JPS645251B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電極表面に固定された酵素又は微生
物を有する新規な生物電気化学センサーの製造法
に関するものであり、更に詳しくは、酵素又は生
きた微生物を水不溶性高分子物質で包括した固定
化酵素膜又は固定化微生物膜で電極表面を直接被
覆した生物電気化学センサーの製造法に関するも
のである。

近時生物の持つ反応特異性と電気化学デバイス
を組み合せた生物電気化学センサーの開発が行な
われ、特に医療分野に於て、その基質選択性、微
量反応性等から、臨床検査手法の変革を可能にす
るものとして注目されている。

そして、既にアンペロメトリー、ポテンシオメ
トリーの両電極反応を基本とする酵素電極による
生体成分定量法、さらにバイオアツセイ法を応用
した微生物電極による微量成分定量法等の提案が
なされている。

しかしながら、従来提案されている酵素固定化
方法あるいは微生物固定化方法（以下両者併せて
固定化方法と略す）では被固定化物の継続的溶
出、失活、立体構造の変化、比活性が低い、基質
通過が困難等々の欠点があり固定方法によつて
は、分子量の制限によつて固定化できないものも
あり、その発展が停滞している。又一方従来の生
物電気化学センサーは、電極表面に別に作成した
酵素あるいは微生物の固定膜を被覆するものであ
り、その取扱いが煩雑であり、さらに電極の微小
化が難かしい等の問題点もあつた。

本発明者らは、これらの点に鑑み、酵素、微生
物を自由に選択でき、かつ電極表面を固定化膜で
直接被覆する方法について検討した結果、本発明
に達したものである。

固定化方法の中でも包括法と称される方法は被
固定化物の活性を低下せしめることの少ない方法
として多く用いられている。酵素や微生物を水不
溶性高分子物質で包括して固定化する方法とし
て、水溶性単量体あるいは水溶性高分子物質と水
溶性架橋剤を酵素あるいは微生物とともに水に溶
解せしめたのち、これを過硫酸カリ等の重合触媒
あるいはγ線等の放射線で重合をおこさせると同
時に架橋構造を与え、生成した水不溶性高分子ゲ
ル中に酵素や微生物を包括する方法とか、水不溶
性単量体あるいは水不溶性高分子物質が溶解して
いる有機溶媒中に酵素や微生物を含有する水溶液
を微小な水滴として分散せしめたのち重合を行な
わしめたり、あるいは水不溶性高分子物質を溶解
している有機溶媒を除去したりしてこの水滴を水
不溶性高分子物質で包括する方法などが知られて
いる。

しかしながら、これら従来の方法は次のような
欠点を有するものである。即ち、酵素や微生物は
一般に水中においては比較的安定であるが有機溶
媒中では不安定であり、従来の方法では包括材料
としては水溶性のものが多い。水溶性の材料を用
いる場合には、重合や架橋などによつて水溶性の
材料を不溶性にする操作が必要であり、それらの
操作によつて酵素や微生物の変質は免れない。又
包括材料として水不溶性高分子物質を用いようと
すると、これらを溶解するために、有機溶媒を用
いる必要があり、有機溶媒により酵素が失活した
り微生物が死滅したりする場合が多い。本発明者
の一人である崎前らは、これら従来の方法がもつ
欠点を解決すべく研究し、有機溶媒中で酵素や微
生物を水不溶性高分子物質で安定に包活する方法
に関し、いくつかの提案を行つた（特開昭54−
105289、特開昭55−135591）。更にその賦形方法
として、固体構造物の表面を酵素又は微生物を包
括した水不溶性高分子物質で被覆することにより
機械的強度が優れ、しかも固体構造物の形状に合
わせた各種の成型された薄膜状の固定化酵素又は
固定化微生物が容易に製造できることを見い出し
た。

本発明者らは、その方法を応用して電極表面に
直接酵素又は微生物を固定化せしめた生物電気化
学センサーが、その活性、耐久性及び応用性に優
れた性能を有することを見出し本発明に到達し
た。

