意しなければならない。
後述する氷塊中に酵素等を包接した後高分子膜で
さらに包接する方法が特に好ましい。固定化酵素
膜等は、一般に水不溶性の高分子マトリツクス中
に酵素等が固定化されているものが良く、高分子
マトリツクスは微小空孔を多数含む多孔質膜が好
ましい。

このような構造を持たせることによつてセンサ
ーと接触する溶液中の基質が酵素等と自由に接触
し、反応が速やかに行なわれる。

次に本発明の生物化学的センサーの製造法につ
いて述べる。

多孔質膜の作成については、予め電極表面上に
作成した緻密膜を膨潤剤で膨潤せしめた後、これ
を非溶剤で置換して多孔質膜とする方法、高分子
溶液を電極表面上に付着させた後、空気中又は溶
媒と相溶する非溶剤中で脱溶媒して凝固させる方
法等々いかなる方法によつてもよく溶媒も数種の
組合せ、溶媒と膨潤剤の組合せ、溶媒−非溶媒混
合液の組合せ等々いかなる系を用いてもよい。

孔径の調整は、溶媒、膨潤剤の組合せ、温度、
高分子の溶解濃度、溶媒−非溶剤の比率、凝固さ
せるタイミング等々によつて行う。又孔径の分布
を持たせる為に、膜形成を複数回にわたつて、順
次つみ重ねる形で行なつてもよい。

得られた多孔質膜は、さらにアニーリングによ
つて、孔径の調整あるいは膨潤強度の調整を行な
つてもよい。

次にこのように貴金属線からなる分離型電極の
電極表面に一体成形された高分子多孔質膜上に固
定化酵素膜等を一体成形する。

酵素又は微生物の固定化方法は、各種の方法が
提案されているが中でも包括法と称される方法
は、被固定化物の活性を低下せしめることの少な
い方法として広く用いられている。

即ち酵素や微生物を水不溶性高分子物質で包括
して固定化する方法として、水溶性単量体あるい
は水溶性高分子物質と水溶性架橋剤を酵素あるい
は微生物とともに水に溶解せしめたのちこれを過
硫酸カリ等の重合触媒あるいはγ線等の放射線で
重合をおこさせると同時に架橋構造を与え生成し
た水不溶性高分子ゲル中に酵素や微生物を包括す
る方法とか、水不溶性単量体あるいは水不溶性高
分子物質が溶解している有機溶媒中に酵素や微生
物を含有する水溶液を微小な水滴として分散せし
めたのち重合を行なわしめたり、あるいは水不溶
性高分子物質を溶解している有機溶媒を除去した
りしてこの水滴を水不溶性高分子物質で包括する
方法などが知られている。

しかしながら、これら従来の方法は次のような
欠点を有するものである。即ち、酵素や微生物は
一般に水中においては比較的安定であるが有機溶
媒中では不安定であり、従来の方法では包括材料
としては水溶性のものが多い。水溶性の材料を用
いる場合には、重合や架橋などによつて水溶性の
材料を不溶性にする操作が必要であり、それらの
操作によつて酵素や微生物の変質は免れない。又
包括材料として水不溶性高分子物質を用いようと
すると、これらを溶解するために、有機溶媒を用
いる必要があり、有機溶媒により酵素が失活した
り微生物が死滅したりする場合が多い。本発明者
の一人である崎前らは、これら従来の方法がもつ
欠点を解決すべく研究し、有機溶媒中で酵素や微
生物を水不溶性高分子物質で安定に包括する方法
に関し、いくつかの提案を行なつている（特開昭
54−105289、特開昭55−135591）。更にその改良
方法として、固体構造物の表面を酵素又は微生物
を包括した水不溶性高分子物質で被覆することに
より機械的強度が優れ、しかも固体構造物の形状
に合わせた各種の成型された薄膜状の固定化酵素
又は固定化微生物が容易に製造できることを見い
出した。

本発明者らは、その方法を応用して電極表面に
直接酵素又は微生物を固定化せしめた生物電気化
学センサーが、その活性、耐久性及び応用性に優
れた性能を有することを見出し本発明に到達し
た。

即ち、酵素又は微生物を含有した氷塊と水不溶
性高分子物質を溶解した有機溶媒との混合物で電
極表面を被覆したのち有機溶媒を除去することを
特徴とする固定化された酵素又は微生物を電極表
面に有する生物電気化学センサーとその製造方法
である。

