JPH048292A - 転写可能なヘアピンプローブを用いた核酸の増巾方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の要旨 特定の核酸配列を転写可能なヘアピンプローブを用いる
ことによって増巾する。プローブはハイブリダイゼーシ
ョン条件下において機能的なプロモーター領域を含むヘ
アピン構造を形成する一本鎖の自己相補的な配列から成
ることを特徴とし、さらにヘアピン配列の５′末端から
伸長する転写可能な配列から成ることを特徴とし、そし
てプローブ配列は転写可能な５′配列またはヘアピン配
列の３′末端から伸長する配列に含まれている。

ヘアピン塁のプローブは適当なＲＮＡポリメラーゼ及び
適当なリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）の存在
下において転写可能である。増巾は所望の目的核酸配列
を転写可能なプローブでハイブリダイゼーションし、問
題の配列にハイブリダイゼーションするプローブのみを
実質的に転写し、そして所望の量のＲＮＡ転写産物が集
積するまで転写を続けることによって成される。ＲＮＡ
転写物を随意２回目に増巾することによってより高レベ
ルの増巾ができる。増巾方法は特定の核酸配列を検出す
る方法として特に有用である。

発明の背景 本発明は核酸配列を増巾する方法に関する。特に、発明
は高い感度をもつ特定の核酸配列の存在を検出する方法
に関する。

特定の核酸配列を検出することが、種々の分野において
、特に医療診断の分野において急速にその重要性を増し
ている。核酸ハイブリダイゼーション法は遺伝病、ガン
、及び細菌及びウィルス感染を示すＤＮＡまたはＲＮＡ
の配列のような医学的重要性をもった核酸配列を検出す
る方法を提供している。核酸ハイブリダイゼーション法
はＤＮＡ及びＲＮＡのハイブリッドに見出される非常に
特定の塩基対に基づいている。核酸の鎖に沿って見られ
る問題となっている分析可能な塩基配列は問題の配列と
相補的な塩基配列から成ることが知られている核酸プロ
ーブの存在下でハイブリッドの形成を観察することによ
って非常に特異的にそして感度をもって検出される。

完全に分析可能な潜在力を獲得するハイブリダイゼーシ
ョン法では検出感度を増大させる方法がいっそう必要と
なることは明らかである。近年この方面に相当な努力が
払われてきており、多数の異なった方法が考案され開発
されてきている。特に有望なものは目的核酸配列または
その相補的なシグナル配列の生化学的増巾に基づく方法
である。

それぞれの検出系は感度に限界があるのに対して、生化
学系は数百刃及び数百刃フビーもの目的またはシグナル
配列を作製することができ、それゆえかかる検出系の有
効感度の限度を格段に延ばすように開発されてきている
。

そのようなひとつの核酸増巾方法はボリメラーゼチェイ
ンリアクション法あるいはＰＣＲとして知られており、
それは米国特許第４．６８３．１９５及び４，６８３．
２０２に記載されている。ＰＣＲは目的配列の二本鎖型
における二本の相補鎖に対するプライマーとして一対の
特定のオリゴヌクレオチドを用いる。プライマーは目的
の相補鎖の反対にある３′末端において特異的なノ１イ
ブリッドを形成するように選ばれる。熱安定なりＮＡポ
リメラーゼを用いて、プライマーは目的配列に相当して
合成されながら伸長する。特異的なノ１イブリッドを形
成し、そして伸長後、プライマー／・イブリダイゼーシ
ョン及び伸長をさらに行えるようにハイブリダイゼーシ
ョン伸長した鎖を変性させるために熱周期法（ｔｈｅｒ
ｍａｌ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｐｒｏｃｅｓｓ）が必要であ
る。この工程を数回繰り返すことによって混合物中に著
量の目的配列の等比級数的な増巾がなされる。

ＰＣＨの変法としては欧州特許刊行３２０．３０８に記
載されているリガーゼチェインリアクション（Ｌ　ＣＲ
）がある。本方法では少くとも４本の別々のオリゴプロ
ーブが必要であり、そのうち２本はそれらが目的配列に
ハイブリダイゼーションするとそれぞれの３′及び５′
末端がライゲーションするために並べて置かれるように
同一の目的鋼の反対側の末端にハイブリダイゼーション
する。第３及び第４のプローブは第１及び第２のプロー
ブにハイブリダイゼーションし、ライゲーション後、変
性し検出される融合プローブを形成する。

他の既知の増巾方法はＰＣＴ刊行第８８−１０３１５に
記載されており、転写増巾系またはＴＡＳとして引用さ
れるであろう。同様の方法が欧州特許料行第３１０，２
２９に記載されている。

ＰＣＲと同様にＴＡＳは所望の目的配列の反対側の末端
にハイブリダイゼーションするオリゴプライマ一対を用
いる。プライマーは伸長生成物が一回の伸長またはＰＣ
Ｈのように幾サイクルかの後、転写プロモータ一部位を
含むように選ばれる。適当なプロモーター特異的ポリメ
ラーゼ及びリポヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）の
存在下において、伸長生成物それ自身が転写することに
よってさらに増巾される。

ＰＣＴ刊行第８７−０６２７０に記載されているＱβレ
プリカーゼ（Ｑ　Ｉ　Ｒ）法はレプリカーゼ酵素によっ
て特異的に転写することができる特異的ＲＮＡプローブ
を用いる。本性は一次反応力学であり、レブリカーゼの
開始部位に合うＲＮＡプローブを設計し合成する必要が
ある。

これらすべての方法では目的核酸配列の増巾の収量をあ
げるが、一般及び洗練されていない利用者にとって望ま
しくない複雑さを伴なわないものはない。先行する技術
による方法の多くはわずられしい手動による方法または
必要とする多くの操作を自動化する複雑で高価な機械に
よってしか成されない多くの相いいれない工程が必要で
ある。

さらに、多くのものは異なる目的配列に対する方法への
簡便な適応を制限する多くの混合試薬の調製が必要であ
る。

上述の研究とは関係なく、種々の合成及び天然に存在す
るＤＮＡ及びＲＮＡの構造及びその機能に関する研究が
なされてきている。そのような構造のひとつとして適当
な条件下で一本のポリヌクレオチドにおいて自己相補的
な領域がハイブリダイゼーションし、その形が普通のヘ
アピンに似ているループ構造を形成するというヘアピン
が知られている。そのようなヘアピン構造は多くの生物
、特にＲＮＡの二次構造において天然に存在することが
知られているが、しかし、それらの機能的な役割につい
てはこの時点ではうまく立証されていない。ヘアピン構
造の物理化学については記載がなされている一力ンター
及びシュンメル（Ｃａｎｔｏｒａｎｄ　Ｓｃｈｉｔｍｅ
ｌ）　、バイオフィジカルケミストリー第三Ｉｔｓ　（
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ％Ｐａｒ
ｔｌｙ）、１１８３ページ、（Ｗ、Ｈ、フリーマン＆カ
ンパニ（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、）　　（
サンフランシスコ１９８０）。

本主題に関する文献は不完全であり矛盾している。例え
ば、ヘアピンは転写終結シグナルを提供するという示唆
があるージエンドロセツク（Ｊｅｎｄｒｏｓｓｅｋ）ら
ジャーナルオブバクテリオロジ（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、）　　１７０　：　５２４８　　（１９８８）及び
ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、バイオケミカルジャー
ナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　２２４　：　７９９　
（１９８４）６既知のロー依存性転写終結シグナルに類
似しているヘアピン構造は大腸菌のウニクオベロン（ｕ
ｎｃ　ｏｐｅｒｏｎ）及びｇｌｍｓのあとに見られた。

一方、安定なヘアピン型を形成することが可能なパリン
ドローム配列はベーターアミロイドの前駆体遺伝子の転
写開始部位付近に見出されているーラファウシ（Ｌａ　
Ｆａｕｃｉ）ら、バイオケミストリーバイオフィジック
スリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　（Ｃｏｍｍｕｎ−）　ｌ　５９
　：２９７（１９８９）。

オリゴヌクレオチドからＤＮＡを合成する際及びオリゴ
ヌクレオチドを標識する際にヘアピン構造を用いること
は欧州特許率２９２．８０２号及びスリプラカツシュ（
Ｓｒｉｐｒａｋａｓｈ）　及びバー’ＩＡ（Ｈａｒｋａ
ｓ）ジーンアナリテイカルテクノロジー（Ｇｅｎｅ　Ａ
ｎａｌ、Ｔｅｃｈｎ、）　６　：　２９−３２　（１９
８９）によって提案されている。さらに、タラップ（Ｋ
ｒｕｐｐ）及びゼール（Ｓｅｌ＋）はＦＥＢＳレターズ
（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ）　２１２　：　２７１　（
１９８９）及び「ヌクレイツクアシッドプローブ」　“
ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｐｒｏｂｅｓ　、シモンズ（
Ｓｙｍｏｎｓ）編（ＣＲＣプレス、バコンラトン、ＦＬ
、　　１９８９　）　　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ。

Ｂａｃｏｎ　Ｒａｔｏｎｓ　ＦＬ％　１９８９　）　２
１及び２２ペーシニヘアピン構造を用いてＭ１３ベクタ
ー／Ｔ　７ＲＮＡポリメラーゼ系によって標識ＲＮＡ転
写物を作製することを記載している。

