JPH01265887A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
- Publication number
- JPH01265887A JPH01265887A JP63094661A JP9466188A JPH01265887A JP H01265887 A JPH01265887 A JP H01265887A JP 63094661 A JP63094661 A JP 63094661A JP 9466188 A JP9466188 A JP 9466188A JP H01265887 A JPH01265887 A JP H01265887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- domain
- tryptophanase
- region
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規なプラスミドに関し、さらに詳しくは、
コリネ型細菌に属する細菌を形質転換したときに高いト
リプトファナーゼ産生能を発現するプラスミド及び該プ
ラスミドで形質転換された微生物に関する。
コリネ型細菌に属する細菌を形質転換したときに高いト
リプトファナーゼ産生能を発現するプラスミド及び該プ
ラスミドで形質転換された微生物に関する。
トリプトファナーゼはα、β脱離反応およびβ置換反応
で触媒し、Ｌ−トリプトファン、５−メチルトリプトフ
ァン、５−ヒドロキシトリプトファン、５−アミノトリ
プトファン、ピルビン酸、インドール５メチルインドー
ル、５−ヒドロキシインドール、５アミノインドール、
などを各々対応する基質から合成することが可能である
。［醗酵協会誌第３２巻第７号１９７４年ｐ、２９８〜
３ｌ７、及びＡｍ１ｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄ、 ｖｏｌ。
で触媒し、Ｌ−トリプトファン、５−メチルトリプトフ
ァン、５−ヒドロキシトリプトファン、５−アミノトリ
プトファン、ピルビン酸、インドール５メチルインドー
ル、５−ヒドロキシインドール、５アミノインドール、
などを各々対応する基質から合成することが可能である
。［醗酵協会誌第３２巻第７号１９７４年ｐ、２９８〜
３ｌ７、及びＡｍ１ｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ ａｃｉｄ、 ｖｏｌ。
３１ ｐ、１１３〜１１．８（１９７５）など］。この
性質を利用したトリプトファンの定量や、本酵素に４分
子のピリドキサール５リン酸が結合することを利用して
ピリドキサール５リン酸の定量にも応用できる。
性質を利用したトリプトファンの定量や、本酵素に４分
子のピリドキサール５リン酸が結合することを利用して
ピリドキサール５リン酸の定量にも応用できる。
このように産業上利用価値の高いトリプトファナーゼを
産生する微生物の多くは腸内細菌群であり、多くの工業
的利用における利点およびアミノ酸、核酸発酵なとの実
績のあるコリネ型細菌を用いるトリプトファナーゼの生
産は従来全く知られていない。
産生する微生物の多くは腸内細菌群であり、多くの工業
的利用における利点およびアミノ酸、核酸発酵なとの実
績のあるコリネ型細菌を用いるトリプトファナーゼの生
産は従来全く知られていない。
本発明者らは、組換えＤＮＡ技術を利用して本来トリプ
トファナーゼ活性を有していないコリネ型細菌に属する
細菌にエシェリヒア・コリ由来のトリプトファナーゼ生
合成遺伝子を導入して該遺伝子に対応するトリプトファ
ナーゼを著量産生させることについて検討を行なった。
トファナーゼ活性を有していないコリネ型細菌に属する
細菌にエシェリヒア・コリ由来のトリプトファナーゼ生
合成遺伝子を導入して該遺伝子に対応するトリプトファ
ナーゼを著量産生させることについて検討を行なった。
その結果、本発明者らは、（ａ）トリプトファナーゼ構
造遺伝子を含むＤＮＡ領域、（ｂ）該構造遺伝子の発現
を制御しうるプロモーター及びオペレーターを含む調節
遺伝子領域、及び（ｃ）コリネ型細菌細胞内で自律増殖
可能なＤＮＡ領域、 を少なくとも含有する新規なプラスミドを創生じ、該プ
ラスミドをコリネ型細菌細胞内に導入し、トリプトファ
ナーゼ活性を有するコリネ型細菌へと形質転換させるこ
とに成功し、コリネ型細菌を用いてトリプトファナーゼ
を製造することを可能にし、本発明を完成するに至った
。
造遺伝子を含むＤＮＡ領域、（ｂ）該構造遺伝子の発現
を制御しうるプロモーター及びオペレーターを含む調節
遺伝子領域、及び（ｃ）コリネ型細菌細胞内で自律増殖
可能なＤＮＡ領域、 を少なくとも含有する新規なプラスミドを創生じ、該プ
ラスミドをコリネ型細菌細胞内に導入し、トリプトファ
ナーゼ活性を有するコリネ型細菌へと形質転換させるこ
とに成功し、コリネ型細菌を用いてトリプトファナーゼ
を製造することを可能にし、本発明を完成するに至った
。
これにより、トリプトファナーゼ活性を利用する多種の
酵素反応は、工業的に数多くの優位性、例えば菌体収量
向上、反応操作性、菌体由来峡雑物の抑制、精製回収過
程の簡略化などが得られ、且つ工業的生産において実績
のあるコリネ型細菌を用いることが可能となった。
酵素反応は、工業的に数多くの優位性、例えば菌体収量
向上、反応操作性、菌体由来峡雑物の抑制、精製回収過
程の簡略化などが得られ、且つ工業的生産において実績
のあるコリネ型細菌を用いることが可能となった。
以下、本発明において新規に創生したプラスミドの構成
についてさらに詳しく説明する。
についてさらに詳しく説明する。
「トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領域」
（以下、「Ｔ領域」と略称することがある）は、Ｌ−ト
リプトファンをインドールとピルビン酸とアンモニアに
分解する役割をもつ酵素、すな＝３− わちトリプトファナーゼをコードするＤＮＡ領域であり
、また、「トリプトファナーゼ構造遺伝子を発現制御し
うるプロモーター及びオペレーターを含む調節遺伝子領
域」 （以下、「Ｐ領域」と略称することがある）は、
トリプトファナーゼを菌株が産生ずるためのシグナルと
なるＤＮＡ領域であって、例えば、エシェリヒア・コリ
染色体ＤＮＡ由来のトリプトファンプロモーター及びオ
ペレーター画分を含むＤＮＡ領域エシェリヒア・コリ染
色体ＤＮＡ由来のトリプトファナーゼプロモーター及び
その発現を調節するＤＮＡ領域等が包含される。上記の
トリプトファンプロモーター及びオペレーター画分は例
えばプラスミドｐＤＲ７２０（ファルマシア製）由来の
ＤＮＡ領域であることができる。
（以下、「Ｔ領域」と略称することがある）は、Ｌ−ト
リプトファンをインドールとピルビン酸とアンモニアに
分解する役割をもつ酵素、すな＝３− わちトリプトファナーゼをコードするＤＮＡ領域であり
、また、「トリプトファナーゼ構造遺伝子を発現制御し
うるプロモーター及びオペレーターを含む調節遺伝子領
域」 （以下、「Ｐ領域」と略称することがある）は、
トリプトファナーゼを菌株が産生ずるためのシグナルと
なるＤＮＡ領域であって、例えば、エシェリヒア・コリ
染色体ＤＮＡ由来のトリプトファンプロモーター及びオ
ペレーター画分を含むＤＮＡ領域エシェリヒア・コリ染
色体ＤＮＡ由来のトリプトファナーゼプロモーター及び
その発現を調節するＤＮＡ領域等が包含される。上記の
トリプトファンプロモーター及びオペレーター画分は例
えばプラスミドｐＤＲ７２０（ファルマシア製）由来の
ＤＮＡ領域であることができる。
上記のＴ領域及びＰ領域の供給源となる微生物は特に制
限されるものではないが、一般には、エシェリヒア・コ
リＡＴＣＣ２３２８２、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２
３４３７、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２７３２５等が
有利に使用される。
限されるものではないが、一般には、エシェリヒア・コ
リＡＴＣＣ２３２８２、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２
３４３７、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２７３２５等が
有利に使用される。
さらに、［コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なＤＮＡ
領域」 （以下、「Ｂ領域」と略称することがある）は
、コリネ型細菌細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域であ
り、主にコリネ型細菌細胞内でに存在しうるプラスミド
が供給源として使用できる。しかして、Ｂ領域の供給源
としては、コリネ型細菌例えば、ブレビバクテリウム・
７ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）Ｍ Ｊ −２３３（微工研菌寄第３０６８号）由来
のプラスミドｐＢＹ−５０２が好適に用いられる。
領域」 （以下、「Ｂ領域」と略称することがある）は
、コリネ型細菌細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域であ
り、主にコリネ型細菌細胞内でに存在しうるプラスミド
が供給源として使用できる。しかして、Ｂ領域の供給源
としては、コリネ型細菌例えば、ブレビバクテリウム・
７ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕ
ｍ）Ｍ Ｊ −２３３（微工研菌寄第３０６８号）由来
のプラスミドｐＢＹ−５０２が好適に用いられる。
本発明により提供されるプラスミドは、以上に述べたＴ
領域、Ｐ領域及びＢ領域の３つのＤＮＡ領域に加えて、
さらに必要に応じて、「エシェリヒア属細胞内で自律増
殖可能なＤＮＡ領域」 （以下「Ｅ領域」と略称するこ
とがある）を含むことができ、このＥ領域はエシェリヒ
ア属細菌細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域であって、
主にエシェリヒア属細菌細胞内に存在しうるプラスミド
が供給源として使用できる。しかして、Ｅ領域の供給源
としては、プラスミドｐＨ３Ｇ３９’８、ｐＨ３Ｇ３９
９、ｐＨ３Ｇ２９８、ｐＨ３Ｇ２９９、 ｐＢＲ３２５
などが好適に用いられる。
領域、Ｐ領域及びＢ領域の３つのＤＮＡ領域に加えて、
さらに必要に応じて、「エシェリヒア属細胞内で自律増
殖可能なＤＮＡ領域」 （以下「Ｅ領域」と略称するこ
とがある）を含むことができ、このＥ領域はエシェリヒ
ア属細菌細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域であって、
主にエシェリヒア属細菌細胞内に存在しうるプラスミド
が供給源として使用できる。しかして、Ｅ領域の供給源
としては、プラスミドｐＨ３Ｇ３９’８、ｐＨ３Ｇ３９
９、ｐＨ３Ｇ２９８、ｐＨ３Ｇ２９９、 ｐＢＲ３２５
などが好適に用いられる。
本発明により提供されるプラスミドはさらに、宿主微生
物に薬剤耐性という形質を付与することができる遺伝子
である「薬剤耐性能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域」
（以下、「Ｃ領域」と略称することがある）を適宜有す
ることができ、このＣ領域としては、例えば、クロラム
フェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子
、カナマイシン耐性遺伝子等を含むＤＮＡ領域が挙げら
れる。このＣ領域は、前記Ｔ領域、Ｐ領域、Ｂ領域及び
Ｅ領域と別の領域として本発明のプラスミド中に存在す
ることができ、或いはＢ領域及び／又はＥ領域の中に存
在していてもよい。
物に薬剤耐性という形質を付与することができる遺伝子
である「薬剤耐性能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域」