本発明で使用される酵素は動植物組織から得ら
れたものでも、あるいは微生物が産生したもので
も、その供給源を問わず使用できる。また酵素は
精製されたものでも未精製のもの、例えば酵素含
有組織のホモジネートや微生物細胞のようなもの
でも差しつかえない。

本発明で使用される酵素は特に制限されない
が、例えば特開昭54−105289号に記載された各種
酵素が全て使用されうる。

又、本発明で使用されうる微生物はカビ、酵
素、細菌、放線菌、不完全菌に分類される微生物
であり、その種類は特に制限されないが、例えば
特開昭55−135591号に記載された各種の微生物が
全て使用されうる。

これらの微生物は栄養培地で生育せしめられた
のち、生きた状態で使用されうる。ここに生きた
状態とは微生物が自己再生能力を有することであ
り、微生物の生育に適する環境下で培養すること
により確認することができる。

本発明で使用される酵素又は微生物を含有する
氷塊は、上記の酵素や微生物を含有する水溶液を
０℃以下に凍結し、氷塊の内部にこれらを包含せ
しめたものである。この氷塊は酵素や微生物を含
有する水溶液を深冷された雰囲気中に分散せしめ
ると同時に急速凍結を行ない調製することができ
る。深冷された雰囲気としては冷却されたガスあ
るいは液いずれでもよいが、好ましくは液状の冷
却媒体を用いるのがよい。

液状の冷却媒体としては、凝固点が０℃以下の
液状物、例えばメタノール、エタノール、アセト
ン、酢酸エテル、二塩化メチレン、クロロホル
ム、四塩化炭酸、エチルエーテル、テトラヒドロ
フラン、トルエン、ｎ−ヘキサン、石油エーテ
ル、液体窒素、液体酸素などであり、これらを冷
却するには蒸発熱を利用したり、ドライアイス等
を投入して直接冷却するか、又は冷凍機などによ
り間接に冷却する方法などがとられる。

酵素又は微生物を含有する水溶液を液状冷却媒
体を用いて凍結するに際しては、これらを含有す
る水溶液を容器等に入れて間接的に凍結してもよ
く、又液状冷却媒体中で直接凍結させてもよい。

冷却媒体中で直接凍結する場合においては、酵
素の失活あるいは微生物の死滅を極力抑えるため
に、冷却媒体の温度をできるだけ低温にし更に水
溶液を噴霧器などを用いて、微小水滴化して急速
凍結することが望ましい。又微小水滴化する為に
予め、酵素あるいは微生物の水溶液を界面活性剤
を用いてｎ−ヘキサン、石油エーテル等の飽和炭
化水素系の溶媒に分散させておいてもよい。

本発明で使用される氷塊は、酵素や微生物以外
に次の物質を共含したものでもよい。例えばポリ
ビニルアルコール、ポリエチレングリコール、タ
ンパク質、核酸、多糖等の水溶性高分子物質、グ
リセリン等の多価アルコール類、ジメチルスルホ
オキサイド等の極性有機溶媒、シヨ糖、乳糖など
の少糖類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のア
ミノ酸類、α−ケトクルタール酸、リンゴ酸等の
有機酸、マグネシウム、マンガン、コバルト、カ
ルシウム等の金属塩類、粉末活性炭、珪藻土、ラ
テツクス等の微小な固形物が挙げられる。その他
特に酵素の場合は該酵素の基質、反応生成物、補
酵素なども共含してもよい。これらの物質は主に
固定化操作中における酵素や微生物の保護、ある
いは固定化後の製品の物性改良を目的として使用
されるのであり、酵素や微生物を含有する水溶液
に加えられたのち、急速凍結されて氷塊中に共含
せしめられる。

本発明で使用される水不溶性高分子物質とは有
機溶媒に溶解し水に不溶な高分子量の重合体であ
り、０℃以下の有機溶媒にわずかでも溶解するも
のならばすべて本発明に使用できるが、好ましく
は０℃以下の有機溶媒に0.1重量％以上溶解する
水不溶性高分子物質が適当である。ここで水不溶
性高分子物質が有機溶媒に溶解することは水不溶
性高分子物質が有機溶媒と相分離を起こさない濃
度で有機溶媒と均一に混合していることである。

