JPS59109172A - カリクレインの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカリクレインの精製法に関するものであり、更
に詳しくは、哺乳動物の膵臓中に存在するカリクレイン
を簡単な操作での工業的規模において大量かつ高純度に
精製する方法に関するものである。

カリクレインは哺乳動物の各種組織で生産される蛋白分
ｗｆ酵素の一種であり、またキニン遊離酵素の一種とし
て知られている。遊離キニンには末梢血管拡張作用があ
り、従ってカリクレインは循環器系疾患の治療用に使用
されている。カリクレインは通常、哺乳動物臓器から抽
出されるので、そσ−〕粗抽出物［は多くの異種蛋白質
が含まれている。なかでもキニン産生あるいはキニン分
解に関連したトリフ０シン及びキモトリプシンの混在は
治療の際の副作用を惹起させるおそれがあるため、抽出
物を医薬品として使用するには、更に十分な精製を行っ
て高純度のものとすることが必要である。

従来、粗カリクレインから異種蛋白質及び類似酵素を除
去−」るための方法としてば、塩析法、デルＩ４過法、
イオン父換りロマトクラフ法（特開昭５３−６２８９３
）、等電点分別法（％開昭４９−４１５８３）、溶媒沈
殿法（特開昭５２−１０２４９５）などの手段を組み合
せた方法や、また阻書剤を利用したアフィニティークロ
マトクラフ法（特開昭５４−６２６１２）アルギニン誘
導体結合担体を用いたクロマトグラフ法（％開昭５６−
１１７７９１、特開昭５７−５０９２４）などが知られ
ている。しかし、これらの方法は操作が繁卸−であった
り、ノ欠率が低い又は試薬が高仙１であるなどの点でい
ずれも工業的製法として満足し得るものではなかった。

本発明者らは、より簡Ｊやで効率的なカリクレインσＪ
精製法を提供１べく鋭意研究を行った結果、カリクレイ
ンがグアニジノ基に刻して特異的に親和性を有すること
、およびグアニジノ基を有する物質をリガンドとしてア
フィニティークロマトグラフィーを行うことにより、簡
単に、且っ高収率で〜ｊ糾度のカリクレインが得られる
ことを見い出し、本発明を完成した。

ゴーなわら、本発明は、カリクレイン含有液を次の式（
ｒ＋ 〔式中、Ｒは−（−ＯＨ２→−ｎ　（ここでｎは１〜５
の数を示ず）又は−Ｃ６Ｈ４−を示す〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサーを介し
て水不溶性担体に結合させて得た吸着体に接触させてカ
リクレインを吸着せしめ、次いで吸着したカリクレイン
を溶離せしめることを特徴とするカリクレインの精製法
を提供１−るものである。

本発明で使用される吸着体は、アガロース、デキストリ
ン、セルロース等の水不溶性担体に、−個以上のアミノ
基を有するスペーサーを結合させ、次いで、このスペー
サーのアミノ基と化合物（１１のカルボキシル基とを常
法によりペプ□チド結合させることにより調製される。

スペーサーとして使用される化合物としては、水不溶性
担体または活性化した水不溶性担体と結合し得る官能基
を有し、かつこれと結合した後、遊離のアミノ基が残存
する化合物であればよく、この様な化合物としては、α
、ω−ジアミノアルキレン例えば１．６−ジアミツヘキ
サン、１．５−ジアミノペンクン、１゜８−ジアミノオ
クタン、１．１０−ジアミノデカン等が挙げられる。ま
た、スペーサーとアガロースを結合させた゛アミノへキ
シルアガロースがファルマシア・ファインケミカル社よ
り［ＡＨ−セファロースＪの商品名で市販されており、
本発明ではこれを使用し、吸着体を調製することもでき
る。

リガンドである弐（１１のグアニジノカルボン酸として
は、グアニジノ酢酸、グアニジノ酢酸、グアニジノ安息
香酸等が挙げられる。

本発明を実＃＋するには、上述の如くして調製した吸着
体をカラムに充填し、これにカリクレイン含有液を通液
してカリクレインを吸着させ、次いて゛これに溶出液を
注加してカリクレインを溶出させ机 カリクレイン含有液の通液は、カリクレインのｍ度、吸
着体の種類によっても異なるが、一般には流速３０〜５
　Ｑ　ｍｌ　／　ｈｒ　　とするのが好ましい。