（以下、「Ｃ領域」と略称することがある）を適宜有す
ることができ、このＣ領域としては、例えば、クロラム
フェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子
、カナマイシン耐性遺伝子等を含むＤＮＡ領域が挙げら
れる。このＣ領域は、前記Ｔ領域、Ｐ領域、Ｂ領域及び
Ｅ領域と別の領域として本発明のプラスミド中に存在す
ることができ、或いはＢ領域及び／又はＥ領域の中に存
在していてもよい。
本発明により提供させるプラスミドは、以上に述べたＴ
領域、Ｐ領域、Ｂ領域、Ｅ領域及びＣ領域の５つのＤＮ
Ａ領域のうち、少なくとも、Ｔ領域、Ｐ領域及びＢ領域
の３領域を必須成分として含有するものであり、典型的
な具体例としては、分子量的８．０メガダルトン（約１
２．３ｋｂ）のプラスミドで本発明者らが「プラスミド
ｒｐＣＲＹ−２１ｔｎａＡ Ｉ Ｊと命名したもの、及
び分子量的１１．７メガダルトン（約１．８のｋｂ）の
プラスミドで［プラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ
２ Ｊ と命名したものが挙げられる。これら２種のプ
ラスミドの調製法は後記実施例において具体的に説明す
る。
領域、Ｐ領域、Ｂ領域、Ｅ領域及びＣ領域の５つのＤＮ
Ａ領域のうち、少なくとも、Ｔ領域、Ｐ領域及びＢ領域
の３領域を必須成分として含有するものであり、典型的
な具体例としては、分子量的８．０メガダルトン（約１
２．３ｋｂ）のプラスミドで本発明者らが「プラスミド
ｒｐＣＲＹ−２１ｔｎａＡ Ｉ Ｊと命名したもの、及
び分子量的１１．７メガダルトン（約１．８のｋｂ）の
プラスミドで［プラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ
２ Ｊ と命名したものが挙げられる。これら２種のプ
ラスミドの調製法は後記実施例において具体的に説明す
る。
なお、本明細書においてプラスミドの分子量はアガロー
スゲル電気泳動法により測定した値である。
スゲル電気泳動法により測定した値である。
本発明のプラスミドは微生物、殊にコリネ型細菌に属す
る細菌に導入することにより、トリプトファナーゼ産生
能を発現させることができる。
る細菌に導入することにより、トリプトファナーゼ産生
能を発現させることができる。
しかして、本発明のプラスミドの宿主となる微生物菌株
は、コリネを細菌であれば特に限定されるものではない
が、一般には、ブレビバクテリウム１フラバム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｍ Ｊ −２
３３由来株が好適に用いられる。
は、コリネを細菌であれば特に限定されるものではない
が、一般には、ブレビバクテリウム１フラバム（Ｂｒｅ
ｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）Ｍ Ｊ −２
３３由来株が好適に用いられる。
本発明のプラスミドによる上記菌株の形質転換はそれ自
体既知の方法で行なうことができるが、その詳細は後記
実施例に示す。
体既知の方法で行なうことができるが、その詳細は後記
実施例に示す。
一７＝
次に本発明のプラスミドにて形質転換されたブレビバク
テリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方法につ
いて述べる。
テリウム・フラバムＭＪ−２３３由来株の培養方法につ
いて述べる。
培養は炭素源、窒素源、無機塩等を含む通常の栄養培地
で行なうことができ、炭素源としては例えばグルコース
、エタノーノ呟メタノール、発糖蜜等が、そして窒素源
としては例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独
もしくは混合していることができる。また無機塩として
は、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミ
ノ酸ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
することもできる。
で行なうことができ、炭素源としては例えばグルコース
、エタノーノ呟メタノール、発糖蜜等が、そして窒素源
としては例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独
もしくは混合していることができる。また無機塩として
は、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫
酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミ
ノ酸ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加
することもできる。
培養は通常、通気撹拌、振盪等の好気的条件下に、約２
０〜約４０°Ｃ１好ましくは２５〜３５°Ｃの温度で行
なうことができる。培養途中のｐＨは５〜ＩＯ１好まし
くは７〜８付近にて行ない、培養中のｐＨの調整は酸又
はアルカリを添加して行なうことができる。
０〜約４０°Ｃ１好ましくは２５〜３５°Ｃの温度で行
なうことができる。培養途中のｐＨは５〜ＩＯ１好まし
くは７〜８付近にて行ない、培養中のｐＨの調整は酸又
はアルカリを添加して行なうことができる。
培養開始時の炭素源濃度は、好ましくは１〜５容量％、
更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期間は
通常１〜７８間とすることができ、最適期間は１〜３日
間である。
更に好ましくは２〜３容量％である。また、培養期間は
通常１〜７８間とすることができ、最適期間は１〜３日
間である。
このようにして得られる培養物から菌体を集めることに
より、トリプトファナーゼ活性画分を得ることができる
。
より、トリプトファナーゼ活性画分を得ることができる
。
以上本発明を説明してきたが、下記の実施例によりさら
に具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の
具体的に認識を得る一助とみなすべきものであり、本発
明の範囲を限定するためのものでないことを理解すべき
である。
に具体的に説明する。しかしながら、実施例は本発明の
具体的に認識を得る一助とみなすべきものであり、本発
明の範囲を限定するためのものでないことを理解すべき
である。
実施例１
Δ！！
Ｌ培地（トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、グルコー
スｌ ｇ、 ＮａＣｌ３ ｇ、蒸留水１（２；ｐＨ７，
２）ｌ ＯＯｍｌを容量５００ｍ１の三角フラスコに分
注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
スｌ ｇ、 ＮａＣｌ３ ｇ、蒸留水１（２；ｐＨ７，
２）ｌ ＯＯｍｌを容量５００ｍ１の三角フラスコに分
注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
この培地にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉ
ａ ｃ。
ａ ｃ。
１ｉ）Ｋ１２ ＡＴＣＣ２７３２５を植菌し、３７０
Ｃで１５時間培養を行った後、この培養液２ｍｌを採り
、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再度３７°Ｃで
４時間培養を行なった。
Ｃで１５時間培養を行った後、この培養液２ｍｌを採り
、新たに上記培地１００ｍ１に接種し、再度３７°Ｃで
４時間培養を行なった。
培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００Ｘｇ
Ｘ １５分間、４°０） して集菌し、菌体を５ＱｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａ溶液５０ｍ１に懸濁した。次にリゾチウムを最終
濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように添加し、５分間静置後
、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｍｌ添加し、
６５°Ｃで３０分間保温した。この溶菌液に、５Ｍ
ＮａＣｌ溶液１５ｍ１を添加し、０°Ｃで１時間冷却し
、全量を遠心分離（１２０００Ｘｇ、６０分間、４°Ｏ
）Ｌ、上溝画分を分取し、２倍量のエタノールを加え、
混合後、遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間、４°Ｏ）
した。得られた沈澱物をｌＯｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７
，５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液で溶解させ、
フニノール処理（除タンパク処理）およびＲＮＡ分解酵
素による処理を行ない、最終的にＤＮＡ１．５ｍｇを得
た。
Ｘ １５分間、４°０） して集菌し、菌体を５ＱｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ８，０）−１０ｍＭ ＥＤＴＡ・
２Ｎａ溶液５０ｍ１に懸濁した。次にリゾチウムを最終
濃度が２ｍｇ／ｍｌになるように添加し、５分間静置後
、１０％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を６ｍｌ添加し、
６５°Ｃで３０分間保温した。この溶菌液に、５Ｍ
ＮａＣｌ溶液１５ｍ１を添加し、０°Ｃで１時間冷却し
、全量を遠心分離（１２０００Ｘｇ、６０分間、４°Ｏ
）Ｌ、上溝画分を分取し、２倍量のエタノールを加え、
混合後、遠心分離（５０００Ｘｇ、１０分間、４°Ｏ）
した。得られた沈澱物をｌＯｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７
，５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液で溶解させ、
フニノール処理（除タンパク処理）およびＲＮＡ分解酵
素による処理を行ない、最終的にＤＮＡ１．５ｍｇを得
た。
（Ｂ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ領域
の調製 前記（Ａ）で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵
素Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩ（各々５ ｕｎｉｔｓ
）を用い３０°０１１時間反応で切断し、染色体ＤＮＡ
のＨｉｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製した
。
の調製 前記（Ａ）で調製した染色体ＤＮＡ２５μｇを、制限酵
素Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩ（各々５ ｕｎｉｔｓ
）を用い３０°０１１時間反応で切断し、染色体ＤＮＡ
のＨｉｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩ分解物溶液を調製した
。
この分解物溶液に、プラスミドｐＢＲ３２５１Ｉｇを制
限酵素Ｈ１ｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩ（各ｌ ｕｎｉｔ
ｓ）を用い、３０°ａ、 １時間反応で切断して得た
分解物溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７。
限酵素Ｈ１ｎｄｌＩ［及びＢａｍＨＩ（各ｌ ｕｎｉｔ
ｓ）を用い、３０°ａ、 １時間反応で切断して得た
分解物溶液を混合し、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７。