本発明で使用される代表的な水不溶性高分子物
質としてはポリアクリロニトリル、ポリアクリル
酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリス
チレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ
カーボネートなどのホモポリマーまたはこれらホ
モポリマーを構成する単量体を成分とするような
コポリマー、あるいは酢酸セルロース、エチルセ
ルロースのようなセルロース誘導体などである
が、もちろんこれだけに限定されるものではな
い。これらの水不溶性高分子物質を０℃以下で
0.1重量％以上溶解する有機溶媒は０℃以下で液
体で存在するもののなかから選ばれ、例えばメタ
ノール、エタノール、プロパノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、二塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、エチルエーテ
ル、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサン、石油エ
ーテル、テトラヒドロフラン、シクロヘキサン、
Ｎ，N′−ジメタルホルムアミド、γ−ブチロチ
クトン、アセトニトリルなどが好ましく使用され
るが、もちろんこれらに限定されるものではな
い。

水不溶性高分子物質はこれらの有機溶媒に溶解
せしめられたのち、０℃以下に冷却されて使用さ
れる。

酵素又は微生物を含有した氷塊と水不溶性高分
子物質を溶解した有機溶媒との混合物とは、氷塊
を水不溶性高分子物質を溶解した０℃以下の有機
溶媒中に懸濁状態で分散せしめたものである。分
散せしめるにあたつては、水不溶性高分子物質を
溶解した有機溶媒に別途調製した氷塊を加えて急
速撹拌などにより懸濁状に分散せしめてもよく、
また冷却下の水不溶性高分子物質を溶解した有機
溶媒中に酵素又は微生物を含有する水溶液を微小
水滴として直接分散させて急速凍結しこれらを含
有する氷塊を生成させてもよい。

氷塊を有機溶媒に均一に分散させるためには氷
塊の粒径が小さい程効果的であり、氷塊の大きさ
として直径が１mm以下のものを使用することが好
ましい。又一旦分散された氷塊を有機溶媒中で安
定に維持するためには、氷塊分散時に氷塊ととも
に該水不溶性高分子物質の非溶媒を適当量加えて
もよい。特に氷塊の比重と水不溶性高分子物質を
溶解した有機溶媒との比重が異なる場合は、一旦
分散された氷塊は撹拌を停止すると有機溶媒と分
離してしまう。

このような場合には非溶媒を加えることにより
氷塊を有機溶媒中に安定に分散せしめることがで
きる。氷塊とともに該水不溶性高分子物質の非溶
媒を加えるときは、氷塊を該水不溶性高分子物質
の非溶媒に一旦スラリー化したのち、このスラリ
ーを水不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒中に
急速撹拌下で加えれば良い。この場合、氷塊は非
溶媒とともに水不溶性高分子物質を溶解した有機
溶媒中に分散されるため、氷塊の周辺で水不溶性
高分子物質が凝固し、更にこの凝固した水不溶性
高分子物質が過剰の有機溶媒になかば溶解された
状態が形成され、その結果氷塊は水不溶性高分子
物質を溶解した有機溶媒中に安定に分散される。
更に又、これをより効果的に行なうために氷塊中
にポリビニルアルコール、ポリエチレングリコー
ル等の水溶性高分子物質あるいはグリセリン、エ
チレングリコール等の多価アルコールなどを共含
させることもできる。氷塊の分散性の向上を目的
として使用される非溶媒は水不溶性高分子物質を
溶解せず０℃以下で液状の溶媒であり、水不溶性
高分子物質を溶解したた有機溶媒と混和するもの
から選ばれる。

本発明は、かくして得られた酵素又は微生物を
含有した氷塊と、水不溶性高分子物質を溶解した
有機溶媒との混合物であるドープを多孔質膜で被
覆した分離型電極先端に付着せしめた後、該ドー
プから有機溶剤を除去せしめ、水不溶性高分子マ
トリツクス中に酵素或いは微生物を固定化した膜
を電極表面に直接形成せしめるものである。この
多孔質膜で被覆された電極先端を前記の氷塊を含
む混合物で被覆せしめるときは、例えば多孔質膜
で被覆された電極先端を氷塊と水不溶性高分子物
質を含む有機溶媒の混合物中に浸漬したり、ある
いは表面に塗布したりすることにより電極先端の
表面を混合物で被覆することができる。これらの
操作は連続的でも回分的でも可能である。次いで
電極先端表面を被覆した混合物から有機溶剤を除
去するには、減圧下で有機溶媒を蒸発させてもよ
く、あるいは水不溶性高分子物質の非溶媒中で凝
固させるなどの方法によつてもよい。