また溶出液としては塩化ナトリウムを含む−４，５〜９
．０（特に好ましくはＰ）１７．４　）の緩衝液を用い
るのが好ましい。溶出にあたっては、最初に塩化ナトリ
ウム濃度の低い溶出液（塩化ナトリウム濃１隻：約０，
１〜Ｏ２ろＭ）を通して、不純物のトリプシン、キモト
リフ０シン等の酵素及び蛋白質を溶出させ、次いでこれ
に地化す）　リウム濃度の高い溶ＩＪＪ　７ｉ　　（４
化　シト　リ　ウ　４　８に度　：　　０．４　〜１．
０　　Ｍ　　）　　を通し′Ｃカリクレインを浴出させ
るのが好ましい。この場合ｌ島化すトす内広濃度が漸次
増大するグラジェント方式（例えは塩化ナトリウム０．
２〜１．０Ｍ）によりカリクレインを船出させＣもよい
。尚本発明で使用される緩衝１俵は特に限定されないが
、精製物を凍結乾燥−４る前にア士トンを加えて脱地濃
釉白する場合（」、トリス（ヒドロキシメチル）アミツ
メタン・塩酸緩衝液が好ましい。また使用した吸着体は
緩衝液で洗浄するだけで再使用が可能であり、特別な再
生作操作を必要としない。

斜上の本発明方法は、１回の吸脱着操作をおこなうだけ
で、トリプシン、キモトリプシン等の不純物をほとんど
含まない高紳度のカリクレインを高収率で得ることので
きる優れたものである。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ （１１豚膵臓抽出原末２５ｇに０．２係均化す）　ＩＪ
ウム水溶液２５０　ｍＡを加え充分に攪拌して懸濁させ
、２Ｎ塩酸でｐＨ４，５として遠心分離する。得られた
上清アンモニア水を用いてｐｆ（７，４とした後、アセ
トン４０〜５５憾の分画沈降を行い、得られた沈殿を水
１ｏｏｍｉに溶かし、１Ｎ−水酸化ナトリウムでｐＨ７
，４とし、カリクレイン含有液を得る。

（１１）一方ＡＨセファロース４Ｂ（ファルマ幻′・フ
ァインケミカル社＆’）１５．？を０．５　Ｍ　塩化ナ
トリウム水溶液に入れて膨潤させた後、吸引１過し、０
．５Ｍ４化ナトリウム水浴液、次いで脱イオン水で洗浄
する。得られた膨潤ゲル約６Ｑｍ／に脱イオン水１ｏｏ
ｍｚを加えて懸濁する。これにグアニジノ凸′１酸７０
ｍ９　（［ｌ＋６　ｍ　ｍ０１ｅ　　）を脱イオン水２
５鯰に溶かした溶液を加えｌＮ−４酸又は１Ｎ−水酸化
ナトリウムで−４４，５とする。これに１−エチル−ろ
−（３′−ジメチルアミノプロピル）カルボシイミド６
．４ｇを脱イオン水５　ｍｌに溶かした溶液を加え、ｐ
ｌｉ　５．ＯＫ保ちながら室温で一夜攪拌する。

反応混合物を吸引１過し、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＪＪ
４．０　：　Ｉ　Ｍ−塩化ナトリウム）および０．１　
Ｍ　）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝
液（ｐＨ８ＪＪ　：　Ｉ　Ｍ　堪化す）　ＩＪウム）で
交互に洗浄した後、吸引ｆ過するとグアニジノ酢酸結合
ＡＨ・セファロース４Ｂが得られる。

ｆｌｌｌｌ　　（Ｉｌ＋で得られたグアニジノ酢酸結合
ＡＨ・セファロース４　Ｂをカラム（２φ×ろ０ＣｒＩ
Ｌ）に充填り、、＋１１で得たカリクレイン含有液をこ
のカラムに通液し、５０ｍ！・Ａ　トリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン・塩酸緩衝液（ｐｆ４７．４　）
次いで０．２　Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラ
ムを洗う。

次に０．２〜１．０　Ｍ　塩化ナトリウム溶液（２５（
ＩＩＡ−２５０ｍｌ）でグラジェント溶出を行う。集め
たカリクレイン分画にアセトンを加えて脱環濃縮し、凍
結乾燥して精製カリクレイ７２４〜（総括性８１６０に
、Ｕ＊　）を得た。

＊に、Ｕ：カリクレインユニット 実施例２ 実施例１　ｆｉｌｌにおけるグアニジノ酢酸７０ｍｇを
グアニジノ安息香酸１２９ｍ＆に変える以外は全（同様
にしＣ得たグアニジノ安、は香酸結合Ａ）ｌ・セファロ
ース４Ｂをカラム（２Ｘ３０ＣｎＬ）に充填し、実施例
１（１）と同様にして得たカリクレイン含有液をこのカ
ラムに通液し、５０ｍＭ＋−リス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン・塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、次いで０．
２Ｍ塙化す）　ＩＪウムを含む同緩衝液でカラムを洗浄
した。次に（１，４Ｍｈ＝化ナトナトリウムむ同緩衝液
でカリクレインを溶出し、集めたカリクレイン分画にア
セトンを加えて脱塩濃縮後、凍結乾燥し゛〔精製カリク
レイン１６４ｍｐ（総括性９６７６　Ｋ、Ｕ　）を得た
。

