JPH01240187A

JPH01240187A - 新規ウレアーゼおよびその製造法

Info

Publication number: JPH01240187A
Application number: JP63169761A
Authority: JP
Inventors: Mohachi Kakimoto; 茂八柿本; Yasuhiro Sumino; 隅野　靖弘; Takashi Suzuki; 鈴木　節士
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-07-09
Filing date: 1988-07-07
Publication date: 1989-09-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は酒類の品質改良や、臨床検査等、あるいは食品
中における尿素測定用酵素として有用な新規ウレアーゼ
に関する。

従来の技術ウレアーゼ（Ｅ、Ｃ，３，５，１，５）は尿素をアンモ
ニアと炭酸ガスに分解する酵素であり、植物、動物、微
生物など広く自然界に分布、存在しているが、ナクマメ
やバチルス・バストウリのウレアーゼが工業的に製造さ
れ、実用に供されているほか、コリネバクテリウム・リ
リウム、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、アー
スロバフタ−・バラフィネウス、プロテウス・ブルガリ
ス、ミクロバクテリウム・アンモニアゲネスム、ボルデ
テラ・ブロンチセブチカに属する菌株が産生ずる分子量
的４４０，０００のウレアーゼ（特公昭６Ｏ−５５１１
９）、およびバチルス・エスピーＵ　Ｒ−１５５株が産
生ずる分子量的４４０．００　（１）ウレアーゼ（特開
昭５９−１７９８７）、およびシュードモナス・エルギ
ノサおよびノカルデイア・エリスロポリスが産生ずる分
子量的２８０．０００のウレアーゼ（特開昭６ｌ−２５
７１８３）などが知られている。

発明が解決しようとする課題上記のウレアーゼはいずれも、反応の至適ｐＨが中性乃
至アルカリ性に存在し、酸性側では酵素が不安定で失活
しやすいばかりでなく、反応が極めて進行しにくく、と
くに反応温度が室温以上の場合や、アルコールなどの有
機溶媒を含む反応液中での失活が著しいなどの難点があ
る。

課題を解決するための手段本発明者らは、至適ｐａｌが酸性域にあり、安定性の優
れたウレアーゼを産生ずる微生物を鋭意検索した結果、
ラクトバチルス属またはストレフトコッカス属に属する
菌株がその菌体内に、目的とするウレアーゼを蓄積して
いることを見出し、さらに該酵素を単離、精製して研究
を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、
本発明は［１］次の理化学的性質を有する酸性域に至適
ｐＨをもつ新規ウレアーゼ（以下、単に酸性ウレアーゼ
と称することがある）。

（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する、（２）基質特異性尿素に最もよく作用する、（３）至適ｐ）ｌおよびｐ）（安定性至適叶１７！ｌ（１，５乃至５．５であり、３７℃、３
０分処理ではｐＨ６乃至８の範囲で安定である、（４）
至適温度および温度安定性至ｉｐＨにおける至適温度が５５℃乃至７５℃であり、
ｐＨ６では、３０分処理で５０℃まで安定である、（５）阻害剤塩化第二水銀およびアセトヒドロキサム酸によって阻害
される、（６）分子量ゲルろ過法で測定した分子量は、１ｏ万乃至２５万であ
る、（７）至適ｐＨおよび３７℃における比活性が２、ＯＵ
／ｍｇたん白質以上である、および［■］ラクトバチルス属またはストレフトコッカ
ス属に属する上記ウレアーゼ生産菌を培地に培養し、培
養物中に上記ウレアーゼを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする上記ウレアーゼの製造法である。

本発明のウレアーゼの製造に使用される微生物としては
、ラクトバチルス属またはストレフトコッカス属に属す
る酸性ウレアーゼ産生菌があげられる。さらに具体的に
はラフトノ（チルス・ファーメンタム　（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｒｍｅｎｔｕｍ）　Ｊ　ＣＭ５
８６７（ＩＦＯ１４５１１，ＦＥｒ（Ｍ　　Ｐ−８９９
０）、ｔ、ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　　「ｅｒｍｅ
ｒ＋ｔｕｍ　　Ｊ　ＣＭ　　５８６Ｂ（ＩＦＯ１４５１
２，ＦＥＲＭＰ−８９９１）、　Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍＪＣＭ　　５８６９（［
ＦＯ１４５１３，ＦＥＲＭＰ−８９９２）、ラクトバチ
ルス・リウテリイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒ
ｅｕｔｅｒｉ）ＵＭ−１２（ＩＦＯ１４６２９、ＦＦＲ
Ｍ　　Ｐ−９４５６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　
　ｒｅｕｔｅｒｉ　　ｕ　Ｍ　−１８（Ｉ　Ｆ　０１４
６３０、ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４５７）、Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ　　Ｒｔ−５（ＩＦＯ
１４６３１゜Ｆ　Ｅ　ＲＭ　　Ｐ　　９４５　Ｂ　）、
ラクトバチルス・ルミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　　ｒｕｍｉｎｉｓ）　Ｐ　Ｃ−９８（ＩＰｏ　　１
４６３２、ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４５９）、ストレプトコ
ッカス・ミチオール（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｉ
ｔｉｏｒ）ＰＣ−１５４（ＩＦｏ　　１４６３３、ＦＥ
ｒｌＭ　　Ｐ−９４６０）、ストレプトコッカス・ボビ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｂｏｖｉｓ）　Ｐ
　Ｇ　−１８６（ＩＦＯ１４６３４、ＦＥＲＭ　　Ｐ−
９４６１）あるいはストレプトコッカス・サリバリウス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ａｌｉｖａｒｉｕ
ｓ）　Ｐ　Ｃ−３０３Ｗ（ＩＰｏ　　１４７４６）など
が例示される。上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究
所（Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ　　Ｆｏｒ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａ
ｔｉｏｎ、　０ｓａｋａ；　　Ｉ　ＦＯ）における受託
番号を、またＦＥＲＭ　　Ｐ番号は通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）における受託番号を
それぞれ示す。

上記のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔ
ｕｍ　　Ｊ　ＣＭ５８６７（Ｉ　ＦＯ１４５１１）、Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｒｍｅｎｔｕｍ　ＪＣＭ
　５８６８（ＩＦＯｌ　４５１２）およびＬａｃｔｏｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　　Ｊ　ＣＭ５
８６９（ＩＦＯ１４５１３）は財団法人発酵研究所発行
の「リサーチ・コミュニイケーションズ（ＲＥＳＥＡＲ
ＣＨＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ）　Ｎｏ、　１３　
、第９４頁、１９８７Ｊに掲載されている公知菌株であ
る。

なお、上記の各微生物のＦＲＩへの寄託はブダベスト条
約に基づく寄託に切り替えられて、次の受託番号（ＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ番号で同研究所に保管されている。

なお、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｓａｌ＋ｖａｒ
ｉｕｓ　Ｐ　Ｇ　−３０３Ｗは１９８８年４月１４日に
ＦＲＩへＦＥＲＭ　　ＢＰ−１８５６として寄託されて
いる。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｔ　　Ｕ
Ｍ−１２。

ＬａｃｔｏｂａｃｔＬｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｔ　　（
Ｊ　Ｍ　　１　Ｂ　。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ　　Ｒ
ｔ　−５およびＬ　ａｃｔｏｂａｃｉ口ｕｓ　　ｒｕｍ
ｉｎｉｓ　　Ｐ　Ｇ　−９８の各菌学的性質は次のとお
りである。

