JPH0350759B2

JPH0350759B2 -

Info

Publication number: JPH0350759B2
Application number: JP58001495A
Authority: JP
Inventors: Mitsuaki Yoshida; Haruo Sugano; Fumio Shimizu; Kenichi Imagawa
Original assignee: GAN KENKYUKAI; OOTSUKA SEIYAKU KK
Current assignee: GAN KENKYUKAI; OOTSUKA SEIYAKU KK
Priority date: 1983-01-07
Filing date: 1983-01-07
Publication date: 1991-08-02
Also published as: JPS59128366A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒト白血病ウイルス（Adult Ｔ−
cell leukemia Virus；ATLV又はHumanT−
cell leukemia Virus；HTLV）に関連する新規
なペプチドであり、これはかかるウイルス感染な
らびに成人Ｔ細胞白血病、皮膚型Ｔ細胞リンパ腫
などの成熟Ｔ細胞白血病・リンパ腫に関連するペ
プチドでもある。本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護
基、活性基、核酸塩基、その他に関して略号で表
示する場合はIUPAC、IUBの規定或いは当該分
野における慣用記号に従うものとし、その例を次
に挙げる。またアミノ酸等に関して光学異性体が
ありうる場合は、特に明記しなければＬ体を示す
ものとする。 Ser；セリン Leu；ロイシン Thr；スレオニン Asn；アスパラギン Gln；グルタミン Glu；グルタミン酸 Lys；リジン Pro；プロリン Val；バリン Trp；トリプトフアン His；ヒスチジン Asp；アスパラギン酸 Gly；グリシン Ile；イソロイシン Ala；アラニン Tyr；チロシンＡ；アデニンＴ；チミンＧ；グアニンＣ；シトシン Tos；ｐ−トルエンスルホニル基 Boc；第３級ブトキシカルボニル基 ONP；ｐ−ニトロフエノキシ基 Bzl；ベンジル基 OBzl；ベンジルオキシ基 Cl₂−Bzl；２，６−ジクロルベンジル基 Cl−Ｚ；２−クロルベンジルオキシカルボニル基ヒト白血病ウイルスは、成人Ｔ細胞白血病
（ATL）より分離され、該疾患との関連が注目さ
れているウイルスである。本発明者の吉田、菅野
は、遺伝子工学的手法をもちい、宿主細胞の
DNAに組込まれたプロウイルス遺伝子をクロー
ニング（cloning）し、その全塩基配列を決定し
た。これに基づいて該疾患ならびに該ウイルス感
染の診断・治療・予防の基礎を確立し、さきに特
許申請を行なつた。本発明は、上記の基礎的な情報を基にし完成さ
れたものであり、該ウイルス感染の診断を目的と
した該ウイルス関連ペプチド、ならびにそれ等に
対する特異抗体の作製と測定法に関する。決定さ
れた上記ウイルス遺伝子のコア（ギヤグ）蛋白前
駆体をコードする塩基配列を下記第１表に示す。

【表】

〔反応行程式−１〕

Ａ−Leu−OH (イ) ↓ Ａ−Leu−R¹ (ロ) ↓ Ｈ−Leu−R¹ (ハ) ↓Ａ−Val−OH (ニ) Ａ−Val−Leu−R¹ (ホ) ↓↓↓ Ａ−Tyr−Val−Glu−Pro−Thr−Ala −Pro−Gln−Val−Leu−R¹ (ヘ) ↓ Ｈ−Tyr−Val−Gll−Pro−Thr−Ala Pro−Gln−Val−Leu−OH (1) 〔式中Ａはアミノ基の保護基及びR¹は不溶性担
体を示す。〕上記において、Ａの好ましいものとしては
Boc、ベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキ
シベンジルオキシカルボニル基等を、またR¹の
好ましいもとしてはクロロメチル化ポリスチレン
等をそれぞれ例示することができる。また、各反応において、使用するアミノ酸が反
応に関与しない側鎖官能基を有する場合は、常法
どうり、前述した保護基により、保護され、これ
は不溶性担体R¹の脱離と同時に脱離される。上記方法において、アミノ酸(イ)と不溶性担体
R¹との反応は、常法に従いアミノ酸(イ)の反応体
カルボキシル基を利用してこれをR¹と結合させ
ることによつて行なわれる。該反応は例えばクロ
ロメチル化ポリスチレンを使用する場合は適当な
溶媒中、例えばトリエチルアミン、カリウムtert
−ブトキシド、炭酸セシウム、水酸化セシウム等
の塩基性化合物の存在下に行なわれる。溶媒とし
ては例えばジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド等又はこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。上記反応は、通常０〜85℃、好ましくは25
〜80℃程度、数分〜24時間程度で終了する。アミ
ノ酸と不溶性担体との使用割合は通常後者１当量
に対して前者を過剰量、一般に１〜３倍当量とす
るのがよい。かくして得られる一般式(ロ)の固相化アミノ酸の
保護基Ａの脱離反応は、常法により行なわれる。
該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒
等の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金
属ナトリウムによる還元等の還元的方法、トリフ
ルオロ酢酸、塩化水素酸、弗化水素、メタンスル
ホン酸、臭化水素酸等の強酸によるアシドリシス
等を例示することができる。上記触媒を用いる水
素添加は、例えば水素圧１気圧、０〜40℃にて行
ない得る。触媒の使用量としては通常100mg〜１
ｇ程度とするのがよく、一般に１〜48時間程度で
反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶
媒下、通常０〜30℃程度、好ましくは０〜20℃程
度で約15〜１時間程度を要して行なわれる。酸の
使用量は原料化合物に対し通常５〜10倍量程度と
するのがよい。該アシドリシスにおいて保護基Ａ
のみを脱離する場合は酸としてトリフルオロ酢酸
又は塩化水素酸を使用するのが好ましい。更に上
記液体アンモニア中金属ナトリウムによる還元
は、反応液がパーマネントブルーに30秒〜10分間
程度呈色しているような量の金属ナトリウムを用
い、通常−40℃〜−70℃程度にて行ない得る。次いで得られる一般式(ハ)の固相化アミノ酸とア
ミノ酸(ニ)（もしくはそのカルボキシル基の活性化
されたもの）との反応は、溶媒の存在下に行なわ
れる。該溶媒としては、ペプチド縮合反応に慣用
される公知の各種のもの、例えば無水ジメチルホ
ルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、
ピリジン、クロロホルム、ジオキサン、ジクロロ
メタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ−
メチルピロリドン、ヘキサメチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等を例示することがで
きる。また該反応は、必要に応じて、通常のペプ
チド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，
Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、
Ｎ−エチル−N′−ジメチルアミノカルボジイミ
ド、１−エチル−３−ジイソプロピルアミノカル
ボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−モ
ルホリニル−４−エチル）カルボジイミド等のカ
ルボジイミド類等の脱水縮合剤の存在下に行なう
ことができる。アミノ酸(ハ)とアミノ酸(ニ)との使用
割合としては、特に限定はないが、通常前者に対
して後者を等モル量〜10倍モル量、好ましくは等
モル量〜５倍モル量とするのがよい。脱水縮合剤
の使用量も特に限定はなく、通常アミノ酸(ニ)に対
して、好ましくは等モル量程度使用される。反応
温度はペプチド結合形成反応に使用される通常の
範囲、一般には約−40℃〜約60℃、好ましくは約
−20℃〜約40℃の範囲から適宜選択される。反応
時間は一般に数分〜30時間程度とされる。かくして得られる一般式(ホ)のペプチドは、上記
と同様に保護基Ａの脱離後、一般式(1)で表わされ
るアミノ酸配列に従い、Ａ−Gln−OH、Ａ−Pro
−OH、Ａ−Ala−OH、Ａ−Thr−OH、Ａ−
Pro−OH、Ａ−Glu−OH、Ａ−Val−OH、Ａ−
Tyr−OHの各アミノ酸もしくはそのカルボキシ
基の活性化されたものと順次縮合反応させること
により行なわれ、斯くして一般式(ヘ)で表わされる
ペプチドに誘導することができる。これら縮合反
応及び保護基Ａの脱離反応は、それぞれ前記した
方法と同様にして行なわれる。また得られるペプチド(ヘ)は、同様にして保護基
Ａの脱離、アミノ酸の側鎖官能基の保護基の脱離
及び不溶性担体R¹の脱離により、式(1)で表わさ
れるペプチドに誘導される。ここで側鎖官能基の
保護基及び不溶性担体R¹の脱離反応は、保護基
Ａの脱離反応と同様に行ない得、この場合酸とし
て弗化水素又は臭化水素酸を用いるのが好まし
い。尚、上記方法において使用される各アミノ酸
は、いずれも公知の市販品でよい。以上のようにして製造された式(1)の本発明ペプ
チドは、反応混合物からペプチドの分離手段例え
ば抽出、分配、カラムクロマトグラフイー等によ
り単離精製される。かくして得られる本発明のペプチドは、これに
¹²⁵I、¹³¹I等の放射性物質、パーオキシダーゼ
（POX）、キモトリプシノーゲン、プロカルボキ
シペプチダーゼ、グロセロルデヒド−３−リン酸
脱水素酵素、アラミーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−
Nase、Ｐ−Nase、β−ガラクトシダーゼ、グル
コース−６−フオスフエートデハイドロゲナー
ゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の各種酵素
試薬等を導入することにより、ラジオイムノアツ
セイ（RIA）法又はエンザイムイムノアツセイ
（EIA）法において用いられる標識抗原として利
用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方法
により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロ
ラミンＴを用いる酸化的ヨード化法〔W.M.