酵素や微生物は氷の内部に包含されている間は
有機溶媒が共存しても安定であるが、氷が融解す
ると有機溶媒による酵素の失活あるいは微生物の
死滅が起こる危険性があるため氷が融解する前に
包括物から有機溶媒を除去することが好ましい。

このようにして有機溶媒を除去した氷の包括物
は、そのまま冷凍保存し使用前に融解して固定化
酵素あるいは固定化微生物として用いることがで
きるが、更にこのものを真空凍結乾燥装置等を用
いて凍結乾燥することにより保存や輪送に便利な
形態とすることができる。

本発明は、貴金属線からなる分離型電極の電極
先端の表面に直接酵素や微生物を包括した水不溶
性高分子物質を形成させるという全く新規な生物
電気化学センサー及びその製造方法を提供するも
のである。従来法が酵素又は微生物を有機溶媒中
に安定に存在せしめた状態で包括を行なつていな
いため、既に述べたような種々の欠点が生じるの
に対し、本発明によればこれら従来の欠点は解決
され、現在工業的に汎用されている各種の水不溶
性高分子物質の使用が可能になり、固体の構造体
に支持された機械的強度の優れた固定化酵素膜又
は固定化微生物膜を有する生物電気化学センサー
が容易に製造できる利点を有する。更に又、本発
明は電極先端表面に薄膜状に酵素や微生物を包括
した水不溶性高分子物質膜を形成させるため反応
に関与する物質の透過性が著しく改善された効率
のよい生物電気化学センサーが酵素、微生物の種
類によらず自由に再現性よく得られる利点も有す
る。又包括法によるため得られたセンサーの活性
の発現性、耐久性が高い。

又、本発明によれば、センサーを微小化するこ
とが出来るので、特に少量の試料での測定が要求
される血液、尿、組織液等の医療分野での定量、
さらには血管、組織等への直接挿入による測定迄
可能となる。

以下実施例により本発明をさらに詳しく説明す
る。

実施例 １ グルコースオキシダーゼ（ベーリンガー社製約
100単位／mg、以下GODと略す）をイオン交換水
に溶解後、スプレーで微小な水滴としてドライア
イスに冷却された−70℃のｎ−ヘキサン中に吹き
込み急速凍結を行つて、GODを含有する微小な
氷塊を生成せしめた。この氷塊を手早くブフナー
ロートで別して回収した。この氷塊約50gr及び
ｎ−ヘキサン約65grを冷却された二塩化メチレン
200gr中に加えて氷塊スラリーを調整した。この
スラリーを別途調整した3.0重量％のセルロース
トリアセテート（以下CTAと略す）を溶解した
−20℃の二塩化メチレン400gr中に急速撹拌下で
徐々に加えて氷塊を分散したCTAのドープを調
整した。このドープを−40℃付近まで冷却して粘
度を調整した。

一方、ポリウレタンコートした直径300μに白
金線の先端を、白金線の長さ方向に直角になるよ
うにして、鋭利なナイフで切断し、白金の新しい
断面を露出させた。この白金線の先端を98％ギ酸
にCTA濃度5.0重量％に溶解したCTAギ酸溶液の
液面に接触させ、白金線の先端断面にCTAのギ
酸溶液を付着させたのち常温のイオン交換水中に
浸漬し、脱溶剤を行つた。この操作を３回繰り返
し行い、白金線の先端にCTAの多孔質膜を形成
させた。この膜は膜厚約15μｍ、平均孔径0.5μｍ
であつた。

このCTA多孔質膜で被覆処理された白金線を
上記GODの氷塊を分散したCTAドープに浸漬
し、白金線のCTA多孔質膜上に該ドープを付着
せしめ、ついで冷却されたトルエン浴中でCTA
を凝固させた。

この付着操作を５回繰り返し、白金先端の
CTA多孔質膜上に氷塊を包括したCTA凝固膜を
形成させた。この凝固膜に含浸されているトルエ
ンを冷却されたｎ−ヘキサンで抽出除去し、つい
で冷却されたエタノールでｎ−ヘキサンを抽出除
去し、この後、該白金線をＭ／10リン酸緩衝液
（PH7.0）に浸漬し、凝固膜内に包括されている氷
塊を融解せしめ、平均150μｍのCTA膜で被覆さ
れた白金酵素電極を得た。