細胞の形状　　　　　　　短桿菌　　　　短桿菌　　　
短桿菌運動性　　　　　　　　　　−−− 胞子形成能　　　　　　　　−−− グラム染色性　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　
　＋酸素要求性　　　　　　微好気性　　　　微好気性
　通性嫌気性酸化・発酵テスト　　　　発酵　　　　　
発酵　　　　発酵カタラーゼ　　　　　　　　−−− オキシダーゼ　　　　　　　−　　　　　　−−硝酸還
元性　　　　　　　　−−− ゼラチン液化性　　　　　　−−− 澱粉の加水分解　　　　　　−−− エスクリンの分解　　　　　−−− Ｍｆｔテスト　　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　
　　＋ＶＰテスト　　　　　　　　−　　　　　　−−
イ８ンドールの生成　　　　　−−− 硫化水素の生成　　　　　　−−− アルギニンからのＮｌ＋、生成　十　　　　　　＋　　
　　　＋リドマスミルクの反応　　　酸形成　　　酸形
成　　　酸形成グルコースからのガス生成　＋　　　　
　　＋　　　　　＋生育至適温度（’Ｃ）　　　　　　
２５〜４５３０〜４５２５〜４５４５℃における生育　
　　　十　　　　　　半　　　　　＋１５℃における生
育　　　　−−− ｐｔ−ｒ４．ｏにおける生育　　　＋　　　　　　＋　
　　　　＋ｐＨ９，６における生育　　　−−− ３％食塩における生育　　　＋　　　　　　−＋６．５
％食塩における生育　−−− 酸の生成アドニトール　　　　　　−　　　　　　−−アラビノ
ース　　　　　　十　　　　　　−−アラビトール　　
　　　　−　　　　　　−−アルブチン　　　　　　　
−−− セロビオース　　　　　　−−− ダルシトール　　　　　　−−− フラクトース　　　　　　−−− ガラクトース　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　
＋グルシコン酸　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　
　　十グルコース　　　　　　　　＋　　　　　　　＋
　　　　　　＋グリセロール　　　　　−　　　　　　
−−イノシトール　　　　　　−−− イヌリン　　　　　　　　−−− ラクトース　　　　　　　＋　　　　　　十　　　　　
−マルトース　　　　　　　＋　　　　　　＋４−マン
ニトール　　　　　　−　　　　　　−−マンノース　
　　　　　　−　　　　　　−メレッツイトース　　　
　−−− メリビオース　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　
＋α−メチルグルコシド　　−　　　　　　−−ラフィ
ノース　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　＋ラム
ノース　　　　　　　−　　　　　　−−リボース　　
　　　　　　＋　　　　　　−＋（微弱）サリンン　　
　　　　　　−　　　　　　−−ソルビトール　　　　
　　−− ソルボース　　　　　　　−−− スターチ　　　　　　　　−　　　　　　−シュークロ
ース　　　　　＋　　　　　　−１−＋トレハロース　
　　　　　　−− キシロース　　　　　　　＋　　　　　　−−キンリト
ール　　　　　　−　　　　　　−栄養要求性ナイアシン　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　　
↓チアミン　　　　　　　　＋　　　　　　＋　　　　
　＋塩化コリン　　　　　　　　　　　　　　　＋　　
　　　　−リボフラビン　　　　　　＋　　　　　　−
パントテン酸カルンウム　＋　　　　　　＋　　　　　
＋ピリドキサール　　　　　−　　　　　　＋　　　　
　−低酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−ＤＮＡのＣＣＣ１０％）３９．１１　　　　　４
０．７　　　　４０．３ペブヂドグリカンの型　　Ｌ　
ｙｓ　　　　　　　Ｌ　ｙｓ　　　　　Ｌ　ｙｓＡ　ｓ
ｐ　　　　　　Ａ　ｓｐ　　　　　Ａ　ｓｐＡ　ｌａ　
　　　　　Ａ　ｌａ　　　　　Ａ　１ａＬａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｒｕｆｆｉ［ｎｉｓ　　Ｐ　Ｇ　−９
８の菌学的性質は次のとおりである。

細胞の形状　　　　　　　　　　　　短桿菌運動性　　
　　　　　　　　　　　　　−胞子形成能　　　　　　
　　　　　　　−ダラム染色性　　　　　　　　　　　
　　十酸素要求性　　　　　　　　　　　　微好気性酸
化・発酵テスト　　　　　　　　　　発酵発酵型式　　
　　　　　　　　　　ホモＬ−乳酸カタラーゼ　　　　
　　　　　　　　　−オキシダーゼ　　　　　　　　　
　　　−硝酸還元性　　　　　　　　　　　　　−ゼラ
ヂン液化性　　　　　　　　　　　−澱粉の加水分解　
　　　　　　　　　＋（微弱）エスクリンの分解　　　
　　　　　　　＋Ｉｌｌテスト　　　　　　　　　　　
　＋（微弱）ＶＰテスト　　　　　　　　　　　　　−
インドールの生成　　　　　　　　　　−硫化水素の生
成　　　　　　　　　　　−アルギニンからのＮｉ１．
生成　　　　　　　−リドマスミルクの反応　　　　　
　　不変グルコースからのガス生成　　　　　　−生育
至適温度　”Ｃ３０〜３７４５℃における生育　　　　　　　　　＝１５℃におけ
る生育　　　　　　　　　−ｐＨ４，０における生育　
　　　　　　　−ｐＨ９，６における生育　　　　　　
　　−３％食塩における生育　　　　　　　　−６，５
％食塩における生育　　　　　　−α−へモリシス　　
　　　　　　　　　　−β−へモリシス　　　　　　　
　　　　　−酸の生成アドニトール　　　　　　　　　　　−アラビノース　
　　　　　　　　　　−アラビトール　　　　　　　　
　　− アルブミン　　　　　　　　　　　　−セロビオース　
　　　　　　　　　　　＋ダルノトール　　　　　　　
　　　　　−フラクトース　　　　　　　　　　　＋ガ
ラクトース　　　　　　　　　　　＋グルコン酸　　　
　　　　　　　　　　−グルコース　　　　　　　　　
　　　　＋グリセロール　　　　　　　　　　− イノシトール　　　　　　　　　　　−イヌリン　　　
　　　　　　　　　　−ラクトース　　　　　　　　　
　　　−マルトース　　　　　　　　　　　　＋マンニ
トール　　　　　　　　　　　−マンノース　　　　　
　　　　　　　　＋メレチトース　　　　　　　　　　
　−メリビオース　　　　　　　　　　　−α−メチル
グリコシド　　　　　　　−ラフイノース　　　　　　
　　　　　＋ラムノース　　　　　　　　　　　　　−
リボース　　　　　　　　　　　　　−サリンン　　　
　　　　　　　　　　＋ソルビトール　　　　　　　　
　　　−ソルボース　　　　　　　　　　　　−スター
チ　　　　　　　　　　　　　十ン二一クロース　　　
　　　　　　　＋トレハロース　　　　　　　　　　　
　−キシロース　　　　　　　　　　　　　−キンリト
ール　　　　　　　　　　　−ＤＮＡのＧＣ含Ｉｔ（％
）　　　　　　　　４５．６ペプチドグリカンの型　　
　　　　−一〇ＡＰｌａ上記のストレプトコッカス・ミチオールＰＣ−１５４、
ストレプトコッカス・ボビスｐｃ−ｔｓ６およびストレ
プトコッカス・サリバリウスＰＣ−３０３Ｗは以下の菌
学的性質を有する。