Hunter and F.C.Greenwood；Nature，194、
495（1962）、Biochem J.89、144、（1963）参照〕
等により行なわれ、酵素試薬の導入は、通常のカ
ツプリング法例えばエルランガー（B.F.
Erlanger）らの方法〔Acta.Endocrinol.Suppl、
168、206（1972）〕及びカロール（M.H.Karol）
らの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.、U.S.A.、57、
713（1967）〕等の公知の方法によつて行なうこと
ができる。以下、本発明のペプチドをハプテンとして利用
した抗原の製造方法につき詳述する。上記抗原は本発明ペプチドをハプテンとし、こ
れをハプテン−担体結合試薬の存在下に、適当な
担体と反応させることにより製造される。上記に
おいてハプテンに結合される担体としては、通常
抗原の作成に当り慣用される高分子の天然もしく
は合成の蛋白質を広く使用できる。該担体として
は例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツ
ジ血清アルブミン等の動物の血清アルブミン類；
馬血清グロブリン、牛血清グロブリン、ウサギ血
清グロブリン、人血清グロブリン、ヒツジ血清グ
ロブリン等の動物の血清グロブリン類；馬チログ
ロブリン、牛チログロブリン、ウサギチログロブ
リン、人チログロブリン、ヒツジチログロブリン
等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグロブリ
ン、牛ヘモグロブリン、ウサギヘモグロブリン、
人ヘモグロブリン、ヒツジヘモグロブリン等の動
物のヘモグロブリン類；キーホールリンペツトヘ
モシアニン（KLH）等の動物のヘモシアニン
類；同虫より抽出された蛋白質（アスカーリス抽
出物、特絵昭56−16414号公報、J.Immun.、111、
260〜268（1973）、J.Immun.、122、302〜308
（1979）、J.Immun.、98、893〜900（1967）及び
Am.J.Physiol.、199、575〜578（1960）に記載さ
れたもの又はこれらを更に精製したもの）；ポリ
リジン、ポリグルタミン酸、リジン−グルタミン
酸共重合体、リジン又はオルニチンを含む共重合
体等を挙げることができる。ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の
作成に当り慣用されているものを広く使用でき
る。具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプト
フアンを架橋結合させる、例えばビスジアゾタイ
ズドベンジジン（BDB）、ビスジアゾタイズド−
３，3′−ジアニシジン（BDD）等のジアゾニウ
ム化合物；アミノ基とアミノ基とを架橋結合させ
る、例えばグリオキサール、マロンジアルデヒ
ド、グルタールアルデヒド、スクシンアルデヒ
ド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデヒド
類；チオール基とチオール基とを架橋結合させ
る、例えばＮ，N′−ｏ−フエニレンジマレイミ
ド、Ｎ，N′−ｍ−フエニレンジマレイミド等の
ジマレイミド化合物；アミノ基とチオール基とを
架橋結合させる、例えばメタマレイミドベンゾイ
ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４
−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カ
ルボキシル−N′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル等のマレイミドカルボキシル−Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル類；アミノ基とカル
ボキシル基とをアミド結合させる通常のペプチド
結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ，Ｎ−
ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ−エチル−
N′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−エチ
ル−３−ジイソプロピルアミノカルボジイミド、
１−シクロヘキシル−３−（２−モリホリニル−