発明の要約 本発明は元来転写可能であり、従って（ｉ）＠的配列の
一部分または全体あるいは（■）目的配列とは区別して
事前に選択されている配列に塩基配列が相当するＲＮＡ
の多数のコピーを提供することができるグローブを用い
て問題の特定の核酸配列（目的配列）を増巾する方法及
び手段を提供する。転写可能なプローブは３つの主要な
部分がアル。（１）適当なハイブリダイゼーション条件
下において機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構
造を形成することが可能な一本鎖自己相補的配列、及び
（２）自己相補的配列の５′末端から伸長し、そしてそ
れと同一の核酸分子の一部を形成する転写可能な配列、
及び（３）問題の配列と実質的に相補する一本鎖プロー
ブ配列。プローブ配列は５′の転写可能な配列から成る
か、またはヘアピン配列の３′末端から伸長する配列の
一部分であり、後者の場合、それは５′の転写可能な配
列とは実質的に相補的ではない。

適当なハイブリダイゼーション条件下において、プロー
ブの自己相補的な領域は一般にヘアピンループまたは簡
単にヘアピンといわれるループ状の自己ハイブリダイゼ
ーションをする構造を形成する。自己相補的領域の塩基
配列はヘアピンを形成する際、所望の二本鎖プロモータ
ー配列が転写可能な領域に操作上連結して形成するよう
に選択される。それゆえ、そのようなグローブのヘアピ
ン型は適当なＲＮＡポリメラーゼ及び必要なりボヌクレ
オシドミリン酸（ｒ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ｓ　）の存在下で転
写可能である。５′転写可能な配列中にプローブ配列が
含まれる場合、ＲＮＡ転写産物における塩基配列は従っ
てプローブ配列と相補的になる。そのような場合、プロ
ーブ配列は目的配列と相補的であるため、ヘアピンプロ
ーブの転写によって目的核酸として同一の塩基配列を持
つ多数のＲＮＡ転写物を生成する。プローブ配列がヘア
ピン領域の３′末端から伸長している配列中に含まれる
場合、転写可能な配列は例えば一般的なまたは普遍的な
検出プローブ及びその系を利用することを可能にするた
めに一連の目的配列を検出するための一連のプローブに
共通な配列のような有用な配列を持つＲＮＡ転写物を提
供するように選ばれる。

目的配列を液体混合物中で本プローブとハイブリダイゼ
ーションした後、本発明方法における次の工程は選ばれ
た目的配列にハイブリダイゼーションしないプローブ（
ｕｎｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ　ｐｒｏｂｅ）を実質的に転
写することなく目的物とハイブリダイゼーションするプ
ローブを転写することである。プローブはそれがハイブ
リダイゼーションするかしないかにかかわらず転写可能
であるので、目的配列を特異的に増巾及び／または検出
するために、ハイブリダイゼーションしないプローブか
らハイブリダイゼーションしたプローブを区別すること
が必要である。この目的のためにいくつかの適当な方法
が適応される。

例えば、ひとつの方法はハイブリダイゼーションしない
プローブからハイブリダイゼーションしたものを分離し
、次に分離したｌ＼イブリダイゼーションするプローブ
画分のみにポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓを添加すること
に基づく。他の方法としては増巾する核酸において第２
の配列に相補的である第２のプローブを用いることがあ
る。両方のプローブが目的核酸にハイブリダイゼーショ
ンする場合第２のグローブの塩基配列はその３′末端が
転写可能なプローブの５′末端からライゲーション可能
な距離内にあるように選ばれる。ノーイブリダイゼーシ
ョン後、ハイブリダイゼーションした第２のプローブの
３′末端はハイブリダイゼーションした転写可能なプロ
ーブの５′末端に適当にライゲーションする。それゆえ
、結合した転写可能でそして第２のプローブによって囲
まれた合併された配列は目的配列が存在し、そしてその
ようなプローブとハイブリダイゼーションする場合にの
み転写される。

転写は目的配列の増巾物を生成する集積した転写産物に
よって所望の時間続かせることができる。

目的配列が分析上重要である場合、目的配列を高感度で
検出することが本発明の方法によって目的物を増巾し、
次に集積した転写産物を適当に検出することによってな
される。集積したＲＮＡ転写産物を検出するために多数
の従来の方法が取られている。

例えば、転写の際に添加されるｒＮＴＰ　ｓは検出可能
な標識物を含み、得られた標識転写産物を使われなかっ
た標識ｒＮＴＰｓから分離した後、その標識物を分離し
た生成物画分において検出する。他の方法は検出可能な
核酸プローブでハイブリダイゼーションし、例えば標識
プローブまたは抗ＤＮＡ／ＲＮＡのような抗ハイブリッ
ド選択抗体を用いる従来の方法によって得られたハイブ
リッドを検出することによって転写産物を検出する。

生成したＲＮＡ転写産物を二次的なまたは第二段階の増
巾に供することによってさらに増巾を増大させることが
できる。種々の方法が本目的に適しており、そのうち代
表的な例はより詳細に以下に記載されている。

本発明の増巾方法は先行する技術による方法に勝る多数
の相当に有利な点を提供する。第一に、もつとも一般的
な態様において本発明方法は上に記載したＰＣＲ，ＴＡ
Ｓ及びＬＣＲのような多くの先行する技術による方法で
はオリゴプライマーのような多数のプローブを必要とす
るのに対して、−本のプローブ成分のみしか必要としな
い。さらに、本プローブは完全でそして安定な転写可能
な状態において目的配列に供され、すなわち、ＴＡＳに
おけるように転写可能型のｉｎ　５ｉｔｕプローブを合
成する必要はない。その上、ＰＣＲ及びＬＣＲにおける
ような時間の浪費及びわずられしい熱周期の必要がない
。上に記載したＱＩＩＲ法とは違って、本プローブは複
雑な三次構造がないどころか簡単な伸長した一本鎖の核
酸である。他の利点についてはこの分野の従事者には明
らかであろう。

本発明の好ましい態様 転写可能なプローブとその調製 本発明の転写可能なプローブは一本鎖ポリヌクレオチド
と結合する少なくとも３つの主要部分から成る。第１−
３図の図に関しては、第１の部分はループ配列呈によっ
て分離した土及び旦の自己相補的部分から成る塩基配列
Ａである。ハイブリダイゼーション条件下において配列
ａ及びａ′は自己アニールし、自己相補的配列の間に形
成した塩基対結合を示す線ＢＰが描かれた第２図に説明
したループ状のヘアピン構造を形成する。配列ａ及びａ
′は出来たループ領域Ａが機能的なプロモーターまたは
転写開始部位を含むように選ばれる。本発明のグローブ
で第２に主要な部分はブロモ−ター領域Ａの５′末端に
直接または介在配列すを介して操作上連結している転写
可能な配列Ｃである。プローブの第３の主要な部分は目
的配列にハイブリダイゼーション可能で増巾または検出
されそして転写可能な配列Ｃまたはヘアピン領域の３′
末端から伸長する配列ｅの一部分から成るプローブ配列
である。プローブは一般的に、配列ｄ及びｅのような第
１及び２図に説明した５′及び／または３′側配列を付
加的に含む。

第２図に描かれたヘアピンをのプローブは転写可能な配
列Ｃ及び介在配列すの３’−５’の転写に必要な同起源
のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下で転写可能であ
る。与えられたプローブの濃度及び反応条件に依存して
、機能的な転写可能な二量体型も形成される（第３図）
。自己相補的な領域Ａは潜在的に自身のみならず、第２
のプロブともハイブリダイゼーションし、分れたプロー
ブ鋼上の相補的な領域ａ及びａ′がハイブリダイゼーシ
ョンすることによって二量体を形成する。

そのような二量体は第２図に描かれたヘアピン型のよう
に、領域Ａにおいて機能的なプロモーターを含み、そし
て同起源のポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓの存在下におい
て、転写可能な配列Ｃ及び介在の及び／または隣接する
配列す及びｄの３′５′の転写がなされる。従って、こ
こに本プローブの「ヘアピン型」について言及するなら
ば、機能的に等価な二量体型が同様の意味をもつことを
理解するであろう。

プローブのヘアピン領域Ａのハイブリダイゼーションに
よって形成されるプロモーターは本技術分野で知られて
いるようにプロモーターに結合しそれから３’−５’の
転写を開始するポリメラーゼ酵素に相当し、そしてそれ
によって認識される二本鎮咳＃（例えばＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）配列である。本発明における操作には重要ではな
いが、プロモーターを形成する自己相補的配列ａ及びａ
′の長さは一般的には約７及び約２００塩基の間であり
、より一般的には約ＩＯ及び約５０塩基の間となるであ
ろう。一般的に、既知で入手可能な適当なポリメラーゼ
に対するプロモーターが本発明において用いられる。通
常、グローブはＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼすな
わち、ＲＮＡ転写物を生成するＤＮＡの鋳型に作用する
ポリメラーゼによって転写可能であるＤＮＡより成る。

しかしながら、ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラ−ゼ（あ
る種のウィルス、例えばレトロウィルス及びピコルナウ
ィルス１：よって生成されるような）によって転写可能
なＲＮＡプローブが用いられる。

有用なプロモーターとしてはとりわけ、Ｔ７、Ｔ３及び
ＳＰ６フアージのようなバクテリオファージによって生
成されるＲＮＡポリメラーゼによって認識されるものが
ある。

そのようなファージポリメラーゼに対するプロモーター
機能を持った典を的な塩基配列は（１−ｅ２から５：配
列は自己ハイブリダイゼーションしたヘアピン型として
表わされており、プロモーター機能に必要な最少配列を
必ずしも表わすものではない）： Ｔ７用　　／−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ
−３’Ｔ。

又ＡＴＴＡＴＧＣＴ（、ＡＧＴＧＡＴＡＴＣ−５’Ｔ３
用　　ｆＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−
３’ｎ ’−ＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５′
ＳＰ６用　ｆＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣ
ＴＡＴＡＧ−３’ｎ 又ＧＴＡＴＧＣＴＡＡＡＴＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＡＴＣ
−５’である。