分　離　源　　　　　　　ブタ空腸　　　ブタ結腸　　
　ブタ空腸細胞の形状　　　　　　　球　　　閑　　球
　　　菌　　球　　　菌（０，８〜１．ＯＸ　　（０，
８〜ｔ、ｏｘ　　（ｏ、８〜１．０×０．８−１．０μ
ｓ）　　　０．８〜１４μｓ）　　　０．１１−１．０
μｓ）短鎖状　短鎖状　短鎖状運動性　　　　−−− 胞子形成能　　　　　　　　　−−− グラム染色性　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　
　　　　＋酸素要求性　　　　　　通性嫌気性　　通性
嫌気性　　通性峰気性酸化・発酵テスト　　　　　発　
酵　　　　発　酵　　　　発　酵発酵型式　　　　　　
　ホモＬ−乳酸　　ホモＬ−乳酸　　ホモし一乳酸カタ
ラーゼ　　　　　　　　　−−− オキンダーゼ　　　　　　　　−−− 硝酸還元性　　　　　　　　　−−− ゼラチン液化性　　　　　　　−−− 椴松の加水分解　　　　　　　−十（微弱）　　　　　
＋エスクリンの分解　　　　　　−−＋ＭＲテスト　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　
　　　　＋ＶＰテスト　　　　　　　　＋（微弱）＋（
微弱）　　　　　＋インドールの生成　　　　　　−−
ＮＤアルギニンからのＩｌ［１，生成　　　−−−リド
マスミルクの反応　　酸（微弱）　　　酸（微弱）　　
　　　　ＮＤグルコースらのガス生成　　　−−ＮＤ生
生育適過温度’ｃ　　　　　　ａｎ〜３７２５〜３７３
０〜３７４５℃における生育　　　　　　−−−１５℃
における生育　　　　　　−−−ｐＨ４，０における生
育　　　−−ＮＤｐＨ９，６における生育　　　−−− ４％食塩における生育　　　　−−− ６，５％食塩における生育　　−−− ４０％机汁寒天での生育　　＋（微弱）＋（微弱）　　
　　　＋ムコイド生育（シェークロース培地）−ｍ− ａ−へモリシス　　　　　　　　−十（微弱）＋（微弱
）β−へモリシス　　　　　　　　−　　　　　　　−
−酸の生成アドニトール　　　　　　　Ｎ　Ｉ）　　　　　　　Ｎ
　Ｄ　　　　　　−アラビノース　　　　　　　−−− アルブチン　　　　　　　＋（微弱）　　　　　　　　
　　　　＋セロビオース　　　　　　　　＋　　　　　
　　＋フラクトース　　　　　　　＋　　　　　　　＋
ガラクトース　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　　
　　　＋グルコノ酸　　　　　　　　−−− グルコース　　　　　　　　＋　　　　　　　＋グリセ
ロール　　　　　　　−　　　　　　−−イノシトール
　　　　　　　−　　　　　　　−ＮＤエスクリン　　
　　　　　　−　　　　　　　−−ラクトース　　　　
　　　　＋　　　　　　　＋　　　　　　＋マルトース
　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　　　　　十マ
ンニトール　　　　　　　−　　　　　　−−マンノー
ス　　　　　　　　　　　　　　　　　＋　　　　　　
＋メレチトース　　　　　　　−−− メリビオース　　　　　　　−　　　　　　　−−ラフ
ィノース　　　　　　　＋　　　　　　　−ラムノース
　　　　　　　　−−− リボース　　　　　　　　　−−− サリノン　　　　　　　　　＋　　　　　　　＋　　　
　　　＋ソルビトール　　　　　　　−−− ンユークロース　　　　　　＋　　　　　　　＋　　　
　　　＋トレハｃ１−ス　　　　　　　　−　　　　　
　　−＋キンロース　　　　　　　　−−− キノリトール　　　　　　　ＮＤ　　　　　　　ＮＤ　
　　　　　−上表中、Ｌｙｓ、　Ａｓｐ、　Ａｌａｌ（
ｄｕ、　Ｏｒｎ、　Ｓｅｒ、ｍ　−Ｄ　Ａ　Ｐはそれぞ
れリジン、アスパラギン酸、アラニン、グルタミン酸、
オルニチン、セリン、メソジアミノピメリン酸を表わす
。また、“ＮＤ“は実験を実施していないことを示す。

上記の菌学的諸性質をもとに、パーツエイズ・マニュア
ル・オブ・システマティック・バクテリオロジイ・ボリ
ューム２（１９８Ｇ）によって、その分類学的位置を調
べるとＵＭ−１２株はフラクトース、片−シロースから
の酸の生成がそれぞれ陰性、陽性である点で、また、ｔ
ＪＭ−１８株およびＲｔ−５味はアラビノース、フラク
トース、リボースからの酸生成が陰性（ただしｒｔｔ−
５株はリボース微陽性）である点でやや異なっているも
のの、３株ともＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕ
ｔｅｒｌとするのが適切である。

なお、ＵＭ−１２殊とｎｔ−５株は生育温度および栄養
要求性の点で異なるので、互いにその変種と考えられる
。Ｐ（、−９８株はＬａｃｔｏｂａｃ　ｉ　ｌ　ｌｕｓ
ｒｕｍｉｎｉｓとほぼ一致する。また、ＰＧ−１５４株
はα−へモリシスが陰性であり、ソルビトールの発酵性
が陽性である点が異なるものの５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｍ１ｔｉｏｒとするの
が適切であり、ＰＣ−１８６株はエスクリンの加水分解
が陰性である点が異なるものの、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ　　ｂｏｖｉｓとするのが適切である。またＰＧ
−３０３Ｗ株は５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ａｌ
ｉｖａｒｉｕｓとするのが適切である。

これらの微生物菌株を培養して酸性ウレアーゼを蓄積さ
せるには、通常の静（４培養、振盪培養、通気攪拌培養
あるいは固体培養などを連続的あるいは間欠的に行なう
ことによって達成されるが、とりわけ静置培養が望まし
い。用いる培地は、使用する微生物の生育しうる通常の
組成のものでよく、炭素源には炭水化物、油脂、詣肪酸
、有機酸あるいはアルコール類などのなかから資化しう
るちのを適宜選択し、単独または混合して使用される。

また窒素源には例えばペプトン、大豆粉、綿実粉、コー
ンステイープリカー、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキ
ス、ホエーなどの有機窒素源のほか、硫安、塩安、硝安
、燐安などの無機窒素源が必要に応じて、適宜混合して
または単独で用いられろ。培地には炭素源、窒素源のほ
か生育や醪素形成に必要なミネラル、アミノ酸あるいは
ビタミンなどの必須因子や促進物質を添加するのがよい
。さらに酸性ウレアーゼの生成を誘導するために尿素、
チオ尿素などを添加することもある。培養中のｐＨおよ
び泡の管理の目的で苛性アルカリ液、炭酸ナトリウム液
、カルシウム塩類を適宜補添したり、消泡剤の添加も有
効である。

培養の温度は、用いる微生物の生育に適した温度を遣損
すればよく、通常１５℃乃至５５°Ｃ１好ましくは２５
℃乃至４５℃で培養するのが有利である。また培養の時
間は、用いる微生物の生育および酸性ウレアーゼの生成
に十分な時間続行されるが、通常５乃至１２０時間を要
する。

このようにして培養後、酸性ウレアーゼは通常、微生物
菌体に含有されている。そこで、培養液から遠心分離、
沈降分離、凝集分離、多孔性膜や高分子膜、セラミック
膜などによるろ過などの方法によって集菌された生菌体
を、凍結融解処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧処理
、細胞壁膜の溶解処理、界面活性剤処理などの方法を単
独もしくは組み合わ仕て行なうことによって、該酵素を
可溶化し、プロタミン処理、塩析、有機溶媒処理、等重
点沈殿、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、品出など
の通常の酵素の精製手段を適宜組み合わせることによっ
て、蛋白質的に単一な酵素標品を得ることができる。