実施例３ 実施例１　ｆｉｌｌにおけるグアニジノ酢酸７０ｒｎｇ
をグアニジノ酪酸８７ｍノに変える以外は全（同様にし
て得たグアニジノ酪酸結合ＡＩ（・セファロース４Ｂを
カラム（２×６０ｃｍ）に充填する。次いで実施例１（
１）でアセトン４０〜５５係を６３〜６７係に変える以
外は全（同様にして得たカリクレイン含有液を上記のカ
ラムに通液し、１０ｍＭ）リス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタ／−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）、次いで０．２
５　Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムを洗浄し
たＯ更にｏ、５ｖｔｔａ化ナトリウムを含む同緩衝液で
カリクレインを溶出後、集めたカリクレイン分画にアセ
トンを加えて脱塙濃縮し、都農カリクレイン７２ｍノ（
総括性９　３　６　０　　Ｋ、Ｕ　　）　　を　得プこ
　。

実施例４ 豚膵臓原末２５ｇに０．２　’１鳩化ノート・リウム水
溶＃２５０威を加えて充分に撹拌して懸濁させ、２Ｎ地
酸でｐｆ４４．５として遠心分離すξ）１、得られた十
清をアンモニア水を用いｐＨ７゜４とした後、硫酸アン
モニウムを加えて硫安分画を行う。得られた沈殿を水に
溶かし、ＤＥＡＦ・セルロースを加えてカリクレインを
Ｉ）ｌｉｔ　ＡＦｉ・セルロースに吸着させ、２％塩化
ナトリウム水溶液でＤＥＡＦ　　セルロースからカリク
レインを脱着させる。次いでこのカリクレイン含有液を
アセト７３３〜６７％の分画沈殿を行い、得られる沈殿
を水２５ｍＡに溶かし、ｐ）１７．４とする。

この溶液を実施例１　ｆｉｌ＋と同様にして得たグアニ
ジノ酢酸結合ＡＨ・セファロース４Ｂを充填したカラム
（２φｘ３ＱＣＴＬ）に通液し、このカラムを１０ｍＭ
　　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩
衝爵（ｐＨ７，４）、次いで０．２５　Ｍ塩化ナトＩＪ
　、：ツムを含む同緩衝液で洗浄する。０．５Ｍ塙化ナ
トリウムを含む同緩衝液でカリクレインを溶出し、集め
たカリクレイン分画にアセトンを加え、脱塩濃縮し、凍
結乾燥して精與カリクレイン４η（総括性４１２０　Ｋ
、Ｕ　）を得た。このものはトリプシン、キモトリプシ
ンを全く含まず純度の高いものであった。

実施例５ 実施例１〜４で得た精製カリクレインについてそのカリ
クレイン活性、トリプシン活性及びキモトリフ０シン活
性を測定した。更に、カリクレイン活性の測定結果から
、その比活性、回収率、精製倍率を計算した。この結果
を第１表に示す。

〔測定方法〕

（１）　　カリクレインの生理活性 ９屋等の方法〔ず・ジャーナル・オプ・バイオケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　〕　５５８巻２０１貞
、１９５６年〕に従って行１工った。

（２）トリプシン活性 高見の方法〔生化学、４１巻、７７７員、１９６９年）
に従って行った（ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン・Ｐ・
ニトロアニリド・ＨＣＪを基質とし、６７°Ｃで１５分
間反応させた）。

（３）　　キモトリプシン活性 佐々木等の方法〔アナリテイカルバイオケミス　ト　リ
　イ　（Ａｎａｌ、　　Ｂｊ、ｏｃｈｅｍ、　　）　　
Ｅ３　６　　巻　１　５９ｊｉ　、１９７８年］に従っ
て行なった（Ｎ−ペンシイイル−ｂ−シロシル−Ｐ−ニ
トロアニリドを基質とし３７°Ｃで３００分間反応せた
）。

〔結　果〕

以下余白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１１カリクレイン含有液を、次の一般式（ＩｌＬ式中
   、Ｒは＋（３Ｈ２−）−ｎ（ここでｎは１〜５の数を示
   す）又は−０６Ｈ，−を示１゛〕 で表わされるグアニジノカルボン酸をスペーサーを介し
   て水不溶性担体に結合させて得た吸着体に接触させてカ
   リクレインを吸着せしめ、次いで吸着したカリクレイン
   を溶離せしめることを特徴とするカリクレインの精製法
   。 （２）　　スペーサーがα、ω−ジアミノアルキレンよ
   り導かれたものである特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 （３）　　スペーサーが１．６−ジアミノへ・キサン、
   １゜５−ジアミノペンタン、１，８−ジアミノオクタン
   、１，１０−ジアミノデカンのいずれかから導かれたも
   のである特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。