プローブ配列は、それが配列旦または見に含まれていよ
うといまいと、問題の目的配列と／翫イブリダイゼーシ
ョンが可能な配列である。この技術分野において知られ
ているように、プローブと目的配列の間の相同性の程度
は使用者それぞれの必要性に依存している。程度の高い
特異性を必要とするかまたは望むのであれば、−塩基対
のミスマツチを検出する場合のような完全かまたは完全
に近い相同性が必要となる。しかしながら、標準的な場
合では、非相同性の程度は目的配列の必要な特異性、増
巾、または検出を犠牲にすることなく大目に見られてい
る。それゆえ、「相補的な」または「ハイブリダイゼー
ション可能な」という用語はここではプローブ配列及び
目的配列間の相同性の望まれているまたは必要な程度を
記載するために用いられている。プローブ配列の長さは
一般的には重要ではない。しかしながら、選ばれた目的
配列と迅速にそして強く）＼イブリダイゼーションさせ
るためには、少なくとも約１０塩基の標準的なプローブ
配列が用いられている。

自己相補的なヘアピン型配列！及び「に連結するグロー
ブにおけるループ配列呈は実質的に転写可能なヘアピン
または二量体構造の形成を妨害しない、または阻害しな
いくらいの組成及び長さである。標準的には、ループ配
列呈は実質上それ自身では非相補的であるように選ばれ
、例えばポリＴ１ポリＡ１ポリＣ１またはポリＧまたは
その組み合わせから成る鎖のようなペテロ多量体または
ホモ多量体ＤＮＡまたはＲＮＡから成り、そしてループ
形成のため十分な空間的自由度をもたせるように少なく
とも２塩基の長さである。より標準的には、ループ配列
呈は約４及び約５０塩基の間の長さである。

転写可能な配列は本技術分野で知られているように、転
写開始の際プロモーターの５′末端から伸長する配列が
ポリメラーゼによって機能的に転写され転写可能な配列
に相当する配列から成るＲＮＡ転写物を形成させるため
に、プロモーターの５′末端に操作上連結している。上
に示したように、転写可能な配列Ｃは介在配列すによっ
て分断されており、そのような介在配列は転写可能な配
列との操作上の連結点を保持しており、例えばそれは転
写終結部位を含まず、転写可能な配列の転写効率をかな
り減少させるほどは長くはなく、そして重大な非特異的
なハイブリダイゼーションを紹かない。ある状況におい
ては、安定性または検出の目的のためにはそのような介
在配列を含めることが望ましくなる。転写効率は転写可
能な配列において最初の数（例えば３から５）ヌクレオ
チドに存在する配列に依存するということも見出されて
いる。特に、開始配列がＣＣＣＴＣである場合にＴ７　
　ＲＮＡポリメラーゼを用いた高い効率の転写がなされ
ることが見出されている。

同様に、プローブはその３′及び５′末端のうちひとつ
または両方において隣接配列を含む。

５′末に隣接する配列ｄは用いたＲＮＡポリメラーゼの
効率及び転写条件に依存しである程度まで転写される。

ある状況においては、そのような隣接配列は分離または
検出に有利なため用いられている。

本発明の転写可能なプローブは適当な方法によって調製
される。そのような方法としては一般的に、オリゴヌク
レオチド合成及び複製可能なベクターによるクローニン
グがある。核酸合成の方法はこの技術分野においてよく
知られている。例えば、「オリゴヌクレオチド合成：実
験的方法」（“０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏＬｉｄｅ　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ　：　Ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒ
ｏａｃｈ”）　Ｍ、Ｊ、ガイド編、ＩＲＬプレス（ｅｄ
　。

Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、　　ＩＲＬ　　Ｐｒｅｓｓ）　　（
オックスフォード１９８４）　（（Ｏｘｆ、ｏｒｄ　ｌ
　９８４））において、オリゴヌクレオチド合成及び得
られた生皮物の精製及び分析のいくつかの異った方法が
記載されている。

自動合成機の場合、５′が保護され、固定しＩ；（３′
ヒドロキシルを介して）ヌクレオシド残基から始める。

５′を脱保護した後、３′−ホスホラミダイトと５′保
護ヌクレオシド残基を反応させることによってホスホジ
エステル結合を導入する。ホスファイト結合は次に酸化
され安定な結合となり、そしてこの工程は所望のヌクレ
オシド残基が配列へと合成されるように繰り返される。

このホスファイトトリエステルホスホトリエステル法に
替わって、同相的な方法も用いることができる。また、
合成された核酸はさらに合成方法によって修飾される（
例えば米国特許第４．８１８．６８１に記載されている
）。増巾ベクターによる核酸のクローニングもまた本技
術分野でよく知られている（マニアティス（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ）ら、モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、）　−ルドスプリングハ
ーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ）（１
９８２）を参照。）。二本鎖ベクターによってクローニ
ングする場合、鎖の分離が生成物をプローブとして用い
るために必要となる。

目的物の増巾方法 本発明方法に従って特定の目的核酸を増巾する第１段階
は適当な液体混合物中でそのような目的物と転写可能な
プローブをハイブリダイゼーションさせることである。

そのようなハイブリダイゼーションはこの技術分野にお
いてよく知られている適当な条件下においてなされる。

意義のある目的核酸を含有すると思われるかまたは含有
していることが知られているサンプルは種々の源から得
られる。それは生物試料、食物または農産物のサンプル
、環境中のサンプル、その他である。本発明方法を医療
診断の補助として特定の核酸配列を検出することに応用
する際、試験サンプルは尿、血液、乳、脳を髄液、たん
、だ液、便、肺呼気、のどまたは生殖器をふき取った綿
棒、その他の体液または浸出物である。ここにおいて他
でより詳細に考察するように、目的核酸はＲＮＡまたは
ＤＮＡである。ある状況下では、試験サンプルを処理し
てハイブリダイゼーション用に目的核酸を遊離及び／ま
たは抽出すること、及び／または目的配列が二本鎖型と
して存在する場合、本技術分野でよく知られている方法
によってハイブリダイゼーション可能な一本鎖型に変性
し抽出することが必要であり、またはそれが望ましい。

−数的には必要とはされていないが、ハイブリダイゼー
ションの全体的な効率をあげ、目的核酸が制限分解を受
けられるようにすることが望ましい。

本プローブはそれがヘアピン型であれば目的物にハイブ
リダイゼーションしようとしまいとにかかわらず転写を
受けることが可能なように設計されているため、転写ま
たは検出を実質上目的配列にハイブリダイゼーションす
るグローブのみに限る段階を設ける必要がある。実質上
ハイブリダイゼーションしないプローブを転写すること
なく目的物にハイブリダイゼーションする転写可能なプ
ローブのために多数の形式が考案されている。特に何効
な方法はハイブリダイゼーションしないプローブからハ
イブリダイゼーションしたプローブを分離することに基
づく方法、目的物にハイブリダイゼーションした場合に
のみグローブの転写しｔ；５′末端にライゲーション可
能な第２プローブを用いることに基づく方法、及び転写
可能な生成物を遊離するためハイブリダイゼーションし
たグローブのみを分解する制限酵素を用いることに基づ
く方法である。

ハイブリダイゼーションしないプローブからハイブリダ
イゼーションしたプローブを分離することに基づく形式
は一般的に第４図の図式に説明されている。本ヘアピン
プローブと核酸のサンプル中に存在する目的配列とハイ
ブリダイゼーシヨンすることによってプローブにおける
プローブ配列Ｃがその相補的目的配列二と／＼イブリダ
イゼーションしているハイブリッド（Ｉ）を生じる。第
４図において、目的核酸は目的配列二に加えて隣接領域
−〔−及びｇ’−と共に示されており、そして転写可能
なプローブは、ここに考察しているように、他への変更
も可能であるが、ヘアピン領域Ａまたはプローブ配列Ｃ
に隣接する領域を省いて描いである。さらに、示しては
いないが、これらの形式はプローブ配列がヘアピンルー
ズの３′末端から伸長する配列に含まれる場合も適応で
きる。

ハイブリダイゼーションしないプローブを分離し、ポリ
メラーゼ及びｒＮＴＰｓを添加した後、結合配列ｂ　Ｉ
　ＣＩ　（ｂ　／−が互に相補的である場合）を含む多
数のＲＮＡ転写物を生じて転写が続く。

ハイブリダイゼーションしないプローブからハイブリダ
イゼーシヨンするプローブを分離するための数々の形式
が可能である。多くのそのような技術は文献においてよ
く知られており、将来能の技術も考案されるであろう。

そのような技術はどれでも本発明に適応できる。分離後
、７％イブリダイゼーションしたプローブ画分は転写に
必要な適当なポリメラーゼ及びｒＮＴＰｓと接触する。

以下はこの目的のために本発明で用いられるほんの２．
３の考えられる分離方法の概略を記載したものである。

（１）目的物の固定化−本方法において、目的配列は転
写可能なプローブとのノジブリダイゼーションの前かま
たは後に固定化され、そして得られた固定化ハイブリッ
ドはハイブリダイゼーシヨンしないプローブから簡単に
分離される。本技術分野においてよく知られているよう
に、目的核酸は例えばニトロセルロースまたは活性化ナ
イロン膜または反応性あるいは吸着性の乳樹脂粒子等の
適当な固相に非共有的または共有的に結合させるような
技術によってノ１イブリダイゼーションの前に固定化さ
れる。固定化はまた分離したプローブすなわち、固定化
されるかまたは固定化可能で転写可能なプローブとハイ
ブリダイゼーション可能な配列と重複しない目的核酸に
おける配列と７％イブリダイゼーション可能な配列から
なるプローブとハイブリダイゼーションすることによっ
てもなされる。利用にあたって、二重の／％イブリダイ
ゼーションが分離したプローブ及び転写可能なプローブ
の両方にハイブリダイゼーションするようになった目的
核酸に生じる。得られた固定化ノ１イブリッドはハイブ
リダイゼーションしていない転写可能なプローブから筒
単に分離される。