酵素活性測定法本願明細書において、ウレアーゼ活性は、３７℃、ｐＨ
４，０において次のように測定した。適宜に希釈した酵
素液２Ｍｌを３７℃で正確に５分間加温する。この液に
３７℃に加温した基質溶液２−を加えて振りまぜ、３７
°Ｃで正確に３０分間反応させる。反応終了後、直ちに
１０％トリクロル酢酸４−を加え、振りまぜた後、遠心
分離（ｇ、ｏｏ。

ｒｐｍ、　５分間）し、その上清液２−をとり水を加え
て２０ｄとする。この液４ｄに、発色液Ａ液を２ｄ加え
、静かに混和する。続いて発色液ＢＫ！ｉ、を２戒加え
、同様に静かに混和した後、３７℃で３０分間反応させ
る。次に、室温で、６４０ｎｍの吸光度を、水を対照液
として測定する。

一方、上記酵素液２ｄに基質溶液のかわりに、０．２Ｍ
クエン酸バッファー２〃Ｊを加えて振りまぜ、３７℃で
正確に３０分間反応させた液について、上記と同様に操
作し酵素液空試験とする。

また、硫酸アンモニウム標準液（５０ｇｇ／ｄ）２ｄ、
ｔｏ％トリクロル酢酸ｌ蔵および０．２Ｍクエン酸バッ
ファー０．５！をとり、水を加えて２０滅とし、この液
について上記と同様に発色操作し標へへ液とする。また
、１０％トリクロル酢酸１蔵、お上び０，２Ｍクエン酸
バッファー０．５ｄをとり、水を加えて２０＃ｌ１２と
し、同様に発色操作し標ｒＩｌＩＳ液の空試験とする。

次式により、酵素活性を算出する。

なお、１分間当り１μｍｏｌのＮ　ｔｌ　ｓを生成する
酵素ｍを１単位（Ｕ）とする。上記測定法中の試薬およ
び試液の調製法は以下のとおりである。基質溶液は尿素
１．０ｇを０．２Ｍクエン酸バッファーに溶解し、１０
０ｄとする。１０％トリクロル酢酸溶液はトリクロル酢
酸ｌｏｇを水に溶解し、１００滅とする。発色液Ａ液（
フェノール・ニトロプルジッドナトリウム溶液）はフェ
ノール５ｇおよびニトロプルジッドナトリウム２５ｍｇ
を水に溶解し、５００−とする。発色液Ｂ液（アルカリ
性次亜塩素酸ソーダ溶液）は水酸化ナトリウム５．０ｇ
および次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素濃度５％）
７．５ｍＭを水に溶解し、５００成とする。

０．２Ｍクエン酸バッファーはクエン酸（１水塩）２５
．１８ｇ、およびクエン酸ナトリウム（２水塩）２３．
５９ｇを水に溶解し、１０００威とする（ｐＨ４，０に
なる。）。硫酸アンモニウム標準液（５０ｇｇ／＋Ｊ）
は硫酸アンモニウム２５０．０ｍｇを正確にとり、水に
溶解して２５０−とする。この液５−をとり水を加えて
ｔｏｏｙとする。

実施例以下に実施例をもって、本発明の内容を上り具体的に説
明するが、これは本発明の内容を例示するものにすぎず
、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１市販ＣＡＭ半流動培地（日永製薬）に生育した、Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅｕｔｅｒｉ　　Ｒｔ−５
（ＩＦＯ１４６３１、ＦＥＲＭ　　Ｂ’Ｐ−１＝１４７
）株をグルコース３％、ポリペプトン１．５％、肉エキ
ス１％、酵母エキス０．８％、食塩０．５％、無水酢酸
ナトリウム０．２％、硫酸マンガン（約４水塩）０．０
０５％、硫酸ニッケル（６水塩）０．００１％、ｐＨ７
，０（３０％苛性アルカリにて中和）からなる滅菌シー
ド培地５０−を含む２００蔵容三角フラスコｌＯ本に接
種して、３４℃で２４時間、静置培養した。このシード
培養物を同じ組成からなる滅菌培地ｌＱを含む、２Ｑ容
三角フラスコ１０本にそれぞれに移植し、３２℃で２日
間静置培養したところ、２１．６Ｕ／ｄの酸性ウレアー
ゼ活性を示す培養液がｌＯＱ得られた。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、０．０５Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７，２）で２回洗浄後、４１２の０．０５
Ｍ燐酸媛衝液（ｐＨ７，２）、Ｉ＋ｎＭのＥＤＴＡおよ
び１ｍＭのジチオスレイトールを含む液に懸濁し、径０
．１乃至０．２１１１ｍのガラスピーズ２Ｑを加えて菌
体破砕機で４５０Ｏｒｐｍ、２０分間処理をした。これ
を遠心分離し、その上清に８０％になるようにエタノー
ルを添加して、その沈殿区分を遠心分離によって集め、
ＩｍＭのＥＤＴＡおよび２メルカプトエタノールを含む
０．０５Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解後
、セファデックスＧ−１００カラム（径７．５ｃｍ×長
さ９０ｃｍ）に吸着し、同緩衝液で溶出し活性区分を集
液した。つぎに同緩衝液で緩衝化したセファデックスＣ
−２００カラム（径４．５ｃＩＩｌｘ長さ１５０ｃｍ）
に吸着後、同緩衝液で溶出して活性区分を集液し、さら
に同様に緩衝化したＤＥＡＥセファデックスＣＬ−６Ｂ
に吸着させ、０〜０．７Ｍ食塩を含む同緩衝液でグラジ
ェント溶出して、活性区分を集液した。この液をアミコ
ン８２００型、ＵＫ−５０膜（分子量カット５０，００
０）の限外ろ過器で濃縮し、緩衝液を１ｍＭの２メルカ
プトエタノールを含む０．００５Ｍ燐酸緩衝液（ｐｌ−
１７、０）に交換した。次にアフィプレップ１０（バイ
オランド社製）とヒドロキシウレアとで作製したアフィ
ニティーゲルクロマト（径４ｃＩＩＩ×長さ５０ｃｍ）
に吸着させ、０．００５Ｍ−０，０４４Ｍの燐酸緩衝液
でグラジェント溶出して活性区分を集め、上記と同じ限
外ろ過器で濃縮、脱塩し、凍結乾燥して精製酵素粉末１
０４ｍｇを得た。この粉末の比活性は３３６．５　Ｕ／
ｍｇであり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一の
蛋白質のバンドを示した。これらの精製の経過を第１表
に示した。

第１表精製操作総蛋白質　総活性　比活性　収率（ｇ）　　　（ｘｔｏ’ｔｌ）　（Ｕ／ｍｇたん　（％
）エタノール　　　　　　　５．２　　　１５７．６　
　３０．３　　　８６．０セファデックスＧ−１００３
，０１４０，１４６，７７６，４セファデックスＧ−２
００１，０７８，７７ｇ、７　　　４２．９ＤＥＡＥセ
ファロースＣＬ−６Ｂ　　Ｏ，３７６０，７１６４，０
３３，１アフイニテイーゲル　　　０．ＩＱ　　　３５
．４　３５４．０　　　１９．３上記の方法で得られた
凍結乾燥品の酸性ウレアーゼの酵素化学的および理化学
的性質は次のとおりである。