６）、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉＬの各
成分を添加しく各成分の濃度は最終限度である）、１６
℃で１５時間反応させ、結合させた。
０ｍＭ ＭｇＣｌ２及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉＬの各
成分を添加しく各成分の濃度は最終限度である）、１６
℃で１５時間反応させ、結合させた。
この溶液を用い、常法［Ｍ、ＭａｎｄｅＬＡ 、Ｈｉｇ
ａ；Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９ （
１９７０）参照］に従ってエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｃｒｉｃｈｉａ１ｌ− ｃｏｌｉ） Ｋ ｌ ２系株（トリプトファナーゼ欠損
変異およびトリプトファン要求性変異株）を形質転換し
、選択培地（Ｋ２ＨＰＯ４７Ｉ、ＫＨ２ＰＯ４２２、（
ＮＨ，）２５０．１７、Ｍｇｓ Ｏ、・７Ｈ２００゜１
２、カザミノ酸５ｇ、ＤＬ−５−メチル−トリプトファ
ン５０ｍｇ、グリセリン２２、寒天２０２、純水１（ｌ
に塗抹した。この培地上の生育株をＬ培地に、アンピシ
リンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３
７°Ｃで７時間培養した後、菌体を遠心分離（８０００
Ｘｇ、１０分間、４°Ｃ）により集めた。この菌体を用
いてトリプトファナーゼ活性を調べた。
ａ；Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、、 ５３．１５９ （
１９７０）参照］に従ってエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
ｈｃｒｉｃｈｉａ１ｌ− ｃｏｌｉ） Ｋ ｌ ２系株（トリプトファナーゼ欠損
変異およびトリプトファン要求性変異株）を形質転換し
、選択培地（Ｋ２ＨＰＯ４７Ｉ、ＫＨ２ＰＯ４２２、（
ＮＨ，）２５０．１７、Ｍｇｓ Ｏ、・７Ｈ２００゜１
２、カザミノ酸５ｇ、ＤＬ−５−メチル−トリプトファ
ン５０ｍｇ、グリセリン２２、寒天２０２、純水１（ｌ
に塗抹した。この培地上の生育株をＬ培地に、アンピシ
リンを最終濃度で５０μｇ／ｍｌ含む培地に植菌し、３
７°Ｃで７時間培養した後、菌体を遠心分離（８０００
Ｘｇ、１０分間、４°Ｃ）により集めた。この菌体を用
いてトリプトファナーゼ活性を調べた。
反応液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０，１０ｍＭト
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）１ｍｌに
湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた
。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒド
を用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得られ
た。この株より、アルカリ−３ＤＳ法［Ｔ 、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｅ 、 Ｆ 、 Ｆ ｒｉｔｓｃｈ。
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）１ｍｌに
湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた
。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒド
を用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得られ
た。この株より、アルカリ−３ＤＳ法［Ｔ 、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、 Ｅ 、 Ｆ 、 Ｆ ｒｉｔｓｃｈ。
Ｊ 、 Ｓａｍｂｒｏｏｋ；“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ” （１９８２）ｐ９０〜９１参照］によ
りプラスミドを抽出し、プラスミドをＢａｍＨＩ及びＨ
１ｎｄｌｌｌで切断し分子量をアガロースゲルを用いて
調べたところ、ｐＢＲ３２５のＨｉｎｄｌｌＩ及びＢａ
ｍＨＩ部位に約３゜２ｋｂのＤＮＡの挿入がみられた（
ｐＢ Ｒ３２５−ｔｎａＡ）。
ｌｏｎｉｎｇ” （１９８２）ｐ９０〜９１参照］によ
りプラスミドを抽出し、プラスミドをＢａｍＨＩ及びＨ
１ｎｄｌｌｌで切断し分子量をアガロースゲルを用いて
調べたところ、ｐＢＲ３２５のＨｉｎｄｌｌＩ及びＢａ
ｍＨＩ部位に約３゜２ｋｂのＤＮＡの挿入がみられた（
ｐＢ Ｒ３２５−ｔｎａＡ）。
さらに、このプラスミド溶液を用いて、上記宿主に再形
質転換したところ、約１０５ｓｅｌｌｓ／μｇＤＮＡの
頻度で選択培地に生育する株が現れた。
質転換したところ、約１０５ｓｅｌｌｓ／μｇＤＮＡの
頻度で選択培地に生育する株が現れた。
（Ｃ）上記（Ｂ）で調製したプラスミドｐＢ Ｒ３２５
ｔｎａＡ１０μｇおよび後記参考例で調製したプラスミ
ドｐＣＲＹ−２３μｇを制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌＩ （２
０ｕｎｉｔｓ）を用いて３７°０１１時間反応させるこ
とにより切断し、６５°Ｃ１１０分間加温することによ
り制限酵素を失活させた後、該失活溶液中の成分が最終
濃度として各々５０ｍＭ）！Ｊス緩衝液ｐＨ７。
ｔｎａＡ１０μｇおよび後記参考例で調製したプラスミ
ドｐＣＲＹ−２３μｇを制限酵素Ｈ１ｎｄｌｌＩ （２
０ｕｎｉｔｓ）を用いて３７°０１１時間反応させるこ
とにより切断し、６５°Ｃ１１０分間加温することによ
り制限酵素を失活させた後、該失活溶液中の成分が最終
濃度として各々５０ｍＭ）！Ｊス緩衝液ｐＨ７。
６．１０ｍＭ ＭｇＣＩ ２．１０ｍＭジチオスレイ
トール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌ ｕｎｉｔｓ
になるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温
することによって、ＤＮＡを結合させた。
トール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌ ｕｎｉｔｓ
になるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温
することによって、ＤＮＡを結合させた。
（Ｄ）上記（Ｃ）で調製したＤＮＡ結合物を用いて、前
記（Ｂ）におけると同様の操作でエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｌ）ｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ −１２系
株（トリプトファナーゼ欠損変異およびトリプトファン
要求性変異株）を形質転換した。前述の選択培地で生育
してきた株から、アルカリ−３ＤＳ法でプラスミドを抽
出し、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉを用いてプラスミドを切
断し、アガロースゲル電気泳動法で切断断片を調べたと
ころ、ｐＢ Ｒ３２５−ｔｎａＡのＨｉｎｄＩ部位に約
４ 、１ ｋｂのＤＮＡの挿入かみとめられるプラスミ
ドを得た。このプラスミドを各種制限酵素で切断したと
きの分子量を以下の表１に示す。
記（Ｂ）におけると同様の操作でエシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｌ）ｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ −１２系
株（トリプトファナーゼ欠損変異およびトリプトファン
要求性変異株）を形質転換した。前述の選択培地で生育
してきた株から、アルカリ−３ＤＳ法でプラスミドを抽
出し、制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉを用いてプラスミドを切
断し、アガロースゲル電気泳動法で切断断片を調べたと
ころ、ｐＢ Ｒ３２５−ｔｎａＡのＨｉｎｄＩ部位に約
４ 、１ ｋｂのＤＮＡの挿入かみとめられるプラスミ
ドを得た。このプラスミドを各種制限酵素で切断したと
きの分子量を以下の表１に示す。
表 １
ＢａｍＨｒ ２ ３．８（５，８） ４．２（６，５
）Ｈｉｎｄ ＩＩＴ ２ ２．７（４，１） ５．３
（Ｌ２）Ｓｍａ Ｉ １ ８．０（１２，３）Ｅ ｃ
ｏＲＩ ｌ ８．０（１２，３）Ｓａｌ Ｉ
３ ０．８（１，３） ３．０（４，５） ４．２
（６，５）Ｐ ｓｔ Ｉ ２ ３．１（４，８） ４
．９（７，５）＊（）内はｋｂを示す。
）Ｈｉｎｄ ＩＩＴ ２ ２．７（４，１） ５．３
（Ｌ２）Ｓｍａ Ｉ １ ８．０（１２，３）Ｅ ｃ
ｏＲＩ ｌ ８．０（１２，３）Ｓａｌ Ｉ
３ ０．８（１，３） ３．０（４，５） ４．２
（６，５）Ｐ ｓｔ Ｉ ２ ３．１（４，８） ４
．９（７，５）＊（）内はｋｂを示す。
上記制限酵素で特徴づけられるプラスミドをｐＣＲＹ−
２１ｔｎａＡｌと命名した。このプラスミドｐＣＲＹ−
２１ｔｎａＡ１の制限酵素地図を第１表に示す。
２１ｔｎａＡｌと命名した。このプラスミドｐＣＲＹ−
２１ｔｎａＡ１の制限酵素地図を第１表に示す。
（Ｅ）プロトプラストの調製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３プラスミド除
去株を１００ ｔＪの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで
培養し、ペニシリンＧを０．２ユニット／ｍｌ、になる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸すトリウム、２
０ｍＭ）リス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム及び２０
ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ７，５）から成るＴＳＭＣ
３ＭＣ緩衝液５で洗浄し、次で４ ＋ｎＦｉ／ ｔｔＪ
リゾチーム、１００ＯＵ／ ＋ｎβ及びアクロモペプチ
ダーゼを含む７３ＭＣ緩衝液１０＋Ｊに懸濁し、３０°
Ｃで１６時間反応によりプロトプラスト化を図った。反
応終了後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、プロ
トプラストをＴＳＭＣ８ＭＣ緩衝液２で洗浄し、３ＬＩ
ｌβのＴＳＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
去株を１００ ｔＪの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで
培養し、ペニシリンＧを０．２ユニット／ｍｌ、になる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸すトリウム、２
０ｍＭ）リス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム及び２０
ｍＭ塩化マグネシウム（ｐＨ７，５）から成るＴＳＭＣ
３ＭＣ緩衝液５で洗浄し、次で４ ＋ｎＦｉ／ ｔｔＪ
リゾチーム、１００ＯＵ／ ＋ｎβ及びアクロモペプチ
ダーゼを含む７３ＭＣ緩衝液１０＋Ｊに懸濁し、３０°
Ｃで１６時間反応によりプロトプラスト化を図った。反
応終了後、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、プロ
トプラストをＴＳＭＣ８ＭＣ緩衝液２で洗浄し、３ＬＩ
ｌβのＴＳＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
（Ｆ）上記（Ｅ）で得られたプロトプラスト２００成と
前記（Ｄ）で得られたプラスミドｐＣＲＹ−２１ｔｎａ
Ａｌを混合し、水冷後、ポリエチレングリコール６００
０を最終濃度２０％になるように添加した後、約３分間
氷冷し、ＴＳＭＣ５ＭＣ緩衝液を加え、遠心分離（３０
００ｒｐｍ、 ｌ ０分間）後、０゜５Ｍシュークロ
ースを含むＡ培地３ｍＮに再懸濁し、３０°０．２時間
培養した。
前記（Ｄ）で得られたプラスミドｐＣＲＹ−２１ｔｎａ
Ａｌを混合し、水冷後、ポリエチレングリコール６００
０を最終濃度２０％になるように添加した後、約３分間
氷冷し、ＴＳＭＣ５ＭＣ緩衝液を加え、遠心分離（３０
００ｒｐｍ、 ｌ ０分間）後、０゜５Ｍシュークロ
ースを含むＡ培地３ｍＮに再懸濁し、３０°０．２時間
培養した。
この培養液をクロラムフェニコール７μｇ／ｍｌ（最終
濃度）で含む再生培地（尿素２２、（Ｎ Ｈ４） Ｓ
Ｏ４７２、ＫＨ２’ＰＯ４０，５１，に２ＨＰＯ４０，
！ｌ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５２、Ｆｅ５０．・７
Ｈ７Ｈ２Ｏ６，Ｍｇ５Ｏｔ・４−６Ｈ２０６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｉ カザミノ酸７，５２、ビオチン２００
μｇ１塩酸チアミン１．Ｏｍｇ、シュークロース１７１
２、グルコース５２、ゼラチン１５２、寒天（ＤＩＦＣ
○）８２、純水で全量を１１２とした）に植菌し、３０
°０．３〜１５日間培養後出現したコロニーヲ、クロラ
ムフェニコール７μｇ／ｍλヲ含むＡ培地に植菌し、ク
ロラムフェニコール耐性能を確認した。得られたクロラ
ムフェニコール耐性株を以下に示す反応液の下にインド
ールの生成を調べＩこ。
濃度）で含む再生培地（尿素２２、（Ｎ Ｈ４） Ｓ
Ｏ４７２、ＫＨ２’ＰＯ４０，５１，に２ＨＰＯ４０，
！ｌ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５２、Ｆｅ５０．・７
Ｈ７Ｈ２Ｏ６，Ｍｇ５Ｏｔ・４−６Ｈ２０６ｍｇ、酵母
エキス２．５ｉ カザミノ酸７，５２、ビオチン２００
μｇ１塩酸チアミン１．Ｏｍｇ、シュークロース１７１
２、グルコース５２、ゼラチン１５２、寒天（ＤＩＦＣ
○）８２、純水で全量を１１２とした）に植菌し、３０
°０．３〜１５日間培養後出現したコロニーヲ、クロラ
ムフェニコール７μｇ／ｍλヲ含むＡ培地に植菌し、ク
ロラムフェニコール耐性能を確認した。得られたクロラ
ムフェニコール耐性株を以下に示す反応液の下にインド
ールの生成を調べＩこ。
反応液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０，１０ｍＭト
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）１ｍｌに
湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた
。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒド
を用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得られ
た。この株より、アルカリ−５ＤＳ法によりプラスミド
を抽出し、プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断しアガロ
ースゲル電気泳動を用いて調べたところ、ｐＢＲ３２５
のＨ１ｎｄｌ［［部位に約４．１ｋｂのＤＮＡの挿入が
みられた。
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）１ｍｌに
湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させた
。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒド
を用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得られ
た。この株より、アルカリ−５ＤＳ法によりプラスミド
を抽出し、プラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断しアガロ
ースゲル電気泳動を用いて調べたところ、ｐＢＲ３２５
のＨ１ｎｄｌ［［部位に約４．１ｋｂのＤＮＡの挿入が
みられた。
このプラスミドを前記表１に示したと同じ各種制限酵素
で切断したところ、表１と同様の結果が得られた。この
ことによりエシェリヒア・コリ（Ｅ。
で切断したところ、表１と同様の結果が得られた。この
ことによりエシェリヒア・コリ（Ｅ。
ｃｏｌｉ）を用いて構築したプラスミドｐｃ ＲＹ −
２１ｔｎａＡ １は、コリネ型細菌であるブレビバクテ
リウム・フラバム中で複製し、しかも、Ｅ、ｃｏｌｉ染
色体ＤＮＡ由来トリプトファナーゼが発現することが確
認された。
２１ｔｎａＡ １は、コリネ型細菌であるブレビバクテ
リウム・フラバム中で複製し、しかも、Ｅ、ｃｏｌｉ染
色体ＤＮＡ由来トリプトファナーゼが発現することが確
認された。
以上に述べた如くして得られた新規なプラスミドｐＣＲ
Ｙ−２１ｔｎａＡ１を保有するブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３由来株は、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３ＧＥＩＯ０３と命名され、茨城県筑波郡
谷田部町東１丁目１番地３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、昭和６３年１月８日付で受託番号：微工研
寄第９８０４号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８０４）として寄
託されている。
Ｙ−２１ｔｎａＡ１を保有するブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ２３３由来株は、ブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ２３３ＧＥＩＯ０３と命名され、茨城県筑波郡
谷田部町東１丁目１番地３号の工業技術院微生物工業技
術研究所に、昭和６３年１月８日付で受託番号：微工研
寄第９８０４号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８０４）として寄
託されている。
実施例２
（Ａ）プラスミドｐＭＴＰ−３の調製
り培地（トリプトン１０ｇ１酵母工キス５ｇ１グルコ−
７、１ｇ、 ＮａＣ１５ｇｓ蒸留水１４；ｐＨ７，２）
ｌｏＯｍｌを容量５００ｍ１の三角フラスコに分注し、
１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
７、１ｇ、 ＮａＣ１５ｇｓ蒸留水１４；ｐＨ７，２）
ｌｏＯｍｌを容量５００ｍ１の三角フラスコに分注し、
１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
この培地にアンピシリンを最終濃度が５０μｇ／ｌβに
なるように添加し、さらにエシェリヒア・コリ （Ｅｓ
ｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＹＫ ３ ０
０ ５ ［Ｆ Ｅ ＲＭＢＰ−１７３６（ＦＥ
ＲＭ ｐ−９６２２）］を植菌し、３７°Ｃで１５時
間培養を行った後、この培養液２ｍｌを採り、新たに上
記培地１００ｍ１に接種し、再度３７°Ｃで４時間培養
を行なった。
なるように添加し、さらにエシェリヒア・コリ （Ｅｓ
ｃｈｃｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） ＹＫ ３ ０
０ ５ ［Ｆ Ｅ ＲＭＢＰ−１７３６（ＦＥ
ＲＭ ｐ−９６２２）］を植菌し、３７°Ｃで１５時
間培養を行った後、この培養液２ｍｌを採り、新たに上
記培地１００ｍ１に接種し、再度３７°Ｃで４時間培養
を行なった。
培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００Ｘｇ
、１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体からアルカリ−
３ＤＳ法［Ｔ 、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ 、 Ｆ
。
、１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体からアルカリ−
３ＤＳ法［Ｔ 、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ 、 Ｆ
。
Ｆ ｒｉｔｓｃｈ、 Ｊ 、 Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ
； “Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” （
１９８２）ｐ９０〜９１参照］によりプラスミドを抽出
し、ｐＭＴＰ’−３を得た。
； “Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ” （
１９８２）ｐ９０〜９１参照］によりプラスミドを抽出
し、ｐＭＴＰ’−３を得た。
（Ｂ）前記（Ａ）で調製したプラスミドｐＭＴＰ−３Ｉ
Ｏμｇおよび後記参考例で調製したプラスミドｐＣＲＹ
−２３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ （２０ｕｎｉｔＳ
）を用いて３７°Ｏ，１時間反応させることにより切断
し、６５℃、１０分間加温することにより制限酵素を失
活させた後、該失活溶液中の成分が最、終濃度として各
々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ
及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６°Ｃで１５時間保温することによってＤＮＡを
結合させた。
Ｏμｇおよび後記参考例で調製したプラスミドｐＣＲＹ
−２３μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ （２０ｕｎｉｔＳ
）を用いて３７°Ｏ，１時間反応させることにより切断
し、６５℃、１０分間加温することにより制限酵素を失
活させた後、該失活溶液中の成分が最、終濃度として各
々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｉ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ ＡＴＰ
及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化
し、１６°Ｃで１５時間保温することによってＤＮＡを
結合させた。
−１９＝
（Ｃ）プロトプラストの調製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３プラスミド除
去株を１００ ＋ｏｊ２の前記Ａ培地で対数増殖期初期
まで培養し、ペニシリンＧを０．２ユニツ）／ｍβにな
るように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸ナトリウム、
２０ｍＭトリス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム、２０
ｍＭ塩化マグネシウム及び（ｐＨ７，５）から成るＴＳ
ＭＣ３ＭＣ緩衝液５０洗浄し、次で４ ｍｇ ／ ｍｌ
リゾチーム、１０００ユニツト／ｍｌ！アクロモペプチ
ダーゼを含むＴＳＭＣ緩衝液１．０ｍβに懸濁し、３０
°Ｃで１６時間反応によりプロトプラスト化を図った。
去株を１００ ＋ｏｊ２の前記Ａ培地で対数増殖期初期