（２）ハイブリダイゼーション後の固定化のための目的
物の修飾−目的配列を直接固定化するというよりもむし
ろ、目的物が続けて固定化のための部位を提供するとい
う方法によってハイブリダイゼーションの前に目的物を
修飾することが知られている。これによってまた好まし
い溶液力学条件下でハイブリダイゼーションが行える。

目的物は多くの既知の方法によって固定化可能となるよ
うに修飾される。標準的には、反応部位は反応相手と安
定な共有または非共有結合の形成が可能な目的物に導入
される。次に修飾された目的鎖と結合する反応相手の固
定化型を添加することによって所望の時に固定化がなさ
れる。代表的な反応相手はアビジン及び抗−ハブテン抗
体とそれぞれ特異的に結合可能なビオチン及びハプテン
のようなリガンドである。

サンプル中における目的鎖の修飾は同様にいくつかの異
なる方法によってなされる。特に有効な方法としては例
えば光反応性の挿入剤（例えば、米国特許路４．７３７
．４５４号参照）のような反応性の部位機能化核酸結合
試薬と反応することによって適当な反応部位を目的鎖に
導入することがある。そのような修飾試薬の特別な例と
してはビオチンまたはハブテンのようなりガントに共役
するブソラレン（ｐ５０ｒａ　ｔｅｎ）の光化学的な反
応型から成る二価性の抱合体がある。

（３）抗ハイブリッド抗体試薬の利用−ハイブリダイゼ
ーションしないプローブからハイブリッドを分離するた
めの他の既知の方法としては−本鎮咳酸上にハイブリッ
ドを結合させるために調製されたかまたは選択された抗
体試薬を用いるものがある。種々のそのような抗ハイブ
リッド試薬は抗ＤＮＡ／ＲＮＡ及び抗ＲＮＡ／ＲＮＡ抗
体（米国特許第４，８３３．０８４号及び欧州特許第１
６３．２２０号）、抗Ｄ　Ｎ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａ抗体（米
国特許第４．６２３．６２７号）及び挿入二重体の抗体
（米国特詐＠４，５６３，４１７号）を含み、文献にお
いて知られている。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに特異
的な抗体は転写可能なプローブが一般的にＤＮＡ及びＲ
ＮＡの目的核酸から成るため特に有効である。抗体試薬
はそれが部位に結合する活性抗体から成るならば全抗体
、抗体断片、またはそれらの凝集をの形状をとる。さら
に、抗体試薬は固定化型または固定化可能な形状で添加
され、すなわち、さらなる反応によって固定化する。こ
れらの変法はすべてこの技術分野においてよく知られて
いる。

（４）二重ハイブリダイゼーション−ハイブリダイゼー
ションしていないヘアピンプローブからハイブリダイゼ
ーションしているヘアピンプローブを分離するためにヘ
アピンプローブに加えて第２の固定化または固定化可能
な（分離）プローブを用いることもできる（欧州特許第
１３０．５１５号及び同第１９２．１６８号参照）。ヘ
アピンプローブにおけるプローブ配列及び分離プローブ
におけるプローブ配列は目的配列に相互に相いれない部
分とハイブリダイゼーションするように選ばれる。それ
ゆえ、ハイブリダイゼーションによって、目的配列はヘ
アピンプローブと分離プ０−ブの間の架橋として与えら
れる。分離プローブは適肖な固体支持物に結合するかま
たは付着し、または反応相手、好ましくは結合相手（例
えば、それぞれアビジンまたは抗ハプテン抗体）に対す
る結合部位（例えばそれぞれビオチンまたはハゲテン残
基）に対する反応部位から成る。ハイブリダイゼーショ
ン後、得られた溶液は反応相手の固定化型と接触しそれ
によって二重ハイブリッドは固定化する。

ハイブリダイゼーションしたグローブとハイブリダイゼ
ーションしないグローブを物理的に分離することによら
ない方法も用いられる。そのような方法はハイブリダイ
ゼーションしていないグローブによって生成されたＲＮ
Ａ転写物と比べてポリメラーゼに対する鋳型が目的配列
にハイブリダイゼーションするかまたはハイブリダイゼ
ーションしている場合に区別したＲＮＡ転写物を生成す
る転写系を設計する戦略に依る。

そのような方法としては第２のプローブを用いるものが
あり、第５図に説明されている。第２プローブは目的核
酸における第２の配列ｈ′に相補的な配列りを含むよう
に設計されるかまたは選ばれる。配列りは第２プローブ
の３′末が一方は目的配列と他方は２つのグローブから
形成されるバイブリド（ＩＩ）において転写可能なプロ
ーブの５′末（プローブ配列Ｃの５′末）とライゲーシ
ョン可能な距離内に位置するようになる。配列りはまた
隣接領域ユを含めて描かれているが、しかし、そのよう
な隣接領域は付加的なものであることが認められる。さ
らに、本説明において、転写可能なプローブは、（配列
りとライゲーションするため）プローブ配列Ｃに隣接す
る領域を含めていないが、ヘアピン領域Ａの３′末端か
ら伸長する隣接領域ｅとあわせて示されている。ハイブ
リダイゼーション後、第２グローブの３′末端と転写可
能なプローブの５′末端は相互にライゲーションし、転
写可能なライゲーション産物（ＩＩＩ）を形成する。続
いて転写可能なライゲーションした核酸が転写すること
によってライゲーションしていない転写可能なプローブ
によって生成された転写物とは区別されたＲＮＡ産物を
生成し、後者の転写物は配列ｂ’ｃ’ｈ’であるのに対
して、前者の転写物はより短い配列ｂ′ｃ′である。ラ
イゲションは従来の方法によって行われる［マニアテイ
ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、上述参照１゜以前に提唱さ
れたように、ハイブリダイゼーションしたプローブとハ
イブリダイゼーションしていないプローブを物理的に分
離することは原理的には本方法には必要ではないが、そ
のような分離はさらにバックグランドのＲＮＡを減少さ
せる上で有効である。そのような分離を行うための多数
の方法を従事者は知っている。例えば、ビチオンのよう
な結合部位、サンプル配列、第２プローブ、または転写
物産を例えば修飾し、適当な例えば固定化した結合相手
を添加することによって同じものを単離することができ
る。サンプル配列のビオチン化によってそのようなサン
プル配列の非特異的な転写を阻害するという付加的な利
点が得られる。

実質的にハイブリダイゼーションしたプローブのみを転
写する第３の方法は転写可能な生成物を遊離するために
ハイブリダイゼーションしたプローブのみを分解する制
限酵素を用いることに基づく。そのような方法はプロー
ブ配列ｅがヘアピン領域Ａの３′末端に位置する転写可
能なヘアピンプローブを用いて第６図に説明されている
。プローブはさらに、ヘアピンプロモーターの５′末端
に操作上連結している転写可能な配列Ｘを含む。

特に説明した方法では、転写可能なプローブは固定化さ
れる。プローブ領域且はサンプル核酸における相補配列
ｅ′と／＼イブリダイゼーションし、制限部位Ｒがハイ
ブリッド生成物（ＩＶ）に形成されるように選ばれる。

部位Ｒに特異的な制限酵素を添加することによってノー
イブリダイゼーションしていない同相プローブから簡単
に分離される生成物（Ｖ）を分断し遊離する。遊離した
生成物（Ｖ）は制限酵素の作用によって生成した短い３
′配列ｅ”を含み、そして転写可能な配列Ｋを保持する
。適当なポリメラーゼ及び必要なｒＮＴＰｓを添加する
ことによってそれに相当する配列（をもつ転写産物が生
成する。

ハイブリダイゼーションによって特定の制限部位を設け
るということは本発明方法の他の変法に応用できる。例
えば、プローブはプローブ配列を含み、そして固定化の
ために同相に結合する５′の転写可能な配列をもつよう
に設計される。）＼イブリダイゼーション及び分解によ
り、分断したプローブ生成物は短くされた転写可能な５
′配列から成る。それゆえ、得られた転写物産はハイブ
リダイゼーシヨンの結果以外ではなくそれと同一である
。さらに修飾としてはヘアピンプローブ上の非プローブ
５′配列または分離したオリゴヌクレオチドに相補的で
ある３′配列の含有物があり、そして、ハイブリダイゼ
ーションにより、それらの３’、５’及び／またはオリ
ゴ配列の相補的配列によって個々のヘアピンプローブが
結合してヘアピンプローブの多重鎖が形成される。その
ような多重鎖の転写可能な生成物の遊離は目的配列との
ハイブリダイゼーションによってハイブリダイゼーショ
ン生成物中に必要な制限部位を生じる場合にのみ起こる
。

転写は転写可能なプローブから成るハイブリッドを含む
液体混合物中にポリメラーゼ及び必要なｒＮＴＰｓを添
加することによって開始する。適当な条件下において、
充分な量のｒＮＴＰｓが存在するならばＲＮＡ転写物の
合成が連続的に進む。

