JPH01235589A - Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法 - Google Patents
Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法Info
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- JPH01235589A JPH01235589A JP5952688A JP5952688A JPH01235589A JP H01235589 A JPH01235589 A JP H01235589A JP 5952688 A JP5952688 A JP 5952688A JP 5952688 A JP5952688 A JP 5952688A JP H01235589 A JPH01235589 A JP H01235589A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、Ｃｕ 、Ｚｎ型スニパーオキシドジスムター
ゼ（以下、単にＳＯＤという）の製造方法に関し、さら
に詳しくは、Ｃｕ 、Ｚｎ型スーツ々−オキシドジスム
ターゼ及び随伴する蛋白質を共に含む水溶液からＳＯＤ
を製造する方法に関する。
ゼ（以下、単にＳＯＤという）の製造方法に関し、さら
に詳しくは、Ｃｕ 、Ｚｎ型スーツ々−オキシドジスム
ターゼ及び随伴する蛋白質を共に含む水溶液からＳＯＤ
を製造する方法に関する。
（従来技術と発明が解決しようとする課題）ＳＯＤは、
下式に示す不均化反応によりスーパーオキシドを消失さ
せる作用を持つ酵素である。
下式に示す不均化反応によりスーパーオキシドを消失さ
せる作用を持つ酵素である。
２０ｉ ＋ ２ Ｈ” ０２ ＋Ｈ２０２
したがって、ＳＯＤは、生体内で酸素分子から発生した
スーパーオキシドに起因する組織障害、例えば、炎症、
変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放射線照射による障
害、紫外線による障害、未熟児酸素網膜症、白内障、ア
ドリアマイシンなどの制癌剤の副作用、虚血部分への血
流再開に伴う障害などに対する有効な治療剤として注目
されている。
したがって、ＳＯＤは、生体内で酸素分子から発生した
スーパーオキシドに起因する組織障害、例えば、炎症、
変形性関節炎、慢性関節リウマチ、放射線照射による障
害、紫外線による障害、未熟児酸素網膜症、白内障、ア
ドリアマイシンなどの制癌剤の副作用、虚血部分への血
流再開に伴う障害などに対する有効な治療剤として注目
されている。
従来、ＳＯＤの精製法としては、ＳＯＤ含有画分を加熱
処理、硫安塩析などの処理をして、夾雑物を除いたのち
、ＤＥＡＥ−セルロース［ジャーナル拳オブ・へイオロ
ジカルΦケミストリー。
処理、硫安塩析などの処理をして、夾雑物を除いたのち
、ＤＥＡＥ−セルロース［ジャーナル拳オブ・へイオロ
ジカルΦケミストリー。
２４４、（２２）、６０４９ （１９６９）］ 。
］ＤＥＡＥ−セファデックスセファデックスＧ１００
［ジャーナル・オブ争バイオケミストリー、炙５，１３
９７ （１９７９）］ 、］ＣＭＣルーロースＣＭ−
セファデックス、セファデックスＧ７５ ［ジャーナル
・オブ拳バイオロジカル会ケミストリー、２４８ （１
０）、８５８２（１９７３）］あるいはハイドロキシア
パタイト［ジャーナル拳オブバイオロジカル・ケミスト
リー、２５２ （１８）、６４２１ （１９７７）］等
のカラムクロマトグラフィーによって精製する方法が知
られている。
［ジャーナル・オブ争バイオケミストリー、炙５，１３
９７ （１９７９）］ 、］ＣＭＣルーロースＣＭ−
セファデックス、セファデックスＧ７５ ［ジャーナル
・オブ拳バイオロジカル会ケミストリー、２４８ （１
０）、８５８２（１９７３）］あるいはハイドロキシア
パタイト［ジャーナル拳オブバイオロジカル・ケミスト
リー、２５２ （１８）、６４２１ （１９７７）］等
のカラムクロマトグラフィーによって精製する方法が知
られている。
しかしながら、これらの方法は、処理工程中に脱塩処理