まで培養し、ペニシリンＧを０．２ユニツ）／ｍβにな
るように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離に
より菌体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸ナトリウム、
２０ｍＭトリス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム、２０
ｍＭ塩化マグネシウム及び（ｐＨ７，５）から成るＴＳ
ＭＣ３ＭＣ緩衝液５０洗浄し、次で４ ｍｇ ／ ｍｌ
リゾチーム、１０００ユニツト／ｍｌ！アクロモペプチ
ダーゼを含むＴＳＭＣ緩衝液１．０ｍβに懸濁し、３０
°Ｃで１６時間反応によりプロトプラスト化を図った。
反応終了後、３０００ ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、
プロトプラストをＴＳＭＣ緩衝液２０−で洗浄し、３ｍ
Ｎの１３ＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
プロトプラストをＴＳＭＣ緩衝液２０−で洗浄し、３ｍ
Ｎの１３ＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
このプロトプラスト２００μｌと前記（Ｃ）で得たＤＮ
Ａ溶液１０ＣＩ！を混合し、水冷後、ポリエチレングリ
コール６０００を最終濃度２０％になるように添加した
後、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ＝２０− Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｊ２を加え、遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ。
Ａ溶液１０ＣＩ！を混合し、水冷後、ポリエチレングリ
コール６０００を最終濃度２０％になるように添加した
後、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ＝２０− Ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｊ２を加え、遠心分離（３０００ｒ
ｐｍ。
１０分間）後、０．５Ｍシュークロースを含むＡ培地３
随βに再懸濁し、３０℃、２時間培養した。
随βに再懸濁し、３０℃、２時間培養した。
この培養液をクロラムフェニコール７μｇ／ｒｎβ（最
終濃度）で含む再生培地（尿素２１１（Ｎ Ｈ４）Ｓ
Ｏ４７２、ＫＨ２ＰＯ４０，ｓ９、Ｋ２ＨＰＯ４０，５
９、ＭｇＳＯ４’ ７Ｈ２００，５９、Ｆｅ５０．’
７Ｈ２０６ｍ１ｉｉｓ ＭｎＳ Ｏ４・４〜６ Ｈ２０
６ｍｇｚ酵母エキス２．５ｉ カザミノ酸７．５ｉ ビ
オチン２００μｇ１塩酸チアミン１０ｍｇ、シュークロ
ース１７１２、グルコース５．？、ゼラチン１５２、寒
天（ＤＩＦＣＯ）８７、純水で全量を１ａとした）に植
菌し、３０°０．３〜１５日間培養後出現したコロニー
ヲ、クロラムフェニコール７μｇ／ｍβヲ含ムＡ培地に
植菌し、クロラムフェニコール耐性能を確認した。
終濃度）で含む再生培地（尿素２１１（Ｎ Ｈ４）Ｓ
Ｏ４７２、ＫＨ２ＰＯ４０，ｓ９、Ｋ２ＨＰＯ４０，５
９、ＭｇＳＯ４’ ７Ｈ２００，５９、Ｆｅ５０．’
７Ｈ２０６ｍ１ｉｉｓ ＭｎＳ Ｏ４・４〜６ Ｈ２０
６ｍｇｚ酵母エキス２．５ｉ カザミノ酸７．５ｉ ビ
オチン２００μｇ１塩酸チアミン１０ｍｇ、シュークロ
ース１７１２、グルコース５．？、ゼラチン１５２、寒
天（ＤＩＦＣＯ）８７、純水で全量を１ａとした）に植
菌し、３０°０．３〜１５日間培養後出現したコロニー
ヲ、クロラムフェニコール７μｇ／ｍβヲ含ムＡ培地に
植菌し、クロラムフェニコール耐性能を確認した。
これらクロラムフェニコール耐性株を以下に示す反応液
の下にインドールの生成を調べた。
の下にインドールの生成を調べた。
反応液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０，１０ｍＭト
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）］、ｍｌ
に湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させ
た。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒ
ドを用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得ら
れた。
リプトファン、０．１％トリトンＸ−１００）］、ｍｌ
に湿菌体５０ｍｇを加え、３７°Ｃで３０分間反応させ
た。生成するインドールをｐ−ジメチルベンズアルデヒ
ドを用いて呈色させたところ、赤色に呈色した株が得ら
れた。
（Ｄ）
前記（Ｃ）で得たクロラムフェニコール耐性でありトリ
プトファナーゼ活性を示す１株から、前記（Ａ）の方法
に従い、プラスミドを得た。このプラスミドを下記に示
す制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用
い分子量を測定した。
プトファナーゼ活性を示す１株から、前記（Ａ）の方法
に従い、プラスミドを得た。このプラスミドを下記に示
す制限酵素により切断し、アガロースゲル電気泳動を用
い分子量を測定した。
表 ２
制限酵素 認識部位数 分子量メガダルトンＨ１ｎｄＩ
ＩＩ ２ ２．７．９．０ＥｃｏＲＩ
３ １３．３．８．６．６Ｋ ｐｎ Ｉ
３ ２．０．４．２．５．５Ｐ ｓｔ Ｉ
６ ０．４５．１．０．１．２．１．４
．２．４．５，２５ Ｓａｆｆｌ ５ ０．７．０．９．２．３
．３．６．４．２ ＳｍａＩ ４ ０．３５、■、２５．４
，１．６．０上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ−２２ｔｎａＡ２と命名シタ。
ＩＩ ２ ２．７．９．０ＥｃｏＲＩ
３ １３．３．８．６．６Ｋ ｐｎ Ｉ
３ ２．０．４．２．５．５Ｐ ｓｔ Ｉ
６ ０．４５．１．０．１．２．１．４
．２．４．５，２５ Ｓａｆｆｌ ５ ０．７．０．９．２．３
．３．６．４．２ ＳｍａＩ ４ ０．３５、■、２５．４
，１．６．０上記制限酵素により特徴づけられるプラス
ミドをｐＣＲＹ−２２ｔｎａＡ２と命名シタ。
（Ｅ）プラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ ２の大腸
菌への導入 プラスミドｐＣＲＹ−２２ＬｎａＡ２ １μｇを用いて
常法［Ｍ、 Ｍａｎｄｅｌ、 Ａ、 Ｈ４ｇａ； Ｊ
、 Ｍｏｌ。
菌への導入 プラスミドｐＣＲＹ−２２ＬｎａＡ２ １μｇを用いて
常法［Ｍ、 Ｍａｎｄｅｌ、 Ａ、 Ｈ４ｇａ； Ｊ
、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、５３，１５９ （１９７０）参照］に従っ
て、エシェリヒア・コリ（Ｅ ５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ
Ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（トリプトファナーゼ欠損変異お
よびトリプトファン要求性変異株）を形質転換し、最終
濃度３０μｇ／ｍ４のクロラムフェニコールヲ含む選択
培地（Ｋ２ＨＯＰ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ。
て、エシェリヒア・コリ（Ｅ ５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ
Ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（トリプトファナーゼ欠損変異お
よびトリプトファン要求性変異株）を形質転換し、最終
濃度３０μｇ／ｍ４のクロラムフェニコールヲ含む選択
培地（Ｋ２ＨＯＰ４ ７ｇ、ＫＨ２ＰＯ４２ｇ。
（Ｎ Ｈ４）２ Ｓ○＋１ｇ、ＭｇＳ○、・７Ｈ２００
゜１ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ＤＬ−５−メチル−トリプ
トファン ５０ ｍｇｓグリセリン２ｇｓ寒天２０ｇ１
純水１１２）に塗抹し、３７°Ｃにて２４時間培養した
ところ、プラスミドＤＮＡ １μｇ当り約１０’ｃｅ１
１の形質添加株が得られた。
゜１ｇ、カザミノ酸 ５ｇ、ＤＬ−５−メチル−トリプ
トファン ５０ ｍｇｓグリセリン２ｇｓ寒天２０ｇ１
純水１１２）に塗抹し、３７°Ｃにて２４時間培養した
ところ、プラスミドＤＮＡ １μｇ当り約１０’ｃｅ１
１の形質添加株が得られた。
これらの形質転換株のうち１０株を、アルカリ−３ＤＳ
法にてプラスミドを抽出し、各種制限酵素により切断し
、その分子量をアガロースゲル電気泳動により測定した
ところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ
１００１から得たプラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ
２ （表２）と同等のものであった。このことはｐＣ
ＲＹ −２２ｔｎａＡ ２がコリネ型細菌の一種である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株とエシ
ェリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドである
ことを示し、さらに、トリプトファナーゼ遺伝子がプラ
スミド上に存在していることを示唆するものである。
法にてプラスミドを抽出し、各種制限酵素により切断し
、その分子量をアガロースゲル電気泳動により測定した
ところ、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ
１００１から得たプラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ
２ （表２）と同等のものであった。このことはｐＣ
ＲＹ −２２ｔｎａＡ ２がコリネ型細菌の一種である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株とエシ
ェリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドである
ことを示し、さらに、トリプトファナーゼ遺伝子がプラ
スミド上に存在していることを示唆するものである。
この新規なプラスミドｐＣＲＹ −２２ｔｎａＡ ２を
保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来
株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１
００１と命名され、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番
地３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和６２
年１０月２０日付で受託番号：微工研寄第９６６５号（
ＦＥＲＭ Ｐ−９６６５）として寄託されている。
保有するブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来
株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１
００１と命名され、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番
地３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和６２
年１０月２０日付で受託番号：微工研寄第９６６５号（
ＦＥＲＭ Ｐ−９６６５）として寄託されている。
実施例３
＝２４−
培地（尿素０．４％、硫酸アンモニウム１．４ｇ。
ＫＨ２Ｐ０． ０．５％、Ｋ２ＨＰ０． ０．０５％、