酸性ウレアーゼＡ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モル゛の炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレット、
メチル尿素、アラントイン酸およびアラントインにも若
干作用する。（第２表）基質　　　　　　　　　相対活
性（％）尿素　　　　　　　　　　　１００．０アラン
トイン　　　　　　　　　１．２アラントイン酸　　　
　　　　　８．８ビウレツト　　　　　　　　　　６４
．ｌメチル尿素　　　　　　　　　　４．９（３）至適
ｐＨおよびｐｉ−１安定性第１図に示されろように、至Ｊａｐ　Ｉ−ｒは２乃至４
．５である。また、３７℃で各ｐ　Ｉ−１に３０分間保
存した場合の残存活性を、第２図に示した。図から明ら
かなように、ｐｌＴ　６乃至８で安定であり、ｐｔ１２
乃至１０の範囲でかなり安定である。

（４）至適温度および温度安定性第３図に示されるように、至適温度は６０℃乃至７０℃
である。また、＋１１１−１４およびｐＨ６で各温度に
３０分間保持した場合の残存活性を、第４図に示した。

図から明らかなように、ｐＨ（ｉでは６０℃まで安定で
あり、ｐＨ４では６０℃までかなり安定である。

（５）阻害剤第３表に示されるように、塩化第二水銀、硝酸銀、ヨー
ド酢酸およびアセトヒドロキサム酸によって阻害される
。

第３表なし　　　　　　　　　　　　１００．０ＡｇＮ　Ｏ３
０，０５ｍＭ　　　　　　Ｏ，７ＭｇＣｉｓ　　　　　
０．０５ｍＭ　　　　　　Ｏ，６ヨード酢酸　　１　　
ｍＭ　　　　　１５．４アセトヒドロ（６）分子量セファデックスＧ−２００ゲルろ過去で、約２２０．０
００である。

（７）等電点ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法で約
４，７である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定せず。

（１Ｇ）　　Ｋｎ＋値Ｋｍｆｐ’ｉは１．７ｍＭ　（ｐｌ−ｔ　　４．０　、
１　Ｍクエン酸バッファー）。

実施例２１、ａｃＬｏｂａｃＮｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ　
Ｊ　ＣＭ　　５８６７（ＩＩ；’０　１４５１１．ＦＥ
ｒ（Ｍ　　ｌ３Ｐ−１４５４）を実施例１と同様の方法
で培養して得られたシード培逐物をグルコース４％、ポ
リペプトン１．５％、肉エキス１％、酵母エキス０．８
％、食塩０．５％、無水酢酸ナトリウム０．２％、尿素
０．５％、硫酸マンガン（約４水塩）０．０５％、硫酸
ニッケル（６水１ｍ）０．００２％、硫酸コバルト（７
水塩）０．００２％、硫酸第一スズ０．００５％、硫酸
ストロンチウム０．００１％、ｐＨ７，０（３０％苛性
アルカリにて中和）からなる滅菌培地ＩＱを含む、２Ｑ
容三角フラスコ１０本にそれぞれに移植し、３２℃で２
日間静置培養したところ、５．６Ｕ／−の酸性ウレアー
ゼ活性を示す培養液が１０Ｑ得られた。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、００５Ｍ燐酸緩
衝液（ｐｌ−１７、２）で２回洗浄後、４Ｑの０．０５
Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，２）、１ｍＭのＥ　Ｉ）　Ｔ　
Ａおよび１ｍＭのジチオスレイトールを含む液に懸濁し
、径０．１乃至０　、２　ｎ＋ｍのガラスピーズ２Ｑを
加えて菌体破砕機で４５０Ｏｒｐｍ、２０分間処理をし
た。これを遠心分離し、その上清に８０％になるように
エタノールを添加して、その沈殿区分を遠心分離によっ
て集め、ＩｍＭのＥＤＴＡおよび２メルカプトエタノー
ルを含む０．０５Ｍ）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）
に溶解後、セファデックスＧ−１００カラム（径７．５
ｃｎ×長さ９０ｃｍ）に吸着し、同緩衝液で溶出し活性
区分を集液した。つぎに同緩衝液で緩衝化したセファデ
ックスＧ−２００カラム（径４．５ｃｍｘ長さ１５０ｃ
ｍ）に吸着後、同緩衝液で溶出して活性区分を集液し、
さらに同様に緩衝化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５
０に吸着させ、０〜０．７Ｍの食塩を含む同緩衝液でグ
ラジェント溶出して、活性区分を集液して、比活性を測
定したところ、３５　、２　Ｕ／ｍｇたん白質であり、
活性の収率は４３．７％であった。このものの酵素化学
的性質は次のようであった。

酸性ウレアーゼＢ：（＋）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレット、
メチル尿素およびアラントイン酸にも若干作用する。（
第４表）尿素　　　　　　　　　　　ｔｏｏ、。

アラントイン　　　　　　　　　０，０アラントイン酸
　　　　　　　　３．７ビウレツト　　　　　　　　　
　７２．Ｏメチル尿素　　　　　　　　　１４．０（３
）至適ｐｉ−１および１）Ｉ−１安定性第５図に示され
るように、至適ｐＨはＯ，１Ｍクエン酸バッファーでｐ
Ｈ３である。３７℃で各ｐＨに３０分間保存した場合の
残存活性を、第６図に示した。図から明らかなように、
ｐＨ６乃至８で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第７図に示されるように、至適温度は６０℃乃至７０℃
である。また、ｐＨ４およびｐＨ６で３０分間保持した
場合の残存活性を、第８図に示した。

図から明らかなように、ｐｉ−１６では８０℃まで、ｐ
Ｈ４では６０℃まで安定である。

（５）阻害剤第５表に示されるように、塩化第二水銀、硝酸銀、硫酸
銅、アセトヒドロキサム酸によって阻害される。

第５表なし　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０Ａｇ
Ｎ　Ｏ３０，０５ｍＭ　　　　Ｏ，４ＣｕＳＯ−・５１
１＊ＯＯ，４ｍＭ　　　　４７．６ｔ１ｇｃ　Ｉｔ　　
　　　　　Ｏ，００５ｍＭ　　　　Ｏ，８ヨード酢・酸
　　　　　　　１　　　ｍＭ　　　　　９６．２（６）
分子量セファデックスＧ−２００ゲルろ過性で、約２１万乃至
２２万である。

（７）等電点ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法で約
４．８である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分計結晶化困難のため測定せず。

（１０）　　Ｋｍ値Ｋｍ値は１．０ｍＭ　（＋）Ｈ２，０，１Ｍクエン酸バ
ッファー）。

実施例３市販ＣＡＭ半流動培地（日永製薬）に生育した、５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　ｂｏｖｉｓ　　Ｐ　Ｇ　−１
８６（Ｉ　Ｆ　０１４６３４、ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４
４９）株をグルコース４％、ポリペプトン１．５％、肉
エキス１％、酵母エキス０，８％、食塩０．５％、無水
酢酸ナトリウム０．２％、尿素０．５％、硫酸マンガン
（約４水塩）０．００５％、硫酸ニッケル（６水塩）０
．００１％からなる滅菌シード培地５０成を含む２００
−容三角フラスコｌＯ本に接種して、３４℃で２４時間
、静置培養した。このシード培養物を同じ組成からなる
滅菌培地ｌＱを含む、２１２容三角フラスコｌＯ本にそ
れぞれ移植し、３２℃で２日間静置培養したところ、７
．６Ｕ／ｄの酸性ウレアーゼ活性を示す培養液が１０Ｑ
得られた。