を必要とするなど操作が煩雑であるうえ、大量に処理で
きないなどの理由のため、工業的に有利な方法とは言い
難い、これらの問題を解決するための方法として、銅キ
レーテイングアフィニティクロマトグラフィー担体で粗
製ＳＯＤ溶液を処理する方法が提案されている（特開昭
５８−１８３０９１参照）、シかしながら、この方法で
は、種々の電荷を持ったＳＯＤの異性体が生成し、また
５ＤＳ−電気泳動法によれば、見かけの分子量において
種々の分子量を有するＳＯＤの異性体が生成し、さらに
ＳＯＤの回収量も満足いくべきものではなく、工業的に
実際に利用するには有利な方法とは言い難い。
を必要とするなど操作が煩雑であるうえ、大量に処理で
きないなどの理由のため、工業的に有利な方法とは言い
難い、これらの問題を解決するための方法として、銅キ
レーテイングアフィニティクロマトグラフィー担体で粗
製ＳＯＤ溶液を処理する方法が提案されている（特開昭
５８−１８３０９１参照）、シかしながら、この方法で
は、種々の電荷を持ったＳＯＤの異性体が生成し、また
５ＤＳ−電気泳動法によれば、見かけの分子量において
種々の分子量を有するＳＯＤの異性体が生成し、さらに
ＳＯＤの回収量も満足いくべきものではなく、工業的に
実際に利用するには有利な方法とは言い難い。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは、これらの問題を解決することを目的とし
て鋭意研究を行った結果、ＳＯＤ及び随伴する蛋白質を
共に含む水溶液にチオ硫斂塩を添加し、銅キレーティン
グアフィニティクロマトグラフィー担体に吸着させた後
、公知の方法に従って展開することにより、電荷異性体
をほとんど生成させることなく、また、みかけの分子量
を、不均一化させることもなく、ＳＯＤを含有した水溶
液から、はぼ定量的にＳＯＤを回収できる方法を見い出
し、本発明に到達した。
て鋭意研究を行った結果、ＳＯＤ及び随伴する蛋白質を
共に含む水溶液にチオ硫斂塩を添加し、銅キレーティン
グアフィニティクロマトグラフィー担体に吸着させた後
、公知の方法に従って展開することにより、電荷異性体
をほとんど生成させることなく、また、みかけの分子量
を、不均一化させることもなく、ＳＯＤを含有した水溶
液から、はぼ定量的にＳＯＤを回収できる方法を見い出
し、本発明に到達した。
本発明はすなわち、Ｃｕ 、Ｚｎ型スーパーオキシドジ
スムターゼ及び随伴する蛋白質を共に含む水溶液からＣ
ｕ 、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼを銅キレー
ティングアフィニテイクロマトグラフィーにより精製す
る方法において、上記溶液にチオ硫酸塩を添加すること
を特徴とするＣｕ 、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムタ
ーゼの製造方法である。
スムターゼ及び随伴する蛋白質を共に含む水溶液からＣ
ｕ 、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼを銅キレー
ティングアフィニテイクロマトグラフィーにより精製す
る方法において、上記溶液にチオ硫酸塩を添加すること
を特徴とするＣｕ 、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムタ
ーゼの製造方法である。
本発明で使用されるＳＯＤ及び随伴するタンパクを共に
含む水溶液は赤血球、肝臓、胎盤等の動物由来組織、植
物組織、あるいは微生物、また、さらにＳＯＤを産生ず
る遺伝子組換え技術によって得られた組換え菌から得る
ことができる０例えば、赤血球に等量の蒸留水あるいは
０．１〜０．５Ｗ／Ｖ％の非イオン界面活性剤を含む蒸
留水を加えて溶血した後、公知の方法によりヘモグロビ
ンを除去することによって得られるＳＯＤを含む両分が
使用できる。好ましくは、さらにこの画分を硫安分画、
陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマ
トグラフィー、亜鉛を担持したメタルキレーティングア
フィニティクロマトグラフイーなどの公知の方法で精製