ＭｇＳ Ｏ４・７ Ｈ２００−０５％、ＣａＣｌ２２２
Ｈ２０２ｐｐｍｓ ＦｅＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、
Ｍｎ５Ｏｔ・４−６Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｚｎ５Ｏ，・
７１−１２０ ２ｐｐｍｓＮａＣＱ ２ｐｐｍｚ ピ
オチン２００ ｐｇ／（１，チアミン−ＨＣＱ １１
００ｐ／（１、トリプトン ０．１％、酵母エキス ０
．１％）１００ｍｆｆを５００ｍ４容三角フラスコに分
注、滅菌（滅菌後 ｐＨ７，０）した後、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１００１及びブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１００３株を各々
植菌し、無菌的にグルコースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）
、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍｆｆとなるよう
に加え、３０℃にて１５時間振とう培養を行なった。
ＭｇＳ Ｏ４・７ Ｈ２００−０５％、ＣａＣｌ２２２
Ｈ２０２ｐｐｍｓ ＦｅＳＯ４・７ Ｈ２Ｏ２ｐｐｍ、
Ｍｎ５Ｏｔ・４−６Ｈ２０２ｐｐｍ、 Ｚｎ５Ｏ，・
７１−１２０ ２ｐｐｍｓＮａＣＱ ２ｐｐｍｚ ピ
オチン２００ ｐｇ／（１，チアミン−ＨＣＱ １１
００ｐ／（１、トリプトン ０．１％、酵母エキス ０
．１％）１００ｍｆｆを５００ｍ４容三角フラスコに分
注、滅菌（滅菌後 ｐＨ７，０）した後、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１００１及びブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１００３株を各々
植菌し、無菌的にグルコースを最終濃度２％（Ｗ／Ｖ）
、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍｆｆとなるよう
に加え、３０℃にて１５時間振とう培養を行なった。
次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２．３％、ＫＨ２
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰ０． ０．０５％、Ｍｇ５
Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２０
ｐｐｍＸＭｎＳＯ４−ｎＨ２０２’Ｏｐｐｍｘピオチン
２００μｇ／１２、チアミン・ＨＣＱ １００μｇ１
０．、トリプトン０．３％、酵母エキス０．３％）のｌ
ｏｏｏｍｐを２ｇ容通撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０°
Ｃ１２０分間）後、無菌的にグルコースを最終濃度２％
（Ｗ／Ｖ）、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍＱと
なるように加え、さらに、前記前培養物を各々２０ｍＱ
添加して、回転数１１００（）ｒｐ、通気量１ ｖｖｍ
、温度３３°ｃｐＨ７，６にて１０時間培養を行った。
ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＨＰ０． ０．０５％、Ｍｇ５
Ｏ，・７Ｈ，ＯＯ，０５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２０２０
ｐｐｍＸＭｎＳＯ４−ｎＨ２０２’Ｏｐｐｍｘピオチン
２００μｇ／１２、チアミン・ＨＣＱ １００μｇ１
０．、トリプトン０．３％、酵母エキス０．３％）のｌ
ｏｏｏｍｐを２ｇ容通撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０°
Ｃ１２０分間）後、無菌的にグルコースを最終濃度２％
（Ｗ／Ｖ）、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍＱと
なるように加え、さらに、前記前培養物を各々２０ｍＱ
添加して、回転数１１００（）ｒｐ、通気量１ ｖｖｍ
、温度３３°ｃｐＨ７，６にて１０時間培養を行った。
尚、グルコースは、培養中培地の濃度が２重量％を越え
ないように、約１〜２時間ごと継続的に添加した。
ないように、約１〜２時間ごと継続的に添加した。
培養終了後、培養物４００ｍＱから遠心分離にて集菌後
、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［インドー
ル ５ｇ、ＤＬ−セリン ２０ｇ１ピリドキサール−５
′−リン酸ｌＱｍｇ、 ＫＣｌ２ ２ｇ。
、脱塩蒸留水にて２度洗浄した菌体を反応液［インドー
ル ５ｇ、ＤＬ−セリン ２０ｇ１ピリドキサール−５
′−リン酸ｌＱｍｇ、 ＫＣｌ２ ２ｇ。
蒸留水 １０００ｍｆｆ（ｐＨ８，０に５Ｎ−ＫＯＨに
て調整）１の１０００ｍ４に懸濁後、該懸濁液を２ｇ容
通気撹拌槽に仕込み、回転数３０ Ｏｒｐｍ、温度３７
℃、ｐＨ８，０で１０時間反応させた。反応終了後、反
応液から遠心分離（６０００ｒｐｍｓ ｌ ５分間、
４°Ｃ）により上澄液を調製し、該上澄液中のＬ−トリ
プトファン により測定した。また、反応終了液５００ｍｆｆをアン
モニア型強酸性イオン交換樹脂（「ダイヤイオ７３に一
ＩＢＪ、三菱化成社製）のカラムを通したのち、アルカ
リ溶液で抽出後、濃縮しＬ − １−リプトファンの粗
結晶を析出させた。結果を表３に示す。
て調整）１の１０００ｍ４に懸濁後、該懸濁液を２ｇ容
通気撹拌槽に仕込み、回転数３０ Ｏｒｐｍ、温度３７
℃、ｐＨ８，０で１０時間反応させた。反応終了後、反
応液から遠心分離（６０００ｒｐｍｓ ｌ ５分間、
４°Ｃ）により上澄液を調製し、該上澄液中のＬ−トリ
プトファン により測定した。また、反応終了液５００ｍｆｆをアン
モニア型強酸性イオン交換樹脂（「ダイヤイオ７３に一
ＩＢＪ、三菱化成社製）のカラムを通したのち、アルカ
リ溶液で抽出後、濃縮しＬ − １−リプトファンの粗
結晶を析出させた。結果を表３に示す。
嚢 ３
なお、比較例として、プラスミドを保有しない宿主菌体
を用いて同様の反応を実施した結果、Ｌ−トリプトファ
ンの生成濃度は０．０５ｇ／ｆｆ以下であった。この場
合の宿主菌体の調製のための培地は本培養培地からクロ
ラムフェニコールを除いたものを用いた。
を用いて同様の反応を実施した結果、Ｌ−トリプトファ
ンの生成濃度は０．０５ｇ／ｆｆ以下であった。この場
合の宿主菌体の調製のための培地は本培養培地からクロ
ラムフェニコールを除いたものを用いた。
実施例４
実施例３で用いたと同じ反応液を反応液［インドール
４ ｍｍｏＱ， ピルビン酸ナトリウム ２００ｍｍｏ
ｆｆ，酢酸アンモニウム ｌ ０ ０ ｍｍｏＱ、ピリ
ドギザ−ルー５′ーリン酸Ｑ 、 ４ ｍｍｏＱ，蒸留
水にて全量１ ０ ０ ０ｍｆｆ（ｐＨ８．０に５Ｎ−
ＮａＯＨにて調製）］に変えた以外は実施例３と同様の
操作を行った。
４ ｍｍｏＱ， ピルビン酸ナトリウム ２００ｍｍｏ
ｆｆ，酢酸アンモニウム ｌ ０ ０ ｍｍｏＱ、ピリ
ドギザ−ルー５′ーリン酸Ｑ 、 ４ ｍｍｏＱ，蒸留
水にて全量１ ０ ０ ０ｍｆｆ（ｐＨ８．０に５Ｎ−
ＮａＯＨにて調製）］に変えた以外は実施例３と同様の
操作を行った。
尚、インドールは反応液中の濃度が４ｍＭを越えぬよう
にインドールを逐次添加し、最終合計添加量が３０ｍｍ
ｏ（２相当量になるまで反応を実施した。
にインドールを逐次添加し、最終合計添加量が３０ｍｍ
ｏ（２相当量になるまで反応を実施した。
結果を表４に示す。
表 ４
なお、比較例として、実施例３と同様に宿主菌体（プラ
スミドを含有しない）を用いた場合にはＬ−トリプトフ
ァンの生成は見られなかった。
スミドを含有しない）を用いた場合にはＬ−トリプトフ
ァンの生成は見られなかった。
参考例
成および性質
（Ａ） プラスミドｐＢＹ５０２の調製プラスミドｐ
ＢＹ５０２は、ブレビバクテリウム、フラバムＭＪ２３
３ ［ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７（ＦＥＲＭ ｐ
−３０６８）］から新たに分離された分子量約３０メガ
ダルトンのプラスミドであり、特開昭６１−１７９７５
１号公報記載のプラスミドである。
ＢＹ５０２は、ブレビバクテリウム、フラバムＭＪ２３
３ ［ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７（ＦＥＲＭ ｐ
−３０６８）］から新たに分離された分子量約３０メガ
ダルトンのプラスミドであり、特開昭６１−１７９７５
１号公報記載のプラスミドである。
一方、プラスミドｐＢＹ５０２は次のようにし調製した
。
。
半合成培地、Ａ培地（尿素２ ｇｌ（Ｎ Ｈ ４）２
Ｓ Ｏ ４７ｇ，に２ＨＰＯ４ ０．５ｇ，’ ＫＨ
２ＰＯ４ ０．５ｇ。
Ｓ Ｏ ４７ｇ，に２ＨＰＯ４ ０．５ｇ，’ ＫＨ
２ＰＯ４ ０．５ｇ。
Ｍｇｓｏ， ０．５ｇ，ＦｅＳ○＋・７Ｈ２０ ６
ｍｇ１ＭｎＳ Ｏ ４ ・４ − ６ Ｈ ２０ ６
ｍｇｚ酵母エキス２．５ｇ１ カザミノ酸５ｇ， ピ
オチン２００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ１ グルコ
ース２０ｇ１純水でＩＱ）ＩＱに、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３ ［ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７（ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８）］ を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を、ｌ Ｏｍ
ｇ／ ｍＱの濃度に、リゾチームを含む緩衝液［２５ｍ
Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ。
ｍｇ１ＭｎＳ Ｏ ４ ・４ − ６ Ｈ ２０ ６
ｍｇｚ酵母エキス２．５ｇ１ カザミノ酸５ｇ， ピ
オチン２００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ１ グルコ
ース２０ｇ１純水でＩＱ）ＩＱに、ブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３ ［ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９
７（ＦＥＲＭ Ｐ−３０６８）］ を対数増殖期後期
まで培養し、菌体を集めた。得られた菌体を、ｌ Ｏｍ
ｇ／ ｍＱの濃度に、リゾチームを含む緩衝液［２５ｍ
Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ。
５ＱｍＭグルコース］２０ｍ０．に懸濁し、３７℃で１
時間反応させた。反応液にアルカリ＝ＳＤＳ液［Ｑ、２
Ｎ ＮａＯＨ，１％ （Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ コ ４０
ｍＱを添加し、穏やかに混和して室温にて１５分間静置
した。
時間反応させた。反応液にアルカリ＝ＳＤＳ液［Ｑ、２
Ｎ ＮａＯＨ，１％ （Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ コ ４０
ｍＱを添加し、穏やかに混和して室温にて１５分間静置
した。
次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液 ５Ｑｍ１２、酢酸１１．５ｍ１２、純水２８．
５ｍ（２の混合液］３０ｍＤ、を添加し、充分混和して
から氷水中に１５分間静置した。溶菌物全量を遠心管に
移し、４°Ｃで１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離