標準的には、リボヌクレアーゼの混入によるＲＮＡ転写
物の望ましくない分解を避けるために転写反応混合物中
にリボヌクレアーゼインヒビターが含まれる。転写は事
前に決めておいた時間または検出可能かまたは所望の量
のＲＮＡ転写産物が集積されるまで続けられる。任意の
時間で生成したＲＮＡ転写物の量は元のサンプル中に存
在していた目的配列の量に比例している。それゆえ集積
された転写産物は目的配列の増巾物として与えられる。

次に転写はポリメラーゼの不活性化まｔ；は混合物から
反応物を除去するといったような従来の方法によって終
結される。

ＲＮＡ転写産物のさらなる増巾は例えばＱβレプリカー
ゼまたはブロムモザイクウィルス由来のレプリカーゼの
ようなレプリカーゼを用いることによる多数の方法でな
さる。また、ヘアピンプローブ（元のヘアピンプローブ
とは区別されている）及び第２プローブがＲＮＡ転写産
物の隣接しｔ；配列とハイブリダイゼーションする場合
にヘアピンプローブ／第２プローブ対の分離セットが用
いられる。転写物に対するヘアピンプローブ／第２プロ
ーブ対のハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼー
ションした対はライゲーションしポリメラーゼの存在下
付加的なＲＮＡ転写物を自ら生成する転写可能な核酸を
形成する。さらに、ＲＮＡ転写物は固定化のための部位
を含むように生成され（例えば、それぞれアビジンまた
は抗ハプテン抗体のようなりガント結合相手の固定化型
の添加によって得られたｒＮＴＰｓ及び固定化物を修飾
する例えばビオチンまたはハプテンのようなリガントの
利用による）、混合物から分離した後、さらなるプロー
ブにハイブリダイゼーションし、さらなる転写のための
プロモータ一部位を導入する。

２．３サイクル後、百万倍以上の増巾物が可能である。

特に示した以下の方法は第２段階の増巾をするのに有効
である。

（１）ＲＮＡによるハイブリッドからのプローブの置換
−プロモータープローブは固体支持物上に固定化したか
または固定化可能な支持物にハイブリダイゼーションし
ているそれと相補的なりＮＡとハイブリダイゼーション
する。固定化または固定化可能な支持物は特異的なハイ
ブリダイゼーション条件下生成ＲＮＡと接触するように
なる。

ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリ
ッドの間の安定性の違いのためＲＮＡがＤＮＡに替って
ハイブリダイゼーションするためこれによって転写可能
なプローブが遊離される。第１段階の転写後、ＲＮＡポ
リメラーゼ活性は鎖が置換する条件下において固定化Ｄ
ＮＡハイブリッド支持体と混合物が反応する前に加熱す
ることによって破壊される。ＲＮＡのそれぞれの分子に
対して１分子のプロモータープローブがもつとも理想的
な条件下において生成される。系を周期化することによ
ってさらに転写可能なプローブを生成するためにＲＮＡ
を用いることが可能であり、それゆえ系の第２の増巾が
可能となる。より効果的に鎖を置換するためには、側鎖
移動が利用可能である。本方法において、置換するＤＮ
Ａ分子にはその３′または５′末端においてハイブリダ
イゼーションしない一本鎖領域があり、ＲＮＡにおいて
それに相当する部位がＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成
を開始する。

一本鎖側鎖移動現象が二本鎖ＤＮＡの転写において見ら
れると考えられている。ＲＮＡの新たに合成された鎖が
ＤＮＡ鎖の同じ配列と置換する。

−末鎖側鎖の移動速度は１０００塩基対／秒よりも速い
と見積もられている。二本鎖側鎖移動についても記載が
ある。この工程は３７℃において約６０００塩基対／秒
である（バイオフィジカルケミストリー（Ｂｉｏｐｈｙ
ｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））、カンタ−＆シュ
ンメル（（Ｃａｎｔｏｒ　＆　Ｓｃｈｉｍａ＋ｅｌ））
フリーマン刊行、サンフランシスコ、１９８０、第■巻
、（（Ｆｒｅｅｍａｎ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、　Ｓ
ａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏｑ　　ｌ　９８０、ｖｏｌ、
ｍ））、ｌ　２３８−１２３９ページ）。この情報によ
り高温処理することなく２０塩基の側鎖移動置換が非常
に速い工程であることが容易に判断される。

（２）プローブの一方の鎖の置換−この方法は遊離した
プローブが完全なプローブではなく、むしろプロモータ
ーの一方の鎖をもつプローブの一方の鎖であることを除
いて前述の方法と同様である。他の鎖を添加することに
よってのみ転写可能となる。

（３）ライゲーション可能なリンカ−の置換−この方法
もまた前述の方法と同様であるが、しかし、遊離した断
片はプロモータープローブの２つの部分をライゲーショ
ンするためのリンカ−として作用する。

（４）ＲＮＡ介在型のライゲーション−この方法は２つ
のＤＮＡ断片のライゲーションがなされ、液溶中におい
て行なわれる可能な限りの利点によって特徴付けされる
架橋を形成するＲＮＡ産物の利用である。

（５）リサイクルの獲得−この方法はプロモータープロ
ーブの獲得試薬として最初の転写物のリガンド修飾した
（例えばビオチニル化した）ＲＮＡ産物を利用する。転
写開始時において、ビオチニル化ＵＴＰを転写開始のた
めに他のヌクレオシド三リン酸に混合する。ビオチニル
化ＲＮＡは次に相補的プロモータープローブとの混合前
かまたはその後に獲得される。ビオチニル化ＲＮＡが獲
得されたら、固体支持物上で相補的ＤＮＡプロモ−ター
の最初の相互作用がなされる。ビオチニル化ＲＮ　Ａ　
−Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドは次により多くのＲＮＡを生
成する転写のために用いられる。そのようなハイブリッ
ドからの転写が効率的でないならば、ハイブリッドから
ＤＮＡを遊離するために熱またはアルカリ処理を転写前
に行う。同様な方法もまた抗ＲＮＡ／ＤＮＡ／＼イブリ
ッド抗体の獲得反応を用いそしてビオチニル化ＲＮＡの
工程を不要とすることによって行なわれる。

（６）ＲＮＡが仲介するコピー−この方法は転写物をプ
ライマーとして用いることによってプロモータ一部位を
作成する。プライマー伸長生成物は転写可能なシグナル
として作用する。ＲＮＡ産物と相補する配列は例えばＭ
１３のような一本鎖７アージベクターにクローン化され
る。転写物はそのようなＭ１３　　ＤＮＡと反応し、モ
してノ飄イブリッドは次にＤＮＡポリメラーゼ及び生成
物を同定するためにそのうちのいくつかを標識したデオ
キシヌクレオシド三リン酸を用いて伸長する。

本方法によってまたさらなる増巾のために転写可能な配
列を生成する。

同様な方法が転写生成物ＲＮＡプライマーを伸長する鋳
型としてクローン化したＤＮＡにかわって合成するオリ
ゴヌクレオチドを用いて行なわれる。

プロモーターを含むＤＮＡは生成ＲＮＡと７１イブリダ
イゼーシヨンし、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長し次
に伸長した生成物が転写される。始めの一本鎖ＲＮＡは
転写されない。最終生成物は特異的固定化プローブによ
る獲得によって分析される。この方法は高感度な分析に
必要なくらいの増巾物を生成することに用いられる。

（７）置換したＤＮＡが仲介するコピー−この方法は転
写産物を生成する伸長のためにプライマーとして置換し
たＤＮＡを用いる点を除いて前述の方法と同様である。

（８）固定化オリゴが仲介する獲得−この方法において
、オリゴヌクレオチド（例えば、完全な転写物の半分の
大きさ）は固体支持物の固定化し、生ｔ、ＲＮＡはハイ
ブリダイゼーションによって獲得され、ＲＮＡの残りの
ハイブリダイゼーションしていない部分は次に転写可能
なヘアピンプローブを獲得するために用いられる。

（９）ＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの利用−この
方法において、始めのプローブは転写後ＲＮＡ依存性の
ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＱβレブリカーゼ）によっ
てさらなる増巾に特異的なＲＮＡを生成する一本鎖また
は二本鎖ＤＮＡの配列を持つように修飾される。この配
列はプローブの５′末端上にある。生成ＲＮＡは第２の
工程を済ずにさらなる増巾のために用いられる（ＰＣＴ
刊行（（Ｐ　Ｔ　ＣＰｕｂｌｉｃａむ１ｏｎ）ｌ））８
８　１０３１５参照）。

検出方法 合成されそして集積されたＲＮＡ転写物を検出する方法
は主として使用者の希望及び必要性に頼る。種々の方法
が知られており、そして本発明に応用できるものが将来
開発されるであろう。単なる例として、２．３の方法を
ここに詳細に記載する。主として、これらの方法は標識
した転写産物の生成まｔ：は得られたハイブリッドを検
出する転写産物のハイブリダイゼーションに基づいてい
る。

（１）標識したＲＮＡ転写物の合成−１つまたはそれ以
上の検出可能な標識物を含むｒＮＴＰｓを転写混合物に
添加することによって、これまた検出可能な標識物を含
むＲＮＡ転写物を合成することができる。有効な検出可
能な標識物として供給される物質はこの技術分野におい
てよく知られており、直接検出されないが、例えばそれ
ぞれアビジン及び抗体等の特異的結合相手の標識型と反
応させることによって簡単に検出されるビオチン及びハ
プテンのようなリガンドと同様に、例えば３ｆｆｐ、　
３）１．　ｌ２ｓ１１及び＋４Ｃ，７）ような放射性同
位体、蛍光物質、化学ルミネセンス、発色団その他であ
る。