してから使用するのがよい、さらに好ましくは、これら
の公知の方法を組み合わせて、ＳＯＤの含有率を高めた
画分を使用するのがよい、肝臓、胎盤などの動物由来組
織あるいは植物組織では、これらの組織をホモジナイザ
ーなどの装置を用いる公知の方法により破砕して得られ
る水抽出液を上記方法で精製してＳＯＤの含量を高めた
両分を使用するのがよい、微生物も公知の方法により破
砕した後、上記方法で精製してＳＯＤの含量を高めた両
分を使用するのがよい。
含む水溶液は赤血球、肝臓、胎盤等の動物由来組織、植
物組織、あるいは微生物、また、さらにＳＯＤを産生ず
る遺伝子組換え技術によって得られた組換え菌から得る
ことができる０例えば、赤血球に等量の蒸留水あるいは
０．１〜０．５Ｗ／Ｖ％の非イオン界面活性剤を含む蒸
留水を加えて溶血した後、公知の方法によりヘモグロビ
ンを除去することによって得られるＳＯＤを含む両分が
使用できる。好ましくは、さらにこの画分を硫安分画、
陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマ
トグラフィー、亜鉛を担持したメタルキレーティングア
フィニティクロマトグラフイーなどの公知の方法で精製
してから使用するのがよい、さらに好ましくは、これら
の公知の方法を組み合わせて、ＳＯＤの含有率を高めた
画分を使用するのがよい、肝臓、胎盤などの動物由来組
織あるいは植物組織では、これらの組織をホモジナイザ
ーなどの装置を用いる公知の方法により破砕して得られ
る水抽出液を上記方法で精製してＳＯＤの含量を高めた
両分を使用するのがよい、微生物も公知の方法により破
砕した後、上記方法で精製してＳＯＤの含量を高めた両
分を使用するのがよい。
本発明の方法は、銅キレーティングアフィニティクロマ
トグラフィー担体と接触させるＳＯＤ含有画分に０．１
〜０．５Ｍｄ度の塩類を加え、ｐＨを６〜８、好ましく
は７に調整したのち、通常、５〜２０ｍＭ、好ましくは
、１０〜１５ｍＭ濃度のチオ硫酸塩を加えて得られる溶
液を、銅キレーティングアフィニティクロマトグラフィ
ー担体と接触させて処理することによって行うことがで
きる。チオ硫酸塩の陽イオンの例としては、ナトリウム
、カリウムなどのアルカリ金属イオン、およびアンモニ
ア、有機アミンなどのアンモニウムイオンなどが挙げら
れる。操作は、例えば、キレ−ティング樹脂１００−に
対して、１．６１＋ｓｏｌの２画調イオン（対イオンと
しては塩素イオン、硫酸イオン、酢酸イオン、硝酸イオ
ンなどが使用される）を含む水溶液を通し、２価銅イオ
ンを樹脂に吸着させた後、該樹脂を水洗し、ＳＯＤ含有
画分と同一組成の緩衝液に０．１〜０．５Ｍ濃度の塩類
を加え、ＰＨを６〜８、好ましくは７に調整した緩衝液
で平衡化したのち、前記のチオ硫酸塩を添加したＳＯＤ
画分を通す、樹脂の使用量は。
トグラフィー担体と接触させるＳＯＤ含有画分に０．１
〜０．５Ｍｄ度の塩類を加え、ｐＨを６〜８、好ましく
は７に調整したのち、通常、５〜２０ｍＭ、好ましくは
、１０〜１５ｍＭ濃度のチオ硫酸塩を加えて得られる溶
液を、銅キレーティングアフィニティクロマトグラフィ
ー担体と接触させて処理することによって行うことがで
きる。チオ硫酸塩の陽イオンの例としては、ナトリウム
、カリウムなどのアルカリ金属イオン、およびアンモニ
ア、有機アミンなどのアンモニウムイオンなどが挙げら
れる。操作は、例えば、キレ−ティング樹脂１００−に
対して、１．６１＋ｓｏｌの２画調イオン（対イオンと
しては塩素イオン、硫酸イオン、酢酸イオン、硝酸イオ
ンなどが使用される）を含む水溶液を通し、２価銅イオ
ンを樹脂に吸着させた後、該樹脂を水洗し、ＳＯＤ含有
画分と同一組成の緩衝液に０．１〜０．５Ｍ濃度の塩類
を加え、ＰＨを６〜８、好ましくは７に調整した緩衝液
で平衡化したのち、前記のチオ硫酸塩を添加したＳＯＤ
画分を通す、樹脂の使用量は。
樹脂１文に対して、ＳＯＤ画分の液量は３０１以下、Ｓ
００画分中のタンパク量が１０ｇ以下であることが好ま
しい、ＳＯＤ画分を通したのち、銅を担持したキレ−テ
ィング樹脂を平衡化した同一の緩衝液を樹脂量の３〜５
倍量流し、次いで、０．０５〜０．５Ｍ濃度の塩類を含
むＰＨ５、５〜６．５、好ましくはｐＨ６の緩衝液を樹