この固定化GOD白金電極及び銀／塩化銀電極
を温度37.0℃のＭ／10リン酸緩衝液（PH7.2）100
ml中に浸漬し、スターラーによる撹拌下にて印加
電圧−0.6Vで酸素の電解電流値を求め、ついで
グルコースを1.0重量％溶解したＭ／10リン酸緩
衝液（PH7.2）を１mlずつ添加し、各グルコース
濃度における酸素の電解電流値を測定した。その
結果、グルコース濃度（０mg／100ml〜500mg／
100ml）と電解電流値との間に直線関係が存在し、
グルコース測定電極として使用できることが判明
した。又乳酸１重量％、アルブミン４重量％を含
むＭ／10リン酸緩衝液（PH7.2）を用いて上記と
同様の手法により、グルコール濃度と酸素の電解
電流値との関係を求めたところ、上記と同一の結
果を得た。

更に、この電極を用いて１回／日、６ケ月間に
わたり、グルコース濃度を測定した結果、この酵
素電極の活性低下率は３％であつた。なおこの電
極のスターラー撹拌によるノイズは約２％であ
り、安定化までの時間は約20秒であつた。

実施例 ２ 実施例１と同様の手法により新しい白金断面を
露出させた直径300μのポリウレタンコート白金
線の先端に実施例１のCTA5％ギ酸溶液を接触さ
せ、断面先端にCTAギ酸溶液を付着させたのち、
約60℃のイオン交換水中でCTA膜を再生させた
のち、再び上記CTAギ酸溶液に接触させ、常温
でわずかに風乾した後、約50℃のイオン交換水中
に浸漬させ白金線の先端にCTAの多孔質膜を形
成させた。この多孔質膜は、走査型電子顕微鏡観
察の結果、二層構造からなり、内層は膜厚約
20μ、平均孔径約3.5μ、最外層は膜厚約8μ、平均
孔径約0.3μであつた。

上記方法により調整したCTA多孔質膜で被覆
された白金線を、実施例１で用いたGODを含む
氷塊を分散したCTAドープを用い、実施例１と
同様の手法により、CTA多孔質膜の表面にGOD
を包括固定した白金酵素電極を得た。この白金線
電極の膜厚は約180μであつた。この固定化GOD
白金電極を用い、実施例１と同様の手法でグルコ
ース濃度（０mg／100ml〜500mg／100ml）と酸素
の電解電流値との関係を求めた結果、直線関係が
存在し、グルコース測定用電極として使用できる
ことが判明した。

なお、この電極は実施例１の電極に比べ、スタ
ーラー撹拌によるノイズの影響が約1.5％と低く、
安定化までの時間が約15秒と短縮できた。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の生物化学センサーの一具体例の断
面図である。 １……高分子多孔質膜、２……絶縁体、３……
貴金属電極、４……固定化酵素膜等。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 貴金属線からなる分離型電極の電極表面に直
   接高分子多孔質膜が被覆され、該多孔質膜表面に
   直接固定化酵素膜又は固定化微生物膜が被覆され
   てなり、該電極と高分子多孔質膜と固定化酵素膜
   又は固定化微生物膜が一体構造をなしていること
   を特徴とする生物電気化学センサー。 ２ 高分子多孔質膜が孔径20Å以上3μｍ以下の
   空孔を有する特許請求の範囲第１項記載の生物電
   気化学センサー。 ３ 高分子多孔質膜が孔径20Å以上1μｍ以下の
   空孔を有する薄い緻密層からなる外層（固定化酵
   素膜又は固定化微生物膜と接触する側）と、これ
   に連続して一体化した孔径1μｍ以上の空孔を有
   する内層（電極と接触する側）からなる特許請求
   の範囲第１項記載の生物電気化学センサー。 ４ 予め高分子多孔質膜で被覆した、貴金属線か
   らなる分離型電極の電極表面を、酵素又は微生物
   を含有した氷塊と水不溶性高分子物質を溶解した
   有機溶媒との混合物で被覆した後、有機溶媒を除
   去することを特徴とする生物電気化学センサーの
   製造法。 ５ 高分子多孔質膜が孔径20Å以上3μｍ以下の
   空孔を有する特許請求の範囲第４項記載の生物電
   気化学センサーの製造法。 ６ 高分子多孔質膜が孔径20Å以上1μｍ以下の
   空孔を有する薄い緻密層からなる外層と、これに
   連続して一体化した孔径1μｍ以上の空孔を有す
   る内層からなる特許請求の範囲第４項記載の生物
   電気化学センサーの製造法。