即ち本発明の要旨とするところは、酵素又は微
生物を含有した氷塊と水不溶性高分子物質を溶解
した有機溶媒との混合物で白金線からなる電極の
表面を被覆したのち、有機溶媒を除去することを
特徴とする、電極表面に、水不溶性高分子マトリ
ツクス中に包括された酵素又は微生物が該高分子
マトリツクスを介して直接被覆されてなる生物電
気化学センサーの製造法にある。

本発明の電気化学センサーの特徴は図ａ，ｂに
示したごとく電極１の表面に水不溶性高分子マト
リツクス２に包括された酵素又は微生物３が、該
高分子マトリツクス２を介して電極表面に直接被
覆されていることである。４は電極表面を被覆し
ている絶縁体である。

即ち、従来の固定化酵素を用いた電極は、たと
えば特開昭54−102193号明細書第２図に示されて
いるごとく、固定化酵素膜を一旦別途成形し、こ
の膜を電極表面に被覆する方法がとられている。

このような方法による場合、電極が白金線のよ
うな細いものである場合、被覆時に膜が破れたり
して非常な困難を伴なう。一方本発明の電極で
は、酵素の固定化と電極への固定化酵素膜の被覆
が製造時に一体化して行なわれるため、非常に微
小な電極表面にも被覆が可能であり、さらに製造
条件の適当な選択により、被覆膜の厚みや多孔度
を任意に選択出来る。特に白金線を電極として用
いた場合、検出される電流値は安定したものとな
り好ましい結果を与える。上記のように電極へ一
体固定化されたものは、測定時に固定化酵素膜の
脱落が起りにくく外部溶液への浸漬による使用は
もちろん、生体組織内へ挿入して測定する場合、
安全に使用出来るものである。

酵素又は微生物を包括した高分子マトリツクス
は、多孔質のものが好ましく、被測定溶液中の基
質が十分な速度で透過出来るものでなければなら
ない。高分子マトリツクスの膜厚は薄い程好まし
いが強度との関連で20〜300μｍの範囲が好まし
い。

本発明で使用される酵素は動植物組織から得ら
れたものでも、あるいは微生物が産生したもので
も、その供給源を問わず使用できる。

また酵素は精製されたものでも未精製のもの例
えば酵素含有組織のホモジネートや微生物細胞の
ようなものでも差しつかえない。

本発明で使用される酵素は特に制限されない
が、例えば特開昭54−105289号に記載されたグル
コースオキシターゼなどの酸化還元酵素、アスパ
ラギン酸トランスカルバミラーゼなどの転移酵
素、アミラーゼ、ウレアーゼなどの加水分解酵素
等各種酵素が全て使用されうる。

又、本発明で使用されうる微生物はカビ、酵
母、細菌、放線菌、不完全菌に分類される微生物
であり、その種類は特に制限されないが、例えば
特開昭55−135591号に記載された各種の微生物が
全て使用されうる。

これらの微生物は栄養培地で生育せしめられた
のち、生きた状態で使用されうる。ここに生きた
状態とは微生物が自己再生能力を有することであ
り、微生物の生育に適する環境下で培養すること
により確認することができる。

本発明で使用される酵素又は微生物を含有する
氷塊は、上記の酵素や微生物を含有する水溶液を
０℃以下に凍結し、氷塊の内部にこれらを包含せ
しめたものである。この氷塊は酵素や微生物を含
有する水溶液を深冷された雰囲気中に分散せしめ
ると同時に急速凍結を行ない調製することができ
る。深冷された雰囲気としては、冷却されたガス
あるいは液いずれでもよいが、好ましくは液状の
冷却媒体を用いるのがよい。

液状の冷却媒体としては、凝固点が０℃以下の
液状物、例えばメタノール、エタノール、アセト
ン、酢酸エチル、二塩化メチレン、クロロホル
ム、四塩化炭素、エチルエーテル、テトラヒドロ
フラン、トルエン、ｎ−ヘキサン、石油エーテ
ル、液体窒素、液体酸素などであり、これらを冷
却するには蒸発熱を利用したり、ドライアイス等
を投入して直接冷却するか、又は冷凍機などによ
り間接に冷却する方法などがとられる。