４−エチル）カルボジイミド等のカルボジイミド
類等の脱水縮合剤等を挙げることができる。また
上記ハプテン−担体結合試薬としては、ｐ−ジア
ゾニウムフエニル酢酸等のジアゾニウムアリール
カルボン酸類と通常のペプチド結合形成反応試
薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたものも使
用可能である。上記抗原の製造反応は、例えば水溶液もしくは
PH７〜10の通常の緩衝液中、好ましくはPH８〜９
の緩衝液中、０〜40℃、好ましくは室温付近で行
なわれる。該反応は通常約１〜24時間、好ましく
は３〜５時間で完結する。上記において用いられ
る代表的緩衝液としては、次のものを例示でき
る。 0.2N水酸化ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩
化カリウム緩衝液、 0.2M炭酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−0.2M塩化
カリウム緩衝液、 0.05M四ホウ酸ナトリウム−0.2Mホウ酸−
0.05M塩化ナトリウム緩衝液、 0.1Mリン酸二水素カリウム−0.05M四ウ酸ナ
トリウム緩衝液上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試
薬及び担体の使用割合は、適宜に決定できるが、
通常ハプテンに対して担体を１〜６倍重量程度、
好ましくは１〜５倍重量程度、及びハプテン−担
体結合試薬を５〜10倍モル程度用いるのがよい。
上記反応によりハプテン−担体結合試薬を仲介さ
せて担体とハプテンとが結合したペプチド−担体
複合体からなる所望の抗原が収得される。反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば
透析法、ゲル過法、分別沈澱法等により容易に
単離精製できる。斯くして得られる抗原は、通常蛋白質１モルに
対してペプチドが平均５〜60モル結合したもので
あり、いずれも引き続き該抗原に対して特異性の
高い抗体の製造を可能とするものである。該抗原による抗体の製造は、上記抗原を哺乳動
物に投与し、生体内に所望抗体を産生させ、これ
を採取することにより実施される。抗体の製造に供せられる哺乳動物としては、特
に制限はないが、通常ウサギやモルモツトを用い
るのが好ましい。抗体の産生に当つては、上記に
より得られる抗原の所定量を生理食塩水で適当濃
度に希釈し、フロインドの補助液（Complete
Freund′s Ajuvant）と混合して懸濁液を調整し、
これを哺乳動物体に投与すればよい。例えばウサ
ギに上記懸濁液を圧内注射（抗原の量として0.5
〜５mg／回）し、以後２週間毎に２〜10ケ月、好
ましくは４〜６ケ月間投与し免疫化させればよ
い。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与の１〜
２週間経過後、免疫化された動物から採血し、こ
れを遠心分離後、血清を分離することにより行な
われる。上記によれば、用いる抗原に対して優れ
た特異性を有する抗体を収得でき、これはRIA
法、EIA法等に利用してヒト白血病ウイルス関連
蛋白の定量に用い得る。以下本発明を更に詳しく説明するため、一般式
(1)で表わされる本発明ペプチドの製造例及びこれ
により得られるペプチドからの抗原及び抗体の製
造例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるも
のではない。尚、各製造例におけるRf値はシリカゲル上の
薄層クロマトグラフイーにて下記混合溶媒を用い
て測定したものである。 Rf¹……ｎ−ブタノール−酢酸−水
（４：１：５） Rf²……ｎ−ブタノール−酢酸−ピリジン−水
（15：３：10：12）＜ペプチドの製造＞製造例カリウム tert−ブトキシド5.88ミリ当量の
DMSO溶液14mlにBoc−Leu−OH1.54ｇを溶
解し、クロロメチル化ポリスチレン樹脂（財団
法人蛋白質研究奨励会）５ｇを加えて、80℃で
30分反応させる。樹脂をDMSO、50％酢酸／
クロロホルム、塩化メチレンの順に、充分に洗
浄し、減圧乾燥して5.06ｇのBoc−Leu−樹脂
を得る。一部を加水分解後アミノ酸分析を行なつた結
果アミノ酸0.30ｍmol／ｇ樹脂であつた。上記で得たBoc−Leu−樹脂2.17ｇをクロ
ロホルム30mlで３回洗浄後、50％トリフルオロ
酢酸（TFA）のクロロホルム溶液30mlに加え、