にかけ、上澄液を得た。
ム溶液 ５Ｑｍ１２、酢酸１１．５ｍ１２、純水２８．
５ｍ（２の混合液］３０ｍＤ、を添加し、充分混和して
から氷水中に１５分間静置した。溶菌物全量を遠心管に
移し、４°Ｃで１０分間、１５，０００×ｇの遠心分離
にかけ、上澄液を得た。
これに等量のフェノール・クロロホルム液（フェノール
・クロロホルムｍｌ混和液）ヲ加エテ懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５゜０００Ｘｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。
・クロロホルムｍｌ混和液）ヲ加エテ懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５゜０００Ｘｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。
水層に２倍量のエタノールを加え、−２０℃で１時間静
置後、４°Ｃで１０分間、１５．ＯＯＯＸｇの遠心分離
にかけ、沈澱を回収した。
置後、４°Ｃで１０分間、１５．ＯＯＯＸｇの遠心分離
にかけ、沈澱を回収した。
沈澱を減圧乾燥後、ＴＥＥ衝液［トリス１０ｍＭ、ＥＤ
ＴＡ １ｍＭ、ＨＣｌ２にてｐＨ８，０に調整１２ｍＱ
、に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃度の
ＴＥ緩緩衝液１０川 ０ｇを溶解させた液コ １５＋ｎＱとｌｏｍｇ／ｍ＋２
エチジウムブロマイド溶液１ｍＱを加えて、密度を１．
３９２ｇ／ｍｆｆに合わせた。この溶液を１２°Ｃで４
２時間、１１６，０００Ｘｇの遠心分離を行なった。
ＴＡ １ｍＭ、ＨＣｌ２にてｐＨ８，０に調整１２ｍＱ
、に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍濃度の
ＴＥ緩緩衝液１０川 ０ｇを溶解させた液コ １５＋ｎＱとｌｏｍｇ／ｍ＋２
エチジウムブロマイド溶液１ｍＱを加えて、密度を１．
３９２ｇ／ｍｆｆに合わせた。この溶液を１２°Ｃで４
２時間、１１６，０００Ｘｇの遠心分離を行なった。
プラスミドｐＢＹ−５０２は紫外線照射により遠心管内
で下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射
器で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミド
ｐＢＹ−５０２を含む分画液を得た。
で下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射
器で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミド
ｐＢＹ−５０２を含む分画液を得た。
次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥＥ衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドｐＢＹ−５０２を含む透析液に３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２
倍量のエタノールを加え、−２０°Ｃに１時間静置した
。この溶液を１５，０００Ｘｇの遠心分離にかけてＤＮ
Ａを沈降させ、プラスミドｐＢＹ−５０２を約２０μｇ
を得た。
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後に
ＴＥＥ衝液に対して透析を行なった。このようにして得
られたプラスミドｐＢＹ−５０２を含む透析液に３Ｍ酢
酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに添加した後、２
倍量のエタノールを加え、−２０°Ｃに１時間静置した
。この溶液を１５，０００Ｘｇの遠心分離にかけてＤＮ
Ａを沈降させ、プラスミドｐＢＹ−５０２を約２０μｇ
を得た。
（Ｂ） プラスミドｐＨ３Ｇ３９８の調製プラスミド
ｐＨ３Ｇ３９８は、エシェリヒア・コリ内で精製し、ク
ロラムフェニコール耐性を発現する分子魚釣１，４メガ
ダルトンのプラスミドであり、全酒造より購入が可能で
ある。
ｐＨ３Ｇ３９８は、エシェリヒア・コリ内で精製し、ク
ロラムフェニコール耐性を発現する分子魚釣１，４メガ
ダルトンのプラスミドであり、全酒造より購入が可能で
ある。
（Ｃ） 複合プラスミドｐＣＲＹ−２の造成プラスミ
ドｐＨ３Ｇ３９８（全酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｈ
１ｎｄｌＩ［ （ ５ ｕｎｉｔｓ）を３７°ｃ，
１時間反応させてプラスミドＤＮＡを完全に分解した
。
ドｐＨ３Ｇ３９８（全酒造製）０．５μｇに制限酵素Ｈ
１ｎｄｌＩ［ （ ５ ｕｎｉｔｓ）を３７°ｃ，
１時間反応させてプラスミドＤＮＡを完全に分解した
。
前記（Ａ）で調ｉしたプラスミドＩ）ＢＹ５０２２ｐｇ
に制限酵素Ｈ １ｎｄｌ［ （ ｌ ｕｎｉｔｓ）を３
７℃、３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解
した。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵
素を不活化するめたに６５°０ １０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５Ｑｍ
Ｍ）リス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（１２、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガー
ゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで
１５時間保温した。この溶液ヲ用いてエシェリヒア・コ
！ＪＪＭ１０９ ：１ンピテントセル（全酒造製）を
形質転換した。
に制限酵素Ｈ １ｎｄｌ［ （ ｌ ｕｎｉｔｓ）を３
７℃、３０分間反応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解
した。両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵
素を不活化するめたに６５°０ １０分間加熱処理し
た後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５Ｑｍ
Ｍ）リス緩衝液ｐＨ７．６、１０ｍＭＭｇ（１２、１０
ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガー
ゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで
１５時間保温した。この溶液ヲ用いてエシェリヒア・コ
！ＪＪＭ１０９ ：１ンピテントセル（全酒造製）を
形質転換した。
形質転換株は３０μｇ／ｍ１２ｃ最終濃度）のクロラム
フェニコール、１００μｇ／ ｍＱ （ 最終濃度）Ｉ
ＰＴＧイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及
び１ ０ ０ ｐｇ／ｍＱ （最終濃度）Ｘ−ｇａ１２
５ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラク
トピラノシドを含むし培地（トリプトン １０ｇ，酵母
エキス ５ｇ，ＮａＣＱ ５ｇ１純水１１２１）Ｈ７
．２）で３７°Ｃ１２４時間培養し、生育株として得ら
れた。これら生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−５ＤＳ法
（Ｔ 、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ −Ｆ 、Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ， Ｊ 、 Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （ １９８２）ｐ９０〜
９２）により抽出した。
フェニコール、１００μｇ／ ｍＱ （ 最終濃度）Ｉ
ＰＴＧイソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及
び１ ０ ０ ｐｇ／ｍＱ （最終濃度）Ｘ−ｇａ１２
５ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄガラク
トピラノシドを含むし培地（トリプトン １０ｇ，酵母
エキス ５ｇ，ＮａＣＱ ５ｇ１純水１１２１）Ｈ７
．２）で３７°Ｃ１２４時間培養し、生育株として得ら
れた。これら生育株のうち、白いコロニーで生育してき
たものを選択し、各々プラスミドをアルカリ−５ＤＳ法
（Ｔ 、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｅ −Ｆ 、Ｆｒ１ｔｓ
ｃｈ， Ｊ 、 Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （ １９８２）ｐ９０〜
９２）により抽出した。
（Ｄ） プロトプラストの調製
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３プラスミド除
去株をｌｏｍｆｆの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで培
養し、ペニシリンＧを０．２ユニット／ｍＱになるよう
に添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍトリス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム及び２０ｍＭ
０ｍＭ塩化マグネシラ）Ｈ７，５）から成るＴＳＭＣ３
ＭＣ緩衝液５０で洗浄し、次で４ｍｇ／ｍｆｆリゾチー
ム及び１０００ユニツト／ｍＱマクロモペプチダーゼを
含むＴＳＭＣ３ＭＣ緩衝液１に懸濁し、３０°Ｃで１６
時間反応によりグロトプラスト化を図った。反応終了後
、３０００ｒｐｍＩＯ分間遠心分離後、プロトプラスト
をＴＳＭＣ３ＭＣ緩衝液２ｆで洗浄し、３ｍ０．のＴＳ
ＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
去株をｌｏｍｆｆの前記Ａ培地で対数増殖期初期まで培
養し、ペニシリンＧを０．２ユニット／ｍＱになるよう
に添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離により菌
体を集め、菌体を０．５Ｍコハク酸ナトリウム、２０ｍ
Ｍトリス緩衝液、２０ｍＭ塩化カルシウム及び２０ｍＭ
０ｍＭ塩化マグネシラ）Ｈ７，５）から成るＴＳＭＣ３
ＭＣ緩衝液５０で洗浄し、次で４ｍｇ／ｍｆｆリゾチー
ム及び１０００ユニツト／ｍＱマクロモペプチダーゼを
含むＴＳＭＣ３ＭＣ緩衝液１に懸濁し、３０°Ｃで１６
時間反応によりグロトプラスト化を図った。反応終了後
、３０００ｒｐｍＩＯ分間遠心分離後、プロトプラスト
をＴＳＭＣ３ＭＣ緩衝液２ｆで洗浄し、３ｍ０．のＴＳ
ＭＣ緩衝液に再度懸濁した。
（Ｅ） 複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換
、 上記（Ｄ）で得られたプロトプラスト２００μαと、前
記（Ｃ）で得られたプラスミドＤＮＡを混和し、水冷後
、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度２０％に
なるように添加した後、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ３Ｍ
Ｃ緩衝液２を加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、 ｌ
０ｍ１ｎ）後、０．５Ｍシュークロースを含むＡ培地３
ｍ４に再懸濁し、３００Ｃ１２時間培養した。
、 上記（Ｄ）で得られたプロトプラスト２００μαと、前