酸素又は微生物を含有する水溶液を液状冷却媒
体を用いて凍結するに際しては、これらを含有す
る水溶液を容器等に入れて間接的に凍結してもよ
く、又液状冷却媒体中で直接凍結させてもよい。

冷却媒体中で直接凍結する場合においては、酵
素の失活あるいは微生物の死滅を極力抑えるため
に、冷却媒体の温度をできるだけ低温にし、更に
水溶液を噴霧器などを用いて、微小水滴下して急
速凍結することが望ましい。又微小水滴化する為
に予め、酵素あるいは微生物の水溶液を必要なら
ば界面活性剤を用いて、ｎ−ヘキサン、石油エー
テル等の飽和炭化水素系の溶媒に分散させておい
てもよい。

本発明で使用される氷塊は、酵素や微生物以外
に次の物質を共含したものでもよい。例えばポリ
ビニルアルコール、ポリエチレングリコール、タ
ンパク質、核酸、多糖等の水溶性高分子物質、グ
リセリン等の多価アルコール類、ジメチルスルホ
オキサイド等の極性有機溶媒、シヨ糖、乳糖など
の少糖類、グルタミン酸、アスパラギン酸等のア
ミノ酸類、α−ケトクルタール酸、リンゴ酸等の
有機酸、マグネシウム、マンガン、コバルト、カ
ルシウム等の金属塩類、粉末活性炭、珪藻土、ラ
テツクス等の微小な固形物が挙げられる。その他
特に酵素の場合は該酵素の基質、反応生成物、補
酵素なども共含してもよい。これらの物質は主に
固定化操作中における酵素や微生物の保護、ある
いは固定化後の製品の物性改良を目的として使用
されるのであり、酵素や微生物を含有する水溶液
に加えられたのち、急速凍結されて氷塊中に共含
せしめられる。

本発明で使用される水不溶性高分子物質とは有
機溶媒に溶解し水に不溶な高分子量の重合体であ
り、０℃以下の有機溶媒にわずかでも溶解するも
のならばすべて本発明に使用できるが、好ましく
は０℃以下の有機溶媒に0.1重量％以上溶解する
水不溶性高分子物質が適当である。ここで水不溶
性高分子物質が有機溶媒に溶解するとは水不溶性
高分子物質が有機溶媒と相分離を起こさない濃度
で有機溶媒と均一に混合していることである。

本発明で使用される代表的な水不溶性高分子物
質としてはポリアクリロニトリル、ポリアクリル
酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリス
チレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ
カーボネートなどのホモポリマーまたはこれらホ
モポリマーを構成する単量体を成分とするような
コポリマー、あるいは酢酸セルロース、エチルセ
ルロースのようなセルロース誘導体などである
が、もちろんこれだけに限定されるものではな
い。これらの水不溶性高分子物質を０℃以下で
0.1重量％以上溶解する有機溶媒は０℃以下で液
体で存在するもののなかから選ばれ、例えばメタ
ノール、エタノール、プロパノール、アセトン、
メチルエチルケトン、酢酸エチル、二塩化メチレ
ン、クロロホルム、四塩化炭素、エチルエーテ
ル、トルエン、キシレン、ｎ−ヘキサン、石油エ
ーテル、テトラヒドロフラン、シクロヘキサン、
Ｎ，N′−ジメチルホルムアミド、Ｎ，N′−ジメ
チルアセトアミド、γ−ブチロチクトン、アセト
ニトリルなどが好ましく使用されるが、もちろん
これらに限定されるものではない。水不溶性高分
子物質はこれらの有機溶媒に溶解せしめられたの
ち、０℃以下に冷却されて使用される。

酵素又は微生物を含有した氷塊と水不溶性高分
子物質を溶解した有機溶媒との混合物とは、氷塊
を水不溶性高分子物質を溶解した０℃以下の有機
溶媒中に懸濁状態で分散せしめたものである。分
散せしめるにあたつては水不溶性高分子物質を溶
解した有機溶媒に別途調製した氷塊を加えて急速
撹拌などにより懸濁状に分散せしめてもよく、ま
た冷却下の水不溶性高分子物質を溶解した有機溶
媒中に酵素又は微生物を含有する水溶液を微小水
滴として直接分散させて急速凍結しこれらを含有
する氷塊を生成させてもよい。