この培養液を遠心分離して菌体集め、０．０５Ｍ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，２）で２回洗浄後、４Ｑの０．０５Ｍ燐
酸緩衝Ｌ＆（ｐｘ−ｒ　７　、２　）、１ｎ＋ＭのＥＤ
ＴＡおよび１ｍＭのジチオスレイトールを含む液に懸濁
し、径０．１乃至０　、２　ｍｍのガラスピーズ２Ｑを
加えて菌体破砕機で４５０Ｏｒｐｍ、２０分間処理をし
た。これを遠心分離し、その上清に８０％になるように
エタノールを添加して、その沈殿区分を遠心分離によっ
て集め、１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび２メルカプトエ
タノールを含む０．０５Ｍトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解後、セファデックスＧ−１００カラム（径
７．５ｃｍＸ長さ９０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液で溶
出し活性区分を集液した。つぎに同緩衝液で緩衝化した
セファデックスＧ−２００カラム（径４．５ｃｍｘ長さ
１５０ｃ＋＋＋）に吸着後、同緩衝液で溶出して活性区
分を集液し、さらに同様に緩衝化したＤＥＡＥセファデ
ックスＣＬ−６Ｂに吸着させ、０〜０，７Ｍ食塩を含む
同緩衝液でグラジェント溶出して、活性区分を集液した
。この液をアミコン８２００型、ｔＪＫ−５０膜（分子
量カット５０，０００）の限外ろ過器で濃縮し、緩衝液
を１ｍＭの２メルカプトエタノール含む０．００５Ｍ燐
酸緩衝液（ｐＨ７、０）に交換した。次にアフィプレッ
プ！０（バイオラッド社製）とヒドロキシウレアとで作
製したアフィニティーゲルクロマト（径４ｃｍＸ長さ５
０ｃｍ）に吸着させ、０．００５Ｍ〜０．０４４Ｍの燐
酸緩衝液でグラジェント溶出して活性区分を集め、上記
と同じ限外ろ過器で濃縮、脱塩し、凍結乾燥して酵素粉
末５０ｍｇを得た。この粉末の比活性は１２４ｔＪ／ｍ
ｇたん白質であり、その酵素化学的および理化学的性質
は次のとおりである。

酸性ウレアーゼＣ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用する（第６表）。

第６表尿素　　　　　　　　　　　　ｔｏｏ、。

アラントイン酸　　　　　　　　０．０ビウレツト　　
　　　　　　　　　０．０（３）至適ｐＨおよびｐＨ安
定性第９図に示されるように、至適ｐ　ｉ−ｔは５付近でま
た、３７℃で各ｐ　Ｉ−１に３０分間保存した場合の残
存活性を、第１θ図に示した。図から明らかなように、
ｐ［４６乃至１０で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第１１図に示されるように、至適温度は６０℃乃至７０
℃である。また、ｐＨ６で各温度に３０分間保持した場
合の残存活性を、第１２図に示した。図から明らかなよ
うに、ｐＨ６では３０℃まで安定である。

（５）阻害剤第７表に示されるように、塩化第二水銀、アセトヒドロ
キサム酸によって阻害される。

なし　　　　　　　　　　　　１００．０ＢｇＣ１＊　
　　　　１　　ｍＭ　　　　　Ｏ，０ヨード酢酸　　　
１０　、ｍＭ　　　　　８９．８アセトヒドロキサム酸　　　ｔｏ　　ｍＭ　　　　　９．８（６）分
子量ポリアクリルアミド電気泳動法［エンらの方法、Ｈ，Ｅ
ｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ：　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ、、　３２．４８７（１９８６）］で約１９万
である。また、セファデックスＧ−２００ゲルろ過法で
約１７万である。

（７）等重点等重点電気泳動法で約４．７である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定せず。

（１０）　　ＫｍｆｐｌＫｍｌ’ｉは０．２ｍＭ　（＋）Ｉ−１５，０，Ｏ，１
Ｍクエン酸バッファー）。

実施例４実施例３と同様にして、Ｓｔ　ｒｅｐｔＯｃＯｃｅｕｓ
ｍｉｔｉｏｒ　　ＰＧ−１５４（ＩＦＯ１４６３３、Ｆ
ＥＲＭ　　ＢＰ−１４４８）株を培養したところ、５．
４０／ｄの酸性ウレアーゼ活性を示す培養液が１ｏｆ２
得られた。

この培養液を遠心分離して菌体を集め、０．０５Ｍ燐酸
緩衝液（ｐＨ７，２）で２回洗浄後、４Ｑの０．０５Ｍ
燐酸緩衝液（ｐＨ７，２）、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１
＋Ｍのジチオスレイトールを含む液に懸濁し、径０．１
乃至０．２１のガラスピーズ２Ｑを加えて菌体破砕機で
４５０Ｏｒｐｍ、２０分間処理をした。これを遠心分離
し、その上清に８０％になるようにエタノールを添加し
て、その沈殿区分を遠心分離によって集め、１ｍＭのＥ
ＤＴＡおよび２メルカプトエタノールを含む０．０５Ｍ
）リス・塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解後、セファデ
ックスＧ−１００カラム（径７．５ｃａ＋×長さ９０ｃ
ｎ＋）に吸着させ、同緩衝液で溶出し活性区分を集液し
た。つぎに同緩衝液で緩衝化したセファデックスＧ−２
００カラム（径４．５ｃＩＩｌｘ長さ１５０ｃｍ）に吸
着後、同ｖＩｉ衝液で溶出して活性区分を集液し、さら
に同様に緩衝化したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０に
吸着させ、０〜０．７Ｍの食塩を含む同緩衝液でグラジ
ェント溶出して、活性区分を集液して、比活性を測定し
たところ、７Ｇ、３ｔＪ／１１１ｇたん白質であり、活
性の収率は３８．７％であった。このものの酵素化学的
性質は次のようであった。

酸性ウレアーゼＤ：（＋）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレットに
も若干作用する（第８表）。

第８表活質　　　　　　　　　相対活性（％）尿素　　　　　
　　　　　　　１００．０アラントイン酸　　　　　　
　　０．０ビウレツト　　　　　　　　　　２２．０（
３）至適ｐＨおよびｐ　Ｉ−Ｉ安定性第１３図に示され
るように、至Ｈｐ　ｔ−ｔはｐｉ−１４ないし５である
。３７℃で各ｐ　Ｈに３０分間保存した場合の残存活性
を、第１４図に示した。図から明らかなように、ｐＨ４
乃至８で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第１５図に示されるように、至適温度は６０℃付近であ
る。また、ｐＨ６で３０分間保持した場合の残存活性を
、第１６図に示した。図から明らかなように、ｐＨ６で
は６０℃まで安定である。

（５）阻害剤第９表に示されるように、塩化第二水銀、ヨード酢酸、
アセトヒドロキサム酸によって阻害される。

阻害剤　　　　濃度　　　相対活性（％）なし　　　　
　　　　　　　　ｔｏｏ、。

ＨｇＣ１＊　　　　　ｌ　　ｍＭ　　　　　Ｏ，０ヨー
ド酢酸　　　１Ｇ　　ＩＩＩＭ　　　　　Ｏ，６アセト
ヒドロ（６）分子量ポリアクリルアミド電気泳動法で、約１６万である。ま
たセファデックスＧ−２００ゲルろ過去で約１７万であ
る。

（７）等電点等電点電気泳動法で約４，６である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため１ｌｌｌｌ定Ｕ・ず。