（２）標識プローブとのノ・イブリダイゼーションによ
る検出−この方法はＲＮＡ転写物を検出するためのさら
なるハイブリダイゼーション工程による。直接または間
接的に検出可能な標識物を含むプローブの調製のための
種々の方法が知られている。標識物はすぐ上に述べた材
料と同じである。

（３）ハイブリダイゼーション及び抗ハイブリッド試薬
の利用による検出−検出プローブはまたＲＮＡ転写物と
形成したハイブリッドが混合物中において特異的であり
それゆえ例えばＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに結合する
ように選ばれた抗体のような上述した抗ハイブリッド試
薬を用いることによって選択的に検出可能であるように
選ばれる。

（４）ＲＮＡ転写物の検出−転写産物それ自体は混合物
からＲＮＡを分離することによって、または先ずホスフ
ァターゼで未反応のｒＮＴＰｓを破壊し、次にポリヌク
レオチドホスホリラーゼ、ピルベートキナーゼ及びホタ
ルルシフェラーゼの反応から成るバイオルミネセンス系
のようなＲＮＡに対して検出可能な反応をする試薬を添
加することによって溶液中において検出可能である（例
えばＣ、Ｐ　、Ｈ、バリー（（ＣＰ、Ｈ，Ｖａｒｙ））
　（１９８７）ヌクレイツクアシツズリサーチ（（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、））上５：６８８３−
６８９７に記載されているように）。

当然のことながら、転写系は特異的な大きさの転写物を
生成するように設計されるので、そのような場合におい
てはそれらはゲル電気泳動のようなサイズ分析方法によ
って簡単に同定される。

本発明をここに説明するが、以下の実施例によって限定
されるものではない。

実施例１ ヘアピンプローブの転写実験 ホスホアミダイト型の合成のために製造元が供給してい
る試薬を用いてｎ＝５及び７である下に示した配列を持
つオリゴヌクレオチドを合成した（アプライドバイオシ
ステムズ（（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））
、フォスター市カルフォルニア、アメリカ合衆国（（Ｆ
ｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ））、モデル３８
０　Ｂ　（（Ｍｏｄｅｌ　３８０　Ｂ））オリゴヌクレ
オチド合成機） ／ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’ｎ ’−ＡＴＴＡＴ（１；ＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＴ
ＣＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＧＧＡＧＣＴＴＡＡ−５’オリ
ゴヌクレオチドは２０％変性ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動で精製した。下に明示した条件でＴ７バタ
テリオフアージＲＮＡポリメラーゼ存在下での精製材料
のＲＮＡ転写物生成能を試験した。

４０ｍ！ｌｈリスー　ＨＣＱＣｐＨ８、ｌ、３７°Ｃ）
、１ｍＭスペルミジン、５ｎＭジチオスレイトール、５
０ｇ／　ｔａｇウシ血清アルブミン、０．０１％（ｖ／
ｖ）　　トライトンＸ−１００、及び８０ｍｇ／−βポ
リエチレングリコール（分子量８０００）中に１ｍＭＡ
ＴＰ。

ＧＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰ及び２マイクロキユーリーの
３２Ｐ標識ＣＴＰ　（３０００キユ一リ／ｍＭ）、７０
ユニツトのＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼ（ファルマシア
、ミルウオーキー、ウィスコンシン州、アメリカ合衆国
Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　、　Ｍ　ｉ　１ｖａｕｋｅｅ　
、　Ｗ　Ｉ　、　ＵＳＡ）及びｌｏｇの鋳型オリゴヌク
レオチドが含有する混合物（最終容量２５マイクロリツ
ター）を３７℃で３時間インキュベートした。生成物を
次にポリアクリルアミド電気泳動及びオートラジオグラ
フィーにより分析しＩ；。

第７図はｌＯピコグラム相当をロードしたゲルのオート
ラジオダラムを示す。レーン１０．５０、及び１００は
転写に用いた開始オリゴヌクレオチドの量をピコグラム
で示している。転写後、全部、Ｋ、％の材料を分析のた
めにロードした。結果は最初の濃度にかかわりなく等量
の鋳型から等量のＲＮＡが生成しｔ；ことを示す。

実施例２ 目的配列を検出するための転写可能なヘアピンプローブ
の利用 Ａ、固定化サンプル核酸のハイブリダイゼーション 以下の異なるグローブ配列がそれぞれの５′末端に付加
されるように転写可能なヘアピンオリゴヌクレオチドを
実施例１のとおりに調製する。

５　’　−ＡＧＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＴ　
ＣＡＴ　ＣＴＴ〜３′及び５　’　−ＣＡＡ　ＧＣＡ　
ＡＧＴ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＣＴＣＴＣＴ−３’上のプロ
ーブ配列は細菌タラミジアトラコマテイス（Ｃｈｌａｍ
ｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の膜タンパク質に
特異的である。Ｃ，トラコマテイスの存在を試験するた
めのサンプル由来の核酸をポリスチレン乳樹脂のような
固体支持物に固定する。固定化サンプル核酸は次に常法
的な条件下において転写可能なプローブとハイブリダイ
ゼーションさせる（マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）
ｅｔ　ａｌ　（１９８２）モレキュラークローニング、
コールドスプリングハーバ−（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａ
ｒ）　）。

ハイブリダイゼーションしないプローブを除去するため
の洗浄後、ハイブリダイゼーションしたプローブｔ−１
ｏｏ℃に加熱することによって溶液中に遊離させ、そし
て転写反応及び分析を実施例１に記載したとおりに行う
。

Ｂ、ビオチニル化サンプル核酸のハイブリダイゼーショ
ン 本実験において、光化学的ビオチニル化すンプル核ｌｌ
びコントロールＤＮＡはヘアピンプローブにハイブリダ
イゼーションした。ハイブリッドはストレプトアビジン
がコートされたビーズ上に獲得された。次にハイブリダ
イゼーションしたヘアピンプローブの３′末端を伸長さ
せるためにＤＮＡポリメラーゼ系でビーズを処理した。

本方法によってプローブが加熱することなく遊離する不
安定な三本鎖構造が生成された。遊離したプローブは次
に適当なＮＴＰ混合物及び特異的なＲＮＡポリメラーゼ
を添加することによって転写された。

転写反応は３！Ｐ−標識及び無標識ＮＴＰの混合物と行
なわれ、次にシンチレーションカウンターで最終的なハ
イブリッドの放射活性を測定することによって分析した
。

光ビオチニル化した５０＋１グラムのＤＮＡサンプル（
ダツタグプタＣＤａｔｔａｇｕｐｔａ　））らの方法、
アナリテイ力ル　バイオケミストリー（（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　））　１７７　：　８５（１９８９
）によって調製）を１００℃に５分間加熱することによ
って変性させ、ｌｎＨのヘアピンプローブＳＪＨ１０（
下に示す配列を持つ）と１ＭＮａｃＱ中４５℃で３０分
間ハイブリダイゼーションした。

／ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’Ｔ。

叉ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴ
ＴＣＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＣ−ＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡ
Ａ−５’ 標識ハイブリッドは次にストレプトアビジンアガロース
（１００μｇ／鎗βの酵母ｔ　ＲＮＡで前処理した）上
に３７℃で３０分間インキュベーションすることによっ
て獲得された。

アガロースビーズ上に獲得されたハイブリッドをインキ
ュベーションし、続いて遠心分離することによって洗浄
した。０．１−％ＳＤＳで２回、ＰＢＳＴ　ＣＰＢＳＴ
　：　３５ｍＭ　ＮａＨｚＰＯａ、３０＋ＭＮａ、ＨＰ
Ｏ，及び１５０ｍＭＮａｃＡ、０．０５％　ツイーン２
０を含有するｐＨ７の緩衝液）で２回、及び転写緩衝液
（４０ｍＭ）−リス、ｐｉ（８，０，１０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｇｚ、４ｍＭスペルミジン、ｌＯｍＭＤＴＴ、１０ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，５０ｔｔｇ／　ｔｔ（ｌのウシ血清アル
ブミン）で１回。次にｄＮＴＰ及びＮＴＰの混合物を添
加し、続いて４ユニツトのＤＮＡポリメラーゼのフレノ
ウ断片を添加し、３７℃で１時間インキュベーションし
た。液体の容量は１００μＱであった。本方法によって
ハイブリダイゼーションしたヘアピンプローブは溶液中
に遊離する。

遊離したヘアピンプローブを含有する５０μＱの溶液を
除去し、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）の１４
０ユニツト　Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを添加し、続いて
２０μＣｉ（マイクロキューリー）のａ　−３！Ｐ標識
ＵＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍＭの比活性）を添加した。

混合物を３７℃で２時間インキュベーションした。

ＲＮＡ生成物を含有する２５μＱの溶液を次に４５℃で
３０分間、５０ｎｇのビオチニル化プローブのオリゴヌ
クレオチドＳＪＨ１０とハイブリダイゼーションした。

ハイブリッド及びハイブリダイゼーションしないビオチ
ニル化プローブをストレプトアビジンがコートされたデ
イナル（Ｄｙｎａｌ）（グレートネック、ニューヨーク
、アメリカ合衆国（（Ｇｒｅａｔ　Ｎｅｃｋ、ＮＹ、Ｕ
ＳＡ　））　）の磁気粒子上に３７℃、及び６８℃で２
回インキュベーションすることによって獲得した。ビー
ズを次にシンチレーションカウンターで測定した。