脂量の３〜５倍量流すことにより洗浄する。溶出は、０
．１〜１．０Ｍ濃度の塩類を含むｐＨ４〜５の緩衝液で
行うか、０．１−１．０Ｍ濃度の塩類を含み、かつ、グ
リシン、ヒスチジンあるいはイミダゾールを含むｐＨ６
〜８、好ましくはｐＨ７の緩衝液で行うのが適当である
。ここで使用される塩類とじては、通常、リン酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸ナト
リウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、あるいは
トリス（ヒドロキシアミノメチル）アミノメタン、トリ
エタノールアミン、ジェタノールアミンなどの有機塩基
の塩酸塩などが適当である。なお、使用後の銅キレーテ
ィングアフィニティクロマトグラフィー樹脂は、５０ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩とＩＭＩ化ナ
トナトリウム調整した水溶液、次いで０．１−ＩＭ濃度
の水酸化ナトリウム、好ましくはｏ、ｓＭ１度の水酸化
ナトリウム水溶液を流したのち、十分に水洗することに
よって新たに銅イオンなどの金属イオンを吸着させるこ
とができる状態にすることができる。
００画分中のタンパク量が１０ｇ以下であることが好ま
しい、ＳＯＤ画分を通したのち、銅を担持したキレ−テ
ィング樹脂を平衡化した同一の緩衝液を樹脂量の３〜５
倍量流し、次いで、０．０５〜０．５Ｍ濃度の塩類を含
むＰＨ５、５〜６．５、好ましくはｐＨ６の緩衝液を樹
脂量の３〜５倍量流すことにより洗浄する。溶出は、０
．１〜１．０Ｍ濃度の塩類を含むｐＨ４〜５の緩衝液で
行うか、０．１−１．０Ｍ濃度の塩類を含み、かつ、グ
リシン、ヒスチジンあるいはイミダゾールを含むｐＨ６
〜８、好ましくはｐＨ７の緩衝液で行うのが適当である
。ここで使用される塩類とじては、通常、リン酸ナトリ
ウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウム、酢酸ナト
リウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、あるいは
トリス（ヒドロキシアミノメチル）アミノメタン、トリ
エタノールアミン、ジェタノールアミンなどの有機塩基
の塩酸塩などが適当である。なお、使用後の銅キレーテ
ィングアフィニティクロマトグラフィー樹脂は、５０ｍ
Ｍエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩とＩＭＩ化ナ
トナトリウム調整した水溶液、次いで０．１−ＩＭ濃度
の水酸化ナトリウム、好ましくはｏ、ｓＭ１度の水酸化
ナトリウム水溶液を流したのち、十分に水洗することに
よって新たに銅イオンなどの金属イオンを吸着させるこ
とができる状態にすることができる。
本発明によって得られるＳＯＤは、さらに疎水相互作用
クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィー
を組み合わせて精製することで、電荷的にも分子量的に
も均一で、かつ、高純度にすることができる。
クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィー
を組み合わせて精製することで、電荷的にも分子量的に
も均一で、かつ、高純度にすることができる。
（実施例）
本発明を、参考例、比較例、実施例により更に詳細に説
明するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるもの
ではない。
明するが、本発明の範囲はこれらの例に限定されるもの
ではない。
本発明の実施例等において、ＳＯＤの活性測定は、リボ
フラビン、メチオニン存在下に可視光を照射することに
より生じたスーパーオキシド（０”２）によるニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元をＳＯＤが阻害す
ることを利用したビューチャンプ及びフリートピッチ法
にもとづいて行った。［ビューチャンブとフリートピッ
チ、アナリティカルやバイオケミストリー。