（１０）　　Ｋｍ値Ｋｍ値は０．３ｍＭ　　（ｐＨ４，０，１Ｍクエン酸）
くツファー）。

実施例５実施例３と同様に５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　　５ａ
ｌｉｖａｒｉｕｓＰＧ−３０３Ｗ（ＩＦＯ１４７４６、
ＦＥＲＭＢｐ−ｔ８５６）ｉを培ａ　Ｌ　７．：ところ
、４．３Ｕ／ｄの酸性ウレアーゼ活性を示す培養液力＜
１Ｏｆ２得られた。この培ａ液から実施例４と同様の方
法で酵素を精製し、比活性を測定したところ、６８．２
Ｕ／ｍｇたん白質であり、活性の収率（よ４１２％であ
った。このものの酵素化学的性質は次のようであった。

酸性ウレアーゼＥ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、アラントイン酸、ビウレッ
ト、エチル尿素にも若干作用する（第１θ表）。

尿素　　　　　　　　　　　１００．０アラントイン酸
　　　　　　　１２．０ビウレツト　　　　　　　　　
　６０・０（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性第１７図に示されるように、至適ｐＩＩはｐｌ（４であ
る。３７°Ｃで各ｐＨに３０分間保存した場合の残存活
性を、第　１８図に示した。図から明らかなように、ｐ
Ｈ６乃至１１で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第１９図に示されるように、至適温度は６０℃乃至７０
℃である。また、ｐＨ６で３０分間保持した場合の残存
活性を、第２０図に示した。図から明らかなように、ｐ
Ｈ６では６０℃まで安定である。

（５）阻害剤第１！表に示されるように、塩化第二水銀、アセトヒド
ロキサム酸によって阻害される。

阻害剤　　　　濃度　　　相対活性（％）なし　　　　
　　　　　　　　ｔｏｏ、。

ＨｇＣ１ｘ　　　　　０．０５ｍＭ　　　　２．０ヨー
ド酢酸　　　１０　　ＩＩＩＭ　　　　１００．０アセ
トヒドロ（６）分子量ポリアクリルアミド電気泳動法で、約１１万である。ま
たセファデックスＧ−２００ゲルろ過法で約１４万であ
る。

（７）等電点等電点電気泳動法で約４，７である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定せず。

（ｔｏ）　　Ｋａ＋値Ｋｍ（直は０．２ｍＭ　（ｐＨ４，０，１Ｍクエン酸バ
ッファー）。

実施例６実施例１と同様にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ｒｕｍ
ｉｎｉｓ　　ＰＧ−９８（ＩＦＯ１４６３２、ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１９０６）株を培養したところ、５．２Ｕ／
１ｎｌの酸性ウレアーゼ活性を示す培養液が１０７２得
られた。この培養液から実施例２と同様の方法で酵素を
精製し、比活性を測定したところ、３６．７Ｕ／ｌｌ１
ｇたん白質であり、活性の収率は４２．８％であった。

この乙のの酵素化学的および理化学的性質は次のとおり
である。

酸性ウレアーゼＦ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）　　Ｊｌ１１’質特穴性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレツトに
ら若干作用する（第１２表）。

尿素　　　　　　　　　　　ｔｏｏ、。

アラントイン酸　　　　　　　　０．０ビウレツト　　
　　　　　　　　２６．０（３）至適ｐＨおよびｐｌ−
１安定性第２１図に示されるように、至適ｐｌ（はｐＨ５である
。３７°Ｃで各ｐ　Ｉ−１に３０分間保存した場合の残
存活性を、第　２２図に示した。図から明らかなように
、ｐｌ−１４乃至８で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第２３図に示されるように、至適Ｘ度は５５乃至６０℃
である。また、ｐＨ４およびｐＨ６で３０分間保持した
場合の残存活性を、第２４図に示した。図から明らかな
ように、ｐＨ６では５５℃まで、ｐｌ−１４では３０℃
まで安定である。

（５）阻害剤第１３表に示されるように、塩化第二水銀、ヨード酢酸
およびアセトヒドロキサム酸によって阻害される。

なし　　　　　　　　　　　　　　　　ｔｏｏ、。

ＨｇＣＩｓ　　　　　　　　　Ｏ，０５ｍＭ　　　　　
Ｏ，０ヨード酢酸　　　　　　ｔｏ　　ｍＭ　　　　５
０．０（６）分子量セファデックスＧ−２００ゲルろ過法で、約１５万であ
る。

（７）等電点等電点電気泳動法で約４．７である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定せず。

（１Ｇ）　　Ｋｍ値Ｋｍ値は１．２ｍＭである（ｐｌ−１５，０，１Ｍクエ
ン酸バッファー）。

実施例７実施例１と同様にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅ
ｕｔｅｒｉＵ’Ｍ−１２（ＩＦＯ１４６２９、ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１９０４）味を培養したところ、３．６　ｔ
Ｊ／威の酸性ウレアーゼ活性を示す培養液が１０Ｑ得ら
れた。この培ａ液から実施例２と同様の方法で酵素を精
製し、比活性を測定したところ、３３．４０／ｍｇたん
白質であり、活性の収率は４５．３％であった。このも
のの酵素化学的および理化学的性質は次のとおりである
。

酸性ウレアーゼＧ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレットに
も若干作用する（第１４表）。

尿素　　　　　　　　　　　　ｉｏｏ、。

アラントイン酸　　　　　　　　０．０ビウレツト　　
　　　　　　　　　７．９（３）至適ｐＨおよびｐＨ安
定性第２５図に示されるように、至適ｐＨはｐＨ４である。

３７℃で各ｐＨに３０分間保存した場合の残存活性を、
第　２６図に示した。図から明らかなように、ｐＨ４乃
至８で安定である。

（４）至適温度および温度安定性第２７図に示されるように、至適温度は７０乃至７５℃
である。また、ｐＨ４およびｐＨ６で３０分間保持した
場合の残存活性を、第２８図に示した。図から明らかな
ように、ｐＨ６では７５°Ｃまで安定てあり、ｐＨ４で
は６５℃まで安定である。

（５）阻害剤第１５表に示されるように、塩化第二水銀、アセトヒド
ロキサム酸によって阻害される。

なし　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０ｔ１
ｇｃ　ｌ＊　　　　　　　　　０．０５ｍＭ　　　　　
Ｏ，０ヨード酢酸　　　　　　１０　　ｍＭ　　’　　
１００．０（６）分子ｍセファデックスＧ−２００ゲルろ過法で、約２１万であ
る。

（７）等電点等電点電気泳動法で約４．８である。

（８）結晶構造本酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定せず。

（１０）　　Ｋｍ値Ｋｍ値は１．３ｍＭである（ｐＨ４，０，１Ｍクエン酸
バッファー）。

実施例８実施例Ｉと同様にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｒｅ
ｕｔｅｒｉＵＭ−１８（ＩＦｏ　　１４６３０、ＦＥＩ
’１Ｍ　　［３Ｆ−１９０５）株を培養したところ、４
．５０／ｍＭの酸性ウレアーゼ活性を示す培養液が１ｏ
ｆ２得られた。この培養液から実施例２と同様の方法で
酵素を精製し、比活性を測定したところ、３９，８Ｕ／
ｍｇたん白質であり、活性の収率は４１．７％であった
。このものの酵素化学的および理化学的性質は次のとお
りである。

酸性ウレアーゼＨ：（１）　　作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。

（２）基質特異性尿素に最もよく作用するが、エチル尿素、ビウレットお
よびアラントイン酸にも若干作用する（第１６表）。

第１６表基質　　　　　　　　　相対活性（％）尿素　　　　　
　　　　　　　１００．０アラントイン酸　　　　　　
　１２．３ビウレヅト　　　　　　　　　　８２．４（
３）至適ｐＨおよびｌ）　Ｉ−１安定性第２９図に示さ
れるように、至適ｐＨはｐＨ３である。３７℃で各ｐＸ
ｔに３０分間保存した場合の残存活性を、第３０図に示
した。図から明らかなように、ｐＨ５乃至８で安定であ
る。