同定方法は３セツトのサンプルによって行なわれた：目
的クラミジアＤＮＡ、コントロールヒトＤＮＡ及びサン
プルとしての核酸が含有しないブランクである。結果は
棒グラフとして第８図に示されている。「ヒト」と示さ
れているサンプルはヒトＤＮＡ、ｒクラミジア」と示さ
れているサンプルはクラミジアＤＮＡ１及び「ブランク
」はすべての方法で試験されたＤＮＡがないサンプルで
ある。結果はクラミジア特異的プローブにクラミジアＤ
ＮＡが特異的にハイブリダイゼーションしていることを
示す。

同様の方法が両方の獲得工程で磁気ビーズを用いて行な
われた。プローブを溶液中に遊離するための中程度のフ
レノウポリメラーゼの伸長処理を行わずに転写がなされ
た。転写反応はビーズ上で直接ＤＮＡに対して行なわれ
た。第９図は５０ｎｇのサンプルＤＮＡについての結果
である。

実施例３ 分離用に抗ＤＮＡ／ＲＮＡを用いたＲＮＡ目的物の増巾 この技術はＨＩＶ及びＨＲＶのようなウィルス及びまた
リボゾームＲＮＡを検出することで細菌に対しても応用
できる。以下の実施例はサンプル中のヒトライノウィル
ス（ＨＲＶ　　ｌ　４）の検出に関する。同様の方法が
他のＲＮＡ分析物を検出するのに用いられる。ＤＮＡプ
ローブ配列は下に示す２つのプロモーター配列及び相補
的なプローブ配列を持つ（プローブ配列は下線部分、ブ
ルース（Ｂｒｕｃｅ）ら（１９８９）アーカイブズオプ
バイ（ＦＯジー（Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、）　１０５　
：　ｌ　７９−１８７による） ５’　−ＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＣＴＴＡＣＧＡＴＧＣ
ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡ−ＴＴＡＴＴＴＴＴ
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’抗ＤＮＡ
／ＲＮＡ抗体はボグスラウスキー（Ｂｏｇｕｓｌａｗｓ
ｋｉ）らの方法、ジャーナルオブイムノロジカルメリッ
ト（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ−）　　（１９８６
）８９　：　１２３−１３０に従って調製される。

抗体のＩｇＧ画分は抗体混合物及び中心体懸濁液を４℃
に一晩コルピン（Ｃｏｌｖｉｎ）らの方法、中心体（Ｍ
ｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）　：医学的及び生物学的応用
（Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　、レンバウム、トエケス（
Ｒｅｍｂａｕａ＋　ａｎｄ　Ｔｏｅｋｅｓ）編１ＣＲＣ
プレス（ボッカラトン、ＦＬ　　１９８８）１−Ｂペー
ジに従ってインキュベーションすることによって中心体
上に固定化する。

ウィルスが含有されている懸濁液をプロテインナーゼに
で処理し、次にフェノール：クロロホルム：イソアシル
アルコール（５０：　５０　：　２）で抽出し、ＲＮＡ
をエタノールで沈殿させる。抽出したＲＮＡを次に５Ｓ
ＰＥ（１０ａ＋Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐ［７，４，
０，１５Ｍ塩化ナトリウム、１＋ｎＭ　ＥＤＴＡ）　、
５％ポリエチレングリコール、０．２ｍｇ／ａ＃サケ精
子ＤＮＡを含有する溶液中で４０℃３０分間プロモータ
ー含有ヘアピンプローブとハイブリダイゼーションする
。抗体固定化中心体をまた同様の溶液で処理しＤＮＡ結
合部位を飽和させる。ハイブリダイゼーション後、混合
物を中心体懸濁液と結合させ３７℃でハイブリダイゼー
ション緩衝液、次に転写緩衝液で洗浄し、ハイブリダイ
ゼーションしていてないプローブを除去する。獲得され
たハイブリッドを持つ中心体は次に実施例１のとおりに
転写され、生成物をゲル電気泳動によって分析する。ま
たは、ノーイブリッドを持つ中心体を加熱し転写され分
析物の検出のために分析されるプローブが遊離される。

生成ＲＮＡの量は分析されるＲＮＡの量と相関する。

実施例４ 分離に替わって第２プローブ及びライゲーションから成
る増巾 本方法で用いられる２つのプローブのグローブ配列（前
に第５図に関連して詳細に記載されている）は相互に相
いれない領域において目的配列（本実施例においてはク
ラミジアのプラスミド配列）とハイブリダイゼーション
するが第２プローブ（下の配列参照）の３′末端と並列
するプロモーター含有のヘアピンプローブ（下の配列参
照）の５′末端がリン酸化されているように設計される
。

ヘアピンプローブ（ＳＪＨＰＩＯＩＡ）の配列５　’　
Ｐ−ＴＣＴＣＴＣＴＣＧＴＡＡＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＡ
ＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＡＴＡＣＧ
ＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’第２プローブ（ＰＣＬ５
）の配列 ５　’　−ＧＴ（、ＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＧＴＴＧＣ
ＡＡＡ−３’グローブは自動ＤＮＡ合成機で調製する。

５ＪＨＰＩＯＩプローブはマニアテイス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）らの方法、上述、１２２ページに従ってポリヌク
レオチドキナーゼ及びＡＴＰでカイネーションされる。

役割の分っていないプラスミド（ｃｒｙｐｉｔｉｃｐＪ
ａｓｍｉｄ）　（ブラック（（Ｂｌａｃｋ　’））ら（
１９８９）カレントマイクロバイオロジー（（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌｏｇｙ））　　ｌ　９　：　６７−７４）を含
むクラミジアの全ゲノムＤＮＡのサンプルをＳａｃ　Ｉ
制限酵素で分解しそして分解物を変性させるために１０
０℃で５分間加熱する。加熱後、サンプルを氷冷する。

変性した分解ＤＮＡを次に実施例１のとおりに転写緩衝
液中４５℃でｌＯ分間ＳＪＨＰＩＯＩＡ及びＰＣＬ５プ
ローブとハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼ
ーション後、２０ユニツトのＴ４リガーセ（ベーりンガ
ーマンハイム、インデイアナポリス、インデイアナ、ア
メリカ合衆国（（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌ　ｉｓ　、　ＩＮ、ＵＳ
Ａ））　）及びＡＴＰ　（最終濃度１０ｍＭ）を添加し
、３７℃で６０分間ライゲーションする。ライゲーショ
ン後、核酸を随意フェノール抽出によって精製しエタノ
ールで沈殿させる。転写は７０ユニツトのＴ７　　ＲＮ
Ａポリメラーゼによって転写緩衝液中で行い実施例１で
行ったように分析する。

実施例５ 増巾した転写産物のさらなる増巾−第２段階の増巾 より多くのＲＮＡを生成するために用いられるより多く
の転写可能なりＮＡを獲得するために上述の実施例にお
ける転写産物が用いられる。例えば、実施例において部
分的にＵＴＰをビオチニル化ＵＴＰ（エンソ、ニューヨ
ーク、ニューヨーク、アメリカ合衆国、（（Ｅｎｚｏ、
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ））　）に替えること
によってビオチニル化ＲＮＡが転写によって生成する。

これは次にストレプトアビジン固体相上に獲得される。

獲得されたＲＮＡは元のプロモーター含有ＤＮＡに結合
し、そのＤＮＡは次に実施例１の条件下においてさらに
転写され、より多くのＲＮＡを生成する。

以下に第２段階のＲＮＡを介する増巾を行った詳細な実
験について記載する。本方法において、ビオチニル化Ｒ
ＮＡはヘアピンプローブの転写により生成された。ビオ
チニル化ＲＮＡはストレプトアビジンがコートされた磁
気ビーズ上に固定化された。獲得されたＲＮＡは次に獲
得されたＲＮＡと相補的なりＮＡ配列を含む元のヘアピ
ンプローブとハイブリダイゼーションされた。これによ
って固定化ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドが生成した。こ
のようにハイブリッドはまた溶液中でＲＮＡとＤＮＡを
先ずハイブリダイゼーションし、次にハイブリッドを磁
気粒子上に獲得させることによっても得ることができる
。獲得されたヘアピンプロモーター含有プローブは次に
転写されＲＮＡを生成する。転写反応は固定化ハイブリ
ッドが付着した粒子を用いるかまたは溶液中でＤＮＡを
変性させた後行う。

以下の配列を持つ既知の量（１０フエトグラム）のプロ
モーター含有ヘアピンプローブ（ＳＪＨ６と設計）を ／ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’’ＡＴ
ＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＴＣＴ
ＡＣＴＴＴＡＧＡＴＣ−ＴＴＴＴＡＧＡ−５’ ４０ｍＭ　トリスｐＨ８，１０ｍＭ塩化マグ４　シ’７
　ム、１（１＋Ｍ塩化ナトリウム、４ｍＭスペルミジン
、１ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、　５０　ｕｇ／ｍｌのウシ血清
アルブミン及び７０ユニツトのＴ７　　ＲＮＡポリメラ
ーゼ（ファルマシア、ビス力タウェイ、ニューシャーシ
ーアメリカ合衆国（（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ、　ＮＪ。

ＵＳＡ））　）を含む緩衝液中でそれぞれ０−５ｍＭの
ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びＣＴＰ、０．４ｍＭＵＴＰ及び０
　＋　１　ｍＭビオ−ＵＴＰ　（エンゾ、ニューヨーク
、ニューヨーク、アメリカ合衆国（（Ｅｎｚｏ、　Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ、　ＮＹ、　ＵＳＡ））　）を含む２５ＩＬ
Ｑの反応容量で３時間ハイブリダイゼーションした。反
応は３７℃で３時間行った。ＲＮＡ産物を次にエタノー
ルで沈殿した。