フラビン、メチオニン存在下に可視光を照射することに
より生じたスーパーオキシド（０”２）によるニトロブ
ルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元をＳＯＤが阻害す
ることを利用したビューチャンプ及びフリートピッチ法
にもとづいて行った。［ビューチャンブとフリートピッ
チ、アナリティカルやバイオケミストリー。
土４，２７６（１９７１）］。
１考胴」
３週間、４℃にて保存したヒ）ＣＰＤ加濃厚赤血球を、
４℃、１５００ＸＧで１５分間遠心分離した。上清液を
除去後、沈降した赤血球を生理食塩水で３回洗浄し、こ
の赤血球沈殿ｌ容に冷水１容を加え、４℃で１時間撹拌
し溶血した。溶血液の容量の１／１０容量の１０％Ｎａ
Ｃ文を加え、７７００ＸＧ、３０分間遠心分離した。上
層をデカンテーションにより分離し、透析用セルロース
チューブに入れた。４℃で、１ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ
７、２）に対して透析脱塩を行った。１ｍＭリン酸緩衝
液（ＰＨ７、２）で平衡化したＤＥ−５２（ワンドマン
社）を用い、回分式で吸着を行った。それからＤＥ−５
２を同一の緩衝液で洗い、カラムにつめた。樹脂容量の
３倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６、８）で展開し
、ＳＯＤを含む両分を得た。
４℃、１５００ＸＧで１５分間遠心分離した。上清液を
除去後、沈降した赤血球を生理食塩水で３回洗浄し、こ
の赤血球沈殿ｌ容に冷水１容を加え、４℃で１時間撹拌
し溶血した。溶血液の容量の１／１０容量の１０％Ｎａ
Ｃ文を加え、７７００ＸＧ、３０分間遠心分離した。上
層をデカンテーションにより分離し、透析用セルロース
チューブに入れた。４℃で、１ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ
７、２）に対して透析脱塩を行った。１ｍＭリン酸緩衝
液（ＰＨ７、２）で平衡化したＤＥ−５２（ワンドマン
社）を用い、回分式で吸着を行った。それからＤＥ−５
２を同一の緩衝液で洗い、カラムにつめた。樹脂容量の
３倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６、８）で展開し
、ＳＯＤを含む両分を得た。
１考眉」
参考例１において得られたＳＯＤを含む画分に、その容
量１００−に対して７０ｇの硫酸アンモニウム（生化学
用）を加え、溶解させ、４℃にて、−晩装置し、生じた
沈殿を４°Ｃ１７７００ＸＧ、３０分間の遠心分離によ
り回収した。沈殿に１０ｍＭトリエタノールアミン塩酸
塩（ｐＨ７，０）を加え、沈殿を溶解し、これと同一の
緩衝液に対して透析し脱塩を行った。ＤＥＡＥ−セファ
ロースΦファーストフロウ（ファルマシア社）をカラム
につめ、上記と同一の緩衝液で平衡化し、透析脱塩後の
ＳＯＤを含む両分を通し、平衡化した緩衝液で洗浄した
。樹脂容量の５倍量の、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
上記緩衝液で展開し、ＳＯＤを含む画分を得た。
量１００−に対して７０ｇの硫酸アンモニウム（生化学
用）を加え、溶解させ、４℃にて、−晩装置し、生じた
沈殿を４°Ｃ１７７００ＸＧ、３０分間の遠心分離によ
り回収した。沈殿に１０ｍＭトリエタノールアミン塩酸
塩（ｐＨ７，０）を加え、沈殿を溶解し、これと同一の
緩衝液に対して透析し脱塩を行った。ＤＥＡＥ−セファ
ロースΦファーストフロウ（ファルマシア社）をカラム
につめ、上記と同一の緩衝液で平衡化し、透析脱塩後の
ＳＯＤを含む両分を通し、平衡化した緩衝液で洗浄した
。樹脂容量の５倍量の、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む
上記緩衝液で展開し、ＳＯＤを含む画分を得た。
糺考眉」
参考例２において得られたＳＯＤを含む両分に０．５Ｍ
濃度になるように塩化ナトリウムを加えた。キレ−ティ
ングセファロース６Ｂ（ファルプシ７社）樹脂１００−
に対して、 ２ 、８＋ｗｍｏｌの硫酸亜鉛を吸着させ