氷塊を有機溶媒に均一に分散させるためには氷
塊の粒径が小さい程効果的であり氷塊の大きさと
して直径が１mm以下のものを使用することが好ま
しい。又一旦分散された氷塊を有機溶媒中で安定
に維持するためには、氷塊分散時に氷塊とともに
該水不溶性高分子物質の非溶媒を適当量加えても
よい。特に氷塊の比重と水不溶性高分子物質を溶
解した有機溶媒との比重が異なる場合は、一旦分
散された氷塊は撹拌を停止すると有機溶媒と分離
してしまう。

このような場合には非溶媒を加えることにより
氷塊を有機溶媒中に安定に分散せしめることがで
きる。氷塊とともに該水不溶性高分子物質の非溶
媒を加えるときは、氷塊を該水不溶性高分子物質
の非溶媒に一旦スラリー化したのち、このスラリ
ーを水不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒中に
急速撹拌下で加えれば良い。この場合、氷塊は非
溶媒とともに水不溶性高分子物質を溶解した有機
溶媒中に分散されるため、氷塊の周辺で水不溶性
高分子物質が凝固し、更にこの凝固した水不溶性
高分子物質が過剰の有機溶媒になかば溶解された
状態が形成され、その結果氷塊は水不溶性高分子
物質を溶解した有機溶媒中に安定に分散される。
更に又、これをより効果的に行なうために氷塊中
にポリビニルアルコール、ポリエチレングリコー
ル等の水溶性高分子物質あるいはグリセリン、エ
チレングリコール等の多価アルコールなどを共含
させることもできる。氷塊の分散性の向上を目的
として使用される非溶媒は水不溶性高分子物質を
溶解せず０℃以下で液状の溶媒であり、水不溶性
高分子物質を溶解した有機溶媒と混和するものか
ら選ばれる。

本発明はかくして得られた酵素又は微生物を含
有した氷塊と水不溶性高分子物質を溶解した有機
溶媒との混合物であるドープを電極先端に付着せ
しめた後、該ドープから有機溶剤を除去せしめ、
水不溶性高分子マトリツクス中に酵素或いは微生
物を固定化した膜を電極表面に直接形成せしめる
ものである。この電極先端を前記の氷塊を含む混
合物で被覆せしめるときは、例えば電極先端を氷
塊と水不溶性高分子物質を含む有機溶媒との混合
物中に浸漬したり、あるいは該電極の表面に該混
合物を塗布したりすることにより電極先端の表面
を混合物で被覆することができる。これらの操作
は連続的でも回分的でも可能である。次いで電極
先端表面を被覆した混合物から有機溶剤を除去す
るには、減圧下で有機溶媒を蒸発させてもよく、
あるいは水不溶性高分子物質の非溶媒中で凝固さ
せるなどの方法によつてもよい。電極としては一
般に白金などの貴金属が用いられる。

酵素や微生物は氷の内部に包含されている間は
有機溶媒が共存しても安定であるが、氷が融解す
ると有機溶媒による酵素の失活あるいは微生物の
死滅が起こる危険性があるため氷が融解する前に
包括物から有機溶媒を除去することが好ましい。

このようにして有機溶媒を除去した氷の包括物
は、そのまま冷凍保存し使用前に融解して固定化
酵素あるいは固定化微生物として用いることがで
きるが、更にこのものを真空凍結乾燥装置等を用
いて凍結乾燥することにより保存や輸送に便利な
形態とすることができる。