室温で20分間反応させる。樹脂をクロロホルム
30mlで１回、塩化メチレン30mlで５回、10％ト
リエチルアミンの塩化メチレン溶液30mlで３
回、次いで塩化メチレン30mlで６回それぞれ洗
浄してＨ−Leu−樹脂を得る。 Boc−Val−OHの0.35ｇを塩化メチレンに溶
かした溶液25mlに上記Ｈ−Leu−樹脂を加え、
次いでDCCの0.33ｇを塩化メチレンに溶かした
溶液５mlを加え室温で２時間反応させる。樹脂
を塩化メチレン30mlで６回洗浄後、Boc−Val
−OHの0.35ｇ及び１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール0.55ｇの塩化メチレン溶液25mlに加
え、次いでDCCの0.33ｇを塩化メチレンに溶か
した溶液５mlを加えて再度同様に反応させる
（二重カツプリング法）。樹脂を塩化メチレンで
充分に洗浄してBoc−Val−Leu−樹脂を得る。上記と同様にして、Boc−Val−Leu樹脂
の脱Boc化を行ない、次いで下記アミノ酸を順
次縮合及び脱Boc反応に付す。 Boc−Gln−ONP 0.59ｇ Boc−Pro−OH 0.35ｇ Boc−Ala−OH 0.31ｇ Boc−Thr（Bzl）−OH 0.50ｇ Boc−Pro−OH 0.35ｇ Boc−Glu（OBzl）−OH 0.55ｇ Boc−Val−OH 0.35ｇ Boc−Tyr（Cl₂−Bzl）−OH 0.71ｇ斯くしてＨ−Tyr（Cl₂−Bzl）−Val−Glu
（OBzl）−Pro−Thr（Bzl）−Ala−Pro−Gln−
Val−Leu−樹脂の2.65ｇを得る。このうち1.35
ｇをアニソール３ml及び弗化水素30mlに溶か
し、−20℃で30分、次いで０℃で30分反応させ
た後、弗化水素を留去し、残渣を10％酢酸にて
抽出し、エーテルにて洗浄する。水層を凍結乾
燥し、次いでセフアデツクスＧ−10（フアルマ
シア社、溶出液10％酢酸）によるゲル過、次
いでセフアデツクスＧ−25（フアルマシア社、
溶出液BuOH：AcOH：H₂O＝４：１：５）に
よるパーテイシヨンクロマトグラフイ、更に
LH−20（フアルマシア社、溶出液、１／1000N
−HCI）にて精製して、Ｈ−Tyr−Val−Glu
−Pro−Thr−Ala−Pro−Gln−Val−Leu−
OHを得る。以下このペプチドを「ペプチド
Ａ」と呼ぶ。 Rf値： Rf¹：0.12 Rf²＝0.58 元素分析値：（C₅₂H₈₁N₁₁O₁₆・7H₂Oとして）Ｃ（％）Ｈ（％）Ｎ（％）理論値 50.27 7.71 12.40 分析値 50.41 7.83 12.41 ＜抗原の製造＞製造例ペプチドの製造例１で得たペプチドＡの５mg及
びKLH（シグマ社）12mgを0.05Mリン酸塩緩衝液
（PH＝7.0）3.0mlに加え、この溶液に２％グルタ
ルアルデヒド溶液0.2mlを滴下し、室温で３時間
撹拌する。その後反応混合物を一夜蒸溜水で４℃
で透析し、凍結乾燥して、目的抗原16.5mgを得
る。以下この抗原を「抗原Ｉ」と言う。抗原ＩはKLH1モル（平均分子量を10万とした
場合）に対してペプチドＡが平均10モル結合した
ものである。尚このペプチドＡとKLHとの結合
率は、得られる抗原Ｉを更にセフアデツクスＧ−
50（溶出液：生理食塩水、検出：OD280nm、流出
速度：３ml／時間、分取量：１mlづつ）でゲル
過した際、未反応のKLH及びペプチドＡの存在
は認められないことより、該ゲル過によつて
KLHに結合したペプチドＡのフラクシヨンと他
の生成体（ペプチドＡの２量体）のフラクシヨン
とを分離し、ペプチド２量体の標準濃度の検量線
を作成して、上記２量体の量を求め、これを出発
原料として用いたペプチドＡの量から差し引いた
値がすべてKLHに結合しているとして求めたも
のである。＜抗体の製造＞製造例抗原の製造例で得た抗原のそれぞれ100μｇ
を1.5mlの生理食塩水に溶解後、これにフロイン
ドの補助液1.5mlを加えて調整した懸濁液を、そ
れぞれ３羽のウサギ（New−Zealand white
rabbits）（2.5〜3.0Kg）に皮下投与し、２週間毎
に６回同量を投与する。更にその後１ケ月毎に３
回、最初に投与した量と同量を投与する。最終投
与後７日経過してのち試験動物から採血し、遠心
分離して抗血清を採取して、目的抗体を得る。

Claims

【特許請求の範囲】１式Ｈ−Tyr−Val−Glu−Pro−Thr−Ala−Pro−Gln−Val
−Leu−OH で表わされるペプチドからなるヒト白血病ウイル
ス関連ペプチド。