、水洗し、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リ
エタノールアミン塩酸塩（ｐＨ７、０）を用いて平衡化
した。これに上記のＳＯＤを含む両分を通し、非吸着部
分と平衡化緩衝液による洗浄液を一緒にし、ＳＯＤ含有
画分を得た。この両分のＳＯＤの比活性は４７０単位／
ｍｇ蛋白であった。
濃度になるように塩化ナトリウムを加えた。キレ−ティ
ングセファロース６Ｂ（ファルプシ７社）樹脂１００−
に対して、 ２ 、８＋ｗｍｏｌの硫酸亜鉛を吸着させ
、水洗し、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リ
エタノールアミン塩酸塩（ｐＨ７、０）を用いて平衡化
した。これに上記のＳＯＤを含む両分を通し、非吸着部
分と平衡化緩衝液による洗浄液を一緒にし、ＳＯＤ含有
画分を得た。この両分のＳＯＤの比活性は４７０単位／
ｍｇ蛋白であった。
！息遣」
キレ−ティングセファロース６Ｂ（ファルマシア社製）
を水洗し、この樹脂１００−に、０．１Ｍ硫酸銅１６−
を通し、水洗後、１０ｍＭトリエタノールアミン塩ＷＩ
’１Ｍ （ｐＨ７、０） ＋０．５Ｍ１ｐ化ナトリウム
５００−でカラムを平衡化した。
を水洗し、この樹脂１００−に、０．１Ｍ硫酸銅１６−
を通し、水洗後、１０ｍＭトリエタノールアミン塩ＷＩ
’１Ｍ （ｐＨ７、０） ＋０．５Ｍ１ｐ化ナトリウム
５００−でカラムを平衡化した。
次に、参考例３で得られた粗製５ＯＤ２．５見に６．２
０ｇのチオ硫酸ナトリウム争５水塩を加えて溶かした。
０ｇのチオ硫酸ナトリウム争５水塩を加えて溶かした。
この溶液を上記銅キレート基結合担体に通し、ＳＯＤを
吸着させた。５００ｍ１の平衡化緩衝液１次いで０．０
５Ｍリン酸緩衝液十０．５Ｍ塩化ナトリウム（Ｐ）１６
、０） ５００Ｊで洗浄した。ＳＯＤの展開は、平衡
化緩衝液十０．０５Ｍグリシン（ｐＨ７、０）を５００
−通すことによって行った。得られた３００画分の粗製
ＳＯＤからの活性回収率は１０４％であり、比活性は２
４９０単位／ｌａｇ蛋白であった。５ＤＳ−電気泳動に
おいて、ＳＯＤのバンドは１７にダルトンの単一の分子
量を示した。
吸着させた。５００ｍ１の平衡化緩衝液１次いで０．０
５Ｍリン酸緩衝液十０．５Ｍ塩化ナトリウム（Ｐ）１６
、０） ５００Ｊで洗浄した。ＳＯＤの展開は、平衡
化緩衝液十０．０５Ｍグリシン（ｐＨ７、０）を５００
−通すことによって行った。得られた３００画分の粗製
ＳＯＤからの活性回収率は１０４％であり、比活性は２
４９０単位／ｌａｇ蛋白であった。５ＤＳ−電気泳動に
おいて、ＳＯＤのバンドは１７にダルトンの単一の分子
量を示した。
ル敗舊」
実施例１と同様にして、平衡化した銅キレート基結合担
体に、参考例３で得た粗製５ＯＤ２．５文を通し、ＳＯ
Ｄを吸着させた。洗浄・展開は、実施例１と同様に行っ
た。得られた３００画分の粗製ＳＯＤからの活性回収率
は６２％であり、比活性は２４８０単位／■ｇ蛋白であ
った。５ＤＳ−電気泳動において、ＳＯＤのバンドは１
６．５゜１７及び１８にダルトンの分子量を示した。
体に、参考例３で得た粗製５ＯＤ２．５文を通し、ＳＯ
Ｄを吸着させた。洗浄・展開は、実施例１と同様に行っ
た。得られた３００画分の粗製ＳＯＤからの活性回収率
は６２％であり、比活性は２４８０単位／■ｇ蛋白であ
った。５ＤＳ−電気泳動において、ＳＯＤのバンドは１
６．５゜１７及び１８にダルトンの分子量を示した。
Ｌ較１」
実施例１と同様にして、銅キレート基結合担体を平衡化
した。参考例３において得られた粗製５ＯＤ２．５交を
、同一の緩衝液で平衡化した２００Ｔａ！のオクチルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通し、同
一の緩衝液で洗浄した。非吸着部分と洗浄液゛を合わせ
て３００画分とした。この３００画分を、平衡化した銅
キレート基結合担体に通し、ＳＯＤを吸着させた。
した。参考例３において得られた粗製５ＯＤ２．５交を
、同一の緩衝液で平衡化した２００Ｔａ！のオクチルセ
ファロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通し、同