（４）至適温度および温度安定性第３１図に示されるように、至適温度は７０乃至７５℃
である。また、ｐＴ（４およびｐＨ６で３０分間保持し
た場合の残存活性を、第３２図に示した。図から明らか
なように、ｐＨ６では７０℃まで安定であり、ｐ！］４
では６５℃まで安定である。

（５）阻害剤第１７表に示されるように、塩化第二水銀、アセトヒド
ロキサム酸によって阻害される。

なし　　　　　　　　　　　　　　　　１００．ＯＨｇ
Ｃｌ＊　　　　　　　　　０．０５ｍＭ　　　　　Ｏ，
０ヨード酢酸　　　　　　１０　　ｍＭ　　　　９９．
０（６）分子量セファデックスＧ−２００ゲルろ過法で、約２３万であ
る。

（７）等電点等重点電気泳動法で約４．５である。

（８）結晶構造木酵素は結晶化が困難である。

（９）元素分析結晶化困難のため測定Ｕ−ず。

（１０）　　　Ｋ　ｍ（直Ｋｍ値は４．８ｍＭである（ｐＨ３，０，１Ｍクエン酸
バッファー）。

試験例１実施例３．４および５でえられた酸性ウレアーゼＣ，Ｄ
およびＥの各酵素活性を、２０％または５０％濃度のエ
タノールを含む反応中で測定したところ、第１８表に示
すように、いずれの酵素もエタノール存在下であっても
尿素をよく分解した。

ウレアーゼ　　　　　　　　エタノール濃度（％）酸性
ウレアーゼＣＩｏｏ　　　　ｇ４．２　　５１．６酸性
ウレアーゼＤ　　　　　　　１００　　　８５．０　　
５Ｇ、４（注）エタノールＯ％の場合の各酵素活性を１
００とする。

試験例２実施例１’　、　２　、６　、７および８でそれぞれ得
られた酸性ウレアーゼＡ、Ｉ３．Ｆ、ＧおよびＩ］なら
びに市販ナタ豆起源のウレアーゼ（Ｐ、Ｌ、バイオケミ
カルズ社製、至適　　ｐｌ（７、０）ヲＩ　ＯＵ／ｄノ
ｅ度１ご調製しエタノール２０％存在下で、反応温度２
０℃で尿素分解活性を比較したところ、第１９表に示す
ように、ナタ豆ウレアーゼに較べ、いずれの酸性ウレア
ーゼもエタノール存在下で強い尿素分解能を示した。

第１９表（注）ナタ豆ウレアーゼの酵素活性を１００．とする。

発明の効果本発明の新規ウレアーゼは、従来のウレアーゼに比べて
、酸性域に活性の至適ｐｌ（を有し、酸性ｐ■および温
度安定性にすぐれている点で、工業的に利用性の高いウ
レアーゼである。特に、本ウレアーゼはエタノールによ
る阻害を受けにくく、かつ比活性が２０Ｕ／ｍｇたん白
質以上であり、従って酒類中の尿素分解除去に少量でも
効果があり、酒類の品質改良の目的により有利に使用で
きる。一方、本ウレアーゼは臨床検査において血液ある
いは尿中の尿素や、食品分析等における尿素定ｍ用の試
薬としても極めて有効である。たとえば、酒類中の尿素
を定ｍする場合に、本ウレアーゼで尿素をアンモニアに
分解したのちインドフェノール法を適用することにより
精度よく尿素の定量ができる。

【図面の簡単な説明】

第１．２．３および４図は実施例１で得られたウレアー
ゼについてのｐ　Ｉ−ｒおよび温度と酵素活性との関係
を示す。第１図は３７°Ｃで測定した、ｐｔ−を活性曲線を表わ
し、図中・はＯ，１Ｍクエン酸バッファー、○は０．１
Ｍ酢酸バッファー、×は０．１Ｍベロナール・酢酸・塩
酸バッファー中で、それぞれ測定した結果を示す。第２
図はｐＨ安定性を調べたもので、３７℃、３０分間処理
した場合の残存活性を表わす。第３図はｐＨ４の０．１
Ｍクエン酸バッファー中での温度活性曲線を表わす。第
４図は温度安定性を調べたもので、各温度で３０分間処
理した場合の残存活性を表わし、図中○はｐＨ４の場合
、・はｐＨ６の場合を示す。以下、第５．６．７および
８図は実施例２、第９．１Ｏ１１１および１２図は実施
例３、第１３．１４、！５および１６図は実施例４、第
１７．１８．１９および２０図は実施例５、第２１，２
２．２３お上び２４図は実施例６、第２５．２６．２７
および２８図は実施例７、第２９．３０．３１および３
２図は実施例８でそれぞれ得られたウレアーゼについて
のＩ）Ｈおよび温度と酵素活性との関係を示１し、ｐＨ
安定性の試験以外は全て０．１Ｍクエン酸バッファ中で
試験を行なった。代理人　　弁理士　　　岩　１）　　弘ｐＨｐＨ爬　な　？！＄　　籠営仲戴程　２兵蓄渋ゼ・　２ｐＨ＄６　ぼｐＨ竿７図湿炭（０Ｃ）＄８図温Ｓ曵（０Ｃ）七ψ蓋曝　２晃Ｘ−９，壇　２に典波場　２典架渋″＄　２ヤ仲栗づ　２呉架票閘　２上物９！蓼　２昇　實　謔ゴ　２判な９″４ｚ（喪派罷　２票架柴要　２忠實波箋　？鷺枠栗堤　２々　宋　票　贈　　ｔヤ嫂衆堤　２潰宋票壜　２（嘘蓋蘭　　２震　裳　票謙　２＄３１図３／ｆＬ炙（０Ｃ）某３２図

Claims

【特許請求の範囲】［ I ］次の理化学的性質を有する新規ウレアーゼ（１
）作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する。（２）基質特異性尿素に最もよく作用する。（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性至適ｐＨが１．５乃至５．５であり、３７℃、３０分処
理ではｐＨ６乃至８の範囲で安定である。（４）至適温度および温度安定性至適ｐＨにおける至適温度が５５℃乃至７５℃であり、
ｐＨ６では、３０分処理で５０℃まで安定である。（５）阻害剤塩化第二水銀およびアセトヒドロキサム酸によって阻害
される。（６）分子量ゲルろ過法で測定した分子量は、１０万乃至２５万であ
る。（７）至適ｐＨおよび３７℃における比活性が２０Ｕ／
ｍｇたん白質以上である。［II］ラクトバチルス属またはストレフトコッカス属に
属し次の理化学的性質を有する新規ウレアーゼ（１）作用１モルの尿素と１モルの水から、２モルのアンモニアと
１モルの炭酸ガスを生成する、（２）基質特異性尿素に最もよく作用する、（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性至適ｐＨが１．５乃至５．５であり、３７℃、３０分処
理ではｐＨ６乃至８の範囲で安定である。（４）至適温度および温度安定性至適ｐＨにおける至適温度が５５℃乃至７５℃であり、
ｐＨ６では、３０分処理で５０℃まで安定である、（５）阻害剤塩化第二水銀およびアセトヒドロキサム酸によって阻害
される、（６）分子量ゲルろ過法で測定した分子量は、１０万乃至２５万であ
る、（７）至適ｐＨおよび３７℃における比活性が２０Ｕ／
ｍｇたん白質以上である、を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物
中に上記ウレアーゼを生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする上記ウレアーゼの製造法。