本発明は、電極先端の表面に直接酵素や微生物
を包括した水不溶性高分子物質を形成させるとい
う全く新規な生物電気化学センサーの製造方法を
提供するものである。従来法が酵素又は微生物を
有機溶媒中に安定に存在せしめた状態で包括を行
なつていないため、既に述べたような種々の欠点
が生じるのに対し、本発明によればこれら従来の
欠点は解決され、現在工業的に汎用されている各
種の水不溶性高分子物質の使用が可能になり、固
体の構造体に支持された機械的強度の優れた固定
化酵素膜又は固定化微生物膜を有する生物電気化
学センサーが容易に製造できる利点を有する。更
に又、本発明は電極先端表面に薄膜状に酵素や微
生物を包括した水不溶性高分子物質膜を形成させ
るため反応に関与する物質の透過性が著しく改善
された効率のよい生物電気化学センサーが酵素、
微生物の種類によらず自由に再現性よく得られる
利点も有する。又包括法によるため得られたセン
サーの活性の発現性、耐久性が高い。

さらに本発明の方法の応用により基質電極、免
疫センサー、酵素サーミスター等の生物電気化学
センサーの開発も可能となつた。

以下実施例により具体的に説明する。

実施例 １ グルコースオキシダーゼ（ベーリンガー社製約
100単位／mg）をイオン交換水に溶解後、スプレ
ーで微小な水滴としてドライアイスに冷却された
−70℃のｎ−ヘキサン中に吹き込み急速凍結を行
つて、グルコースオキシダーゼを含有する微小な
氷塊を生成せしめた。この氷塊を手早くブフナー
ロートで別して回収した。この氷塊約50ｇｒ及
びｎ−ヘキサン約65ｇｒを冷却された二塩化メチ
レン200ｇｒ中に加えて氷塊スラリーを調整した。
このスラリーを別途調整した3.0重量％のセルロ
ーストリアセテートを溶解した−20℃の二塩化メ
チレン400ｇｒ中に急速撹拌下で徐々に加えて氷
塊を分散したセルローストリアセテートのドープ
を調整した。このドープを−40℃付近まで冷却し
て粘度を調整した。

ポリウレタンコートした直径300μの白金線の
先端を白金線の長さ方向に直角になるように鋭利
なナイフで切断し、新しい白金断面を形成せし
め、該白金線断面をドープに接触させ、白金線の
先端にドープを付着せしめ、ついで冷却されたト
ルエン浴中でセルローストリアセテートを凝固さ
せた。

この付着操作を３回繰り返し、白金先端を氷塊
を包括したセルローストリアセテート凝固膜で被
覆せしめた。この凝固膜に含浸されているトルエ
ンを冷却されたｎ−ヘキサンで抽出除去し、つい
で減圧下でｎ−ヘキサンを蒸発除去した。この
後、該白金線をＭ／10リン酸緩衝液（PH7.0）に
浸漬し、凝固膜内に包括されている氷塊を融解せ
しめて、平均100μｍの厚みを有するセルロース
トリアセテート膜で被覆された白金酵素電極を得
た。

この固定化グルコースオキシダーゼ白金電極及
び銀／塩化銀電極を温度37℃のＭ／10リン酸緩衝
液（PH7.0）100ml中に浸漬し、スターラーによる
撹拌下にて、印加電極圧−0.6Vで酸素の電解電
流値を求め、ついでグルコースを1.0重量％溶解
したＭ／10リン酸緩衝液（PH7.0）を１mlずつ加
え、各グルコース濃度における酸素の電解電流値
を測定した。

その結果、グルコース濃度（０mg／100ml〜500
mg／100ml）と電解電流値との間に直線関係が存
在し、グルコース測定用電極として使用できるこ
とが判明した。この酵素電極を１回／日、６ケ月
間にわたり、グルコース濃度を測定した結果、こ
の酵素電極の活性低下率は３％であつた。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の生物電気化学センサーの一具体例
である。 １……電極、２……高分子マトリツクス、３…
…酵素又は微生物、４……絶縁体。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酵素又は微生物を含有した氷塊と水不溶性高
   分子物質を溶解した有機溶媒との混合物で白金線
   からなる電極の表面を被覆したのち、有機溶媒を
   除去することを特徴とする、電極表面に、水不溶
   性高分子マトリツクス中に包括された酵素又は微
   生物が該高分子マトリツクスを介して直接被覆さ
   れてなる生物電気化学センサーの製造法。