一の緩衝液で洗浄した。非吸着部分と洗浄液゛を合わせ
て３００画分とした。この３００画分を、平衡化した銅
キレート基結合担体に通し、ＳＯＤを吸着させた。
洗浄・展開は、実施例１と同様に行った。このようにし
て得られた３００画分の粗製ＳＯＤからの活性回収率は
７３％であり、比活性は３４２０単位／＋ｓｇ蛋白であ
った。５ｎｓ−電気泳動において、ＳＯＤのバンドは１
７及び１８にダルトンの分子量を示した。
て得られた３００画分の粗製ＳＯＤからの活性回収率は
７３％であり、比活性は３４２０単位／＋ｓｇ蛋白であ
った。５ｎｓ−電気泳動において、ＳＯＤのバンドは１
７及び１８にダルトンの分子量を示した。
（発明の効果）
以上詳述したところからも明らかなように、本発明の方
法は、ＳＯＤを高純度で、しかも、高回収率で与えるこ
とができるうえ、電荷異性体の生成、異なった分子量を
有する種の生成を抑えることができる産業上有用なＳＯ
Ｄの製造方法である。
法は、ＳＯＤを高純度で、しかも、高回収率で与えるこ
とができるうえ、電荷異性体の生成、異なった分子量を
有する種の生成を抑えることができる産業上有用なＳＯ
Ｄの製造方法である。
Claims (1)
- Ｃｕ、Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼ及び随伴す
る蛋白質を共に含む水溶液からＣｕ、Ｚｎ型スーパーオ
キシドジスムターゼを銅キレーティングアフィニティク
ロマトグラフィーにより精製する方法において、上記溶
液にチオ硫酸塩を添加することを特徴とするＣｕ、Ｚｎ
型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5952688A JPH07110229B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5952688A JPH07110229B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01235589A true JPH01235589A (ja) | 1989-09-20 |
| JPH07110229B2 JPH07110229B2 (ja) | 1995-11-29 |
Family
ID=13115806
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5952688A Expired - Lifetime JPH07110229B2 (ja) | 1988-03-15 | 1988-03-15 | Ｃｕ，Ｚｎ型スーパーオキシドジスムターゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07110229B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008208123A (ja) * | 2007-02-02 | 2008-09-11 | Iwate Univ | 天蚕絹セリシンの取得方法と化粧水等への使用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150052137A (ko) | 2012-08-31 | 2015-05-13 | 쟈트코 가부시키가이샤 | 뉴트럴 판정 장치 및 차량의 제어 장치 |
-
1988
- 1988-03-15 JP JP5952688A patent/JPH07110229B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008208123A (ja) * | 2007-02-02 | 2008-09-11 | Iwate Univ | 天蚕絹セリシンの取得方法と化粧水等への使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07110229B2 (ja) | 1995-11-29 |
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