沈殿したＲＮＡを２５ｎＭリン酸ナトリウム、ｐｉ（７
，０，１％ツイーン２０．０−１％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕ
ｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ）　、４０μｇ／
ＩＩρのニシン精子ＤＮＡを含む緩衝液に懸濁した。Ｒ
ＮＡを同じ緩衝液中で３０分間室温でインキュベーショ
ンすることによって、磁気ビーズ上に獲得した。

ビーズを同じ緩衝液で１回、そして転写緩衝液で３回洗
浄した。ビーズを次に固定化ビオチニル化ＲＮＡとハイ
ブリダイゼーションさせるためにｌＯｎＭの５ＪＨ６を
含む転写緩衝液中で３０分間４５℃でインキュベーショ
ンした。ハイブリダイゼーション後ビーズを５０℃で同
じ緩衝液で３回洗浄した。獲得されたハイブリッドを次
に転写緩衝液中に移し、それぞれ０．５ｍＭ（最終）の
ＡＴＰ。

ＣＴＰｌＧＴＰｌＵＴＰ及びｌ０ｐｃｉのａ　−１１ｐ
−ＵＴＰ　（３０００ｃｉ／ａ＋Ｍ）及び７０ユニツト
のＴ７　　ＲＮＡポリメラーゼを添加した後３７℃で３
時間転写した。

生成ＲＮＡを次に変性２０％ポリアクリルアミドゲルの
ゲル電気泳動によって分析した。電気泳動した後、ゲル
をゲル乾燥機で乾燥させ、Ｘ線フィルム上にオートラジ
オグラフを撮った。オートラジオグラフより生成物の位
置を同定し、バンドを切り出しそしてシンチレーション
カウンターで測定した。ゲル上のひとつのレーンに、既
知の量の全混合物も電気泳動が終了する１５分前にロー
ドした。このレーンでは生成物は分離しない。このレー
ンと分離した生成物のレーンの間の比を反応効率に見積
もった。約３００万倍モル数の増巾になった。

転写効率は緩衝液中のスペルミジンを除去し開始ヌクレ
オチドとしてｌからｌＯＯμＭのｐＧｐＧを添加するこ
とでさらに改善されることも見出された。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、（ａ）（１）ハイブリダイゼーション条件下におい
て機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形成
することが可能な一本鎖の自己相補的な配列であり、（
２）該自己相補的配列の５′末端から伸長する転写可能
な配列で、その５′配列は該ヘアピン形成のハイブリダ
イゼーション条件下においてＲＮＡポリメラーゼ及び必
要とするリポヌクレオシド三リン酸存在下で転写可能で
あり、及び（３）一本鎖プロープの配列は実質的に問題
の配列と相補的であることを特徴とする転写可能なグロ
ーブと液体混合物中において問題の配列をハイブリダイ
ゼーションし、 （ｂ）実質的にハイブリダイゼーションしないプローブ
を転写することなく問題の配列とハイブリダイゼーショ
ンする該プローブを転写し、かかる転写はヘアピン形成
のハイブリダイゼーション条件下においてなされ、そし
て、 （Ｃ）あらかじめ決められた時間、該ハイブリダイゼー
シヨン・プローブにおいてプローブ配列を最終的に転写
し、得られたＲＮＡ転写産物を問題の配列の増巾物とし
て集積する工程から成ることを特徴とする特定の核酸配
列を増巾する方法。

２、該プローブ配列は該転写可能な５′配列から成る第
１項記載の方法。

３、該プローブ配列は該自己相補的配列の３′末端から
伸長する配列から成りそしてそれは実質的に該５′の転
写可能な配列と相補的でない第１項記載の方法。

４、得られたＲＮＡ転写産物が第２段階の増巾でさらに
増巾される第１から３項記載の方法。

５、該ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ
、好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６バクテリオフアー
ジＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくは該プロモータ
ー領域はヘアピン型として表わされた以下の塩基配列か
ら成る第１から４項記載の方法。

Ｔ７用　　〆ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−
３’ｎ 一 ＼ＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣ−５’Ｔ３用
　　／ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ−３
’ｎ 又ＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＴＡＧＣＴＴＴＣＣ−５’　
劃た。よＳＦ３用 ／ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ
−３’ｎ （６１□□ＧＣＴえ□ＴＣＣ□。１６□。い、い、。−
５・８図中ｎは２と５０を含めて２から５０の整数であ
る。

６、（ａ）（１）ハイブリダイ、ゼーション条件下にお
いて機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形
成することが可能な一本鎖の自己相補的な配列であり、
（２）該自己相補的配列の５′末端から伸長する転写可
能な配列で、その５′配列は該ヘアピン形成のハイブリ
ダイゼーション条件下においてＲＮＡポリメラーゼ及び
必要とするリボヌクレオシド三リン酸存在下で転写可能
であり、及び（３）−木調プローブの配列は実質的に問
題の配列と相補的である転写可能なプローブと液体混合
物中において問題の配列をハイブリダイゼーションし、 （ｂ）実質的にハイブリダイゼーションしないプローブ
を転写することなく問題の配列とハイブリダイゼーショ
ンする該プローブを転写し、かかる転写はヘアピン形成
のハイブリダイゼーション条件下においてなされ、そし
て、 （Ｃ）あらかじめ決められた時間、該ハイブリダイゼー
ション・グローブにおいてプローブ配列を最終的に転写
し、得られたＲＮＡ転写産物を問題の配列の増巾物とし
て集積しそして （ｄ）集積されたＲＮＡ転写産物を検出する、工程から
成ることを特徴とするテストサンプル中において特定の
核酸配列を検出する方法。

７、該プローブ配列は該転写可能な５′配列から成る第
６項記載の方法。

８、該グローブ配列は該自己相補的配列の３′末端から
伸長する配列から成りそしてそれは実質的に該５′転写
可能な配列と相補的でない第６項記載の方法。

９、得られたＲＮＡ転写産物が第２段階の増巾でさらに
増巾される第６から８項記載の方法。

１０、（１）（１）ハイブリダイゼーション条件下にお
いて機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形
成することが可能な一本鎖の自己相補的な配列であり、
（２）該自己相補的配列の５′末端から伸長する転写可
能な配列で、その５′配列は該ヘアピン形成のハイブリ
ダイゼーション条件下においてＲＮＡポリメラーゼ及び
必要とするりボヌクレオシド三リン酸存在下で転写可能
であり、及び（３）−木調プローブの配列は実質的に問
題の配列と相補的である転写可能なヘアピングローブ及
び （２）該ＲＮＡポリメラーゼ から成ることを特徴とする特定の核酸配列を増巾するた
めに用いる試薬キット。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図はヘアピンを及び二量体型を含む本発明の転
写可能なプローブのいくつかの異なる形状の説明である
。 第４図はハイブリダイゼーションしていないプローブか
らハイブリダイゼーションしたものを区別することを利
用した分離段階を含んだ目的核酸配列を増巾する際の本
発明の転写可能なプローブの利用について説明した図で
ある。 第５図はハイブリダイゼーションしたプローブとハイブ
リダイゼーションしないプローブを物理的に分離する必
要がない増巾の際の本プローブの利用を説明した図であ
る。ここに説明する方法は目的配列とハイブリダイゼー
ションする際、転写可能なグローブと第２プローブのラ
イゲーションをするための第２プローブを利用する。 第６図はグローブ配列がヘアピン配列の３′末端から伸
長した配列から成る本発明のグローブの利用について説
明した図である。特に説明した方法においてはハイブリ
ダイゼーションしＩ；プローブは固定型のプローブ及び
ハイブリダイゼーションしたプローブに特異的な制限分
解を用いてハイブリダイゼーションしないプローブから
区別する。 第７図はヘアピンオリゴヌクレオチドの転写を実証する
ポリアクリルアミドゲルのオートラジオダラムを示す写
真である。 第８及び９図は以下の実施例に記載した増巾実験の結果
を表わしたグラフである。 特許出願人　モレキュラー・ダイアグノステイツクス慟
インコーボレーテッ ド ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、１ Ｕ） 図面の浄書（内容に変更なし） ＦｌＧ　７ ｒｏ　、ｒＬ：ｊ　ＤＮ／’ｌ　？’　＋峯しト ７うＳシ゛ア ブルア す〉グル ＦｌＧ、８ ５０＊１ＤＮＡ？”の多能にピース゛０゛らり４ア〉２
＠ル ＦＩＧ、９ 手続補正書 （方式） ％式％ ２、発明の名称 転写可能なヘアピンプローブを用いた核酸の増巾方法３
゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）（１）ハイブリダイゼーシヨン条件下におい
   て機能的なプロモーター領域を含むヘアピン構造を形成
   することが可能な一本鎖の自己相補的な配列であり、 （２）該自己相補的配列の５′末端から伸長する転写可
   能な配列であり、その５′配列は該ヘアピン形成のハイ
   ブリダイゼーシヨン条件下においてＲＮＡポリメラーゼ
   及び必要とするリボヌクレオシド三リン酸存在下で転写
   可能であり、 及び（３）一本鎖プローブの配列は実質的に問題の配列
   と相補的であることよりなる転写可能なプローブと液体
   混合物中において問題の配列をハイブリダイゼーシヨン
   し、 （ｂ）実質的にハイブリダイゼーシヨンしないプローブ
   を転写することなく問題の配列とハイブリダイゼーシヨ
   ンする該プローブを転写し、かかる転写はヘアピン形成
   のハイブリダイゼーシヨン条件下においてなされ、そし
   て、 （ｃ）あらかじめ決められた時間、該ハイブリダイゼー
   シヨン・プローブにおいてプローブ配列を最終的に転写
   し、得られたＲＮＡ転写産物を問題の配列の増巾物とし
   て集積する、工程から成ることを特徴とする特定の核酸
   配列を増巾する方法。