記（Ｃ）で得られたプラスミドＤＮＡを混和し、水冷後
、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度２０％に
なるように添加した後、約３分間氷冷し、ＴＳＭＣ３Ｍ
Ｃ緩衝液２を加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、 ｌ
０ｍ１ｎ）後、０．５Ｍシュークロースを含むＡ培地３
ｍ４に再懸濁し、３００Ｃ１２時間培養した。
この培養液をクロラムフェニコール７μｇ／ｍＱ（最終
濃度）を含む再生培地（尿素２ｇ１ （ＮＨ４）ｓｏ、
７ｇＸＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５
ｇ、Ｍｇ５Ｏ＜−７Ｈ２００，５ｇＸＦｅＳＯ４・７
Ｈ２０６ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４−６ＨｚＯ６ｍｇ５酵母
エキス２，５ｇ１カザミノ酸７．５ｇ、 ビオチン２０
０μｇ１塩酸チアミン１０ｍｇ、シュー７０−ス１７１
ｇ、グルコース５ｇ、ゼラチン１５ｇ、寒天（ＤＩＦＣ
Ｏ）８ｇ、純水で全量をｌＱとした）に植菌し、３０°
Ｃ，３〜１５日間培養後出現したコロニーヲ、クロラム
フェニコール７μｇ／ｍ＋２ヲ含むＡ培地に植菌し、ク
ロラムフェニコール耐性能を確認した。
濃度）を含む再生培地（尿素２ｇ１ （ＮＨ４）ｓｏ、
７ｇＸＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、に２ＨＰＯ４０，５
ｇ、Ｍｇ５Ｏ＜−７Ｈ２００，５ｇＸＦｅＳＯ４・７
Ｈ２０６ｍｇ、Ｍｎ５Ｏ，・４−６ＨｚＯ６ｍｇ５酵母
エキス２，５ｇ１カザミノ酸７．５ｇ、 ビオチン２０
０μｇ１塩酸チアミン１０ｍｇ、シュー７０−ス１７１
ｇ、グルコース５ｇ、ゼラチン１５ｇ、寒天（ＤＩＦＣ
Ｏ）８ｇ、純水で全量をｌＱとした）に植菌し、３０°
Ｃ，３〜１５日間培養後出現したコロニーヲ、クロラム
フェニコール７μｇ／ｍ＋２ヲ含むＡ培地に植菌し、ク
ロラムフェニコール耐性能を確認した。
（Ｆ）
上記（Ｅ）で得たクロラムフェニコール耐性株より、前
記（Ａ）の方法を用いてプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で分子量を測定した（表５）。
記（Ａ）の方法を用いてプラスミドを得た。このプラス
ミドを各種制限酵素で分子量を測定した（表５）。
表 ５
制限酵素 認識部位数 分子量水メガダルトンＨ１ｎｄ
Ｉ［［２２，７（４−１） １．４（２−２）Ｋ ｐｎ
Ｉ ｌ ４．１（６，３）ＥｃｏＲ
Ｉ ｌ ４．１（６，３）ＢａｍＨＩ
２ ２．２（３，４） １．９（２，９）Ｓ
ｍａ Ｉ ２ ４．０（６，１）
０．１（０，２）木（）内はｋｂを示す 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ −２と命名した。
Ｉ［［２２，７（４−１） １．４（２−２）Ｋ ｐｎ
Ｉ ｌ ４．１（６，３）ＥｃｏＲ
Ｉ ｌ ４．１（６，３）ＢａｍＨＩ
２ ２．２（３，４） １．９（２，９）Ｓ
ｍａ Ｉ ２ ４．０（６，１）
０．１（０，２）木（）内はｋｂを示す 上記制限酵素により特徴づけられるプラスミドをｐＣＲ
Ｙ −２と命名した。
（Ｇ）
上記（Ｆ）で得たプラスミドｐｃ ＲＹ −２を用いて
エシェリヒア・コリＨＢ １０１ コンピテントセル
（宝酒造製）を形質転換した。
エシェリヒア・コリＨＢ １０１ コンピテントセル
（宝酒造製）を形質転換した。
形質転換株は、最終濃度３０μｇ／ｍＱのフロラムフェ
ニコールを含むし培地で選択したところ、ｐＣＲＹ−２
１μｇ当りｌ ０５Ｃｅｌｌｓの頻度でクロラムフェニ
コール耐性能を示す形質転換株が得られた。これらの形
質転換株のうち１０株からアルカリ−３ＤＳ法にてプラ
スミドを抽出し、各種制限酵素により切断し、その分子
量をアガロースゲル電気泳動により測定したところ、ブ
レビバクテリウム・フラバムの形質転換株から得たプラ
スミドｐＣＲＹ−２（表５）と同等のものであった。
ニコールを含むし培地で選択したところ、ｐＣＲＹ−２
１μｇ当りｌ ０５Ｃｅｌｌｓの頻度でクロラムフェニ
コール耐性能を示す形質転換株が得られた。これらの形
質転換株のうち１０株からアルカリ−３ＤＳ法にてプラ
スミドを抽出し、各種制限酵素により切断し、その分子
量をアガロースゲル電気泳動により測定したところ、ブ
レビバクテリウム・フラバムの形質転換株から得たプラ
スミドｐＣＲＹ−２（表５）と同等のものであった。
このことは、ｐｃＲＹ−２がコリネ型細菌の一種である
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株とエシ
ェリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドである
ことを示し、さらにプラスミドの存在を示唆する薬剤耐
性遺伝子が両者菌属間にて発現することを示すものであ
り、工業的に有用なベクターであると考えられる。
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３由来株とエシ
ェリヒア・コリ内で複製増殖する複合プラスミドである
ことを示し、さらにプラスミドの存在を示唆する薬剤耐
性遺伝子が両者菌属間にて発現することを示すものであ
り、工業的に有用なベクターであると考えられる。
また、複合プラスミドｐＣＲＹ−２により形質転換され
たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０１
株は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、昭和６３年１月８日付
で受託番号：微工研寄第９８０１号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９８０１）として寄託されている。
たブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０１
株は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業
技術院微生物工業技術研究所に、昭和６３年１月８日付
で受託番号：微工研寄第９８０１号（ＦＥＲＭ Ｐ−
９８０１）として寄託されている。
（Ｈ） プラスミドｐｃ ＲＹ−２の調製半合成培地
Ａ培地（尿素２ ｇ、 （Ｎ Ｈ４）２Ｓ Ｏ４７ｇ
１に２ＨＰＯ４０，５ｇ、ＫＨ２Ｐ０． ０．５ｇ５Ｍ
ｇ５Ｏ，’ ７Ｈ２００，５ｇ、Ｆｅ５０．・７Ｈ２７
Ｈ２Ｏ６ＭｎＳＯ４’ ４−ｆ３）Ｉ２ｏ ６ｍｇ５
酵母エキス ２．５ｇ、カザミノ酸５ｇｓ ビチオン２
００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ
１純水１１２）１００ｍ（２を容量５００ｍＱの三角フ
ラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
Ａ培地（尿素２ ｇ、 （Ｎ Ｈ４）２Ｓ Ｏ４７ｇ
１に２ＨＰＯ４０，５ｇ、ＫＨ２Ｐ０． ０．５ｇ５Ｍ
ｇ５Ｏ，’ ７Ｈ２００，５ｇ、Ｆｅ５０．・７Ｈ２７
Ｈ２Ｏ６ＭｎＳＯ４’ ４−ｆ３）Ｉ２ｏ ６ｍｇ５
酵母エキス ２．５ｇ、カザミノ酸５ｇｓ ビチオン２
００μｇ１塩酸チアミン２００μｇ、グルコース２０ｇ
１純水１１２）１００ｍ（２を容量５００ｍＱの三角フ
ラスコに分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。
この培地にクロラムフェニコールを最終濃度１５μｇ／
ｍＱになるように添加し、さらにブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０１ （ＦＥＲＭ Ｐ−９
８０１）を植菌し、３０°Ｃで２０時間振とう培養をお
こなった。培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８
０００Ｘｇ １５分間４０Ｃ）シて集菌し、菌体から
アルカリ−３ＤＳ法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＲ
Ｙ−２を得た。
ｍＱになるように添加し、さらにブレビバクテリウム・
フラバムＭＪ２３３ＧＥ１０１ （ＦＥＲＭ Ｐ−９
８０１）を植菌し、３０°Ｃで２０時間振とう培養をお
こなった。培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８
０００Ｘｇ １５分間４０Ｃ）シて集菌し、菌体から
アルカリ−３ＤＳ法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＲ
Ｙ−２を得た。
第１図はプラスミドｐＣＲＹ −２１ｔｎａＡ ｌの制
限酵素地図である。 −４０＝
限酵素地図である。 −４０＝
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ
領域、 （ｂ）トリプトファナーゼ構造遺伝子の発見を制御しう
るプロモーター及びオペレーターを含む調節遺伝子領域
、及び （ｃ）コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なＤＮＡ領域
、 を含有することを特徴とするプラスミド。 ２、（ｄ）エシエリヒア属細胞内で自律増殖可能なＤＮ
Ａ領域 をさらに含有する特許請求の範囲第１項記載のプラスミ
ド。 ３、薬剤耐性能を司る遺伝子を含むＤＮＡ領域を有する
特許請求の範囲第１項又は第２項記載のプラスミド。 ４、ｐＣＲＹ−２１ｔｎａＡ１である特許請求の範囲第
１〜３項のいずれかに記載のプラスミド。 ５、ｐＣＲＹ−２２ｔｎａＡ２である特許請求の範囲第
１〜３項のいずれかに記載のプラスミド。 ６、プラスミドｐＣＲＹ−２１ｔｎａＡ１又はｐＣＲＹ
−２２ｔｎａＡ２で形質転換されたブレビバクテリウム
・フラバムＭＪ２３３。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63094661A JPH01265887A (ja) | 1988-04-19 | 1988-04-19 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63094661A JPH01265887A (ja) | 1988-04-19 | 1988-04-19 | プラスミド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01265887A true JPH01265887A (ja) | 1989-10-23 |
Family
ID=14116434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63094661A Pending JPH01265887A (ja) | 1988-04-19 | 1988-04-19 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01265887A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61216690A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-09-26 | アンチビオチコス・ソシエダ−ド・アノニマ | シヤトルベクタ− |
-
1988
- 1988-04-19 JP JP63094661A patent/JPH01265887A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61216690A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-09-26 | アンチビオチコス・ソシエダ−ド・アノニマ | シヤトルベクタ− |
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